JP4763017B2 - 遺伝子発現のための多重プロモーターおよびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、さらなる調節核酸配列、特にプロモーター構築物ならびに/または有利な特性、例えば、元のプロモーターと比較して増大もしくは変化した転写活性および/もしくは翻訳活性を有する発現ユニットを提供する目的に基づくものであった。
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3' (I)
(式中、
nは0〜10の整数であり、
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学結合またはリンカーの核酸配列であり;
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合領域、例えばコア領域を含む、同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし;かつ、少なくともPyは、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含み;P1および個々のまたは全てのPxは、互いに独立して、リボソーム結合を媒介する種類の配列部分を有していてもよい)
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、多重プロモーター含有型発現ユニットを提供することにより、本発明によって達成された。
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3' (II)
(式中、
n、Ax、Ay、P1、PxおよびPyは、上記に定義されるとおりであり、かつ
Gは、5'上流の調節配列に機能的にまたは操作可能に連結された少なくとも1つのコーディング核酸配列である)
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、発現カセットに関する。
a) タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
b) ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
c) 有機酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
d) 脂質および脂肪酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
e) ジオールの生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
f) 炭水化物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
g) 芳香族化合物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
h) ビタミンの生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
i) 補因子の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
j) 酵素の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;および
k) 中央代謝のタンパク質をコードする核酸、
から選択される。
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子LuxR、転写調節因子LysR1、転写調節因子LysR2、リンゴ酸キノンオキシドレダクターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニン-γ-シンターゼ、シスタチオニン-β-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニン輸送担体、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンNADPレダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655調節因子, RXN2910調節因子、アルギニルtRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質(threonine efflux protein)、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質RXA077、硫酸還元タンパク質RXA248、硫酸還元タンパク質RXA247、OpcAタンパク質、1-ホスホフルクトキナーゼおよび6-ホスホフルクトキナーゼ、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルアミノケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびリンゴ酸酵素、から選択されるアミノ酸生合成経路のタンパク質をコードする核酸から選択される。
I. 一般的定義:
本発明において、「生合成産物」とは、細胞において天然の代謝過程(生合成経路)を経て生産されるものを意味する。これらは多くの異なる方法、特に食品産業、飼料産業、化粧品産業、飼料、食品および製薬産業において使用される。これらの物質は、略式で、ファインケミカル/タンパク質と呼ばれ、特に、有機酸、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子が含まれ、さらにタンパク質や酵素も含まれる。
多重アラインメントパラメーター:
ギャップオープニングペナルティー 10
ギャップエクステンションペナルティー 10
ギャップセパレーションペナルティー範囲 8
ギャップセパレーションペナルティー off
アラインメント・ディレイについての%同一性 40
残基特異的ギャップ off
親水性残基ギャップ off
転移計量 0
ペアワイズアラインメントパラメーター:
FASTアルゴリズム on
K-タプルサイズ 1
ギャップペナルティー 3
ウィンドウサイズ 5
最適ダイアゴナル数 5
を設定して、比較により計算される同一性を意味する。
50%ホルムアミド、5 × SSC(750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 × デンハルト溶液、10%硫酸デキストランおよび20 g/mlの変性させた、せん断サケ***DNAを含む溶液中で、42℃において一晩インキュベーションし、その後、0.1 × SSCを用いて、65℃においてフィルターを洗浄することを意味する。
a)発現ユニット
本発明は、特に、以下の式I:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'
(式中、
nは、0〜10の整数(例えば、1、2、3、4、5または6)であり;
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学的結合(特に共有結合)であり、あるいは化学的に(特に共有結合的に)組み込まれたリンカーの核酸配列であり;
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合領域(例えばコア領域)を含む、同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし;かつ少なくともPy(例えば、Pyのみ)が、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含む)
の配列モジュールを5’から3’方向に含む、多重プロモーター含有型発現ユニットの提供に関する。
pGROについては、配列番号1の50位〜80位の範囲;
pEFTsについては、配列番号2の130位〜170位の範囲;
pEFTuについては、配列番号3の30位〜110位の範囲;
pSODについては、配列番号4の50位〜100位の範囲、
に位置する。
プロモーター活性を有する核酸配列を2つ以上含み、
a) 好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4のなかから選択される同一のまたは異なる配列に由来し;または他の、同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列に由来し;
b) 適切な場合、ヌクレオチドの置換、挿入、逆位、欠失または付加により誘導される配列を表す1つ以上の上記配列を有し、この配列は、特にコア領域において、好ましくは配列番号1、2、3もしくは4または他の、同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列から選択される配列に対して核酸レベルで少なくとも80%同一であり、
c) あるいは、適切な場合、ストリンジェントな条件下で配列番号1、2、3もしくは4の核酸配列の1つに対しておよび/または他の、同程度もしくはより多い存在量の遺伝子のプロモーター配列に相補な配列に対してハイブリダイズすることを示すこれらの核酸配列を1つ以上有し、
d) あるいは、適切な場合、a)、b)またはc)の配列の「機能的に同等の断片」であることを示すこれらの核酸配列を1つ以上有する。
e)
PeftuPsod、配列番号45中の18位〜390位由来、
PsodPeftu、配列番号52中の18位〜395位由来、
PgroPsod、配列番号55中の18位〜369位由来、
PgroPsodPefts、配列番号59中の11位〜538位由来、
PeftuPsodPefts、配列番号60中の11位〜559位由来、
をコードする配列、または
f) ヌクレオチドの置換、挿入、反転、付加もしくは欠失によりe)に記載の配列から誘導され、かつ前記出発配列と比較して核酸レベルで少なくとも80%もしくは少なくとも90%同一である配列、または
g) ストリンジェントな条件下で、e)に相補的な配列とハイブリダイズする核酸配列、あるいは
h) 上記e)、f)およびg)の配列の「機能的等価断片」。
中程度または高いGC含量を有する細菌(例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム)のコンセンサス配列には、一般に高度の変動が生じることはよく知られている(Bourn and Babb, 1995., Bashyamら, 1996)。このことは特に-35領域に当てはまり、そのため-35領域は多くの場合予測することができない。このことは例えばPatekら(2003). J of Biotechnology 104, 325-334に記載されている。
本発明はさらに、翻訳可能な核酸配列に機能的に連結された本発明の多重プロモーター含有型発現ユニットに関する。遺伝子を発現することのできるこうした構築物を、本発明において、発現カセットとも言う。
1つ以上の本発明の発現ユニット(適当であれば変更された特異的発現活性を有する)を微生物のゲノムに導入して、1つ以上の内在性遺伝子が、導入された本発明の発現ユニットの制御下で発現されるようにすること、または
本発明の発現ユニット(適当であれば変更された特異的発現活性を有する)および、機能的に連結された、1つ以上の発現すべき核酸、すなわち発現カセットを含む1つ以上の核酸構築物を微生物内に導入すること。
プロモーター活性を有するすべての上記核酸および発現ユニットおよび発現カセットは、さらに、ヌクレオチド構成単位からの化学合成により、例えば二重螺旋の個々のオーバーラップする相補的核酸構成単位の断片縮合によりそれ自体知られた方法で作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、既知の方法によりホスホアミダイト法を用いて行うことができる(Voet, Voet, 第2版, Wiley Press New York, pp. 896-897)。合成オリゴヌクレオチドの組立およびDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによるギャップの穴埋めおよび連結反応ならびに一般的クローニング方法は、Sambrookら (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
本発明はまた、上記本発明の発現カセットを含む発現ベクターに関する。
その助けを借りることにより染色体内への組込みによる遺伝子増幅の方法に応用可能なプラスミドベクターはさらに適当であり、こうしたものは、例えばRemscheidらにより(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994))においてhom-thrBオペロンの複製と増幅について記載されている。この方法において、完全遺伝子は、宿主(典型的には大腸菌)では複製できるがコリネバクテリウム・グルタミクムでは複製できないプラスミドベクターにクローニングされる。適当なベクターの例は、pSUP301 (Sirnonら, Bio/ Technology 1, 784-791 (1983))、pK18mobもしくはpK19mob (Schaeferら, Gene 145, 69-73 (1994)), Bernardら, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993))、pEM1 (Schrumpfら 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510--4516)またはpBGS8 (Sprattら,1986, Gene 41: 337-342)である。その後、増幅すべき遺伝子を有するプラスミドベクターを形質転換により所望のコリネバクテリウム・グルタミクム菌株内に導入する。形質転換方法は、例えばThierbachら (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989))および Tauchら (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))に記載されている。
微生物の遺伝子の転写速度および/または翻訳速度は、野生型と比較して、本発明の発現ユニットにより前記微生物の遺伝子の転写を調節することにより変更または生じるようにすることが可能であり、このとき前記遺伝子は前記発現ユニットに対して異種性(heterologous)である。
プロモーター活性を有する本発明の核酸の1つ以上を微生物のゲノム内に導入して、1つ以上の内在性遺伝子が前記プロモーター活性を有する導入された核酸(適切であれば変更された特異的プロモーター活性を有する)の制御下で転写されるようにすること、あるいは
プロモーター活性を有する本発明の核酸およびそれに機能的に連結された転写されるべき1つ以上の外来性または内在性核酸を含有する1つ以上の核酸構築物を該微生物に導入すること、により達成される。
本発明の発現ユニット、上記遺伝子および上記核酸構築物または発現カセットは、当業者に知られた方法、例えばコンジュゲーション法またはエレクトロポレーション法(例えば、Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53, 299-303)を用いて、微生物、特にコリネフォルム細菌に導入する。
ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA
FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japan
NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain
NCIMB: National Collection of Industrial and Marine bacteria Ltd., Aberdeen, UK
CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL
NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen, Braunschweig, Germany
本発明の多重プロモーター含有型発現ユニット、発現カセットおよびベクターは、例えば下に説明するように、生合成産物の発酵産生の改良方法において特に都合良く使用することができる。
本発明により製造される好ましい生合成産物はファインケミカルである。
本発明は特に、野生型と比べ少なくとも1つの遺伝子の発現速度が増大するまたはかかる遺伝子の発現が生じるように遺伝子改変した微生物を培養することによりリシンを産生する方法に関し、ここで
- 微生物中の少なくとも1つの内在性遺伝子の発現活性は、本発明の発現ユニットにより調節され、または
- 微生物中の少なくとも1つの遺伝子の発現は、前記微生物に前記遺伝子を含む本発明の発現カセットを導入することにより生じるまたは改変される。
本発明はさらに、野生型と比べ少なくとも1つの遺伝子の発現速度が増大しているまたは発現を生じる遺伝子改変した微生物を培養することによりメチオニンを調製する方法に関し、ここで
- 微生物中の少なくとも1つの内在性遺伝子の発現活性は、本発明の発現ユニットにより調節され、または
- 微生物中の少なくとも1つの遺伝子の発現は、前記微生物に前記遺伝子を含む本発明の発現カセットを導入することにより生じるまたは改変される。
本発明はさらに、野生型と比べ少なくとも1つの遺伝子の発現速度が増大しているまたは発現が生じている遺伝子改変した微生物を培養することによりトレオニンを調製する方法に関し、ここで
- 微生物中の少なくとも1つの内在性遺伝子の発現活性は、本発明の発現ユニットにより調節され、あるいは
- 微生物中の少なくとも1つの遺伝子の発現は、前記微生物に前記遺伝子を含む本発明の発現ユニットを導入することにより生じるかまたは改変される。
上記活性のうち少なくとも1つが更に増大または低下した当該活性は、必ずしも必要ではないが、本発明の発現ユニットまたは本発明の発現カセットにより生じさせることができる。
・共抑制を誘導するための少なくとも1つのセンスリボ核酸配列の導入、またはその発現を確保する発現カセットの導入
・対応する遺伝子、RNAもしくはタンパク質に対する少なくとも1つのDNAやタンパク質結合因子の導入、またはその発現を確保する発現カセットの導入
・RNAを分解するウイルス核酸配列の少なくとも1つの導入、またはその発現を確保する発現カセットの導入
・例えば遺伝子の終止コドンの生成やリーディングフレームにおけるシフト、例えば遺伝子において挿入、欠失、逆位または突然変異を生じさせることなど機能を喪失させるための少なくとも1つの構築物の導入。相同組換えまたは標的遺伝子に対し配列特異的なヌクレアーゼの導入により、所望の標的遺伝子に目的とする挿入をしてノックアウト変異体を作製することが可能でありかつ好ましい。
・センスRNA(mRNA)の翻訳を減少させるアンチセンスRNAの導入
当業者であれば、本発明の目的の範囲内でこの活性または機能を低下させるために、更なる方法も適用できることを理解できる。例えば、タンパク質のドミナント・ネガティブ変異体またはそれらの発現を確保する発現カセットの導入が有利なこともある。
本発明の生合成産物を調製する方法では、遺伝子改変した微生物を培養するステップに続いて、好ましくは生合成産物を微生物および/または発酵ブロスから単離する。このステップは前記培養ステップと同時および/または好ましくは前記培養ステップの後に実施され得る。
ベクターpCLiK5MCSの調製
第1に、ベクターpBR322のアンピシリン耐性および複製起点を、配列番号5および配列番号6のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。
5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'
配列番号6:
5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'
pBR322と相補的な配列の他に、配列番号5のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼSmaI、BamHI、NheIおよびAscIの切断部位を含み、また配列番号6のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼXbaI、XhoI、NotIおよびDraIの切断部位を含む。PCR反応は、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))などの標準的方法により、PfuTurboポリメラーゼ (Stratagene, La Jolla, USA)を用いて行った。得られたDNA断片のサイズは約2.1kbで、該DNA断片はGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitand Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。DNA断片の平滑末端は、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、互いにライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、アンピシリン(50μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3'
配列番号8:
5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3'
pWLT1と相補的な配列の他に、配列番号7のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼXbaI、SmaI、BamHI、NheIの切断部位を含み、また配列番号8のオリゴヌクレオチドプライマーは5’から3’方向に制限エンドヌクレアーゼAscIおよびNheIの切断部位を含む。PCR反応は、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))などの標準的方法により、PfuTurboポリメラーゼ (Stratagene, La Jolla, USA)を用いて行った。得られたDNA断片のサイズは約1.3kbで、該DNA断片はGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。DNA断片を制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびAscI (New England Biolabs, Beverly, USA)により切断し、続いてGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて再度精製した。pCLiK1ベクターも同様にXbaIおよびAscI制限エンドヌクレアーゼで切断し、さらにアルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8%強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約2.1 kb)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、切断したPCR断片とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3'
配列番号10:
5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'
pWLQ2と相補的な配列の他に、配列番号9および配列番号10のオリゴヌクレオチドプライマーは制限エンドヌクレアーゼNotIの切断部位を含む。PCR反応は、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))などの標準的方法により、PfuTurboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いて行った。得られたDNA断片のサイズは約2.7 kbで、該DNA断片はGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。DNA断片を制限エンドヌクレアーゼNotI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、続いてDNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて再度精製した。pCLiK3ベクターも同様にNotI制限エンドヌクレアーゼで切断し、そしてアルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8%強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約2.3 kb)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、切断したPCR断片とライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いて、Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3'
配列番号12:
5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3'
pCLiK5ベクターを制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHI(New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、そしてアルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を製造業者の記載情報のとおり用いて脱リン酸化した。0.8%強度のアガロースゲルで電気泳動後、線状化ベクター(約5.0 kb)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。このベクター断片と前記合成二本鎖DNA断片を、Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の記載情報のとおり用いてライゲートした。また、ライゲートした混合物を用いてSambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)に記載の標準的方法により、コンピテントE.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)を形質転換した。プラスミド保有細胞は、カナマイシン (20μg/ml)含有LB寒天 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレーティングすることにより選択することができた。
プラスミドPmetA metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号14および配列番号15のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、非コーディング5’領域を含むmetA遺伝子を増幅した。
5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'
および
配列番号15:
5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'
得られた約1.3 kbのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて単離した。続いて、制限酵素Asp718およびSpeI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてDNA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
プラスミドpCLiK5MCS Psod metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号17および配列番号18のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、スーパーオキシド・ジスムターゼ(Psod)の非コーディング5’領域(発現ユニット領域)由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
5'-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3'
および
配列番号18:
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3'
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
および
配列番号20
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
得られた約470塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
プラスミドpCLiK5MCS P EF-TU metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号22および配列番号23のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、スーパーオキシド・ジスムターゼ(Psod)の非コーディング5’領域(プロモーター領域)由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
5'-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3'
および
配列番号23:
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3'
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
および
配列番号25:
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
得られた約470塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
プラスミドpCLiK5MCS Pgro metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号27および配列番号28のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、GroES遺伝子(Pgro)の非コーディング5’領域(プロモーター領域)由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3'
配列番号28:
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3'
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
配列番号30:
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
得られた約470塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
プラスミドP EF-TS metAの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマーBK 1849 (配列番号32)およびBK 1862 (配列番号33)、鋳型として染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼをコードするMetaA遺伝子を増幅した。
5'- GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG-3'
および
BK 1862 (配列番号33)
5'-ATGCCCACCCTCGCGCC-3'
得られた約1134 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
5'-GAGAGGATCCCCCCCACGACAATGGAAC-3'
および
Haf 27 (配列番号35)
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTACGGGGCGATCCTCCTTATG-3'
得られた約195 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
プラスミドP EF-Tu pSOD metA (H473)の調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマーBK 1753 (配列番号37)およびBK 1754 (配列番号38)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、GroELターミネーターを増幅した。
GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG
BK 1754 (配列番号38)
GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC
得られた約77 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製し、XbaIおよびBcuI制限酵素で切断し、再度精製した。
GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG
配列番号41 (BK 1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
pG A4 (配列番号42)プラスミドをXhoIおよびBcuI制限酵素で切断し、さらにGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマーBK 1695 (配列番号43)およびHaf16 (配列番号44)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、EF Tu遺伝子(Peftu)の非コーディング5’領域(発現ユニット領域)由来の約182塩基対のDNA断片を増幅した。
GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG
配列番号44 (Haf16)
GAGAACTAGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC
得られた約200 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製し、XhoIおよびBcuI制限酵素で切断し、再度精製した。
プラスミドPsodPeftu metA (H505)の調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号46(Haf64)および配列番号47(Haf65)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、EF Tu遺伝子 (Peftu)の非コーディング5'領域(発現ユニット領域)由来の約200塩基対のDNA断片を増幅した。
GAGAACTAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG
配列番号47 (Haf65)
GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC
得られた約200 bpのDNA 断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。
ATGCCCACCCTCGCGCC
配列番号49 (BK1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応で鋳型として共に使用した。
GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG
配列番号51 (Haf 17)
GAGAACTAGTTAGGTTTCCGCACCGAGC
増幅したDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびBcuI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、さらにゲル電気泳動で分画した。約180塩基対のDNA断片をその後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてアガロースから精製した(これがPsod断片に相当する)。
プラスミドpClik5MCS Pgro Psod metA (H472)の調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号53 (BK1701)および配列番号54 (Haf18)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、約175ヌクレオチドのDNA断片を増幅した。これは、GRO EL遺伝子(Pgro)の非コーディング5’領域 (発現ユニット領域)由来の155塩基対ならびに5’および3’末端にそれぞれ1つの制限酵素切断部位(それぞれXhoIおよびBcuI)を含む。
GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC
配列番号54 (Haf018)
GAGAACTAGTATTTTGTGTGTGCCGGTTGTG
得られた約175bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびBcuI(Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、DNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
プラスミドPgroPsod Pefts metA (H501)の調製
オリゴヌクレオチドプライマーBK1782 (配列番号56)およびHaf63 (配列番号57)、ならびに鋳型としてpClik5MCS Pgro Psod metA (配列番号55 (H472))プラスミドを用いたPCRを、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により実施した。増幅した断片は、約474の塩基対および3'末端にAcc65I切断部位を有するPgro-Psodカセットを含む。得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて精製した。続いて、XhoIおよびAcc65I制限酵素で切断し、そしてDNA断片(333塩基対)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
配列番号57 (Haf 63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
H479(配列番号58)プラスミドは、metA ORFに融合したPefts発現ユニットを含む。これを(Peftsのすぐ上流で)XhoIおよびAcc65I制限酵素で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて約6.4 kbの断片を単離した。
プラスミドPeftu Psod Pefts metA (H502)の調製
オリゴヌクレオチドプライマーBK1782 (配列番号56)およびHaf63 (配列番号57)、ならびに鋳型としてpClik5MCS Peftu Psod (配列番号45 (H473))プラスミドを用いたPCRを、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法により実施した。増幅した断片は、約495塩基対であり3'末端にAcc65I切断部位を有するPeftu-Psodカセットを含む。得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素XhoIおよびAcc65Iで切断し、さらにDNA断片(354塩基対)を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
配列番号57 (Haf 63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
H479(配列番号58)プラスミドは、metA ORFに融合したPefts発現ユニットを含む。これを(Peftsのすぐ上流で)XhoIおよびAcc65I制限酵素で切断し、そして電気泳動による分画の後、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを用いて約6.4 kbの断片を単離した。
metA活性の測定
コリネバクテリウム・グルタミクム株 ATCC13032を、Lieblら, (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303に記載の方法により、プラスミドpClik5 MCS、pClik MCS Psod metA、pClik MCS Peftu metA、pClik5 MCS Pefts metA、pClik5 MCS Peftu Psod metA、pClik5 MCS Psod Peftu metA、pClik5 MCS Pgro Psod meta、pClik5 MCS Pgro Psod Pefts metA、pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metAのいずれかを用いて形質転換した。形質転換混合物は、プラスミド保有細胞の選択を確実に行うために20 mg/l カナマイシンをさらに含むCMプレート上にプレーティングした。得られたカナマイシン耐性クローンを選出し、間引きした。
プラスミドpCIS lysCの構築
リシン産生株を作製するために、lysC野生型遺伝子の対立遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC1303中で置換した。この置換には、生成タンパク質中の311位のThrをIleで置換するように、lysC遺伝子中でヌクレオチドを置換することを含んでいた。染色体DNA(ATCC13032)をPCR反応の鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号61および配列番号62を用いて、製造業者の記載情報に基づきPfu-Turbo PCR Systems (Stratagene USA)を用いて、lysCを増幅した。
5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3'
配列番号62
5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3'
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。増幅した断片は、その5’末端をSalI制限酵素で切断し、その3'末端をMluI制限酵素で切断することによりフランクにした。クローニングする前に、増幅した断片をこれら2つの制限酵素で消化し、そしてGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて精製した。
コリネバクテリウム・グルタミクム lysC遺伝子の突然変異生成
コリネバクテリウム・グルタミクム lysC遺伝子を、Quick-Change Kit (Stratagene/USA) を製造業者の記載情報のとおり用いて、特異的に突然変異生成させた。突然変異生成は、pCIS lysC(配列番号64)プラスミド内で行った。Quick-Change方法 (Stratagene)を用いて311位のThrを311位のIleで置換するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した:
配列番号65
5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3'
配列番号66
5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3'
これらのオリゴヌクレオチドプライマーをQuick-Change反応に使用し、lysC遺伝子(配列番号67)の932位のヌクレオチドを(CからTへ)置換した。lysC遺伝子中のアミノ酸置換(311位のThr→Ile)は、E.coli XL1-blueの形質転換およびプラスミドの調製後に、配列決定反応により確認した。プラスミドはpCIS lysC Thr311Ileとして示され、配列番号68に示す。
プラスミドpCIS Peftu ddhの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032 染色体DNAをTauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら(1994) Microbiology 140:1817-1828により調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号69 (Old38)および配列番号70 (Old 39)、鋳型として染色体DNAおよびPfu Turbo ポリメラーゼ (Stratagene)を用いて、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法によってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、EFTu遺伝子の非コーディング5’領域 (発現ユニット領域)由来の約200塩基対のDNA断片(Peftu)を増幅した。
ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT
配列番号70 (Old 39)
TGTATGTCCTCCTGGACTTC
得られた約200 bpのDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
GAAGTCCAGGAGGACATACAATGACCAACATCCGCGTAGC
Old 37 (配列番号72)
GAAACCACACTGTTTCCTTGC
得られた上記2つの断片を、さらなるPCR反応にて鋳型として共に使用した。PCR反応の過程で、オリゴヌクレオチドプライマーOld40(配列番号71)を用いて導入されたPeftu-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的なDNA鎖を生じさせる。標準的方法に関しては、使用したオリゴヌクレオチドプライマーOld37およびOld 38(配列番号72および配列番号69)を2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC
配列番号74 (Old33)
ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG
増幅したDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素MluIおよびNcoI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。その後、約720塩基対のDNA断片をGFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した(5’ dhh断片に相当する)。
pCIS PeftuPsod ddhの調製
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032染色体DNAを、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828のとおり調製した。配列番号76および配列番号77のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene)を使用して、Innisら (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press (1990))に記載の標準的方法によりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、ddh遺伝子の5’領域由来の約677塩基対のDNA断片を増幅した(5’dhh断片)。
CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC
配列番号77 (CK466)
GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA
得られたDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。続いて、制限酵素AatIIおよびMunI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、そしてゲル電気泳動で分画した。その後、約661塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いて、アガロースから精製した。得られた断片は、dhh ORFの5’領域を含む。
CGCCAATTGTCGAGGGCCGTTACCCT
配列番号79 (CK463)
GCTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTA
得られた約378塩基対のDNA断片を、GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification Kitを製造業者の記載情報のとおり用いて、精製した。
TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC
配列番号81 (CK467)
AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA
得られた上記2つの断片(PeftuPsodカセットおよびddh ORF)を、さらなるPCR反応において鋳型として共に使用した。PCR反応の過程で、配列番号80 (CK464)のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて導入されたPsod-相同性配列は前記2つの断片を互いに結合させ、ポリメラーゼにより伸長され、連続的なDNA鎖を生じさせる。標準的方法に関しては、使用した配列番号79 (CK426)および配列番号81 (CK467)のオリゴヌクレオチドプライマーを2サイクル目の開始時に反応混合物に加える点のみを改良した。
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh株およびATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh株の作製
E. coli株 Mn522 (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)の細胞を、プラスミドpCIS Peftu ddhおよびpCIS PeftuPsod ddhのいずれか、またプラスミド pTc15AcglMを用いて、Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303のとおりに形質転換した。pTc15AcglMプラスミドは、コリネバクテリウム・グルタミクムのメチル化パターンに従って、DNAをメチル化することができる(DE 10046870)。このメチル化により、コリネバクテリウム・グルタミクム細胞中のpCIS Peftu ddhおよびpCIS PeftuPsod ddhプラスミドの安定性が向上する。次に、プラスミドDNAをMn522細胞から標準的方法により単離し、そしてエレクトロポーレーション法により上記コリネバクテリウム・グルタミクム株 ATCC 13032 ask (fbr)に導入した。このエレクトロポーレーションおよび後続のカナマイシン (25μg/ml)含有CMプレー上での選択により、複数のトランスコンジュガント(transconjugant)を生じた。ベクターの切除を必要とする第2の組換え事象について選択するために、該トランスコンジュガントはカナマイシンを含まないCM培地で一晩生育し、続いて選択のため10%スクロース含有CMプレート上にプレーティングした。pCISベクター上に存在するsacB遺伝子は酵素レバンスクラーゼをコードし、スクロース上で成長し、レバンの合成を導く。レバンはコリネバクテリウム・グルタミクムに対し毒性があるので、第2の組換えステップにより組み込みプラスミドを失ったコリネバクテリウム・グルタミクム細胞のみがスクロース含有培地上で成長した(Jaegerら, Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466)。100個のスクロース耐性クローンをそのカナマイシン感受性について調べた。試験した複数のクローンでは、スクロースに対する耐性に加え、ベクター配列の所望な切除に伴うと予測されるカナマイシンへの感受性も検出された。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して、PeftuまたはPeftuPsod発現ユニットが所望されるように取込まれたか否かを確認した。PCRの最後に、特定のクローンを寒天プレートから爪楊枝を使用して取り出し、100μlの水に懸濁し、そして95℃で10分間煮沸した。得られた10μlの溶液をその都度、PCRの鋳型として使用した。使用したプライマーは、導入される発現ユニットおよびddh遺伝子と相同的なオリゴヌクレオチドであった。PCR条件は以下のとおり選択した:最初の変性:95℃で5分間;変性:95℃で30秒間;ハイブリダイゼーション:55℃で30秒間;増幅:72℃で2分間;30サイクル:最後の伸長:72℃で5分間。開始株のDNAを含む反応混合物では、オリゴヌクレオチドを選択してもいかなるPCR産物も産生しなかった。第2の組換えの結果として、PeftuまたはPeftuPsod発現ユニットがddh遺伝子の5'末端と隣接して組み込まれた場合にのみ、クローンのバンドが得られると予測された。ここで、試験で陽性だったクローンに組み込むことができた場合には、さらに(例えばSambrookら (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載の標準的方法により)サザンブロット解析による確認も行った。ここで、制限酵素を用いて2つの異なる加水分解を、作製しようとする株それぞれについて行った。この加水分解により、開始株(ATCC13032 ask (fbr))と所望の株を明確に区別することができる。さらに、得られた株は染色体にカナマイシン遺伝子を含まないという事実を、カナマイシン耐性遺伝子と相同的なプローブを用いて確認した。このように、以下の株を作製した:
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC13032 lysCfbr PeftuPsod ddh
これらの株は全てフィードバック調節を解除するask遺伝子を含んでいるので、リシンを産生する。これらは、ddh遺伝子の転写を制御する調節ユニットのみが互いに異なる。
リシン産生における二重プロモーターによるddh増強効果
二重プロモーターを用いたddh遺伝子の増強効果について調べるため、次の株をリシン産生について調べた。
ATCC13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC13032 lysCfbr Peftu Psod ddh
この目的のため、株はCMプレート(10.0 g/L D-グルコース、2.5 g/L NaCl、2.0 g/L 尿素、10.0 g/L Bacto Peptone (Difco)、5.0 g/L 酵母エキス(Difco)、5.0 g/L牛肉エキス(Difco)、22.0 g/L寒天(Difco)、20分間121℃で加熱滅菌)上で、30℃で3日間生育した。その後、細胞をプレートから擦り取り、生理食塩水に再懸濁した。100 ml三角フラスコ中にて、主培養液(10 mlの培養液Iおよび0.5 gの加熱滅菌したCaCO3 (Riedel de Haen))に、OD600が1.5になるように細胞懸濁液を接種し、そしてInfors AJ118 (Infors, Bottmingen, Switzerland)にて220 rpm、40時間インキュベートした。その後、培養液中へ分泌されたリシンの濃度を測定した。
40 g/l スクロース
60 g/l (100%糖成分に基づく)糖蜜
10 g/l (NH4)2SO4
0.4 g/l MgSO4*7H2O
0.6 g/l KH2PO4
0.3 mg/l チアミン*HCl
1 mg/l ビオチン(濾過滅菌し、NH4OHでpH 8.0に調製した1 mg/mlの原液から)
2 mg/l FeSO4
2 mg/l MnSO4
NH4OHでpH 7.8に調製し、加熱滅菌した(121℃、20分間)。
Claims (12)
- 以下の式I:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3' (I)
(式中、
nは0〜10の整数であり、
AxおよびAyは、同一または異なり、かつ化学結合またはリンカーの核酸配列であり;
P1、PxおよびPyは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ結合部分を含む、同一のまたは異なるコリネフォルム細菌に由来する同一のまたは異なるプロモーター配列をコードし;また
少なくともPyは、リボソーム結合媒介性3'末端配列部分を含む)
の配列モジュールを5'から3'方向に含む、多重プロモーター含有型組換発現ユニットであって、ここでP 1 、P x およびP y は、互いに独立して、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4の中から選択される、発現ユニット。 - 以下の式II:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3' (II)
(式中、
n、Ax、Ay、P1、PxおよびPyは、上記に定義されるとおりであり、かつ
Gは、5'上流の調節配列に機能的に連結された少なくとも1つのコーディング核酸配列である)
の配列モジュールを5'-3'方向に含む、発現カセットであって、
ここでP 1 、P x およびP y は、互いに独立して、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4の中から選択される、発現カセット。 - Gが、以下:
a) タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
b) ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
c) 有機酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
d) 脂質および脂肪酸の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
e) ジオールの生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
f) 炭水化物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
g) 芳香族化合物の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
h) ビタミンの生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
i) 補因子の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;
j) 酵素の生合成経路のタンパク質をコードする核酸;および
k) 中央代謝のタンパク質をコードする核酸、
から選択される、請求項2に記載の発現カセット。 - 核酸が、以下:
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子LuxR、転写調節因子LysR1、転写調節因子LysR2、リンゴ酸キノンオキシドレダクターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニン-γ-シンターゼ、シスタチオニン-β-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニン輸送担体、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性、スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンNADPレダクターゼ、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655調節因子、RXN2910調節因子、アルギニルtRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質(threonine efflux protein)、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質RXA077、硫酸還元タンパク質RXA248、硫酸還元タンパク質RXA247、OpcAタンパク質、1-ホスホフルクトキナーゼ、6-ホスホフルクトキナーゼ、テトラヒドロピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニルアミノケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、ホスホグリセレートムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびリンゴ酸酵素、
から選択される、アミノ酸生合成経路のタンパク質をコードする、請求項3のa)に記載の発現カセット。 - 請求項2〜4のいずれか1項に記載の発現カセットを少なくとも1つ含むベクター。
- 請求項5に記載のベクターの少なくとも1つで形質転換されているか、または請求項2〜4のいずれか1項に記載の発現カセットを少なくとも1つ含む、遺伝子改変微生物。
- コリネフォルム細菌に由来する、請求項6に記載の遺伝子改変微生物。
- コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌に由来する、請求項7に記載の遺伝子改変微生物。
- 統合型発現カセットを少なくとも1つ含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
- 請求項6〜9のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を培養すること、および該培養物から所望の産物を単離することを含んでなる、生合成産物の調製方法。
- 前記生合成産物が、有機酸、タンパク質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、酵素およびタンパク質のなかから選択される、請求項10に記載の方法。
- 産物の生合成を調節するための、請求項1に記載の発現ユニットの使用。
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