LU86972A1 - MONOCLONAL ANTIBODIES, PEPTIDES AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM, FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF HIV VIRUS INFECTIONS - Google Patents

Description

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A "ΓΙΟ GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURGA "ΓΙΟ GRAND-DUCHY OF LUXEMBOURG

Monsieur le Ministre · du 19 août 1.9 8.7 3rip£. de l’Économie et des Classes Moyennes _ ,... „ 1¾¾¾ Service de la Propriété IntellectuelleMinister · of 19 August 1.9 8.7 3rip £. Economy and the Middle Classes _, ... "1¾¾¾ Intellectual Property Service

LUXEMBOURGLUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention T &·^:_____________________________:_ (o I. RequêteT & · ^ Invention Patent Application: _____________________________: _ (o I. Request

La société dite: GENETIC SYSTEMS CORPORATION, 3005 First (2jThe company known as: GENETIC SYSTEMS CORPORATION, 3005 First (2d

Avenue. SEATTLE. Washington 98121, Etats-Unis d'Amérique,__ -représentée-par ..Monsieur Jacques.....de Muyser, agissant en_ ....q.uali.té„de.„maMa.tair&__:____________( 3) dépose(nt) ce ____dix-neuf août 1900 quatre-vingt sept_ ( 4) à —1.5--------heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: "Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contena^, .„destinées......au......diagnostic et au traitement des, infections par le _ ...virus.......HIV. "......................................................................Avenue. SEATTLE. Washington 98121, United States of America, __ -represented -by ..Mr Jacques ..... de Muyser, acting in_ .... q.uali.té „de.„ MaMa.tair & __: ____________ (3) deposit (s) this ____ nineteen August 1900 eighty seven_ (4) at —1.5 -------- hours, at the Ministry of the Economy and the Middle Classes, in Luxembourg: 1. this request for obtaining a patent for an invention concerning: "Monoclonal antibodies, peptides and compositions containing them ^,.„ intended ...... for ...... diagnosis and treatment of, infections by _. ..virus ....... HIV. "..................................... .................................

2. la description en langue f r ançai s e_____de l’invention en trois exemplaires; 3............................................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 19 août 1987 .2. the description in French language e_____ of the invention in triplicate; 3 ................................................. ........... drawing boards, in triplicate; 4. receipt of the fees paid to the Luxembourg Registration Office, August 19, 1987.

5. la délégation de pouvoir, datée de ...._______________.___ le ....._ __; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont): ( 6) voir désignation séparée : pas .¾ mentionner f_______ revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (7) „_______________brevets.___________________________________________________1_____________déposée(s)J8i:(8) aux Etats-Unis d'Amérique le(9) ...2..Q.......août 1986. le 1er mai 1987 et le 29 juin 1987_ sous le N° (10) ...8..98 .273.,.......No.........045.026.......et No. 067.996_________ au nom de (11) s.......inventeurs_________( J&ife jfa, £ 3. -lÂaZjteJi_ élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg____/__ _____________35 , boulevard Royal________________________________________________________ (12) sollicitent) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à___6__________________________mois. (13)5. the delegation of power, dated ...._______________.___ on ....._ __; 6. the successor document (authorization); declares (s) assuming responsibility for this declaration, that the inventor (s) is (are): (6) see separate designation: not .¾ mention f_______ claims (s) for the above patent application priority of (a) request (s) for (7) „_______________ patents .___________________________________________________ 1 _____________ filed J8i: (8) in the United States of America on (9) ... 2..Q ..... ..August 1986. May 1, 1987 and June 29, 1987_ under N ° (10) ... 8..98 .273., ....... No ......... 045.026 ....... and No. 067.996 _________ on behalf of (11) s ....... inventors _________ (J & ife jfa, £ 3. -lÂaZjteJi_ elect (elect) domicile for him / her and, if designated , for its representative, in Luxembourg ____ / __ _____________35, boulevard Royal________________________________________________________ (12) request) the grant of a patent for the subject described and represented in the abovementioned appendices, with postponement of this grant to ___ 6__________________________months. (13)

Lgjdép5sanli^andataire>y..A.._A_A_i.____-____________________________________________________ (14) / \ Π. Procès-verbal de DépôtLgjdép5sanli ^ andataire> y..A .._ A_A_i .____-____________________________________________________ (14) / \ Π. Deposit Minutes

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes,The above application for a patent for invention has been filed with the Ministry of the Economy and the Middle Classes,

Service delsPropriété toteJleCE^qTfTsuxembourg, en date du: 19 août 1987 / .ta- ' ί· Pr. le Ministre de l’Éconj) nie et des Classes Moyennes, à____1.5.______heures J s / rl jj fà.Service delsPropriété toteJleCE ^ qTfTsuxembourg, dated: August 19, 1987 / .ta- 'ί · Pr. The Minister of the Economy and the Middle Classes, at ____ 1.5 .______ hours J s / rl dd fà.

Ä Ça \ -J* J Le chef du servic^de^ rproptiété intellectuelle,Ä Ca \ -J * J The head of the intellectual property service,

Coi K A680oz__/]/_ EXPLICATIONS RELATIVES AU FORMULAIRE DEDÉPÔT · f/ Γ' . λ (1) s’il y a lieu "Demande de certificat d’addition au brevet principal, à la demande de brevet principal No............du............"-(2) inscrire les nom, prénom, profession.Coi K A680oz __ /] / _ EXPLANATIONS RELATING TO THE DEPOSIT FORM · f / Γ '. λ (1) if applicable "Application for certificate of addition to the main patent, to main patent application No ............ of ......... ... "- (2) enter the surname, first name, profession.

( . 7 0 H adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale - (3) inscrire t. / / / lunnm nr<nnm ailrece· Hn manHirain aan(2 mncAÏl »n nmnn^l j initnctnAllA iminî it'nn nnminir en^net c'il v ü IÎpii* "rmritpnfi mr ülncoilî M mialilérfp manriatair^" 52.682(. 7 0 H address of the applicant, when the latter is an individual or corporate name, legal form, address of the head office, when the applicant is a legal person - (3) enter t. / / / Lunnm nr <nnm ailrece · Hn manHirain aan (2 mncAÏl »n nmnn ^ lj initnctnAllA iminî it'nn nnminir en ^ net c'il v ü IÎpii *" rmritpnfi mr ülncoilî M mialilérfp manriatair ^ "52.682

REVENDICATION DE LA PRIORITECLAIM OF PRIORITY

de la demande de brevet / etixxnadèteKdlMtaiiâ; XSK Aux Etats-Unis d'Amérique Du 20 août 1986 (No. 898.273), ; du 1er mai 1987 (No. 045.026) et du 29 juin 1987 (No. 067.996).the patent application / etixxnadèteKdlMtaiiâ; XSK In the United States of America From August 20, 1986 (No. 898.273),; May 1, 1987 (No. 045.026) and June 29, 1987 (No. 067.996).

Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande deBrief Description filed in support of a request for

BREVET D’INVENTIONPATENT

auat

Luxembourg au nom de : genetic Systems corporation SEATTLE, Washington 98121 (Etats-Unis d'Amérique) pour : "Anticorps monoclonaux, -peptides et compositions les contenant, destinées au diagnostic et au traitement des infections par le virus HIV." * *Luxembourg on behalf of: genetic Systems corporation SEATTLE, Washington 98121 (United States of America) for: "Monoclonal antibodies, peptides and compositions containing them, intended for the diagnosis and treatment of infections by the HIV virus." * *

Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contenant destinées au diagnostic et au traitement des infections par leMonoclonal antibodies, peptides and compositions containing them for the diagnosis and treatment of infections by

virus HIVHIV virus

La présente invention se rapporte d'une manière générale au diagnostic, au traitement et à la prévention des infections virales.The present invention relates generally to the diagnosis, treatment and prevention of viral infections.

Elle concerne plus particulièrement des compositions 5 et des procédés pour la production d'anticorps monoclonaux ainsi que des peptides utiles dans le diagnostic, la neutralisation et la vaccination contre les infections par virus d'immunodéficience humaine HIV (Human Immunodeficiency Virus).It relates more particularly to compositions and methods for the production of monoclonal antibodies as well as peptides useful in the diagnosis, neutralization and vaccination against infections with Human Immunodeficiency Virus (HIV).

L'agent d'infection responsable du syndrome d'immuno-10 déficience acquis (SIDA) et ses phases prodromiques, le complexe correspondant au SIDA ARC ("AIDS-related complex"), et le syndrome de lymphadénopathie (LAS), est un nouveau rétro-virus lymphotrophique. Le virus a été diversement appelé LAV, HTLV-III, ARV, et plus récemment HIV.The infectious agent responsible for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and its prodromal phases, the AIDS-related complex (ARC), and lymphadenopathy syndrome (LAS), is a new lymphotrophic retro-virus. The virus has been variously called LAV, HTLV-III, ARV, and more recently HIV.

15 Etant donné que le virus HIV atteint des proportions pandémiques, le traitement des individus infectés et la prévention de la transmission à des individus exposés et non infectés est d'un intérêt fondamental. Diverses stratégies thérapeutiques ont visé différentes étapes dans le cycle de vie du virus et 20 sont soulignées par Mitsuya et Broder, 1987, Nature 325:773.Since the HIV virus is reaching pandemic proportions, the treatment of infected individuals and the prevention of transmission to exposed and uninfected individuals is of fundamental interest. Various therapeutic strategies have targeted different stages in the life cycle of the virus and are emphasized by Mitsuya and Broder, 1987, Nature 325: 773.

Une approche consiste à utiliser des anticorps qui se lient au virus et inhibent la réplication virale, soit en interférant avec l'entrée du virus dans des cellules hôtes, soit par d'autres mécanismes. Une fois que le ou les constituants du 25 virus susceptibles ou sensibles à l'intervention de l'anticorps sont identifiés, on peut espérer que des titres d'anticorps suffisants pour neutraliser le pouvoir infectieux du virus puissent être engendrés par vaccination ou, alternativement, J * 2 par l'administration passive d'immunoglobulines ou d'anticorps monoclonaux de spécificité désirée.One approach is to use antibodies that bind to the virus and inhibit viral replication, either by interfering with the entry of the virus into host cells, or by other mechanisms. Once the constituent (s) of the virus susceptible or sensitive to the intervention of the antibody are identified, it is hoped that antibody titers sufficient to neutralize the infectious power of the virus can be generated by vaccination or, alternatively, D * 2 by passive administration of immunoglobulins or monoclonal antibodies of desired specificity.

On pense que les glycoprotéines formant l'enveloppe de la plupart des rétrovirus réagissent avec des molécules récep-5 trices sur la surface des cellules susceptibles, ce qui permet la détermination du pouvoir infectieux du virus pour certains hôtes. Des anticorps qui se lient aux glycoprotéines peuvent bloquer l'interaction du virus avec les récepteurs cellulaires, en neutralisant le pouvoir d'infection du virus. Voir d'une 10 manière générale, The Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J. Tooze, éd., 1973) et RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss et autres, eds., 1982) ces deux documents étant cités ici dans leur totalité à titre de référence. Voir également, Gonzalez-Scarano et autres, 1982, Virology 120:42 (La Crosse 15 Virus); Matsuno et Inouye, 1983, Infect. Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); et Mathews et autres, 1982, J. Immunol. , 129:2763 (Encephalomyelitis Virus).The envelope glycoproteins of most retroviruses are believed to react with receptor molecules on the surface of susceptible cells, allowing the infectious power of the virus to be determined for certain hosts. Antibodies that bind to glycoproteins can block the virus’s interaction with cell receptors, neutralizing the virus’s infectivity. See generally, The Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J. Tooze, ed., 1973) and RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss et al., Eds., 1982) these two documents being cited here in their entirety for reference. See also, Gonzalez-Scarano et al., 1982, Virology 120: 42 (La Crosse 15 Virus); Matsuno and Inouye, 1983, Infect. Immun. 39: 155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); & Mathews et al., 1982, J. Immunol. , 129: 2763 (Encephalomyelitis Virus).

La structure générale d'un virus HIV est celle d'un noyau de ribonucléoprotéine entouré par une enveloppe conte-20 nant des lipides que le virus acquiert au cours d'un bourgeonnement à partir de la membrane de la cellule hôte infectée. Logées à l'intérieur de l'enveloppe et faisant saillie de celle-ci, on trouve les glycoprotéines codées du virus.The general structure of an HIV virus is that of a ribonucleoprotein nucleus surrounded by an envelope containing lipids which the virus acquires during budding from the membrane of the infected host cell. Housed inside the envelope and protruding from it, we find the encoded glycoproteins of the virus.

Les glycoprotéines de l'enveloppe du HIV sont initialement 25 synthétisées dans la cellule infectée sous la forme d'une molécule précurseur de 150.000-160.000 daltons (gpl50 ou gpl60) , qui est ensuite traitée dans la cellule pour former un fragment N-terminal de 110.000-120.000 daltons (gpllO ou gpl20) afin d'engendrer la glycoprotéine externe, et un 30 fragment C-terminal de 41.000-46.000 daltons (gp 41), qui représente la glycoprotéine d'enveloppe transmembranaire.The HIV envelope glycoproteins are initially synthesized in the infected cell as a 150,000-160,000 dalton precursor molecule (gpl50 or gpl60), which is then processed in the cell to form an N-terminal fragment of 110,000-120,000 daltons (gpl10 or gpl20) in order to generate the external glycoprotein, and a C-terminal fragment of 41,000-46,000 daltons (gp 41), which represents the transmembrane envelope glycoprotein.

Pour les raisons données ci-dessus, la glycoprotéine gpllO du virus HIV a été l'objet de recherche importantes en tant que cible potentielle pour interrompre le cycle de vie 35 du virus. On a montré que des sérums d'individus infectés 3 * 3 par HIV neutralisaient HIV _in vitro , et que des anticorps qui se lient à gpllO purifié sont présents dans les sérums.For the reasons given above, the glycoprotein gpl10 of the HIV virus has been the subject of important research as a potential target for interrupting the life cycle of the virus. It has been shown that sera from individuals infected 3 * 3 with HIV neutralize HIV in vitro, and that antibodies which bind to purified gpl10 are present in the sera.

Voir Robert-Guroff et autres, 1985, Nature 316:72; Weiss et autres, 1985, Nature 316:69; et Mathews et autres, 1986, 5 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 83:9709. La molécule gpllO recombinante et purifiée peut stimuler la production des anticorps de sérum neutralisant lorsqu'on l'utilise pour immuniser des animaux, voir Robey et autres, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A., 83:7023; Lasky et autres, 1986, Science 10 233:209; et pour immuniser un être humain, voir Zagury et autres, 1986, Nature 326:249. La liaison de la molécule gpllO au récepteur (T4) CD4 a également été décrite , et des anticorps monoclonaux qui reconnaissent certains épitopes du récepteur CD4 ont été décrits comme bloquant la liaison HIV, 15 la formation syncytiale et le pouvoir infectieux. Voir McDougal et autres, 1986, Science 231:382. Putney et autres (1986, Science 234:1392) ont découvert des anticorps de sérums neutralisants chez des animaux après immunisation avec une protéine de fusion recombinante contenant la moitié du 20 carboxyle-terminal de la molécule gpllO et ont en outre démontré que la glycosylation de la protéine d'enveloppe n'est pas nécessaire pour une réponse d'anticorps neutralisante.See Robert-Guroff et al., 1985, Nature 316: 72; Weiss et al., 1985, Nature 316: 69; & Mathews et al., 1986, 5 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 83: 9709. The recombinant and purified gpl10 molecule can stimulate the production of neutralizing serum antibodies when used to immunize animals, see Robey et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 83: 7023; Lasky et al., 1986, Science 10 233: 209; and to immunize a human being, see Zagury et al., 1986, Nature 326: 249. The binding of the gpl10 molecule to the CD4 receptor (T4) has also been described, and monoclonal antibodies which recognize certain epitopes of the CD4 receptor have been described as blocking HIV binding, syncytial formation and infectiousness. See McDougal et al., 1986, Science 231: 382. Putney et al. (1986, Science 234: 1392) discovered antibodies to neutralizing sera in animals after immunization with a recombinant fusion protein containing half of the carboxyl-terminal of the gpl10 molecule and further demonstrated that the glycosylation of the envelope protein is not necessary for a neutralizing antibody response.

Un vaccin en sous-unité pour le SIDA utilisant la molécule gpllO de HIV ou des parties de celle-ci peut ainsi 25 être désirable. Des vaccins formant sous-unités constituent une alternative à des vaccins préparés à partir de virus atténués ou inactivés. Les vaccins inactivés sont préoccupants étant donné le défaut possible qu'ils présentent pour tuer toutes les particules virales, et les vaccins atténués peuvent 30 posséder un pouvoir de mutation et retrouver leur capacité à provoquer la maladie. Avec des vaccins de sous-unités, seulement les parties du virus qui contiennent les antigènes ou les épitopes qui sont capables de faire apparaître des réponses immunitaires, c'est-à-dire des anticorps neutralisants, 35 ADCC, et une réponse de cellule T cytoxique, sont utilisées * Jr 4 pour immuniser l'hôte. Un avantage majeur des vaccins de sous-unités est que le matériau viral non intéressant est exclus.An AIDS subunit vaccine using the HIV gp110 molecule or parts thereof may thus be desirable. Vaccines forming subunits are an alternative to vaccines prepared from attenuated or inactivated viruses. Inactivated vaccines are of concern because of the possible defect they present in killing all viral particles, and attenuated vaccines may possess mutational power and regain their ability to cause disease. With subunit vaccines, only those parts of the virus that contain the antigens or epitopes that are capable of producing immune responses, i.e. neutralizing antibodies, ADCC, and a T cell response cytoxic, are used * Jr 4 to immunize the host. A major advantage of subunit vaccines is that uninteresting viral material is excluded.

Des sous-unités virales utilisables dans un vaccin 5 peuvent être produites par plusieurs procédés. A titre d'exemple, la glycoprotéine d'enveloppe peut être exprimée et purifiée à partir d'un hôte bactérien, bien que cette molécule puisse être déficiente au niveau de la plupart des modifications post-translationnelles (telle que la glycosylation), ou iO à partir d'autres procédés. Une telle modification peut être obtenue en utilisant un système d'expression eucaryotique, tel que la levure ou des cellules de mammifère cultivées.Viral subunits for use in a vaccine can be produced by several methods. For example, the envelope glycoprotein can be expressed and purified from a bacterial host, although this molecule may be deficient in most post-translational modifications (such as glycosylation), or iO from other processes. Such a modification can be achieved using a eukaryotic expression system, such as yeast or cultured mammalian cells.

Des gènes de virus ont été introduits dans des cellules de mammifère en utilisant le virus des vaccins comme vecteur.Virus genes have been introduced into mammalian cells using the vaccine virus as a vector.

15 Voir par exemple Mackett M. et autres, 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:741b; Panicali, D. et Paoletti, E., 1982, Proc, Nat. Acad. Sei USA 79:4927. Un virus de vaccin recombinant peut être construit suivant la méthode de Hu et autres,15 See, for example, Mackett M. et al., 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79: 741b; Panicali, D. and Paoletti, E., 1982, Proc, Nat. Acad. Sci USA 79: 4927. A recombinant vaccine virus can be constructed according to the method of Hu and others,

Nature 320:537 (1986) ou Chakrabarti et autres, Nature 320:535 20 (1986), ces deux documents étant donnés ici à titre de réfé rence. Dans ces systèmes, les glycoprotéines virales produites par des cellules infectées avec des vaccins recombinants sont glycosylées d'une manière appropriée et peuvent être transportées jusqu'à la surface de la cellule pour extrusion et 25 isolation ultime.Nature 320: 537 (1986) or Chakrabarti and others, Nature 320: 535 20 (1986), these two documents being given here for reference. In these systems, viral glycoproteins produced by cells infected with recombinant vaccines are appropriately glycosylated and can be transported to the cell surface for extrusion and ultimate isolation.

Une importante phase dans la production d'un vaccin de sous-unité est la purification adéquate de la glycoprotéine désirée à partir du mélange complexe du système d'expression. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour accomplir la 30 purification. Celles-ci comprennent , mais ne sont pas limitées à, l'électrophorèse sur gel polyacrylamide préparative, la chromatographie de perméation sur gel et diverses méthodes de chromatographie (c'est-à-dire échange d'ions, phase inverse, immunoaffinité, interaction hydrophobe), ainsi que d'autres 35 méthodes. La plupart de ces méthodes sont utilisées suivant -î -t 5 diverses combinaisons pour réaliser des préparations sensiblement pures (Kleid , D.G., et autres, 1981, Science 214:1125; Cabradilla, C.D. et autres, 1986, Biotechnology 4:128, Dowbenko, D.J., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:7748), 5 ces articles étant donnés ici à titre de référence.An important phase in the production of a subunit vaccine is the adequate purification of the desired glycoprotein from the complex mixture of the expression system. Several methods can be used to accomplish the purification. These include, but are not limited to, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, gel permeation chromatography and various chromatography methods (i.e., ion exchange, reverse phase, immunoaffinity, interaction hydrophobic), as well as other methods. Most of these methods are used in various combinations to make substantially pure preparations (Kleid, DG, et al., 1981, Science 214: 1125; Cabradilla, CD et al., 1986, Biotechnology 4: 128, Dowbenko , DJ, 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 7748), 5 these articles being given here for reference.

Des méthodes qui réduisent le nombre de phases requises pour réaliser la purification maximum d'un antigène viral particulier à partir d'un mélange d'expression complexe, sont nécessaires pour fabriquer des vaccins de sous-unités. La 10 séparation efficace des antigènes des composants étrangers pourrait être réalisée en utilisant une chromatographie d'immunoaffinité. Cette technique, également connue sous l'appellation immuno-adsorption, consiste dans son principe à adsorber sélectivement un antigène sur un support solide 15 sur lequel un anticorps spécifique a été fixé de façon covalente. L'antigène adsorbé sélectivement est ensuite élué à partir, d'un tel adsorbant à affinité d'anticorps, en changeant par exemple le pH et/ou la force ionique du tampon.Methods that reduce the number of phases required to achieve maximum purification of a particular viral antigen from a mixture of complex expression are required to make subunit vaccines. Efficient separation of antigens from foreign components could be accomplished using immunoaffinity chromatography. This technique, also known as immuno-adsorption, consists in its principle of selectively adsorbing an antigen on a solid support on which a specific antibody has been covalently attached. The selectively adsorbed antigen is then eluted from such an antibody affinity adsorbent, for example by changing the pH and / or ionic strength of the buffer.

Des anticorps polyclonaux, obtenus à partir d'animaux 20 immunisés avec l'antigène désiré ou à partir d'individus naturellement infectés ou contaminés (voir par exemple Lasky et autres, supra), ont été utilisés fréquemment comme immuno-adsorbants, mais, en général, ces réactifs présentent des inconvénients substantiels , tels que (i) les anticorps liés 25 au support insoluble ne sont pas tous spécifiques pour la molécule d'intérêt, ce qui nécessite une purification supplémentaire; (ii) les rendements de l'antigène désiré sont fréquemment faibles ; et (iii) les affinités pour l'anticorps varient souvent d'une préparation à l'autre, ce qui exige 30 des modifications dans les processus d'élution. L'utilisation des anticorps monoclonaux spécifiques pour l'antigène viral désiré et destinés à être utilisés dans la préparation de vaccin de sous-unités, plutôt que d'anticorps polyclonaux, devrait contourner ces difficultés.Polyclonal antibodies, obtained from animals immunized with the desired antigen or from naturally infected or contaminated individuals (see for example Lasky et al., Supra), have been used frequently as immunoadsorbents, but, in In general, these reagents have substantial drawbacks, such that (i) the antibodies bound to the insoluble support are not all specific for the molecule of interest, which requires additional purification; (ii) the yields of the desired antigen are frequently low; and (iii) affinities for the antibody often vary from preparation to preparation, which requires modifications in the elution processes. The use of monoclonal antibodies specific for the desired viral antigen and intended for use in the preparation of subunit vaccines, rather than polyclonal antibodies, should circumvent these difficulties.

35 Des anticorps monoclonaux murins qui se lient aux i .t 6 antigènes HIV ont été décrits. Plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des anticorps monoclonaux spécifiques pour la protéine de noyau p25 (voir par exemple di Marzo Veronese et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:5199 et 5 Chassagne, J., et autres, 1986, J. Immunol. 136:1442). Des anticorps monoclonaux spécifiques pour la glycoprotéine de membrane gp41 ont également été décrits (voir par exemple di Marzo Veronese et autres, 1985, Science 229:1402).Murine monoclonal antibodies which bind to 6 HIV antigens have been described. Several groups of researchers have described monoclonal antibodies specific for the p25 nucleus protein (see for example di Marzo Veronese et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5199 and 5 Chassagne, J., et al., 1986, J. Immunol. 136: 1442). Monoclonal antibodies specific for the membrane glycoprotein gp41 have also been described (see for example di Marzo Veronese et al., 1985, Science 229: 1402).

Il demeure qu'il y a une nécessité dans la technique 10 concernée pour des anticorps monoclonaux spécifiques pour des épitopes dans des régions bien définies de la glycoprotéine d'enveloppe importante, gpllO. Des anticorps monoclonaux qui se lient à ces régions et provoquent une réduction ou une élimination de la réplication et de la trans-15 missibilité du virus HIV présenteraient une utilité prophylactique et thérapeutique substantielle. Par ailleurs, les anticorps monoclonaux pourraient également être utilisés pour purifier la région désirée de gpllO à partir de virus rompus ou brisés, ou de systèmes d'expression recombinants 20 pour une utilisation dans les vaccins, par exemple. En outre, la région contenant l'épitope ou les épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux pourrait être chimiquement synthétisée, ce qui permet d'éviter les difficultés inhérentes à la purification et l'administration des fragments plus gros 25 de la molécule gpllO. La présente invention répond aux besoins ci-dessus ainsi qu'à d'autres.The fact remains that there is a need in the art for specific monoclonal antibodies for epitopes in well-defined regions of the large envelope glycoprotein, gpl10. Monoclonal antibodies which bind to these regions and cause a reduction or elimination of the replication and transmissibility of the HIV virus would have substantial prophylactic and therapeutic utility. Furthermore, monoclonal antibodies could also be used to purify the desired region of gpl10 from ruptured or broken viruses, or from recombinant expression systems for use in vaccines, for example. Furthermore, the region containing the epitope or epitopes recognized by the monoclonal antibodies could be chemically synthesized, which avoids the difficulties inherent in the purification and administration of the larger fragments of the gpl10 molecule. The present invention meets the above needs as well as others.

La présente invention propose des peptides capables d'imiter ou de mimer immunologiquement des épitopes neutralisants de protéines HIV, des sondes d'acide nucléique codant 30 de tels peptides et des anticorps monoclonaux réagissant avec de tels peptides, aussi bien que d'autres peptides interférant avec le pouvoir infectieux de HIV. Ces nouveaux matériaux trouvent une utilité par exemple dans les essais de diagnostic pour la détection des infections par HIV et dans les actions 35 thérapeutiques pour le traitement de ou la vaccination contre * « 7 de telles infections.The present invention provides peptides capable of immunologically mimicking or mimicking neutralizing epitopes of HIV proteins, nucleic acid probes encoding such peptides and monoclonal antibodies reacting with such peptides, as well as other interfering peptides with the infectious power of HIV. These new materials find utility, for example, in diagnostic assays for the detection of HIV infections and in therapeutic actions for the treatment of or vaccination against such infections.

La présente invention a pour objet des nouvelles compositions et des nouveaux procédés pour neutraliser les infections par HIV, c'est-à-dire pour la prévention ou 5 l'inhibition substantielle de la formation ou de la transmission cellulaire des infections HIV chez un hôte. Plus particulièrement, des peptides imitant une région neutralisante du HIV et des anticorps monoclonaux réagissant avec une telle région sont utilisés pour diagnostiquer, traiter et 10 vacciner contre les infections HIV. A cet égard, l'expression "région neutralisante" indique les parties de HIV, particulièrement les protéines HIV, contenant des segments d'acides aminés définissant un ou plusieurs épitopes réagissant avec des anticorps qui, soit individuellement ou en combinaison 15 avec d'autres anticorps de la présente invention, sont capables de neutraliser les infections par HIV. Des tests convenables pour la neutralisation sont bien connus et peuvent comprendre la réduction des infections par HIV dans les lignées de cellules T, la réduction d'unités formant des plaques de 20 pseudotypes VSV (HIV) portant les glycoprotéines d'enveloppe de HIV, les essais d'inhibition syncytiale, et les essais de liaison récepteur virion. Si on le désire, l'activité neutralisante peut être comparée à la réactivité d'anticorps dans les tests immunochimiques tels que l'essai d'immuno-25 fluorescence, d'immunoblot et de radioimmunoprécipitation.The subject of the present invention is novel compositions and methods for neutralizing HIV infections, that is to say for preventing or substantially inhibiting the formation or cellular transmission of HIV infections in a host. . More particularly, peptides mimicking an HIV neutralizing region and monoclonal antibodies reacting with such a region are used to diagnose, treat and vaccinate against HIV infections. In this regard, the term "neutralizing region" indicates parts of HIV, particularly HIV proteins, containing amino acid segments defining one or more epitopes reacting with antibodies which either individually or in combination with others antibodies of the present invention are capable of neutralizing HIV infections. Suitable tests for neutralization are well known and may include reducing HIV infection in T cell lines, reducing plaque forming units of VSV (HIV) pseudotypes carrying HIV envelope glycoproteins, syncytial inhibition assays, and virion receptor binding assays. If desired, the neutralizing activity can be compared to the reactivity of antibodies in immunochemical tests such as the immunofluorescence, immunoblot and radioimmunoprecipitation assay.

Suivant un aspect de l'invention, les nouveaux peptides, qui d'une manière typique possèdent moins d'environ 50 acides aminés, contiennent cinq ou plus d'acides aminés contigus formant des épitopes sensiblement similaires aux épitopes situés sur les 30 régions neutralisantes de gpllO ou p25 de HIV, codées par les régions env et gag respectivement, du génome HIV. Les régions qui sont d'un intérêt particulier sont celles qui s'étendent depuis environ 301 résidus d'acides aminés jusqu'à environ 336 de gpllO , et depuis environ 278 jusqu'à environ 35 319 et depuis environ 315 jusqu'à environ 363 de p25, tous « Γ 8 provenant de la souche HIV désignée LAVBRy. Les désignations de résidus d'acides aminés proviennent de la Banque de Données de Los Alamos (Base de données de séquence virus SIDA, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, 5 Los Alamos, NM 87545).In accordance with one aspect of the invention, the new peptides, which typically have less than about 50 amino acids, contain five or more contiguous amino acids forming epitopes substantially similar to the epitopes located on the neutralizing regions of gpl10 or p25 of HIV, encoded by the env and gag regions respectively, of the HIV genome. The regions of particular interest are those which extend from about 301 amino acid residues to about 336 gp110, and from about 278 to about 35,319 and from about 315 to about 363 p25, all «8 from the HIV strain designated LAVBRy. The amino acid residue designations come from the Los Alamos Database (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, 5 Los Alamos, NM 87545).

Les familiers de la technique apprécieront que des régions analogues supplémentaires ("homologues") à partir d'autres isolats HIV peuvent être identifiées sur la base de leur situation à l'intérieur des protéines correspondantes 10 à partir d'isolats divers. En pratique, de tels homologues peuvent être identifiés par référence aux données de séquence LAVßRu > comme suit : (a) Les séquences d'acides aminés d'isolats HIV et de LAVbru peuvent être alignées pour obtenir une homologie 15 maximum entre les deux séquences; (b) Des peptides comprenant des séquences d'acides aminés d'isolats HIV correspondant au site des peptides de LAVgpu Qui imitent immunologiquement les protéines LAVBRU peuvent être identifiés. Les peptides comprenant des séquen- 20 cas d'acides aminés d'isolats HIV ainsi identifiés imitent ou miment immunologiquement , et ce d'une manière typique, les protéines correspondantes d'isolat HIV.Those familiar with the art will appreciate that additional analogous regions ("homologs") from other HIV isolates can be identified based on their location within the corresponding proteins from various isolates. In practice, such homologs can be identified by reference to LAVβRu> sequence data as follows: (a) The amino acid sequences of HIV isolates and LAVbru can be aligned to obtain maximum homology between the two sequences; (b) Peptides comprising amino acid sequences of HIV isolates corresponding to the site of the LAVgpu peptides which immunologically mimic the LAVBRU proteins can be identified. Peptides comprising amino acid sequences of HIV isolates so identified typically mimic or mimic immunologically, and typically, the corresponding HIV isolate proteins.

Cette méthode peut être appliquée aux souches HIV qui sont encore à découvrir. Par exemple, lorsque des nou-25 velles souches de HIV sont identifiées, leurs séquences d'acides aminés de noyau et d'enveloppe peuvent être alignées avec celle de LAVRR^ pour obtenir une homologie maximum. Les méthodes grâce auxquelles les séquences sont alignées, sont connues de ceux qui sont familiers de la technique. En 30 alignant les séquences, il est désirable de maintenir autant d'homologie que possible entre les résidus de cystéine. La séquence d'acides aminés de la nouvelle espèce ou souche HIV, qui correspond à la situation ou au site des peptides spécifiquement décrits présentement, peut être synthétisée et 35 utilisée suivant la présente invention.This method can be applied to HIV strains which are still to be discovered. For example, when new strains of HIV are identified, their core and envelope amino acid sequences can be aligned with that of LAVRR ^ to obtain maximum homology. The methods by which sequences are aligned are known to those familiar with the art. In aligning the sequences, it is desirable to maintain as much homology as possible between the cysteine residues. The amino acid sequence of the new HIV species or strain, which corresponds to the location or site of the peptides specifically described herein, can be synthesized and used in accordance with the present invention.

Λ t 9Λ t 9

Une autre méthode pour déterminer les séquences d'une région homologue dans d'autres souches HIV est décrite par Scharf et autres, Science (1986) 233:1076. Elle utilise deux amorces d'oligonucléotides qui se lient à des séquences 5 conservées à l'extérieur de la région de séquence d'intérêt, et contiennent différents sites restrictifs dans chaque amorce. De l'ADN à partir de souches HIV peut alors être amplifié in vitro par la suite, et les oligonucléotides résultants peuvent être clonés en vecteurs pour une analyse 10 de séquence , et incorporés dans un vaccin sous la forme d'une cassette représentant un épitope particulier de la souche HIV.Another method for determining the sequences of a homologous region in other HIV strains is described by Scharf et al., Science (1986) 233: 1076. It uses two oligonucleotide primers which bind to sequences conserved outside the sequence region of interest, and contain different restrictive sites in each primer. DNA from HIV strains can then be amplified in vitro thereafter, and the resulting oligonucleotides can be cloned into vectors for sequence analysis, and incorporated into a vaccine in the form of an epitope cassette particularly of the HIV strain.

Il n'est pas nécessaire pour la présente invention que les épitopes contenus à l'intérieur de telles séquences soient réactifs par réaction croisée avec des anticorps pour toutes les souches ou espèces de HIV. Les peptides englobant des épitopes immunologiques qui distinguent une espèce ou un sérogroupe d'un autre, trouvent une utilité dans l'identification des espèces ou sérogroupes particuliers, 20 et peuvent en fait aider à l'identification des individus infectés par une ou plusieurs espèces ou sérogroupes de HIV. Ils peuvent également être utiles en combinaison avec d'autres peptides à partir de soit une région homologue ou une autre région neutralisante, dans des compositions 25 thérapeutiques.It is not necessary for the present invention that the epitopes contained within such sequences be reactive by cross-reaction with antibodies for all strains or species of HIV. Peptides encompassing immunological epitopes which distinguish one species or serogroup from another, find utility in the identification of particular species or serogroups, and may in fact assist in the identification of individuals infected with one or more species or HIV serogroups. They may also be useful in combination with other peptides from either a homologous region or another neutralizing region, in therapeutic compositions.

Les peptides d'intérêt proviennent très préférablement de la région gllO du virus. Les peptides présentant un intérêt particulier dans cette région sont les peptides codés dans le cadre de lecture ouvert env s'étendant depuis 20 environ la paire de base (bp) 6667 jusqu'à environ 6774 de l'isolat LAVbru . Ainsi, diverses régions homologues d'autres isolats HIV comprennent les séquences homologues obtenues à partir de la Banque de Données de Los Alamos (sauf LAV2) , comme énoncé dans le Tableau I.The peptides of interest very preferably come from the g11O region of the virus. Peptides of particular interest in this region are the peptides encoded in the env open reading frame extending from about 20 base pairs (bp) 6667 to about 6774 of the LAVbru isolate. Thus, various homologous regions of other HIV isolates include the homologous sequences obtained from the Los Alamos Database (except LAV2), as set out in Table I.

X IX I

10 TABLEAU 1.10 TABLE 1.

tiXB2 TGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGA...............ATCCGTATDtiXB2 TGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGA ............... ATCCGTATD

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg...............IleArglle 309 BH102-----------------------------Ser----------------------- 309 - BH8 ------------------------------Lys---------------------- 309 HXB3 -----------------------------Lys----------------------- 309 H9M ------------------------------Ser---------------------- 309 BRU ----------------------------Ser-------------------- 314 MAL --------Gly------------ArgGly----------------HisPhe 314 ELI ---Ala-----TyrGln--------Gin-------------ThrPro-- 310 ARV2 Ser-----------------Tyr--- 312 WM J 2 ---------Tyr------Val---ArgSer--------------LeuSer 306 10 RFENV--------------------------Ser-----------------ThrLys 322 26 ---------TyrLys-------GlnSer--------ThrPro--- 311 Z3 ------------GlySerAspLysLyslle---------------—-GlnSer 306 NY5 ---------------------Lys---Gly---------------Ala-- 304 CDC42---------------His------------ValThrLeu............... 320 LAV2 ------------Gly---Lys---Val---Gin----——-------—MeCLeu 302CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg ............... IleArglle 309 BH102 ----------------------------- Ser- ---------------------- 309 - BH8 ------------------------- ----- Lys ---------------------- 309 HXB3 -------------------- --------- Lys ----------------------- 309 H9M --------------- --------------- Ser ---------------------- 309 BRU ---------- ------------------ Ser -------------------- 314 MAL -------- Gly ------------ ArgGly ---------------- HisPhe 314 ELI --- Ala ----- TyrGln -------- Gin ------------- ThrPro-- 310 ARV2 Ser ----------------- Tyr --- 312 WM J 2 ----- ---- Tyr ------ Val --- ArgSer -------------- LeuSer 306 10 RFENV ---------------- ---------- Ser ----------------- ThrLys 322 26 --------- TyrLys ------- GlnSer- ------- ThrPro --- 311 Z3 ------------ GlySerAspLysLyslle ---------------—- GlnSer 306 NY5 ---- ----------------- Lys --- Gly --------------- Ala-- 304 CDC42 -------- ------- His ------------ ValThrLeu ............... 320 LAV2 ------------ Gly --- Lys --- Val --- Gin ----——-------— MeCLeu 302

HXB2 CAGAGA.........GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGQAAATATGHXB2 CAGAGA ......... GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGQAAATATG

1 GlnArg.........GlyProGlyArgAlaPheValThrlleGlyLysIleGlyAsnMet 326 BH102 ------------------------------------------------------------ 326 BH8 ------------------------------------------------------------326 HXB3 ----------------------------------------------------------326 H9M ---------------------------------------------------326 BRU -----------------------------------------------------331 MAL ......—----------—-Gin---LeuTyr---Thr--IlaVal---Asp Ile 329 20 ELI GlyLeu------------...GlnSerLeuTyrThr---Arg---IleValSerArgSer 323 ARV2 -------------------------------His---Thr---Arg—-IleGlyAsp 327 WMJ2 ......—----------------------Arg--ArgGlu...---IleGlylle 320 RFENV--------------------------ValIleTyrAlalhr--Gin---IleGlyAsp 337 Z6 GlyLeu—---------... GlnAlaLeuTyrThr--Arg—ArgThrLysIlelle 327 Z3 Argile-------------LysVal--TyrAlaLys---Gly............ 319 NY5 GlyPro------------...------ThrLeuTyrAlaArgGlu----------Asplle 320 CDC42 .........................—ValTrpTyr---Thr---Glu---LeuGlyAsn 335 25 LAV2 MetSer-----------------HisVal--HisSerHisTyrGlnProIle---Lys 3231 GlnArg ......... GlyProGlyArgAlaPheValThrlleGlyLysIleGlyAsnMet 326 BH102 ------------------------------------ ------------------------ 326 BH8 ------------------------ ------------------------------------ 326 HXB3 ------------ ---------------------------------------------- 326 H9M - ------------------------------------------------- 326 BRU ------------------------------------------------- ---- 331 MAL ......—----------—- Gin --- LeuTyr --- Thr - IlaVal --- Asp Ile 329 20 ELI GlyLeu ---- --------... GlnSerLeuTyrThr --- Arg --- IleValSerArgSer 323 ARV2 ---------------------------- --- His --- Thr --- Arg —- IleGlyAsp 327 WMJ2 ......—---------------------- Arg - ArgGlu ...--- IleGlylle 320 RFENV -------------------------- ValIleTyrAlalhr - Gin --- IleGlyAsp 337 Z6 GlyLeu —--- ------... GlnAlaLeuTyrThr - Arg — ArgThrLysIlelle 327 Z3 Clay ------------- LysVal - TyrAlaLys --- Gly ........... 319 NY5 GlyPro ------------...------ ThrLeuTyrAlaArgGlu ---------- Asplle 320 CDC42 ........... ..............— ValTrpTyr --- Thr --- Glu --- LeuGlyAsn 335 25 LA V2 MetSer ----------------- HisVal - HisSerHisTyrGlnProIle --- Lys 323

11XB2 ... AGA... CAAGCACATTGT11XB2 ... AGA ... CAAGCACATTGT

...Arg...GlnAlaHisCys 331 BH102 --------------------- 331 BH8 ---------------------331 HXB3 --------------------331 30 H9M ---------------------331 BRU ---------------------336 MAL ---------Arg---Tyr---334 fcLl IlelleGly------------330 ARV2 Ile---Lys...---------333 WM J 2 Ile------------------326 RFENV Ile--Lys...---------343 ,- Z6 Gly...---------------334 Z3 IleThrGly------------326 NY5 ---------------------J25 CDC42 Ile------------------341 LAV2 ArgProArg------Mec---330 I Λ 11 D'autres peptides convenables pour engendrer ou obtenir par "screening" des anticorps monoclonaux, comprennent ceux codés dans le cadre de lecture ouvert env depuis environ bp 7246 jusqu'à environ 7317 de LAVggy. De tels anticorps 5 et peptides réactifs sont particulièrement utiles dans les tests d'immunisation.... Arg ... GlnAlaHisCys 331 BH102 --------------------- 331 BH8 ----------------- ---- 331 HXB3 -------------------- 331 30 H9M --------------------- 331 BRU --------------------- 336 MAL --------- Arg --- Tyr --- 334 fcLl IlelleGly ----- ------- 330 ARV2 Ile --- Lys ...--------- 333 WM J 2 Ile ------------------ 326 RFENV Ile - Lys ...--------- 343, - Z6 Gly ...--------------- 334 Z3 IleThrGly ------- ----- 326 NY5 --------------------- J25 CDC42 Ile ------------------ 341 LAV2 ArgProArg ------ Mec --- 330 I Λ 11 Other peptides suitable for generating or obtaining by "screening" monoclonal antibodies, include those encoded in the open reading frame env from about bp 7246 to about 7317 from LAVggy. Such reactive antibodies and peptides are particularly useful in immunization tests.

Dans la région gag de l'isolat LAVggy, les séquences d'acides aminés p25 depuis environ 278 jusqu'à 319 et depuis 315 jusqu'à 363 sont des régions neutralisantes supplémen-10 taires de HIV. Ceux qui sont familiers de cette technique pourront comprendre que des régions de neutralisation supplémentaires de HIV peuvent être identifiées en se basant sur les enseignements donnés ici; en particulier, des combinaisons d'anticorps monoclonaux réagissant avec divers 15 épitopes HIV différents présentent une activité de neutralisation.In the gag region of the LAVggy isolate, the amino acid sequences p25 from about 278 to 319 and from 315 to 363 are additional neutralizing regions of HIV. Those familiar with this technique will understand that additional HIV neutralizing regions can be identified based on the teachings given here; in particular, combinations of monoclonal antibodies reacting with various different HIV epitopes exhibit neutralizing activity.

Le peptide I, également appelé peptide 29 est codé dans le cadre de lecture ouvert env depuis un nombre de résidus d'acides aminés d'environ 308 jusqu'à environ 328, 20 et présentera la séquence suivante d'acides aminés, où les oligopeptides inclus dans la séquence suivante comprendront des épitopes linéaires à l'intérieur d'une telle séquence : I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-25 Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Peptide I, also called peptide 29 is encoded in the open reading frame env from a number of amino acid residues from about 308 to about 328, 20 and will have the following sequence of amino acids, where the oligopeptides included in the following sequence will include linear epitopes within such a sequence: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-25 Pro-Gly- Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-

Ile-Y' dans laquelle Y et Y' , s'ils sont présents, représentent chacun des séquences jusqu'à environ vingt acides aminés. Lorsqu'Y et/ou Y' sont présents, ils peuvent comprendre, par 30 exemple, un ou plusieurs acides aminés à partir de séquences qui sont disposées à côté des résidus d'acides aminés 308 à 328 de la séquence d'enveloppe HIV ou de n'importe quelle partie de ces séquences latérales ou disposées à côté. A titre d'exemple non limitatif, Y peut comprendre toute ou des 35 parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe l-AV ^ « * 12 depuis environ un nombre de résidus 301 à 307; et Y' peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe depuis un nombre de résidus d'environ 329 à 336 comme suit : 5 II (29a)Ile-Y 'in which Y and Y', if present, each represent sequences up to about twenty amino acids. When Y and / or Y 'are present, they may comprise, for example, one or more amino acids from sequences which are arranged next to amino acid residues 308 to 328 of the HIV envelope sequence or of any part of these side sequences or arranged next to them. By way of nonlimiting example, Y can include all or part of the envelope amino acid sequence 1-AV ^ "* 12 from about a number of residues 301 to 307; and Y 'can comprise all or parts of the envelope amino acid sequence from a number of residues of approximately 329 to 336 as follows: II (29a)

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-

Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-

Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

Alternativement, des séquences tronquées de pe.ptides 10 selon la présente invention peuvent être préparées. A cet égard, les séquences suivantes du peptide 29 peuvent être particulièrement utiles : III (29b) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-15 Y' dans laquelle Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à environ vingt .résidus d'acides aminés.Alternatively, truncated sequences of peptides according to the present invention can be prepared. In this regard, the following sequences of peptide 29 may be particularly useful: III (29b) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-15 Y 'in which Y and / or Y ', if present, each represent sequences of up to about twenty amino acid residues.

IV (29c) 20 Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-IV (29c) 20 Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-

Ile-Gly-Lys-Ile-Y' dans laquelle Y et Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à environ vingt résidus d'acides aminés.Ile-Gly-Lys-Ile-Y 'in which Y and Y', if present, each represent sequences of up to about twenty amino acid residues.

25 Suivant un autre mode de réalisation, des régions homologues de l'isolat ARV-2, d'un intérêt particulier,· sont codées dans le cadre de lecture ouvert env depuis des nombres de résidus d'acides aminés d'environ 306 à environ 323 et présentent d'une manière typique, les séquences d'acides 30 aminés suivantes, où les oligopeptides inclus dans la séquence d'acides aminés suivante comprennent des épitopes linéaires à l'intérieur d'une telle séquence : V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-35 Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y' «r * 13 dans laquelle Y et Y', s'ils sont présents, représentent chacun de un jusqu'à environ vingt ou plus de résidus d'acides aminés. Si Y et/ou Y' sont présents, ils peuvent comprendre un ou plusieurs résidus d'acides aminés de sé-5 quences qui sont disposées à côté de résidus d'acides aminés 306 à 323 de la séquence d'enveloppe ARV-2 ou de n'importe quelle partie de ces séquences latérales ou disposées à côté.In another embodiment, homologous regions of the ARV-2 isolate of particular interest are encoded in the open reading frame env from numbers of amino acid residues from about 306 to about 323 and typically have the following amino acid sequences, where the oligopeptides included in the following amino acid sequence include linear epitopes within such a sequence: V (177) Y- Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-35 Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y '' r * 13 in which Y and Y ', if present, each represents from one to about twenty or more amino acid residues. If Y and / or Y 'are present, they may comprise one or more amino acid residues of sequence 5 which are arranged next to amino acid residues 306 to 323 of the ARV-2 envelope sequence or of any part of these side sequences or arranged next to them.

En particulier, Y peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe HIV depuis environ des 10 nombres de résidus 299 à 306; Y' peut comprendre toute ou1 des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe HIV depuis des nombres de résidus 324 à 333.In particular, Y can include all or parts of the HIV envelope amino acid sequence from about numbers of residues 299 to 306; It can include any or all of the HIV envelope amino acid sequence from residue numbers 324 to 333.

Alternativement, des séquences tronquées de peptide V peuvent être préparées . A cet égard, les séquences suivantes 15 peuvent être particulièrement utiles : VI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y'; etAlternatively, truncated peptide V sequences can be prepared. In this regard, the following sequences may be particularly useful: VI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y '; and

VIIVII

Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-20 Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-20 Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-

Cys-Y' dans lesquelles Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à vingt ou plus de résidus d'acides aminés.Cys-Y 'in which Y and / or Y', if present, each represents sequences of up to twenty or more amino acid residues.

25 Un autre exemple comprend des régions homologues de l'isolat LAV-2, telles que codées dans le cadre de lecture ouvert env depuis environ un nombre de résidus d'acides aminés 311 à 330, et présentent d'une manière typique la séquence suivante : 30 VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y' dans laquelle Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à vingt ou plus de résidus 35 d'acides aminés. (Voir article dans Nature 326:662 (1987), 14 qui est donné ici à titre de référence).Another example includes homologous regions of the LAV-2 isolate, as encoded in the open reading frame env from about a number of amino acid residues 311 to 330, and typically have the following sequence : 30 VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro- Y 'in which Y and / or Y', if present, each represents sequences of up to twenty or more amino acid residues. (See article in Nature 326: 662 (1987), 14 which is given here for reference).

Suivant un autre aspect de la présente invention, des nouvelles lignées cellulaires capables de produire des anticorps monoclonaux et des compositions comprenant de tels 5 anticorps sont proposées , lesquels anticorps sont capables de reconnaître sélectivement à des titres extrêmement élevés 2 4 7 (de 10 , à 10 jusqu'à environ 10 ou plus) des régions neutralisantes contenues dans une séquence prédéterminée de glycoprotéines d'enveloppe gpllO ou p25, leurs précurseurs 10 (je protéine , les protéines de fusion recombinantes biologiquement exprimées , et les peptides de synthèse qui contiennent un ou plusieurs épitopes dans la région de séquence prédéterminée de gpllO ou p25. Les cellules hybrides objet de l'invention présentent un chromosome identifiable 15 dans lequel l'ADN de lignée germinale s'est réarrangé pour coder un anticorps possédant un site de liaison pour un épitope sur gpllO ou p25 commun à quelques ou tous les isolats cliniques HIV. Ces anticorps monoclonaux peuvent être utilisés suivant une grande variété de manières incluant les 20 diagnostics et la thérapie, aussi bien que pour identifier d'autres anticorps réagissant de façon croisée, tels que les anticorps de blocage. Les peptides ou polypeptides contenant l'épitope ou les épitopes avec lesquels ils réagissent peuvent trouver des utilisations séparées comme immunogènes 25 pour les vaccins, ou comme agents thérapeutiques.According to another aspect of the present invention, new cell lines capable of producing monoclonal antibodies and compositions comprising such antibodies are provided, which antibodies are capable of selectively recognizing at extremely high titers 2 4 7 (from 10, to 10 to about 10 or more) neutralizing regions contained in a predetermined sequence of envelope glycoproteins gpl10 or p25, their precursors 10 (I protein, the biologically expressed recombinant fusion proteins, and the synthetic peptides which contain one or more several epitopes in the region of predetermined sequence of gpl10 or p25. The hybrid cells object of the invention have an identifiable chromosome 15 in which the germ line DNA has rearranged to encode an antibody having a binding site for an epitope on gpl10 or p25 common to some or all of the HIV clinical isolates. These monoclonal antibodies can be used used in a wide variety of ways including diagnostics and therapy, as well as to identify other cross-reactive antibodies, such as blocking antibodies. Peptides or polypeptides containing the epitope or epitopes with which they react can find separate uses as immunogens for vaccines, or as therapeutic agents.

Peptides de blocageBlocking peptides

Suivant un autre mode de réalisation de la présente invention, on utilise, pour une utilisation conjointe avec les anticorps monoclonaux de neutralisation ou les peptides 30 précédents, des peptides supplémentaires ou anticorps qui interfèrent avec la liaison HIV aux récepteurs pour en outre modérer le pouvoir infectieux de HIV. De préférence, des peptides appelés "peptides bloquants" capables d'inhiber la profilération du virus, aussi bien que des anticorps mono-35 clonaux spécifiques pour les épitopes contenus dans de tels 15 peptides bloquants, peuvent être utilisés pour augmenter l'efficacité des traitements contre les infections par HIV.According to another embodiment of the present invention, for use in conjunction with the neutralizing monoclonal antibodies or the preceding peptides, additional peptides or antibodies are used which interfere with HIV binding to receptors to further moderate the infectious power. of HIV. Preferably, peptides called "blocking peptides" capable of inhibiting virus profiling, as well as monoclonal antibodies specific for the epitopes contained in such blocking peptides, can be used to increase the effectiveness of treatments. against HIV infections.

Les peptides de blocage HIV correspondent d'une manière typique aux séquences d'acides aminés de HIV que l'on estime 5 être essentielles pour la fixation du virus sur une cellule hôte, tel que les résidus d'acides aminés codés env d'environ 190 à environ 197 de LAV^^ et d'environ 185 à environ 192 de ARV-2 et HTLV-III(BH-IO). Ces peptides comprennent 1'octapeptide T (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) et ses 10 divers dérivés (voir IX ci-dessous) et les analogues (par exemple XI ci-dessous) décrits par Pert et autres (1986,HIV blocking peptides typically correspond to the amino acid sequences of HIV which are believed to be essential for binding of the virus to a host cell, such as the amino acid residues encoded env of approximately 190 to approximately 197 of LAV ^^ and approximately 185 to approximately 192 of ARV-2 and HTLV-III (BH-IO). These peptides include octapeptide T (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) and its various derivatives (see IX below) and analogs (e.g. XI below) described by Pert et al. (1986,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9254-9258, laquelle publication est donnée ici à titre de référence) situés sur la glycoprotéine d'enveloppe (gpllO ou 120).Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 9254-9258, which publication is given here for reference) located on the envelope glycoprotein (gpl10 or 120).

15 Par exemple, les peptides de blocage possédant les séquences suivantes sont d'un intérêt particulier, de préférence avec une acétylation du NH2-terminal et une amidation du COOH-terminal: IX (173D) 20 Y-^Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y ’ ; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y ' ; 25 XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y ' ; XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y ' ; XIV (190) 30 Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y ' ; XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y'; dans lesquelles, pour chaque peptide, Y et Y', s'ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés de 35 jusqu'à environ 20 acides aminés. Les épitopes ou déterminants 16 antigéniques dans ces peptides sont d'une manière typique définis par au moins environ cinq acides aminés contigus, et trouvent une utilisation dans par exemple l'imitation des sites antigènes HIV se produisant naturellement pour produire 5 des anticorps réactifs HIV et des vaccins.For example, blocking peptides having the following sequences are of particular interest, preferably with acetylation of the NH2-terminal and amidation of the COOH-terminal: IX (173D) 20 Y- ^ Ala-Ser-Thr- Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y '; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y '; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y '; XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y '; XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y '; XIV (190) 30 Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y '; XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y '; wherein, for each peptide, Y and Y ', if present, each comprise an amino acid sequence of 35 to about 20 amino acids. The epitopes or antigenic determinants 16 in these peptides are typically defined by at least about five contiguous amino acids, and find use in, for example, mimicking naturally occurring HIV antigen sites to produce HIV reactive antibodies and vaccines.

Production des anticorps monoclonauxMonoclonal antibody production

La préparation des anticorps monoclonaux peut être réalisée en immortalisant l'expression des séquences d'acides nucléiques qui codent des anticorps spécifiques pour HIV, en 10 introduisant de telles séquences, typiquement ADNc codant pour l'anticorps, dans un hôte capable d'être cultivé dans une culture. La lignée cellulaire immortalisée peut être une lignée cellulaire de mammifère qui a été transformée par oncogenèse, par transfection, mutation ou analogues. De 15 telles cellules comprennent les lignées de myélomes, les lignées de lymphomes ou d'autres lignées cellulaires capables de supporter l'expression et la sécrétion de l'anticorps in vitro. L'anticorps peut être une immunoglobuline se produisant naturellement d'un mammifère, produite par trans-20 formation d'un lymphocyte, particulièrement d'un splénocyte, au moyen d'un virus ou par fusion du lymphocyte avec une cellule néoplasique, par exemple un myélome, pour produire une lignée cellulaire hybride. D'une manière typique, le splénocyte sera obtenu à partir d'un animal immunisé contre 25 le virus HIV ou un fragment de celui-ci contenant un site épitopique.The preparation of the monoclonal antibodies can be carried out by immortalizing the expression of the nucleic acid sequences which code antibodies specific for HIV, by introducing such sequences, typically cDNA coding for the antibody, in a host capable of being cultured. in a culture. The immortalized cell line can be a mammalian cell line which has been transformed by oncogenesis, by transfection, mutation or the like. Such cells include myeloma lines, lymphoma lines or other cell lines capable of supporting expression and secretion of the antibody in vitro. The antibody may be a naturally occurring mammalian immunoglobulin produced by transformation of a lymphocyte, particularly a splenocyte, by means of a virus or by fusion of the lymphocyte with a neoplastic cell, for example myeloma, to produce a hybrid cell line. Typically, the splenocyte will be obtained from an animal immunized against the HIV virus or a fragment thereof containing an epitopic site.

Les protocoles d’immunisation sont bien connus et peuvent varier considérablement pour demeurer cependant efficaces. Voir Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and 30 Practice, Academie Presse, 2è édition (1986), qui est donné ici à titre de référence. Un virus rompu ou brisé , des peptides de synthèse, et des protéines de fusion bactérienne qui contiennent des fragments antigéniques de la molécule gpllü ou p25, peuvent être utilisés comme immunogènes. De 35 préférence, l'immunogène du virus brisé, des peptides ou desImmunization protocols are well known and can vary widely to remain effective, however. See Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and 30 Practice, Academie Presse, 2nd edition (1986), which is given here for reference. A ruptured or broken virus, synthetic peptides, and bacterial fusion proteins which contain antigenic fragments of the gp111 or p25 molecule can be used as immunogens. Preferably, the immunogen of the broken virus, peptides or

* A* AT

17 protéines recombinantes sera enrichi en protéines ou en ses fragments contenant les épitopes pour lesquels les cellules B produisant l'anticorps ou les splénocytes sont désirés.17 recombinant proteins will be enriched in proteins or in its fragments containing the epitopes for which the B cells producing the antibody or the splenocytes are desired.

Plus particulièrement, des solutions contenant des extraits 5 ou lysats de virus brisé ou rompu, ou des surnageants de protéines recombinantes biologiquement exprimées ou des vecteurs d'expression rompus ou séparés, peuvent être enrichis en glycoprotéines, si on le désire, en utilisant des méthodes de purification, telles que par exemple, l'électrophorèse 10 sur gel polyacrylamide. La purification d’affinité par lectine est une méthode pratique et préférée pour purifier gpllO et d'autres glycoprotéines, par exemple la purification d’affinité utilisant la lectine de lentille. L'étendue jusqu'à laquelle les glycoprotéines sont purifiées à partir 15 des solutions pour une utilisation comme immunogènes, peut varier d’une manière importante, c'est-à-dire de moins de 50%, habituellement ou au moins de 75% à 95% , d'une manière désirable de 95% à 99% et, plus désirablement , jusqu'à l'homogénéité absolue.More particularly, solutions containing extracts or lysates of broken or disrupted virus, or supernatants of biologically expressed recombinant proteins or disrupted or separated expression vectors, can be enriched in glycoproteins, if desired, using methods purification, such as for example, electrophoresis on polyacrylamide gel. Affinity purification by lectin is a convenient and preferred method for purifying gpl10 and other glycoproteins, for example affinity purification using lens lectin. The extent to which glycoproteins are purified from solutions for use as immunogens can vary widely, i.e., less than 50%, usually or at least 75% to 95%, desirably from 95% to 99% and, more desirably, to absolute homogeneity.

20 Une fois que les protéines ont été purifiées jusqu'au degré désiré, elles peuvent être mises en suspension ou diluées dans un support physiologique approprié pour immunisation, ou bien peuvent être couplées à un adjuvant. Une technique préférée, par exemple, consiste en l'adsorption des 25 protéines et de leurs fragments sur de l'agarose de lectine de lentille ou sur un autre support macromoléculaire pour l'injection. Des quantités immunogènes de préparations antigéniques enrichies en protéines HIV, comprenant la glycoprotéine gpllO et la protéine de noyau p25 ou des 30 fractions antigèniques de celles-ci, sont injectées , généralement à des- concentrations comprises dans l'intervalle 1 pg à 20 mg/kg d'hôte. L'administration peut se faire par injection, par exemple intramusculaire, péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse etc. L'administration peut se faire en une 35 ou plusieurs fois, habituellement suivant des intervalles de A t 18 une à quatre semaines. Les animaux immunisés sont contrôlés pour la production de l'anticorps en les antigènes désirés, puis les rates sont enlevées et les lymphocytes B spléniques isolés et combinés avec une lignée cellulaire de myélomes 5 ou transformés. La transformation ou la fusion peut être réalisée suivant des manières classiques, la technique de fusion ou combinaison étant décrite dans un grand nombre de brevets, par exemple les brevets américains N° 4 172 124; N° 4 350 683; N° 4 363 799; N° 4 381 292; et N° 4 423 147.Once the proteins have been purified to the desired degree, they can be suspended or diluted in a physiological carrier suitable for immunization, or can be coupled to an adjuvant. A preferred technique, for example, is the adsorption of proteins and their fragments onto lens lectin agarose or other macromolecular support for injection. Immunogenic amounts of antigen preparations enriched in HIV proteins, including the glycoprotein gpl10 and the core protein p25 or antigenic fractions thereof, are injected, generally at concentrations in the range 1 pg to 20 mg / kg of host. Administration can be by injection, for example intramuscular, peritoneal, subcutaneous, intravenous etc. The administration can be done in one or more times, usually at intervals of A t 18 one to four weeks. The immunized animals are checked for the production of the antibody to the desired antigens, then the spleens are removed and the spleen B cells isolated and combined with a myeloma cell line or transformed. The transformation or fusion can be carried out in conventional ways, the fusion or combination technique being described in a large number of patents, for example US Pat. Nos. 4,172,124; No. 4,350,683; No. 4,363,799; No. 4,381,292; and No. 4,423,147.

10 Voir encore , Kennett et autres, Monoclonal Antibodies (1980), et les références citées dans cet article qui sont citées à titre de référence, et voir encore Goding, supra.10 See again, Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980), and the references cited in this article which are cited by reference, and still see Goding, supra.

Les lignées cellulaires immortalisées peuvent être clonées et triées , suivant les techniques classiques , et 15 on détecte les anticorps dans les produits surnageants qui sont capables de se lier aux protéines virales HIV désirées de gpllO ou p25 , les protéines de fusion recombinantes ou les peptides de synthèse qui contiennent la région épitopique désirée. Les lignées de cellules immortalisées appropriées 20 peuvent ensuite être soumises à une croissance i£ vitro ou injectées dans la cavité péritonéale d'un hôte approprié pour production d'un fluide ascite. En vertu du fait que l'on dispose de certains anticorps de la présente invention qui sont connus comme étant spécifiques pour des épitopes contenus 25 par exemple dans les régions codées par la région génomique LAVgpnj d'environ 6688 bp à environ 6750 bp (peptide codant 29), ou d'environ 7246 bp à environ 7317 (peptide codant 36) (numérotage bp selon Wain-Hobson et autres, Cell 44:9 1985, qui est donné ici à titre de référence), les surnageants 30 peuvent être sélectionnés en compétition avec les anticorps monoclonaux objet de l'invention dans un test de compétition. Ainsi, des lignées cellulaires d'hybridomes immortalisées supplémentaires avec les caractérisques de liaison désirées peuvent être produites facilement à partir d'une variété de 35 sources en fonction de la disponibilité des anticorps * * 19 présents spécifiques pour l'antigène particulier. Alternativement, ces lignées cellulaires peuvent être combinées avec d'autres cellules B néoplasiques, où de telles autres cellules B peuvent servir comme récipients pour l'ADN du 5 génome codant pour l'anticorps.Immortalized cell lines can be cloned and sorted, according to conventional techniques, and antibodies are detected in the supernatants which are capable of binding to the desired HIV viral proteins of gpl10 or p25, the recombinant fusion proteins or the peptides of synthesis which contain the desired epitopic region. The appropriate immortalized cell lines can then be subjected to in vitro growth or injected into the peritoneal cavity of an appropriate host for production of ascites fluid. By virtue of the fact that certain antibodies of the present invention are available which are known to be specific for epitopes contained for example in the regions coded by the genomic region LAVgpnj of approximately 6688 bp to approximately 6750 bp (peptide coding 29), or from about 7246 bp to about 7317 (peptide encoding 36) (bp numbering according to Wain-Hobson et al., Cell 44: 9 1985, which is given here for reference), the supernatants can be selected by competition with the monoclonal antibodies object of the invention in a competition test. Thus, additional immortalized hybridoma cell lines with the desired binding characteristics can be readily produced from a variety of sources depending on the availability of the present * * 19 antibodies specific for the particular antigen. Alternatively, these cell lines can be combined with other neoplastic B cells, where such other B cells can serve as recipients for the DNA of the genome encoding the antibody.

Bien que des cellules B néoplasiques de rongeur, particulièrement murin soient préférées, d'autres espèces de mammifères peuvent être utilisées telles que lagomorphe, bovin, ovin, équin, porcin, avien ou analogues. L'immunisa-10 tion de ces animaux peut être facilement réalisée et leurs lymphocytes, particulièrement les splénocytes, peuvent être obtenus pour des fusions.Although neoplastic rodent, particularly murine B cells are preferred, other mammalian species can be used such as lagomorph, bovine, sheep, equine, pig, avian or the like. Immunization of these animals can be easily accomplished and their lymphocytes, particularly splenocytes, can be obtained for fusions.

L'anticorps monoclonal sécrété par les lignées cellulaires hybrides ou transformées peut être l'un quelconque 15 des classes ou sous-classes d ' immunoglobulines, telles que IgM, IgD, IgA, IgG^ ou IgE. Etant donné que IgG est l'isotype le plus commun utilisé dans les tests de diagnostic, il est souvent préféré. Les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés intacts, ou sous la forme de fragments, tels 20 que Fv, Fab, F ( a b ' )21 mais habituellement intacts.The monoclonal antibody secreted by the hybrid or transformed cell lines can be any of the classes or subclasses of immunoglobulins, such as IgM, IgD, IgA, IgG1 or IgE. Since IgG is the most common isotype used in diagnostic tests, it is often preferred. Monoclonal antibodies can be used intact, or in the form of fragments, such as Fv, Fab, F (a b ') 21 but usually intact.

Pour atténuer l'antigénicité possible dans un hôte humain d'un anticorps monoclonal, dérivé d'un animal autre qu'un être humain, des anticorps chimériques peuvent être construits, dans lesquels le fragment de liaison à l'antigène 25 d'une molécule d'immunoglobuline (région variable), est relié par une liaison peptidique à au moins une partie d'une autre protéine non reconnue comme étrangère par les humains, telle que la partie évacuée d'une molécule d'immunoglobuline humaine. Ceci peut être réalisé en fusionnant ou combinant 30 des exons de régions variables d'animal avec des exons de régions constantes gamma ou kapa d'un être humain. Diverses techniques sont connues par ceux familiers de la technique, telles que celles décrites dans la demande de brevet international N° 86/01533, et dans les demandes de brevets 35 européens 171496 et 173494, qui sont données ici à titre J* ·> 20 de référence.To attenuate the possible antigenicity in a human host of a monoclonal antibody, derived from an animal other than a human, chimeric antibodies can be constructed, in which the antigen-binding fragment of a molecule immunoglobulin (variable region), is linked by a peptide bond to at least part of another protein not recognized as foreign by humans, such as the evacuated part of a human immunoglobulin molecule. This can be achieved by fusing or combining exons from variable regions of animal with exons from constant gamma or kapa regions of a human. Various techniques are known by those familiar with the technique, such as those described in international patent application No. 86/01533, and in European patent applications 171496 and 173494, which are given here under D *> 20 reference.

Utilisation et formulations pharmaceutiquesPharmaceutical formulations and use

Les anticorps monoclonaux de cette invention qui présentent une activité de neutralisation, tels que ceux qui 5 réagissent avec un site épitopique sur gpllO ou p25 ou qui réagissent avec un peptide de blocage, peuvent également être incorporés comme constituants d'une composition pharmaceutique pour atténuer les infections par HIV. La composition doit contenir une quantité prophylactique ou thérapeutique 10 d'au moins l'un des anticorps monoclonaux de cette invention avec un support pharmaceutiquement efficace. Le support pharmaceutique..doit être constitué par n'importe quel substance compatible, non toxique et convenable pour permettre l'administration des anticorps monoclonaux au malade. De 15 l'eau stérile, de l'alcool, des produits gras, des cires et des produits solides inertes peuvent être utilisés comme support. Des adjuvants pharmaceutiquement acceptables (agents tampon, agents de dispersion) peuvent également être incorporés dans la composition pharmaceutique. De telles 20 compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique de façon à être par exemple spécifiques pour des souches de HIV avec des glycoprotéines d'enveloppe contenant un site épitopique dans une région codée par 6688 bp-6750 bp. Alternativement, la composition pharmaceutique peut contenir 25 un ou plusieurs anticorps monoclonaux pour former un "cocktail". Par exemple, un cocktail contenant des anticorps monoclonaux contre les diverses souches de HIV constituerait un produit universel avec une activité prophylactique ou thérapeutique contre la grande majorité des isolats cliniques 30 de HIV. Le cocktail peut contenir des anticorps monoclonaux qui se lient à des protéines ou des glycoprotéines de HIV autres que gpllO ou p25, telles que, par exemple, à la glycoprotéine gp41 ou à 1'intégrase/p34 nucléase. Le rapport molaire des divers constituants d'anticorps monoclonaux ne 35 différera habituellement pas de plus d'un facteur 10, plus *' * 21 habituellement de pas plus d'un facteur 5, et sera habituellement compris entre environ 1:1-2 pour chacun des autres constituants d'anticorps.The monoclonal antibodies of this invention which exhibit neutralizing activity, such as those which react with an epitopic site on gpl10 or p25 or which react with a blocking peptide, can also be incorporated as components of a pharmaceutical composition to attenuate HIV infections. The composition should contain a prophylactic or therapeutic amount of at least one of the monoclonal antibodies of this invention with a pharmaceutically effective carrier. The pharmaceutical carrier ... must consist of any compatible, non-toxic and suitable substance to allow the administration of monoclonal antibodies to the patient. Sterile water, alcohol, fatty products, waxes and inert solid products can be used as a carrier. Pharmaceutically acceptable adjuvants (buffering agents, dispersing agents) can also be incorporated into the pharmaceutical composition. Such compositions may contain a single monoclonal antibody so as to be, for example, specific for HIV strains with envelope glycoproteins containing an epitopic site in a region encoded by 6688 bp-6750 bp. Alternatively, the pharmaceutical composition may contain one or more monoclonal antibodies to form a "cocktail". For example, a cocktail containing monoclonal antibodies against various strains of HIV would constitute a universal product with prophylactic or therapeutic activity against the vast majority of clinical HIV isolates. The cocktail may contain monoclonal antibodies which bind to HIV proteins or glycoproteins other than gp101 or p25, such as, for example, the gp41 glycoprotein or the integrase / p34 nuclease. The molar ratio of the various constituents of monoclonal antibodies will usually not differ by more than a factor of 10, plus * '* 21 usually by no more than a factor of 5, and will usually be between about 1: 1-2 for each of the other antibody constituents.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention 5 peuvent être utilisés sous la forme de compositions administrées séparément et données en conjonction avec d'autres agents anti-rétroviraux, comprenant des peptides de blocage. L'état actuel du développement des agents anti-rétroviraux, et des agents anti-HIV en particulier, est décrit dans la 10 publication de Mitsuya et autres, Nature 32b:773-778, 1987, qui est donnée ici à titre de référence.The monoclonal antibodies of the present invention can be used in the form of compositions administered separately and given in conjunction with other anti-retroviral agents, including blocking peptides. The current state of development of anti-retroviral agents, and anti-HIV agents in particular, is described in the publication by Mitsuya et al., Nature 32b: 773-778, 1987, which is given here for reference.

Les anticorps monoclonaux, les peptides et les compositions pharmaceutiques de ceux-ci selon la présente invention sont particulièrement utiles pour une administrais tion par voie orale ou parentérale.The monoclonal antibodies, peptides and pharmaceutical compositions thereof according to the present invention are particularly useful for oral or parenteral administration.

De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie parentérale, c'est-à-dire par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Ainsi, cette invention propose des compositions pour une 20 administration parentérale , qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal, d'un peptide ou d'un cocktail de ceux-ci, dissous dans un support acceptable, de préférence un support aqueux. Une grande variété de supports aqueux peut être utilisée, par exemple l'eau, l'eau tamponnée, une 25 solution saline 0,4%, de glycine 0,3% ou analogues. Ces solutions sont stériles et généralement dépourvues de particules. Ces compositions peuvent être stérilisées par des techniques classiques et bien connues de stérilisation. Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires 30 pharmaceutiquement acceptables comme exigé pour satisfaire approximativement aux conditions physiologiques, tels que les agents tampon et d'ajustage du pH, les agents d'ajustage de la toxicité ou analogues, par exemple l'acétate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure 35 de calcium, le lactate de sodium etc. La concentration de *' Λ 22 l'anticorps dans ces formulations peut varier d'une manière importante, c'est-à-dire de moins environ 0,5%, habituellement à ou au moins environ 1% jusqu'à autant que 15 ou 20% en poids, et la concentration sera choisie essentiellement 5 en fonction des volumes de fluide, des viscosités, etc., de préférence en fonction du mode particulier d'administration choisi.Preferably, the pharmaceutical compositions can be administered parenterally, that is to say by subcutaneous, intramuscular or intravenous route. Thus, this invention provides compositions for parenteral administration, which comprise a solution of the monoclonal antibody, a peptide or a cocktail thereof, dissolved in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. A wide variety of aqueous carriers can be used, for example water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine or the like. These solutions are sterile and generally free of particles. These compositions can be sterilized by conventional and well known sterilization techniques. The compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to meet approximately physiological conditions, such as buffering and pH adjusting agents, toxicity adjusting agents or the like, for example sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate etc. The concentration of * Λ 22 the antibody in these formulations can vary significantly, i.e. from minus about 0.5%, usually at or at least about 1% up to as much as 15 or 20% by weight, and the concentration will be chosen essentially according to the volumes of fluid, the viscosities, etc., preferably according to the particular mode of administration chosen.

Ainsi, une composition pharmaceutique typique pour injection intramusculaire pourra être confectionnée de façon 10 à contenir 1 ml d'eau tamponnée stérile, et 50 mg d'anticorps monoclonal. Une composition typique pour injection intraveineuse pourrait être confectionnée de façon à contenir 250 ml de solution de Ringer stérile , et 150 mg d'anticorps monoclonal. Des méthodes pour préparer des compositions 15 administrables par voie parentérale sont bien connues de ceux qui sont familiers de la technique et sont décrites en plus de détail dans par exemple la publication Remington's Pharma-ceutical Science, 15è Ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvanie (1980), qui est indiquée ici à titre de 20 référence.Thus, a typical pharmaceutical composition for intramuscular injection could be made up to contain 1 ml of sterile buffered water, and 50 mg of monoclonal antibody. A typical composition for intravenous injection could be made up to contain 250 ml of sterile Ringer's solution, and 150 mg of monoclonal antibody. Methods for preparing parenterally administrable compositions are well known to those familiar with the art and are described in more detail in, for example, the publication Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), which is given here for reference.

Les anticorps monoclonaux et les peptides de cette invention peuvent être lyophilisés pour le stockage et reconstitués dans un support ou véhicule convenable avant usage. Cette technique s'est montrée comme efficace avec des 25 globulines immunes classiques et des techniques de reconstitution et de lyophilisation connues dans la technique peuvent être utilisées. Il sera apprécié par ceux familiers de la technique que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire à divers degrés de perte d'activité de l'anticorps 30 (par exemple avec des immunoglobulines classiques, des anticorps IgM tendent à avoir une plus grande perte d'activité que les anticorps IgG) et que des niveaux ou proportions d'utilisation peuvent nécessiter un ajustement pour compensation.The monoclonal antibodies and peptides of this invention can be lyophilized for storage and reconstituted in a suitable carrier or vehicle before use. This technique has been shown to be effective with conventional immune globulins and reconstitution and lyophilization techniques known in the art can be used. It will be appreciated by those familiar with the art that lyophilization and reconstitution can lead to varying degrees of loss of antibody activity (for example with conventional immunoglobulins, IgM antibodies tend to have greater loss of activity than IgG antibodies) and that levels or proportions of use may require adjustment for compensation.

35 Les compositions contenant les anticorps monoclonaux ϊ * 23 de la présente invention, les peptides ou leurs cocktails peuvent être administrés pour le traitement thérapeutique et/ou prophylactique des infections par HIV. Dans les applications thérapeutiques, les compositions sont administrées à un 5 malade déjà infecté avec le HIV, suivant une quantité suffisante pour guérir ou au moins partiellement arrêter l'infection et ses complications. Une proportion adéquate pour accomplir ceci est définie comme étant une "dose thérapeutiquement efficace". Des quantités efficaces pour cette utilisation 10 dépendent de la sévérité de l'infection et de l'état général du système immunitaire propre du malade, mais sont généralement comprises entre environ 1 et environ 200 mg d'anticorps par kilogramme de poids du corps, des doses comprises entre 5 et 25 mg par kilogramme étant plus communément utilisées. On 15 doit garder à l'esprit que les matériaux de cette invention peuvent être généralement utilisés dans des états de maladie sérieux , c'est-à-dire dans des situations où la vie est menacée ou potentiellement menacée. Dans de tels cas, il est possible et peut être estimé désirable par le médecin trai-20 tant d'administrer ces anticorps suivant des excès sensibles.The compositions containing the ϊ * 23 monoclonal antibodies of the present invention, the peptides or their cocktails can be administered for the therapeutic and / or prophylactic treatment of HIV infections. In therapeutic applications, the compositions are administered to a patient already infected with HIV, in an amount sufficient to cure or at least partially stop the infection and its complications. An adequate proportion to accomplish this is defined as a "therapeutically effective dose". Amounts effective for this use depend on the severity of the infection and the general condition of the patient's own immune system, but are generally between about 1 and about 200 mg of antibodies per kilogram of body weight, doses between 5 and 25 mg per kilogram are more commonly used. It should be borne in mind that the materials of this invention can generally be used in serious disease states, i.e. in situations where life is threatened or potentially threatened. In such cases, it is possible and may be considered desirable by the treating physician to administer these antibodies in substantial excess.

Dans les applications prophylactiques, les compositions contenant les présents peptides, anticorps ou leurs cocktails sont administrées à un malade qui n'est pas déjà infecté par le virus HIV, mais qui a peut-être été récemment exposé ou 25 qui est estimé avoir été exposé à un risque d'infection par le virus ou au virus lui-même, de façon à renforcer la résistance du malade à une telle infection potentielle ou de façon à le vacciner contre le virus. On définit la quantité administrée par une "dose prophylactiquemênt efficace".In prophylactic applications, the compositions containing the present peptides, antibodies or their cocktails are administered to a patient who is not already infected with the HIV virus, but who may have been recently exposed or who is believed to have been exposed at risk of infection with the virus or the virus itself, so as to strengthen the patient's resistance to such a potential infection or so as to vaccinate him against the virus. The amount administered is defined by a "prophylactically effective dose".

30 Dans cette utilisation, les quantités précises dépendent de nouveau de l'état de santé du malade et de son état général immunitaire, mais sont généralement comprises entre 0,1 mg et 25 mg par kilogramme , tout particulièrement entre 0,5 mg et 2,5 mg par kilogramme.In this use, the precise amounts again depend on the state of health of the patient and his general immune state, but are generally between 0.1 mg and 25 mg per kilogram, very particularly between 0.5 mg and 2 , 5 mg per kilogram.

35 Des administrations uniques ou multiples des « » 24 compositions peuvent être réalisées avec des doses et un protocole choisis par le médecin traitant. Dans tous les cas, les formulations pharmaceutiques doivent fournir une quantité de l'anticorps ou des anticorps de cette invention qui sont 5 suffisantes pour traiter efficacement le malade.Single or multiple administrations of the "" 24 compositions can be performed with doses and a protocol chosen by the attending physician. In all cases, the pharmaceutical formulations should provide an amount of the antibody or antibodies of this invention which are sufficient to effectively treat the patient.

En outre, les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent trouver une utilisation en tant que molécule support ou véhicule spécifique pour une cible. Un anticorps peut être lié à une toxine pour former une immunotoxine 10 ou un matériau radioactif ou un médicament pour former un produit pharmaceutique ou radiopharmaceutique . Des procédés pour produire des immunotoxines et des produits radiopharmaceutiques sont bien connus (voir par exemple, Cancer Treatment Reports 68:317 (1984)).Furthermore, the monoclonal antibodies of the present invention can find use as a specific carrier molecule or vehicle for a target. An antibody can be linked to a toxin to form an immunotoxin or a radioactive material or drug to form a pharmaceutical or radiopharmaceutical. Methods for producing immunotoxins and radiopharmaceuticals are well known (see, for example, Cancer Treatment Reports 68: 317 (1984)).

15 II est également possible que des hétéroagrégats d'anticorps monoclonaux de la présente invention et d'activateurs de cellules T humaines, tels que des anticorps monoclonaux pour l'antigène CD3 ou le récepteur gamma F sur des cellules T, puissent permettre à des cellules T humaines ou 20 à des cellules portant Fc-gamma (telles que des cellules K ou neutrophiles) de tuer des cellules infectées par HIV via une cytolyse par l'intermédiaire de cellules dépendant d'anticorps ("antibody dépendent cell-mediated cytolysis" * "ADCC"). De tels hétéroagrégats peuvent être assemblés, par 25 exemple, par liaison covalente des anticorps anti-HIV aux anticorps anti-CD3 en utilisant le réactif hétéro-bifonctionnel N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate, comme décrit par Karpowsky et autres, J. Exp. Med. 160:1686 (1984), cette publication étant donnée ici à titre de référence.It is also possible that heteroaggregates of monoclonal antibodies of the present invention and human T cell activators, such as monoclonal antibodies to the CD3 antigen or the gamma F receptor on T cells, may allow cells Human T or Fc-gamma-carrying cells (such as K or neutrophils) to kill HIV-infected cells via cytolysis via antibody-dependent cells ("antibody depend cell-mediated cytolysis" * "ADCC"). Such heteroaggregates can be assembled, for example, by covalent binding of anti-HIV antibodies to anti-CD3 antibodies using the hetero-bifunctional reagent N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate, as described by Karpowsky and others , J. Exp. Med. 160: 1686 (1984), this publication being given here for reference.

30 Les compositions peptidiques elles-mêmes objet de cette invention peuvent également trouver une utilisation thérapeutique, lorsque l'administration produit la réduction ou l'élimination du virus HIV dans un hôte infecté. Ces compositions , telles que le peptide 29, les peptides de blocage et 35 le peptide 126 peuvent être administrées dans des supports 25 ou véhicules physiologiques appropriés, par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale etc. Divers véhicules comprennent une solution saline tamponnée au phosphate, une solution saline, de l'eau, du 5 chlorure de potassium., du lactate de sodium ou analogues.The peptide compositions themselves which are the subject of this invention can also find therapeutic use, when the administration produces the reduction or elimination of the HIV virus in an infected host. These compositions, such as peptide 29, blocking peptides and peptide 126 can be administered in appropriate physiological carriers or vehicles, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneal etc. Various vehicles include phosphate buffered saline, saline, water, potassium chloride, sodium lactate or the like.

La concentration des peptides varie largement en fonction de son usage ultime, de l'activité et du mode d'administration.The concentration of peptides varies widely depending on its end use, activity and method of administration.

De préférence, les peptides comportent une amidation du C00H-terminal, une formylation du Nl^-terminal ou d'autres dérivés 10 pharmaceutiquement acceptables. L'addition de peptides bloquants aux peptides imitant une région du HIV neutralisante et/ou les anticorps spécifiquement réactifs de la présente invention procurera une efficacité thérapeutique accrue de manière significative. D'autres agents anti-HIV peuvent égale-15 ment être inclus dans les formulations (autres que les anticorps monoclonaux qui lient les peptides) tels que la 3'-azido-3'-déoxythymidine, la 2',3'-didéoxycytidine, la 2',3'-didéoxy-2',3'-didéhydrocytidine , etc.Preferably, the peptides include C00H-terminal amidation, Nl-terminal formylation or other pharmaceutically acceptable derivatives. Addition of blocking peptides to peptides mimicking a neutralizing HIV region and / or the specifically reactive antibodies of the present invention will provide significantly increased therapeutic efficacy. Other anti-HIV agents can also be included in the formulations (other than the monoclonal antibodies which bind the peptides) such as 3'-azido-3'-deoxythymidine, 2 ', 3'-dideoxycytidine, 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydrocytidine, etc.

Utilisation des anticorps monoclonaux dans la purification 20 d'immunoaffinitéUse of monoclonal antibodies in the purification of immunoaffinity

Des anticorps monoclonaux spécifiques pour les polypeptides contenant gpllO ou d'autres déterminants antigéniques, particulièrement les déterminants antigéniques obtenus à partir des protéines de fusion recombinantes biologiquement 25 exprimées ou des lysats ou extraits d'HIV cultivé, sont particulièrement avantageux pour une utilisation dans les protocoles de purification. Généralement les anticorps possèdent des constantes d'association par affinité de l'ordre 8 12 de 10 à 10 M. De tels anticorps peuvent être utilisés pour 30 purifier les protéines recombinantes à partir du milieu de culture du système d'expression recombinant si la protéine exprimée est sécrétée ou à partir des constituants du système d'expression biologique rompu si elle n'est sécrétée. Généralement, les anticorps monoclonaux qui sont capables de réagir 35 avec gpllO ou d'autres déterminants antigéniques sont attachés * * 26 ou immobilisés sur un substrat ou support. La solution contenant les déterminants antigéniques HIV est ensuite mise en contact avec l'anticorps immobilisé dans des conditions convenables pour la formation de complexes immuns entre 5 l'anticorps et les polypeptides contenant les déterminants antigéniques gpllO. Le matériau non lié est séparé des complexes immuns liés, lesquels complexes ou fragments antigèniques de gpllO sont ensuite séparés du support.Monoclonal antibodies specific for polypeptides containing gpl10 or other antigenic determinants, particularly the antigenic determinants obtained from biologically expressed recombinant fusion proteins or cultured HIV lysates or extracts, are particularly advantageous for use in protocols of purification. Generally, the antibodies have affinity association constants of the order of 8 12 from 10 to 10 M. Such antibodies can be used to purify the recombinant proteins from the culture medium of the recombinant expression system if the protein expressed is secreted or from the constituents of the disrupted biological expression system if not secreted. Generally, monoclonal antibodies which are capable of reacting with gpl10 or other antigenic determinants are attached * * 26 or immobilized on a substrate or support. The solution containing the HIV antigenic determinants is then contacted with the immobilized antibody under conditions suitable for the formation of immune complexes between the antibody and the polypeptides containing the gpl10 antigenic determinants. The unbound material is separated from the bound immune complexes, which antigenic complexes or fragments of gpl10 are then separated from the support.

D'une manière typique, les anticorps monoclonaux sont 10 purifiés bruts à partir d'un fluide ascite ou de surnageants, de culture de cellules avant fixation sur un support. De tels processus sont bien connus de ceux familiers de la technique, et peuvent inclure un fractionnement avec des sels neutres à concentration élevée. D'autres méthodes, telles que la 15 chromatographie DEAE , la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel préparative, ou la chromatographie d'affinité protéine A, peuvent également être utilisées pour purifier l'anticorps monoclonal avant son utilisation comme un immunoadsorbant.Typically, the monoclonal antibodies are crude purified from ascites fluid or supernatants, cell culture before attachment to a support. Such processes are well known to those familiar with the art, and may include fractionation with neutral salts at high concentration. Other methods, such as DEAE chromatography, gel filtration chromatography, preparative gel electrophoresis, or protein A affinity chromatography, can also be used to purify the monoclonal antibody before use as a immunoadsorbent.

20 Le support sur lequel les anticorps monoclonaux sont immobilisés doit avoir les caractéristiques générales suivantes : (a) interactions faibles avec les protéines en général pour minimiser les liaisons non spécifiques, (b) bonnes caractéristiques d'écoulement qui permettent l'écoule-25 ment au travers de matériaux de poids moléculaire élevé, (c) possession de groupes chimiques qui peuvent être activés ou modifiés pour permettre la liaison chimique de l'anticorps monoclonal, (d) stabilité physique et chimique dans les conditions utilisées pour lier l'anticorps monoclonal et (e) 30 stabilité aux conditions et constituants des tampons exigés pour l'adsorption et l'élution de l'antigène. Certains supports communément utilisés sont l'agarose, les polystyrènes dérivés, les polysaccharides, les grains de polyacrylamide, la cellulose activée, le verre et analogues. Diverses méthodes 35 chimiques existent pour la fixation des anticorps sur les ·* * 27 supports formant substrats. Voir généralement Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology 36:29 (1972). Les anticorps de la présente invention peuvent être fixés directement sur le support ou, alternativement, par l'intermédiaire d'un bras 5 de liaison ou d'entretoise.The support on which the monoclonal antibodies are immobilized must have the following general characteristics: (a) weak interactions with proteins in general to minimize non-specific bonds, (b) good flow characteristics which allow the flow-through through high molecular weight materials, (c) possession of chemical groups which can be activated or modified to allow chemical binding of the monoclonal antibody, (d) physical and chemical stability under the conditions used to bind the monoclonal antibody and (e) stability to the conditions and components of the buffers required for adsorption and elution of the antigen. Some commonly used carriers are agarose, derived polystyrenes, polysaccharides, polyacrylamide grains, activated cellulose, glass and the like. Various chemical methods exist for the attachment of antibodies to the substrates forming substrates. See generally Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology 36:29 (1972). The antibodies of the present invention can be attached directly to the support or, alternatively, via a link or strut.

Les conditions générales requises pour l'immobilisation des anticorps monoclonaux sur les supports chromatographiques sont bien connues dans la technique. Voir par exemple Tijssen, P. 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, 10 cette publication étant donnée ici à titre de référence. Les processus actuels de couplage dépendent légèrement des caractéristiques et du type de l'anticorps à coupler. Les anticorps monoclonaux possèdent des caractéristiques qui sont habituellement constantes d'un mélange à l'autre, ce qui 15 permet à de telles conditions ou caractéristiques d'être y optimisées. La fixation se produit typiquement par l'intermédiaire de liaisons covalentes.The general conditions required for the immobilization of the monoclonal antibodies on the chromatographic supports are well known in the art. See, for example, Tijssen, P. 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, 10 this publication being given here for reference. Current coupling processes depend slightly on the characteristics and type of the antibody to be coupled. Monoclonal antibodies have characteristics which are usually constant from one mixture to another, allowing such conditions or characteristics to be optimized there. Fixation typically occurs through covalent bonds.

Une suspension d'extraits ou lysats de virus HIV, le surnageant d'un système d'expression biologique cultivé, ou 20 une suspension des cellules rompues ou brisées est ensuite ajoutée à la matrice de séparation. Le mélange est incubé sous des conditions et pendant un temps suffisant pour que se produise la formation du complexe immun , habituellement pendant au moins 30 minutes, plus habituellement pendant un 25 temps de 2 à 24 heures. Les complexes immuns contenant des polypeptides avec des parties antigéniques de gpllO sont ensuite séparés du mélange. D'une manière typique, le mélange est enlevé, par exemple par élution, et les complexes immuns liés sont lavés d'une manière exhaustive avec du tampon 30 d'adsorption. Les complexes immuns peuvent être ensuite élues à partir de la matrice de séparation en utilisant un éluant compatible avec le support particulier qui est utilisé, lesquels éluants sont bien connus par ceux qui sont familiers de la technique. Egalement, les polypeptides contenant le 35 gpllO ou d'autres fractions antigèniques peuvent être éliminés -* ·» 28 sélectivement. Par exemple, les peptides qui contiennent un épitope reconnu par les anticorps peuvent être utilisés pour entrer en compétition avec le site de liaison de l'anticorps, ce qui constitue une technique d'élution alternative qui peut 5 être réalisée dans des conditions d'élution douces. Le polypeptide sélectivement adsorbé contenant l'antigène gpllO peut être élue à partir d'un adsorbant d'affinité d’anticorps en altérant le pH et/ou la force ionique du tampon. Des agents chaotropiques peuvent également trouver une utilisation 10 dans l'élimination de l'antigène lié. La sélection de l'agent chaotropique, sa concentration et d'autres conditions d'élution dépendent des caractéristiques de l'interaction anticorps-antigène, mais une fois qu'elles sont déterminées, elles ne doivent pas être soumises à des changements habituellement 15 nécessaires dans les systèmes de séparation par affinité polyclonale.A suspension of extracts or lysates of HIV virus, the supernatant of a cultured biological expression system, or a suspension of disrupted or broken cells is then added to the separation matrix. The mixture is incubated under conditions and for a time sufficient for the formation of the immune complex, usually for at least 30 minutes, more usually for a period of 2 to 24 hours. The immune complexes containing polypeptides with antigenic parts of gpl10 are then separated from the mixture. Typically, the mixture is removed, for example by elution, and the bound immune complexes are washed thoroughly with adsorption buffer. The immune complexes can then be eluted from the separation matrix using an eluent compatible with the particular support that is used, which eluents are well known to those familiar with the art. Also, polypeptides containing gp101 or other antigenic moieties can be eliminated selectively. For example, peptides which contain an epitope recognized by antibodies can be used to compete with the binding site of the antibody, which is an alternative elution technique which can be performed under elution conditions. sweet. The selectively adsorbed polypeptide containing the gpl10 antigen can be eluted from an antibody affinity adsorbent by altering the pH and / or ionic strength of the buffer. Chaotropic agents may also find use in the removal of bound antigen. The selection of the chaotropic agent, its concentration and other elution conditions depend on the characteristics of the antibody-antigen interaction, but once they are determined, they should not be subject to changes usually necessary. in polyclonal affinity separation systems.

Le matériau élué peut exiger un ajustage à un pH physiologique si des tampons de force ionique ou pH faibles ou élevés sont utilisés pour séparer les antigènes gpllO liés 20 de la matrice de séparation. Une dialyse ou une chromatographie de filtration sur gel peuvent également être exigées pour éliminer les sels en excès utilisés dans l'éluant de façon à permettre la reconstitution de gpllO ou des polypeptides contenant des fractions antigéniques de gpllO sur 25 des conformations naissantes.The eluted material may require adjustment to physiological pH if low or high ionic strength or pH buffers are used to separate the bound gpl10 antigens from the separation matrix. Dialysis or gel filtration chromatography may also be required to remove excess salts used in the eluent so as to allow reconstitution of gpl10 or polypeptides containing gpl10 antigenic fractions on nascent conformations.

Les procédés de cette invention procurent, par exemple, du gpllO sensiblement purifié ou des polypeptides contenant des fragments antigéniques de celui-ci, soit produits naturellement par des cultures de cellules infectées ou par des 30 systèmes d'expression recombinants de bactéries, levures, ou des cellules de mammifère ou d'insectes cultivées. Le gpllO et les fragments ou d'autres protéines purifiées seront d'une manière typique d'une pureté supérieure à 50%, plus usuellement d'au moins 75% et fréquemment plus grande que 35 95 à 99%. Ces molécules peuvent ensuite trouver un usage «* « 29 ultérieur dans uns grande variété d'applications.The methods of this invention provide, for example, substantially purified gpl10 or polypeptides containing antigenic fragments thereof, either produced naturally by cultures of infected cells or by recombinant expression systems of bacteria, yeasts, or cultured mammalian or insect cells. The gpl10 and the fragments or other purified proteins will typically be of greater than 50% purity, more usually at least 75% and frequently greater than 95 to 99%. These molecules can then find further use in a wide variety of applications.

Les protéines de gpllO HIV, les polypeptides contenant des fragments antigéniques de celles-ci, ou d'autres protéines sensiblement purifiées selon les procédés de la présente 5 invention, peuvent trouver une utilisation dans une grande variété d'applications, comprenant les formulations de sous-unités de vaccin SIDA, dans lesquelles l'immunogène comprend une dose efficace de déterminants antigéniques de, par exemple, gpllO ou d'une région neutralisante de gpllO, D'au-10 très constituants de la formulation peuvent inclure les fractions antigéniques des protéines HIV ou des glycoprotéines qui stimulent la production d'anticorps (de préférence anticorps neutralisants) dans un hôte immunisé, lesquels anticorps sont capables de constituer une protection contre une 15 infection subséquente par HIV.The gpl10 HIV proteins, polypeptides containing antigenic fragments thereof, or other proteins substantially purified according to the methods of the present invention, can find use in a wide variety of applications, including sub-formulations - AIDS vaccine units, in which the immunogen comprises an effective dose of antigenic determinants of, for example, gpl10 or of a neutralizing region of gpl10, Au-10 very constituents of the formulation can include the antigenic fractions of the proteins HIV or glycoproteins which stimulate the production of antibodies (preferably neutralizing antibodies) in an immunized host, which antibodies are capable of providing protection against subsequent HIV infection.

Utilisations pour diagnostic des anticorps monoclonauxUses for diagnosis of monoclonal antibodies

Les anticorps monoclonaux de la présente invention sont également utiles dans des buts de diagnostic. Ils peuvent être soit marqués ou non marqués dans ce but. Typiquement, 20 des tests de diagnostic permettent la détection de la formation dçun complexe par l'intermédiaire de la liaison de l'anticorps monoclonal sur un antigène HIV. S'ils sont non marqués, les anticorps trouvent l'utilisation par exemple dans les tests d'agglutination. En outre, des anticorps non marqués 25 peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres anticorps marqués (seconds anticorps) qui réagissent avec l'anticorps monoclonal, tels que des anticorps spécifiques pour l'immunoglobuline. Alternativement, les anticorps monoclonaux peuvent être marqués directement. Une grande variété de marqueurs 30 peut être utilisée, tels que des radionucléides, des agents fluorescents, des enzymes, des substrats d'enzyme, des co-facteurs d’enzyme, des inhibiteurs d'enzyme , des ligands (particulièrement haptens) , etc. Divers types d ' immuno-essais sont disponibles, et, à titre d'exemple, ceux décrits dans 35 les brevets américains N°s 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; * * 30 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; et 4 098 876 qui sont donnés ici à titre de référence.The monoclonal antibodies of the present invention are also useful for diagnostic purposes. They can be either marked or unmarked for this purpose. Typically, diagnostic tests allow the detection of the formation of a complex through the binding of the monoclonal antibody to an HIV antigen. If they are unlabelled, the antibodies find use, for example, in agglutination tests. In addition, unlabeled antibodies can be used in combination with other labeled antibodies (second antibodies) which react with the monoclonal antibody, such as antibodies specific for immunoglobulin. Alternatively, the monoclonal antibodies can be labeled directly. A wide variety of markers can be used, such as radionuclides, fluorescers, enzymes, enzyme substrates, enzyme co-factors, enzyme inhibitors, ligands (especially haptens), etc. . Various types of immunoassays are available, and, by way of example, those described in US Pat. Nos. 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; * * 30 3 935 074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; and 4,098,876 which are given here for reference.

De manière habituelle, les anticorps monoclonaux et les peptides de la présente invention sont utilisés dans des 5 immuno-essais d'enzyme où, par exemple, les anticorps objet de l'invention, ou les seconds anticorps d'une espèce différente, sont conjugués à un enzyme. Lorsqu'un échantillon biologique contenant des antigènes HIV, tels que le sérum sanguin humain, la salive, le sperme, les sécrétions vaginales 10 ou une suspension de culture de cellules infectéespar virus, est combiné avec les anticorps, une liaison se produit entre les anticorps et les molécules présentant l'épitope désiré.Usually, the monoclonal antibodies and the peptides of the present invention are used in enzyme immunoassays where, for example, the antibodies of the invention, or the second antibodies of a different species, are conjugated to an enzyme. When a biological sample containing HIV antigens, such as human blood serum, saliva, semen, vaginal secretions or a culture suspension of virus-infected cells, is combined with the antibodies, binding occurs between the antibodies and molecules with the desired epitope.

De telles protéines ou particules virales peuvent ensuite être séparées des réactifs non liés, et un second anticorps 15 (marqué avec un enzyme) ajouté. Par la suite, la présence du conjugat anticorps-enzyme spécifiquement lié à l'antigène est déterminée. D'autres techniques classiques bien connues des familiers de la technique peuvent également être utilisées.Such proteins or viral particles can then be separated from unbound reagents, and a second antibody (labeled with an enzyme) added. Subsequently, the presence of the antibody-enzyme conjugate specifically linked to the antigen is determined. Other conventional techniques well known to those familiar with the art can also be used.

Des kits peuvent également être réalisés pour être 20 utilisés avec les anticorps dans la détection de l'infection HIV ou pour la présence de l'antigène HIV. Ainsi, les compositions d'anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent être proposées, habituellement sous forme lyophilisée, soit seules ou conjointement avec des anticorps 25 supplémentaires spécifiques pour d'autres épitopes de HIV.Kits can also be made to be used with antibodies in the detection of HIV infection or for the presence of the HIV antigen. Thus, the monoclonal antibody compositions according to the present invention can be provided, usually in lyophilized form, either alone or in conjunction with additional antibodies specific for other HIV epitopes.

Les anticorps, qui peuvent être conjugués à un marqueur ou non conjugués, sont inclus dans les kits avec des tampons, tels que Tris, phosphate, carbonate etc..., des stabiliseurs, des biocides, des protéines inertes, par exemple de l'albumine de 30 sérum bovin, ou analogues. D'une manière générale, ces matériaux seront présents suivant une proportion de moins d'environ 5¾ en poids basée sur la quantité d'anticorps actifs, et seront habituellement présents suivant une quantité totale d'au moins environ 0,001% en poids basée sur la 35 concentration d'anticorps. Fréquemment, il est désirable 31 * 9 d'inclure un agent de dilution inerte ou un excipient pour diluer les ingrédients actifs, où l'excipient peut être présent suivant une quantité d'environ 1% à 99% en poids de la composition totale. Si un second anticorps capable de se 5 lier à l'anticorps monoclonal est utilisé, celui-ci sera habituellement présent dans un récipient séparé. Le second anticorps est d'une manière typique conjugué à un marqueur et formulé d'une manière analogue aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus.Antibodies, which can be conjugated to a marker or non-conjugated, are included in the kits with buffers, such as Tris, phosphate, carbonate etc ..., stabilizers, biocides, inert proteins, for example bovine serum albumin, or the like. Generally, these materials will be present in a proportion of less than about 5% by weight based on the amount of active antibodies, and will usually be present in a total amount of at least about 0.001% by weight based on the 35 antibody concentration. Frequently, it is desirable to include an inert diluting agent or an excipient for diluting the active ingredients, where the excipient may be present in an amount of from about 1% to 99% by weight of the total composition. If a second antibody capable of binding to the monoclonal antibody is used, it will usually be present in a separate container. The second antibody is typically conjugated to a label and formulated in a manner analogous to the antibody formulations described above.

10 La détection des antigènes p25 ou de gpllO , ou du virus entier, dans des échantillons biologiques variés peut trouver une utilisation dans le diagnostic d'une infection courante par le virus HIV. Les échantillons biologiques peuvent comprendre, mais ne sont pas limités à, le sérum 15 sanguin, la salive, le sperme, les échantillons de tissus obtenus par biopsie (cerveau, peau, nodosités lymphatiques, rate, etc..), des surnageants de culture de cellules, des systèmes d'expression bactériens et eucaryotiques rompus ou brisés, et analogues. La présence du virus est testée par 20 incubation de l'anticorps monoclonal avec l'échantillon biologique dans des conditions contribuant à la formation d'un complexe immun, ce après quoi on détecte la formation du complexe. Suivant une réalisation, la formation de complexe est détectée par l'utilisation d'un second anticorps capable 25 de se lier à l'anticorps monoclonal qui est typiquement conjugué à un marqueur et formulé d'une manière analogue aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus. Dans une autre réalisation, l'anticorps monoclonal est fixé sur un support à phase solide qui est ensuite mis en contact avec un échan-30 tillon biologique. Après une phase d'incubation, l'anticorps monoclonal marqué est ajouté pour détecter l'antigène lié. Préparation et utilisation des peptides de synthèseDetection of p25 or gpl10 antigens, or the whole virus, in various biological samples may find use in the diagnosis of common infection with the HIV virus. Biological samples can include, but are not limited to, blood serum, saliva, semen, tissue samples obtained by biopsy (brain, skin, lymph nodes, spleen, etc.), culture supernatants disrupted or broken cells, bacterial and eukaryotic expression systems, and the like. The presence of the virus is tested by incubating the monoclonal antibody with the biological sample under conditions contributing to the formation of an immune complex, after which the formation of the complex is detected. In one embodiment, complex formation is detected by the use of a second antibody capable of binding to the monoclonal antibody which is typically conjugated to a label and formulated in a manner analogous to the antibody formulations described herein. -above. In another embodiment, the monoclonal antibody is fixed on a solid phase support which is then brought into contact with a biological sample. After an incubation phase, the labeled monoclonal antibody is added to detect the bound antigen. Preparation and use of synthetic peptides

La présente invention a pour objet des nouveaux peptides qui, entre autres, imitent immunologiquement des 35 épitopes de protéine codés par le rétrovirus HIV, 32 particulièrement des épitopes codés dans les régions gag ou env du génome viral codant respectivement gpllO ou p25.The present invention relates to new peptides which, inter alia, imitate immunologically protein epitopes encoded by the HIV retrovirus, in particular epitopes encoded in the gag or env regions of the viral genome encoding gpl10 or p25 respectively.

Pour satisfaire les variations de souche à souche, parmi les différents isolats, des ajustements pour les substitutions 5 conservatives, et une sélection parmi les alternatives si des substitutions non-conservatives sont nécessaires, peuvent être réalisés. Ces peptides peuvent être utilisés comme des immunogènes, pour inhiber ou éliminer la production d'antigène HIV in_ vitro ou i£ vivo, pour la détection du virus ou 10 des anticorps sur le virus dans un échantillon physiologique.To satisfy strain-to-strain variations, among different isolates, adjustments for conservative substitutions, and selection from alternatives if non-conservative substitutions are required, can be made. These peptides can be used as immunogens, to inhibit or eliminate the production of HIV antigen in vitro or in vivo, for the detection of virus or antibodies to the virus in a physiological sample.

En fonction de la nature du protocole, les peptides peuvent être conjugués à un support ou d'autres composés, marqués ou non marqués, liés à une surface solide, ou analogue.Depending on the nature of the protocol, the peptides can be conjugated to a support or other compounds, labeled or unlabeled, linked to a solid surface, or the like.

Suivant un mode de réalisation, des peptides d'intérêt 15 peuvent dériver de la région gpllO du virus. La région qui présente un intérêt particulier est celle qui se trouve dans le cadre de lecture ouvert env s'étendant depuis environ la paire de bases 6688 bp jusqu'à environ 6750 bp et depuis environ 7246 bp jusqu'à environ 7317, 20 Les peptides d'intérêt, comprenant les peptides blo quants, comprennent au moins cinq, parfois six, quelquefois huit, parfois douze, parfois 21, habituellement un peu moins que 50, plus habituellement un peu moins qu'environ 35 et de préférence moins d'environ 25 acides aminés compris dans une 25 séquence codée par un rétrovirus HIV. D'une manière désirable, le peptdde sera aussi petit que possible tout en maintenant encore sensiblement toute l'activité antivirale ou d'immunoréactivité du peptide plus important. Dans quelques cas, il peut être désirable de réunir deux ou plus d'oligopeptides 30 qui ne se chevauchent pas pour former une structure de peptide unique ou pour les utiliser comme des peptides individuels en même temps, lesquels procurent ensemble ou séparément une sensibilité équivalente au peptide père.According to one embodiment, peptides of interest can derive from the gpl10 region of the virus. The region of particular interest is that in the open reading frame env extending from about the base pair 6688 bp to about 6750 bp and from about 7246 bp to about 7317, 20 Peptides of interest, including blocking peptides, include at least five, sometimes six, sometimes eight, sometimes twelve, sometimes 21, usually a little less than 50, more usually a little less than about 35 and preferably less than about 25 amino acids included in a sequence encoded by an HIV retrovirus. Desirably, the peptide will be as small as possible while still maintaining substantially all of the antiviral or immunoreactivity activity of the larger peptide. In some cases, it may be desirable to combine two or more non-overlapping oligopeptides to form a single peptide structure or to use them as individual peptides at the same time, which together or separately provide equivalent sensitivity to father peptide.

Le peptide peut être modifié en introduisant des 35 substitutions conservatives ou non-conservatives dans le '* > 33 peptide, habituellement moins de 20%, plus habituellement moins de 10% des acides aminés étant échangés. Dans les situations où des régions sont trouvées comme étant polymorphiques, il peut être désirable de faire varier un ou 5 plusieurs acides aminés particuliers pour imiter plus efficacement les différents épitopes des différentes souches rétrovirales. Dans beaucoup de cas pour obtenir une stabilité chimique, la méthionine peut être remplacée par la norleucine (Nor).The peptide can be modified by introducing conservative or non-conservative substitutions into the peptide, usually less than 20%, more usually less than 10% of the amino acids being exchanged. In situations where regions are found to be polymorphic, it may be desirable to vary one or more particular amino acids to more effectively mimic different epitopes of different retroviral strains. In many cases to obtain chemical stability, methionine can be replaced by norleucine (Nor).

10 II convient de comprendre que le peptide utilisé dans la présente invention n'a pas besoin d'être identique à une séquence de polypeptides d'HIV particulière, pour autant que le composé soit capable de procurer une compétition immunologique avec des protéines d'au moins l'une des souches du 15 rétrovirus HIV. Par conséquent, le peptide de l'invention peut être sujet à divers changements, tels que des insertions, des suppressions et des substitutions, soit conservatifs ou non-conservatifs, si de tels changements peuvent procurer certains avantages lors de l'utilisation. Par substitutions 20 conservatives, on entend des substitutions dans des groupes tels que gly, ala; val, île, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; et nor, met. Habituellement, la séquence ne diffère de pas plus de 20% par rapport à la séquence d'au moins une souche d'un rétrovirus HIV sauf où 25 des acides aminés supplémentaires peuvent être ajoutés sur l'un ou l'autre terminal de façon à procurer un "bras" par lequel le peptide de cette invention peut être convenablement immobilisé. Les bras peuvent avoir une longueur qui est habituellement d'au moins 1 acide aminé et peut être de 50 30 ou plus d'acides aminés, plus souvent de 1 à 10 acides aminés.It should be understood that the peptide used in the present invention need not be identical to a particular HIV polypeptide sequence, provided that the compound is capable of providing immunological competition with proteins of at least minus one of the strains of the HIV retrovirus. Therefore, the peptide of the invention may be subject to various changes, such as insertions, deletions and substitutions, either conservative or non-conservative, if such changes can provide certain advantages in use. By conservative substitutions is meant substitutions in groups such as gly, ala; val, island, leu; asp, glue; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; and nor, met. Usually the sequence does not differ by more than 20% from the sequence of at least one strain of an HIV retrovirus except where additional amino acids can be added to either terminal so as to providing an "arm" by which the peptide of this invention can be properly immobilized. The arms may have a length which is usually at least 1 amino acid and may be 50 or more amino acids, more often 1 to 10 amino acids.

Le peptide dans lequel la séquence d'acides aminés est modifiée par la substitution, l'addition ou la suppression des résidus d'acides aminés, doit retenir sensiblement toute l'activité antivirale ou d'immunoréactivité des peptides non 35 modifiés, ce qui peut être commodément mesuré par diversesThe peptide in which the amino acid sequence is modified by the substitution, addition or deletion of amino acid residues, must retain substantially all of the antiviral or immunoreactivity activity of the unmodified peptides, which can be conveniently measured by various

* J* J

34 techniques de test présentement décrites. La forme isomère d d'un ou plusieurs acides aminés peut être utilisée, si on le désire, pour modifier les propriétés biologiques, telles que l'activité , le taux de rupture etc..34 test techniques currently described. The d-isomeric form of one or more amino acids can be used, if desired, to modify biological properties, such as activity, rate of breakdown, etc.

5 En outre, un, deux ou plusieurs acides aminés peuvent être ajoutés sur les parties terminales d'un oligopeptide ou d'un peptide pour faciliter la liaison des peptides l'un à l'autre, pour le couplage à un support ou un peptide plus grand, pour des raisons qui seront discutées plus loin, pour 10 modifier les propriétés physiques ou chimiques du peptide ou de l'oligopeptide, ou analogues.In addition, one, two or more amino acids can be added to the terminal parts of an oligopeptide or a peptide to facilitate the binding of the peptides to one another, for coupling to a support or a peptide. larger, for reasons which will be discussed later, to modify the physical or chemical properties of the peptide or oligopeptide, or the like.

Des acides aminés tels que la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide aspartique ou glutamique, ou analogues, peuvent être introduits sur le C ou N terminal du peptide 15 ou de l'oligopeptide pour procurer une fonctionnalité utile dans la liaison. La cystéine est particulièrement préférée pour faciliter le couplage covalent à d'autres peptides ou pour former des polymères par oxydation.Amino acids such as tyrosine, cysteine, lysine, aspartic or glutamic acid, or the like, can be introduced at the C or N terminal of the peptide or oligopeptide to provide useful functionality in binding. Cysteine is particularly preferred to facilitate covalent coupling to other peptides or to form polymers by oxidation.

En outre, les séquences de peptide ou d'oligopeptide 20 peuvent différer de la séquence naturelle par le fait que la séquence est modifiée par acylation du Nh^-terminal, par exemple acétylation ou amidation par acide thioglycolique, amidation du carboxy-terminal , par exemple , avec de l'ammoniac ou de la méthylamine, pour procurer une stabi-25 lité, un pouvoir hydrophobe accru pour la liaison à un support ou une autre molécule, ou pour la polymérisation.In addition, the peptide or oligopeptide sequences may differ from the natural sequence in that the sequence is modified by acylation of the Nh-terminal, for example acetylation or amidation by thioglycolic acid, amidation of the carboxy-terminal, by for example, with ammonia or methylamine, to provide stability, increased hydrophobicity for binding to a support or other molecule, or for polymerization.

Ainsi, par exemple, dans les peptides I-VIII et IX-XV décrits ci-dessus, lorsque Y ou Y' sont présents, un mode de réalisation préféré existe si Y ou Y' comprend un ou plusieurs 30 résidus de cystéine ou une combinaison d'un ou plusieurs résidus de cystéine avec des acides aminés d'espacement. La glycine constitue un moyen d'espacement ou une entretoise particulièrement préféré. Des peptides préférés pour utilisation dans une polymérisation oxydante sont ceux dans lesquels 35 Y ou Y' représente au moins deux résidus de cystéine. Si deux *· y 35 résidus de cystéine sont présents à la même extrémité du peptide, une réalisation préférée existe lorsque les résidus de cystéine sont séparés au moyen d'un à trois résidus d'acides aminés d'espacement, de préférence la glycine. La 5 présence de résidus de cystéine peut permettre la formation de dimères du peptide et/ou augmenter le caractère hydrophobe du peptide résultant ce qui facilite l'immobilisation du peptide dans des systèmes immobilisés de test ou des systèmes de phase solide.Thus, for example, in peptides I-VIII and IX-XV described above, when Y or Y 'are present, a preferred embodiment exists if Y or Y' comprises one or more cysteine residues or a combination one or more cysteine residues with spacer amino acids. Glycine is a particularly preferred spacer or spacer. Preferred peptides for use in oxidative polymerization are those in which Y or Y 'represents at least two cysteine residues. If two * 35 y cysteine residues are present at the same end of the peptide, a preferred embodiment exists when the cysteine residues are separated by means of one to three spacer amino acid residues, preferably glycine. The presence of cysteine residues can allow the formation of peptide dimers and / or increase the hydrophobicity of the resulting peptide which facilitates immobilization of the peptide in immobilized test systems or solid phase systems.

10 Un usage d'un intérêt particulier est celui du groupe mercaptan des cystéines ou des acides thioglycoliques utilisés pour les groupes amino terminaux d'acylation ou analogues pour lier deux des peptides ou oligopeptides ou leurs combinaisons par une liaison disulfure ou une liaison plus grande 15 pour former des polymères qui contiennent un certain nombre d'épitopes. De tels polymères présentent l'avantage d'une réaction immunologique accrue. Si différents peptides sont utilisés pour fabriquer le polymère, ils possèdent la possibilité supplémentaire d'induire des anticorps qui immuno-20 réagissent avec plusieurs déterminants antigéniques de différents isolats HIV.One use of particular interest is that of the mercaptan group of cysteines or thioglycolic acids used for amino terminal acylation groups or the like to link two of the peptides or oligopeptides or their combinations by a disulfide bond or a larger bond. to form polymers that contain a number of epitopes. Such polymers have the advantage of an increased immunological reaction. If different peptides are used to make the polymer, they have the additional possibility of inducing antibodies which immuno-react with several antigenic determinants of different HIV isolates.

Pour obtenir la formation de polymères antigéniques (multimères synthétiques), on peut utiliser des composés possédant des groupes bis-haloacétyles, des nitroarylhalogénures, 25 ou analogues, lorsque les réactifs sont spécifiques pour les groupes thio. Ainsi, la liaison entre les deux groupes mercapto des différents peptides ou oligopeptides peut être une liaison simple ou un groupe liant d'au moins 2, habituellement d'au moins 4, et pas plus d'environ 16, habituellement 30 pas plus d'environ 14 atomes de carbone.To obtain the formation of antigenic polymers (synthetic multimers), compounds having bis-haloacetyl groups, nitroarylhalides, or the like can be used when the reagents are specific for thio groups. Thus, the bond between the two mercapto groups of the different peptides or oligopeptides can be a single bond or a linking group of at least 2, usually at least 4, and no more than about 16, usually no more than about 14 carbon atoms.

Le peptide objet de l'invention peut être utilisé en étant lié à un support macromoléculaire soluble (par exemple pas moins de 5 kDal). D'une manière commode, le support peut être un poly(acide aminé), soit naturel ou synthétique, vis-35 è-vis duquel des anticorps ont peu de chance d'être rencontrés 36 «r i dans le sérum humain. Des exemples de tels supports sont la poly-L-lysine, 1'hémocyanine limpet keyhole, la thyroglobuline, les albumines, telles que l'albumine de sérum bovin , le toxoïde du tétanos etc.. Le choix du support est essentiel-5 lement dépendant de l'utilisation ultime de l'antigène, et dépend des commodités et des disponibilités.The peptide object of the invention can be used by being linked to a soluble macromolecular support (for example not less than 5 kDal). Conveniently, the carrier can be a poly (amino acid), either natural or synthetic, against which antibodies are unlikely to be encountered in human serum. Examples of such carriers are poly-L-lysine, hemocyanin limpet keyhole, thyroglobulin, albumin, such as bovine serum albumin, tetanus toxoid, etc. The choice of carrier is essential. depending on the end use of the antigen, and depends on amenities and availability.

Avec de tels produits conjugués, il y aura au moins une molécule d'au moins un peptide de l'invention par macromolécule, et pas plus qu'environ 1 par 0,5kDal, habituellement 10 pas plus d'environ 1 par 2kDal de la macromolécule. Un ou plusieurs peptides différents peuvent être liés à la même macromolécule.With such conjugates, there will be at least one molecule of at least one peptide of the invention per macromolecule, and no more than about 1 per 0.5kDal, usually no more than about 1 per 2kDal of the macromolecule. One or more different peptides can be linked to the same macromolecule.

La façon de réaliser la liaison est classique, et utilise des réactifs tels que l'acide p-maléïmidobenzoïque, 15 l'acide p-méthyldithiobenzoïque, l'anhydride d'acide maléique, l'anhydride d'acide succinique, le glutaraldéhyde etc. La liaison peut se produire sur le N-terminal, le C-terminal ou sur un site intermédiaire entre les extrémités de la molécule. Le peptide objet de l'invention peut être dérivé par liaison, 20 peut être lié tout en étant relié à un support, ou analogues.The way of binding is conventional, and uses reagents such as p-maleimidobenzoic acid, p-methyldithiobenzoic acid, maleic acid anhydride, succinic acid anhydride, glutaraldehyde etc. Binding can occur on the N-terminal, the C-terminal or on an intermediate site between the ends of the molecule. The peptide object of the invention can be derived by binding, can be linked while being linked to a support, or the like.

Divers protocoles d'essai connus de ceux qui sont familiers de la technique peuvent être utilisés pour détecter la présence de soit les anticorps sur les protéines rétro-virales soit les protéines rétrovirales elles-mêmes. Il y a 25 un intérêt particulier à utiliser le peptide sous la forme du réactif marqué, si le marqueur permet un signal détectable, ou à lier le peptide, soit directement ou indirectement sur une surface, si l'anticorps sur le peptide dans l'échantillon devient lié au peptide sur la surface. La présence d'un 30 anticorps humain lié au peptide peut alors être détectée en utilisant un anticorps xénogène spécifique pour l'immunoglobuline humaine, normalement à la fois IgM et IgG humaines, ou une protéine marquée spécifique pour des complexes immuns, par exemple le facteur Rf de la protéine A S. aureus.Various assay protocols known to those familiar with the art can be used to detect the presence of either the antibodies on the retroviral proteins or the retroviral proteins themselves. There is particular interest in using the peptide in the form of the labeled reagent, if the label allows a detectable signal, or in binding the peptide, either directly or indirectly on a surface, if the antibody on the peptide in the sample becomes bound to the peptide on the surface. The presence of a human antibody linked to the peptide can then be detected using a xenogenic antibody specific for human immunoglobulin, normally both human IgM and IgG, or a labeled protein specific for immune complexes, for example the factor Rf of protein A S. aureus.

35 A titre d'illustration d'une technique d'essai, on « & 37 citera l'utilisation d'un conteneur d'échantillons, par exemple les puits de plaques comportant des micropuits, où le polypeptide objet de l'invention ou les produits conjugués de celui-ci sont adsorbés sur le fond du récipient 5 et/ou les parois soit de façon covalente ou non covalente. L'échantillon, qui est normalement du sang humain ou du sérum dilué dans un milieu tamponné de manière appropriée, est mis dans le récipient et un temps suffisant est laissé pour la formation du complexe entre le ou les polypeptides 10 et tous les anticorps parents dans l'échantillon. Le surnageant est éliminé et le récipient lavé pour enlever les protéines non spécifiquement liées. Une protéine de liaison spécifique marquée qui se lie spécifiquement au complexe, tel que l'antisérum xénogénique pour l'immunoglobuline 15 humaine, est utilisée pour la détection.By way of illustration of a test technique, the use of a sample container, for example plate wells comprising microwells, where the polypeptide object of the invention or the conjugate products thereof are adsorbed on the bottom of the container 5 and / or the walls either covalently or non-covalently. The sample, which is normally human blood or serum diluted in an appropriately buffered medium, is put in the container and sufficient time is left for the complex to form between the polypeptide (s) and all of the parent antibodies in the sample. The supernatant is removed and the container washed to remove non-specifically bound proteins. A labeled specific binding protein which specifically binds to the complex, such as the xenogenic antiserum for human immunoglobulin, is used for detection.

Le peptide peut être préparé suivant une grande variété de façons. Le peptide, en raison de ses dimensions relativement courtes, peut être synthétisé en solution ou sur un support solide suivant les techniques classiques. Divers 20 appareils automatiques de synthèse sont disponibles dans le commerce aujourd'hui et peuvent être utilisés avec des protocoles connus. Voir par exemple Stewart et Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 2è ed., Pierce Chemical Co., 1984; et Tarn et autres, J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6442.The peptide can be prepared in a variety of ways. The peptide, because of its relatively short dimensions, can be synthesized in solution or on a solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesis devices are commercially available today and can be used with known protocols. See, for example, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., 1984; and Tarn et al., J. Am. Chem. Soc. (1983) 105: 6442.

25 Alternativement, la technologie ADN hybride peut être utilisée si un gène synthétique peut être préparé en utilisant des brins uniques qui codent pour le polypeptide ou des brins sensiblement complémentaires de celui-ci,si les brins uniques se chevauchent et peuvent être mis ensemble dans un 30 milieu de recuisson de façon à permettre l'hybridation. Les brins ou filaments hybridés peuvent être ensuite ligaturés pour former le gène complet, et, par le choix de terminaisons appropriées, le gène peut être inséré dans des vecteurs d'expression, qui sont facilement disponibles aujourd'hui.Alternatively, hybrid DNA technology can be used if a synthetic gene can be prepared using single strands that code for the polypeptide or strands substantially complementary thereto, if the single strands overlap and can be put together in one 30 annealing medium so as to allow hybridization. The hybridized strands or filaments can then be ligated to form the complete gene, and, by choosing appropriate terminations, the gene can be inserted into expression vectors, which are readily available today.

35 Voir par exemple Maniatis et autres, Molecular Cloning, * » 38 A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Ou bien la région du génome viral codant pour le peptide peut être clonée par des techniques ADN recombinant classiques et exprimée (voir Maniatis, supra).35 See for example Maniatis et al., Molecular Cloning, * ”38 A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Or the region of the viral genome encoding the peptide can be cloned by conventional recombinant DNA techniques and expressed ( see Maniatis, supra).

5 Des séquences codantes ADN des isolats LAVgpy et ARV-2 de HIV qui peuvent être utilisées pour exprimer les peptides, sont les suivantes :The DNA coding sequences of the LAVgpy and ARV-2 isolates from HIV which can be used to express the peptides are as follows:

LAVBRU TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTTLAVBRU TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT

10 GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA10 GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA

GCA CAT TGTGCA CAT TGT

ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA 15 CAT TGTARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA 15 CAT TGT

Des fragments d'une séquence peuvent être utilisés pour l'expression de fragments de peptide, des changements de base conservatifs peuvent être faits, si le ou les codons codent pour le ou les mêmes acides aminés, ou bien des chan-20 gements non-conservatifs dans la séquence codante peuvent être faits, si l’acide aminé résultant peut être un changement conservatif ou non-conservatif dans la séquence d'acides ' aminés, comme cela a été discuté précédemment.Fragments of a sequence can be used for expression of peptide fragments, conservative base changes can be made, if the codon (s) code for the same amino acid (s), or non-coding changes. conservatives in the coding sequence can be made, if the resulting amino acid can be a conservative or non-conservative change in the amino acid sequence, as previously discussed.

La séquence codante peut être étendue soit au 25 5' ou 3' terminal ou aux deux terminaux pour allonger le peptide, tout en retenant son ou ses sites épitopiques. L'allongement peut procurer un bras pour la liaison, par exemple à un marqueur, tel qu'un enzyme, pour réunir deux ou tous les peptides ensemble dans la même chaîne, de façon 30 à procurer une activité antigénique, des sites de restriction convenables pour le clonage , ou analogues.The coding sequence can be extended to either the 5 ′ or 3 ′ terminal or to both terminals to lengthen the peptide, while retaining its epitopic site (s). The extension can provide an arm for binding, for example to a marker, such as an enzyme, to join two or all of the peptides together in the same chain, so as to provide antigenic activity, suitable restriction sites for cloning, or the like.

La séquence ADN par elle-même, ses fragments, ou des séquences plus grandes, habituellement d'au moins 15 bases, de préférence d'au moins 18 bases, peuvent être utilisés 35 comme sondes nucléotidiques pour la détection d'ARN rétroviral « » 39 ou d'ADN proviral, ou pour identifier les régions homologues pour le clonage ou la formation de séquence. De nombreuses techniques sont décrites, telles par exemple la technique Grunstein-Hogness, la technique Southern, la technique 5 Northern, dot-blot, leurs perfectionnements, aussi bien que d'autres méthodologies, telles que celles décrites dans le brevet américain N° 4 358 535 qui est donné ici à titre de référence.The DNA sequence by itself, its fragments, or larger sequences, usually at least 15 bases, preferably at least 18 bases, can be used as nucleotide probes for the detection of retroviral RNA "" 39 or proviral DNA, or to identify homologous regions for cloning or sequence formation. Numerous techniques are described, such as for example the Grunstein-Hogness technique, the Southern technique, the Northern technique, dot-blot, their improvements, as well as other methodologies, such as those described in US Patent No. 4 358,535 which is given here for reference.

Les peptides objet de l'invention, comprenant des 10 peptides de blocage, et leurs analogues trouvent une utilisation en eux-mêmes ou en combinaison dans des vaccins. De manière similaire, des anticorps anti-idiotypes c'est-à-dire réagissant avec les idiotypes des anticorps de la présente invention et contenant par conséquent des épitopes imitant les 15 régions neutralisantes de HIV, peuvent également être utilisés dans des vaccins. Les peptides ou anticorps anti-idiotypes peuvent être formulés d'une manière convenable, généralement à des concentrations dans l'intervalle de 1 »jjg à 20 mg/kg d'hôte. Des milieux physiologiquement acceptables peuvent 20 être utilisés comme supports, tels que l'eau stérile, une solution saline, une solution saline tamponnée au phosphate ou analogues. Des adjuvants peuvent être utilisés tels que le gel d'hydroxyde d'aluminium, les substances actives en surface telles que la lysolécithine, les polyols pluroniques, 25 les polyanions, les peptides, les protéines (par exemple toxine du choléra ou diphtérie) et les émulsions d'huile.The peptides object of the invention, comprising blocking peptides, and their analogs find use by themselves or in combination in vaccines. Similarly, anti-idiotypic antibodies, i.e. reacting with the idiotypes of the antibodies of the present invention and therefore containing epitopes mimicking the neutralizing regions of HIV, can also be used in vaccines. The anti-idiotype peptides or antibodies can be formulated in a suitable manner, generally at concentrations in the range of 1 µg to 20 mg / kg host. Physiologically acceptable media can be used as carriers, such as sterile water, saline, phosphate buffered saline or the like. Adjuvants can be used such as aluminum hydroxide gel, surface active substances such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, proteins (e.g. cholera toxin or diphtheria) and oil emulsions.

Les peptides peuvent également être incorporés dans des liposomes, ou conjugués à des polysaccharides, des polypeptides ou des polymères pour une utilisation dans une 30 formule de vaccin. L'administration peut se faire par injection, par exemple par voie intramusculaire, péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse etc. L'administration d'une dose immunogéniquement efficace peut être faite en une ou plusieurs fois, habituellement dans un intervalle de une à quatre 35 semaines. Une "dose immunogéniquement efficace" correspond à 40Peptides can also be incorporated into liposomes, or conjugated to polysaccharides, polypeptides or polymers for use in a vaccine formula. Administration can be by injection, for example intramuscularly, peritoneally, subcutaneously, intravenously etc. Administration of an immunogenically effective dose may be done in one or more doses, usually in the range of one to four weeks. An "immunogenically effective dose" corresponds to 40

κ Vκ V

une quantité de vaccin convenable pour obtenir une réponse immunitaire chez un hôte, ce qui démontre chez l'hôte une infection accrue.an amount of vaccine suitable to elicit an immune response in a host, demonstrating an increased infection in the host.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente 5 invention apparaîtront mieux dans les expériences qui suivent, et qui décrivent l'invention à titre d’exemple.Other characteristics and advantages of the present invention will appear better in the experiments which follow, and which describe the invention by way of example.

Ces exemples ne doivent pas être considérés comme limitant la présente invention.These examples should not be considered as limiting the present invention.

EXEMPLE IEXAMPLE I

10 Production et caractérisation des anticrops monoclonaux L'exemple I décrit la production de lignées cellulaires hybrides qui produisent des anticorps monoclonaux spécifiques pour les glycoprotéines d'enveloppe de HIV. Cette 15 méthode implique l'utilisation d'extraits purifiés de lectine de bAVgpy fixés à l'agarose de lectine de lentille comme l'immunogène. Les anticorps monoclonaux produits par la suite par les lignées cellulaires hybrides sont caractérisés par leur pouvoir à précipiter radioimmunitairement et 20 en "immunoblot" gpllO à partir de LAV purifié et comme protéine de fusion recombinante biologiquement exprimée. Les anticorps monoclonaux qui se lient aux épitopes sur gpllO sont également réactifs dans le test ELISA avec le virus entier rompu, des protéines de fusion et des peptides synthé-25 tiques, et réagissent avec le virus entier dans des tests de fluorescence indirecte.Production and Characterization of Monoclonal Anticrops Example I describes the production of hybrid cell lines which produce monoclonal antibodies specific for the HIV envelope glycoproteins. This method involves the use of purified extracts of bAVgpy lectin attached to the lens lectin agarose as the immunogen. The monoclonal antibodies subsequently produced by the hybrid cell lines are characterized by their ability to precipitate radio-immune and in "immunoblot" gpl10 from purified LAV and as a biologically expressed recombinant fusion protein. Monoclonal antibodies which bind to epitopes on gpl10 are also reactive in the ELISA test with the whole ruptured virus, fusion proteins and synthetic peptides, and react with the whole virus in indirect fluorescence tests.

Les protocoles pour la production de lignées de cellules hybrides produisant un anticorps monoclonal et la caractérisation des anticorps sont les suivants.The protocols for the production of hybrid cell lines producing a monoclonal antibody and the characterization of the antibodies are as follows.

30 Du virus LAV purifié à partir de cellules CEM infec tées (A.T.T.C. N° CRL8904) , fut rompu ou brisé dans du Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, aprotinine 1%, Nonidet P-40^ (NP-40) (octylphénoxypolyéthoxyéthanol) 2%. L'extrait fut 35 clarifié deux fois par centrifugation et ajusté à 0,5% NP-40 avec l'addition de trois volumes de tampon de dislocation * Λ 41 100 NP-40. De la Sepharose de lectine de lentille (Pharmacia, Piscataway, N.J.) fut prélavée dans le tampon de dislocation 100 NP-40 et ensuite équilibrée dans le tampon d'adsorption (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, aprotinine 1%, NP-40 0,5%).LAV virus purified from infected CEM cells (ATTC No. CRL8904), was broken or broken in 50 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 1% aprotinin, Nonidet P-40 ^ ( NP-40) (octylphenoxypolyethoxyethanol) 2%. The extract was clarified twice by centrifugation and adjusted to 0.5% NP-40 with the addition of three volumes of dislocation buffer * Λ 41 100 NP-40. Lentin lectin Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) was prewashed in 100 NP-40 dislocation buffer and then equilibrated in adsorption buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl, aprotinin 1%, NP-40 0.5%).

5 L'extrait viral clarifié fut adsorbé avec de la Sepharose lectine de lentille pendant 42 heures à 4°C. Le matériau non adsorbé fut éliminé par lavage avec du tampon d'adsorption en excès. L'élution du matériau adsorbé fut réalisée avec de l'alpha méthyl mannoside 0,2 M dans du tampon d'adsorption. 10 L'éluant fut dialysé contre PBS pour éliminer le sucre et le matériau fut réadsorbé sur la Sepharose de lectine de lentille,The clarified viral extract was adsorbed with lens lectin Sepharose for 42 hours at 4 ° C. The non-adsorbed material was removed by washing with excess adsorption buffer. The elution of the adsorbed material was carried out with 0.2 M alpha methyl mannoside in adsorption buffer. The eluent was dialyzed against PBS to remove the sugar and the material was reabsorbed on the lens lectin Sepharose,

Le complexe de Sepharose de lectine de lentille-glycoprotéine fut utilisé pour immuniser des souris BALB/c 15 par trois injections intrapéritonéales sans adjuvant et données séparément sur une période de 2-3 semaines. Des rates furent éliminées des souris immunisées, qui démontraient la présence d'un anticorps circulant sur les glycoprotéines de HIV par immunoblot, RIP et/ ou ELISA.The lens lectin-glycoprotein Sepharose complex was used to immunize BALB / c mice by three intraperitoneal injections without adjuvant and given separately over a period of 2-3 weeks. Spleens were eliminated from the immunized mice, which demonstrated the presence of an antibody circulating on the HIV glycoproteins by immunoblot, RIP and / or ELISA.

20 Les protocoles utilisés pour la production de lignées cellulaires étaient généralement ceux de Köhler et Milstein (Nature 256:495 (1985)) avec les modifications de Goldstein L.C. et autres (Infect. Immun. 38:273 (1982)). Les lymphocy tes B spléniques des souris immunisées furent fusionnés avec 25 des cellules de myélome NS-1 utilisant 40% (poids/volume) de polyéthylène glycol. Après la fusion, le mélange de cellules fut remis en suspension dans un milieu HAT (milieu RPMI - 1640 supplémenté avec 15% de sérum de veau foetal, de -4 -7 l'hypoxanthine 1 x 10 M, de l'aminoptérine 4 x 10 M et de _5 30 la thymidine 1,6 x 10 M) pour choisir la croissance des cellules hybrides , et ensuite le mélange fut délivré dans des plateaux de microculture à 96 puits à une concentration g de 1 à 3 x 10 cellules/ml et incubé à 37°C dans une atmosphère humide contenant 6% de COg. Les cultures furent alimen-35 tées par remplacement d'une moitié du surnageant avec du * k 42 milieu HAT frais. Les puits furent observés en utilisant un microscope inversé pour les indications de prolifération de cellules et lorsque les cellules étaient d'une densité suffisante les surnageants furent testés pour l'anticorps 5 anti-LAV.The protocols used for the production of cell lines were generally those of Köhler and Milstein (Nature 256: 495 (1985)) with modifications from Goldstein L.C. and others (Infect. Immun. 38: 273 (1982)). The spleen lymphocytes of the immunized mice were fused with NS-1 myeloma cells using 40% (w / v) polyethylene glycol. After fusion, the cell mixture was resuspended in HAT medium (RPMI medium - 1640 supplemented with 15% fetal calf serum, -4 -7 hypoxanthine 1 x 10 M, aminopterin 4 x 10 M and thymidine 1.6 x 10 M) to choose the growth of the hybrid cells, and then the mixture was delivered in 96-well microculture trays at a g concentration of 1 to 3 x 10 cells / ml and incubated at 37 ° C in a humid atmosphere containing 6% COg. The cultures were fed by replacing one half of the supernatant with fresh HAT medium. The wells were observed using an inverted microscope for indications of cell proliferation and when the cells were of sufficient density the supernatants were tested for the anti-LAV antibody.

Les puits contenant des cellules hybrides produisant un anticorps vis-à-vis de LAV furent identifiés par test ELISA en mesurant la liaison à soit le virus rompu entier purifié soit les protéines de fusion biologiquement exprimées. 10 Des tests ELISA utilisant du virus rompu furent réalisés sur des plaques LAV EIA (Genetic Systems, Seattle, Washington).Wells containing hybrid cells producing an antibody to LAV were identified by ELISA test by measuring the binding to either the purified whole disrupted virus or the biologically expressed fusion proteins. ELISA tests using disrupted virus were performed on LAV EIA plates (Genetic Systems, Seattle, Washington).

Les plaques furent incubées avec des fluides de culture de cellule à 37°C pendant 45 minutes et ensuite lavées trois fois avec 0,5% de Tween 20 dans une solution saline tamponnée 15 au phosphate (PBS-Tween).The plates were incubated with cell culture fluids at 37 ° C for 45 minutes and then washed three times with 0.5% Tween 20 in phosphate buffered saline (PBS-Tween).

De l'IgG anti-souris chèvre-peroxydase (dilution 1:2.000 dans PBS-Tween; Zymed Laboratories, Inc., San Francisco Sud, Californie) fut ajouté (100 μΐ par puits), et les plaques furent incubées pendant 45 minutes à 37°C et 20 lavées comme ci-dessus. Un substrat (acide citrique 0,025 M, phosphate de sodium dibasique 0,05 M, pH 5 contenant 14 mg de o-phénylènediamine et 10 μΐ de peroxyde d'hydrogène 30% par 50 ml) fut ajouté et les plaques furent incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans le noir. La réaction 25 fut arrêtée avec de l'acide sulfurique 3N, et des réactions colorimétriques furent quantifiées avec un lecteur automatique de microplaques. Les puits qui donnaient des résultats positifs furent sous-clonés par dilution limitée, retestés pour la spécificité, puis étendus.Goat anti-mouse peroxidase IgG (dilution 1: 2,000 in PBS-Tween; Zymed Laboratories, Inc., San Francisco South, California) was added (100 μΐ per well), and the plates were incubated for 45 minutes at 37 ° C and 20 washed as above. A substrate (0.025 M citric acid, 0.05 M dibasic sodium phosphate, pH 5 containing 14 mg of o-phenylenediamine and 10 μΐ of 30% hydrogen peroxide per 50 ml) was added and the plates were incubated for 30 minutes. at room temperature in the dark. The reaction was stopped with 3N sulfuric acid, and colorimetric reactions were quantified with an automatic microplate reader. Wells that gave positive results were subcloned by limited dilution, retested for specificity, and then expanded.

30 Les anticorps monoclonaux sécrétés par les lignées de cellules hybrides résultantes furent ensuite caractérisés en ce qui concerne la spécificité et la réactivité par immunoblot, immunoprécipitation et test ELISA en utilisant du virus LAV rompu, des protéines de fusion LAV recombinantes et des 35 peptides LAV de synthèse. Tous les anticorps furent déterminés 43 comme étant de l'isotype IgG^ . Des lignées cellulaires HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2 et HIV-gpllO-3 ont été déposées auprès de (l'American Type Culture Collection) avant le dépôt de cette demande et sont référencées sous les N°s ATCC 5 HB 9175 , HB 9176 et HB 9177 respectivement.The monoclonal antibodies secreted by the resulting hybrid cell lines were then characterized with regard to specificity and reactivity by immunoblot, immunoprecipitation and ELISA test using disrupted LAV virus, recombinant LAV fusion proteins and LAV peptides. synthesis. All antibodies were determined 43 to be of the IgG ^ isotype. HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2 and HIV-gpllO-3 cell lines were deposited with the (American Type Culture Collection) before filing this request and are referenced under the numbers ATCC 5 HB 9175, HB 9176 and HB 9177 respectively.

Les protéines de fusion recombinantes testées pour la réactivité ont précédemment été appelées ENV2, ENV3, ENV4 et ENV5. La protéine ENV2 est exprimée à partir de pENV2 (ATCC N° 53071), qui est une région de LAV de la paire de bases 10 bp 6598 à bp 7178 (numérotation selon Wain-Hobson et autres Cell 44:9 (1985)), ENV3 est exprimée à partir de pENV3 (ATCC N° 53072) qui comprend la région LAV de bp 7178 à bp 7698; ENV4 est exprimée à partir de pENV4 (ATCC N° 53073)» et comprend bp 7698 à bp 8572; et ENV5 est exprimée à 15 partir de pENV5 (ATCC N° 53074) qui comprend la région LAV bp 5889 à bp 7698.The recombinant fusion proteins tested for reactivity were previously called ENV2, ENV3, ENV4 and ENV5. The ENV2 protein is expressed from pENV2 (ATCC No. 53071), which is an LAV region of the base pair 10 bp 6598 to bp 7178 (numbering according to Wain-Hobson and others Cell 44: 9 (1985)), ENV3 is expressed from pENV3 (ATCC No. 53072) which includes the LAV region from bp 7178 to bp 7698; ENV4 is expressed from pENV4 (ATCC No. 53073) "and includes bp 7698 to bp 8572; and ENV5 is expressed from pENV5 (ATCC # 53074) which includes the LAV region bp 5889 to bp 7698.

Assemblage de peptides de synthèseAssembly of synthetic peptides

Les peptides I (29) et VIII (110-2-2) furent assemblés sur une résine de benzhydrylamine (polystyrène/divinylbenzène) 20 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Le peptide V (177) fut assemblé sur une résine p-butyloxy-carbonyl(Boc)-éthylbenzylcystéïne-phénylacétamidométhyl (PAM) polystyrène/divinylbenzène. Des couplages d'anhydride symétriques furent réalisés dans un synthétiseur 430A 25 (Applied Biosystems). De la cystéine fut ajoutée comme un premier résidu dans les deux peptides.Peptides I (29) and VIII (110-2-2) were assembled on a benzhydrylamine resin (polystyrene / divinylbenzene) 20 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Peptide V (177) was assembled on a p-butyloxy-carbonyl (Boc) -ethylbenzylcysteine-phenylacetamidomethyl (PAM) polystyrene / divinylbenzene resin. Symmetrical anhydride couplings were carried out in a 430A 25 synthesizer (Applied Biosystems). Cysteine was added as a first residue in the two peptides.

Des couplages de dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxylbenzotriazole furent utilisés pour l'asparagine et la glutamine. Une protection de chaîne latérale ou ramifiée 30 à base de benzyle et une protection d'alpha-amine Boc furent utilisées. D'autres protections de chaîne latérale utilisées de manière habituelle étaient constituées par tryptophane (formyl) Boc, sulfoxyde de méthionine Boc, arginine (tosyl) Boc, cystéine (méthylbenzyl) Boc» histidine (tosyl) Boc, 35 lysine (chlorobenzyloxycarbonyl) Boc et tyrosine (bromobenzyl- " t 3 44 oxycarbonyl) Boc.Dicyclohexylcarbodiimide couplings in the presence of hydroxylbenzotriazole were used for asparagine and glutamine. Benzyl-based side or branched chain protection and alpha-amine Boc protection were used. Other commonly used side chain protections were tryptophan (formyl) Boc, methionine sulfoxide Boc, arginine (tosyl) Boc, cysteine (methylbenzyl) Boc »histidine (tosyl) Boc, lysine (chlorobenzyloxycarbonyl) Boc and tyrosine (bromobenzyl- "t 3 44 oxycarbonyl) Boc.

Lorsque les peptides furent radiomarqués, ce le fut par acétylation du terminal amino avec de l'acide acétique- H et un excès de dicyclohexylecarbodiimide.When the peptides were radiolabeled, it was by acetylation of the amino terminal with acetic acid-H and an excess of dicyclohexylecarbodiimide.

5 La déprotection et le clivage du peptide à partir de la résine furent effectués par le protocole HF "bas-élevé" Tarn (Tarn et autres, supra). L'extraction de la résine fut faite avec de l'acide acétique 5% et l'extrait fut soumis à une chromatographie de filtration par gel dans de l'acide 10 acétique 5%.The deprotection and cleavage of the peptide from the resin were carried out by the Tarn "low-high" HF protocol (Tarn et al., Supra). The resin extraction was done with 5% acetic acid and the extract was subjected to gel filtration chromatography in 5% acetic acid.

Les peptides de synthèse HIV testés pour la réactivité avec les anticorps monoclonaux comprenaient les peptides 29, 36 et 39. Le peptide 29 est codé par la région de génome LAVgru 3 partir de 6688 bp jusqu'à 6750 bp; le peptide 36 15 est codé par la région depuis environ 7246 bp jusqu'à 7317 bp; et le peptide 39 est codé par la région depuis environ 7516 bp jusqu'à 7593 bp. Les peptides 36 et 39 sont décrits en détail dans le brevet américain N° 4 629 783 qui est donné ici à titre de référence.HIV synthetic peptides tested for reactivity with monoclonal antibodies included peptides 29, 36 and 39. Peptide 29 is encoded by the LAVgru 3 genome region from 6688 bp to 6750 bp; peptide 36 is regionally encoded from about 7,246 bp to 7,317 bp; and peptide 39 is regionally encoded from about 7,516 bp to 7,593 bp. Peptides 36 and 39 are described in detail in US Patent No. 4,629,783 which is given here for reference.

20 Les peptides de blocage, IX-XV furent assemblés essentiellement comme décrit ci-dessus sur une résine de méthyl-benzhydrylamine (polystyrène/divinylbenzène) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Les couplages d'anhydride symétriques furent réalisés sur un appareil de 25 synthèse 430A (Applied Biosystems). Les couplages de dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxylbenzotriazole furent utilisés pour l'asparagine. Pour la protection, une protection par Boc alpha-amine et par chaîne latérale à base de benzyle fut utilisée, tandis que Boc (bromobenzyloxy-30 carbonyl ) fut utilisé spécifiquement pour les chaînes ramifiées de tyrosine. L'acétylation, si elle est présente, fut réalisée en utilisant de l'anhydride acétique ou de l'acide acétique glacé et du dicyclohexylcarbodiimide. La déprotection et le clivage du peptide de la résine furent accomplis par le 35 protocole HF "haut" standard (Stewart et autres, voir supra).The blocking peptides, IX-XV were assembled essentially as described above on a methyl-benzhydrylamine (polystyrene / divinylbenzene) resin (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Symmetrical anhydride couplings were performed on a 430A synthesis apparatus (Applied Biosystems). Dicyclohexylcarbodiimide couplings in the presence of hydroxylbenzotriazole were used for asparagine. For protection, protection by Boc alpha-amine and by benzyl-based side chain was used, while Boc (bromobenzyloxy-30 carbonyl) was used specifically for branched tyrosine chains. Acetylation, if present, was performed using acetic anhydride or ice-cold acetic acid and dicyclohexylcarbodiimide. Deprotection and cleavage of the peptide from the resin was accomplished by the standard "high" HF protocol (Stewart et al., See above).

» « 45 L'extraction de la résine fut réalisée avec 50% d'acide acétique, et l'extrait fut ensuite soumis à une chromatographie de filtration sur gel dans 20% d'acide acétique. Comme désiré, une chromatographie liquide à haute performance fut 5 réalisée sur une colonne Vydac C18 (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) en utilisant un acide trifluoacétique 0,1%, gradient d'acétonitrile."" 45 The resin extraction was carried out with 50% acetic acid, and the extract was then subjected to gel filtration chromatography in 20% acetic acid. As desired, high performance liquid chromatography was performed on a Vydac C18 column (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) using 0.1% trifluoacetic acid, acetonitrile gradient.

ImmunoblotImmunoblot

La caractérisation par immunoblot fut réalisée sur 10 des surnageants de clone ou un fluide ascite en utilisant du virus LAV purifié et des protéines de fusion recombinantes comme antigènes. Les antigènes furent d'abord séparés par électrophorèse sur gel à gradient polyacrylamide (7-15%) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (NCM) par 15 électrophorèse pendant 4 heures à 25 V dans du phosphate de sodium 25 mM (pH 7). Après transfert, le NCM fut bloqué pour empêcher les interactions non spécifiques par incubation dans PBS-Tween ou Blotto (5% lait sec non gras dans PBS) pendant une heure à la température ambiante. Le NCM fut incubé 20 avec du surnageant de culture de cellules ou un fluide ascite dilué dans PBS-Tween pendant une heure à la température ambiante et fut rincé avec trois changements de PBS-Tween.The immunoblot characterization was performed on clone supernatants or ascites fluid using purified LAV virus and recombinant fusion proteins as antigens. The antigens were first separated by polyacrylamide gradient gel electrophoresis (7-15%) and transferred to a nitrocellulose membrane (NCM) by electrophoresis for 4 hours at 25 V in 25 mM sodium phosphate (pH 7). . After transfer, the NCM was blocked to prevent non-specific interactions by incubation in PBS-Tween or Blotto (5% non-fat dry milk in PBS) for one hour at room temperature. The NCM was incubated with cell culture supernatant or ascites fluid diluted in PBS-Tween for one hour at room temperature and was rinsed with three changes of PBS-Tween.

Dans la seconde phase, le NCM fut incubé avec une peroxydase de radis noir IgG anti-souris chèvre, diluée dans PBS-Tween 25 pendant une heure à la température ambiante. Cette incubation fut suivie par un lavage avec PBS-Tween et ensuite une immersion dans une solution de développement en couleur de peroxydase de radis noir (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie) pendant 20 minutes. La réaction fut arrêtée par 30 immersion dans de l'eau déionisée. La réactivité de l'anticorps monoclonal fut comparée à un sérum témoin positif réagissant avec le virus rompu purifié ou une protéine de fusion exprimée. Les résultats montraient que tous les anticorps se liaient à gpllO et sa molécule précurseur, gpl50, en utilisant des 35 préparations de virus rompus ou séparés. Les anticorps 110-1 46 et 110-2 reconnaissaient également la protéine de fusion ENV3, tandis que les anticorps 110-3, 110-4, 110-5 et 110-6 formaient un immunocomplexe ENV2.In the second phase, the NCM was incubated with a goat anti-goat anti-mouse IgG black radish peroxidase, diluted in PBS-Tween 25 for one hour at room temperature. This incubation was followed by washing with PBS-Tween and then immersion in a color developing solution of black radish peroxidase (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) for 20 minutes. The reaction was stopped by immersion in deionized water. The reactivity of the monoclonal antibody was compared to a positive control serum reacting with the purified disrupted virus or an expressed fusion protein. The results showed that all antibodies bind to gpl10 and its precursor molecule, gpl50, using ruptured or separated virus preparations. Antibodies 110-1 46 and 110-2 also recognized the fusion protein ENV3, while antibodies 110-3, 110-4, 110-5 and 110-6 formed an ENV2 immunocomplex.

Immunoprécipitation 5 Des extraits de virus pour précipitation radioimmune furent préparés à partir de cellules CEM infectées avec l'isolat LAVgpy de HIV apte à une croissance lytique par passage continu. Lorsque les effets cytopathes précoces étaient évidents, les cellules furent transférées dans un 10 milieu marquant contenant de la méthionine ^ ^ _l (0,05 mCi/ml) ou de la glucosamine ^ Γη ] (0,025 mCi/ml) , puis incubées pendant 24 heures jusqu'à ce que la plupart des cellules aient été lysées, ce qui relâche le virus dans le surnageant de la culture. Le virus fut transformé en pilules 15 ou comprimés (une heure à 100.000 xg) à partir du surnageant dépourvu de cellules, et des extraits de détergent furent préparés dans un tampon P-RIPA (solution saline tamponnée au phosphate contenant 1% de Triton X-100, 1% de déoxycholate, 0,1% de SDS et 1% d'aprotinine). Des extraits similaires 20 furent préparés à partir des surnageants de cellules CEM non infectées.Immunoprecipitation Virus extracts for radioimmune precipitation were prepared from CEM cells infected with the HIV LAVgpy isolate capable of lytic growth by continuous passage. When the early cytopathic effects were evident, the cells were transferred to a labeling medium containing methionine ^ ^ _l (0.05 mCi / ml) or glucosamine ^ Γη] (0.025 mCi / ml), then incubated for 24 hours until most of the cells have been lysed, which releases the virus into the culture supernatant. The virus was transformed into pills or tablets (one hour at 100,000 xg) from the cell-free supernatant, and detergent extracts were prepared in P-RIPA buffer (phosphate buffered saline containing 1% Triton X- 100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS and 1% aprotinin). Similar extracts were prepared from the supernatants of uninfected CEM cells.

Les tests d'immunoprécipitation furent réalisés avec 100 pl d'extrait de virus incubé avec 100 μ1 de surnageant de culture à partir de lignées cellulaires hybrides pendant 25 une heure sur de la glace. Quatre microlitres d'Ig anti-souris lapin (Zymed Laboratories, So. San Francisco, Californie) furent ajoutés à chaque échantillon et incubés pendant 30 minutes. De 1 ' immunoprécipitine (100 jjI; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland) remise en suspension dans un 30 tampon P-RIPA contenant 1% d'ovalbumine fut ajoutée à chaque échantillon et incubée pendant 30 minutes supplémentaires.The immunoprecipitation tests were carried out with 100 μl of virus extract incubated with 100 μl of culture supernatant from hybrid cell lines for 25 hours on ice. Four microliters of rabbit anti-mouse Ig (Zymed Laboratories, So. San Francisco, California) was added to each sample and incubated for 30 minutes. Immunoprecipitin (100 µl; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland) resuspended in P-RIPA buffer containing 1% ovalbumin was added to each sample and incubated for an additional 30 minutes.

Les complexes liés furent lavés et séparés par électrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS (15% acrylamide; gel DATD). A la suite de l'électrophorèse, les gels furent fixés, trempés 35 dans le produit "Enhance" (New England Nuclear, Boston, MA), * « 47 séchés et exposés à un film Kodak XR-5. Un sérum positif de référence qui immunoprécipitait toutes les protéines virales HIV fut mis en réaction avec des surnageants de cellules CEM faussement infectées et infectées par virus 5 comme témoins négatifs et positifs.The bound complexes were washed and separated by electrophoresis on polyacrylamide-SDS gel (15% acrylamide; DATD gel). Following electrophoresis, the gels were fixed, soaked in the "Enhance" product (New England Nuclear, Boston, MA), dried and exposed to Kodak XR-5 film. A positive reference serum which immunoprecipitates all HIV viral proteins was reacted with supernatants of falsely infected and virus infected CEM cells as negative and positive controls.

Les résultats ont montré que tous les six anticorps monoclonaux immunoprécipitaient spécifiquement gpllO et gpl50.The results showed that all six monoclonal antibodies specifically immunoprecipitate gpl10 and gpl50.

Test d'immunoadsorbant lié par enzyme 10 Pour établir que les épitopes gpllO étaient reconnus par les anticorps monoclonaux de la présente invention, des surnageants de culture à partir de lignées cellulaires hybrides ou fluides ascites furent en outre caractérisés par réactivité dans le test ELISA avec des protéines de 15 fusion biologiquement exprimées et des peptides de synthèse.Enzyme-linked immunoadsorbent test To establish that the gpl10 epitopes were recognized by the monoclonal antibodies of the present invention, culture supernatants from hybrid cell lines or ascites fluids were further characterized by reactivity in the ELISA test with biologically expressed fusion proteins and synthetic peptides.

Les processus étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus à l'exception que les protéines de fusion ou les peptides de synthèse remplaçaient le virus purifié comme l'antigène ’ adsorbé sur la surface des puits de microtitrage.The procedures were the same as those described above except that the fusion proteins or the synthetic peptides replaced the purified virus as the antigen adsorbed on the surface of the microtiter wells.

20 Lorsque des peptides furent utilisés comme antigène, le protocole de mise sur plaque était le suivant. Le peptide lyophilisé fut dissous dans de la guanidine 6M HCl. Juste avant la mise sur plaque dans des plaques de 96 puits, la solution de guanidine fut diluée dans un tampon de bicarbonate/ 25 carbonate 0,05 M (pH 9,6) jusqu'à une concentration finale de peptide allant jusqu'à 100 jug/ml. Un volume de 50 ul du peptide dilué fut placé dans chaque puits de microtitrage et les plaques furent ensuite incubées toute la nuit à 4°C.When peptides were used as the antigen, the plate protocol was as follows. The lyophilized peptide was dissolved in 6M guanidine HCl. Just before plate-mounting in 96-well plates, the guanidine solution was diluted in 0.05 M bicarbonate / carbonate buffer (pH 9.6) to a final peptide concentration of up to 100 jug / ml. A volume of 50 µl of the diluted peptide was placed in each microtiter well and the plates were then incubated overnight at 4 ° C.

La solution de peptide en excès fut "secouée", les plaques 30 fermées ou bloquées Blotto , et le processus décrit ci-dessus fut suivi pour le reste du test ELISA. De manière similaire, une protéine recombinante fut diluée jusqu'à une concentration finale d'environ 2 pg/ml dans un tampon bicarbonate/carbonate 0,05 M (pH 9,6) avant que le même processus soit suivi.The excess peptide solution was "shaken", the plates closed or blocked Blotto, and the process described above was followed for the remainder of the ELISA test. Similarly, a recombinant protein was diluted to a final concentration of about 2 µg / ml in 0.05 M bicarbonate / carbonate buffer (pH 9.6) before the same process was followed.

35 Les résultats sont donnés dans le Tableau II. Les 48 anticorps monoclonaux produits par les lignées de cellules HIV-gpllO-1 et HIV-gpllQ-2 réagissaient avec ENV3, ENV5, le peptide 36 et le virus disloqué. Les anticorps provenant des lignées de cellules HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5 5 et HIV-gpllO-6 réagissaient avec ENV2 et le peptide 29 aussi bien que le virus disloqué ou rompu.The results are given in Table II. The 48 monoclonal antibodies produced by the HIV-gpllO-1 and HIV-gpllQ-2 cell lines reacted with ENV3, ENV5, peptide 36 and the disrupted virus. Antibodies from HIV-gpl10-3, HIV-gpl10-4, HIV-gpl10-5 and HIV-gpl10-6 cell lines reacted with ENV2 and peptide 29 as well as disrupted or disrupted virus.

TABLEAU IITABLE II

Test ELISA montrant la réactivité des anticorps monoclonaux avec des protéines recombinantes et 10 des peptides de synthèseELISA test showing the reactivity of monoclonal antibodies with recombinant proteins and synthetic peptides

Protéine de fusion recombinante Peptide de synthèse LAV CEMRecombinant fusion protein Synthetic peptide LAV CEM

té- té- ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 29 36 39 moin moin 110-1 0,077 3,000 0,113 3,000 ND 2,421 0,054 0,908 0,125 110-2 -0,003 3,000 0,000 3,000 ND 2,305 -0,005 1,214 0,009 15 110-3 3,000 0,011 ND ND 3,000 ND 0,017 0,363 0,046 110-4 3,000 0,020 ND ND 3,000 ND 0,016 0,383 0,067 110-5 3,000 0,014 ND ND 3,000 ND 0,016 0,368 0,025 110-6 3,000 0,033 ND ND 1,937 ND 0,017 0,486 0,032tete- ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 29 36 39 less than 110-1 0.077 3,000 0.113 3,000 ND 2,421 0.054 0.908 0.125 110-2 -0.003 3,000 0,000 3,000 ND 2.305 -0.005 1,214 0.009 15 110-3 3,000 0.011 ND ND 3,000 ND 0.017 0.363 0.046 110-4 3.000 0.020 ND ND 3.000 ND 0.016 0.383 0.067 110-5 3.000 0.014 ND ND 3.000 ND 0.016 0.368 0.025 110-6 3.000 0.033 ND ND 1.937 ND 0.017 0.486 0.032

Les résultats dans le Tableau II montrent que les p n anticorps monoclonaux 110-1 et 110-2 reconnaissaient un déterminant antigénique codé par une séquence ADN dans la région pENV3 , plus particulièrement par la région du génome de HIV définie par une séquence d'acides aminés dans le peptide 36. Autrement dit, les anticorps monoclonaux gpllO-l et 110-2 se 25 lient à une région de peptide de gpllO codée dans 7246 bp à 7317, comme cela est mis en évidence par la formation de complexes immuns avec le peptide 36 et ENV3. Cette région du génome de HIV a précédemment été identifiée comme conservée, c'est-à-dire peu de changement dans la séquence d' ADN dans la 30 région codée par le peptide 36 parmi différents isolats viraux à partir de divers lieux géographiques. Voir Starcich et autres , Cell 46:637 (1986). Par contraste, les anticorps monoclonaux gpllO-3, -4, -5 et -6 se lient à des peptides de * * 49 HIV définis par la région codée par le peptide 39 de 6688 pb à environ 6750 bp. La région dans gpllO définie par le peptide 29 a été identifiée comme contenant plusieurs substitutions de nucléotide parmi différents isolats de virus. Les 5 anticorps monoclonaux qui se lient sélectivement aux polypeptides gpllO qui contiennent des épitopes conservés, tels que les anticorps 110-1 et 110-2 peuvent posséder une utilité renforcée dans différentes circonstances, telles que dans la chromatographie d'affinité etc. Egalement , dans un test 10 ELISA, le peptide 110-2-2 réagissait avec des sérums de l'individu à partir duquel LAV-2 fut isolé.The results in Table II show that the pn monoclonal antibodies 110-1 and 110-2 recognized an antigenic determinant encoded by a DNA sequence in the pENV3 region, more particularly by the region of the HIV genome defined by an amino acid sequence. in peptide 36. In other words, the monoclonal antibodies gpl10-1 and 110-2 bind to a gpl10 peptide region encoded in 7246 bp at 7317, as evidenced by the formation of immune complexes with the peptide 36 and ENV3. This region of the HIV genome has previously been identified as conserved, i.e., little change in the DNA sequence in the region encoded by peptide 36 among different viral isolates from various geographic locations. See Starcich et al., Cell 46: 637 (1986). In contrast, the monoclonal antibodies gpl10-3, -4, -5 and -6 bind to * * 49 HIV peptides defined by the region encoded by peptide 39 from 6688 bp to approximately 6750 bp. The region in gpl10 defined by peptide 29 has been identified as containing several nucleotide substitutions among different virus isolates. Monoclonal antibodies which selectively bind to gpl10 polypeptides which contain conserved epitopes, such as antibodies 110-1 and 110-2 may have enhanced utility in various circumstances, such as in affinity chromatography etc. Also, in an ELISA test, peptide 110-2-2 reacted with sera from the individual from whom LAV-2 was isolated.

Test immunofluorescent indirectIndirect immunofluorescent test

Des tests immunofluorescents indirects utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène gpllO de HIV 15 furent réalisés sur des cellules vivantes et fixées par l'acétone. Des cadres ou châssis fixés par acétone, préparés à partir de cellules OEM infectées par LAV furent incubés avec un surnageant de culture dilué ou un fluide ascite pendant une heure à 37°C, tandis que des cellules vivantes 20 furent incubées avec un surnageant de culture ou un fluide ascite pendant une heure à 4°C avant que les cellules soient placées sur des cadres ou analogues et fixées par l'acétone. Les deux méthodes utilisaient de l'IgG anti-souris marquée à 1'isothiocyanate de fluorescéine pour détecter les cellules 25 portant l'antigène gpllO réactif. L'anticorps monoclonal HIV-gpllO-1 a donné des résultats positifs en utilisant soit des cellules vivantes soit des cellules infectées par LAV fixées par l'acétone.Indirect immunofluorescent tests using monoclonal antibodies directed against the HIV 15 gpl10 antigen were carried out on living cells and fixed with acetone. Acetone-fixed frames or frames prepared from OEM cells infected with LAV were incubated with diluted culture supernatant or ascites fluid for 1 hour at 37 ° C, while live cells were incubated with culture supernatant or an ascites fluid for one hour at 4 ° C before the cells are placed on frames or the like and fixed by acetone. Both methods used fluorescein isothiocyanate-labeled anti-mouse IgG to detect cells carrying the reactive gpl10 antigen. The monoclonal antibody HIV-gpl10-1 gave positive results using either living cells or cells infected with LAV fixed by acetone.

EXEMPLE IIEXAMPLE II

30 Neutralisation du pouvoir infectieux de HIV par des anticorps monoclonaux anti-gpllO Cet exemple décrit et caractérise la neutralisation du pouvoir infectieux de HIV en utilisant des anticorps mono-clonaux qui se lient à gpllO et des peptides dans gpllO. Les 35 résultats indiquent que les anticorps monoclonaux GpllO-3, • b 50 -4, -5 et -6 possèdent une activité neutralisante, et que gpll0-3 et -4 possèdent des niveaux particulièrement élevés d'activité neutralisante.Neutralization of HIV infectivity by monoclonal anti-gpl10 antibodies This example describes and characterizes the neutralization of HIV infectivity by using monoclonal antibodies which bind to gpl10 and peptides in gpl10. The results indicate that the monoclonal antibodies Gpl10-3, b 50 -4, -5 and -6 have neutralizing activity, and that gpl10-3 and -4 have particularly high levels of neutralizing activity.

Test de neutralisation 5 Un test de neutralisation sensible fut développé pour quantifier l'effet des anticorps monoclonaux sur le pouvoir infectieux de HIV. Une lignée cellulaire CD4+ hautement susceptible ou sensible à l'infection HIV, CEM fut choisie comme cible pour des comparaisons du pouvoir infectieux. Un 10 fluide ascite préparé comme décrit dans l'Exemple I, ou sa fraction IgG purifiée en utilisant une précipitation de sulfate d'ammonium, fut désactivé à la chaleur à 56°C pendant 30 minutes, puis dilué comme requis dans un milieu RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal . Une suspension de 15 LAVgpu souche HIV fut moissonnée depuis des cultures d'environ 4 jours de CEM dans une phase de croissance logarithmique, filtrée au travers de filtres de 0,2 ou 0,45 micron, mise sous forme d'aliquotes et congelées à -70°C. Un aliquote fut décongelé, titré pour déterminer le TCID^g, et des tests 20 subséquents ont été réalisés avec des aliquotes fraîchement décongelés, dilué à 1:500 dans un milieu de culture jusqu'à une concentration d'approximativement dix fois la quantité requise pour infecter 50% de cellules CEM dans la culture (10 TCIDj-g). La suspension de virus fut mélangée avec un 25 volume égal (250 pl) d'une préparation d'anticorps monoclonal selon cinq dilutions depuis 1:5 à 1:9,765,625. Le mélange virus/anticorps fut incubé pendant 45 minutes à 37°C et ensuite dupliqué de 1:5 à 1:9,765,625. Le mélange virus/ anticorps fut incubé pendant 45 minutes à 37°C et ensuite des 30 échantillons dupliqués de 200 jul furent utilisés pour inoculer des puits contenant 1 ml d ' approximativement 2 x 10^ cellules CEM par puits. Les cultures furent incubées à 37°C dans une atmosphère de 5% de COg humidifiée pendant 14 jours. Les cellules furent récoltées, mises en comprimés, et lysées avec 35 1% de Triton X-100 dans PBS pendant environ 10 minutes. La f > 51 quantité de virus (ou d'antigène viral) présente dans les cellules lysées fut quantifiée en utilisant un immunotest enzyme "sandwich" à capture d'antigène HIV sensible. Le titrage de l'activité neutralisante, s'il y en a, fut déter-5 miné comme la réciproque de la dilution d'anticorps monoclonal qui inhibait la production d'antigène sur plus de 50% de cultures témoin de virus incubées sans anticorps, ou avec un anticorps monoclonal du même isotype qui avait précédemment été montré comme manquant d'activité neutralisante.Neutralization test 5 A sensitive neutralization test was developed to quantify the effect of monoclonal antibodies on the infectivity of HIV. A CD4 + cell line highly susceptible or sensitive to HIV infection, CEM was chosen as target for comparisons of infectious power. An ascites fluid prepared as described in Example I, or its IgG fraction purified using ammonium sulfate precipitation, was heat quenched at 56 ° C for 30 minutes, then diluted as required in RPMI medium containing 10% fetal calf serum. A suspension of 15 LAVgpu strain HIV was harvested from cultures of approximately 4 days of CEM in a logarithmic growth phase, filtered through filters of 0.2 or 0.45 micron, put into aliquots and frozen at -70 ° C. An aliquot was thawed, titrated to determine the TCID ^ g, and subsequent tests were performed with freshly thawed aliquots, diluted 1: 500 in culture medium to a concentration of approximately ten times the amount required to infect 50% CEM cells in the culture (10 TCIDj-g). The virus suspension was mixed with an equal volume (250 µl) of a monoclonal antibody preparation in five dilutions from 1: 5 to 1: 9,765,625. The virus / antibody mixture was incubated for 45 minutes at 37 ° C and then duplicated from 1: 5 to 1: 9,765,625. The virus / antibody mixture was incubated for 45 minutes at 37 ° C and then duplicate samples of 200 µl were used to inoculate wells containing 1 ml of approximately 2 x 10 ^ CEM cells per well. The cultures were incubated at 37 ° C in an atmosphere of humidified 5% COg for 14 days. The cells were harvested, compressed, and lysed with 1% Triton X-100 in PBS for about 10 minutes. The amount of virus (or viral antigen) present in the lysed cells was quantified using an immunoassay "sandwich" enzyme that captures sensitive HIV antigen. The titration of the neutralizing activity, if there is one, was determined as the reciprocal of the dilution of monoclonal antibody which inhibited the production of antigen on more than 50% of control cultures of virus incubated without antibody. , or with a monoclonal antibody of the same isotype which had previously been shown to lack neutralizing activity.

10 Le test de capture antigénique HIV décrit ci-dessus utilisait deux anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes p25 comme réactifs de capture. Ces lignées de cellules hybridomes furent produites par les méthodes décrites ci-dessus avec des modifications mineures, y compris en 15 utilisant une protéine de fusion recombinante de gag purifiée comme l'immunogène et caractérisant les anticorps monoclonaux résultants en ce qui concerne la spécificité et la réactivité utilisant les protéines de fusion recombinantes précédemment appelées GAG-1 , GAG-2 et GAG-3 , et le peptide synthèse 141.The HIV antigenic capture test described above used two monoclonal antibodies directed against p25 antigens as capture reagents. These hybridoma cell lines were produced by the methods described above with minor modifications, including using a purified recombinant gag fusion protein as the immunogen and characterizing the resulting monoclonal antibodies with respect to specificity and reactivity using the recombinant fusion proteins previously called GAG-1, GAG-2 and GAG-3, and the peptide synthesis 141.

20 La protéine GAG-1 est exprimée à partir de pGAG-1 (ATCCThe GAG-1 protein is expressed from pGAG-1 (ATCC

N° 53379), GAG-2 est exprimée à partir de pGAG-2 (ATCC N° 53111) et GAG-3 est exprimée à partir de pGAG-3 (ATCC N° 53112).No. 53379), GAG-2 is expressed from pGAG-2 (ATCC No. 53111) and GAG-3 is expressed from pGAG-3 (ATCC No. 53112).

Le peptide de synthèse 141 est codé par la région de génome LAVgRu correspondant aux résidus d'acides aminés 198-242.Synthetic peptide 141 is encoded by the LAVgRu genome region corresponding to amino acid residues 198-242.

25 Des anticorps monoclonaux produits par des lignées de cellules hybridomes p25-2 et p25-3 ont été trouvés comme réagissant avec des protéines de fusion recombinantes GAG-1, GAG-2 et GAG-3 et le monoclonal de p25-3 est également réactif avec le peptide de synthèse 141.Monoclonal antibodies produced by hybridoma cell lines p25-2 and p25-3 have been found to react with recombinant fusion proteins GAG-1, GAG-2 and GAG-3 and the monoclonal of p25-3 is also reactive with synthetic peptide 141.

30 Pour réaliser le test de capture d'antigène, les réactifs de capture furent d'abord adsorbés sur un support solide. Un fluide ascite dérivant des lignées de cellules hybridomes p25-2 et p25-3 fut dilué 1:5.000 dans un tampon Tris 25 mM, pH 8,5 et 200 pi furent placés dans des puits de 35 plaques à micropuits. Les puits furent fermés de manière * * 52 étanche et incubés pendant environ 16 heures à 4°C. La solution fut éliminée des puits par aspiration avant d'ajouter une solution de blocage de 0,3% Blotto dans BBS. Le blocage fut réalisé pendant 15 minutes à la température ambiante.To carry out the antigen capture test, the capture reagents were first adsorbed on a solid support. Ascites fluid derived from hybridoma cell lines p25-2 and p25-3 was diluted 1: 5,000 in 25 mM Tris buffer, pH 8.5 and 200 µl were placed in wells of 35 microwell plates. The wells were sealed * * 52 and incubated for about 16 hours at 4 ° C. The solution was removed from the wells by aspiration before adding a 0.3% Blotto blocking solution in BBS. The blocking was carried out for 15 minutes at room temperature.

5 La solution de blocage fut aspirée et l'échantillon fut ajouté. Deux cents microlitres de la suspension cellulaire lysée et 5 ju 1 de conjugat de détection, préparé comme décrit ci-dessous, furent ajoutés à chaque puits. Les plaques ou bandes de puits furent incubées pendant 2 heures à 37°C, 10 après quoi la suspension fut aspirée et les puits lavés quatre fois avec du tampon (0,05% Tween 20 dans PBS). Le produit conjugué de détection fut préparé comme suit. Les anticorps monoclonaux p25-6 et p25-7 furent conjugués avec la peroxydase de radis noir (HRP) suivant un rapport molaire 15 3:1 (Ab:HRP) pendant trois heures en utilisant une méthode d'oxydation au périodate (Nakane et autres, J. Histochem. Cytochem. 22:1084 (1974). Les produits conjugués furent dilués 1:1500 dans 2,5% (poids/volume) de lait sec non gras, 0,01% de thimérosal et 0,05% d'anti-mousse A dans du citrate 20 de sodium 20 mM. Le restant du test ELISA fut réalisé comme décrit dans l'Exemple I.5 The blocking solution was aspirated and the sample was added. Two hundred microliters of the lysed cell suspension and 5 µl of detection conjugate, prepared as described below, were added to each well. The well plates or strips were incubated for 2 hours at 37 ° C, after which the suspension was aspirated and the wells washed four times with buffer (0.05% Tween 20 in PBS). The conjugate detection product was prepared as follows. Monoclonal antibodies p25-6 and p25-7 were conjugated with black radish peroxidase (HRP) in a 3: 1 molar ratio (Ab: HRP) for three hours using a periodate oxidation method (Nakane et al. , J. Histochem, Cytochem 22: 1084 (1974) The conjugates were diluted 1: 1500 in 2.5% (weight / volume) of non-fat dry milk, 0.01% thimerosal and 0.05% d anti-foam A in 20 mM sodium citrate 20. The remainder of the ELISA test was carried out as described in Example I.

Les résultats de l'essai de l'activité neutralisante avec les anticorps gpllO-3, -4, -5 et -6 sont les suivants. Les titres les plus élevés qui retenaient l'activité neutra-25 lisante furent déterminés comme étant : gpllÛ-3 = 15,625; gpllQ-4 = 9,765,625; gpllO-5 = 125; et gpllO-6 = 625.The results of the neutralizing activity test with the antibodies gpl10-3, -4, -5 and -6 are as follows. The highest titers which retained neutralizing activity were determined to be: gpllÛ-3 = 15.625; gpllQ-4 = 9,765,625; gpl10-5 = 125; and gpl10-6 = 625.

Etant donné la variabilité génétique prédite de la région définie par le peptide 29, le pouvoir de l'anticorps monoclonal gpll0-4 à reconnaître d'autres isolats de HIV fut 30 examiné. Les tests d'immunofluorescence furent réalisés comme décrit ci-dessus. L'anticorps gpll0-4 détectait un antigène dans des cultures d'au moins 3 à 16 isolats HIV testés.Given the predicted genetic variability of the region defined by peptide 29, the power of the monoclonal antibody gpl10-4 to recognize other HIV isolates was examined. The immunofluorescence tests were carried out as described above. The antibody gpl10-4 detected an antigen in cultures of at least 3 to 16 HIV isolates tested.

L'anticorps gpllO-4 était capable de neutraliser des 35 virus isolés sur quinze semaines à partir d'un chimpanzé 53 inoculé avec du LAVRRy comme animal témoin dans un essai de vaccin SIDA. L'anticorps monoclonal était capable de neutraliser les isolats même si l'animal avait des anticorps de sérum qui neutralisaient HIV ijn vitro, et avait développé 5 une réponse mesurable immunitaire engendrée par les cellules, à l'infection HIV. Ceci indique un défaut de mouvement antigénique in vivo pour l'épitope reconnu par l'anticorps gpllQ-4.The antibody gpl10-4 was able to neutralize viruses isolated over fifteen weeks from a chimpanzee 53 inoculated with LAVRRy as a control animal in an AIDS vaccine trial. The monoclonal antibody was able to neutralize the isolates even if the animal had serum antibodies which neutralized HIV in vitro, and had developed a measurable cell-generated immune response to HIV infection. This indicates a defect in antigenic movement in vivo for the epitope recognized by the antibody gpllQ-4.

EXEMPLE IIIEXAMPLE III

10 Neutralisation du pouvoir infectieux de HIV par un cocktail d'anticorps monoclonaux anti-gpllO et anti-p2510 Neutralization of the infectious power of HIV with a cocktail of anti-gpl10 and anti-p25 monoclonal antibodies

Cet exemple décrit la neutralisation du pouvoir infectieux HIV en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient 15 à gpllO et aux peptides dans gpllO en combinaison avec des anticorps monoclonaux qui se lient à p25 et des peptides dans p25 , lesquels seuls montrent peu ou pas d'activité neutralisante. Les résultats indiquent que l'anticorps monoclonal gpllO-2 en combinaison avec soit p25-6 ou p25-7 possède des 20 niveaux particulièrement élevés d'activité neutralisante.This example describes neutralization of HIV infectivity using monoclonal antibodies which bind to gpl10 and peptides in gpl10 in combination with monoclonal antibodies which bind to p25 and peptides in p25, which alone show little or no neutralizing activity. The results indicate that the monoclonal antibody gpl10-2 in combination with either p25-6 or p25-7 has particularly high levels of neutralizing activity.

Des lignées de cellules hybridomes p25-6 et p25-7 ont été produites par les méthodes décrites ci-dessus avec des modifications qui comprennent l'utilisation du virus disloqué ou rompu inactivé ou ou une protéine de fusion ’re-25 combinante de gag purifiée exprimée dans E^ Coli, comme immunogène, et caractérisant les anticorps monoclonaux résultants en ce qui concerne la spécificité et la réactivité, utilisant les protéines de fusion recombinantes précédemment appelées GAG-1, GAG-2 et GAG-3 et les peptides de synthèse 15, 88, 30 150, 147 et 148. Les peptides de synthèse sont codés par la région de génome LAVßRU correspondant aux résidus d'acides aminés comme suit : peptide 15, résidus d'acides aminés 329 à 350; peptide 88, résidus d'acides aminés 315 à 350; peptide 150, résidus d'acides aminés 318 à 363; peptide 147, 35 résidus d'acides aminés 278 à 319; et peptide 148, résidusHybridoma cell lines p25-6 and p25-7 were produced by the methods described above with modifications which include the use of inactivated disrupted or disrupted virus or or a purified gag re-combining fusion protein expressed in E. coli, as an immunogen, and characterizing the resulting monoclonal antibodies with regard to specificity and reactivity, using the recombinant fusion proteins previously called GAG-1, GAG-2 and GAG-3 and the synthetic peptides 15 , 88, 150, 150, 147 and 148. The synthetic peptides are coded by the LAVßRU genome region corresponding to the amino acid residues as follows: peptide 15, amino acid residues 329 to 350; peptide 88, amino acid residues 315 to 350; peptide 150, amino acid residues 318 to 363; peptide 147, 35 amino acid residues 278 to 319; and peptide 148, residues

* A* AT

54 d'acides aminés 290 à 319. Les anticorps monoclonaux produits par les lignées de cellules hybridomes p25-6 et p25-7 réagissent avec la protéine recombinante GAG-3 , p25-6 réagit avec les peptides de synthèse 147 et 148, et p25-7 réagit avec 5 les peptides de synthèse 15, 88, et 150.54 of amino acids 290 to 319. The monoclonal antibodies produced by the hybridoma cell lines p25-6 and p25-7 react with the recombinant protein GAG-3, p25-6 reacts with the synthetic peptides 147 and 148, and p25 -7 reacts with synthetic peptides 15, 88, and 150.

Des essais de neutralisation furent réalisés comme décrit ci-dessus, sauf lorsque des cocktails ont été utilisés; des anticorps monoclonaux d'individus furent d'abord dilués 1:5 dans un milieu de culture et ensuite mélangés suivant 10 des rapports égaux pour donner une dilution finale de 1:10.Neutralization tests were carried out as described above, except when cocktails were used; monoclonal antibodies from individuals were first diluted 1: 5 in culture medium and then mixed in equal ratios to give a final dilution of 1:10.

Le restant de l'essai fut réalisé comme décrit ci-dessus.The remainder of the test was carried out as described above.

Les anticorps monoclonaux gpllO-2, p25-6 et p25-7 montrent moins de 50% d'activité neutralisante lorsqu'ils sont utilisés seuls. Lorsqu'ils sont utilisés dans un cocktail 15 qui comprend les anticorps monoclonaux gpll0-2 avec p25-6 ou gpll0-2 avec p25-7 suivant une dilution 1:10, il se produit une neutralisation totale. Un cocktail comprenant les anticorps monoclonaux p25-6 en combinaison avec p25-7 a donné un taux d'activité neutralisante de 60-90%.The monoclonal antibodies gpl10-2, p25-6 and p25-7 show less than 50% of neutralizing activity when used alone. When used in a cocktail which includes the monoclonal antibodies gpl10-2 with p25-6 or gpl10-2 with p25-7 at a 1:10 dilution, complete neutralization occurs. A cocktail comprising the monoclonal antibodies p25-6 in combination with p25-7 gave a neutralizing activity rate of 60-90%.

20 EXEMPLE IV20 EXAMPLE IV

Immunopotentialité du peptide 29 et ses homologues Le pouvoir du peptide 29 et des peptides homologues, y compris le peptide 177, à stimuler une réponse immunitaire contre HIV fut d'abord examiné dans deux souches de souris.Immunopotentiality of peptide 29 and its homologs The power of peptide 29 and homologous peptides, including peptide 177, to stimulate an immune response against HIV was first examined in two strains of mice.

25 Les processus pour la préparation des immunogènes de peptide, les protocoles d'immunisation, et pour la caractérisation de la réponse immunitaire engendrée sont donnés en détail ci-dessous .The procedures for the preparation of the peptide immunogens, the immunization protocols, and for the characterization of the generated immune response are given in detail below.

Le peptide 29 fut préparé pour immunisation par conju-30 gaison avec une thyroglobuline purifiée. La thyroglobuline peut être dérivée avec du N-succinimidyl-4-(N-maléïmido-méthyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC) pour conjugaison selon le processus souligné dans le brevet américain N° 4 629 783, colonne 10, lignes 28 à 51. Comme second immunogène, la thyro-35 globuline fut dérivée avec du glutaraldéhyde comme suit.Peptide 29 was prepared for conjugate immunization with purified thyroglobulin. Thyroglobulin can be derived with N-succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) for conjugation according to the process outlined in U.S. Patent No. 4,629,783, column 10, lines 28 to 51. As the second immunogen, thyro-globulin was derived with glutaraldehyde as follows.

* * 55* * 55

De la thyroglobuline porcine, 27 mg, fut dissoute dans 1 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M, auquel 8,3 jul d'une solution de glutaraldéhyde 25% furent ajoutés goutte à goutte, et le mélange fut agité toute la nuit à la température ambiante.Swine thyroglobulin, 27 mg, was dissolved in 1 ml of 0.1 M sodium bicarbonate, to which 8.3 µl of 25% glutaraldehyde solution was added dropwise, and the mixture was stirred overnight Room temperature.

5 1 ml de tampon de bicarbonate/carbonate de sodium , pH 9,3, fut ajouté à la solution et ensuite dialysé pendant 8 heures sur 2 litres du même tampon à 4°C, avec un changement complet du dialysat après 4 heures. Le peptide 29 fut ensuite ajouté à la thyroglobuline dérivée suivant approximativement un 10 excès molaire de 100, et le mélange fut agité toute la nuit à la température ambiante. Le glutaraldéhyde qui n'avait pas réagi fut bloqué avec 200 pl d'une solution de lysine 0,2 M, lequel mélange fut agité pendant plusieurs heures (ou pendant toute la nuit) à la température ambiante. Le conjugat de 15 thyroglobuline-peptide fut ensuite dialysé d'une manière extensive sur du PBS à 4°C.5 1 ml of bicarbonate / sodium carbonate buffer, pH 9.3, was added to the solution and then dialyzed for 8 hours on 2 liters of the same buffer at 4 ° C, with a complete change of the dialysate after 4 hours. Peptide 29 was then added to the derived thyroglobulin in approximately a molar excess of 100, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The unreacted glutaraldehyde was blocked with 200 µl of 0.2 M lysine solution, which mixture was stirred for several hours (or overnight) at room temperature. The thyroglobulin-peptide conjugate was then dialyzed extensively on PBS at 4 ° C.

Deux souches de souris (noire C57 et BALB/c) furent inoculées avec des peptides préparés par chaque méthode de conjugaison. Tous les animaux avaient un âge d'environ 20 2-4 semaines au moment de l'inoculation. Les voies d'inoculation comprennent le bout de la patte, une scarification de la queue, une administration sous-cutanée, intranasale, ou intrapéritonéale. L'inoculum consistait de 25 pg de peptide conjugué en suspension dans 0,5 ml d'adjuvant de Freund 25 complet, avec des inoculations renforcées et répétées aux semaines 2, 3 et 5, avec le même immunogène en suspension dans un adjuvant de Freund incomplet. Des échantillons de sérum de souris individuelles furent recueillis avant immunisation, 4 jours après l'immunisation renforcée à 3 semaines, et 30 4 jours après l'inoculation renforcée à 5 semaines. Les échantillons de sérum furent analysés pour les anticorps contre les peptides homologues ou le virus entier par "screening" dans le test ELISA. Les sérums présentant une activité d'anticorps pour LAV sont en outre triés pour 35 l'activité de neutralisation, ce après quoi on analyse les « * 56 sérums dans des immunoblots pour l'antigène LAV rompu et des tests de radioimmunoprécipitation avec gpllO radiomarqué.Two mouse strains (black C57 and BALB / c) were inoculated with peptides prepared by each method of conjugation. All animals were approximately 20 2-4 weeks old at the time of inoculation. The routes of inoculation include the tip of the leg, scarification of the tail, subcutaneous, intranasal, or intraperitoneal administration. The inoculum consisted of 25 µg of conjugated peptide suspended in 0.5 ml of complete Freund's adjuvant, with enhanced inoculations and repeated at weeks 2, 3 and 5, with the same immunogen suspended in a Freund's adjuvant incomplete. Serum samples from individual mice were collected before immunization, 4 days after the enhanced immunization at 3 weeks, and 4 days after the enhanced inoculation at 5 weeks. The serum samples were analyzed for antibodies against the homologous peptides or the whole virus by "screening" in the ELISA test. Sera with antibody activity for LAV are further screened for neutralization activity, after which the "56" sera are analyzed in immunoblots for disrupted LAV antigen and radioimmunoprecipitation tests with radiolabeled gpl10.

Les résultats des immunisations indiquaient que les souris immunisées avec le peptide 29 développaient des 5 anticorps réactifs avec le peptide 29 et le virus LAV-1 rompu ou brisé dans les tests ELISA. La conjugaison du peptide 29 à travers du glutaraldéhyde révélait généralement un titre plus élevé d'anticorps pour le peptide 29 dans des souris Balb/c, bien que la conjugaison 10 à travers de la maléimide faisait mettre au jour avec succès des anticorps anti-peptide 29 dans quelques souris Balb/c.Immunization results indicated that mice immunized with peptide 29 developed antibodies reactive with peptide 29 and ruptured or broken LAV-1 virus in ELISA tests. Conjugation of peptide 29 through glutaraldehyde generally revealed a higher antibody titer for peptide 29 in Balb / c mice, although conjugation 10 through maleimide successfully demonstrated anti-peptide antibodies 29 in some Balb / c mice.

Des souris immunisées avec le peptide 177 développaient des anticorps pour le peptide, et une conjugaison du peptide 177 à travers du glutaraldéhyde était meilleure pour mettre au 15 jour une réponse immunologique. Des souris C57 étaient plus sensibles à une stimulation immune avec le peptide 177 que les souris Balb/c. Des souris immunisées avec le peptide 110-2-2 de LAV-2 développaient des anticorps contre 110-2-2 et le virus LAV-2 comme montré par les tests ELISA. Un 20 peptide 110-2-2 conjugué à travers du glutaraldéhyde était immunogénique à la fois dans des souris Balb/c et C57, bien que les titres pour le peptide 110-2-2 soient généralement plus élevés dans les souris Balb/c que C57, tandis que les titres au virus LAV-2 étaient généralement plus élevés 25 dans les souris C57 que dans les souris Balb/c.Mice immunized with peptide 177 developed antibodies to the peptide, and conjugation of peptide 177 through glutaraldehyde was better for evidencing an immunological response. C57 mice were more sensitive to immune stimulation with peptide 177 than Balb / c mice. Mice immunized with the LAV-2 peptide 110-2-2 developed antibodies against 110-2-2 and the LAV-2 virus as shown by the ELISA tests. A 110-2-2 peptide conjugated through glutaraldehyde was immunogenic in both Balb / c and C57 mice, although the titers for peptide 110-2-2 were generally higher in Balb / c mice than C57, while LAV-2 titer was generally higher in C57 mice than in Balb / c mice.

Généralement, les échantillons de sérum à partir de souris immunisées qui (i) présentent des anticorps vis-à-vis du virus entier; (ii) sont capables de neutraliser HIV, tel que dans les tests décrits dans l'Exemple II; et (iii) 30 réagissent avec le peptide 29 dans le test ELISA, indiquent de manière cumulative l'efficacité de l'utilisation du peptide 29 dans une formulation de vaccin.Generally, serum samples from immunized mice which (i) have antibodies against the whole virus; (ii) are capable of neutralizing HIV, as in the tests described in Example II; and (iii) 30 react with peptide 29 in the ELISA test, cumulatively indicate the effectiveness of the use of peptide 29 in a vaccine formulation.

I * 57I * 57

EXEMPLE VEXAMPLE V

Séparation d'immunoaffinité d'un anticorps monoclonal utilisant gpllQImmunoaffinity separation of a monoclonal antibody using gpllQ

Les anticorps monoclonaux vis-à-vis de l'antigène 5 gpllO de HIV peuvent être utilisés dans des processus de séparation d'immunoaffinité pour purifier sensiblement les protéines recombinantes d'expression bactérienne. Si la protéine exprimée est sécrétée par les bactéries, la protéine peut être isolée du surnageant de la culture; si la protéine 10 n'est pas sécrétée, la rupture des cellules bactériennes peut être nécessaire.Monoclonal antibodies to the 5 gpl10 HIV antigen can be used in immunoaffinity separation processes to substantially purify recombinant proteins from bacterial expression. If the expressed protein is secreted by bacteria, the protein can be isolated from the culture supernatant; if protein 10 is not secreted, bacterial cell breakdown may be necessary.

Le plasmide pENV-5 (ATCC N° 53074) code une fraction majeure de l'extrémité carboxyle de gpllO et une fraction du terminal amino de gp41 de LAV inséré dans le vecteur 15 d'expression trp . _E. Coli C600 transformé par ce vecteur exprime mais ne sécrète pas la protéine gpllO.Plasmid pENV-5 (ATCC No. 53074) encodes a major moiety of the carboxyl terminus of gpl10 and a moiety of the amino terminus of gp41 of LAV inserted into the expression vector trp. _E. Coli C600 transformed by this vector expresses but does not secrete the protein gpl10.

Des _E. Coli C 600 contenant le plasmide pENV-5 sont soumises à la croissance dans un milieu contenant du tryptophane (20 pg/ml) et de l'ampicilline (100 pg/ml) pen-20 dant toute une nuit à 37°C avec aération. Les cultures de la nuit sont alors inoculées suivant 1:100 dans un milieu minimal frais contenant de l'ampicilline (100 pg/ml) mais pas de tryptophane. Ces cultures croissent avec aération pendant 2-3 heures (jusqu'à la phase logarithmique précoce) 25 à 37°C. L'inducteur, l'acide 3-B-indole-acrylique (SigmaTo. Coli C 600 containing the plasmid pENV-5 are subjected to growth in a medium containing tryptophan (20 pg / ml) and ampicillin (100 pg / ml) overnight at 37 ° C with aeration . The overnight cultures are then inoculated at 1: 100 in a fresh minimal medium containing ampicillin (100 μg / ml) but no tryptophan. These cultures grow with aeration for 2-3 hours (up to the early log phase) 25 to 37 ° C. Inductor, 3-B-indole-acrylic acid (Sigma

Chemical Co., Saint-Louis, MO) est ajouté à une concentration finale de 20 pg/ml à partir de stocks fraîchement obtenus de 20 mg/ml dans 95% d'éthanol. Les cultures induites sont ensuite soumises à la croissance à 37°C avec une aération 30 pendant 4 à 5 heures puis mises en comprimés et, facultativement, congelées. Les rendements de protéines provenant de pENV-5 sont typiquement moindres que 1 mg/litre.Chemical Co., St. Louis, MO) is added to a final concentration of 20 pg / ml from freshly obtained stocks of 20 mg / ml in 95% ethanol. The induced cultures are then grown at 37 ° C with aeration for 4 to 5 hours and then compressed and optionally frozen. Protein yields from pENV-5 are typically less than 1 mg / liter.

Les cellules bactériennes en grains ou pilules sont lysées en utilisant du tampon P-RIPA (PBS contenant 1% de 35 Triton X-100, 1% de désoxycholate, 0,1% de sulfate de sodium * t.The bacterial cells in grains or pills are lysed using P-RIPA buffer (PBS containing 1% of Triton X-100, 1% of deoxycholate, 0.1% of sodium sulfate * t.

58 dodécyle, et 1% d'aprotinine) qui provoquera la lyse des cellules £. Coli . La suspension peut être soumise à des ondes sonores pour cisailler l'ADN et l'ARN, ce après quoi on effectue une centrifugation pour éliminer les particules.58 dodecyl, and 1% aprotinin) which will cause lysis of the £ cells. Coli. The suspension can be subjected to sound waves to shear DNA and RNA, after which centrifugation is carried out to remove the particles.

5 Une phase de dilution ou de concentration peut être nécessaire pour standardiser la concentration de protéine.5 A dilution or concentration phase may be necessary to standardize the protein concentration.

L'anticorps monoclonal HIV-gpllO-1 est précipité initialement à partir de fluides ascites ou de surnageants de culture de cellules à la température ambiante ou dans le 10 froid avec des solutions de (NH^gSO^ ou NagSO^ tamponnées à pH 7,3 jusqu'à saturation finale de 33 ou 18% respectivement. Les protéines précipitées sont éliminées par centrifugation et redissoutes dans PBS et précipitées une seconde fois avec 33% de (NH^^SO^ ou 12-15% de NagSO^. Cette phase 15 peut être répétée si nécessaire. Le comprimé est de nouveau dissous dans PBS et les sels en excès sont enlevés par filtration sur gel à travers une matrice de dessalage ou par dialyse-exhaustive sur PBS.The HIV-gpl10-1 monoclonal antibody is initially precipitated from ascites fluids or cell culture supernatants at room temperature or in the cold with solutions of (NH 4 gSO 4 or NagSO 4 buffered at pH 7, 3 until final saturation of 33 or 18% respectively The precipitated proteins are eliminated by centrifugation and redissolved in PBS and precipitated a second time with 33% of (NH ^^ SO ^ or 12-15% of NagSO ^. This phase 15 can be repeated if necessary The tablet is again dissolved in PBS and the excess salts are removed by gel filtration through a desalting matrix or by dialysis-exhaustive on PBS.

L'anticorps monoclonal purifié 110-1 peut ensuite 20 être couplé à de la Sepharose activée par bromure de cyanogène. La quantité nécessaire de gel est gonflée dans f -3 une solution de HCl 10 M sur un filtre de verre (1 g de matériau séché par congélation donne un volume final de gel d'approximativement 3,5 ml) et lavée pendant 15 minutes avec 25 la même solution, et l'anticorps est ajouté immédiatement après. En général, la réaction de couplage a lieu plus efficacement dans un intervalle de pH 8-10, mais un pH plus faible peut être utilisé si nécessaire pour la stabilité de l'anticorps. L'anticorps doit être dissous dans PBS ou un 30 tampon de borate ou bicarbonate/carbonate de force ionique élevée avec du NaCl 150 mM. La suspension d'anticorps et de Sepharose activée est agitée doucement pendant 2-4 heures à la température ambiante, ou toute la nuit à 4°C, et ensuite lavée sur un filtre de verre fritté avec tampon de couplage.The purified monoclonal antibody 110-1 can then be coupled to cyanogen bromide activated Sepharose. The required amount of gel is swollen in f -3 10 M HCl solution on a glass filter (1 g of freeze-dried material gives a final gel volume of approximately 3.5 ml) and washed for 15 minutes with 25 the same solution, and the antibody is added immediately after. In general, the coupling reaction takes place more efficiently in the pH range 8-10, but a lower pH can be used if necessary for the stability of the antibody. The antibody should be dissolved in PBS or a high ionic strength borate or bicarbonate / carbonate buffer with 150 mM NaCl. The suspension of antibodies and activated Sepharose is stirred gently for 2-4 hours at room temperature, or overnight at 4 ° C, and then washed on a sintered glass filter with coupling buffer.

35 Tous les groupes actifs restants sont bloqués par traitement » λ 59 avec de 1'éthanolamine 1 M à pH 8 pendant 2 heures. Le produit final Sepharose-anticorps est ensuite lavé alternativement avec des solutions tamponsà pH élevé et faible (tampon borate, 0,1M, pH 8,5, tampon acétate et NaCl IM, 0,IM, pH 4, 5 NaCl 1 M, respectivement) quatre ou cinq fois. Ce lavage élimine les traces de matériaux adsorbés de façon non covalente. La matrice de séparation d'immunoaffinité finie est stockée en dessous de 8°C en présence d'un agent bactériostatique convenable, tel que azide 0,01%.All remaining active groups are blocked by treatment of λ 59 with 1 M ethanolamine at pH 8 for 2 hours. The final Sepharose-antibody product is then washed alternately with high and low pH buffer solutions (borate buffer, 0.1 M, pH 8.5, acetate buffer and IM NaCl, 0, IM, pH 4.5, 1 M NaCl, respectively ) four or five times. This washing removes traces of non-covalently adsorbed materials. The finished immunoaffinity separation matrix is stored below 8 ° C in the presence of a suitable bacteriostatic agent, such as 0.01% azide.

10 L'addition de la suspension de protéine exprimée à la matrice de séparation d'immunoaffinité provoque l'élimination sélective de l'antigène gpllO. On laisse le mélange interagir pendant 2 à 24 heures, de préférence 12-18 heures, avec oscillation ou agitation lente. Un système à colonne peut 15 également être utilisé dans lequel la matrice d'immunoaffinité est versée sur une colonne, équilibrée et la suspension de protéine exprimée ajoutée lentement à la colonne. Après que la suspension de protéine a été ajoutée, l'écoulement peut être arrêté pour permettre une formation de complexe immuni-20 taire maximum.The addition of the expressed protein suspension to the immunoaffinity separation matrix causes the selective elimination of the gpl10 antigen. The mixture is allowed to interact for 2 to 24 hours, preferably 12-18 hours, with oscillation or slow agitation. A column system can also be used in which the immunoaffinity matrix is poured onto a column, equilibrated and the suspension of expressed protein added slowly to the column. After the protein suspension has been added, the flow can be stopped to allow for the formation of maximum immune complex.

Le matériau non lié est lavé ou enlevé par séparation par un lavage extensif avec un tampon d'adsorption. Un filtre de verre fritté avec du vide peut être utilisé ou bien on utilise un écoulement au travers de la colonne. Le matériau 25 lié est ensuite élué en utilisant des tampons de pH faible ou élevé (tampon d'acétate, pH 4 ou tampon de borate, pH 8,6) ou bien un agent chaotropique.The unbound material is washed or removed by separation by extensive washing with an adsorption pad. A vacuum sintered glass filter can be used or a flow through the column is used. The bound material is then eluted using low or high pH buffers (acetate buffer, pH 4 or borate buffer, pH 8.6) or else a chaotropic agent.

EXEMPLE VIEXAMPLE VI

Purification d1immunoaffinité de gpllO recombinant 30 à partir d'un système d'expression de mammifèrePurification of Immunoaffinity of Recombinant Gpl10 from a Mammalian Expression System

Les anticorps monoclonaux de la présente invention trouvent une utilisation dans la purification d'immunoaffinité de gpllO recombinant exprimé par des cellules de mammifère.The monoclonal antibodies of the present invention find use in the immunoaffinity purification of recombinant gpl10 expressed by mammalian cells.

Les cellules de mammifère sont infectées avec des vaccins 35 recombinants (Mackett et autres, ^J. Virol. 49:857 (1984) qui r i 60 contiennent des séquences codant au moins la partie de gpllû qui est antigène et met à jour les anticorps de neutralisation .The mammalian cells are infected with recombinant vaccines (Mackett et al., ^ J. Virol. 49: 857 (1984) which ri 60 contain sequences encoding at least the part of gp11 which is antigenic and updates the antibodies of neutralization.

Les vaccins recombinants sont construits selon la 5 méthode décrite dans la demande de brevet américain N° 842 984 qui est donnée ici à titre de référence. Brièvement parlant, des séquences codant pour la glycoprotéine d'enveloppe de HIV sont insérées dans un vecteur plasmide (pGS20) en aval d'un élément témoin de transcription de vaccin. Ce gène 10 chimérique est flanqué de séquences codant le gène (TK) de la thymidine kinase virale.Recombinant vaccines are constructed according to the method described in American patent application No. 842 984 which is given here for reference. Briefly speaking, sequences encoding the HIV envelope glycoprotein are inserted into a plasmid vector (pGS20) downstream of a vaccine transcription control element. This chimeric gene is flanked by sequences encoding the viral thymidine kinase (TK) gene.

Des vecteurs de plasmide chimériques contenant un promoteur de virus de vaccin ligaturé au gène d'enveloppe LAV sont utilisés pour transformer la souche Coli MC1000.Chimeric plasmid vectors containing a vaccine virus promoter ligated to the LAV envelope gene are used to transform the Coli MC1000 strain.

15 L'insertion des séquences LAV-env chimériques dans le génome de virus des vaccins fut réalisée par recombinaison i£ vivo , ce qui est rendu possible par le fait que les gènes chimériques dans les plasmides pv-env5 sont flanqués ou disposés à côté de séquences de virus de vaccin codant pour le gène TK. 20 Ce plasmide est ensuite introduit dans des cellules précédemment infectées par un virus de vaccin du type sauvage et on laisse se produire la recombinaison entre les séquences TK sur le plasmide et les séquences homologues dans le génome viral de vaccin, ce qui assure l'insertion du gène chimérique. 25 Des cellules de rein du Singe Vert d'Afrique (souche BSC-40, lignée dérivée de cellules BSC-1, ATCC N° CCL26) sont utilisées comme cellule hôte dans le système d'expression.The insertion of the chimeric LAV-env sequences into the vaccine virus genome was accomplished by recombination in vivo, which is made possible by the fact that the chimeric genes in the plasmids pv-env5 are flanked or arranged next to vaccine virus sequences encoding the TK gene. This plasmid is then introduced into cells previously infected with a wild type vaccine virus and the recombination between the TK sequences on the plasmid and the homologous sequences in the viral vaccine genome is allowed to occur, which ensures insertion of the chimeric gene. Kidney cells of the African Green Monkey (strain BSC-40, line derived from BSC-1 cells, ATCC No. CCL26) are used as host cell in the expression system.

Les cellules BSC-40 confluentes sont infectées suivant un multiple d'infection de 10 par virus de vaccin re-30 combinant. On laisse s'effectuer l'infection pendant 12 heures, auquel moment, les cellules sont récoltées, lavées une fois avec PBS, et recueillies par centrifugation. Les grains cellulaires sont remis en suspension dans un tampon de lyse (1% NP 40, 2,5% désoxycholate de sodium, NaCl 0,1 Μ, M Tris-HCl 35 0,01 M, pH 7,4, EDTA 1 mM), et le lysat est ensuite clarifié * * 61 .par centrifugation. Une séparation d1immunoaffinité de la protéine recombinante exprimée est réalisée comme décrit ci-dessus pour le système d'expression bactérien, en utilisant l'anticorps monoclonal gpllO-1. Les protéines produites 5 par ce système d'expression ressemblent plus étroitement au gpllO HIV produit naturellement en raison du traitement et de la glycosylation fournis par les cellules de mammifère.The confluent BSC-40 cells are infected following an infection multiple of 10 with re-combining vaccine virus. The infection is allowed to proceed for 12 hours, at which time the cells are harvested, washed once with PBS, and collected by centrifugation. The cell grains are resuspended in a lysis buffer (1% NP 40, 2.5% sodium deoxycholate, 0.1 Na NaCl, M 0.01 M Tris-HCl 35, pH 7.4, 1 mM EDTA ), and the lysate is then clarified * * 61. by centrifugation. An immunoaffinity separation of the expressed recombinant protein is carried out as described above for the bacterial expression system, using the monoclonal antibody gpl10-1. The proteins produced by this expression system more closely resemble the gpl10 HIV produced naturally by the processing and glycosylation provided by mammalian cells.

EXEMPLE VIIEXAMPLE VII

Inhibition de l'infection par HIV avec des 10 pepti*des bloquants L'efficacité des peptides bloquants dans l'inhibition de l'infection des cellules de tissus par la souche LAV^y de HIV fut étudiée en utilisant une modification du protocole pour l'évaluation du peptide T, comme publié par Pert et 15 autres, voir supra. Les tests d'inhibition préférés de HIV consistent à combiner des volumes égaux de peptide bloquant et de cellules CEM (2,5 x 10^) dans un milieu (RPMI, 10% FCS et 2 mg/ml polybrène), et à incuber pendant 45 minutes à 37°C. Du virus est ensuite ajouté à des doses différentes (10, 50, 20 500 TCID 50) le mélange est incubé pendant 14 jours à 37°C et ensuite le supernageant testé pour la production d'antigène du virus (par exemple noyau p25).Inhibition of HIV infection with blocker pepti * The efficacy of blocker peptides in inhibiting infection of tissue cells by the LAV ^ y strain of HIV was studied using a protocol modification for the of the T peptide, as published by Pert and 15 others, see above. Preferred HIV inhibition tests consist of combining equal volumes of blocking peptide and CEM cells (2.5 x 10 ^) in medium (RPMI, 10% FCS and 2 mg / ml polybrene), and incubate for 45 minutes at 37 ° C. Virus is then added at different doses (10, 50, 20 500 TCID 50) the mixture is incubated for 14 days at 37 ° C. and then the supernatant tested for the production of virus antigen (for example p25 nucleus).

Une préincubation des cellules CEM avec les peptides avant l'addition de virus dans les cultures renforce l'effet 25 d'inhibition dans les tests. L'inhibition fut trouvée comme étant dépendante de la dose de virus, et présente une forte activité à des doses moyennes et faibles, mais moins d'effet pour des doses de virus très élevées.Preincubation of CEM cells with peptides before addition of virus to cultures enhances the inhibition effect in the tests. The inhibition was found to be dose dependent, and exhibits strong activity at medium and low doses, but less effect for very high doses of virus.

Environ 60% à 90% d'inhibition de la production 30 d'antigène dans les expériences avec doses de virus faibles, furent obtenus avec du peptide T. Des expériences supplémentaires avec des peptides X-XV, typiquement à COOH-terminal amidé et NHg-terminal acétylé, ont donné des résultats similaires, tandis que le peptide XI était particulièrement 35 efficace sur un large intervalle de dose. Les anticorps 62 * 1 neutralisants peuvent être ajoutés soit pendant la période de préincubation ou au moment où le virus est ajouté pour produire une inhibition synergique ou additive de la production d'antigène viral.About 60% to 90% inhibition of antigen production in experiments with low virus doses was obtained with peptide T. Additional experiments with peptides X-XV, typically with COOH-terminal amide and NHg -acetylated terminal, gave similar results, while peptide XI was particularly effective over a wide dose range. Neutralizing 62 * 1 antibodies can be added either during the preincubation period or when the virus is added to produce synergistic or additive inhibition of viral antigen production.

5 On comprend de ce qui précède que les anticorps monoclonaux et peptides , comprenant les peptides bloquants, de la présente invention, constituent des méthodes perfectionnées pour neutraliser et/ou inhiber les infections par HIV. Ceci permet à des compositions thérapeutiques et 10 prophylactiques d'être plus facilement développées et qui peuvent être efficaces contre des infections dues pour la plupart, sinon toutes, aux souches HIV. En outre, les nouveaux matériaux de l'invention trouvent des utilisations dans les tests de diagnostic et d'autres processus bien 15 connus.It is understood from the above that the monoclonal antibodies and peptides, including the blocking peptides, of the present invention constitute improved methods for neutralizing and / or inhibiting HIV infections. This allows therapeutic and prophylactic compositions to be more easily developed and which can be effective against infections caused by most, if not all, of the HIV strains. In addition, the new materials of the invention find uses in diagnostic tests and other well-known processes.

On donnera ci-après un tableau comportant les références d'un certain nombre de microorganismes qui constituent une partie de la présente invention et qui ont été déposés auprès de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn 20 Drive, Rockville, Maryland 20852, USA .A table will be given below with the references of a number of microorganisms which constitute a part of the present invention and which have been deposited with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn 20 Drive, Rockville, Maryland 20852, USA .

Description scientifique Ref. Déposants Ref. ATCC Date dépêtScientific description Ref. Applicants Ref. ATCC Date of deposit

Hybridome souris 25 (balb c/NS-1) HIV-gp 110-1 HB 9175 15 Août 1986 " HIV-gp 110-2 HB 9176 15 Août 1986 " HIV-gp 110-3 HB 9177 15 Août 1986 ‘ " HIV-gp 110-6 HB 9404 30 Avril 1987 " HIV-gp 110-4 HB 9405 30 Avril 1987 30 " HIV-gp 110-5 HB 9406 30 Avril 1987 " HIV-p 25-2 HB 9407 30 Avril 1987 " HIV-p 25-3 HB 9408 30 Avril 1987 " HIV-p 25-6 HB 9409 30 Avril 1987 " HIV-p 25-7 HB 9410 30 Avril 1987 ' '* 63Mouse 25 hybridoma (balb c / NS-1) HIV-gp 110-1 HB 9175 15 August 1986 "HIV-gp 110-2 HB 9176 15 August 1986" HIV-gp 110-3 HB 9177 15 August 1986 '"HIV- gp 110-6 HB 9404 30 April 1987 "HIV-gp 110-4 HB 9405 30 April 1987 30" HIV-gp 110-5 HB 9406 30 April 1987 "HIV-p 25-2 HB 9407 30 April 1987" HIV-p 25-3 HB 9408 April 30, 1987 "HIV-p 25-6 HB 9409 April 30, 1987" HIV-p 25-7 HB 9410 April 30, 1987 '' * 63

On notera que les hybridomes HB 9175, HB 9176 et HB 9177 ont été testés et trouvés viables le 26 Août 1986. Les hybridomes restants ont été testés et trouvés viables le 4 Mai 1987.It will be noted that the hybridomas HB 9175, HB 9176 and HB 9177 were tested and found viable on August 26, 1986. The remaining hybridomas were tested and found viable on May 4, 1987.

5 Bien entendu, la présente invention n’est nullement limitée aux exemples donnés qui doivent être considérés comme clarifiant l’invention mais ne la limitant pas.5 Of course, the present invention is in no way limited to the examples given which should be considered as clarifying the invention but not limiting it.

C’est dire que l’invention comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs 10 combinaisons si celles-ci sont effectuées suivant son esprit.This means that the invention includes all the technical equivalents of the means described and their 10 combinations if these are carried out according to the spirit.

Claims (50)

1. Composition à utiliser pour le traitement d'infections par HIV, caractérisée en ce qu'elle 5 comprend une dose thérapeutiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec une ou plusieurs régions neutralisantes de HIV, et un excipient pharmaceutiquement efficace.1. Composition for use in the treatment of HIV infections, characterized in that it comprises a therapeutically effective dose of at least one monoclonal antibody specifically reactive with one or more neutralizing regions of HIV, and a pharmaceutically effective excipient. 2. Composition suivant la revendication 1, 0 caractérisée en ce que les régions neutralisantes contiennent des épitopes codés par les régions env ou gag du génome de HIV.2. Composition according to claim 1, 0 characterized in that the neutralizing regions contain epitopes encoded by the env or gag regions of the HIV genome. 3. Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les ^5 épitopes sont situés sur les protéines gpllO ou p25 de HIV.3. Composition according to any one of claims 1 and 2, characterized in that the ^ 5 epitopes are located on the proteins gpl10 or p25 of HIV. 4. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend aussi un ou plusieurs peptides bloquants 2q capables d'atténuer le pouvoir infectieux de HIV et/ou anticorps monoclonaux réactifs avec des épitopes de ces peptides.4. Composition according to any one of the preceding claims, characterized in that it also comprises one or more 2q blocking peptides capable of attenuating the infectious power of HIV and / or monoclonal antibodies reactive with epitopes of these peptides. 5. Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce que les peptides bloquants compren- 25 nent au moins environ 5 acides aminés contigus provenant d'une protéine gpllO de HIV.5. Composition according to claim 4, characterized in that the blocking peptides comprise at least about 5 contiguous amino acids originating from a protein gpl10 of HIV. 6. Composition suivant la revendication 5, caractérisée en ce que les peptides bloquants comprennent des peptides provenant de la séquence d'acides 2q aminés 190 à 197 de LAVbru» ou des homologues de cette séquence.6. Composition according to claim 5, characterized in that the blocking peptides comprise peptides originating from the 2q amino acid sequence 190 to 197 of LAVbru "or homologues of this sequence. 7. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’un anticorps monoclonal est réactif avec au moins un 3!- épitope de la séquence d'acides aminés 278 à 319 de p25 k 65 de LAVßgjj et/ou ses homologues, et un second anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de la séquence d'acides aminés 315 à 363 de p25 de iAVßjyj et/ou ses homologues.7. Composition according to any one of the preceding claims, characterized in that a monoclonal antibody is reactive with at least one 3! - epitope of the amino acid sequence 278 to 319 of p25 k 65 of LAVßgjj and / or its homologs, and a second monoclonal antibody is reactive with at least one epitope of the amino acid sequence 315 to 363 of p25 of iAVßjyj and / or its homologs. 8. Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'un anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de p25 de HIV et un second anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de gpllO de HIV.8. Composition according to any one of claims 1 to 5, characterized in that a monoclonal antibody is reactive with at least one epitope of HIV p25 and a second monoclonal antibody is reactive with at least one epitope of HIV gpl10. 9. Composition suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'épitope de p25 est situé dans la séquence d’acides aminés 278 à 319 ou 315 à 363 de LAVߣu» ou dans les homologues de ces séquences.9. Composition according to claim 8, characterized in that the epitope of p25 is located in the amino acid sequence 278 to 319 or 315 to 363 of LAVβ £ u "or in the homologues of these sequences. 10. Composition suivant l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que l'épitope de gpllO est situé dans les séquences d'acides aminés de l'enveloppe 190 à 197, 301 à 336 ou 308 à 328 de LAVBru» ou dans des homologues de ces séquences.10. Composition according to any one of claims 8 and 9, characterized in that the gpl10 epitope is located in the amino acid sequences of the envelope 190 to 197, 301 to 336 or 308 to 328 of LAVBru " or in homologs of these sequences. 11. Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle 20 comprend, en outre, un cocktail d'anticorps monoclonaux réactifs avec ces séquences ou différents homologues de ces séquences.11. Composition according to any one of claims 7 to 10, characterized in that it further comprises a cocktail of monoclonal antibodies reactive with these sequences or different homologs of these sequences. 12. Composition d'anticorps monoclonaux, ^ caractérisée en ce qu'elle est spécifiquement réactive avec une région neutralisante de HIV.12. Composition of monoclonal antibodies, ^ characterized in that it is specifically reactive with a neutralizing region of HIV. 13. Composition suivant la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un anticorps monoclonal réactif avec un peptide bloquant de HIV. 3013. Composition according to claim 12, characterized in that it further comprises a monoclonal antibody reactive with an HIV blocking peptide. 30 14. Composition suivant l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la région neutralisante est située sur gpllO de HIV.14. Composition according to any one of claims 12 and 13, characterized in that the neutralizing region is located on gpl10 of HIV. 15. Composition suivant la revendication 14, 2^ caractérisée en ce que la région comprend la séquence 66 « » d'acides aminés d'environ 301 à 336 ou 308 à 328 de gpllO de HIV ou des homologues de ces séquences.15. Composition according to claim 14, 2 ^ characterized in that the region comprises the sequence 66 "" of amino acids of approximately 301 to 336 or 308 to 328 of HIV gp101 or of the homologs of these sequences. 16. Composition suivant la revendication 14, caractérisée en ce que la région neutralisante et le 5 peptide bloquant sont situés sur gpllO de HIV.16. Composition according to claim 14, characterized in that the neutralizing region and the blocking peptide are located on HIV gp101. 17. Composition suivant la revendication 16, caractérisée en ce que le peptide bloquant comprend la séquence d'acides aminés d'environ 190 à 197 de gpllO de HIV, ou des homologues de cette séquence. ^0 18.- Composition suivant l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la région neutralisante est située sur p25 de HIV.17. Composition according to claim 16, characterized in that the blocking peptide comprises the amino acid sequence of approximately 190 to 197 of HIV gp101, or homologues of this sequence. ^ 0 18.- Composition according to any one of claims 12 and 13, characterized in that the neutralizing region is located on p25 of HIV. 19. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) au moins un anticorps monoclonal réactif avec une région neutralisante de HIV et, (b) un peptide bloquant contenant au moins environ 5 acides aminés contigus provenant des séquences d'acides aminés de gpllO de HIV ci-après, ou de leurs homologues :19. Composition, characterized in that it comprises (a) at least one monoclonal antibody reactive with an HIV neutralizing region and, (b) a blocking peptide containing at least approximately 5 contiguous amino acids originating from the amino acid sequences of gpl10 of HIV below, or their counterparts: 20 IX (173) Y-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y', ou XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y' 2^ où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides aminés.20 IX (173) Y-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y ', or XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y '2 ^ where Y and Y', if present, each include an amino acid sequence of up to about 20 amino acids. 20. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un anticorps monoclonal spécifique pour 2Q une région neutralisante de HIV, et (b) un peptide bloquant contenant au moins 1'une des séquences d'acides aminés ci-après ou de leurs homologues : 35 » * 67 XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y', ou XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', ou 5 XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y', ou XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y' où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides aminés.20. Composition, characterized in that it comprises (a) a monoclonal antibody specific for 2Q an HIV neutralizing region, and (b) a blocking peptide containing at least one of the following amino acid sequences or their counterparts: 35 ”* 67 XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y ', or XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', or 5 XIII ( 189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y ', or XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y' where Y and Y ', if present, include each an amino acid sequence of up to about 20 amino acids. 21. Composition suivant l'une quelconque des revendications 19 et 20, caractérisée en ce que le 15 peptide bloquant définit au moins un déterminant antigénique capable de faire apparaître des anticorps par immunisation d'un hôte, les anticorps ainsi apparus étant protecteurs contre des infections par HIV.21. Composition according to any one of claims 19 and 20, characterized in that the blocking peptide defines at least one antigenic determinant capable of producing antibodies by immunization of a host, the antibodies thus appeared being protective against infections by HIV. 22. Composition suivant l'une quelconque des 20 revendications 19 à 21, caractérisée en ce que Y et/ou Y' comprennent un résidu de liaison choisi dans la classe formée essentiellement par la glycine, la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide glutamique et l'asparagine. 25 23.- Composition suivant l'une quelconque (»es revendications 19 à 22, caractérisée en ce que le peptide comprend un terminal amino acétylé et/ou un terminal carboxy amidé et/ou un acide aminé d.22. Composition according to any one of claims 19 to 21, characterized in that Y and / or Y ′ comprise a binding residue chosen from the class formed essentially by glycine, tyrosine, cysteine, lysine, l glutamic acid and asparagine. 23. Composition according to any one of claims 19 to 22, characterized in that the peptide comprises an acetylated amino terminal and / or an amidated carboxy terminal and / or an amino acid d. 24.- Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend 30 au moins environ 5 acides aminés contigus provenant de la séquence d'acides aminés de gpllO de HIV ci-après, ou de ses homologues : 35 68 * 3 XI (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile- Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. 524.- Peptide, characterized in that it comprises at least about 5 contiguous amino acids originating from the amino acid sequence of HIV gpl10 below, or from its counterparts: 35 68 * 3 XI (29a) Cys -Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile- Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly -Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. 5 25. Peptide suivant la revendication 24, caractérisé en ce que les acides aminés contigus définissent au moins un déterminant antigénique capable de faire apparaître des anticorps par immunisation d'un ^ hôte, ces anticorps étant protecteurs contre des infections par HIV.25. Peptide according to claim 24, characterized in that the contiguous amino acids define at least one antigenic determinant capable of producing antibodies by immunization of a host, these antibodies being protective against infections by HIV. 26. Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences d'acides aminés de gpllO de HIV ci- après ou de leurs homologues : 15 I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y', V (177)26. Peptide, characterized in that it comprises one of the following amino acid sequences of HIV gpl10 or of their counterparts: 15 I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg -Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y ', V (177) 20 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg- Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y', ou VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y', 25 où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides aminés.20 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg- Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y ', or VIII (110 -2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y ', 25 where Y and Y ', if present, each include an amino acid sequence of up to about 20 amino acids. 27. Peptide suivant la revendication 26, 30 caractérisé en ce que Y et/ou Y* comprennent un résidu de liaison choisi dans la classe formée essentiellement par la glycine, la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide glutamique et l'asparagine.27. Peptide according to claim 26, 30 characterized in that Y and / or Y * comprise a binding residue chosen from the class formed essentially by glycine, tyrosine, cysteine, lysine, glutamic acid and asparagine. 28. Séquences d'acides nucléiques, caracté-35 risées en ce qu'elles codent pour les peptides suivant » J 69 l'une quelconque des revendications 24 à 27.28. Nucleic acid sequences, characterized in that they code for the peptides according to “J 69 any one of claims 24 to 27. 29. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend un segment d'acides nucléiques d'environ 150 nucléotides ou moins codant pour un segment de 5 peptide bloquant de HIV. 30, - Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que le segment d'acides nucléiques code, en outre, pour un peptide d'une région neutralisante de HIV. 10 31.- Segment d'acides nucléiques d'environ 150 nucléotides ou moins, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide d'une région neutralisante de HIV.29. Composition, characterized in that it comprises a segment of nucleic acids of approximately 150 nucleotides or less encoding a segment of HIV blocking peptide. 30 - A composition according to claim 29, characterized in that the nucleic acid segment also codes for a peptide of an HIV neutralizing region. 10 31.- Segment of nucleic acids of approximately 150 nucleotides or less, characterized in that it codes for a peptide of an HIV neutralizing region. 32. Segment d'acides nucléiques suivant la revendication 31, caractérisé en ce qu'il code aussi 15 pour un peptide bloquant de HIV.32. Segment of nucleic acids according to claim 31, characterized in that it also codes for an HIV blocking peptide. 33. Segment d'acides nucléiques suivant l'une quelconque des revendications 31 et 32, caractérisé en ce que le peptide d'une région neutralisante comprend au moins environ 5 acides aminés provenant des acides 20 aminés 310 à 336 de gpllO de LAVgj^j, ou des séquences d'acides aminés 278 à 319 ou 315 à 363 de p25 de LAVbru» et des homologues de ces séquences.33. Segment of nucleic acids according to any one of claims 31 and 32, characterized in that the peptide of a neutralizing region comprises at least about 5 amino acids originating from amino acids 310 to 336 of gpl10 of LAVgj ^ j , or amino acid sequences 278 to 319 or 315 to 363 of p25 of LAVbru "and homologues of these sequences. 34. Jeu de sondes, à utiliser pour des tests de diagnostic par hybridation, caractérisé en ce qu'il 25 comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques codant pour les peptides mentionnés au tableau I.34. Set of probes, to be used for diagnostic tests by hybridization, characterized in that it comprises at least two nucleic acid sequences coding for the peptides mentioned in Table I. 35. Vaccin contre une infection par HIV, caractérisé en ce qu'il comprend une dose immunologi-quement efficace d'un ou plusieurs peptides de moins 30 d'environ 50 acides aminés contenant des régions neutralisantes de gpllO et/ou de p25, ces peptides étant mélangés avec un excipient physiologiquement acceptable.35. Vaccine against an HIV infection, characterized in that it comprises an immunologically effective dose of one or more peptides of less than approximately 50 amino acids containing neutralizing regions of gpl10 and / or p25, these peptides being mixed with a physiologically acceptable excipient. 36. Vaccin suivant la revendication 35, 35 caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins * 4 70 environ 5 acides aminés d'un peptide bloquant.36. Vaccine according to claim 35, 35 characterized in that it further comprises at least * 4 70 approximately 5 amino acids of a blocking peptide. 37. Vaccin suivant l'une quelconque des revendications 35 et 36, caractérisé en ce que les peptides sont conjugués avec un support immunogénique. 537. Vaccine according to any one of claims 35 and 36, characterized in that the peptides are conjugated with an immunogenic support. 5 38. Lignée cellulaire immortalisée, caractérisée en ce qu'elle produit un anticorps monoclonal capable de réagir avec un déterminant antigénique de la glycoprotéine gpllO de l'enveloppe contenu dans une région neutralisante ou un peptide bloquant de HIV.38. Immortalized cell line, characterized in that it produces a monoclonal antibody capable of reacting with an antigenic determinant of the envelope glycoprotein gpl10 contained in a neutralizing region or an HIV blocking peptide. 39. Les lignées cellulaires HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2, HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5, HIV-gpllO-6, HIV-p25-6 et HIV-p25-7.39. The cell lines HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2, HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5, HIV-gpllO-6, HIV-p25-6 and HIV-p25 -7. 40. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée cellulaire suivant l'une quelconque des revendications 38 et 39.40. Monoclonal antibody, characterized in that it is produced by a cell line according to any one of claims 38 and 39. 41. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il est capable de réagir avec un déterminant antigènique de la glycoprotéine gpllO de l'enveloppe de HIV. 20 42.- Anticorps monoclonal, capable de réagir spécifiquement avec un déterminant antigénique de HIV, caractérisé en ce qu'il bloque la liaison d'un anticorps produit par les lignées cellulaires suivant l'une quelconque des revendications 38 et 39. 25 43.- Procédé pour engendrer des lignées cellulaires qui produisent des anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques de gpllO de HIV, caractérisé en ce qu'il comprend : l'administration à un hôte d'une quantité 20 immunogénique d'une préparation antigénique enrichie en protéines de HIV, l'observation, chez l'hôte, immunisé de la production d'anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques de gpllO, 35 l'obtention, à partir de l'hôte, de cellules » » 71 productrices d'anticorps et l'immortalisation de ces cellules, la sélection des cellules immortalisées qui produisent des anticorps à l'égard de gpllO de HIV, et ^ le clonage des cellules immortalisées pour produire les lignées cellulaires,41. Monoclonal antibody, characterized in that it is capable of reacting with an antigenic determinant of the glycoprotein gpl10 of the HIV envelope. 42. Monoclonal antibody capable of reacting specifically with an antigenic determinant of HIV, characterized in that it blocks the binding of an antibody produced by the cell lines according to any one of claims 38 and 39. 25 43. - Method for generating cell lines which produce antibodies reactive with antigenic determinants of HIV gpl10, characterized in that it comprises: the administration to an host of an immunogenic amount of an antigenic preparation enriched in proteins of HIV, the observation, in the host, immunized of the production of antibodies reactive with antigenic determinants of gpl10, the obtaining, from the host, of cells "» 71 producing antibodies and the immortalization of these cells, selection of the immortalized cells which produce antibodies against HIV gp101, and the cloning of the immortalized cells to produce the cell lines, 44. Procédé suivant la revendication 43, caractérisé en ce que les protéines de HIV sont des protéines de fusion recombinantes exprimées par un hôte eucaryote ou bactérien, ou bien les protéines de HIV sont obtenues à partir d'un extrait ou lysat de HIV.44. Method according to claim 43, characterized in that the HIV proteins are recombinant fusion proteins expressed by a eukaryotic or bacterial host, or else the HIV proteins are obtained from an HIV extract or lysate. 45. Procédé pour diagnostiquer la présence de HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un anticorps monoclonal capable de réagir avec gpllO de HIV contenu dans le dit échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre 1'anticorps monoclonal et le 20 déterminant antigénique dans l'échantillon biologique, et partant la détermination de la présence ou de l'absence de HIV dans l'échantillon.45. A method for diagnosing the presence of HIV in a biological sample, characterized in that it comprises: the incubation of a monoclonal antibody capable of reacting with gpl10 of HIV contained in said biological sample, and the detection of the presence immune complexes formed between the monoclonal antibody and the antigenic determinant in the biological sample, and therefore determining the presence or absence of HIV in the sample. 46. Procédé suivant la revendication 45, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est 25 capable de réagir avec une région neutralisante ou un peptide bloquant de gpllO.46. The method of claim 45, characterized in that the monoclonal antibody is capable of reacting with a neutralizing region or a gpl10 blocking peptide. 47. Procédé pour diagnostiquer la présence d'anticorps contre HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : 50 l'incubation d'un peptide provenant d'une région neutralisante de gpllO ou p25 de HIV avec le dit échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre le peptide et les anticorps de 55 l'échantillon réactifs avec le peptide, et partant la * > 72 détermination de la présence ou de l'absence de HIV dans l'échantillon.47. A method for diagnosing the presence of antibodies against HIV in a biological sample, characterized in that it comprises: 50 the incubation of a peptide originating from a neutralizing region of gpl10 or p25 of HIV with said biological sample , and detecting the presence of immune complexes formed between the peptide and the antibodies in the sample reactive with the peptide, and therefore determining the presence or absence of HIV in the sample. 48. Procédé pour diagnostiquer la présence de HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce g qu'il comprend : l'incubation, dans des conditions d'hybridation, d'un segment d'acide nucléique codant au moins pour une partie d'une région neutralisante de HIV avec l'acide nucléique que contient l'échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes hybrides formés entre le segment d'acide nucléique et l'acide nucléique de l'échantillon, et partant la détermination de la présence ou de 1 ' absence de HIV dans l'échantillon. 15 , ,48. A method for diagnosing the presence of HIV in a biological sample, characterized in that it comprises: the incubation, under hybridization conditions, of a nucleic acid segment coding at least for part of an HIV neutralizing region with the nucleic acid contained in the biological sample, and the detection of the presence of hybrid complexes formed between the nucleic acid segment and the nucleic acid of the sample, and therefore the determination of the presence or absence of HIV in the sample. 15,, 49. Procédé pour déterminer une souche de HIV chez un hôte infecté, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un échantillon biologique prélevé chez l'hôte avec un peptide provenant d'une 20 région neutralisante de HIV, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre le peptide et des anticorps de l'échantillon, et partant la détermination de la souche de HIV infectant l'hôte. 2549. A method for determining a strain of HIV in an infected host, characterized in that it comprises: incubating a biological sample taken from the host with a peptide originating from a neutralizing region of HIV, and the detecting the presence of immune complexes formed between the peptide and antibodies in the sample, and therefore determining the strain of HIV infecting the host. 25 50. Composition a utiliser pour le traitement d'un patient suspecté d'avoir été exposé à HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeu tiquement ou immunologiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal réactif avec une région neutra-30 lisante de HIV.50. Composition to be used for the treatment of a patient suspected of having been exposed to HIV, characterized in that it comprises a therapeutically or immunologically effective dose of at least one monoclonal antibody reactive with a neutralizing region of HIV. 51. Trousse à utiliser pour le traitement d'un patient suspecté d'avoir été exposé à HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeu tiquement ou prophylactiquement efficace d'un ou 35 * ' * 73 plusieurs anticorps monoclonaux réactifs avec une région neutralisante de HIV, des peptides bloquants capables d'atténuer le pouvoir infectieux de HIV et/ou des anticorps monoclonaux réactifs avec les peptides 5 bloquants.51. Kit to be used for the treatment of a patient suspected of having been exposed to HIV, characterized in that it comprises a therapeutically or prophylactically effective dose of one or 35 * '* 73 several monoclonal antibodies reactive with a HIV neutralizing region, blocking peptides capable of attenuating the infectious power of HIV and / or monoclonal antibodies reactive with the blocking peptides. 52. Trousse suivant la revendication 51, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal réactif avec la région neutralisante de HIV est produit par une lignée cellulaire portant la désignation ATCC HB 9405 10 et un peptide bloquant est le peptide T ou un dérivé, ou analogue de celui-ci.52. Kit according to claim 51, characterized in that the monoclonal antibody reactive with the neutralizing region of HIV is produced by a cell line bearing the designation ATCC HB 9405 10 and a blocking peptide is the T peptide or a derivative, or the like of it. 53. Composition à utiliser pour le traitement d'un patient infecté par HIV après détermination de la souche de HIV par le procédé suivant la revendi- ^5 cation 49, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec une région neutralisante de la souche de HIV.53. Composition to be used for the treatment of a patient infected with HIV after determination of the strain of HIV by the method according to claim 49, characterized in that it comprises a monoclonal antibody specifically reactive with a neutralizing region of the HIV strain. 54. Composition à utiliser pour vacciner un patient contre des infections par HIV, caractérisée en 2Q ce qu'elle comprend une dose immunologiquement efficace d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique, l'anticorps étant spécifiquement réactif avec un idiotype d'un second anticorps monoclonal capable de se fixer sur une région neutralisante de HIV. 25 30 3554. Composition to be used for vaccinating a patient against HIV infections, characterized in 2Q that it comprises an immunologically effective dose of an anti-idiotypic monoclonal antibody, the antibody being specifically reactive with an idiotype of a second antibody monoclonal capable of binding to a neutralizing region of HIV. 25 30 35