KR20070092745A - 다중 프로모터 및 유전자 발현을 위한 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중 프로모터 및 이들을 포함하는 발현 유닛; 유전자의 전사 및 발현 조절을 위한 그의 용도; 상기 종류의 다중 프로모터 또는 발현 유닛을 포함하는 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 상기 종류의 벡터 및(또는) 발현 유닛을 포함하는 유전적으로 변형된 미생물; 및 상기 유전적으로 변형된 미생물의 배양에 의한 생합성 산물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

다중 프로모터 및 유전자 발현을 위한 그의 용도 {MULTIPLE PROMOTERS AND THE USE THEREOF FOR GENE EXPRESSION}
본 발명은 다중 프로모터 및 이를 포함하는 발현 유닛, 유전자의 전사 및 발현 조절을 위한 그의 용도, 상기 종류의 다중 프로모터 또는 발현 유닛을 포함하는 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터, 상기 종류의 벡터 및(또는) 발현 유닛을 포함하는 유전적으로 변형된 미생물 및 상기 유전적으로 변형된 미생물의 배양에 의한 생합성 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
다양한 생합성 산물이 자연 대상 과정에 의해 세포에서 생산되며, 식료품, 사료, 화장품, 먹이, 식품 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업 분야에서 사용되고 있다. 정밀 화학물질/단백질로 총칭되는 이들 물질들은 특히 유기산, 단백질원성 (proteinogenic) 아미노산 및 비단백질원성 아미노산 둘 모두, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자 (cofactor), 및 단백질 및 효소를 포함한다. 이들은, 가장 편리하게는, 각각의 경우에 요구되는 특정 물질을 다량으로 생산 및 분비하도록 개발된 세균 균주 또는 다른 미생물의 성장에 의해 대규모로 생산된다. 이러한 목적에 특히 적합한 유기체는 코리네형 세균, 그람 양성 비-병원성 세균이다.
아미노산은 코리네형 세균 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 제조되는 것으로 알려져 있다. 이는 매우 중요하기 때문에, 생산 공정을 개선하기 위한 작업이 계속 이루어져 왔다. 공정 개선은 발효 기술 수단, 예를 들면 교반 및 산소 공급; 영양 배지의 조성, 예를 들면 발효 중의 당 농도; 생성물 제공을 위한 마무리 처리, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 또는 분무 건조; 또는 미생물 고유의 성능 특성과 관련될 수 있다.
마찬가지로, 재조합 DNA 기술 방법이 개별 유전자를 증폭시켜 정밀 화학물질/단백질 생산에 대한 효과를 연구함으로써, 정밀 화학물질/단백질을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키기 위해 수년간 이용되어 왔다.
정밀 화학물질, 아미노산 또는 단백질의 생산 공정을 개발하기 위한 다른 방법, 또는 정밀 화학물질, 아미노산 또는 단백질을 생산하는 기존 공정의 생산성을 증가 또는 개선시키기 위한 다른 방법은 하나 이상의 유전자의 발현을 증가 또는 변경시키고(시키거나) 적합한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 mRNA 번역에 영향을 끼치는 것을 포함한다. 이와 관련하여, "영향"은 유전자 발현의 증가, 감소, 또는 연대별 발현 패턴과 같은 다른 파라미터를 포함할 수 있다.
세균 조절 서열의 다양한 구성 성분은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 오퍼레이터(operator)라고도 지칭되는 조절인자(regulator)에 대한 결합 부위, -35 및 -10 영역으로 지칭되는 RNA 폴리머라제 전효소에 대한 결합 부위, 및 리보좀 결합 부위 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열로 지칭되는 리보좀 16S RNA에 대한 결합 부위로 구분되어 있다.
문헌 [E. coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press]에는, 샤인-달가노 서열의 폴리뉴클레오티드 서열의 조성, 염기의 서열뿐만 아니라, 샤인-달가노 서열에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열의 출발 코돈까지의 거리도 또한 번역 개시 속도에 상당한 영향을 끼친다고 보고되어 있다.
프로모터 활성을 갖는 핵산 서열은 다양한 방식으로 mRNA 형성에 영향을 끼칠 수 있다. 그 활성이 유기체의 생리학적 증식기와는 무관한 프로모터를 구성적(constitutive) 프로모터라고 지칭한다. 다른 프로모터는 또한, 산소, 대사산물, 열, pH 등과 같은 외부의 화학적 및 물리적 자극에 반응한다. 한편, 다른 프로모터들은 상이한 증식기에서는 프로모터 활성의 강도도 달라지는 것으로 나타났다. 미생물의 대수 증식기 동안, 또는 달리 정확하게는 미생물 증식의 정지기에서 두드러지게 현저한 활성을 나타내는 프로모터가 상기 문헌에 기재되어 있다. 프로모터의 두 가지 특성은 모두 대사 경로에 따라 정밀 화학물질 및 단백질 생산에 대한 생산성에 유익한 효과를 나타낼 수 있다.
이미 코리네박테리움 종에서는 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 단리할 수 있었다. 이들 조절된 프로모터는 세포의 내부 및(또는) 외부 조건에 따라 유전자가 전사되는 속도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 몇몇 경우에는, 인듀서(inducer)로 공지된 특정 인자의 존재가 프로모터로부터 전사 속도를 촉진시킬 수 있다. 인듀서는 프로모터로부터 전사에 직접 또는 간접적으로 영향을 끼칠 수 있다. 서프레서(suppressor)로 공지되어 있는 또다른 종류의 인자는 프로모터로부터 전사를 감소 또는 억제할 수 있다. 인듀서와 마찬가지로, 서프레서 또한 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 그러나, 온도에 의해 조절되는 프로모터가 또한 공지되어 있다. 따라서, 상기 프로모터의 전사 수준은 예를 들면 성장 온도를 정상적인 세포 성장 온도보다 높게 증가시킴으로써 증가 또는 감소시킬 수 있다.
지금까지 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)으로부터 소수의 프로모터가 문헌에 기재된 바 있다. 씨. 글루타미쿰 말레이트 신타제 유전자의 프로모터는 DE-A-44 40 118에 기재되어 있다. 이 프로모터는 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 상류에 삽입되어 있다. 이러한 구성체를 코리네형 세균에 형질전환시킨 후에, 프로모터 하류의 구조 유전자의 발현이 조절된다. 구조 유전자의 발현은 대응하는 인듀서를 배지에 첨가한 직후에 유도된다.
문헌 [Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999)]에서는 씨. 글루타미쿰으로부터의 pta-ack 프로모터와 리포터 유전자 (클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제) 사이의 전사 융합체를 기재하고 있다. 이러한 전사 융합체를 포함하는 씨. 글루타미쿰의 세포는 아세테이트-포함 배지 상에서 증식시켰을 때 리포터 유전자의 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 이에 반해, 글루코스 상에서 증식시킨 형질전환된 세포에서는 상기 리포터 유전자의 발현이 증가되지 않는 것으로 나타났다.
문헌 [Patek et al., Microbiology 142:1297 (1996)]에서는 씨. 글루타미쿰 세포에서 리포터 유전자의 발현을 향상시킬 수 있는 씨. 글루타미쿰으로부터의 몇몇 DNA 서열을 기재하고 있다. 씨. 글루타미쿰 프로모터에 대해 컨센서스 서열을 규정하기 위해 상기 서열들을 서로 비교하였다.
유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 씨. 글루타미쿰으로부터의 추가의 DNA 서열이 WO 02/40679에 기재되어 있다. 이들 단리된 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 발현 유닛이다. 상기 국제특허 출원 공개는 또한, 그 위에서 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 발현 유닛이 이종 유전자와 연결되는 재조합 플라스미드를 기재하고 있다. 상기 공개에 기재된, 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터와 이종 유전자를 융합시키는 방법은 특히 아미노산 생합성 유전자를 조절하는데 사용될 수 있다.
보다 오래된, 이전에 공개되지 않은 특허 출원 DE-A-103 59 594, DE-A-103 59 595, DE-A-103 59 660 및 DE-A-10 2004 035 065는 씨. 글루타미쿰으로부터의 특수한 단일 프로모터를 개시한 바 있다.
<발명의 개요>
본 발명은 출발 프로모터에 비해 유리한 특성, 예를 들어 증가 또는 변경된 전사 활성 및(또는) 번역 활성을 갖는 이용가능한 추가의 조절성 핵산 서열, 특히 프로모터 구성체 및(또는) 발현 유닛을 제조하고자 하는 목적에 기초로 한 것이다
상기 목적은 본 발명에 따라 5'-3' 방향으로 하기 화학식 I의 서열 모듈을 포함하는, 다중 프로모터-포함 발현 유닛을 제공함으로써 달성되었다:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'
여기서, n은 0 내지 10의 정수이고,
Ax 및 Ay는 동일하거나 상이하고, 화학 결합 또는 링커 핵산 서열이고;
P1, Px 및 Py는 적어도 하나의 RNA 폴리머라제 결합 영역, 예를 들어 코어 영역을 포함하는 동일하거나 상이한 프로모터 서열을 코딩하고; 적어도 Py는 리보좀 결합-매개 3' 말단 서열 섹션을 포함한다. P1 및 개개의 또는 모든 Px는 또한 서로 독립적으로 리보좀 결합을 매개하는 상기 종류의 서열 섹션을 가질 수 있다.
한 실시태양에 따르면, P1, Px 및 Py는 동일하거나 상이한 진핵 또는 특히 원핵 유기체로부터 유도된다. 인공 프로모터도 이용가능하다.
바람직한 실시태양에 따르면, P1, Px 및 Py는 각각의 경우에 단백질, 예를 들어 상기 유기체의 게놈에서 유기체의 생합성 경로에 관련되는 단백질의 코딩 서열의 5' 상류에 위치하는, 35 내지 500 뉴클레오티드 잔기, 바람직하게는 35 내지 300 뉴클레오티드 잔기, 보다 바람직하게는 35 내지 210 뉴클레오티드 잔기, 특히 더 바람직하게는 35 내지 100 뉴클레오티드 잔기의 연속적인 서열로부터 유도될 수 있다.
또다른 실시태양에 따르면, 발현 유닛의 P1, Px 및 Py는 코리네형 세균으로부터 유도된다.
바람직한 실시태양에 따르면, 발현 유닛의 P1, Px 및 Py는 진핵 또는 원핵 유기체, 특히 코리네형 세균, 예를 들어 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속 중의 하나, 예를 들어 표 3의 리스트에 따른 종 또는 균주에서 높은 풍부도 (abundance)를 갖는 단백질의 코딩 서열을 위한 프로모터 서열 중에서 서로 독립적으로 선택된다.
또한, 개개의 또는 모든 상기 프로모터 서열은 표 1에 나열되고 유기체의 아미노산 생합성에 관련되는 단백질의 코딩 서열을 위한 프로모터 서열 중에서 선택될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 발현 유닛의 적어도 하나의 프로모터는 이와 관련하여 본원에서 규정되는 높은 풍부도를 가져야 한다.
또다른 바람직한 실시태양에 따르면, 발현 유닛의 P1, Px 및 Py는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열 중에서 서로 독립적으로 선택되거나, 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 서열 1 (pGRO), 서열 2 (pEFTs), 서열 3 (pEFTu) 및 서열 4 (pSOD)로부터 유도된다.
또다른 실시태양에 따라, 발현 유닛의 P1, Px 및 Py는 강력한, 구성적 또는 조절가능 프로모터로부터 서로 독립적으로 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은 5'-3' 방향으로 하기 화학식 II의 서열 모듈을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다:
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3'
여기서, n, Ax, Ay, P1, Px 및 Py는 상기 정의한 바와 같고,
G는 5' 상류 조절 서열에 기능적으로 또는 작동적으로 연결되는 적어도 하나의 코딩 핵산 서열이다.
발현 카세트의 바람직한 실시태양에 따르면, G는
a) 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
b) 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
c) 유기산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
d) 지질 및 지방산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
e) 디올의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
f) 탄수화물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
g) 방향족 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
h) 비타민의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
i) 보조인자의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
j) 효소의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 및
k) 중추 대사의 단백질을 코딩하는 핵산
중에서 선택된다.
발현 카세트의 특히 바람직한 실시태양에 따르면, G는 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 조절인자 LuxR, 전사 조절인자 LysR1, 전사 조절인자 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 (exporter) 캐리어 (carrier), 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신 술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 조절인자, RXN2910 조절인자, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, OpcA 단백질, 1-포스포프럭토키나제 및 6-포스포프럭토키나제, 테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노트랜스퍼라제, 숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제, 피루베이트 키나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제, 말레이트 효소 중에서 선택되는, 아미노산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산 중에서 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은 상기한 발현 카세트의 적어도 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 상기한 벡터로 형질전환되거나 적어도 하나의 상기한 발현 카세트를 바람직하게는 통합된 형태로 포함하는 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.
한 실시태양에 따르면, 유전적으로 변형된 유기체는 코리네형 세균으로부터 유도된다.
바람직한 실시태양에 따르면, 유전적으로 변형된 유기체는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 세균으로부터 유도된다.
추가의 측면에 따르면, 본 발명은 상기한 유전적으로 변형된 임의의 미생물을 배양하고 배양액으로부터 목적하는 생성물을 단리하는 것을 포함하는 생합성 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 한 실시태양에 따르면, 생합성 산물은 유기산, 단백질, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 효소 및 단백질 중에서 선택된다. 특히 더욱 바람직한 생합성 산물은 리신, 메티오닌, 트레오닌 및 트레할로스이다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 생성물 생합성을 조절하기 위한 본 발명의 발현 유닛의 용도에 관한 것이다.
도 1은 예시적인 실시태양에서 설명된 다중 프로모터 제조에 사용된, 4개의 프로모터의 특정 서열을 도시한 것이다. pEFTu (도 1A); 프로모터 pGRO (도 1B), 프로모터 pEFTs (도 1C) 및 프로모터 pSOD (도 1D)의 프로모터 서열이 제시되어 있다. 2개의 서열을 각각의 프로모터에 대해 제시하고, 각각의 경우에 보다 긴 서열 (상부 서열)은 굵은 이탤릭체로 표시된 리보좀 결합 부위 (RBS)를 포함하는 완전한 프로모터 서열을 나타낸다. 본 발명의 다중 프로모터 구성체에서 특정 프로모터의 3' 말단 배열의 경우, 각각의 경우에 보다 긴 뉴클레오티드 서열 (RBS 포함)을 사용하는 것이 바람직하다. 3' 말단 프로모터 유닛의 5' 상류의 프로모터 서열은 임의의 RBS를 포함하지 않고, 각각의 경우에 제2 위치에 나타낸 말단 절단 (truncated) 핵산 서열 (RBS 미포함)에 사용된다. 또한, 보다 짧은 프로모터 서열에는, 적절한 경우, 굵은 대문자로 나타낸 3' 말단 부분 서열이 결여될 수 있다. 효능있는 "-10 영역"은 밑줄로 표시하였다.
I. 일반적인 정의:
"생합성 산물"은 본 발명의 목적을 위해 세포에서 천연 대사 과정 (생합성 경로)을 통해 생산되는 것을 의미한다. 이들은 특히 식료품, 사료, 화장품, 먹이, 식품 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업 분야에서 사용된다. 정밀 화학물질/단백질로 총칭되는 상기 물질은 특히 유기산, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 및 또한 단백질 및 효소를 포함한다.
본 발명에 따르면, "프로모터", "프로모터 활성을 갖는 핵산" 또는 "프로모터 서열"은 전사시킬 핵산에 기능적으로 연결되어 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.
"단일 프로모터"로 명시적으로 언급되지 않는 한, 용어 "프로모터"는 본 발명에 따라 문맥상, 전사되는 핵산에 기능적으로 연결될 때 핵산의 전사를 각각 조절할 수 있는 하나 초과의 핵산 서열의 순차적 배열 (즉, "다중 프로모터")을 포함한다.
용어 "단일 프로모터"는 따라서 전사되는 핵산의 전사를 조절할 수 있는, 전사되는 핵산에 기능적으로 연결될 때 핵산을 전사시킬 수 있는 단일 핵산 서열을 의미한다.
"다중 프로모터"의 경우에, 전사되는 핵산에 기능적으로 연결될 때 핵산의 전사를 각각 조절할 수 있는 적어도 2개의 동일하거나 상이한 핵산 서열 (단일 프로모터)이, 임의로 상기 핵산 서열 중의 하나로부터의 전사 개시가 상기 전사되는 핵산을 포함하는 전사체를 생산할 수 있도록 순차적으로 연결된다. 이와 관련하여, 프로모터 기능이 없는 추가의 서열, 예를 들어 하나 이상의 제한 절단 부위를 갖는 링커가 각각의 경우에 2개의 단일 프로모터 사이에 삽입될 수 있다. 임의로, 각각의 경우에 2개의 단일 프로모터는 또한 서로 직접 연결될 수도 있다. 상기 다중 프로모터는 바람직하게는 특히 프로모터의 3' 말단의 영역에 단지 하나의 리보좀 결합 부위 (RBS)를 포함한다.
"높은 풍부도"를 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 위한 프로모터 서열은 특히 "강력한 프로모터"를 의미한다. 유전자를 증강시키기 위해 다중 프로모터를 사용하고자 할 경우에는, 상기 강력한 프로모터를 적합한 방식으로 조합하는 것이 바람직하다. 강력한 프로모터는 유기체의 대부분의 유전자보다 해당 유전자가 RNA 폴리머라제에 의해 보다 빈번하게 해독되도록 유전자의 전사를 조절한다. 대부분의 경우에, 강력한 프로모터가 존재하면 다량의 전사체가 세포에 존재할 수 있다. 상기 전사체의 비율이 다른 세포 전사체에 비해 더 클 때, 이를 "풍부한 (abundant) 전사체"로 칭한다. 세균에서, 전사체의 양 및 이에 의해 코딩되는 대응하는 단백질의 양은 대체로 밀접한 관련성이 있다. 즉, "풍부한 전사체"는 종종 "풍부한 단백질"을 생성시킨다. 강력한 프로모터를 단백질의 풍부도를 통해 확인하는 방법을 예를 들어 아래에서 설명한다. 방법 절차에 대한 상세한 설명 및 추가의 언급은 예를 들어 문헌 [Proteomics in Practice - A Laboratory Manual of Proteome Analysis (Authors: R. Westermeier, T. Naven; Publisher: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002)]에서 볼 수 있다. 세균 세포를 붕괴시키고, 세포 추출물의 단백질을 2D 겔 전기영동에 의해 분획화시킨다. 이어서, 단백질을 통상적인 방법, 예를 들어 쿠마시 (Coomassie), 은 또는 형광 염료 염색에 의해 염색한다. 개개의 단백질 스폿 (spot)을 추후 정량할 수 있도록 단백질의 과다염색은 방지하여야 한다. 이어서, 겔을 스캐닝하고, 얻은 영상을 적합한 소프트웨어 (예를 들어 Melanie, 아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences))로 분석한다. 이를 위해, 모든 검출가능한 스폿을 먼저 확인하고, 스폿 부피를 측정한다. 모든 스폿 부피의 합은 1차 근사치로서 총 단백질에 대응한다. 이어서, 특히 큰 스폿 부피를 갖는 스폿을 영상 분석 소프트웨어로 선택할 수 있다. 예를 들어, 총 스폿 부피의 0.1%를 초과하는 부피의 스폿은 풍부한 것으로 칭할 수 있다. 이어서, 특히 풍부한 단백질을 포함하는 스폿을 겔에서 절단한다. 통상적으로, 겔 슬라이스에 존재하는 단백질은 이어서 단백질 분해에 의해 소화되고 (예를 들어 트립신으로), 생성되는 펩티드의 몰 질량을 예를 들어 MALDI-ToF MS (Matrix assisted laser desorption ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)로 결정한다. 이어서, 단백질의 트립신 분해 펩티드의 일부의 몰 질량을 기초로 하여, 대응하는 단백질 데이타베이스 검색으로 확인할 수 있다. 이것은 씨. 글루타미쿰, 이. 콜라이 및 많은 다른 세균에서와 같이 특히 연구되는 유기체의 게놈의 서열이 결정되었을 때 가능하다. 이어서, 상기 단백질을 코딩하는 ORF (개방 해독 프레임)을 상기 단백질의 확인을 기초로 하여 결정할 수 있다. 세균에서, 상기 유전자를 조절하는 프로모터는 대체로 출발 코돈의 바로 상류에 위치한다. 따라서, 강력한 프로모터는 종종 "풍부한" 단백질의 출발 코돈의 약 200 뉴클레오티드 상류의 영역에도 존재한다.
본 발명의 목적을 위해 "인공" 프로모터는 계내에서 전사 활성을 갖지 않고 또다른 서열 컨텍스트 (context)에서, 예를 들어 특히 본 발명의 발현 유닛 또는 발현 카세트의 컨텍스트에서 전사 활성인 프로모터 서열을 포함한다.
"프로모터 활성"은 본 발명에 따르면 특정 시간 내에 프로모터에 의해 형성되는 RNA의 양, 즉 전사 속도를 의미한다.
"특이적 프로모터 활성"은 각 프로모터에 대해 특정 시간 내에 프로모터에 의해 형성되는 RNA의 양을 의미한다.
유전자와 관련하여 야생형에 비해 "유발된" 프로모터 활성 또는 전사 속도의 경우에, 야생형에서 존재하지 않는 RNA의 형성이 유발된다.
유전자와 관련하여 야생형에 비해 "변경된" 프로모터 활성 또는 전사 속도의 경우에, 특정 시점에서 형성된 RNA의 양이 변경된다.
이와 관련하여 "변경된"은 바람직하게는 증가 또는 감소를 의미한다.
이와 관련하여 "기능적" 또는 "작동적" 연결은 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 임의의 핵산 및 전사되는 핵산 서열 및 적절한 경우 추가의 조절 성분, 예를 들어 핵산 전사를 확실하게 하는 핵산 서열, 및 예를 들어 상기 각각의 조절 성분이 상기 핵산 서열의 전사시에 그의 기능을 완료하도록 하기 위한 터미네이터 (terminator)의 순차적인 배열을 의미한다. 이것은 화학적 의미에서 반드시 직접 연결을 필요로 하는 것은 아니다. 유전자 조절 서열, 예를 들어 인핸서 서열은 더 먼 위치에서부터 또는 심지어 다른 DNA 분자의 표적 서열에 대해 그 기능을 수행할 수 있다. 두 서열이 서로 공유 결합으로 연결되도록 전사되는 핵산 서열이 본 발명의 프로모터 서열 뒤에 (즉, 프로모터 서열의 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 프로모터 서열과 유전자 도입 (transgenically) 발현되는 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200 염기쌍 미만, 특히 바람직하게는 100 염기쌍 미만, 특히 더 바람직하게는 50 염기쌍 미만이다.
본 발명에 따라 "리보좀 결합 부위" (RBS)의 서열 (또는 샤인-달가노 서열로도 칭함)은 번역 개시 코돈의 30개 염기 이하의 상류에 위치하는 A/G 풍부 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"전사"는 본 발명에 따르면 DNA 주형으로부터 출발하여 상보성 RNA 분자를 생산하는 과정을 의미한다. 상기 과정은 RNA 폴리머라제, "시그마 인자" 및 전사 조절성 단백질과 같은 단백질을 수반한다. 이어서, 합성된 RNA는 번역 과정에서 주형으로 기능하여 생합성 활성 단백질을 생성시킨다.
프로모터의 "코어 영역"은 본 발명에 따르면 적어도 하나의 효능있는 "-10 영역"을 포함하는, 약 20 내지 80, 또는 30 내지 60개의 뉴클레오티드의 연속적인 핵산 서열을 의미한다. 효능있는 -10 영역의 예는 개개의 바람직한 프로모터 서열에 대해 본원에서 설명된다 (특히 도 1을 참조). "-10 영역"은 TATA 박스 또는 프립나우-샬러 (Pribnow-Schaller) 서열로도 불린다. 사용되는 각각의 프로모터는 적어도 하나, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상기 효능있는 "-10 영역"을 포함하여야 한다. 코어 영역은 RBS의 5' 상류에 위치하고, RBS로부터 1 내지 200 또는 10 내지 150 또는 20 내지 100개의 뉴클레오티드 잔기의 거리에 위치할 수 있다.
"발현 유닛"은 본 발명에 따르면 본원에서 규정된 다중 프로모터를 포함하고 발현시킬 핵산 또는 유전자에 기능적으로 연결된 후에 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 발현 활성을 갖는 핵산을 의미한다. 따라서, 이와 관련하여 상기 핵산 서열은 "조절 핵산 서열"로도 불린다. 다중 프로모터 구성체 이외에, 추가의 조절 성분, 예를 들어 인핸서가 존재할 수 있다.
"발현 카세트"는 본 발명에 따르면 발현시킬 핵산 또는 발현시킬 유전자에 기능적으로 연결된 발현 유닛을 의미한다. 따라서, 발현 유닛과 달리, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 서열 뿐만 아니라 전사 및 번역의 결과로서 단백질로서 발현되는 핵산 서열을 포함한다.
"발현 활성"은 본 발명에 따르면 발현 카세트 또는 그의 발현 유닛에 의해 특정 시점에 형성되는 단백질의 양, 즉 발현 속도를 의미한다.
"특이적 발현 활성"은 본 발명에 따르면 각각의 발현 유닛에 대해 발현 카세트 또는 그의 발현 유닛에 의해 특정 시점에 형성되는 단백질의 양을 의미한다.
유전자에 대해 야생형에 비해 "유발된 발현 활성" 또는 발현 속도의 경우에, 야생형에서 상기 형태로 존재하지 않는 단백질의 형성이 유발된다.
유전자에 대해 야생형에 비해 "변경된 발현 활성" 또는 발현 속도의 경우에, 특정 시점에 형성된 단백질의 양이 변경된다. 이와 관련하여, "변경된"은 바람직하게는 증가 또는 감소를 의미한다. 이것은 예를 들어 돌연변이에 의한, 또는 자극 또는 억제에 의한 내인성 발현 유닛의 특이적 활성의 증가 또는 감소에 의해 발생할 수 있다. 변경된 발현 활성 또는 발현 속도는 또한 미생물에서 본 발명의 발현 유닛에 의한, 발현 유닛에 대해 이종성인 유전자의 발현을 조절함으로써 달성할 수 있다.
생합성 활성 단백질이 생산되는 "형성 속도"는 전사 및 번역 속도의 곱이다. 두 속도는 본 발명에 따라 영향받을 수 있고, 따라서 미생물에서 생성물/정밀 화학물질의 형성 속도에 영향을 줄 수 있다.
용어 "야생형"은 본 발명에 따르면 적절한 출발 미생물을 의미하고, 반드시 천연 유기체에 대응할 필요는 없다.
문맥에 따라, 용어 "미생물"은 본 발명의 출발 미생물 (야생형) 또는 유전적으로 변형된 미생물 또는 둘 모두를 의미할 수 있다.
바람직하게는, 특히 미생물 또는 야생형이 명확하게 지정될 수 없는 경우, "야생형"은 각각의 경우에 프로모터 활성 또는 전사 속도의 변경 또는 유발, 발현 활성 또는 발현 속도의 변경 또는 유발, 및 생합성 산물 함량의 증가에 사용된 "대조 유기체"를 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 "대조 유기체"는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 특이적 또는 비특이적 돌연변이에 의해 ATCC　13032로부터 유도된 미생물이다.
특히, 이미 목적하는 생성물 (정밀 화학물질/단백질)을 생산할 수 있는 사용되는 "출발 미생물"을 사용할 수 있다.
"유도된" 서열, 예를 들어 유도된 프로모터 서열은 본 발명에 따르면 다른 정보가 제시되지 않을 경우 출발 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%, 특히 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 의미한다.
두 핵산 사이의 동일성은 각각의 경우에, 특히 하기 파라미터를 설정한 클러스탈(Clustal) 방법 (문헌 [Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci.1989 Apr; 5(2):151-1])을 이용하여 벡터 NTI Suite 7.1 소프트웨어 (인포맥스 (Informax), 미국)를 사용하는 비교에 의해 계산된, 핵산의 완전한 길이에 걸친 뉴클레오티드의 동일성을 의미한다.
다중 배열 파라미터:
갭 개방 패널티 10
갭 신장 패널티 10
갭 분리 패널티 범위 8
갭 분리 패널티 오프 (off)
정렬 지연에 대한 동일성% 40
잔기 특이적 갭 오프
친수성 잔기 갭 오프
전치 중량(Transition weighing) 0
페어형(Pairwise) 정렬 파라미터:
FAST 알고리즘 온 (on)
K-터플 크기 (tuple size) 1
갭 패널티 3
윈도우 크기 5
최적 항의 수 5
"혼성화"는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 엄격한 조건 하에 실질적으로 상보성 서열에 결합하는 능력을 의미하며, 상기 조건 하에서는 비-상보성 파트너 사이에서 비특이적인 결합이 발생하지 않는다. 이를 위해, 서열은 바람직하게는 90 내지 100% 상보적이어야 한다. 상보성 서열이 서로 특이적으로 결합할 수 있는 특성은, 예를 들면 노던 (Northern) 또는 서던 (Southern) 블로팅 기술, 또는 PCR 또는 RT-PCR에서의 프라이머 결합에 사용된다.
본 발명에 있어서, "혼성화"는 엄격한 조건 하에 수행한다. 이러한 혼성화 조건은 예를 들면 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다. 엄격한 혼성화 조건은 특히 50% 포름아미드, 5xSSC (750　mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH　7.6), 5x덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 전단된 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 용액에서 밤새 42℃에서 인큐베이션한 후에, 필터를 65℃의 0.1xSSC로 세척하는 것을 의미한다.
"기능적으로 동등한 단편"은 출발 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 변경되거나 더 낮거나 더 높은 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열을 의미한다.
"본질적으로 동일한"은 출발 서열의 특이적 프로모터 활성의 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%의 특이적 프로모터 활성을 의미한다.
II. 발현 유닛, 발현 카세트 및 그의 성분
a) 발현 유닛
본 발명은 특히 5'-3' 방향으로 하기 화학식 I의 서열 모듈을 포함하는 다중 프로모터-포함 발현 유닛의 제공에 관한 것이다:
<화학식 I>
5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'
여기서, n은 0 내지 10의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고,
Ax 및 Ay는 동일하거나 상이하고, 화학 결합 또는 공유 결합이거나 화학적으로, 특히 공유 결합에 의해 통합된 링커 핵산 서열이고;
P1, Px 및 Py는 적어도 하나의 RNA 폴리머라제 결합 영역, 예를 들어, 코어 영역을 포함하는 동일하거나 상이한 프로모터 서열을 코딩하고; 적어도 Py는, 예를 들어 Py만이 리보좀 결합-매개 3' 말단 서열 섹션을 포함한다.
프로모터 서열 P1, Px 및 Py는 유기체의 생합성 경로에 관련되는 단백질을 코딩하는, 상기 유기체의 게놈으로부터의 서열로부터 유도될 수 있다. 여기서, 프로모터 서열은 상기 유기체의 게놈 내의 특정 단백질의 코딩 서열의 5' 상류에 20 내지 500 뉴클레오티드 잔기, 또는 20 내지 300 뉴클레오티드 잔기, 예를 들어 20 내지 210 뉴클레오티드 잔기, 특히 20 내지 100 또는 35 내지 100 뉴클레오티드 잔기의 거리로 위치한다.
프로모터 서열 P1, Px 및 Py가 유도될 수 있는 서열의 예는 하기 표 1에 나열된 유전자이다.
특정 프로모터 서열의 비제한적인 예는 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4, 및 도 1에 따른 핵산 서열로부터 유도되지만, 이로 제한되지는 않는다.
이와 관련하여, 서열 1은 GroES 샤퍼로닌 (Chaperonin) (pGRO)의 코딩 영역의 상류에 위치하는 서열에 대응하고, 서열 2는 단백질 연장 인자 TS (pEFTs)의 코딩 영역의 상류에 위치하는 서열에 대응하고, 서열 3은 단백질 연장 인자 TU (pEFTu)의 코딩 영역의 상류에 위치하는 서열에 대응하고, 서열 4는 수퍼옥시드 디스뮤타제 (pSOD)의 코딩 영역의 상류에 위치하는 서열에 대응하며, 이들은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된 것이다. 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4는 야생형 프로모터 서열에 대응한다.
"유도된" 서열은 본 발명에 따르면 출발 서열에 적어도 80% 또는 적어도 90%, 예를 들어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 특히 99% 동일한 서열을 의미한다. 상기 동일성 정도는 특정 프로모터의 상기 규정된 "코어 영역"에 특히 적용된다. 특정 코어 영역 외부의 동일성 정도는 더 낮을 수 있고, 0 내지 80%, 예를 들어 10 내지 80%, 20 내지 70%, 30 내지 60% 또는 40 내지 50%일 수 있다.
이용가능한 코어 영역은 예를 들어 pGRO의 경우에 서열 1의 위치 50 내지 80에; pEFTs의 경우에 서열 2의 위치 130 내지 170에; pEFTu의 경우에 서열 3의 위치 30 내지 110에; pSOD의 경우에 서열 4의 위치 50 내지 100에 존재한다.
본 발명의 발현 유닛은 특히 프로모터 활성을 갖는 2 이상의 핵산 서열을 포함하고,
a) 상기 핵산 서열은 바람직하게는 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4; 또는 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 다른 프로모터 서열 중에서 선택된 동일하거나 상이한 서열로부터 유도되고;
b) 적절할 경우, 하나 이상의 상기 핵산 서열은 바람직하게는 서열 1, 2, 3 또는 4 또는 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 다른 프로모터 서열 중에서 선택되는 서열에 대해 핵산 수준에서, 특히 코어 영역에서 적어도 80% 동일한, 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 역위 또는 결실 또는 부가에 의해 유도된 서열을 나타내거나,
c) 또는 적절한 경우, 하나 이상의 상기 핵산 서열은 서열 1, 2, 3 또는 4에 따른 핵산 서열 중의 하나에 및(또는) 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 다른 프로모터 서열에 상보성인 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하거나,
d) 또는 적절한 경우, 하나 이상의 상기 핵산 서열은 a), b) 또는 c)의 서열의 기능적으로 동등한 단편을 나타낸다.
본 발명의 다중 프로모터의 성분으로서 이용가능한 다른 천연 프로모터는 예를 들어 데이타베이스로부터의 핵산 서열과 상기한 서열 1, 2, 3 또는 4 또는 도 1에 따른 서열 또는 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 다른 프로모터 서열의 동일성을 비교함으로써 그의 게놈 서열이 알려진 상이한 유기체로부터 쉽게 확인할 수 있다.
추가의 적합한 천연 프로모터는 상기한 핵산 서열로부터 출발하여, 특히 서열 1, 2, 3 또는 4로부터 및(또는) 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 프로모터 서열로부터 출발하여 공지된 방법으로 혼성화 기술을 적용함으로써 그의 게놈 서열이 알려지지 않은 상이한 유기체로부터 쉽게 확인할 수 있다.
추가로 적합한 천연 프로모터는 또한 예를 들어 문헌 [Cadenas et al (1991) Gene 98, 117-121; Eikmanns et al, (1991) Gene 102, 93-98.; Patek et al (1996) Microbiology 142, 1297-1309 또는 Santamaria et al (1987) Gene 56, 199-208]에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 의해 단리할 수 있다. 이것은 대체로 관심있는 게놈으로부터의 게놈 단편이 그 내부로 삽입되는 프로모터 프로브 벡터의 사용을 수반한다. 이어서, 하류의 리포터 유전자, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 측정함으로써 개개의 단편의 프로모터 활성을 언급된 실험 과정에서 결정할 수 있다.
본 발명은 따라서 본원에서 언급되지 않은 프로모터의 조합을 포함한다. 또한, 이것은 문헌, 예를 들어 [Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191]에 기재된 바와 같이 공지의 단일 프로모터의 조합에도 적용된다.
본 발명은 따라서 본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛 내로 포함되기 위한 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관한 것으로서, 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산은 엄격한 조건 하에 서열 1, 2, 3 또는 4의 핵산 서열과 또는 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 프로모터 서열과 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열은 적어도 10, 바람직하게는 12, 15, 30, 50 초과, 또는 150 초과의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛에 포함시키기 위한 인공 프로모터 서열은 서열 1, 2, 3 또는 4 또는 도 1에 따른 서열로부터 및(또는) 비견할 수 있거나 보다 큰 풍부도를 갖는 유전자를 위한 프로모터 서열로부터 출발하여 인공 변이 및 돌연변이, 예를 들어 하나 이상의 개개의 또는 연속적인 뉴클레오티드 잔기의 부가, 치환, 삽입, 역위 또는 결실에 의해 쉽게 제조할 수 있다 (Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. bacteriol 181, 6188-6191 and references mentioned therein).
프로모터 서열 Py의 리보좀 결합-매개 3' 말단 서열 섹션의 적합한 예는 pGRO의 RBS인 GGAGGGA; pEFTs의 RBS인 AGGAGGA; pEFTu의 RBS인 AGGAGGA; 및 pSOD의 RBS인 GGAGGGA이다 (또한, 첨부된 도 1 참조). 이론적으로 최적의 RBS, 즉, 씨. 글루타미쿰 16S rRNA 상의 항-샤인-달가노 서열에 100% 상보성인 서열은 5' GAAAGGAGG 3'이다. 다른 적합한 RBS 서열 섹션은 예를 들어 인공 변이 및 돌연변이, 예를 들어 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 역위, 부가 또는 결실에 의해, 또는 데이타베이스의 프로모터 서열과의 상동성 비교를 통해 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛의 비제한적인 예는 다음 서열 중에서 선택된다:
e) 서열 45에서 위치 18 내지 390의 PeftuPsod; 서열 52에서 위치 18 내지 395의 PsodPeftu; 서열 55에서 위치 18 내지 369의 PgroPsod; 서열 59에서 위치 11 내지 538의 PgroPsodPefts; 서열 60에서 위치 11 내지 559의 PeftuPsodPefts를 코딩하는 서열; 또는
f) 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 역위, 부가 또는 결실에 의해 e)에 따른 서열로부터 유도되고 상기 출발 서열과 비교시에 핵산 수준에서 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열; 또는
g) 엄격한 조건 하에 e)에 상보성인 서열과 혼성화하는 핵산 서열; 또는
h) 상기한 서열 e), f) 및 g)의 "기능적으로 동등한 단편".
발현 유닛에 대해서 특히 실시태양 d) 및 h)에 따른 "기능적으로 동등한 단편"은 출발 서열과 동일하거나 이보다 높은 특이적 발현 활성을 본질적으로 갖는 단편을 의미한다.
"본질적으로 동일한"은 출발 서열의 특이적 발현 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%의 특이적인 발현 활성을 의미한다.
"단편"은 실시태양 a) 내지 h)에 기재된 서열의 부분 서열을 의미한다. 상기 단편은 바람직하게는 출발 서열의 10개 초과, 보다 바람직하게는 12, 15, 30, 50개 초과, 또는 특히 바람직하게는 150개 초과의 연속적인 뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 발현 유닛은 바람직하게는 -10 영역; 전사 개시, 인핸서 영역; 및 오퍼레이터 영역의 유전자 성분 중의 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 유전자 성분은 바람직하게는 리네박테리움 종, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰에 특이적이다.
세균 프로모터는 통상 3개의 RNA 폴리머라제 인식 부위, 즉 -10 영역, -35 영역 및 UP 성분으로 이루어진다. 상기 프로모터 성분은 이. 콜라이에서 고도로 보존되지만, 씨. 글루타미쿰에서는 보존되지 않는다. 이것은 특히 -35 영역에 적용된다. 따라서, 상기 영역은 가능한 경우에도 종종 신뢰할 수 없을 정도로만 서열로부터 유도될 수 있다. 또한, -10 영역은 AT 풍부 게놈을 포함하는 유기체에서보다 고도로 보존되지 않는다. 이전에 문헌에 기재된 컨센서스 서열은 TGNGNTA(C/T)AATGG 및 GNTANAATNG이다 (Patek et al (2003), J. of Biotechnology 104, 311-323; Vasicova et al. (1999) J. Bacteriol 181, 6188-6191).
고도의 변이성이 일반적으로 중등도 또는 높은 GC 함량을 갖는 세균 (예를 들어, 씨. 글루타미쿰)의 컨센서스 서열에서 발생한다는 사실이 공지되어 있다 (Bourn and Babb, 1995., Bashyam et al, 1996). 이것은 특히 -35 영역에 적용되고, 따라서 종종 예측할 수 없다. 이것은 예를 들어 문헌 [Patek et al (2003). J of Biotechnology 104, 325-334]에 기재되어 있다.
b) 발현 카세트
본 발명은 추가로 번역가능한 핵산 서열에 기능적으로 연결된 본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛에 관한 것이다. 유전자를 발현할 수 있는 상기 구성체는 본 발명의 목적을 위해 발현 카세트로도 불린다.
이와 관련하여 "기능적 연결"은 예를 들어 본 발명의 임의의 발현 유닛 및 유전자 도입에 의해 발현되는 핵산 서열 및 적절한 경우 추가의 조절 성분, 예를 들어 상기 핵산 서열의 유전자 도입에 의한 발현시에 그의 기능을 완료하도록 하기 위한 터미네이터의 순차적인 배열을 의미한다. 이것은 화학적 의미에서 반드시 직접 연결을 필요로 하는 것은 아니다. 유전자 조절 서열, 예를 들어 인핸서 서열은 더 먼 위치에서부터 또는 심지어 다른 DNA 분자의 표적 서열에 대해 그 기능을 수행할 수 있다. 두 서열이 서로 공유 결합으로 연결되도록 유전자 도입 발현되는 핵산 서열이 본 발명의 발현 유닛 서열 뒤에 (즉, 발현 유닛 서열의 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 발현 유닛 서열과 유전자 도입 발현되는 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200 염기쌍 미만, 특히 바람직하게는 100 염기쌍 미만, 특히 더 바람직하게는 50 염기쌍 미만이다.
본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 카세트는 본래의 발현 활성과는 상이한 발현 활성을 달성하여 목적하는 유전자의 발현을 미세 조절할 수 있다.
본 발명의 발현 유닛에 의한 미생물의 유전자 발현 조절은 바람직하게는
- 하나 이상의 내인성 유전자가 본 발명의 도입된 발현 유닛의 조절 하에 발현되도록, 적절한 경우 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 발현 유닛의 미생물의 게놈 내로의 도입; 또는
- 적절한 경우 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유닛 및 기능적으로 연결된, 발현시킬 하나 이상의 핵산, 즉 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 핵산 구성체의 미생물 내로의 도입
에 의해 달성된다.
본 발명의 발현 카세트에서, 발현시킬 유전자에 대한 발현 유닛의 물리적 위치는 상기 발현 유닛이 발현시킬 유전자의 전사, 및 바람직하게는 또한 번역을 조절하여 하나 이상의 단백질을 형성할 수 있도록 선택된다. 여기서, "형성할 수 있도록"은 상기 형성의 구성적 증가, 특정 조건 하에서 상기 형성의 약화 또는 차단 및(또는) 특정 조건 하에서 상기 형성의 증가를 포함한다. "조건"은 본원에서 (1) 배양 배지에 성분의 첨가, (2)　배양 배지로부터 성분의 제거, (3) 배양 배지 내의 성분을 다른 성분으로 교체, (4) 배양 배지의 온도의 증가, (5) 배양 배지의 온도 감소, 및 (6) 배양 배지가 유지되는 분위기 조건, 예를 들어, 산소 농도 또는 질소 농도의 조절을 포함한다.
c) 일반적인 정보:
프로모터 활성을 갖는 상기한 모든 핵산 및 발현 유닛 및 발현 카세트는 또한 뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 화학적 합성에 의해, 예를 들어 이중 나선구조의 개개의 중복되는 상보성 핵산 빌딩 블록의 단편 축합에 의해 공지의 방식으로 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 예를 들어 포스포아미다이트 방법을 사용하여 공지의 방법으로 수행할 수 있다 (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New　York, pp. 896-897). 합성 올리고뉴클레오티드의 조립 및 DNA 폴리머라제의 클레나우 (Klenow) 단편을 사용한 갭 충전 및 라이게이션 반응 및 일반적인 클로닝 과정은 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.
본 발명에 이용되는 방법 및 기술은 미생물학 및 재조합 DNA 기술 분야의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 세균 세포의 성장, 단리된 DNA 분자의 숙주 세포 내로의 수송 및 단리된 핵산 분자의 단리, 클로닝 및 서열결정 등을 위한 방법 및 기술은 상기 기술 및 방법의 예이다. 상기 방법은 표준 문헌의 많은 항목에 기재되어 있다 [Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg, Genes & Genome, University Science Books, Mill Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); 및 P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989)].
본 발명의 모든 핵산 분자는 바람직하게는 단리된 핵산 분자의 형태이다. "단리된" 핵산 분자는 상기 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 제거되고, 추가로, 재조합 기술에 의해 제조될 경우 본질적으로 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 존재하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명은 구체적으로 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보성인 핵산 분자, 또는 그의 섹션을 포함한다.
또한, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 다른 세포 종류 및 미생물에서 상동성 서열의 확인 및(또는) 클로닝을 위해 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 생성시킬 수 있다. 상기 종류의 프로브 및 프라이머는 대체로 엄격한 조건 하에 본 발명의 핵산 서열의 센스 스트랜드 또는 대응하는 안티센스 스트랜드의 적어도 약 12개, 바람직하게는 적어도 약 25개, 예를 들어 약 40, 50 또는 75개의 연속적인 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 소위 "사일런트" (silent) 돌연변이를 포함하거나, 또는 구체적으로 언급된 서열 및 이들의 천연 변이체, 예를 들면 스플라이스 (splice) 변이체 또는 대립유전자 변이체와 비교하였을 때 특정 공급원 또는 숙주 유기체의 코돈 사용 빈도에 따라 변경된 핵산 서열도 포함된다.
III. 발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 상기한 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 ["Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., editors, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에서 찾아볼 수 있다. 플라스미드 이외에도, 벡터는 당업자에게 공지된 다른 모든 벡터, 예를 들면 파지, 트랜스포존, IS 성분, 파스미드, 코스미드, 및 선형 또는 원형 DNA를 의미한다. 이들 벡터는 숙주 유기체에서의 자발적 복제 또는 염색체 복제를 수행할 수 있다.
바람직한 플라스미드는 특히 바람직하게는 코리네형 세균에서 복제되는 것이다. 수많은 공지의 플라스미드 벡터, 예를 들어 pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) 또는 pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991))은 크립틱 (cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1 기재의 것이다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pCLiK5MCS (실시예 1 참조), 또는 pCG4 (US-A 4,489,160), pNG2 (문헌 [Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)]) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891) 기재의 벡터가 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
염색체 내로의 통합에 의한 유전자 증폭 방법, 예를 들면 문헌 [Remscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기재된 hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭 방법에 사용될 수 있는 플라스미드 벡터가 또한 적합하다. 이 방법에서, 완전한 유전자는 숙주 (통상적으로는 이. 콜라이)에서는 복제될 수 있지만 씨. 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터에 클로닝된다. 적합한 벡터의 예로는 SUP301 (문헌 [Sirnon et al., Bio/Technology 1,784-791 (1983)]), pK18mob 또는 pK19mob (문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994), Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541 (1993)]), pEM1 (문헌 [Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]) 또는 pBGS8 (문헌 [Spratt et al., 1986, Gene 41:337-342])이 있다. 증폭시킬 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터는 이후에 형질전환에 의해 목적하는 씨. 글루타미쿰 균주로 전달된다. 형질전환 방법은 예를 들면 문헌 [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], [Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)] 및 [Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기재되어 있다.
IV. 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질
야생형에 비해 미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 번역 속도는 본 발명의 발현 유닛에 의해 상기 미생물에서 상기 발현 유닛에 대해 이종성인 유전자의 전사를 조절함으로써 변경되거나 유발될 수 있다.
이것은 바람직하게는
- 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내에 도입하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절한 경우에 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 조절 하에 일어나도록 하거나,
- 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 외인성 또는 내인성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성체를 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.
하나 이상의 유전자가 미생물의 게놈 내로 도입되어 하나 이상의 도입된 유전자가 본 발명의 핵산의 조절 하에 전사되는 경우, 유전자 또는 유전자들이 코딩 또는 비코딩 영역 내로 통합되도록 삽입될 수 있다. 삽입은 바람직하게는 비영역에서 발생할 수 있다.
이와 관련하여, 핵산 구성체는 염색체 내에 또는 염색체 외에 삽입될 수 있다. 핵산 구성체는 바람직하게는 염색체 내로 삽입된다. "염색체" 통합은 DNA 단편의 숙주 세포 염색체 내로의 삽입이다.
"내인성"은 야생형 게놈 (상기 정의된 바와 같은)에 이미 존재하는 유전 정보, 예를 들어 유전자를 의미한다.
"외인성"은 야생형 게놈에 존재하지 않는 유전 정보, 예를 들면 유전자를 의미한다. 외인성 유전 정보, 예를 들어 본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛은 야생형 균주의 게놈에 도입되어 유전적으로 변형된 균주를 생성시킨 후, 상기 유전 정보는 초기에 생성된 유전적 균주를 그의 자손체와 함께 비교하면 내인성이지만, 상기 유전 정보를 포함하지 않는 본래의 야생형 균주에 비교하면 외인성이다.
프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의한 전사의 조절과 관련하여, 용어 "유전자"는 바람직하게는 전사시킬 영역, 즉 예를 들면 번역을 조절하는 영역, 및 코딩 영역, 및 적절한 경우에 추가의 조절 성분, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 핵산을 의미한다.
본 발명의 발현 유닛에 의한 발현의 조절과 관련하여, 용어 "유전자"는 바람직하게는 코딩 영역, 및 적절한 경우에 추가의 조절 성분, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 핵산을 의미한다.
"코딩 영역"은 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.
프로모터 활성을 갖는 핵산 및 유전자와 관련하여, "이종성"은 사용되는 유전자가 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산의 조절 하에 야생형에서 전사되지 않지만, 야생형에서 발생하지 않는 새로운 기능적 연결기가 생성되고, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산과 특이적 유전자의 기능적 조합이 야생형에서 일어나지 않는 것을 의미한다.
발현 유닛 및 유전자와 관련하여, "이종성"은 사용되는 유전자가 본 발명의 발현 유닛의 조절 하에 야생형에서 발현되지 않지만, 야생형에서 발생하지 않은 새로운 기능적 연결을 생성하고, 본 발명의 발현 유닛과 특이적 유전자의 기능적 조합이 야생형에서 일어나지 않는 것을 의미한다.
미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 변경하거나 유발하는 본 발명의 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 유전자는 정밀 화학물질의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 상기 유전자는 적절한 경우에 추가의 조절 성분을 포함할 수 있다.
미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 변경 또는 유발하기 위한 상기 본 발명의 방법의 특히 바람직한 실시태양에서, 유전자는 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 및 효소의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산, 중추 대사의 단백질을 코딩하는 핵산 중에서 선택되고, 유전자는 적절한 경우에 추가의 조절 성분을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시태양에서, 단백질은 아미노산의 생합성 경로의 단백질, 즉 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 조절인자 LuxR, 전사 조절인자 LysR1, 전사 조절인자 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신 술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 조절인자, RXN2910 조절인자, 아르기닐-tRNA 신테타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, OpcA 단백질, 1-포스포프럭토키나제, 6-포스포프럭토키나제, 테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노트랜스퍼라제, 숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 글루코스-포스페이트 이소머라제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제, 피루베이트 키나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제, 및 말레이트 효소로부터 선택된다.
바람직한 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산은 각각 미생물 기원, 바람직하게는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 세균, 바람직하게는 코리네형 세균, 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰의 단백질 서열 및 핵산 서열이다.
특히 바람직한 단백질 서열 및 아미노산의 생합성 경로의 상기 단백질을 코딩하는 대응하는 핵산 서열의 예, 이에 대해 기재하고 있는 문헌 및 참고 문헌에서의 그의 명칭을 표 1에 나타낸다.
단백질 단백질을 코딩하는 핵산 참고 문헌 참고문헌의 서열
아스파르테이트 키나제 ask 또는 lysC EP1108790 DNA: 281단백질: 3781
아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제 asd EP1108790 DNA: 331단백질: 3831
디히드로디피콜리네이트신테타제 dapA WO 0100843 DNA: 55단백질: 56
디히드로디피콜리네이트 리덕타제 dapB WO 0100843 DNA: 35단백질: 36
메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 ddh EP1108790 DNA: 3494단백질　: 6944
디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 lysA EP1108790 DNA: 3451단백질: 6951
리신 엑스포터 lysE EP1108790 DNA: 3455단백질: 6955
테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라제 dapD EP1108790 DNA: 1229단백질: 4729
숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 dapC WO 0100843 DNA: 327단백질: 328
숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라제 dapE WO 0100843 DNA: 31단백질: 32
디아미노피멜레이트 에피머라제 dapF EP1108790 DNA: 2131단백질: 5632
아르기닐-tRNA 신테타제 argS EP1108790 DNA: 3450단백질: 6950
글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 zwf WO 0100844 DNA: 243단백질: 244
트랜스케톨라제 RXA2739 EP 1108790 DNA: 1740단백질: 5240
트랜스알돌라제 RXA2738 WO 0100844 DNA: 245단백질: 246
OpcA opcA WO 0100804 DNA: 79단백질: 80
6-포스포-글루코노락토나제 RXA2735 WO 0100844 DNA: 1단백질: 2
6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 EP1108790 DNA: 1605단백질: 5105
글루코스포스페이트 이소머라제 gpi WO 0100844 DNA: 41단백질: 42
말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 mqo WO 0100844 DNA: 569단백질: 570
글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 gap WO 0100844 DNA: 187단백질: 188
3-포스포글리세레이트키나제 pgk WO 0100844 DNA: 69단백질: 70
트리오스포스페이트 이소머라제 tpi WO 0100844 DNA: 61단백질: 62
1-포스포프럭토키나제 1 pfk1 WO0100844 DNA: 55단백질: 56
1-포스포프럭토키나제 2 pfk2 WO0100844 DNA: 57단백질: 58
6-포스포프럭토키나제 1 6-pfk1 EP 1108790 DNA: 1383단백질: 4883
6-포스포프럭토키나제 2 6-pfk2 DE 10112992 DNA: 1단백질: 2
프럭토스-1,6-비스포스파타제 1 fbr1 EP1108790 DNA: 1136단백질: 4636
피루베이트 옥시다제 poxB WO 0100844 DNA : 85단백질: 86
포스포글리세레이트 뮤타제 WO 0100844 DNA: 49단백질: 50
에놀라제 eno WO 0100844 DNA: 71단백질: 72
피루베이트 키나제 pykA WO 0100844 DNA: 75단백질: 76
피루베이트 키나제 pykA EP1108790 DNA: 3328단백질: 6828
피루베이트 카르복실라제 pycA EP1108790 DNA: 765단백질: 4265
아스파르테이트 트랜스아미나제 EP1108790 DNA: 3226단백질: 4726DNA: 3134단백질: 6634DNA: 2861단백질: 6361DNA: 911단백질: 4411
PEP-카르복실라제 pck EP1108790 DNA: 3470단백질: 6970
말레이트 효소 malE EP1108790 DNA: 3328단백질: 6828
비오틴 리가제 birA EP1108790 DNA: 786단백질: 4286
호모세린 키나제 thrB WO 0100843 DNA: 173단백질: 174
트레오닌 신타제 thrC WO 0100843 DNA: 175단백질: 176
트레오닌 엑스포트 캐리어 thrE WO 0251231 DNA: 41단백질: 42
트레오닌 유출 단백질 RXA2390 WO 0100843 DNA: 7단백질: 8
트레오닌 데히드라타제 ilvA EP 1108790 DNA: 2328단백질: 5828
호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 metA EP 1108790 DNA:727단백질: 4227
시스타티오닌 감마-신타제 metB EP 1108790 DNA:3491단백질: 6991
시스타티오닌 베타-리아제 metC EP 1108790 DNA:2535단백질: 6035
조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 metH EP 1108790 DNA:1663단백질: 5163
O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 metY EP 1108790 DNA:726단백질: 4226
메틸렌테트라히드로-폴레이트 리덕타제 metF EP 1108790 DNA:2379단백질: 5879
D-3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 serA EP 1108790 DNA:1415단백질: 4915
포스포세린 포스파타제 1 serB WO 0100843 DNA: 153단백질:154
포스포세린 포스파타제 2 serB EP 1108790 DNA: 467단백질: 3967
포스포세린 포스파타제 3 serB EP 1108790 DNA: 334단백질: 3834
포스포세린 아미노트랜스퍼라제 serC WO 0100843 DNA: 151단백질: 152
세린 아세틸 트랜스퍼라제 cysE WO 0100843 DNA: 243단백질: 244
시스테인 신타제 I cysK EP 1108790 DNA: 2817단백질: 6317
시스테인 신타제 II CysM EP 1108790 DNA: 2338단백질: 5838
호모세린 데히드로게나제 hom EP 1108790 DNA: 3452단백질: 6952
조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 metE WO 0100843 DNA:755단백질: 756
세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 glyA WO 0100843 DNA: 143단백질: 144
술페이트 환원 단백질 RXA247 EP 1108790 DNA: 3089단백질: 6589
술페이트 환원 단백질 RXA248 EP 1108790 DNA: 3090단백질: 6590
술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 1 CysN EP 1108790 DNA: 3092단백질: 6592
술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 2 CysD EP 1108790 DNA: 3093단백질: 6593
포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 CysH WO 02729029 DNA: 7단백질: 8
페레독신 술파이트 리덕타제 RXA073 WO 0100842 DNA: 329단백질: 330
페레독신 NADP 리덕타제 RXA076 WO 0100843 DNA: 79단백질: 80
전사 조절인자 LuxR luxR WO 0100842 DNA: 297단백질: 298
전사 조절인자 LysR1 lysR1 EP 1108790 DNA: 676단백질: 4176
전사 조절인자 LysR2 lysR2 EP 1108790 DNA: 3228단백질: 6728
전사 조절인자 LysR3 lysR3 EP 1108790 DNA: 2200단백질: 5700
RXA00655 조절인자 RXA655 US2003162267.2 DNA: 1단백질: 2
RXN02910 조절인자 RXN2910 US2003162267.2 DNA: 5단백질: 6
상기 나열된 유전자로부터 본 발명에 따라 조절되는 표적 유전자 G를 선택하는 것이 바람직하다.
아미노산의 생합성 경로로부터의 특히 바람직한 단백질 서열은 각각의 경우에 상기 단백질에 대해 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 여기서 각각의 단백질은 상기 아미노산 서열에 대해 표 2의 컬럼 2에 나타낸 적어도 하나의 아미노산 위치에서 표 2의 컬럼 3의 동일한 행에 나타낸 각각의 아미노산과는 상이한 단백질원성 아미노산을 갖는다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 단백질은 아미노산 서열에 대해 표 2의 컬럼 2에 나타낸 적어도 하나의 아미노산 위치에서 표 2의 컬럼 4의 동일한 행에 나타낸 아미노산을 갖는다. 표 2에 나타낸 단백질은 특히 유리한 특성을 갖고 따라서 본 발명의 프로모터 구성체를 통한 대응하는 핵산의 발현 및 아미노산 생산에 특히 적합한, 아미노산의 생합성 경로의 돌연변이된 단백질이다. 예를 들어, 돌연변이 T311I는 스위치 오프되는 ask의 피드백 억제를 야기한다.
표 2로부터 상기한 돌연변이된 단백질을 코딩하는 대응하는 핵산을 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
돌연변이된 단백질을 코딩하는 핵산 서열 제조를 위한 적합한 출발점은 예를 들어 기탁번호 ATCC　13032로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 게놈 또는 표 1에 나타낸 핵산 서열이다. 돌연변이된 단백질을 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 역번역하기 위해, 핵산 서열이 도입될 예정이거나 또는 핵산 서열이 존재하는 유기체의 코돈 사용 빈도를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미굼의 코돈 사용 빈도를 사용하는 것이 유리하다. 특정 유기체의 코돈 사용 빈도는 바람직한 유기체로부터의 1종 이상의 단백질 및 이 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 기재하고 있는 데이타베이스 또는 특허 출원으로부터 당업계에 공지된 방식으로 확인할 수 있다.
표 2의 정보는 다음과 같은 방식으로 이해될 것이다:
컬럼 1 "명칭"에서, 표 1에 관련하여 각 서열에 대한 명확한 명칭이 제시된다.
컬럼 2 "AA-POS"에서, 각각의 숫자는 표 1로부터 대응하는 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치를 의미한다. 따라서, 컬럼 "AA-POS"에서 "26"은 대응하는 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 26을 의미한다. 위치 넘버링은 N 말단에서 +1로 시작한다.
컬럼 3 "AA 야생형"에서, 각각의 문자는 표 1의 서열의 대응하는 야생형 균주에서 컬럼 2에 나타낸 위치에 1문자 코드로 나타낸 아미노산을 지칭한다.
컬럼 4 "AA 돌연변이체"에서, 각각의 문자는 대응하는 돌연변이체 균주에서 컬럼 2에 나타낸 위치에 1문자 코드로 나타낸 아미노산을 지칭한다.
컬럼 5 "기능"에서, 대응하는 폴리펩티드 서열의 생리학적 기능이 제시된다.
특정 기능 (컬럼 5) 및 특정 초기 아미노산 서열 (표 1)을 갖는 돌연변이된 단백질에 대해, 컬럼 2, 3 및 4는 적어도 하나의 돌연변이 및 일부 서열에 대한 다수의 돌연변이를 기재하고 있다. 상기 다수의 돌연변이는 항상 각각의 경우에 상기 가장 근접한 초기 아미노산 서열을 나타낸다 (표 1). 용어 특정 아미노산 서열의 "적어도 하나의 아미노산 위치"는 바람직하게는 컬럼 2, 3 및 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 기재된 하나 이상의 돌연변이를 의미한다.
단백질원성 아미노산의 1문자 코드는 다음과 같다.
A 알라닌 C 시스테인 D 아스파르테이트
E 글루타메이트 F 페닐알라닌 G 글라이신
H 히스티딘 I 이소류신 K 리신
L 류신 M 메티오닌 N 아스파라긴
P 프롤린 Q 글루타민 R 아르기닌
S 세린 T 트레오닌 V 발린
W 트립토판 Y 타이로신
컬럼 1 컬럼 2 컬럼 3 컬럼 4 컬럼 5
명칭 AA 위치 AA 야생형 AA 돌연변이체 기능
ask 317 S A 아스파르테이트 키나제
311 T I
279 A T
asd 66 D G 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제
234 R H
272 D E
285 K E
20 L F
dapA 2 S A 디히드로디피콜리네이트 신테타제
84 K N
85 L V
dapB 91 D A 디히드로디피콜리네이트 리덕타제
83 D N
ddh 174 D E 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제
235 F L
237 S A
lysA 265 A D 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제
320 D N
332 I V
argS 355 G D 아르기닐-tRNA 신테타제
156 A S
513 V A
540 H R
zwf 8 S T 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제
150 T A
321 G S
gap 264 G S 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제
pycA 7 S L 피루베이트 카르복실라제
153 E D
182 A S
206 A S
227 H R
455 A G
458 P S
639 S T
1008 R H
1059 S P
1120 D E
pck 162 H Y PEP 카르복실라제
241 G D
829 T R
thrB 103 S A 호모세린 키나제
190 T A
133 A V
138 P S
thrC 69 G R 트레오닌 신타제
478 T I
RXA330 85 I M 트레오닌 유출 단백질
161 F I
195 G D
hom 104 V I 호모세린 데히드로게나제
116 T I
148 G A
59 V A
270 T S
345 R P
268 K N
61 D H
72 E Q
lysR1 80 R H 전사 조절인자 LysR1
lysR3 142 R W 전사 조절인자 LysR3
179 A T
RXA2739 75 N D 트랜스케톨라제
329 A T
332 A T
556 V I
RXA2738 242 K M 트랜스알돌라제
opcA 107 Y H OpcA
219 K N
233 P S
261 Y H
312 S F
65 G R 아스파르테이트-1-데카르복실라제
33 G S 6-포스포글루코노락토나제
유전적으로 변형된 미생물
본 발명의 발현 유닛, 상기한 유전자 및 상기한 핵산 구성체 또는 발현 카세트는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 컨쥬게이션 또는 전기천공 (예를 들어, Liebl et al (1989) FEMS Microbiology Letters 53, 299-303)에 의해 미생물, 특히 코리네형 세균에 도입된다.
통합된 발현 카세트는 바람직하게는 SacB 방법에 의해 선택된다. SacB 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Schaefer A, Tauch A, Jaeger W, Kalinowski J, Thierbach G, Puehler A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22; 145(1):69-73] 및 [Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun; 5(6):1447-57]에 기재되어 있다.
바람직한 상이한 생성물 (정밀 화학물질/단백질)을 이미 생산하는 미생물을 출발 미생물로서 본 발명에 따라 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트 또는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 특히 바람직하게는 본 발명의 적어도 하나의 발현 카세트를 운반하는 벡터, 특히 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물, 특히 코리네형 세균에 관한 것이다
바람직한 미생물 또는 유전적으로 변형된 미생물은 세균, 조류, 진균 또는 효모이다.
특히 바람직한 미생물은 특히 코리네형 세균이다.
바람직한 코리네형 세균은 코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens) 종 또는 브레비박테리움 속, 특히 브레비박테리움 플라붐 (flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) 및 브레비박테리움 디바리카툼 (divaricatum) 종의 세균이다.
코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 특히 바람직한 세균은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노제네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 멜라쎄콜라 ATCC 17965, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44547, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44548, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44549, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869, 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21608, 및 또한 예를 들어 전통적인 돌연변이 및 선택 또는 지정 돌연변이에 의해 그로부터 유도된 균주로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
약자 KFCC는 한국 종균 협회 (Korean Federation of Culture Collection)를 의미하고, 약자 ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션을 의미하고, 약자 DSM은 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)을 의미한다.
코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 특히 더 바람직한 세균은 표 3에 나열하였다:
약어는 다음 의미를 갖는다:
ATCC: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 메릴랜드주 록빌)
FERM: 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트 (Fermentation Research Institute, 일본 지바),
NRRL: ARS 컬쳐 컬렉션, 노던 리져널 리서치 래보러토리 (ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, 미국 일리노이주 페오리아),
CECT: 컬렉시온 에스파놀라 드 컬티보스 티포 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, 스페인 발렌시아),
NCIMB: 내셔날 컬렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 엘티디. (National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 영국 애버딘),
CBS: 센트라알부로 보어 쉬멜컬쳐스 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, 네덜란드 바른),
NCTC: 내셔널 컬렉션 오브 타입 컬쳐스 (National Collection of Type Cultures, 영국 런던),
DSMZ: 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 ((Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, 독일 브룬스빅).
코리네박테리움 속의 세균, 특히 이미 L-리신, L-메티오닌 및(또는) L-트레오닌을 생산할 수 있는 미생물이 특히 바람직하다. 특히, 이들은 예를 들어 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 유전자 (ask 유전자)가 하향조절되거나 피드백 억제가 제거 또는 감소된 코리네 세균이다. 예를 들어, 상기 세균에는 피드백 억제의 감소 또는 제거를 초래하는 ask 유전자에 돌연변이 (예를 들어, 돌연변이 T311I)가 존재한다.
본 발명의 발현 유닛을 사용하면 본 발명의 상기한 유전적으로 변형된 미생물에서 특이적 생합성 산물의 대사 경로를 조절할 수 있다.
이러한 목적을 위해, 예를 들면 특정 생합성 산물을 생성하는 대사 경로는 상기 경로의 유전자 전사 속도 또는 발현 속도를 유발 또는 증가시킴으로써 향상시키며, 이때 상기 생합성 경로에서는 단백질의 양이 증가하여 목적하는 생합성 경로로부터의 상기 단백질의 총 활성을 증가시킴으로써 목적하는 생합성 산물을 향한 대사 유입을 증가시킨다.
또한, 특정 생합성 산물로부터 분지되는 대사 경로는 이 분지된 생합성 경로의 유전자 전사 속도 또는 발현 속도를 감소시킴으로써 감소시킬 수 있으며, 이 때 상기 분지된 생합성 경로에서는 단백질의 양이 감소하여 원치않는 생합성 경로로부터의 상기 단백질의 총 활성을 감소시킴으로써 목적하는 생합성 산물을 향한 대사 유입을 더 증가시킨다.
본 발명의 유전적으로 변형된 미생물은, 예를 들면 글루코스, 수크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 생합성 산물을 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 유전적으로 변형된 미생물의 배양에 의한 생합성 산물의 생산 방법에 관한 것이다.
목적하는 생합성 산물에 따라, 다양한 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도는 증가 또는 감소되어야 한다. 통상적으로, 여러 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도를 변경시키는 것, 즉 유전자 조합물의 전사 속도 또는 발현 속도를 증가시키고(시키거나) 유전자 조합물의 전사 속도 또는 발현 속도를 감소시키는 것이 유리하다.
본 발명의 유전적으로 변형된 미생물에서는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 유닛에 의해 하나 이상의 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도가 변경, 즉 증가 또는 감소될 수 있다.
또한, 유전적으로 변형된 미생물에서 추가의 유전자의 추가로 변경된, 즉 더 증가되거나 더 감소된 전사 속도 또는 발현 속도는 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 유닛으로부터 유래될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 유전적으로 변형된 미생물의 배양에 의한 생합성 산물의 생산 방법에 관한 것이다.
V. 본 발명의 적용 분야
본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛, 발현 카세트 및 벡터는 예를 들어 아래에서 설명하는 생합성 산물의 발효 생산을 위한 개선된 방법에서 특히 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛 또는 이들을 포함하는 발현 카세트는 기능적으로 연결된 구조 유전자의 발현 조절이 가능하다는 특정 잇점을 갖는다.
본 발명의 발현 유닛 또는 이들을 포함하는 발현 카세트는 야생형에 비해 미생물에서 유전자의 발현 속도의 변경, 즉 증가 또는 감소 또는 유발을 위해 사용될 수 있다. 이것은 발현 속도의 증가의 경우에 목적하는 유전자의 최대 발현 가능성을 제공한다. 그러나, 발현은 또한 적합한 발현 유닛을 선택함으로써, 상이한 발현 유닛에 의해 얻을 수 있는 최대치 미만이지만 동시에 발현 미생물에 보다 적합한 양으로 발현 산물을 전달하는 강도에서 발생할 수 있다. 이것은 지나치게 높은 발현 생성물 농도가 발현 미생물에 유해할 경우에 특히 유리하다. 각각의 경우에 상이한 발현 강도를 갖는 발현 유닛 중에서 선택함으로써, 본 발명의 발현 유닛은 특히 장기간 발현을 위해 발현을 최적값으로 미세 조절할 수 있다.
본 발명의 발현 유닛 또는 상기 발현 유닛을 포함하는 발현 카세트는 또한 미생물, 특히 코리네박테리움 종에서 상이한 생합성 산물, 예를 들어, 정밀 화학물질, 단백질, 특히 아미노산의 형성을 조절 및 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 생성물 생합성을 조절하기 위한 본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛의 용도에 관한 것이다. 본원에서, 생성물 생합성의 조절에 관련되는 단백질의 유전자는 상기 발현 유닛의 제어 하에 놓이게 된다. 상기 생성물 생합성은 선택된 다중 프로모터-포함 발현 유닛의 전사 속도에 따라 영향받는다. 별법으로, 생성물 생합성의 조절에 관련되는 단백질의 유전자는 미생물에서 본 발명의 발현 카세트의 구성 성분으로서 발현될 수 있고, 상기 생성물 생합성은 그에 의해 발현되는 단백질에 의해 조절될 수 있다. 다중 프로모터의 활성이 내인성 프로모터보다 약할 경우, 다중 프로모터는 또한 특이적으로 원치 않는 생합성 경로를 약화시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛의 전사 속도는 상기 다중 프로모터를 구성하는 하나 이상의 개개의 프로모터의 특이적 돌연변이에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 활성의 증가 또는 감소는 RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위 (-10 영역 및 -35 영역으로도 당업자에게 알려짐)의 결합 부위 내의 뉴클레오티드를 치환함으로써 달성할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드를 결실시키거나 또는 삽입하여 기재된 RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위 사이의 거리를 단축 또는 연장시킴으로써 프로모터 활성을 증가 또는 감소시킬 수도 있다. 또한, RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위의 공간 근처에 조절 단백질 (당업자에게 리프레서 및 활성화제로도 공지되어 있음)에 대한 결합 부위 (당업자에게 오퍼레이터라고도 공지되어 있음)를 위치시켜, 이들 조절인자가 프로모터 서열에 결합한 후에 RNA 폴리머라제 전효소의 결합 및 전사 활성을 감소 또는 향상시키거나 새로운 조절 영향하에 놓이게 함으로써 프로모터 활성을 증가 또는 감소시킬 수도 있다. 또한, 번역 활성은 본 발명의 다중 프로모터-포함 발현 유닛 내의 단일 프로모터 Py의 리보좀 결합-매개, 3'-말단 서열 섹션을 돌연변이시킴으로써 영향받을 수 있다.
VI. 생합성 산물 및 바람직한 생산 방법
본 발명에 따라 제조된 바람직한 생합성 산물은 정밀 화학물질이다.
용어 "정밀 화학물질"은 당업계에 공지되어 있으며, 유기체에 의해 생산되고, 예를 들어 제약 산업, 농업, 화장품, 사료 및 식품 산업 등을 비롯한 다양한 산업 분야에 사용되는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기산, 예를 들어, 락트산, 숙신산, 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산, 및 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 퓨린 염기 및 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (예를 들면, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., editors, VCH: Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있음), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들면, 아라키돈산), 디올 (예를 들면, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들면, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들면, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌; 및 [Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease", Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)]에 기재되어 있음), 효소, 및 다른 모든 화합물 (문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN:0818805086] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있음)을 포함한다.
특히 바람직한 생합성 산물은 유기산, 단백질, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 효소 및 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
바람직한 유기산은 락트산, 숙신산, 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산이다.
바람직한 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 예를 들어 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology, vol. 6, Rehm et al., editors VCH: Weinheim 및 여기에 언급된 참고문헌]에 기재되어 있다.
바람직한 생합성 산물은 추가로 지질, 포화 및 불포화 지방산, 예를 들어, 아라키돈산, 디올, 예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올, 탄수화물, 예를 들어, 히알루론산 및 트레할로스, 방향족 화합물, 예를 들어, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고, 비타민 및 보조인자 (예를 들어, 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim] 및 여기에 언급된 참고문헌; 및 [Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)]에 기재되어 있음); 효소, 폴리케티드 (문헌 [Cane et al. (1998) Science 282:63-68]); 및 다른 모든 화합물 (문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN:0818805086] 및 여기에 언급된 참고문헌에 기재되어 있음)이다.
특히 바람직한 생합성 산물은 아미노산, 특히 바람직하게는 필수 아미노산, 특히 L-글라이신, L-알라닌, L-류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-리신, L-글루타민, L-글루탐산, L-세린, L-프롤린, L-발린, L-이소류신, L-시스테인, L-타이로신, L-히스티딘, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산 및 L-트레오닌, L-호모세린, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌이다. 아미노산, 예를 들어, 리신, 메티오닌 및 트레오닌은 이하에서 각각의 경우에 아미노산의 L 및 D형, 바람직하게는 L형, 즉 예를 들어 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 의미한다.
다음 섹션은 리신, 메티오닌 및 트레오닌의 특히 바람직한 제조를 보다 상세하게 설명한다.
a) 리신의 제조
본 발명은 특히 하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 리신을 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서,
- 하나 이상의 내인성 유전자의 미생물 내에서의 발현 활성이 본 발명의 발현 유닛에 의해 조절되거나, 또는
- 하나 이상의 유전자의 미생물 내에서의 발현이 상기 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트를 상기 미생물에 도입함으로써 유발 또는 변경된다.
유전자는 특히 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 신테타제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 전사 조절인자 LuxR을 코딩하는 핵산, 전사 조절인자 LysR1을 코딩하는 핵산, 전사 조절인자 LysR2를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 리신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 아르기닐-tRNA 신테타제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산, 테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라제를 코딩하는 핵산, 숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 에피머라제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글루코스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 포스포글리세레이트 뮤타제를 코딩하는 핵산, 에놀라제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트 트랜스아미나제 및 말레이트 효소를 코딩하는 핵산으로부터 선택된다.
상기 리신 제조 방법의 또다른 바람직한 실시태양은 야생형에 비해 다음 활성 중에서 선택되는 활성의 적어도 하나의 증가된 활성을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한다:
아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신테타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 전사 조절인자 LuxR의 활성, 전사 조절인자 LysR1의 활성, 전사 조절인자 LysR2의 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 트랜스알돌라제 활성, 리신 엑스포터 활성, 아르기닐-tRNA 신테타제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프럭토키나제 활성, 6-포스포프럭토키나제 활성, 비오틴 리가제 활성, 및 테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라제 활성, 숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 활성, 숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라제 활성, 디아미노피멜레이트 에피머라제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 글루코스 포스페이트 이소머라제 활성, 포스포글리세레이트 뮤타제 활성, 에놀라제 활성, 피루베이트 키나제 활성, 아스파르테이트 트랜스아미나제 활성 및 말레이트 효소 활성.
상기 리신 제조 방법의 특히 바람직한 다른 실시태양은 야생형에 비해 다음 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 활성의 적어도 하나의 감소된 활성을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한다:
트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸-트랜스퍼라제 활성, O-아세틸-호모세린 술프히드릴라제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 호모세린 키나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 트레오닌 엑스포터 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성 및 트레오닌 신타제 활성.
b) 메티오닌의 제조
본 발명은 또한 하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서,
- 하나 이상의 내인성 유전자의 미생물 내에서의 발현 활성이 본 발명의 발현 유닛에 의해 조절되거나, 또는
- 하나 이상의 유전자의 미생물 내에서의 발현이 상기 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 유닛을 상기 미생물에 도입함으로써 유발 또는 변경된다.
유전자는 특히 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 감마-신타제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 베타-리아제를 코딩하는 핵산, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 핵산, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 핵산, 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 활성 I를 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 활성 II를 코딩하는 핵산, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성을 코딩하는 핵산, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성을 코딩하는 핵산, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 핵산, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 술파이트 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 NADPH 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 활성을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA077을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA248을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA247을 코딩하는 핵산, RXA0655 조절인자를 코딩하는 핵산, 및 RXN2910 조절인자를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글루코스 포스페이트 이소머라제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제, 피루베이트 키나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제 또는 말레이트 효소를 코딩하는 핵산으로부터 선택된다.
상기 메티오닌 제조 방법의 또다른 바람직한 실시태양은 야생형에 비해 다음 활성 중에서 선택되는 활성의 적어도 하나의 증가된 활성을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한다:
아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스타티오닌 감마-신타제 활성, 시스타티오닌 베타-리아제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 활성, 포스포세린 포스파타제 활성, 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스테인 신타제 I 활성, 시스테인 신타제 II 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 활성, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 활성, 페레독신 술파이트 리덕타제 활성, 페레독신 NADPH 리덕타제 활성, 페레독신 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA077의 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA248의 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA247의 활성, RXA655 조절인자의 활성 및 RXN2910 조절인자의 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제의 활성, 글루코스 포스페이트 이소머라제의 활성, 포스포글리세레이트 뮤타제의 활성, 에놀라제의 활성, 피루베이트 키나제의 활성, 아스파르테이트 트랜스아미나제의 활성 및 말레이트 효소의 활성.
상기 메티오닌 제조 방법의 특히 바람직한 다른 실시태양은 야생형에 비해 다음 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 활성의 적어도 하나의 감소된 활성을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한다: 호모세린 키나제 활성, 트레오닌 데히드라타제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성.
c) 트레오닌의 제조
본 발명은 또한 하나 이상의 유전자의 발현 속도가 야생형에 비해 증가 또는 유발된 유전적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 트레오닌을 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서,
- 하나 이상의 내인성 유전자의 미생물 내에서의 발현 활성이 본 발명의 발현 유닛에 의해 조절되거나, 또는
- 하나 이상의 유전자의 미생물 내에서의 발현이 상기 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 유닛을 상기 미생물에 도입함으로써 유발 또는 변경된다.
유전자는 특히 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 엑스포터 캐리어를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 리신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 유출 단백질을 코딩하는 핵산, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, OpcA 단백질을 코딩하는 핵산, 1-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산 및 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 및 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제, 피루베이트 키나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제 및 말레이트 효소를 코딩하는 핵산으로부터 선택된다.
상기 트레오닌 제조 방법의 또다른 바람직한 실시태양은 야생형에 비해 다음 활성 중에서 선택되는 활성의 적어도 하나의 증가된 활성을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한다:
아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 트레오닌 엑스포트 캐리어의 활성, 트랜스알돌라제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 호모세린 키나제 활성, 비오틴 리가제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프럭토키나제 활성, 6-포스포프럭토키나제 활성, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성 및 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제의 활성, 글루코스 포스페이트 이소머라제의 활성, 포스포글리세레이트 뮤타제의 활성, 에놀라제의 활성, 피루베이트 키나제의 활성, 아스파르테이트 트랜스아미나제의 활성 및 말레이트 효소의 활성.
상기 트레오닌 제조 방법의 특히 바람직한 다른 실시태양은 야생형에 비해 다음 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 활성의 적어도 하나의 감소된 활성을 추가로 갖는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한다:
트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸-호모세린 술프히드릴라제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신테타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성, 리신 엑스포터 활성, 아세토락테이트 신타제 활성, 케톨산 리덕토이소머라제 활성, 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 디히드록시산 데히드라타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성.
d) 본 발명에 따른 생체 산물의 제조에 대한 추가의 정보
상기한 활성의 적어도 하나의 상기한 추가의 증가 또는 감소는 본 발명의 발현 유닛 또는 본 발명의 발현 카세트에 의해 유발될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
용어 단백질의 "활성"은 효소의 경우에는 대응하는 단백질의 효소 활성을 의미하고, 다른 단백질, 예를 들어 구조 또는 수송 단백질의 경우에는 단백질의 생리적 활성을 의미한다.
효소는 통상적으로 기질을 생성물로 전환시킬 수 있거나, 이러한 전환 단계를 촉매할 수 있다. 따라서, 효소의 "활성"은 특정 시간 내에 효소에 의해 전환된 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양을 의미한다.
따라서, 활성이 야생형에 비해 증가된 경우에는, 특정 시간 내에 효소에 의해 전환된 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양이 야생형에 비해 증가한다.
"활성"의 증가는 예를 들어 상기 또는 하기 기재된 모든 활성의 경우에, 바람직하게 "야생형 활성"의 적어도 1 내지 5%, 예를 들어, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 300%, 또는 적어도 500%, 또는 적어도 600%이다.
따라서, 활성이 야생형에 비해 감소된 경우에는, 특정 시간 내에 효소에 의해 전환된 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양이 야생형에 비해 감소한다.
감소된 활성은 바람직하게는 다양한 세포 생물학적 메카니즘에 기초하여, 미생물에서 상기 효소의 기능이 부분적으로 또는 실질적으로 완전하게 억제 또는 차단되는 것을 의미한다.
활성의 감소는 효소의 양적인 감소뿐만 아니라 효소의 실질적으로 완전한 부재 (즉, 대응하는 활성의 검출가능성 결여 또는 효소의 면역학적 검출가능성 결여)까지 포함한다. 미생물의 활성은 바람직하게는 야생형에 비해 적어도 5%, 예를 들어 적어도 20%, 적어도 50%, 또는 약 100% 감소한다. 또한, "감소"는 특히 대응하는 활성의 완전한 부재를 의미한다.
유전적으로 변형된 미생물 및 야생형에서의 특정 효소의 활성, 및 이에 따른 효소 활성의 증가 또는 감소는 예를 들어 효소 분석과 같은 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
활성의 추가의 증가는 상이한 방식, 예를 들어 발현 및 단백질 수준에서 억제 조절성 메카니즘의 스위치 오프에 의해 또는 야생형에 비해 상기 설명한 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현의 증가에 의해 발생할 수 있다.
야생형에 비해 상기 설명한 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현의 증가는 유사하게 상이한 방식, 예를 들어 활성화제에 의한 유전자의 유도 또는 상기한 바와 같은 프로모터 활성의 증가 또는 발현 활성의 증가 또는 하나 이상의 유전자 카피의 미생물 내로의 도입에 의해 발생할 수 있다.
또한, 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현의 증가는 본 발명에 따르면 미생물에 고유한 내인성 단백질의 발현 조작을 의미한다. 이것은 예를 들어 상기한 바와 같이 유전자의 프로모터 서열의 변경, 유전자의 조절 제어를 위한 본 발명의 발현 유닛의 도입 및 본 발명의 도입된 발현 유닛의 변경에 의해 달성할 수 있다. 유전자의 발현 속도를 증가시키는 상기 변경은 예를 들어 DNA 서열의 결실 또는 삽입에 의해 발생할 수 있다.
상기한 바와 같이, 외인성 자극에 의해 내인성 단백질의 발현을 변경시킬 수 있다. 이것은 특정 생리학적 조건, 즉 외래 물질의 도입을 통해 발생할 수 있다.
당업자는 유전자 발현을 증가시키는 또다른 절차를 단독으로 또는 조합하여 재현할 수 있다. 따라서, 예를 들면 적절한 유전자의 카피수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자의 상류에 위치한 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 또한, 유도가능한 프로모터를 통해 발효 생산 공정 동안 발현을 증가시킬 수 있다. 이와 마찬가지로, mRNA의 수명을 연장시키는 절차가 발현을 향상시킨다. 이와 같이, 효소 활성이 효소 단백질의 분해 방지에 의해 향상될 수도 있다. 유전자 또는 유전자 구성체는 카피수를 다르게 하여 플라스미드에 존재하거나, 또는 염색체에 통합되어 증폭될 수 있다. 또한, 별법으로, 배지의 조성 및 배양액 관리를 변경시킴으로써 관련 유전자를 과다발현시킬 수 있다.
당업자은 이에 대한 지침을 특히 문헌 [Martin et al. (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991), EP-A　0472869, US-A　4,601,893, Schwarzer and Puehler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), WO　96/15246, Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996) 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재]에서 찾을 수 있다.
추가로, 원치 않는 부작용을 제거하는 것은 유전자의 발현 또는 향상 이외에도, 생합성 산물, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌의 생산에 유리할 수도 있다 (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganism", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
바람직한 실시태양에서, 상기한 단백질의 하나를 코딩하는 핵산의 유전자 발현은 대응하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 미생물 내에 도입함으로써 증가시킨다. 핵산은 염색체 내 또는 염색체 외에, 즉 염색체 상의 카피수 및(또는) 숙주 미생물에서 복제되는 플라스미드 상의 유전자 카피를 증가시킴으로써 도입시킬 수 있다.
핵산, 예를 들면 핵산을 포함하는 본 발명의 발현 카세트 형태의 핵산은, 바람직하게는 특히 상기 기재된 SacB 방법에 의해 염색체 내에 도입된다. 이론상, 이러한 목적을 위해 상기 기재된 단백질 중 하나를 코딩하는 임의의 유전자를 사용할 수 있다.
인트론을 포함하는 진핵세포 공급원으로부터의 게놈 핵산 서열의 경우, 숙주 미생물이 대응하는 단백질을 발현시킬 수 없거나 또는 이를 발현시키도록 제조할 수 없다면, 대응하는 cDNA와 같이 이미 프로세싱된 핵산 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
상응하는 유전자의 예를 표 1 및 2에 나열하였다.
미생물에서 상기 기재된 활성은 바람직하게는 하기 방법 중 하나 이상에 의해 감소된다:
- 동시억제 유도를 위한 하나 이상의 센스 리보핵산 서열 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.
- 대응하는 유전자, RNA 또는 단백질에 대한 하나 이상의 DNA- 또는 단백질-결합 인자 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.
- RNA 분해를 유발하는 하나 이상의 바이러스 핵산 서열 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.
- 예를 들면 유전자에 삽입, 결실, 역위 또는 돌연변이를 발생시켜, 예를 들어 정지 코돈의 생성 또는 해독 프레임의 이동과 같이 유전자의 기능을 저하시키는 하나 이상의 구성체의 도입. 상동성 재조합 또는 표적 유전자에 대해 서열-특이적인 뉴클레아제의 도입을 통해 목적하는 표적 유전자에 표적화시켜 삽입시킴으로써 넉아웃 돌연변이를 발생시킬 수 있으며, 또한 바람직하다.
- 감소된 프로모터 활성을 갖는 프로모터 또는 감소된 발현 활성을 갖는 발현 유닛의 도입.
- 센스 RNA (mRNA)의 번역을 감소시키는 안티센스 RNA의 도입.
당업자는 활성 또는 기능을 감소시키기 위한 또다른 방법이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있음을 알고 있다. 예를 들면, 단백질의 우성의 음성 변이체 또는 이의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입이 유리할 수도 있다.
또한, 상기 방법이 각각 단독으로 단백질의 양, mRNA의 양 및(또는) 단백질의 활성을 감소시킬 수도 있다. 이들 방법을 조합하여 사용하는 것도 고려해 볼 수 있다. 또다른 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질의 프로세싱, 단백질 또는 그의 mRNA의 수송의 방해 또는 억제, 리보좀 부착의 억제, RNA 스플라이싱의 억제, RNA 분해 효소의 유도 및(또는) 번역 연장 또는 종결의 억제를 포함할 수 있다.
VII. 미생물 배양 및 생성물의 단리
생합성 산물을 생산하기 위한 본 발명의 방법에서, 유전자 조작 미생물의 배양 단계 후에 바람직하게는 미생물 및(또는) 발효 브로쓰로부터 생합성 산물을 단리한다. 이들 단계는 동시에 및(또는) 바람직하게는 배양 단계 후에 수행할 수 있다.
본 발명의 유전자 조작 미생물을 배양하여, 배치식 방법 (배치식 배양) 또는 유가식 배양 또는 반복 유가식 배양 방법에 의해 연속적 또는 불연속적으로 생합성 산물, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법의 개론은 문헌 [Chemiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991] 또는 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994]에서 찾아볼 수 있다.
사용될 배양 배지는 각 균주의 요구를 적합한 방식으로 만족시켜야 한다. 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에 다양한 미생물에 사용되는 배양 배지가 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및(또는) 미량 원소를 포함한다.
바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 매우 우수한 탄소 공급원의 예로는 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스가 있다. 당류는 또한 당밀과 같은 복합 화합물 또는 다른 당 제련 부산물을 통해 배지에 공급할 수 있다. 또한, 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수도 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 예를 들어 대두유, 해바라기씨 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 지방과 같은 오일 및 지방; 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀산과 같은 지방산; 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알콜; 및 예를 들어 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이다.
질소 공급원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.
배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다.
정밀 화학물질, 특히 메티오닌의 생산을 위해, 예를 들면 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술피드와 같은 무기 화합물, 및 머캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물을 황 공급원으로 사용할 수 있다.
인 공급원으로서, 인산, 인산2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨, 또는 대응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다.
용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제는 카테콜 또는 프로토카테추에이트와 같은 디히드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 발효 배지는 통상적으로 비타민 또는 증식 촉진제와 같은 다른 증식 인자를 포함하며, 예를 들면 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신이 있다. 성장 인자 및 염은 종종 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 배지의 복합 성분으로부터 유래될 수도 있다. 적합한 전구체를 배지에 첨가할 수도 있다. 배지 중 화합물의 정확한 조성은 특정 실험에 따라 크게 좌우되며, 각각의 구체적인 상황에 따라 개별적으로 결정될 것이다. 배지의 최적화에 대한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (editors. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]으로부터 얻을 수 있다. 성장 배지는 또한 Standard 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌-심장 침출 배지, 딥코 (DIFCO))와 같은 상업적 공급원으로부터 구입할 수도 있다.
배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라 개별적으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.
배양 온도는 통상적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이며, 실험하는 동안 일정하게 유지하거나 변경시킬 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 대략 7.0이어야 한다. 배양시 pH는 배양하는 동안 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 첨가함으로써 제어할 수 있다. 거품 발생은, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용함으로써 제어할 수 있다. 플라스미드의 안정성은, 예를 들면 항생제와 같이 선택 작용을 하는 적합한 물질을 배지에 첨가함으로써 유지시킬 수 있다. 호기성 조건은, 예를 들어 대기와 같은 산소 또는 산소-포함 기체 혼합물을 배양액에 도입함으로써 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 목적하는 산물의 형성이 최대치에 도달할 때까지 계속한다. 이 목적은 통상적으로 10 내지 160 시간 내에 달성된다.
이러한 방법으로 수득한 발효 브로쓰의 건조 물질 함량은 통상적으로 7.5 내지 25 중량％이다.
또한, 발효는 적어도 종료 시점에, 특히 발효 시간의 적어도 30％가 넘는 시간 동안 당 공급을 제한하면서 실시하는 것이 더 유리하다. 이는 상기 시간 동안 발효 배지 내의 이용가능한 당의 농도가 0 내지 3 g/l에서 유지되거나, 감소됨을 의미한다.
생합성 산물은 필요한 생합성 산물 및 생합성 부산물의 물리적/화학적 특성에 따라 당업계에 공지된 방법으로 발효 브로쓰 및(또는) 미생물로부터 단리한다.
이어서, 발효 브로쓰는 예를 들어 추가로 가공될 수 있다. 필요에 따라, 바이오매스는 예를 들어 원심분리, 여과, 따라내기 또는 이들 방법의 조합과 같은 분리 방법에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 발효 브로쓰로부터 분리하거나 또는 발효 브로쓰 내부에서 완전하게 잔류시킬 수 있다.
발효 브로쓰는 이후에, 예를 들면 회전 증발기, 박막 증발기, 낙하 필름 증발기를 사용하는, 역삼투압 또는 나노여과와 같은 공지된 방법에 의해 농축시킬 수 있다. 이 농축된 발효 브로쓰는 이후에 동결 건조, 분무 건조, 분무 과립화 또는 다른 방법에 의해 마무리 처리될 수 있다.
그러나, 생합성 산물, 특히 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 정제할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 생성물-포함 브로쓰는 바이오매스를 제거한 후에 적합한 수지를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 목적하는 산물 또는 불순물을 전체적으로 또는 부분적으로 크로마토그래피 수지에 잔류시킨다. 이러한 크로마토그래피 단계는 필요하다면 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 반복할 수 있다. 당업자라면 용이하게 적절한 크로마토그래피 수지를 선택하여 이를 가장 효과적으로 사용할 수 있다. 정제된 산물은 여과 또는 한외여과에 의해 농축시켜 이 산물의 안정성이 최대가 되는 온도에서 보관할 수 있다.
생합성 산물은 다양한 형태, 예를 들면 이들의 염 또는 에스테르 형태로 생성될 수 있다.
단리된 화합물(들)의 동일성 및 순도는 선행 기술에 의해 측정될 수 있다. 이러한 기술로는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 분광분석 방법, 염색 방법, 박층 크로마토그래피, NIRS, 효소 분석법 또는 미생물학 분석법이 있다. 이러한 분석 방법들은 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32]; [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70]; [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH:Weinheim, pp.　89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587]; [Michal, G (1999) Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons]; [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17]에 요약되어 있다.
이제, 본 발명을 하기 비제한적 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다:
실시예 1:
벡터 pCLiK5MCS 의 제조
먼저, 벡터 pBR322의 암피실린 내성 및 복제 기원을 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 5 및 서열 6을 사용하여 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)의 도움으로 증폭시켰다.
서열 5:
5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'
서열 6:
5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'
pBR322에 대한 서열 상보성에 관계없이, 서열 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-3' 방향으로 제한 엔도뉴클레아제 SmaI, BamHI, NheI 및 AscI에 대한 절단 부위를 포함하고, 서열 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-3' 방향으로 제한 엔도뉴클레아제 XbaI, XhoI, NotI 및 DraI에 대한 절단 부위를 포함한다. PCR 반응은 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))]에 의해 PfuTurbo 폴리머라제 (스트라타젠 (Stratagene, 미국 라 졸라))를 사용하여 수행하였다. 크기가 약 2.1　kb인 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia, 독일 프라이부르크))를 사용하여 정제하였다. DNA 단편의 블런트 (blunt) 단부를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics), 독일 만하임))를 사용하여 서로 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 암피실린 (50　㎍/ml)-함유 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
개개의 클론의 플라스미드 DNA를 제조사의 정보에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit (퀴아겐 (Qiagen, 독일 힐덴))를 사용하여 단리하고 제한 소화를 통해 검토하였다. 상기 방식으로 얻어진 플라스미드를 pCLiK1로 칭한다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 플라스미드 pWLT1 (Liebl et al., 1992)로부터 출발하여, 카나마이신 내성 카세트를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 7 및 서열 8을 사용하여 증폭시켰다.
서열 7:
5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3'
서열 8
5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3'
pWLT1에 대한 서열 상보성에 관계없이, 서열 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-3' 방향으로 제한 엔도뉴클레아제 XbaI, SmaI, BamHI, NheI에 대한 절단 부위를 포함하고, 서열 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-3' 방향으로 제한 엔도뉴클레아제 AscI 및 NheI에 대한 절단 부위를 포함한다. PCR 반응을 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))]에 의해 PfuTurbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여 수행하였다. 크기가 약 1.3　kb인 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 AscI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 비벌리)로 절단하고, 후속적으로 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 다시 정제하였다. pCLiK1 벡터를 유사하게 XbaI 및 AscI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 제조사의 정보에 따라 알칼리 포스파타제 (I (로셰 다이아그노스틱스))에 의해 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동시킨 후에, 선형화된 벡터 (약 2.1　kb)를 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 절단된 PCR 단편과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 암피실린 (50　㎍/ml) 및 카나마이신 (20　㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
개개의 클론의 플라스미드 DNA를 제조사의 정보에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit (퀴아겐)를 사용하여 단리하고 제한 소화를 통해 검토하였다. 상기 방식으로 얻어진 플라스미드를 pCLiK2로 칭한다.
pCLiK2 벡터를 제한 엔도뉴클레아제 DraI (뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 절단하였다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동시킨 후, 약 2.3　kb 벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 재라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
개개의 클론의 플라스미드 DNA를 제조사의 정보에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit (퀴아겐)를 사용하여 단리하고 제한 소화를 통해 검토하였다. 상기 방식으로 얻어진 플라스미드 pCLiK3으로 칭한다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 플라스미드 pWLQ2 (Liebl et al., 1992)로부터 출발하여, pHM1519 복제 기원을 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 9 및 서열 10을 사용하여 증폭시켰다.
서열 9:
5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3'
서열 10:
5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'
pWLQ2에 대한 서열 상보성에 관계없이, 서열 9 및 서열 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 NotI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 부위를 포함한다. PCR 반응을 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))]에 의해 PfuTurbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여 수행하였다. 크기가 약 2.7　kb인 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NotI (뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 절단하고, 후속적으로 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 다시 정제하였다. pCLiK3 벡터를 유사하게 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 제조사의 정보에 따라 알칼리 포스파타제 (I (로셰 다이아그노스틱스))에 의해 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 선형화된 벡터 (약 2.3　kb)를 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 절단된 PCR 단편과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
개개의 클론의 플라스미드 DNA를 제조사의 정보에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit (퀴아겐)를 사용하여 단리하고 제한 소화를 통해 검토하였다. 상기 방식으로 얻어진 플라스미드를 pCLiK5로 칭한다.
pCLiK5를 다중 클로닝 부위 (MCS)에 의해 연장하기 위해, 제한 엔도뉴클레아제 SwaI, XhoI, AatI, ApaI, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI 및 SmaI에 대한 절단 부위를 포함하는 2개의 본질적으로 상보성인 합성 올리고뉴클레오티드 서열 11 및 서열 12를 가열한 후 서서히 냉각시켜 함께 조합함으로써 이중쇄 DNA 단편을 얻었다.
서열 11:
5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATAT
GACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAAC
AATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3'
서열 12:
5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAG
CATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCG
GGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3'
pCLiK5 벡터를 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamHI (뉴 잉글랜드 바이오랩스)으로 절단하고, 제조사의 정보에 따라 알칼리 포스파타제 (I (로셰 다이아그노스틱스))에 의해 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동시킨 후, 선형화된 벡터 (약 5.0　kb)를 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 합성 이중쇄 DNA 단편과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
개개의 클론의 플라스미드 DNA를 제조사의 정보에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit (퀴아겐)를 사용하여 단리하고 제한 소화를 통해 검토하였다. 상기 방식으로 얻어진 플라스미드를 pCLiK5MCS로 칭한다.
서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems), 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS를 서열 13으로 나열한다.
실시예 2:
플라스미드 PmetA metA 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 14 및 서열 15, 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 비코딩 5' 영역을 포함하는 metA 유전자를 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 14
5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'
서열 15
5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'
얻어진 약 1.3　kb DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 Asp718 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
벡터 pClik5MCS 서열 13을 Asp718 및 SpeI 제한 효소로 절단하고, 5　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편과 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS PmetA metA를 서열 16으로 나열한다.
실시예 3:
플라스미드 pCLiK5MCS Psod metA 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 17 및 서열 18, 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 수퍼옥시드 디스뮤타제 (Psod)의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)으로부터의 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 17
5'-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3'
서열 18
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3'
얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 PmetA metA 서열 16 플라스미드로부터 출발하여, metA를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 19 및 서열 20을 사용하여 부분적으로 증폭시켰다.
서열 19
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
서열 20
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
약 470 염기쌍의 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 얻어진 2개의 단편을 추가의 PCR 반응에서 주형으로서 함께 사용하였다. PCR 반응의 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 18과 함께 도입된 metA-상동성 서열은 2개의 단편을 서로 부착시키고 사용된 폴리머라제에 의해 연장시켜 연속적인 DNA 스트랜드를 생성시킨다. 제2 사이클 개시시에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 17 및 서열 20만을 반응 혼합물에 첨가하였다는 점에서 표준 방법을 변형시켰다.
약 675 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 XhoI 및 NcoI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 620 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
PmetA metA 서열 16 플라스미드를 제한 효소 NcoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하였다. 겔 전기영동에 의한 분획화 후에, 약 0.7　kb metA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
pClik5MCS 서열 13 벡터를 제한 효소 XhoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 5　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편 및 metA 단편과 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20　㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
얻어진 플라스미드 pCLiK5MCS PSODmetA를 서열 21로 나열한다.
실시예 4:
플라스미드 pCLiK5MCS P EF -TU metA 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 22 및 서열 23, 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 수퍼옥시드 디스뮤타제 (Psod)의 비코딩 5' 영역 (프로모터 영역)으로부터의 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 22
5'-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3'
서열 23
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3'
얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 PmetA metA 서열 16 플라스미드로부터 출발하여, metA를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 24 및 서열 25를 사용하여 부분적으로 증폭하였다.
서열 24
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
서열 25
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
약 470 염기쌍의 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 얻어진 2개의 단편을 추가의 PCR 반응에서 주형으로서 함께 사용하였다. PCR 반응의 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 18과 함께 도입된 metA-상동성 서열은 2개의 단편을 서로 부착시키고 사용된 폴리머라제에 의해 연장시켜 연속적인 DNA 스트랜드를 생성시킨다. 제2 사이클 개시시에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 22 및 서열 25만을 반응 혼합물에 첨가하였다는 점에서 표준 방법을 변형시켰다.
약 675 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 XhoI 및 NcoI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 620 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
PmetA metA 서열 16 플라스미드를 제한 효소 NcoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하였다. 겔 전기영동에 의한 분획화 후에, 약 0.7　kb metA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
pClik5MCS 서열 13 벡터를 제한 효소 XhoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 5　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편 및 metA 단편과 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
얻어진 플라스미드 pCLiK5MCS P_EFTUmetA를 서열 26으로 나열한다.
실시예 5:
플라스미드 pCLiK5MCS Pgro metA 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 27 및 서열 28, 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, GroES 유전자 (Pgro)의 비코딩 5' 영역 (프로모터 영역)으로부터의 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 27
5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3'
서열 28
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3'
얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 PmetA metA 플라스미드로부터 출발하여, metA를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 29 및 서열 30을 사용하여 부분적으로 증폭하였다.
서열 29
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
서열 30
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
약 470 염기쌍의 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
상기 얻어진 2개의 단편을 추가의 PCR 반응에서 주형으로서 함께 사용하였다. PCR 반응의 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 28과 함께 도입된 metA-상동성 서열은 2개의 단편을 서로 부착시키고 사용된 폴리머라제에 의해 연장시켜 연속적인 DNA 스트랜드를 생성시킨다. 제2 사이클 개시시에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 27 및 서열 30만을 반응 혼합물에 첨가하였다는 점에서 표준 방법을 변형시켰다.
약 675 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 XhoI 및 NcoI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 620 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
PmetA metA 서열 16 플라스미드를 제한 효소 NcoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하였다. 겔 전기영동에 의한 분획화 후에, 약 0.7　kb metA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
pClik5MCS 서열 13 벡터를 제한 효소 XhoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 5　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편 및 metA 단편과 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
얻어진 플라스미드 pCLiK5MCS Pgro metA를 서열 31로 나열한다.
실시예 6:
플라스미드 P EF -TS metA 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 BK 1849 (서열 32) 및 BK 1862 (서열 33), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 MetaA 유전자를 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
BK 1849 (서열 32)
5'-GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG-3'
BK 1862 (서열 33)
5'-ATGCCCACCCTCGCGCC-3'
얻어진 약 1134　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 Haf 26 (서열 34) 및 Haf 27 (서열 35), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 연장 인자 TS를 코딩하는 유전자의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)으로부터의 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
Haf 26 (서열 34)
5'-GAGAGGATCCCCCCCACGACAATGGAAC-3'
Haf 27 (서열 35)
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTACGGGGCGATCCTCCTTATG-3'
얻어진 약 195　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
Haf 27 및 BK 1862 프라이머는 중복 서열을 포함하고, 그들의 5' 말단은 서로 상동성이다.
상기 얻어진 PCR 산물을 프라이머 BK 1849 (서열 32) 및 Haf 26 (서열 34)을 이용하는 또다른 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다.
이 방법을 사용하여, 1329　bp의 예상 크기에 대응하는 DNA 단편을 증폭하였다. 이어서, 상기 P EF-TS/metA 융합체를 BamHI 및 SalI 제한 절단 부위를 통해 pClik 5a MCS (서열 13) 벡터 내로 클로닝하였다.
벡터 단편를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편과 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드를 pClik 5a MCS P EF-TS metA (서열 36)으로 칭하였다.
실시예 7:
플라스미드 P EF - Tu pSOD metA ( H473 )의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 BK 1753 (서열 37) 및 BK 1754 (서열 38), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, GroEL 터미네이터를 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
BK 1753 (서열 37)
GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG
BK 1754 (서열 38)
GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC
얻어진 약 77　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하고, XbaI 및 BcuI 제한 효소로 절단하고, 한번 더 정제하였다.
pClik5MCS (서열 13) 벡터를 XbaI 제한 효소로 선형화시키고, 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
선형화된 벡터를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편과 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드를 H247 (서열 39)로 칭한다.
상기 플라스미드를 BcuI 및 SalI 제한 효소로 처리하고, 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
올리고뉴클레오티드 BK 1848 (서열 40) 및 BK 1849 (서열 41), 주형으로서의 pClik5MCS Psod metA (서열 21) 플라스미드 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용한 PCR을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 수행하였다. 증폭된 단편의 예상된 길이는 약 1350　bp이었고, 이를 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하고, BcuI 및 SalI 제한 효소로 절단하여 한번 더 정제하였다.
상기 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 H247 플라스미드 (BcuI 및 SalI 절단 부위)와 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드를 pG A4 (H344)로 칭하였고, 서열 42에 나열한다.
서열 40 (BK 1848)
GAGAACTAGTAGCTGCCAATTATTCCGGG
서열 41 (BK 1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
pG A4 (서열 42) 플라스미드를 XhoI 및 BcuI 제한 효소로 절단하고, 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
H473의 제조:
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 BK 1695 (서열 43) 및 Haf16 (서열 44), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, EF Tu 유전자 (Peftu)의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)으로부터의 약 182 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 43 (BK1695)
GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG
서열 44 (Haf16)
GAGAACTAGTGTGGCTACGACTTTCGCAGC
얻어진 약 200　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하고, XhoI 및 BcuI 제한 효소로 절단하여 한번 더 정제하였다.
상기 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 pG A4 (H344) 플라스미드 (XhoI 및 BcuI 절단 부위)와 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
얻어진 플라스미드를 pClik5MCS PeftuPsod metA (H473)로 칭하였다. 이를 서열 45에 나열한다. 이는 (5'에서 3'으로) Peftu 프로모터, Psod 발현 유닛 및 그의 바로 하류의 metA 개방 해독 프레임을 포함한다.
실시예 8:
플라스미드 PsodPeftu metA ( H505 )의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 46 (Haf64) 및 서열 47 (Haf65), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, EF Tu 유전자 (Peftu)의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)으로부터의 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 46 (Haf64)
GAGAACTAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG
서열 47 (Haf65)
GCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGACTTC
얻어진 약 200　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
제2 PCR에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 BK1862 (서열 48) 및 BK1849 (서열 49) 및 주형으로서의 H344 (서열 42) 플라스미드를 사용하여, metA 개방 해독 프레임을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 증폭시켰다. 얻어진 약 1140　bp 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
서열 48 (BK1862)
ATGCCCACCCTCGCGCC
서열 49 (BK1849)
GTGTGTCGACTTAGATGTAGAACTCGATGTAG
상기 얻어진 2개의 단편을 추가의 PCR 반응에서 주형으로서 함께 사용하였다. PCR 반응의 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 Haf 65 (서열 47)과 함께 도입된 metA-상동성 서열은 2개의 단편을 서로 부착시키고 사용된 폴리머라제에 의해 연장시켜 연속적인 DNA 스트랜드를 생성시킨다. 제2 사이클 개시시에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Haf 64 및 BK 1849 (서열 46 및 서열 49)만을 반응 혼합물에 첨가하였다는 점에서 표준 방법을 변형시켰다.
약 1350 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 BcuI 및 SalI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 1340 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다. 이 단편은 metA ORF에 융합된 Peftu 발현 유닛 (=　Peftu-metA 단편)을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 BK 1697 (서열 50) 및 Haf17 (서열 　51), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, SOD 유전자 (Psod)의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)으로부터의 DNA 단편 (총 길이: 193　bp, 이중 173 bp는 pSOD임)을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 50 (BK 1697)
GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG
서열 51 (Haf 17)
GAGAACTAGTTAGGTTTCCGCACCGAGC
증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 XhoI 및 BcuI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 180 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다 (= Psod 단편).
(H344) pG A4 (서열 42) 플라스미드를 제한 효소 XhoI 및 SalI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 선형화된 벡터를 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
선형화된 벡터를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 2개의 단편 (Peftu-metA 단편 및 Psod 단편)과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드 pClik5MCS PsodPeftu metA를 서열 52로 나열한다.
실시예 9:
플라스미드 pClik5MCS Pgro Psod metA ( H472 )의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 53 (BK1701) 및 서열 54 (Haf18), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 약 175 뉴클레오티드 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다. 상기 단편은 GRO EL 유전자 (Pgro)의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)으로부터의 155 염기쌍, 및 5' 및 3' 말단에 각각 하나의 제한 절단 부위 (각각 XhoI 및 BcuI)를 포함한다.
서열 53 (BK1701)
GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC
서열 54 (Haf018)
GAGAACTAGTATTTTGTGTGTGCCGGTTGTG
얻어진 약 175　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 XhoI 및 BcuI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
H344 (서열 42) 플라스미드를 XhoI 및 BcuI 제한 효소로 절단하고, 약 6.4　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
PCR 산물 및 절단 개방된 H344 플라스미드를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다.
서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드는 Pgro 프로모터와, 바로 그 다음에 존재하는 Psod 발현 유닛 및 metA ORF를 포함한다. 이를 서열 55에 pCLiK5MCS PgroPsod metA (H472)로서 나열한다.
실시예 10:
플라스미드 PgroPsod Pefts metA ( H501 )의 제조
올리고뉴클레오티드 프라이머 BK1782 (서열 56) 및 Haf63 (서열 57) 및 주형으로서의 pClik5MCS Pgro Psod metA (서열 55 (H472)) 플라스미드를 사용한 PCR을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 수행하였다. 증폭된 단편은 약 474 염기쌍 및 3' 말단에 Acc65I 절단 부위를 갖는 Pgro-Psod 카세트를 포함한다. 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 XhoI 및 Acc65I 제한 효소로 절단하고, DNA 단편 (333 염기쌍)을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
서열 56 (BK1782)
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
서열 57 (Haf 63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
H479 (서열 58) 플라스미드는 metA ORF에 융합된 Pefts 발현 유닛을 포함한다. 이를 XhoI 및 Acc65I 제한 효소로 (Pefts의 바로 상류에서) 절단하고, 약 6.4　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
이어서, 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편 (Pgro-Psod 카세트)과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드는 metA ORF에 융합된 3개의 프로모터, 즉 Pgro, Psod 및 P EF-TS를 포함한다. 이를 서열 59에 pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA (H501)로서 나열한다.
실시예 11:
플라스미드 Peftu Psod Pefts metA ( H502 )의 제조
올리고뉴클레오티드 프라이머 BK1782 (서열 56) 및 Haf63 (서열 57) 및 주형으로서의 pClik5MCS Peftu Psod (서열 45 (H473)) 플라스미드를 사용한 PCR을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 수행하였다. 증폭된 단편은 약 495 염기쌍 및 3' 말단에 Acc65I 절단 부위를 갖는 Peftu-Psod 카세트를 포함한다. 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 XhoI 및 Acc65I 제한 효소로 절단하고, DNA 단편 (354 염기쌍)을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
서열 56 (BK1782)
TCGAGAGATTGGATTCTTAC
서열 57 (Haf 63)
TCTCGGTACCCCGCACCGAGCATATACATC
H479 (서열 58) 플라스미드는 metA ORF에 융합된 Pefts 발현 유닛을 포함한다. 이를 XhoI 및 Acc65I 제한 효소로 (Pefts의 바로 상류에서) 절단하고, 약 6.4　kb 단편을 전기영동 분획화 후에 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.
이어서, 이를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 PCR 단편 (Peftu-Psod 카세트)에 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드는 metA ORF에 융합된 3개의 조절 서열, 즉 Peftu, Psod 및 P EF-TS를 포함한다. 이를 서열 60에 pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA (H501)로서 나열한다.
실시예 12:
metA 활성의 측정
코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032를 각각의 경우에 플라스미드 pClik5 MCS, pClik MCS Psod metA, pClik MCS Peftu metA, pClik5 MCS Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod metA, pClik5 MCS Psod Peftu metA, pClik5 MCS Pgro Psod metA, pClik5 MCS Pgro Psod Pefts metA, pClik5 MCS Peftu Psod Pefts metA로 문헌 [Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303]에 기재된 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 선택하기 위해서 20　mg/l 카나마이신을 추가로 포함하는 CM 플레이트에 형질전환 혼합물을 도말하였다. 얻어진 Kan-내성 클론을 분리하였다.
상기 임의의 플라스미드 구성체를 포함하는 씨. 글루타미쿰 균주를 MMA 배지 (40　g/l 수크로스, 20　g/l (NH4)2SO4, 1　g/l KH2PO4, 1　g/l K2HPO4, 0.25　g/MgSO4 x 7H2O, 54 g의 Aces, 1　ml의 CaCl2 (10　g/l), 1　ml의 프로토카테추에이트 (300 mg/10 ml), 1　ml의 미량 원소 용액 (10 g/l FeSO4 x /H2O, 10 g/l MnSO4 x H2O, 2 g/l ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 g/l CuSO4, 0,02 g/l NiCl2 x 6 H2O), 100 ㎍/l 비타민 B12, 0.3 mg/l 티아민, 1 mM 류신, 1 mg/l 피리독살 HCl, 1 ml의 비오틴 (100 mg/l), pH　7.0) 중에서 30℃에서 철야 성장시켰다. 세포를 4℃에서 원심분리시켜 제거하고, 차가운 Tris-HCl 버퍼 (0.1%, pH 8.0)로 2회 세척하였다. 다시 원심분리한 후, 세포를 차가운 Tris-HCl 버퍼 (0.1%, pH 8.0)에 용해시키고, OD600을 160으로 조정하였다. 1　ml의 상기 세포 현탁액을 2-ml Hybaid Ribolyser 튜브에 이송하여 세포를 붕괴시키고, 6.0으로 회전이 설정된 Hybaid Ribolyser에서 각각의 경우에 30초 동안 3회 용해시켰다. 용해액을 Eppendorf 원심분리기에서 4℃에서 30분 동안 15,000　rpm으로 원심분리시켜 투명하게 만들고, 상등액을 새 Eppendorf 컵에 이송하였다. 단백질 함량은 문헌 [Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254]에 따라 결정하였다.
MetA의 효소 활성은 다음과 같이 측정하였다. 1-ml 반응 혼합물은 100　mM 인산칼륨 버퍼 (pH 7.5), 5　mM MgCl2, 100 μM 아세틸-CoA, 5　mM L-호모세린, 500 μM DTNB (Ellman 시약) 및 세포 추출물을 포함하였다. 관련 단백질 용해액을 첨가하여 분석을 개시하고, 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 동역학을 412　nm에서 10분 동안 기록하였다.
그 결과를 표 1a에 나타낸다.
균주 내부 구성체 명칭 비활성
ATCC 13032 pCLiK5MCS H356 (metZ) 3.1
ATCC 13032 pCLiK5MCS Psod metA H144 1308.7
ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu metA H146 1233.0
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pefts metA H479 2339.0
ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu Psod metA H473 2308.1
ATCC 13032 pCLiK5MCS Psod Peftu metA H505 2061.9
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro Psod metA H472 1501.6
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro Psod Pefts metA H501 1773.4
ATCC 13032 pCLiK5MCS Peftu Psod Pefts metA H502 2262.2
프로모터/발현 유닛의 다양한 조합을 사용하여 metA 활성을 조절할 수 있었다.
실시예 13:
플라스미드 pCIS lysC 의 제조
리신 생산 균주를 제조하기 위해, lysC 야생형 유전자의 대립유전자 치환을 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 수행하였다. 이는 생성 단백질에서 위치 311의 아미노산 Thr을 Ile으로 치환하기 위해 lysC 유전자에서 뉴클레오티드 치환을 수반하였다. PCR 반응을 위한 주형으로서 ATCC 13032의 염색체 DNA로부터 출발하여, lysC를 제조사의 정보에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 61 및 서열 62를 사용하여 Pfu-Turbo PCR Systems (스트라타젠)에서 증폭시켰다.
서열　61
5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3'
서열 62
5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3'
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 증폭된 단편에는 그의 5' 말단에 SalI 제한 절단부 및 그의 3' 말단에 MluI 제한 절단부가 인접한다. 클로닝 전에, 증폭된 단편을 상기 2개의 제한 효소로 절단하고, GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
얻어진 폴리뉴클레오티드를 SalI 및 MluI 제한 절단부를 통해 pCLIK5 MCS 통합 (integrative) SacB (이하에서 pCIS로 칭함) (서열 63) 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 XL-1 blue 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190). 플라스미드를 단리하고, 예상된 뉴클레오티드 서열을 서열 결정에 의해 확인하였다. 플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다. 얻어진 플라스미드 pCIS lysC를 서열　64로 나열한다.
실시예 14:
씨. 글루타미쿰 lysC 유전자의 돌연변이 유발
씨. 글루타미쿰 lysC 유전자의 지정 돌연변이 유발은 제조사의 정보에 따라 Quick-Change Kit (스트라타젠)를 사용하여 수행하였다. 돌연변이 유발은 pCIS lysC (서열 64) 플라스미드에서 수행하였다. Quick-Change 방법 (스트라타젠)을 사용하여 thr311을 311Ile로 치환하기 위해, 다음 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
서열 65
5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3'
서열 66
5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3'
Quick-Change 반응에 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하면 lysC 유전자 (서열 　67)에서 위치 932의 뉴클레오티드의 치환 (C에서 T로)이 발생한다. lysC 유전자의 생성되는 아미노산 치환 Thr311Ile은 이. 콜라이 XL1-blue 내로의 형질전환 및 플라스미드 제조 후에 서열 결정 반응에 의해 확인하였다. 플라스미드는 pCIS lysC thr311ile로 명명하고, 서열 　68로서 나열한다.
pCIS lysC thr311ile 플라스미드를 문헌 [Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303]에 기재된 바와 같은 전기천공에 의해 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 내로 형질전환시켰다. 프로토콜의 변형은 DE　10046870에 기재되어 있다. 개개의 형질전환체의 lysC 로커스의 염색체 배열은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같이 서던 블로트 및 혼성화를 통한 표준 방법에 의해 조사하였다. 그 결과, 형질전환체는 형질전환된 플라스미드를 상동성 재조합에 의해 lysC 로커스에서 통합시켰음이 확인되었다. 상기 콜로니를 항생제를 포함하지 않는 배지에서 철야 성장시킨 후, 세포를 수크로스 CM-아가 배지 (10% 수크로스, 10 g/l 글루코스; 2.5 g/l NaCl; 2 g/l 우레아, 10　g/l Bacto Peptone (딥코); 10 g/l 효모 추출물, 22.0 g/L 아가 (딥코)) 상에 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다.
pCIS lysC thr311ile 벡터에 존재하는 sacB 유전자는 수크로스를 독성 산물로 전환시키기 때문에, 야생형 lysC 유전자와 돌연변이된 lysC thr311ile 유전자 사이의 제2 상동성 재조합 단계에 의해 sacB 유전자가 삭제된 콜로니만이 성장할 수 있다. 상동성 재조합 동안, 야생형 유전자 또는 돌연변이된 유전자가 sacB 유전자와 함께 삭제될 수 있다. sacB 유전자가 야생형 유전자와 함께 삭제되면, 돌연변이된 형질전환체가 생성된다.
성장하는 콜로니를 카나마이신-감수성 표현형에 대해 시험한다. sacB 유전자가 삭제된 클론은 동시에 카나마이신-감수성 성장 거동을 보여야 한다. 상기 Kan-감수성 클론은 그의 리신 생산성에 대해 진탕 플라스크에서 시험하였다 (실시예 19 참조). 비처리된 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032를 비교를 위해 성장시켰다. 대조군에 비해 리신 생산이 증가한 클론을 선택하고, 염색체 DNA를 회수하여 lysC 유전자의 대응하는 영역을 PCR 반응에 의해 증폭시키고 서열결정하였다. 리신 합성이 증가하고 위치 932에서 lysC의 돌연변이가 검출된 상기 종류의 클론을 ATCC 13032 lysCfbr로 명명하였다.
실시예 15:
플라스미드 pCIS Peftu ddh 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 69 (Old38) 및 서열 70 (Old 39), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, EFTu 유전자 (Peftu)의 비코딩 5' 영역 (발현 유닛의 영역)을 포함하는 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 69 (Old38)
ACATCCATGGTGGCCGTTACCCTGCGAAT
서열 70 (Old 39)
TGTATGTCCTCCTGGACTTC
얻어진 약 200　bp DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 Old40 (서열 71) 및 서열 72 (Old 37) 및 주형으로서의 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 사용하는 제2 PCR에서, ddh 개방 해독 프레임을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 바와 같은 표준 방법으로 증폭하였다. 얻어진 약 1017　bp 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.
Old40 (서열 71)
GAAGTCCAGGAGGACATACAATGACCAACATCCGCGTAGC
Old 37 (서열 72)
GAAACCACACTGTTTCCTTGC
상기 얻어진 2개의 단편을 추가의 PCR 반응에서 주형으로서 함께 사용하였다. PCR 반응의 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 Old40 서열 71과 함께 도입된 Peftu-상동성 서열은 2개의 단편을 서로 부착시키고 사용된 폴리머라제에 의해 연장시켜 연속적인 DNA 스트랜드를 생성시킨다. 제2 사이클 개시시에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Old37 및 Old 38 (서열 72 및 서열 69)만을 반응 혼합물에 첨가하였다는 점에서 표준 방법을 변형시켰다.
약 1207 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 NcoI 및 XhoII (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 약 1174 염기쌍의 DNA 단편을 이어서 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다. 상기 단편은 ddh ORF에 융합된 Peftu 발현 유닛 (=　Peftu-ddh 단편)을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 Old 32 (서열 73) 및 Old 33 (서열 74), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, ddh 유전자의 비코딩 5' 영역으로부터의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 73 (Old32)
ATCAACGCGTCGACACCACATCATCAATCAC
서열 74 (Old33)
ATCACCATGGGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTG
증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 MluI 및 NcoI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 720 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다 (= 5' ddh 단편).
pCIS (서열 63) 플라스미드를 제한 효소 MluI 및 XhoI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 선형화된 벡터를 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
선형화된 벡터를 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 2개의 단편 (Peftu-ddh 단편 및 5' ddh 단편)과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
플라스미드 DNA는 퀴아겐의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다.
생성되는 플라스미드 pCIS Peftu ddh를 서열 75로 나열한다.
실시예 16:
pCIS PeftuPsod ddh 의 제조
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 76 및 서열 77, 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, ddh 유전자의 5' 영역으로부터의 약 677 염기쌍의 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다.
서열 76 (CK461)
CCTGACGTCGCAATATAGGCAGCTGAATC
서열 77 (CK466)
GCCCAATTGGTTCTTGTAATCCTCCAAAA
얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이를 후속적으로 제한 효소 AatII 및 MunI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 이어서, 약 661 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다. 생성되는 단편은 ddh ORF의 5' 영역을 포함한다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 P EF-Tu pSOD metA (H473) (서열 45) 플라스미드로부터 출발하여, PeftuPsod 카세트를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 78 및 서열 79를 사용하여 증폭시켰다.
서열 78 (CK426)
CGCCAATTGTCGAGGGCCGTTACCCT
서열 79 (CK463)
GCTACGCGGATGTTGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTA
약 378 염기쌍의 얻어진 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
ddh ORF를 후속 PCR에서 증폭하였다. 이를 위해, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]에 따라 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 80 (CK464) 및 서열 81 (CK467), 주형으로서의 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여, 약 992 염기쌍의 DNA 단편 (ddh ORF)을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
서열 80 (CK464)
TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCAACATCCGCGTAGC
서열 81 (CK467)
AGACCCGGGTTAGACGTCGCGTGCGATCA
상기 얻어진 2개의 단편 (PeftuPsod 카세트 및 ddh ORF)을 추가의 PCR 반응에서 주형으로서 함께 사용하였다. PCR 반응의 과정에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 80 (CK464)과 함께 도입된 Psod-상동성 서열은 2개의 단편을 서로 부착시키고 사용된 폴리머라제에 의해 연장시켜 연속적인 DNA 스트랜드를 생성시킨다. 제2 사이클 개시시에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 79 (CK426) 및 서열 81 (CK467)만을 반응 혼합물에 첨가하였다는 점에서 표준 방법을 변형시켰다.
약 1359 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
이를 후속적으로 제한 효소 MunI 및 SmaI (로셰 다이아그노스틱스)로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분획화시켰다. 약 1359 염기쌍의 DNA 단편을 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.
생성되는 단편은 (5'에서 3'으로) Peftu 프로모터, Psod 발현 유닛 및 그의 바로 하류에 ddh 개방 해독 프레임 (PeftuPsod ddh)를 포함한다.
pCIS 벡터를 AatII 및 SmaI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 제조사의 정보에 따라 알칼리 포스파타제 (로셰 다이아그노스틱스)에 의해 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동시킨 후에, 선형화된 벡터 (약 4.2　kb)를 제조사의 정보에 따라 GFX™ PCR, DNA 및 Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조사의 정보에 따라 Rapid DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스)를 사용하여 2개의 절단된 PCR 단편 (5'ddh 및 PeftuPsod ddh)과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/ml)을 함유하는 LB 아가에 도말하여 달성하였다 (Lennox, 1955, Virology, 1:190).
개개의 클론의 플라스미드 DNA를 제조사의 정보에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit (퀴아겐)를 사용하여 단리하고 제한 소화를 통해 검토하였다. 2개의 정확한 플라스미드의 서열을 결정하였다. 서열 결정 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 서열 결정 반응물을 분획화시키고, ABI Prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)에 의해 평가하였다. 생성되는 플라스미드 pClik Peftu Psod ddh는 2회의 연속적인 재조합을 사용하여 PeftuPsod 카세트를 ddh ORF의 상류에서 염색체 내에 통합시키기 위해 적합하다.
pCIS PeftuPsod ddh 플라스미드를 서열 82로 나열한다.
실시예 17:
균주 ATCC 13032 lysC fbr Peftu ddh 및 ATCC 13032 lysC fbr PeftuPsod ddh 의 생성
이. 콜라이 균주 Mn522 (스트라타젠, 네덜란드 암스테르담)의 세포를 문헌 [Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303]에 따라 플라스미드 pCIS Peftu ddh 및 pCIS PeftuPsod ddh 중의 어느 하나로 및 플라스미드 pTc15AcglM으로 형질전환시켰다. pTc15AcglM 플라스미드는 코리네박테리움 글루타미쿰 메틸화 패턴에 따라 DNA가 메틸화되도록 한다 (DE 10046870). 상기 메틸화는 pCIS Peftu ddh 및 pCIS PeftuPsod ddh 플라스미드의 씨. 글루타미쿰 세포 내에서의 안정성을 증가시킨다. 플라스미드 DNA를 표준 방법에 의해 Mn522 세포로부터 후속적으로 단리하고, 전기천공에 의해 상기한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032 ask (fbr) 내로 도입하였다. 상기 전기천공 및 카나마이신 (25 ㎍/ml)을 포함하는 CM 플레이트 상에서의 후속적인 선택을 통해 다수의 트랜스컨쥬건트 (transconjugant)를 생성시켰다. 벡터를 절제하여야 하는 제2 재조합 사건에 대해 선택하기 위해, 상기 트랜스컨쥬건트를 카나마이신이 없는 CM 배지에서 철야 성장시키고, 후속적으로 선택을 위해 10% 수크로스를 포함하는 CM 플레이트 상에 도말하였다. pCIS 벡터에 존재하는 sacB 유전자는 효소 레반 슈크라제를 코딩하고, 수크로스 상에서 성장시키면 레반을 합성한다. 레반은 씨. 글루타미쿰에 독성이기 때문에, 제2 재조합 단계에 의해 통합 플라스미드를 상실한 씨. 글루타미쿰 세포만이 수크로스 함유 배지에서 성장한다 (Jaeger et al., Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). 100개의 수크로스-내성 클론을 그의 카나마이신 감수성에 대해 조사하였다. 시험된 다수의 클론에서, 수크로스에 대한 내성에 추가하여 카나마이신에 대한 감수성도 검출되었고, 이는 벡터 서열의 요구되는 절제시에 예상되는 것이다. Peftu 또는 PeftuPsod 발현 유닛의 요구되는 통합이 발생하였는지를 조사하기 위해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)을 사용하였다. 이를 위해, 특정 클론을 이쑤시개로 아가 플레이트로부터 분리하여 100 ㎕의 H2O에 현탁시키고, 95℃에서 10분 동안 비등시켰다. 얻어진 10　ml의 용액을 각각의 경우에 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 사용된 프라이머는 도입되는 발현 유닛 및 ddh 유전자에 상동성인 올리고뉴클레오티드이었다. PCR 조건은 다음과 같이 선택되었다: 초기 변성: 95℃에서 5분; 변성: 95℃에서 30초; 혼성화: 55℃에서 30초; 증폭: 72℃에서 2분; 30 사이클: 최종 연장: 72℃에서 5분. 출발 균주의 DNA를 포함하는 반응 혼합물에서, 올리고뉴클레오티드의 선택은 어떠한 PCR 산물도 생산하지 않았다. 밴드는 제2 재조합의 결과로서 Peftu 또는 PeftuPsod 발현 유닛이 ddh 유전자의 바로 5'에 통합된 클론에 대해서만 예상되었다. 양성으로 시험된 클론에 의한 성공적인 통합은 또한 서던 블로트 분석을 통해서도 확인하였다 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해). 제한 효소를 사용한 2개의 상이한 가수분해를 생성되는 각각의 균주에 대해 수행하였고, 이 가수분해는 출발 균주 (ATCC 13032 ask (fbr)) 및 요구되는 균주가 명백하게 구별되도록 한다. 얻어진 균주가 어떠한 카나마이신 유전자도 염색체에 갖지 않는다는 사실은 또한 카나마이신 내성 유전자에 상동성인 프로브를 사용하여 확인하였다.
따라서, 다음 균주를 생성하였다:
ATCC 13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC 13032 lysCfbr PeftuPsod ddh
모든 상기 균주는 피드백-탈조절된 (deregulated) ask 유전자를 포함하고, 따라서 리신을 생산한다. 이들 균주는 ddh 유전자의 전사를 조절하는 조절 유닛만 서로 상이하다.
실시예 18:
리신 생산에 대한 이중 프로모터에 의한 ddh 증강 효과
이중 프로모터를 사용한 ddh 유전자의 증강 효과를 연구하기 위해, 다음 균주를 리신 생산에 대해 시험하였다:
ATCC 13032 lysCfbr
ATCC 13032 lysCfbr Peftu ddh
ATCC 13032 lysCfbr Peftu Psod ddh
이를 위해, 균주를 CM 플레이트 (10.0 g/L D-글루코스, 2.5　g/L NaCl, 2.0 g/L 우레아, 10.0 g/L Bacto Peptone (딥코), 5.0 g/L 효모 추출물 (딥코), 5.0　g/L 소고기 추출물 (딥코), 22.0 g/L 아가 (딥코), 고압살균 (20분, 121℃)) 상에서 30℃에서 3일 동안 성장시켰다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 긁어내어 염수에 재현탁시켰다. 주 배양을 위해, 100　ml 얼렌마이어 플라스크 중에서 10　ml의 배지 I 및 0.5　g의 고압살균된 CaCO3 (리이델 데 하엔 (Riedel de Haen))에 OD600이 1.5가 되도록 세포 현탁액으로 접종하고, Infors AJ118 (인포르스 (Infors, 스위스 보트밍겐))으로 220　rpm에서 40　h 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 배지 내로 분비된 리신의 농도를 측정하였다.
배지 I:
40　g/l 수크로스
60　g/l 당밀 (100% 당 함량 기준)
10　g/l (NH4)2SO4
0.4　g/l MgSO4*7H2O
0.6　g/l KH2PO4
0.3　mg/l 티아민*HCl
1　mg/l 비오틴 (여과 멸균되고 NH4OH를 사용하여 pH 8.0으로 조정된 1　mg/ml 원액으로부터)
2　mg/l FeSO4
2　mg/l MnSO4
NH4OH를 사용하여 pH 7.8로 조정하고, 고압살균하였다 (121℃, 20분).
추가로, 비타민 B12 (히드록시코발라민, 시그마 케미칼스 (Sigma Chemicals)를 원액 (200 ㎍/ml, 여과 멸균됨)으로부터 최종 농도 100 ㎍/l로 첨가한다.
아미노산 농도는 Agilent 1100 Series LC System HPLC로 Agilent의 지시에 따라 고압 액체 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 오르토-프탈알데히드를 사용한 가드 (guard) 컬럼 유도체화를 통해 형성된 아미노산을 정량하고, 아미노산 혼합물을 Hypersil AA 컬럼 (Agilent)로 분획화시켰다.
연구 결과를 하기 표에 제시한다.
균주 상대 리신 농도 (%)
ATCC 13032 lysCfbr 100
ATCC 13032 lysCfbr Peftu ddh 102.9
ATCC 13032 lysCfbr PeftuPsod ddh 106.9
SEQUENCE LISTING <110> BASF AG <120> Mehrfachpromotoren <130> M/45256 <160> 84 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 177 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <223> pGRO <220> <221> misc_feature <222> (1)..(177) <223> promoter sequence if no further downstream promoter occurs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(155) <223> promoter sequence if a further promoter is attached downstream <220> <221> misc_feature <222> (70)..(75) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (165)..(172) <223> putative ribosome binding sequence <400> 1 cggcttaaag tttggctgcc atgtgaattt ttagcaccct caacagttga gtgctggcac 60 tctcgggggt agagtgccaa ataggttgtt tgacacacag ttgttcaccc gcgacgacgg 120 ctgtgctgga aacccacaac cggcacacac aaaatttttc tcatggaggg attcatc 177 <210> 2 <211> 195 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <223> pEFTS <220> <221> misc_feature <222> (1)..(195) <223> promoter sequence if no further downstream promoter occurs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(178) <223> promoter sequence if a further promoter is attached downstream <220> <221> misc_feature <222> (147)..(152) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (162)..(167) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (179)..(185) <223> putative ribosome binding sequence <400> 2 cccccacgac aatggaactt tgacttttaa aatttcatcg ccgtgggggc tttttgggca 60 gccagcccgc cgtgtcgcaa cgtaatcgac tgaatacctg tacgatcact ttttagacgg 120 gcgggtaggg ctactgtgcc ctaacctaag cttgtaaagc attaattatc catacataag 180 gaggatcgcc ccgta 195 <210> 3 <211> 199 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <223> pEFTU <220> <221> misc_feature <222> (1)..(199) <223> promoter sequence if no further downstream promoter occurs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(176) <223> promoter sequence if a further promoter is attached downstream <220> <221> misc_feature <222> (36)..(41) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (63)..(68) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (92)..(97) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (187)..(193) <223> putative ribosome binding sequence <400> 3 ggccgttacc ctgcgaatgt ccacagggta gctggtagtt tgaaaatcaa cgccgttgcc 60 cttaggattc agtaactggc acattttgta atgcgctaga tctgtgtgct cagtcttcca 120 ggctgcttat cacagtgaaa gcaaaaccaa ttcgtggctg cgaaagtcgt agccaccacg 180 aagtccagga ggacataca 199 <210> 4 <211> 191 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <223> pSOD <220> <221> misc_feature <222> (1)..(191) <223> promoter sequence if no further downstream promoter occurs <220> <221> misc_feature <222> (1)..(173) <223> promoter sequence if a further promoter is attached downstream <220> <221> misc_feature <222> (65)..(70) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (86)..(92) <223> putative -10 region <220> <221> misc_feature <222> (175)..(181) <223> putative ribosome binding sequence <400> 4 agctgccaat tattccgggc ttgtgacccg 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acgccgacga cgtggacgtg ctgttcctgt 5460 gcatgggctc cgccaccgac atccctgagc aggcaccaaa gttcgcgcag ttcgcctgca 5520 ccgtagacac ctacgacaac caccgcgaca tcccacgcca ccgccaggtc atgaacgaag 5580 ccgccaccgc agccggcaac gttgcactgg tctctaccgg ctgggatcca ggaatgttct 5640 ccatcaaccg cgtctacgca gcggcagtct tagccgagca ccagcagcac accttctggg 5700 gcccaggttt gtcacagggc cactccgatg ctttgcgacg catccctggc gttcaaaagg 5760 cagtccagta caccctccca tccgaagacg ccctggaaaa ggcccgccgc ggcgaagccg 5820 gcgaccttac cggaaagcaa acccacaagc gccaatgctt cgtggttgcc gacgcggccg 5880 atcacgagcg catcgaaaac gacatccgca ccatgcctga ttacttcgtt ggctacgaag 5940 tcgaagtcaa cttcatcgac gaagcaacct tcgactccga gcacaccggc atgccacacg 6000 gtggccacgt gattaccacc ggcgacaccg gtggcttcaa ccacaccgtg gaatacatcc 6060 tcaagctgga ccgaaaccca gatttcaccg cttcctcaca gatcgctttc ggtcgcgcag 6120 ctcaccgcat gaagcagcag ggccaaagcg gagctttcac cgtcctcgaa gttgctccat 6180 acctgctctc cccagagaac ttggacgatc tgatcgcacg cgacgtctaa ccc 6233 <210> 83 <211> 7 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <223> ribosome binding sequence <400> 83 aggagga 7 <210> 84 <211> 1365 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <223> RAX077 <400> 84 atgaatgatg agaatattca aagctccaac tatcagccat tcccgagttt tgacgattgg 60 aaacagatcg aggtgtcgct cttagatgtc atcgaatcct cacgccattt ttctgatttg 120 aaagatagca ctgatcgttc tgcgttagat gctgcgctag agagagcaaa aagagctgcc 180 gcagttgata ccaatgccat agaaggaatc ttccaaactg atcgcggttt tacccataca 240 gttgcaacgc aggtaggggc ttgggagcaa caaatggcga tgaaaggcaa acatgttaag 300 cctgcgtttg acgatactct agaaggcttt gagtatgttc tcgatgcagt aactggtaga 360 actccaatct ctcagcaatg gattagaaat ttgcacgccg tcattctgcg gagccaagaa 420 agccacgagg tttttacagc cgttggagtc caaaatcagg cgcttcagaa aggcgagtat 480 aaaactcagc caaatagtcc acagcgctca gatggatctg tacatgcata cgccccagtt 540 gaagatactc ctgctgaaat ggctagattt atttcagaac ttgaatctaa ggaattctta 600 gcagccgaga aggttattca agctgcctat gcccactatg ctttcgtatg tattcatcct 660 tttgcagatg ggaatggacg agttgcacga gccttggcta gtgtttttct atacaaagat 720 cctggtgtcc ctctcgtaat ctaccaagat caacgcagag attacatcca tgctctagaa 780 gcagcggaca agaataaccc gctcctgctg attagattct ttgctgaacg agtgaccgat 840 actattaact ctattatcgt tgatctcact accccgatcg cgggtaaatc tggttcggct 900 aagctttcgg atgcgctacg ccccactcgc gtattaccag aattacatga tgctgcacat 960 aggctccaag aaagtttatt tacagaaatc cgatctcgat tggatgaaga aggaaaaagg 1020 aatgggttgg agtttctact tcaacggatt tttatcggtt ccccattcaa tctgccagag 1080 ggctataacg ctttccctga tagctattgt ctgaccttag ctttcaatag caactctcca 1140 aaacaaatct tccacccgct atccatagta atagcagctc gagatgggaa aagagcgagc 1200 agcgacctcg tggcagctac ttctattgga tacaactttc acgcttacgg acgtgaagtc 1260 gagcctgttg ttactgaaag ctttcgagaa cgtgtgaaaa tttacgccga cgggattgta 1320 gatcacttct taaccgaact ggctaaaaag tttcaacaga attaa 1365

Claims (18)

  1. 5'-3' 방향으로 하기 화학식 I의 서열 모듈을 포함하는, 다중 프로모터-포함 발현 유닛.
    <화학식 I>
    5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-3'
    여기서, n은 0 내지 10의 정수이고,
    Ax 및 Ay는 동일하거나 상이하고, 화학 결합 또는 링커 핵산 서열이고;
    P1, Px 및 Py는 적어도 하나의 RNA 폴리머라제 결합 섹션을 포함하는 동일하거나 상이한 프로모터 서열을 코딩하고; 적어도 Py는 리보좀 결합-매개 3' 말단 서열 섹션을 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, P1, Px 및 Py가 각각의 경우에 동일하거나 또는 상이한 진핵 또는 원핵 유기체로부터 유래되거나, 또는 인공 프로모터 서열인 발현 유닛.
  3. 제2항에 있어서, P1, Px 및 Py가 각각의 경우에 유기체의 게놈 내의 단백질에 대한 코딩 서열의 5' 상류에 위치하는 35 내지 500 뉴클레오티드 잔기의 연속적인 서열로부터 유래되는 것인 발현 유닛.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 유기체가 코리네형 세균인 발현 유닛.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, P1, Px 및 Py가 유기체에서 높은 풍부도를 갖는 단백질의 코딩 서열에 대한 프로모터 서열 중에서 서로 독립적으로 선택되는 것인 발현 유닛.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, P1, Px 및 Py가 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4 중에서 서로 독립적으로 선택되는 것인 발현 유닛.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 강력한 프로모터, 구성적 (constitutive) 프로모터 또는 조절가능 프로모터 중에서 선택되는 것인 발현 유닛.
  8. 5'-3' 방향으로 하기 화학식 II의 서열 모듈을 포함하는 발현 카세트.
    <화학식 II>
    5'-P1-(-Ax-Px-)n-Ay-Py-G-3'
    여기서, n, Ax, Ay, P1, Px 및 Py는 제1항에서 정의한 바와 같고,
    G는 5' 상류의 조절 서열에 기능적으로 연결되는 적어도 하나의 코딩 핵산 서열이다.
  9. 제8항에 있어서, G가
    a) 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    b) 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    c) 유기산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    d) 지질 및 지방산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    e) 디올의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    f) 탄수화물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    g) 방향족 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    h) 비타민의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    i) 보조인자의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산,
    j) 효소의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산 및
    k) 중추 대사의 단백질을 코딩하는 핵산
    중에서 선택되는 것인 발현 카세트.
  10. 제9항에 있어서, a)의 아미노산의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 신테타제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 조절인자 LuxR, 전사 조절인자 LysR1, 전사 조절인자 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마 신타제, 시스타티오닌 베타 리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 (exporter) 캐리어 (carrier), 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 리신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신 술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 조절인자, RXN2910 조절인자, 아르기닐-t-RNA 신테타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, OpcA 단백질, 1-포스포프럭토키나제, 6-포스포프럭토키나제, 테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐 아미노케토피멜레이트 아미노트랜스퍼라제, 숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 에놀라제, 피루베이트 키나제, 아스파르테이트 트랜스아미나제 및 말레이트 효소 중에서 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 발현 카세트.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환되거나, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 코리네형 세균으로부터 유래되는 유전적으로 변형된 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 또는 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속의 세균으로부터 유래된 유전적으로 변형된 미생물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 발현 카세트를 통합된 형태로 포함하는 유전적으로 변형된 미생물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 유전적으로 변형된 미생물을 배양하고, 목적하는 생성물을 배양액으로부터 단리하는 것을 포함하는, 생합성 산물의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 생합성 산물이 유기산, 단백질, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 효소 및 단백질 중에서 선택되는 것인 방법.
  18. 산물 생합성을 조절하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 발현 유닛의 용도.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230014556A (ko) 2021-07-21 2023-01-30 성균관대학교산학협력단 코리네박테리움 글루타미쿰의 모듈화 클로닝용 벡터 및 이의 용도
KR20230031538A (ko) 2021-08-27 2023-03-07 성균관대학교산학협력단 코리네박테리움 글루타미쿰의 모듈화 클로닝을 위한 프로모터 라이브러리 및 터미네이터 라이브러리, 및 이의 용도

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5584470B2 (ja) * 2007-01-12 2014-09-03 アクトジェニックス・エヌブイ ラクトコッカスプロモーター及びその使用
WO2008101857A2 (en) * 2007-02-19 2008-08-28 Evonik Degussa Gmbh Coryneform bacteria with formate-thf-synthetase and/or glycine cleavage activity
EP2121735A1 (en) * 2007-02-19 2009-11-25 Evonik Degussa GmbH Method of producing methionine in corynebacteria by over-expressing enzymes of the pentose phosphate pathway
GB0715416D0 (en) * 2007-08-07 2007-09-19 Phico Therapeutics Ltd Modified bacteriophage
EP2235194B1 (de) 2008-01-23 2011-07-20 Basf Se Verfahren zur fermentativen Herstellung von 1,5-Diaminopentan
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
DE102009030342A1 (de) 2009-06-25 2010-12-30 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen
CN102753682A (zh) 2009-12-17 2012-10-24 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
DE102010003419B4 (de) 2010-03-30 2019-09-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin
WO2012114256A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 Basf Se Processes and recombinant microorganisms for the production of cadaverine
DE102011006716A1 (de) 2011-04-04 2012-10-04 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
DE102011118019A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
PL2841568T3 (pl) 2012-04-27 2018-07-31 Evonik Technochemie Gmbh Odporne na sprzężenie zwrotne syntazy alfa-izopropylojabłczanowe
US20150353940A1 (en) * 2013-08-05 2015-12-10 Absci, Llc Vectors for use in an inducible coexpression system
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
PL2811028T3 (pl) 2013-06-03 2017-07-31 Evonik Degussa Gmbh Sposób wytwarzania L-waliny z zastosowaniem zrekombinowanych bakterii maczugowatych zawierających operon ilvBN indukowany propionianem
WO2014205518A1 (en) * 2013-06-26 2014-12-31 Phylogica Limited Method of monitoring cellular trafficking of peptides
CN104845923B (zh) 2014-02-14 2018-03-23 中国科学院微生物研究所 生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌
CN105779447B (zh) * 2014-12-22 2018-09-14 中国科学院大连化学物理研究所 3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子和终止子及其应用
CN105779445B (zh) * 2014-12-22 2018-09-28 中国科学院大连化学物理研究所 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶启动子和终止子及其应用
CN105779446B (zh) * 2014-12-22 2018-09-14 中国科学院大连化学物理研究所 3-磷酸甘油酸激酶启动子和终止子及其应用
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
CA3007635A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
EP3478833A4 (en) 2016-06-30 2019-10-02 Zymergen, Inc. METHODS OF GENERATING A BACTERIAL HEMOGLOBIN LIBRARY AND USES THEREOF
WO2018005793A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
ES2921017T3 (es) * 2016-12-30 2022-08-16 Natures Toolbox Inc Sistema de expresión libre de células que tiene una nueva regeneración de energía basada en polifosfato inorgánico
CN110869504A (zh) 2017-06-07 2020-03-06 齐默尔根公司 来自谷氨酸棒状杆菌的启动子及其在调节辅助基因表达中的用途
CN109142578B (zh) * 2018-09-12 2021-08-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 检测生物细胞中两种基因对目标代谢物调控关系的方法
JP7498598B2 (ja) * 2020-05-29 2024-06-12 花王株式会社 新規プロモーター
CN115322990A (zh) * 2021-05-10 2022-11-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途
CN114717237B (zh) * 2022-06-10 2022-08-19 北京中科伊品生物科技有限公司 一种ep6启动子与其相关生物材料及应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
GB2165546B (en) 1984-08-21 1989-05-17 Asahi Chemical Ind A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom
DE4027453A1 (de) 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
DE4440118C1 (de) 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
DE10046870A1 (de) 2000-09-20 2002-03-28 Basf Ag Verfahren zur Veränderung des Genoms von Corynebakterien
US7141388B2 (en) * 2000-11-15 2006-11-28 Archer-Daniels-Midland Company Nucleotide sequences for transcriptional regulation in corynebacterium glutamicum
CN1140628C (zh) * 2001-11-02 2004-03-03 武汉大学 人白细胞白介素-12重组昆虫病毒株及其制备方法
DE10154180A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag gene die für genetische Stabilitäts-, genexpressions-und Faltungsproteine codieren
DE10359660A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag Psod-Expressionseinheiten
DE10359595A1 (de) * 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag Pgro-Expressionseinheiten
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
DE102004035065A1 (de) 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag P-ET-TS-Expressionseinheiten

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230014556A (ko) 2021-07-21 2023-01-30 성균관대학교산학협력단 코리네박테리움 글루타미쿰의 모듈화 클로닝용 벡터 및 이의 용도
KR20230031538A (ko) 2021-08-27 2023-03-07 성균관대학교산학협력단 코리네박테리움 글루타미쿰의 모듈화 클로닝을 위한 프로모터 라이브러리 및 터미네이터 라이브러리, 및 이의 용도

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