FR2646854A1 - Antigens of the envelope transmembrane glycoprotein of a HIV-2 type human retrovirus, antigens exhibiting an immunological relationship with them - Google Patents
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Abstract
Description
ANTIGENES DE LA GLYCOPROTEINE TRANSMEMBRANAIRE
D'ENVELOPPE D'UN RETROVIRUS HUMAIN DU TYPE HIV-2
ANTIGENES PRESENTANT AVEC EUX UNE PARENTE
IMMUNOLOGIQUE
L'invention concerne des antigènes de la glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe d'un rétrovirus humain du type HIV-2, des antigènes présentant avec eux une parenté immunologique et plus précisément des antigènes présents exclusivement lors de certaines phases de l'évolution in vivo d'une infection due à un rétrovirus humain HIV-2. Ces antigènes sont caractéristiques du processus de formation et de maturation de la glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe de ce rétrovirus, et sont en conséquence impliqués dans le développement et la prolifération du rétrovirus HIV-2 et partant dans la propagation de l'infection.ANTIGENS OF TRANSMEMBRANE GLYCOPROTEIN
OF ENVELOPE OF A HUMAN RETROVIRUS OF THE HIV-2 TYPE
ANTIGENS PRESENTING WITH THEM A PARENT
IMMUNE
The invention relates to antigens of the envelope transmembrane glycoprotein of a human retrovirus of the HIV-2 type, antigens presenting with them an immunological relationship and more specifically antigens present exclusively during certain phases of the in vivo evolution of the invention. an infection due to a human retrovirus HIV-2. These antigens are characteristic of the process of formation and maturation of the envelope transmembrane glycoprotein of this retrovirus, and are therefore involved in the development and proliferation of the HIV-2 retrovirus and hence in the propagation of the infection.
L'invention a également trait à des anticorps reconnaissant ces antigènes, ainsi qu'a des compositions immunogènes contenant ces anticorps. The invention also relates to antibodies recognizing these antigens, as well as to immunogenic compositions containing these antibodies.
L'invention concerne en outre la préparation des antigènes précédents, ainsi que leur utilisation pour le diagnostic d'une infection due à un rétrovirus humain HIV-2. The invention further relates to the preparation of the above antigens, as well as their use for the diagnosis of an infection due to a human HIV-2 retrovirus.
Des agents étiologiques responsables du développement de syndrômes de lymphadénopathies (dont l'abréviation anglaise est LAg ou . concourant au développement de ces syndrômes ou responsables du développement de syndrômes d'immunodéficîence acquise (SIDA) ont été isolés, identifiés et caractérisés. Etiological agents responsible for the development of lymphadenopathy syndromes (the English abbreviation of which is the development of these syndromes or responsible for the development of acquired immunodeficiency syndromes (AIDS) have been isolated, identified and characterized.
On a désigné par HIV (abréviation anglaise de
Human Immunodeficiency Virus) plusieurs rétrovirus humains susceptibles, dans certaines conditions, de provoquer un SLA éventuellement relayé par un SIDA chez l'homme.It has been designated by HIV (abbreviation of
Human Immunodeficiency Virus) several human retroviruses likely, under certain conditions, to cause ALS possibly relayed by AIDS in humans.
Ainsi un premier virus dénommé LAV-I ou HIV-1 a été isolé et décrit dans la deaande de brevet
GB.83/24.800 et une demande EP.84/401.834 du 14/09/84.Thus a first virus called LAV-I or HIV-1 has been isolated and described in the patent application.
GB.83 / 24.800 and an application EP.84 / 401.834 of 14/09/84.
Ce virus a également été décrit par F.Barre Sinoussi et al. (1).This virus has also been described by F. Barre Sinoussi et al. (1).
Des variants de ce virus H-IV-1 désignés par LAV
ELI et LAV MAL, ont également été isolés, caractérisés et décrits dans la demande de brevet EP.84/401.834.Variants of this virus H-IV-1 designated by LAV
ELI and LAV MAL, have also been isolated, characterized and described in the patent application EP.84 / 401.834.
L'isolement et la caractérisation de rétrovirus appartenant à une classe distincte et n'ayant qu'une parenté immunologique réduite avec les précédents, ont été décrits dans la demande de brevet européen nO 87/400.151.4. publiée sous le nO 239.425.- Ces rétrovirus qui ont été regroupés sous la désignation
HIV-2, ont été isolés chez plusieurs malades africains présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un SIDA.The isolation and characterization of retroviruses belonging to a distinct class and having only a reduced immunological relationship with the previous ones have been described in European Patent Application No. 87 / 400.151.4. published under No. 239,425. These retroviruses which have been grouped under the designation
HIV-2, have been isolated from several African patients with symptoms of lymphadenopathy or AIDS.
L'étude de ces rétrovirus HIV l'isolement et l'analyse de leurs séquences nucléotidiques, ainsi que la caractérisation de leurs protéines antigéniques a permis d'effectuer des études de comparaison entre les différentes souches obtenues, au niveau de leur parenté ou au contraire de leur spécificité, tant structurales que fonctionnelles. The study of these HIV retroviruses the isolation and analysis of their nucleotide sequences, as well as the characterization of their antigenic proteins made it possible to carry out comparative studies between the different strains obtained, at the level of their relatives or on the contrary their specificity, both structural and functional.
Ces rétrovirus HIV-l et HIV-2 ont également été étudiés en comparaison avec un rétrovirus d'origine simienne (désigné par l'abréviation SIV ou STLV-IIÍ) et cette étude a permis de montrer une certaine parenté entre les protéines et glycoprotéines du rétrovirus HIV-2 et de ses variants et celles du rétrovirus SIV. These retroviruses HIV-1 and HIV-2 were also studied in comparison with a retrovirus of simian origin (designated by the abbreviation SIV or STLV-III) and this study made it possible to show a certain relationship between the proteins and glycoproteins of the retrovirus HIV-2 and its variants and those of retrovirus SIV.
Une parenté est notamment remarquée au niveau de la protéine d'enveloppe de chacun de ces virus On a en effet mis en évidence des réactions immunologiques croisées entre la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus SIV et des anticorps dirigés contre la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2, alors que cette réaction de croisement immunologique ne se produit pas entre le rétrovirus SIV et le rétrovirus
HIV-1 ni entre les rétrovirus HIV-1 et HIV-2. A kinship is noted in particular at the level of the envelope protein of each of these viruses. Cross-immunological reactions between the envelope glycoprotein of the SIV retrovirus and antibodies directed against the envelope glycoprotein of the retrovirus have indeed been demonstrated. HIV-2, whereas this immunological crossover reaction does not occur between the SIV retrovirus and the retrovirus
HIV-1 or between HIV-1 and HIV-2 retroviruses.
Des résultats concernant la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2 codée par le gène env du génome de ce rétrovirus ont été donnés- dans la demande de brevet européen n 87/400.151.4. précitée. Results concerning the HIV-2 retrovirus envelope glycoprotein encoded by the env gene of the retrovirus genome have been given in European Patent Application No. 87 / 400.151.4. supra.
Dans cette demande de brevet EP, cette glycoprotéine a été désignée par l'abréviation gp140 par référence à son poids moléculaire d'environ 140.000d. Il était précisé toutefois que le calcul du poids moléculaire était apprécié à +10*. Dans une demande de brevet
France précédente (nO 86/03881 publiée sous le n 2.596.063) un précurseur de la gp140 désigné par gpl60 (poids moléculaire de 160Kd +10%) avait également été décrit.In this EP patent application, this glycoprotein has been designated by the abbreviation gp140 with reference to its molecular weight of about 140,000d. It was specified however that the calculation of the molecular weight was appreciated at + 10 *. In a patent application
Previous France (No. 86/03881 published under No. 2,596,063) a precursor of gp140 designated gp160 (molecular weight 160Kd + 10%) was also described.
Des investigations plus poussées relatives a la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2-ont été conduites et ont permis aux inventeurs de réaliser d'autres mesures des poids moléculaires donnés jusqu'à présent et en conséquence d'affiner les résultats, à partir des intervalles de poids moléculaires décrits ci-dessus. La glycoprotéine externe d'enveloppe présente. dans les particules virales de HIV-2 -dans les conditions opératoires de la présente inventionun PM d'environ 125000d (elle sera désignée par gp125). Dans ces mêmes conditions opératoires, le précurseur déjà mis en évidence et désigné par gp160 dans la demande de brevet FR.86/03881 a, selon les derniers résultats obtenus, un poids moléculaire d'environ 140000d. Il sera donc mentionné par "gp140" dans la présente demande de brevet. Further investigations relating to the envelope glycoprotein of the HIV-2 retrovirus have been conducted and have allowed the inventors to carry out further measurements of the molecular weights given so far and consequently to refine the results, from molecular weight ranges described above. The outer envelope glycoprotein presents. in the viral particles of HIV-2 under the operating conditions of the present invention an MW of about 125,000d (it will be designated gp125). Under these same operating conditions, the precursor already identified and designated by gp160 in the patent application FR.86 / 03881 has, according to the latest results obtained, a molecular weight of about 140000d. It will therefore be referred to as "gp140" in this patent application.
Jusqu'à présent, l'existence de plusieurs phases de développement conduisant à l'obtention de glycoprotéines d'enveloppe sous une forme nature, ces glycoprotéines d'enveloppe matures comprenant une glycoprotéine externe d'enveloppe, gpl25 et une glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe gp36 a été mise en évidence différents stades dans le déroulement du cycle de réplication virale apparaissant lorsque des troubles pathogènes se développent à la suite d'une infection par un rétrovirus humain HIV-2 ont été identifiés a cet égard. Up to now, the existence of several development phases leading to the production of envelope glycoproteins in a natural form, these mature envelope glycoproteins comprising an outer envelope glycoprotein, gp125 and a transmembrane envelope glycoprotein gp36 has been identified various stages in the course of viral replication cycle occurring when pathogenic disorders develop as a result of infection with a human retrovirus HIV-2 have been identified in this regard.
Des premiers résultats concernant l'existence. et la caractérisation d'un précurseur de la glycoprotéine externe d'enveloppe gp300 de HIV-2 ont été obtenus. First results concerning existence. and the characterization of a precursor of the outer envelope glycoprotein gp300 of HIV-2 were obtained.
Cette glycoprotéine a été décrite dans une publication (29). Pour les besoins de la description, il sera fait référence dans la suite a cette glycoprotéine qui sera désignée par gp300. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence et caractérisé une nouvelle glycoprotéine intervenant dans le cycle viral de HIV-2.This glycoprotein has been described in a publication (29). For the purposes of the description, reference will be made hereinafter to this glycoprotein which will be designated gp300. The inventors have now demonstrated and characterized a new glycoprotein involved in the viral cycle of HIV-2.
En parallèle, ils ont conduit des études similaires sur les cycles viraux des rétrovirus HIV-1 et SIV. Ces dernières études ont permis la mise en évidence de nouvelles propriétés très spécifiques communes aux rétrovirus HIV-2 èt SIV et au contraire apparemment inexistentes lors du cycle de réplication virale de HIV-1. In parallel, they conducted similar studies on viral cycles of HIV-1 and SIV retroviruses. These latest studies have revealed new, very specific properties common to HIV-2 and SIV retroviruses and, on the contrary, apparently non-existent during the viral replication cycle of HIV-1.
L'invention concerne donc de nouveaux moyens pour détecter une infection due à un rétrovirus humain
HIV-2 ou a un virus apparenté, ainsi que pour caractérier l'appartenance d'un rétrovirus au type des rétrovirus humains HIV-2. The invention thus relates to new means for detecting an infection due to a human retrovirus
HIV-2 or a related virus, as well as to characterize the membership of a retrovirus to the type of human retrovirus HIV-2.
Au vu des résultats obtenus, le cycle viral propre aux rétrovirus HIV-2 et SIV apparait comme un processus complexe de réactions en chaîne dont l'ensemble seul pourrait conduire à la formation des glycoprotéines d'enveloppe du rétrovirus HIV-2 sous leur forme définitive. Lors de ce processus, de nouvelles protéines ou glycoprotéines antigéniques ont pu être reconnues, isolées et identifiées;
L'invention est donc relative à des glycoprotéines antigéniques produites à la suite d'une infection par un rétrovirus humain HIV-2, présentant une ossature peptidique en commun avec la glycoprotéine transmembranaire gp36 et susceptible d'être dissociée lors du déroulement du cycle viral, en deux glycoprotéines transmembranaires gp36.In view of the results obtained, the viral cycle specific to HIV-2 and SIV retroviruses appears to be a complex process of chain reactions, the whole of which alone could lead to the formation of envelope glycoproteins of the HIV-2 retrovirus in their definitive form. . During this process, new antigenic proteins or glycoproteins could be recognized, isolated and identified;
The invention therefore relates to antigenic glycoproteins produced as a result of infection with a human HIV-2 retrovirus, having a peptide backbone in common with the transmembrane glycoprotein gp36 and capable of being dissociated during the course of the viral cycle, in two gp36 transmembrane glycoproteins.
Une telle glycoprotéine, sous forme dimérisée correspondrait à la forme et à la conformation optimales et permettrait la fusion de la membrane virale avec la membrane cellulaire. Such a glycoprotein in dimerized form would correspond to the optimal shape and conformation and would allow fusion of the viral membrane with the cell membrane.
L'invention concerne donc une glycoprotéine antigénique gp80 caractérisée par les propriétés suivantes - elle a un poids moléculaire (PM) voisin de 80 kDa, - elle est reconnue par des- anticorps polyclonaux dirigés contre la glycoprotéine gp300 - elle comprend en association sous forme d'un dimère, deux entités de la ' glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe gp36 codée par le génome d'un rétrovirus humain du type HIV-2, susceptible de provoquer un SLA ou un SIDA chez l'homme, ou - toute glycoprotéine de poids moléculaire du même ordre de grandeur, capable de former un complexe inunologique du type antigène-anticorps, avec des anticorps dirigés contre ladite gp80. The invention therefore relates to a gp80 antigenic glycoprotein characterized by the following properties - it has a molecular weight (MW) of about 80 kDa, - it is recognized by polyclonal antibodies directed against the glycoprotein gp300 - it comprises in combination in the form of a dimer, two entities of the gp36 envelope transmembrane glycoprotein encoded by the genome of a human retrovirus of the HIV-2 type, capable of causing ALS or AIDS in humans, or any molecular weight glycoprotein of the same order of magnitude, capable of forming an immunological antigen-antibody complex, with antibodies directed against said gp80.
La glycoprotéine gp300 ci-dessus est la glycoprotéine décrite dans (13), elle a un poids moléculaire d'environ 300KDa et est constituée par l'association de deux unités d'une glycoprotéine gp140 précurseur notamment de la glycoprotéine d'enveloppe gp125 codée par le gène env du génome d'un rétrovirus humain HIV-2 susceptible de provoquer un SLA ou un
SIDA,
Après lavoir isolée et caractérisée les inventeurs ont mis en évidence que le sérum de malades positifs pour les antigènes de HIV-2 reconnaissent la glycoprotéine gp80 dans des extraits cellulaires, ou dans des extraits viraux. La gp80 est un produit mature de la glycoprotéine transmembranaire, constituant une étape nécessaire pour la formation des particules virales infectieuses voire pathogènes.Les inventeurs ont donc déterminé qu'en bloquant le cycle viral normal de formation des particules du type
HIV-2, notamment au niveau de la formation ou de la dissociation de la gap80, il est possible d'intervenir sur la propagation de l'infection. Un tel bloquage de l'infection pourrait être dopéré en utilisant de la castanospermine, capable d'inhiber la saturation de la glycoprotéine gp80,
La glycoprotéine gp80 selon l'invention est encore caractérisée par les propriétés suivantes - elle peut être associée à des cellules infectées par un rétrovirus humain du type HIV-2 ou/et à des virions ou/et å des virus du type HIV-2, - elle n'est pas dissociée in vitro en présence de détergent non ionique tel que le Triton X-100 1% et elle est dissociée in vitro pour former la glycoprotéine transmembranaire gp36 d'un rétrovirus du type HIV-2, en présence de détergent ionique tel que le SDS 1 à pH faiblement acide, - elle peut être purifiée sur colonne d'immunoaffinité
HIV-2 sérum Sepharose et elle apparaît (lors d'une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide), 3 à 4 heures après le début du marquage des cellules infectées.The glycoprotein gp300 above is the glycoprotein described in (13), it has a molecular weight of about 300KDa and is constituted by the combination of two units of a precursor gp140 glycoprotein including the gp125 envelope glycoprotein encoded by the env gene of the genome of a human HIV-2 retrovirus capable of causing ALS or
AIDS,
After being isolated and characterized, the inventors have demonstrated that the serum of patients who are positive for the HIV-2 antigens recognize the glycoprotein gp80 in cell extracts, or in viral extracts. Gp80 is a mature product of the transmembrane glycoprotein, constituting a necessary step for the formation of infectious or even pathogenic viral particles. The inventors have therefore determined that by blocking the normal viral cycle of formation of the particles of the type
HIV-2, especially in the formation or dissociation of the gap80, it is possible to intervene on the spread of the infection. Such a blockage of the infection could be doped using castanospermine, capable of inhibiting the saturation of the gp80 glycoprotein,
The gp80 glycoprotein according to the invention is further characterized by the following properties: it may be associated with cells infected with a human retrovirus of the HIV-2 type or / and with virions or / and with viruses of the HIV-2 type, it is not dissociated in vitro in the presence of nonionic detergent such as Triton X-100 1% and is dissociated in vitro to form the transmembrane glycoprotein gp36 of a retrovirus of the HIV-2 type, in the presence of detergent ionic such as SDS 1 with weakly acidic pH, - it can be purified on an immunoaffinity column
HIV-2 serum Sepharose and it appears (during a polyacrylamide gel electrophoresis analysis), 3 to 4 hours after the beginning of the labeling of the infected cells.
Entrent également dans le cadre de l'invention des protéines dérivées de la glycoprotéine gp80 définie ci-dessus et caractérisées en ce qu'elles correspondent a l'ossature peptidique non-glycosylée de cette glycoprotéine gp80. Also within the scope of the invention are proteins derived from the glycoprotein gp80 defined above and characterized in that they correspond to the non-glycosylated peptide backbone of this glycoprotein gp80.
Cette protéine, dépourvue des groupes de glycosylation de la gp80 est intéressante dans le cadre de l'invention, pour les propriétés qu'elle possède en commun avec la. gp80. This protein, which lacks the glycosylation groups of gp80, is interesting in the context of the invention for the properties it possesses in common with the. gp80.
Les études parallèles du cycle viral du rétrovirus simien SIV et du rétrovirus HIV-1 ont montré que le cycle de SIV comporte une étape de dimérisation sous forme d'une glycoprotéine gp65 d'un poids moléculaire d'environ 65 kDa, pouvant conduire a la formation de deux glycoprotéines transmembranaires d'enveloppe gp32. Parallel studies of the viral cycle of the simian SIV retrovirus and the HIV-1 retrovirus have shown that the SIV cycle includes a dimerization step in the form of a gp65 glycoprotein with a molecular weight of about 65 kDa, which can lead to formation of two gp32 envelope transmembrane glycoproteins.
En revanche, ce processus de dimérisation de la glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe n'a pas été observé dans des échantillons biologiques infectés par HIV-l. In contrast, this process of dimerization of envelope transmembrane glycoprotein was not observed in biological samples infected with HIV-1.
L'obtention d'une forme dimérisée, de la glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe pourrait donc être associée à une infection spécifique par un rétrovirus du type HIV-2 ou un rétrovirus présentant une parenté immunologique avec ce dernier. Cette glycoprotéine constitue donc un moyen particulièrement adapté de détection d'une infection spécifique due au rétrovirus HIV-2 ou d'un rétrovirus apparenté. Obtaining a dimerized form of the envelope transmembrane glycoprotein could therefore be associated with a specific infection by a retrovirus of the HIV-2 type or a retrovirus having an immunological relationship with the latter. This glycoprotein therefore constitutes a particularly suitable means for detecting a specific infection caused by the HIV-2 retrovirus or a related retrovirus.
L'invention a également trait a des anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant spécifiquement d'une part, la gp300, la gp140, la gp125 et la gp80, présentes dans des cellules infectées par un rétrovirus du type HIV-2, d'autre part, la gp125, la gp80 et la gp3-6 présentes dans des extraits de rétrovirus du type HIV-2 et ne reconnaissant pas les protéines-au glycoprotéines de cellules saines ou de cellules infectées par un rétrovirus du type HIV-1. The invention also relates to polyclonal or monoclonal antibodies specifically recognizing, on the one hand, gp300, gp140, gp125 and gp80, present in cells infected with an HIV-2 retrovirus, on the other hand, gp125, gp80 and gp3-6 present in extracts of retrovirus type HIV-2 and not recognizing the protein-glycoproteins of healthy cells or cells infected with a retrovirus type HIV-1.
Entrent également dans le cadre de l'invention des anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils réagissent spécifiquement avec la glycoprotéine gp80 et qu'ils -ne réagissent pas avec les protéines de cellules infectées par un rétrovirus du type HIV.-1 ou avec des agrégats viraux de HIV-1. Also within the scope of the invention are monoclonal antibodies, characterized in that they specifically react with the gp80 glycoprotein and they do not react with the HIV-1 or type-retrovirus-infected cell proteins. viral aggregates of HIV-1.
Un autre anticorps monoclonal selon l'invention est caractérisé en ce qu'il reconnaît en outre les glycoprotéines gp300, gp140 et gp36 de HIV-2. Another monoclonal antibody according to the invention is characterized in that it further recognizes the glycoproteins gp300, gp140 and gp36 of HIV-2.
De façon particulièrement avantageuse, un troisième anticorps monoclonal conforme aux définitions précédentes est caractérisé en ce qu'il reconnaît un épitope commun à la glycoprotéine gp80, et à la séquence d'acides aminés suivante du peptide p39' :
VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH
L'invention vise aussi des anticorps dirigés contre la protéine dérivée de la gp8O et dépourvue des groupes glycosylés.Particularly advantageously, a third monoclonal antibody according to the preceding definitions is characterized in that it recognizes an epitope common to the glycoprotein gp80, and to the following amino acid sequence of the peptide p39 ':
VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH
The invention also relates to antibodies directed against the protein derived from gp8O and lacking glycosyl groups.
Les anticorps monoclonaux ci-dessus peuvent avoir des propriétés immunogènes et neutralisantes, et en agissant sur le processus de formation de la gp80, ils peuvent interrompre la prolifération du rétrovirus HIV.2
Plusieurs méthodes pour la production des anticorps précédents peuvent convenir dans le cadre de la réalisation de l'invention. Par exemple, on aura recours à des cultures en ascite chez les animaux, notamment chez les rongeurs comme le nurin. On pourra également produire les anticorps à partir de cultures cellulaires soit immobilisées ou encapsulées ou encore en suspension. On utilisera notamment la technique des hybridomes obtenus à partir de la fusion de lymphocytes d'un animal auquel on aura préalablement inoculé le rétrovirus HIV-2.Des lymphocytes de l'animal infecté sont alors prélevés et fusionnés avec des cellules myélomateuses choisies, pour former des hybrides, sélectionnés ensuite pour leur capacité à produire des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines et glycoprotéines antigéniques décrites plus haut.The above monoclonal antibodies can have immunogenic and neutralizing properties, and by acting on the formation process of gp80, they can interrupt the proliferation of the HIV retrovirus.
Several methods for the production of the above antibodies may be suitable for carrying out the invention. For example, we will use ascites cultures in animals, especially rodents like nurin. The antibodies can also be produced from cell cultures either immobilized or encapsulated or in suspension. In particular, the hybridoma technique obtained from the fusion of lymphocytes of an animal inoculated with the HIV-2 retrovirus will be used. Lymphocytes of the infected animal are then removed and fused with selected myeloma cells to form hybrids, subsequently selected for their ability to produce specific antibodies directed against the antigenic proteins and glycoproteins described above.
Un procédé de préparation préféré, des anticorps monoclonaux de l'invention comprend les étapes suivantes - immunisation de souris type BALB-C si besoin à plusieurs reprises par injection intrapéritonéale avec la glycoprotéine gp80 purifiée, - fusion de cellules de souris immunisées, notamment de cellules de rate avec des cellules myélomateuses, par exemple des cellules de type NS1, selon la méthode de Kohler et Milstein (10), - sélection et récupération des hybridômes producteurs des anticorps nonoclonaux recherchés. A preferred method of preparation, monoclonal antibodies of the invention comprises the following steps - immunization of BALB-C-type mice if necessary several times by intraperitoneal injection with the purified gp80 glycoprotein, - fusion of cells of immunized mice, in particular cells spleen with myeloma cells, for example NS1-type cells, according to the method of Kohler and Milstein (10), - selection and recovery of the hybridomas producing the desired non-monoclonal antibodies.
Le criblage des hybridômes en vue de sélectionner ceux d'entre eux qui conduisent à la production des anticorps monoclonaux recherchés, peut être réalisé en utilisant des tests RIPA ou des analyses Western Blot. The screening of the hybridomas for the purpose of selecting those which lead to the production of the desired monoclonal antibodies can be carried out using RIPA tests or Western Blot analyzes.
Des anticorps monoclonaux spécifiquement adaptés à la réalisation de l'invention seront obtenus par l'une des méthodes ci-dessus décrites et leurs propriétés vis-à-vis de la gp80 ou d'une protéine analogue répondant aux définitions ci-dessus pourront être testées par comparaison avec les résultats décrits avec l'anticorps monoclonal 1H8 (Mab 1H8). Monoclonal antibodies specifically adapted to the embodiment of the invention will be obtained by one of the methods described above and their properties vis-à-vis gp80 or a similar protein meeting the definitions above may be tested compared with the results described with the monoclonal antibody 1H8 (Mab 1H8).
L'invention vise également des hybridômes producteurs des anticorps monoclonaux décrits précédemment. The invention also relates to hybridomas producing the monoclonal antibodies described above.
Ces anticorps monoclonaux produits seront par exemple utilisés pour inactiver les protéines et/ou glycoprotéines avec lesquelles ils forment un complexe immunologique ou encore pour leur capacité à empêcher le déroulement normal de la formation des glycoprotéines finales de l'enveloppe de HIV-2. These monoclonal antibodies produced will, for example, be used to inactivate the proteins and / or glycoproteins with which they form an immunological complex or for their ability to prevent normal formation of the final glycoproteins of the HIV-2 envelope.
Une autre application éventuelle de ces anticorps consisterait par-exemple dans la détection d'antigènes viraux dans des préparations biologiques ou encore dans la purification de protéines et/ou glycoprotéines par exemple sur colonne d'affinité. Another possible application of these antibodies would consist, for example, in the detection of viral antigens in biological preparations or in the purification of proteins and / or glycoproteins, for example on an affinity column.
Ayant mis en évidence l'existence de la gp80 et après l'avoir isolée et caractérisée, les inventeurs ont mis au point des moyens pour effectuer le diagnostic d'une infection due à un rétrovirus humain du type HIV-2. Having demonstrated the existence of gp80 and after having isolated and characterized, the inventors have developed means for performing the diagnosis of an infection due to a human retrovirus type HIV-2.
A cet effet l'invention concerne une composition antigénique pour le diagnostic spécifique invitro d'une infection due à un rétrovirus humain du type
HIV-2, dans un échantillon biologique susceptible de contenir des anticorps formés après ladite infection, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la glycoprotéine gp80 définie dans les pages précédentes.For this purpose, the invention relates to an antigenic composition for the specific diagnosis of an infection caused by a human retrovirus of the type
HIV-2, in a biological sample capable of containing antibodies formed after said infection, characterized in that it comprises at least the glycoprotein gp80 defined in the preceding pages.
L'échantillon biologique peut être un fluide biologique, notamment le sang ou le sérum ou encore un extrait tissulaire biologique. Les compositions ci dessus sont utilisables pour la détection d'anticorps dans un échantillon biologique susdit. The biological sample may be a biological fluid, especially blood or serum or a biological tissue extract. The above compositions are useful for the detection of antibodies in a biological sample mentioned above.
L'invention vise donc également un procédé pour le diagnostic in vitro d'une infection due spécifiquement à un rétrovirus du type HIV-2 caractérisé par les étapes de - mise en contact d'un échantillon biologique susceptible de contenir des anticorps produits à la suite d'une infection par un rétrovirus du type HIV-2, avec une glycoprotéine gp80 répondant aux définitions ci-dessus ou avec une composition antigénique décrite ci-dessus, dans des conditions appropriées permettant la formation d'un complexe immunologique du type antigène-anticorps, - détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé. The invention therefore also relates to a method for the in vitro diagnosis of an infection due specifically to a retrovirus of the HIV-2 type characterized by the steps of - bringing into contact a biological sample that may contain antibodies produced as a result of infection with a retrovirus of the HIV-2 type, with a gp80 glycoprotein as defined above or with an antigenic composition described above, under appropriate conditions allowing the formation of an antigen-antibody immunological complex detection of the antigen-antibody complex that may be formed.
L'invention concerne par ailleurs une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la glycoprotéine gp80 en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable pour la constitution de vaccins. The invention also relates to an immunogenic composition characterized in that it comprises at least the glycoprotein gp80 in combination with a pharmaceutical vehicle acceptable for the constitution of vaccines.
Ces compositions peuvent être utilisées pour la fabrication de vaccins contre un rétrovirus du type
HIV-2.These compositions can be used for the manufacture of vaccines against a retrovirus of the type
HIV-2.
Une composition immunogène ainsi formée est dosée en protéines et/ou glycoprotéines antigéniques de façon à permettre l'administration d'une dose de 10 à 100ug par kilogramme. An immunogenic composition thus formed is assayed for antigenic proteins and / or glycoproteins so as to allow the administration of a dose of 10 to 100 μg per kilogram.
L'invention se rapport également à un procédé de préparation de la gp80 caractérisé par les étapes suivantes - lyse de cellules infectées par un rétrovirus humain
HIV-2 et séparation du surnageant et des cellules infectées ou lyse des culots viraux préparés par centrifugation, - incubation de l'extrait cellulaire et/ou de l'extrait viral sur une colonne d'immunoaffinité, sur laquelle est déposé un immunoadsorbant renfermant des anticorps purifiés, tels qu'obtenus à partir d'un sérum d'un malade infecté par le rétrovirus humain
HIV-2, ce sérum ayant la capacité de réagir fortement avec les protéines d'enveloppe de HIV-2. lesdits anticorps étant fixés avantageusement sur un support adapté, en présence d'un tampon et pendant un temps suffisamment long pour obtenir la formation d'un complexe immunologique antigène-anticorps, - lavage de la colonne avec un tampon pour éliminer les molécules non retenues sur le support, - récupération des protéines antigéniques recherchées.The invention also relates to a process for the preparation of gp80 characterized by the following steps - lysis of cells infected with a human retrovirus
HIV-2 and separation of the supernatant and the infected cells or lysis of the viral pellets prepared by centrifugation, incubation of the cell extract and / or the viral extract on an immunoaffinity column, on which an immunoadsorbant containing purified antibodies, as obtained from a serum of a patient infected with the human retrovirus
HIV-2, this serum having the ability to react strongly with HIV-2 envelope proteins. said antibodies being advantageously fixed on a suitable support, in the presence of a buffer and for a time long enough to obtain the formation of an antigen-antibody immunological complex, - washing of the column with a buffer to eliminate the molecules not retained on the support, - recovery of the desired antigenic proteins.
Selon un premier mode de réalisation de ce procédé de préparation, la récupération des glycoprotéines est faite par électrophorèse et par électroélution des protéines. According to a first embodiment of this preparation process, the glycoproteins are recovered by electrophoresis and electroelution of the proteins.
Les cellules infectées auront pu être obtenues in vitro à partir d'une culture de cellules infectées par HIV-2, en particulier en utilisant des lymphocytes
T4 infectés par HIV-2. De telles cultures cellulaires peuvent être réalisées sur des lignées CEM.The infected cells could have been obtained in vitro from a culture of cells infected with HIV-2, in particular by using lymphocytes
T4 infected with HIV-2. Such cell cultures can be performed on EMC lines.
Selon un autre mode de réalisation de ce procédé de préparation, la récupération des glycoprotéines est obtenue par: - élution des protéines fixées sur la colonne d' immuno-affinité ci-dessus, - purification des produits ainsi élués sur une colonne de chromatographie contenant, fixés sur le support de séparation, des anticorps monoclonaux reconnaissant la gp8Q. According to another embodiment of this method of preparation, the recovery of the glycoproteins is obtained by: elution of the proteins fixed on the immunoaffinity column above, purification of the products thus eluted on a chromatography column containing, attached to the separation support, monoclonal antibodies recognizing gp8Q.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention la lyse des cellules infectées est réalisée dans une solution détergente, les anticorps compris dans l'immunoadsorbant sont fixés sur des billes d'agarose et on opère en présence d'un tampon d'accrochage. In a particular embodiment of the invention, the lysis of the infected cells is carried out in a detergent solution, the antibodies included in the immunoadsorbent are fixed on agarose beads and the reaction is carried out in the presence of a coupling buffer.
Entre également dans le cadre de l'invention un nécessaire ou kit pour la détection d'anticorps dans le sérum ou dans un autre échantillon biologique d'un patient susceptible d'être infecté par un rétrovirus humain HIV-2, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une glycoprotéine antigénique gp80 ou une composition - ou encore un mélange de ces différents constituants, - des moyens permettant la réaction de formation du complexe immunologique entre les antigènes et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique à tester, notamment si besoin un ou plusieurs tampons d'incubation, - un échantillon de contrôle négatif, - des moyens pour la révélation du complexe antigèneanticorps formé. Also within the scope of the invention is a kit or kit for the detection of antibodies in the serum or other biological sample of a patient susceptible to infection by a human HIV-2 retrovirus, characterized in that it comprises: at least one antigenic glycoprotein gp80 or a composition or a mixture of these various constituents, means allowing the formation reaction of the immunological complex between the antigens and the antibodies possibly present in the biological sample to be tested, in particular, if necessary, one or more incubation buffers, a negative control sample, means for revealing the formed antigenic antibody complex.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparattront dans les exemples et les figures. Other features and advantages of the invention will become apparent in the examples and figures.
LEGENDES DES FIGURES
Figure l:Identification d'une protéine spécifique de 80-kDa dans des cellules infectées par HIV-2 par analyse Western blot en utilisant un sérum positif pour HIV-1 et 3 sérums positifs pour HIV-2 (A, B et
C). Des extraits cellulaires de cellules CEM (correspondant aux produits de 10' cellules) de cellules non infectées (lignes 2), de cellules infectées par HIV-1 (lignes 1) et de cellules infectées par HIV-2 (lignes 3 > ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 7,5* avant le test Western blot. Un autoradiographe est présenté sur la figure. Sur la gauche, les flèches indiquent la position de la glycoprotéine extracellulaire de HIV-1 (gp120) et des précurseurs de gag p55 et p40.Sur la droite on a noté la position des glycoprotéines spécifiques de HIV-2, gp300, gp140 et gp80. LEGENDS OF FIGURES
Figure l: Identification of a specific 80-kDa protein in HIV-2 infected cells by Western blot analysis using HIV-1 positive serum and 3 HIV-2 positive sera (A, B and
C). Cell extracts of CEM cells (corresponding to 10 'cells) of uninfected cells (lanes 2), HIV-1 infected cells (lanes 1) and HIV-2 infected cells (lanes 3) were analyzed. by polyacrylamide gel electrophoresis 7.5 * before the Western blot test An autoradiograph is shown in the figure On the left, the arrows indicate the position of the extracellular glycoprotein of HIV-1 (gp120) and gag precursors p55 and p40. On the right the position of specific glycoproteins of HIV-2, gp300, gp140 and gp80 was noted.
Fissure 2:Synthèse des glycoprotéines liées à HIV-2. Crack 2: Synthesis of glycoproteins linked to HIV-2.
Les cellules infectées par HIV-2 ont été marquées avec (3 Higlucosamine (200pCi/ml ; 4x105 cellules/ml) pendant 2, 3, 4, 6 et 8 heures. A différents points, des extraits (produits de 107 cellules) ont été préparés à partir de cellules infectées et à partir d'agrégats (synonyme de culots) viraux (préparés par centrifugation du milieu de culture à 100.000g). Des aliquotes de ces extraits (correspondant à 2 x 10' cellules ont été purifiées sur HIV-2 sérum-Sépharose et les protéines marquées ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (12,5%). Un fluorographe est présenté.Sur la gauche on a donné la position des marqueurs protéiques de poids moléculaire: la myosine: 200.000, la phosphorylase B: 97.000, la sérum albumine bovine: 68.000, l'ovalbumine: 43.000, et l'anhydrase carbonique: 30.000.The cells infected with HIV-2 were labeled with Higlucosamine (200 μCi / ml, 4x105 cells / ml) for 2, 3, 4, 6 and 8 hours at different points, extracts (products of 107 cells) were prepared from infected cells and from viral aggregates (synonymous with pellets) (prepared by centrifugation of the culture medium at 100,000g.) Aliquots of these extracts (corresponding to 2 x 10 'cells were purified on HIV-1). Serum-Sepharose and labeled proteins were analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel (12.5%) A fluorograph is presented.On the left was given the position of protein markers of molecular weight: myosin: 200,000, the phosphorylase B: 97,000, bovine serum albumin: 68,000, ovalbumin: 43,000, and carbonic anhydrase: 30,000.
Fiaure 3:Analyse Western Blot avec des anticorps polyclonaux dirigés contre la gp300. Sur la gauche des extraits de cellules CEM non infectées (-) et infectées par HIV-1 ou HIV-2 sont présentés. Sur la droite des extraits de cellules CEM infectées par
HIV-2: extraits cellulaires (ligne C) et agrégat viral (culot viral) (ligne V). Les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gel à 7,5% sur la gauche t gel à 12,5% sur la droite) avant l'analyse Western blot en utilisant des anticorps polyclonaux murins dirigés contre la protéine purifiée gp300 (anti-gp300).Fiaure 3: Western blot analysis with polyclonal antibodies against gp300. On the left uninfected (-) CEM cell extracts infected with HIV-1 or HIV-2 are shown. On the right are extracts of CEM cells infected with
HIV-2: cell extracts (line C) and viral aggregate (viral pellet) (line V). Samples were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (7.5% gel on the left 12.5% gel on the right) before Western blot analysis using murine polyclonal antibodies against the purified gp300 protein. (anti-gp300).
L'autoradiogramme est présenté, chaque échantillon correspond au produit de 106 cellules.The autoradiogram is presented, each sample corresponds to the product of 106 cells.
Fissure 4:Une analyse Western blot en utilisant un anticorps monoclonal mAb 1H8 est présentée. Les extraits de cellules infectées par HIV-1 ou HIV-2 (lignes C) et les extraits d'agrégats viraux (lignes
V) ont été analysés en électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5% avant le test Western blot en utilisant l'anticorps mAb 1H8. L'autoradiographe est présenté, l'anticorps monoclonal était dirigé contre la glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe de HIV-2ftoD. Crack 4: Western blot analysis using monoclonal mAb 1H8 antibody is shown. Extracts of cells infected with HIV-1 or HIV-2 (lines C) and extracts of viral aggregates (lines
V) were analyzed by 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis before the Western blot test using mAb 1H8 antibody. The autoradiograph is presented, the monoclonal antibody was directed against the transmembrane envelope glycoprotein HIV-2ftoD.
Figure 5:Le peptide p39' bloque la liaison entre l'anticorps mAb 1H8 et la gp80. Des extraits d'agrégats viraux de HIV-2 ont été analysés par
Western blot en utilisant l'anticorps 1H8 (section iAb) ou des anticorps polyclonaux anti-gp300 (section
S). L'incubation avec chaque anticorps a été réalisée en l'absence (lignes -) ou en présence (lignes +) de 1 pg/ml de peptide p391. Les résultats de l'autoradiographie sont présentés. Figure 5: The p39 'peptide blocks the binding between mAb 1H8 antibody and gp80. Extracts of viral aggregates of HIV-2 were analyzed by
Western blot using 1H8 antibody (section iAb) or anti-gp300 polyclonal antibodies (section
S). Incubation with each antibody was performed in the absence (lines -) or presence (+ lines) of 1 μg / ml of p391 peptide. The results of autoradiography are presented.
Fissure 6:Des expériences de "Pulse chase" (marquage, suivi du marqueur) montrant la production de gp80 dans des cellules infectées par HIV-2 sont présentées. Les cellules CEM infectées par HIV-2 ont été marquées par la (5S)méthionine (200 pCi/ml ; 4x10' cellules/ml) pendant 30 minutes (lignes 0). Le marquage radioactif a été suivi dans le milieu de culture contenant 5mM de méthionine froide pendant 2 et 4 heures (lignes 2 et 4). Le milieu de culture a été centrifugé à 100.000g au bout de 4 heures et les agrégats ont été extraits. Fissure 6: "Pulse chase" experiments showing the production of gp80 in HIV-2 infected cells are presented. CEM cells infected with HIV-2 were labeled with (5S) methionine (200 μCi / ml, 4x10 7 cells / ml) for 30 minutes (0 lines). The radioactive labeling was monitored in the culture medium containing 5 mM cold methionine for 2 and 4 hours (lines 2 and 4). The culture medium was centrifuged at 100,000 g after 4 hours and the aggregates were extracted.
Tous les échantillons ont été immunoprécipités en utilisant des anticorps anti-gp300 ou des anticorps mAb 1H8. Les protéines marquées des préparations du complexe immun ont été éluées sur le tampon d'électrophorèse et analysées par électrophorêse sur gel de polyacrylamide 7,5%. Un fluorographe est présenté, dans lequel C et V correspondent aux extraits cellulaires et viraux respectivement. Chaque échantillon représente le produit de 10' cellules.All samples were immunoprecipitated using anti-gp300 antibodies or mAb 1H8 antibodies. The labeled proteins of the preparations of the immune complex were eluted on the electrophoresis buffer and analyzed by 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis. A fluorograph is presented, in which C and V correspond to cellular and viral extracts respectively. Each sample represents the product of 10 'cells.
Figure 7: a/ incorporation de glucosamine marquée et de fucose dans gp80. Les cellules CEM infectées par HIV-2 marquées avec [ H] glucosamine (200 pCi/ml) ou avec t3H] fucose (200 pCi/ml) ont été testées par immunoprécipitation en utilisant des anticorps polyclonaux anti-gp300 (lignes S) ou des anticorps monoclonaux mAb 1H8 (lignes M). Tous ces échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5%. Le fluorographe est présenté.Figure 7: a / incorporation of labeled glucosamine and fucose in gp80. CEM cells infected with HIV-2 labeled with [H] glucosamine (200 μCi / ml) or with t3H] fucose (200 μCi / ml) were tested by immunoprecipitation using polyclonal anti-gp300 antibodies (S lines) or mAb 1H8 monoclonal antibodies (M lines). All of these samples were analyzed by 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis. The fluorograph is presented.
b/ effet de la castanospermine sur la production de gp125 et gp80. Des cellules infectées par HIV-2 ont été marquées (16 heures) avec la [25S] méthionine (200 Ci/ml ; 4x10' cellules/ml) en l'absence (lignes -) ou en présence (lignes +) de castanospermine (lmM). b / effect of castanospermine on the production of gp125 and gp80. HIV-2 infected cells were labeled (16 hours) with [25 S] methionine (200 Ci / ml, 4x10 'cells / ml) in the absence (lines -) or presence (+ lines) of castanospermine ( mM).
Les extraits du milieu de culture contenant les particules virales ont été purifiés sur colonne d'immunoaffinité en utilisant HIV-2 sérum-sépharose et les protéines purifiées ont été testées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5%. Le fluorographe correspondant est présenté.The extracts of the culture medium containing the viral particles were purified on an immunoaffinity column using HIV-2 serum sepharose and the purified proteins were tested by 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis. The corresponding fluorograph is presented.
Figure 8:Dissociation de gp80. Section C: extraits de cellules CEM infectées par HIV-2 marquées à la (2553 méthionine testés par immunoprécipitation en utilisant un anticorps monoclonal mAb 1H8 (ligne 1). Une autre aliquote de la même préparation d'extraits cellulaires a été d'abord chauffée (950C 5 minutes) en présence de 1% SDS. Ensuite elle a été diluée 10 fois dans un tampon RIPA avant le test d'immunoprécipiation (ligne 2). Les préparations de complexe immun ont été analysées par électrophorese. Chaque échantillon correspond à l'extrait de 10' cellules.Section V: des agrégats de virus HIV obtenus à partir de cellules marquées à la [30S] méthionine (chacun correspondant au produit de 107 cellules) ont été suspendus dans différents tampons: (1) tampon de lyse contenant
Triton (lOmM Tris-HCl pH 7,6, 150mM NaCl, lmM EDTA, 1% (V/V) Triton X-100 et 100 unités/ml d'aprotinine). (2) tampon de lyse contenant SDS (puis chauffé comme dans (1) mais contenant 1* (v/v) SDS å la place du Triton X-100); (3) tampon de lyse contenant SDS puis chauffé à 95 pendant 5 minutes; (4) tampon RIPA (le même que dans (1) modifié aussi par 0,1% (v/v) SDS et 0,2% (v/v) déoxycholate).Tous ces échantillons ont ensuite été immunoprécipités en utilisant un anticorps mAb 1H8 et les protéines marquées ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5%. Le fluorographe est présenté.Figure 8: Dissociation of gp80. Section C: Extracts of 2553 methionine-labeled HIV-2 infected CEM cells immunoprecipitated using mAb 1H8 monoclonal antibody (lane 1) Another aliquot of the same cell extract preparation was first heated (950C 5 minutes) in the presence of 1% SDS, then it was diluted 10-fold in RIPA buffer prior to the immunoprecipitation test (lane 2), and the immune complex preparations were analyzed by electrophoresis. Extract of 10 cells. Section V: HIV virus aggregates obtained from [30 S] -labeled methionine cells (each corresponding to the product of 107 cells) were suspended in different buffers: (1) lysis buffer containing
Triton (10mM Tris-HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% (V / V) Triton X-100 and 100 units / ml aprotinin). (2) lysis buffer containing SDS (then heated as in (1) but containing 1 * (v / v) SDS in place of Triton X-100); (3) lysis buffer containing SDS and then heated at 95 for 5 minutes; (4) RIPA buffer (same as in (1) also modified with 0.1% (v / v) SDS and 0.2% (v / v) deoxycholate). All these samples were then immunoprecipitated using an antibody mAb 1H8 and the labeled proteins were analyzed by 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis. The fluorograph is presented.
Figure 9:Dissociation de gp80 purifiée en gp36. Des cellules CEM infectées par HIV-2 ont été marquées (17 heures) avec la E3as] méthionine et les agrégats viraux ont été suspensus dans un tampon de lyse contenant du Triton. Ces extraits viraux (produits correspondant à 2xlQ7 cellules) ont été immunoprecipités en utilisant des anticorps mAb 1H8 et la gp80 a été purifiée par électrophorèse préparative sur gel. Des aliquotes égales de la préparation purifiée de gp80 ont été lyophilisées et resuspendues dans de l'acétate 100mM à pH 6,8, 5,8 et 4,8 contenant 1% (v/v) SDS, 100 unités/ml d'aprotinine et 5mM EGTA (pour inhiber la protéolyse calcium-dépendante). Tous les échantillons ont été incubés à 300C pendant 60 minutes avant la dilution dans un tampon d'électrophorèse concentré 2 fois.Les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (12,5%) et on présente un fluorographe.Figure 9: Dissociation of gp80 purified gp36. HIV-2 infected CEM cells were labeled (17 hours) with E3as] methionine and the viral aggregates were suspensed in lysis buffer containing Triton. These viral extracts (products corresponding to 2xlQ7 cells) were immunoprecipitated using mAb 1H8 antibodies and gp80 was purified by preparative gel electrophoresis. Equal aliquots of the purified gp80 preparation were lyophilized and resuspended in 100mM acetate pH 6.8, 5.8 and 4.8 containing 1% (v / v) SDS, 100 units / ml aprotinin and 5mM EGTA (to inhibit calcium-dependent proteolysis). All samples were incubated at 300C for 60 minutes prior to dilution in a 2-fold concentrated electrophoresis buffer. The samples were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (12.5%) and a fluorograph was presented.
Figure 10:La glycoprotéine transmembranaire de SIV existe sous forme de dimère. Section Cell (cellule):
Des cellules HUT-78 infectées par SIV-mac et des cellules CEM infectées par HIV-2 ont été marquées pendant 16 heures avec t3 H] glucosamine (200 pCi/ml: 4 x 106 cellules/ml). Les extraits (préparés dans un tampon de lyse contenant du Triton) des cellules infectées (lignes C) et des agrégats viraux (lignes V) ont été purifiés par immunoprécipitation en utilisant mAb 1H8 et les protéines marquées ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5%. On présente le fluorographe. Figure 10: SIV transmembrane glycoprotein exists as a dimer. Cell section:
HUT-78 cells infected with SIV-mac and HIV-2 infected CEM cells were labeled for 16 hours with t3 H] glucosamine (200 uCi / ml: 4 x 106 cells / ml). The extracts (prepared in lysis buffer containing Triton) of the infected cells (lines C) and viral aggregates (lines V) were purified by immunoprecipitation using mAb 1H8 and the labeled proteins were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. 12.5%. The fluorograph is presented.
EXEMPLES
MATERIELS ET METHODES
MATERIELS
La L-[35S]Methionine (activité spécifique > 1000 pCi/oemol) L-[6-2H3 Fucose (activité spécifique : 45-70 pCi/mmol), D-t6-3H] Glucosamine (activité spécifique 20-40 pCi/mmol) ont été fournis par Amersham (Amersham, UK). La castanospermine et la tunicamycine ont été fournies par Boehringer-Mannheim (Mannheim,
R.F.A.) poly(A).poly(U) provient de l'Institut Curie à
Paris et a été préparé selon la méthode décrite par
Hovanessian et al -1982- (Journal Interferon Research vol.2 - p.209 à 216).EXAMPLES
MATERIALS AND METHODS
MATERIALS
L- [35S] Methionine (specific activity> 1000 pCi / oemol) L- [6-2H3 Fucose (specific activity: 45-70 pCi / mmol), D-t6-3H] Glucosamine (specific activity 20-40 pCi / mmol) were provided by Amersham (Amersham, UK). Castanospermine and tunicamycin were provided by Boehringer-Mannheim (Mannheim,
RFA) poly (A) .poly (U) comes from the Institut Curie at
Paris and was prepared according to the method described by
Hovanessian et al. 1982 (Journal Interferon Research vol.2 - p.209-216).
VIRUS ET CELLULES
L'isolat HIV-1BRU du virus humain d'immunodeficience de type 1 (12) l'isolat HIV-2ton du virus humain d'immunodéficience de type 2 (4,5) et le virus Simien d'immunodéficience, SIVmac142 (6) ont été utilisés pour ces exemples.VIRUSES AND CELLS
The HIV-1BRU isolate of the human immunodeficiency virus type 1 (12) the HIV-2ton isolate of the human immunodeficiency virus type 2 (4,5) and the Simian immunodeficiency virus, SIVmac142 (6) were used for these examples.
Les différentes lignées cellulaires et lymphocytes humains ont été cultivés dans un milieu de suspension RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise
France) contenant 10% (v/v) de sérum de veau foetal 2pgSml de polybrene (Sigma) ont été ajoutés pour les cultures de cellules infectées par HIV. Les cellules
CEM clone 13 sont dérivées de la lignée de lymphoïdes humains CEM (ATCC-CCL119) et expriment l'antigène T4 à un niveau élevé. Cinq jours après l'infection avec les isolats HIV-1BRU ou HIV-2xo , environ 80-90% des cellules produisent des particules virales et peuvent être identifiées par l'effet cytopathogène correspondant a la vacuolisation des cellules et par l'apparence de petits syncitiums.La lignée cellulaire
HUT-78 est une autre lignée cellulaire de lymphoïdes humains positifs pour le récepteur T4 (Gazdal et al.The various cell lines and human lymphocytes were cultured in RPMI-1640 suspension medium (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise
France) containing 10% (v / v) fetal calf serum 2 μg / ml of polybrene (Sigma) were added for cultures of HIV infected cells. Cells
EMC clone 13 are derived from the human lymphoid CEM line (ATCC-CCL119) and express the T4 antigen at a high level. Five days after infection with HIV-1BRU or HIV-2xo isolates, approximately 80-90% of the cells produce viral particles and can be identified by the cytopathic effect corresponding to cell vacuolation and the appearance of small cells. syncitiums.The cell line
HUT-78 is another human lymphoid cell line positive for the T4 receptor (Gazdal et al.
1980) qui est hautement permissive pour la réplication de SIVmac142 (Daniel et al. 1985). Leslymphocytes du sang périphérique de donneurs sains ont été stimulés pendant 3 jours avec 0,2% (w/v) de fraction P de phytohémagglutinine (Difco, Detroit, USA) dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10% de veau foetal. Les cellules ont été mises en culture dans un milieu
RPMI-1640 contenant 10% (v/v) de facteur de croissance de cellule T (TCGF, Biotest). Après infection avec
HIV-2, les lymphocytes ont été lis en culture en présence de 10% (v/v) TCGF et de 2wug/ml de Polybrene).1980) which is highly permissive for replication of SIVmac142 (Daniel et al., 1985). Peripheral blood lymphocytes from healthy donors were stimulated for 3 days with 0.2% (w / v) fraction P of phytohemagglutinin (Difco, Detroit, USA) in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf. The cells were cultured in a medium
RPMI-1640 containing 10% (v / v) T cell growth factor (TCGF, Biotest). After infection with
HIV-2, the lymphocytes were read in culture in the presence of 10% (v / v) TCGF and 2 μg / ml Polybrene).
MARQUAGE METABOLIQUE DES CELLULES
Pour le marquage métabolique des protéines, des cellules infectées ont été incubées pendant 16 heures à 370C dans un milieu de culture minimum MEM (abréviation anglaise de "Minimal Essential Medium") exempt de L-méthionine et de sérum, le milieu étant toutefois complété avec 200 Ci/ml (35S]méthionine. Pour le marquage métabolique des glycoprotéines, les cellules infectées ont été incubées pendant 16 heures a 370C dans un milieu de culture MEM dépourvu de sérum et de glucose mais complété avec 200pCi/ml aH-Fucose ou 200 Ci/ml H-glucosamine.METABOLIC MARKING OF CELLS
For the metabolic labeling of proteins, infected cells were incubated for 16 hours at 370C in a minimal MEM culture medium (abbreviation of "Minimal Essential Medium") free of L-methionine and serum, but the medium was supplemented with 200 Ci / ml (35S) methionine For the metabolic labeling of the glycoproteins, the infected cells were incubated for 16 hours at 370C in serum and glucose-free MEM culture medium but supplemented with 200 μCi / ml αH-Fucose or 200 μCi. Ci / ml H-glucosamine.
EXTRAITS CELLULAIRES ET VIRAUX
Les culots cellulaires correspondant a 10' cellules ont été resuspendus dans 100 pl de tampon l0mM Tris-HCl pH 7,6, 150mM NaCl, lmM EDTA, 0,2mM
PMSF, 100 unités/ml d'aprotinine (Iniprol, Choay > avant addition de 100 l du même tampon contenant 2* (v/v) de Triton X-100. CELLULAR AND VIRAL EXTRACTS
The cell pellets corresponding to 10 'cells were resuspended in 100 μl of 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.2 mM
PMSF, 100 units / ml of aprotinin (Iniprol, Choay) before addition of 100 l of the same buffer containing 2 * (v / v) Triton X-100.
Les extraits cellulaires ont été centrifugés à 12.000g pendant 10 minutes, et le surnageant a été conservé à -800C jusqu'à utilisation. Pour la préparation des extraits viraux, 100pl de 10X du tampon de lyse (100mM Tris-HCl pH 7,6, 1,5M NaCl, îOmM
EDTA, 10%(v/v) Triton X-100, 100 unités/ml d'aprotinine) ont été ajoutés par il de surnageant clarifié des cellules CEM infectées et traitées comme ci-dessus. Pour la préparation d'extraits à partir d'agrégats de virus, un milieu de culture de cellules infectées a d'abord été centrifugé à 12.000 g pendant 10 minutes avant une centrifugation à grande vitesse à 100.000 g à 15 minutes (centrifugeur TL100 Beckman).The cell extracts were centrifuged at 12,000 g for 10 minutes, and the supernatant was stored at -800C until used. For the preparation of the viral extracts, 100 μl of 10 × lysis buffer (100 mM Tris-HCl pH 7.6, 1.5 M NaCl, 10 mM
EDTA, 10% (v / v) Triton X-100, 100 units / ml aprotinin) was added with clarified supernatant of the infected and treated CEM cells as above. For the preparation of extracts from virus aggregates, an infected cell culture medium was first centrifuged at 12,000 g for 10 minutes before high speed centrifugation at 100,000 g at 15 minutes (Beckman TL100 centrifuge). .
Les agrégats de virus (produit obtenu à partir de 107 cellules) ont ensuite été solubilisés dans 200 l de tampon de lyse.The virus aggregates (product obtained from 107 cells) were then solubilized in 200 l of lysis buffer.
PREPARATION D'UN IMMUNOADSORBANT AVEC DES ANTICORPS
OBTENUS D'UN PATIENT SEROPOSITIF POUR HIV-2
Les immunoglobulines de sérum d'un patient séropositif pour HIV-2 ont été précipitées avec 50% de (NH4)iSO4, dissous dans 20mM de phosphate de sodium (pH 8,0) et ensuite purifiées sur une colonne de cellulose DEAE (DE52, Whatman) par élution avec 20mM de phosphate de sodium (pH 8,0). Les immunoglobulines ainsi purifiées ont été jugées pures à 90%. Les anticorps ont ensuite été couplés a une colonne de
Sépharose CL 4B activée avec le CNBr conformément à la technique décrite par Berg (2). Deux niligrammes d'IgG ont été couplés par ml de Sépharose CL 4B. Dans la suite cet immunoadsorbant sera désigné par "HIV-2 sérum-Sépharose". PREPARATION OF AN IMMUNOADSORBENT WITH ANTIBODIES
OBTAINED FROM A SEROPOSITIVE PATIENT FOR HIV-2
The serum immunoglobulins of a seropositive HIV-2 patient were precipitated with 50% (NH4), SO4, dissolved in 20mM sodium phosphate (pH 8.0) and then purified on a DEAE cellulose column (DE52, Whatman) eluting with 20mM sodium phosphate (pH 8.0). The immunoglobulins thus purified were found to be 90% pure. The antibodies were then coupled to a column of
Sepharose CL 4B activated with CNBr according to the technique described by Berg (2). Two niligrams of IgG were coupled per ml of Sepharose CL 4B. In the following this immunoadsorbent will be designated by "HIV-2 serum-Sepharose".
PREPARATION DES PROTEINES DE HIV-2 SUR LA COLONNE D'IMMUNOAFFINITE
Les extraits cellulaires des cellules CEM produisant HIV-2 ont tout d'abord été dilués dans deux volumes de tampon de liaison (20mM Tris-HCl pH 7,6 50mM KCl, 150mM NaCl, lmM EDTA, 20% (v/v) de glycerol, 7mM-ssmercaptoethanol, 0,2mM PMSF, 100 unités/ml d'aprotinine) avant incubation avec un volume de HIV-2 sérum-sépharose. Le virus extracellulaire a été traité comme les surnageants des cellules productrices de
HIV-2 avec 1/10ème du tampon de liaison concentré 10 fois . L'opération de liaison a été conduite toute une nuit puis la colonne a été lavée suffisamment dans le tampon de liaison.Les protéines liées sur la colonne ont été éluées en procédant à l'ébullition dans un tampon d'électrophorèse (125mM Tris-HCl pH 6,8, 1% (w/v) SDS, 2M d'urée, 20% de glycerol, 0,5* de ss- mercaptoethanol) Les protéines éluées ont été récupérées par électrophorèse sur des gels de polyacrylamides SDS 7,5% contenant 6M d'urée et 0,1% de bis-acrylamide à la place de 0,2* (w/v). PREPARATION OF HIV-2 PROTEINS ON THE IMMUNOAFFINITY COLUMN
The cell extracts of the CEM cells producing HIV-2 were first diluted in two volumes of binding buffer (20mM Tris-HCl pH 7.6 50mM KCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 20% (v / v)). glycerol, 7mM-ssmercaptoethanol, 0.2mM PMSF, 100 units / ml of aprotinin) before incubation with a volume of HIV-2 serum-sepharose. The extracellular virus was treated as the supernatants of the cells producing the
HIV-2 with 1 / 10th of the binding buffer concentrated 10 times. The binding operation was conducted overnight and the column was washed sufficiently in the binding buffer. The bound proteins on the column were eluted by boiling in electrophoresis buffer (125 mM Tris-HCl). pH 6.8, 1% (w / v) SDS, 2M urea, 20% glycerol, 0.5% ss-mercaptoethanol) The eluted proteins were recovered by electrophoresis on SDS 7.5 polyacrylamide gels. % containing 6M urea and 0.1% bis-acrylamide in place of 0.2 * (w / v).
ELECTROPHORESE PREPARATIVE
La récupération des glycoprotéines de HIV-2 (gp300 ou gp80) éluées à partir de la colonne d'affinité été faite par électrophorèse sur gel de polyacrylamide comme décrit précédemment et, les régions du gel contenant les glycoprotéines virales ont été coupées par référence à la position des marqueurs protéiques de poids moléculaire préétablis(BRL).PREPARATIVE ELECTROPHORESIS
The recovery of the HIV-2 glycoproteins (gp300 or gp80) eluted from the affinity column was made by polyacrylamide gel electrophoresis as previously described and the regions of the gel containing the viral glycoproteins were cut by reference to position of pre-established molecular weight protein markers (BRL).
La glycoprotéine gp300 a été éluée par incubation pendant 16 heures a 40C dans un tampon d'élution (0,îM NaHCO3, 0,5mM EDTA, 0,05* (w/v) SDS, 0,2mM PMSF). Les fractions de glycoprotéines ainsi obtenues ont été lyophilisées et conservées au réfrigérateur jusqu'à utilisation. La gp & ,a été électroéluée dans un tampon contenant 4mM Tris-HCl, pH 7,6 ; 2mM d'acétate de sodium et 2mM d'EDTA
PREPARATION D'ANTICORPS MURINS POLYCLONAUX DIRIGES
CONTRE LA GP300. The gp300 glycoprotein was eluted by incubation for 16 hours at 40C in elution buffer (0.1M NaHCO3, 0.5mM EDTA, 0.05 * (w / v) SDS, 0.2mM PMSF). The glycoprotein fractions thus obtained were lyophilized and refrigerated until use. Gp, was electroeluted in a buffer containing 4 mM Tris-HCl, pH 7.6; 2mM sodium acetate and 2mM EDTA
PREPARATION OF POLYCLONAL MURINE ANTIBODIES DIRECTED
AGAINST THE GP300.
La glveoprotéine d'enveloppe de HIV-2 gp300 a été purifiée à partir d'extraits de cellules CEM infectées (3x10' cellules) par chromatographie d'immunoaffinité sur HIV-2 sérum Sépharose suivi d'une électrophorèse préparative sur gel (13). La préparation purifiée de gp300 a été dissoute dans 10 ml de 150mM NaCl contenant 0,5M d'urée et lmg/ml de protéines de sérum de souris puis dialysée pendant 24 heures au contact d'une solution contenant 150mMNaCl et 0,5M d'urée. Le produit de dialyse a ensuite été centrifugé et des aliquotes de 2ml ont été conservées à -800C. Cinq souris (agées de 8 semaines) ont reçu une injection intrapéritonéalle,à 5 reprises a 12 jours d'intervalle avec 350 ul de préparation de gp300 (environ lpg de gp300).Un adjuvant Poly(A).poly(U) (200pu ; lmg/ml dans 150mM NaCl) a été administré par voie intraveineuse pendant chaque immunisation (17). Cinq jours après la dernière injection les souris ont reçu par injection intrapéritonéalle une suspension de 10t cellules de sarcome 180/TG pour préparer un fluide ascite hyperimmun (8). Huit jours après l'injection les souris ont été sacrifiées et les fluides ascites ont été recueillis. Les cellules des ascites ont été enlevées par centrifugation (200g, 5 minutes) et le fluide péritonéal a été recueilli. The HIV-2 gp300 envelope gloveoprotein was purified from infected EMC cell extracts (3x10 'cells) by immunoaffinity chromatography on HIV-2 serum Sepharose followed by preparative gel electrophoresis (13). The purified gp300 preparation was dissolved in 10 ml of 150mM NaCl containing 0.5M urea and 1mg / ml mouse serum protein and then dialyzed for 24 hours in contact with a solution containing 150mM NaCl and 0.5M NaCl. urea. The dialysis product was then centrifuged and 2ml aliquots were stored at -800C. Five mice (8 weeks old) were injected intraperitoneally, 5 times at 12-day intervals with 350 μl of gp300 preparation (approximately 1 μg of gp300). Poly (A). Poly (U) adjuvant (200 μl) 1mg / ml in 150mM NaCl) was administered intravenously during each immunization (17). Five days after the last injection, the mice received by intraperitoneal injection a suspension of 10t sarcoma 180 / TG cells to prepare a hyperimmune ascites fluid (8). Eight days after injection the mice were sacrificed and ascites fluids were collected. The ascites cells were removed by centrifugation (200g, 5 minutes) and the peritoneal fluid was collected.
PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX, mAb 1H8
Les virions HIV-2 ont été cultivés dans des cellules CEM et purifiés à partir de surnageants de culture concentrés en formant des bandes, dans des gradients de sucrase. Le virus purifié a été disloqué solubilisé) dans 0,5% Triton-100, 150mM NaCl, 50mM
Tris, pH8,0, 1% d'aprotinine (Sigma) et clarifié par ultracentrifugation. L'extrait viral a ensuite été passé sur une colonne d'affinité Lentil-Lectin
Sepharose 4B (Pharmacia), la colonne a été lavée et les glycoprotéines accrochées ont été éluées avec 0,5M méthyl a-D-mannopyranoside (Sigma) et dialysées toute une nuit au contact d'un tampon salin de phosphate.PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES, mAb 1H8
HIV-2 virions were cultured in EMC cells and purified from band-like, concentrated culture supernatants in sucrase gradients. The purified virus was disrupted solubilized) in 0.5% Triton-100, 150mM NaCl, 50mM
Tris, pH8.0, 1% aprotinin (Sigma) and clarified by ultracentrifugation. The viral extract was then passed on a Lentil-Lectin affinity column.
Sepharose 4B (Pharmacia), the column was washed and the attached glycoproteins were eluted with 0.5M methyl αD-mannopyranoside (Sigma) and dialyzed overnight in contact with a phosphate buffered saline.
Des souris BALB/c ont été immunisées par une injection intrapérîtonéale avec 0,3ml de glycoprotéines purifiées 2-5pg, re-accrochées sur
Lentil-Lectin Sépharose 4B (50-100pl), Les souris ont reçu un rappel toutes les 4-6 semaines pendant 24 heures avec le même immunogène. Ces souris ont été suivies pour détecter la production d'anticorps, qualitativement par test RIPA sur des extraits de virions HIV-2 marqués avec [3SS3 méthionine et quantitativement avec le test EIA sur des virions disloqués (solubilisés) (Genetic System). BALB / c mice were immunized by intraperitoneal injection with 0.3ml purified glycoproteins 2-5pg, re-hooked on
Lentil-Lectin Sepharose 4B (50-100 μl), The mice were boosted every 4-6 weeks for 24 hours with the same immunogen. These mice were monitored for antibody production, qualitatively by RIPA test on extracts of HIV-2 virions labeled with [3SS3 methionine and quantitatively with the EIA test on disrupted (solubilized) virions (Genetic System).
Trois jours après la dernière injection, des cellules de rate ont été fusionnées avec des cellules de myélome NSl conformément à la méthode de Kohler et
Milstein (10 > . Des plaques de fusion à 96 puits ont été criblées pour détecter la présence d' hybridomes secrétant des anticorps anti-HIV-2 en utilisant le test EIA sur virions disloqués (solubilisés) de
Genetic System. Des méthodes pour la propagation et la stabilisation des hybridomes clonés et pour la production d'ascite ont déjà été décrites (7 > . Les surnageants de culture des hybridomes ont été criblés par des analyses RIPA et Western Blot. Un anticorps monoclonal (mAb11H8, réagissant avec la glycoprotéine a ensuite été caractérisé avec la séquence d'acides aminés 579-604 de la glycoprotéine transmembranaire de
HIV-2 correspondante en utilisant un test EIA basé sur un peptide synthétique (16) La séquence d'acides aminés 579-604 est hautement conservée parmi tous les isolats HIV-2 et SIV séquencés, l'anticorps monoclonal 1H8 produit une réaction croisée avec tous les isolats
HIV-2 et SIV ainsi testés.Le peptide synthétique p39' utilisé a été synthétisé d'après -la séquence d'acides aminés 579-604 déduite de la séquence nucléotidique de l'enveloppe de HIV-2ion. La séquence d'acides aminés du peptide synthétique p39' est la suivante:
VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH
TEST DE RADIO-IMMUNOPRECIPITATION (RIPA)
Les extraits cellulaires ou viraux (20 ul) (produit correspondant à 10' cellules infectées) ont d'abord été dilués dans deux -volumes de tampon RIPA [(lOmM Tris-HCl pH 7,6, 150mM NaCl, lmM EDTA, 1%
Triton X-100 (v/v), 0,2% sodium déoxycholate (wt/v), 0,1% SDS (wt/v), 7mM 2ss-mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF, 100 /ml d'aprotinime (Iniprol,Choay) et 20% de glycérol (v/v)].Les extraits dilués ont ensuite été incubés (45 minutes, 40C) avec des anticorps polyclonaux ou monoclonaux (25 pl). La protéine A
Sepharose a ensuite été ajoutée et les échantillons ont été incubés pendant 3 heures à 40C. Ces échantillons ont ensuite été lavés dans un tampon
RIPA. Les protéines récupérées par immunoprécipitation ont été éluées en chauffant (950C, 5 minutes) dans un tampon d'électrophorèse [125mM Tris-HCl, pH6,8, 1% SDS (wt/v), 20% glycérol (v/v), 0,5% 2 g-mercaptoethanol]. Three days after the last injection, spleen cells were fused with NS1 myeloma cells according to Kohler's method and
Milstein (10) 96-well fusion plates were screened for the presence of hybridomas secreting anti-HIV-2 antibodies using the EIA dislocated (solubilized) virus assay.
Genetic System. Methods for the propagation and stabilization of cloned hybridomas and for the production of ascites have already been described (7) Hybridoma culture supernatants were screened by RIPA and Western Blot assays.A monoclonal antibody (mAb11H8, reactive with the glycoprotein was then characterized with the amino acid sequence 579-604 of the transmembrane glycoprotein of
Corresponding HIV-2 using a synthetic peptide-based EIA test (16) The amino acid sequence 579-604 is highly conserved among all the HIV-2 and SIV sequenced isolates, the monoclonal antibody 1H8 cross-reacts with all isolates
HIV-2 and SIV thus tested. The synthetic peptide p39 'used was synthesized from amino acid sequence 579-604 deduced from the nucleotide sequence of the HIV-2ion envelope. The amino acid sequence of the synthetic peptide p39 'is as follows:
VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH
RADIO IMMUNOPRECIPITATION TEST (RIPA)
Cellular or viral extracts (20 μl) (product corresponding to 10 infected cells) were first diluted in two volumes of RIPA buffer (10mM Tris-HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1%).
Triton X-100 (v / v), 0.2% sodium deoxycholate (wt / v), 0.1% SDS (wt / v), 7mM 2ss-mercaptoethanol, 0.2 mM PMSF, 100 / ml aprotinime (Iniprol, Choay) and 20% glycerol (v / v)] The diluted extracts were then incubated (45 minutes, 40C) with polyclonal or monoclonal antibodies (25 μl). Protein A
Sepharose was then added and the samples were incubated for 3 hours at 40C. These samples were then washed in a buffer
RIPA. Proteins recovered by immunoprecipitation were eluted by heating (950C, 5 minutes) in electrophoresis buffer [125mM Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS (wt / v), 20% glycerol (v / v), 0.5% 2 g-mercaptoethanol].
Les protéines éluées ont été récupérées par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide SDS 7,5 ou 12,5% contenant 0,1% bis-acrylamide au lieu de 0,2% (wt/v).The eluted proteins were recovered by electrophoresis on SDS 7.5 or 12.5% polyacrylamide gels containing 0.1% bis-acrylamide instead of 0.2% (wt / v).
ANALYSE IMMUNOBLOT APRES TRANSFERT ELECTROPHORETIQUE
WESTERN BLOT
Les protéines ont été soumises à une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avant d'être électrophorétiquement transférées sur des feuilles de nitrocellulose 0,45pm (Schleicher et Schûll, Dassel,
FRG) dans un tampon d'électrode (20mM base Tris 150mM glycine, 20% méthanol, v/v) tel que décrit par (3).IMMUNOBLOT ANALYSIS AFTER ELECTROPHORETIC TRANSFER
WESTERN BLOT
Proteins were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis analysis before being electrophoretically transferred to 0.45 μm nitrocellulose sheets (Schleicher and Schul, Dassel,
FRG) in an electrode buffer (20mM Tris base 150mM glycine, 20% methanol, v / v) as described by (3).
Les empreintes d'électrophorèse ont été saturées avec 5% (w/v) de lait en poudre écrémé dans P8S (9). Elles ont ensuite été incubées dans un sac scellé (toute la nuit à 40C) soit avec des sérums positifs pour HIV-1 ou avec des sérums positifs pour HIV-2 (à une dilution de 1:100) ou avec des anticorps de souris polyclonaux ou monoclonaux (à une dilution de 1:200) dans du PBS contenant 10% FCS. Les feuilles ont ensuite été lavées- dans PBS, le PBS contenant 5% de Nonidet P-40 puis resaturée dans PBS contenant du lait écrémé (5%).Les feuilles lavées ont ensuite été incubée (2 heures à température ambiante) dans un sac scellé soit avec une préparation de protéines A marquées avec 1125 (Amersham, > 30mCi/mg) pour révéler les anticorps polyclonaux humains dans les sérums HIV-1 ou HIV-2 ou avec une préparation d'immunoglobulines .de chèvre anti-souris marquées au 1125 (Amersham ; 2-10 pCi/g). Electrophoresis fingerprints were saturated with 5% (w / v) skimmed milk powder in P8S (9). They were then incubated in a sealed bag (overnight at 40C) either with HIV-1 positive sera or with HIV-2 positive sera (at a 1: 100 dilution) or with polyclonal mouse antibodies. or monoclonal (at a dilution of 1: 200) in PBS containing 10% FCS. The leaves were then washed in PBS, PBS containing 5% Nonidet P-40 and then resaturated in PBS containing skim milk (5%) .The washed leaves were then incubated (2 hours at room temperature) in a bag. sealed with either 1125-labeled protein preparation (Amersham,> 30mCi / mg) to reveal human polyclonal antibodies in HIV-1 or HIV-2 sera or with an anti-mouse goat immunoglobulin preparation labeled with 1125 (Amersham, 2-10 pCi / g).
Les feuilles ont été sorties des sacs et lavées à nouveau, séchées puis autoradiographiées (Kodak RP
Royal, X-Ray Films) pour 24-48 heures.The leaves were removed from the bags and washed again, dried and then autoradiographed (Kodak RP
Royal, X-Ray Films) for 24-48 hours.
RESULTATS
DETECTION DE LA GLYCOPROTEINE DE 80 kDa DANS DES
CELLULES INFECTEES PAR HIV-2 ET DANS LE VIRION
On a déjà montré (13) que le précurseur des glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 est une proteine de 140-kDa (gp140) qui nécessite la formation d'un dimere homologue au cours de sa transformation en produits matures, à savoir les glycoprotéines extracellulaires (gp125) et transmembranaires (gp36).RESULTS
DETECTION OF 80 kDa GLYCOPROTEIN IN
CELLS INFECTED BY HIV-2 AND IN THE VIRION
It has already been shown (13) that the HIV-2 envelope glycoprotein precursor is a 140-kDa protein (gp140) which requires the formation of a homologous dimer during its transformation into mature products, namely the extracellular (gp125) and transmembrane glycoproteins (gp36).
On a maintenant mis en évidence que la glycoprotéine transmembranaire existe sous forme d'un homodimère ayant une mobilité électrophrétique sur des gels de polyacrylamide à une position correspondante à une protéine de 80-kDa (figures 1 à 6). Cette protéine est glycosylée et par commodité elle sera désignée par l'expression gp80.It has now been demonstrated that the transmembrane glycoprotein exists as a homodimer with electrophoretic mobility on polyacrylamide gels at a position corresponding to an 80-kDa protein (FIGS. 1 to 6). This protein is glycosylated and for convenience it will be referred to as gp80.
Des extraits bruts de cellules CEM infectées par HIV-lrro ou HIV-2woD ou encore des cellules de ce type non infectées ont été analysés par test immunoblot après transfert électrophorétique (Western blot) en utilisant un sérum positif pour HIV-1 et 3 sérums différents positifs pour HIV-2 recueillis chez des patients atteints de SIDA (figure 1).Les sérums spécifiques de HIV-2 identifiaient les précurseurs de l'enveloppe (gp140 et gp300) et en plus reconnaissaient fortement la glycoprotéine de 80 kDa (gap80). Ces sérums étaient spécifiques des protéines de HIV-2 puisqu'ils ne reconnaissaient pas les protéines de HIV-1 suivantes qui étaient détectables en utilisant un sérum spécifique de HIV-1 : le précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe gp120 de
HIV-1 et les précurseurs de la protéine gag (p55 et p40 pour HIV-1). L'association de gp80 à l'infection due à HIV-2 a été démontrée par plusieurs résultats dans lesquels gp80 n'a pas été identifié par des sérums HIV-1 positifs ni dans des cellules infectées par HIV-1.Crude extracts of CEM cells infected with HIV-1rro or HIV-2woD or even non-infected cells of this type were analyzed by immunoblotting test after electrophoretic transfer (Western blot) using a serum positive for HIV-1 and 3 different sera. positive for HIV-2 collected in patients with AIDS (Figure 1). HIV-2 specific sera identified precursors of the envelope (gp140 and gp300) and in addition strongly recognized the 80 kDa glycoprotein (gap80). These sera were specific for HIV-2 proteins since they did not recognize the following HIV-1 proteins that were detectable using a specific serum of HIV-1: the precursor of the gp120 envelope glycoprotein.
HIV-1 and the precursors of the gag protein (p55 and p40 for HIV-1). The association of gp80 with HIV-2 infection has been demonstrated by several results in which gp80 has not been identified by HIV-1 positive sera or in HIV-1 infected cells.
Une analyse Western blot des culots de virus préparés par centrifugation (100.000g pendant 30 minutes) d'un milieu de culture infecté a montré que la gp80 pouvait également être détectée dans des particules de HIV-2 en même temps que la glycoprotéine extracellulaire gp125. Western blotting of the pellets of viruses prepared by centrifugation (100,000g for 30 minutes) of an infected culture medium showed that gp80 could also be detected in HIV-2 particles along with the extracellular glycoprotein gp125.
SYNTHESE DE aD80 DANS DES CELLULES INFECTEES PAR HIV-2
Des expériences préliminaires ont montré que tous les sérums HIV-2 positifs pouvaient immunoprécipiter la gp80 ainsi que les précurseurs de l'enveloppe, gp140 et gp300 ainsi que la glycoprotéine extracellulaire gp125. Pour caractériser la synthèse de gp80, on a utilisé un sérum HIV-2 positif réagissant fortement avec les protéines d'enveloppe.SYNTHESIS OF αD80 IN HIV-2 INFECTED CELLS
Preliminary experiments showed that all HIV-2 positive sera could immunoprecipitate gp80 as well as the envelope precursors, gp140 and gp300 as well as the extracellular glycoprotein gp125. To characterize gp80 synthesis, HIV-2 positive serum reacting strongly with envelope proteins was used.
Des anticorps purifiés de ce sérum ont été couplés à une colonne de sépharose activé par CNBr (HIV-2 sérum-Sépharose), utilisée comme colonne d'immunoaffinité pour purifier les glycoprotéines d'enveloppe. Les cellules infectées par HIV-2 ont été marquées avec EHigIucosamine et à différents moments (2,3,4,6 et 8 heures) des extraits ont été préparés à partir des cellules infectées et à partir des culots viraux. Tous les échantillons ont été purifiés sur
HIV-2 sérum-Sépharose et les protéines marquées ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (figure 2); après 2 heures, la gpl40-et la gp300 sont les seules protéines marquées détectables dans les cellules infectées.La gp125 et la gp80 sont devenues détectables 3 ou 4 heures après le début du marquage et elles sont également devenues détectables dans les agrégats (culots) de virus préparés à partir du milieu de culture. 6 ou 8 heures après le début du marquage, la gpl25 et la gp80 ont pu clairement être détectées. Ces résultats indiquent que la gp80 est associée aux particules virales et suggèrent que cette gp80 doit être un produit mature d'un précurseur qui nécessite une maturation.Purified antibodies to this serum were coupled to a CNBr-activated Sepharose (HIV-2 serum-Sepharose) column, used as an immunoaffinity column to purify envelope glycoproteins. The cells infected with HIV-2 were labeled with EHIGIUCOSAMINE and at different times (2,3,4,6 and 8 hours) extracts were prepared from the infected cells and from the viral pellets. All samples were purified on
HIV-2 serum Sepharose and labeled proteins were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (Fig. 2); after 2 hours, gp140- and gp300 are the only detectable labeled proteins in the infected cells. gp125 and gp80 became detectable 3 or 4 hours after the start of labeling and they also became detectable in the aggregates (pellets) of viruses prepared from the culture medium. 6 or 8 hours after the beginning of the marking, the gp125 and the gp80 could clearly be detected. These results indicate that gp80 is associated with viral particles and suggests that this gp80 should be a mature product of a precursor that requires maturation.
Dans ces expériences une gp36 marquée avec le (2H3glucosamine a également pu être détectée mais pas de façon intracellulaire. Une protéine de 200 kDa apparait également sur la figure 2 et correspond probablement à une protéine cellulaire puisqu'elle n'a pas été immunoprécipitée par d'autres sérums HIV-2 positifs. In these experiments a gp36 labeled with (2H3glucosamine could also be detected but not intracellularly.) A 200 kDa protein also appears in Figure 2 and probably corresponds to a cellular protein since it was not immunoprecipitated by other HIV-2 positive sera.
Les résultats de cinétique concernant la synthèse des glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 sont conformes au résultat déjà obtenus. Dans les cellules infectées par HIV-2, la gp140 est le premier produit d'enveloppe détectable 15 minutes après le marquage (pulselabelling). Pendant la période du suivi du traceur (chase) la forme dimérique du précurseur de l'enveloppe (gp300) a pu être détectée après 30 minutes alors que la glycoprotéine extracellulaire mature (gp125) est devenue détectable 1 h.30 à 3 heures après le début (13). The kinetic results concerning the synthesis of HIV-2 envelope glycoproteins are consistent with the result already obtained. In HIV-2 infected cells, gp140 is the first detectable envelope product 15 minutes after labeling (pulselabelling). During the tracer (chase) monitoring period, the dimeric form of the envelope precursor (gp300) could be detected after 30 minutes whereas the mature extracellular glycoprotein (gp125) became detectable 1 h 30 to 3 h after beginning (13).
IDENTIFICATION DE LA qD80 PAR DES ANTICORPS
POLYCLONAUX DIRIGES CONTRE LE PRECURSEUR D'ENVELOPPE
DE HIV-2.IDENTIFICATION OF qD80 WITH ANTIBODIES
POLYCLONAUX DIRECTED AGAINST THE ENVELOPE PRECURSOR
Of HIV-2.
Pour caractériser les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 on a préparé des anticorps polyclonaux dirigés contre le précurseur dimérique purifié gp300. To characterize the HIV-2 envelope glycoproteins, polyclonal antibodies directed against purified dimer precursor gp300 were prepared.
Pour cela la gp300 a d'abord été partiellement purifiée par un immunoadsorbant avec des anticorps d'un patient séropositif pour HIV-2 avant purification par électrophorèse préparative. Cinq souris ont été immunisées avec 5pg de cette préparation de gp300 purifiée, administrée intrapéritonéalement 5 fois à 10 jours d'intervalles. Poly(A).poly(U) (200wu) a été utilisé comme adjuvant administré en mélange avec l'antigène (voir Matériels et Méthodes). Toutes les souris ont développé des anticorps contre la gp300.For this, the gp300 was first partially purified by an immunoadsorbent with antibodies of a patient seropositive for HIV-2 before purification by preparative electrophoresis. Five mice were immunized with 5 μg of this purified gp300 preparation, administered intraperitoneally 5 times at 10-day intervals. Poly (A) .poly (U) (200wu) was used as an adjuvant administered in admixture with the antigen (see Materials and Methods). All mice developed antibodies against gp300.
Ces anticorps sont des anticorps polyclonaux contre la gp300 (anticorps anti-gp300). La figure 3 montre les résultats d'une analyse Western blot mettant en oeuvre les anticorps de l'une des souris immunisées. Des anticorps anti-gp300 ont réagi spécifiquement avec la gp300, mais également avec les gp140, gp125 et gp80 présentes dans des cellules infectées par HIV-2. Aucun signal spécifique n'a été observé dans des cellules
CEM infectées par HIV-1 ou dans des cellules non infectées. Le marquage parfois observé d'une protéine de 60 kDa avec des anticorps anti-gp300 était probablement non spécifique puisqu'il a été observé dans les extraits cellulaires indépendamment de l'infection virale (figure 3, section cellules:"CELLS") et dans certaines expériences il n'a pas été observé du tout.Ces anticorps polyclonaux ont également été utilisés dans un test Western blot similaire en mettant en oeuvre des extraits de cellules infectées par HIV-2, de même que des agrégats de virus. Dans les extraits cellulaires, les anticorps reconnaissaient la gp300, la gp140 et la gp80 (figure 3, section HIV-2, ligne C). Dans les extraits viraux, ils reconnaissaient la gpl25, la gp80 et la protéine de 36 kDa qui est probablement la glycoprotéine transmembranaire gp36 (figure 3, section HIV-2, ligne
V). Après une exposition prolongée il a été possible de détecter un signal correspondant à la position de la gp36 dans les extraits cellulaires De façon intéressante on note que le niveau de gp80 et de gp36 était beaucoup plus élevé dans l'agrégat (culot) viral comparé à son niveau dans les extraits cellulaires.These antibodies are polyclonal antibodies against gp300 (anti-gp300 antibody). FIG. 3 shows the results of a Western blot analysis using the antibodies of one of the immunized mice. Anti-gp300 antibodies reacted specifically with gp300, but also with gp140, gp125 and gp80 present in HIV-2 infected cells. No specific signal was observed in cells
CEM infected with HIV-1 or in uninfected cells. The sometimes observed labeling of a 60 kDa protein with anti-gp300 antibodies was probably non-specific since it was observed in the cell extracts independently of the viral infection (FIG. 3, cell section: "CELLS") and in some experiments were not observed at all. These polyclonal antibodies were also used in a similar Western blot test using extracts of cells infected with HIV-2, as well as aggregates of virus. In the cell extracts, the antibodies recognized gp300, gp140 and gp80 (FIG. 3, section HIV-2, line C). In the viral extracts, they recognized gp125, gp80 and the 36 kDa protein which is probably the transmembrane glycoprotein gp36 (Figure 3, section HIV-2, line
V). After prolonged exposure it was possible to detect a signal corresponding to the position of gp36 in the cell extracts Interestingly we note that the level of gp80 and gp36 was much higher in the viral aggregate (pellet) compared to its level in cell extracts.
Ces résultats montrent que les anticorps polyclonaux dirigés contre le précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe identifient la gp80, de même que tous les composants de l'enveloppe de HIV-2. C'est pourquoi la gp80 peut être mise en relation avec l'enveloppe de HIV-2. La glycoprotéine gp80 est associée avec le virus ; il s'agit probablement d'un produit mature. These results show that the polyclonal antibodies directed against the envelope glycoprotein precursor identify gp80, as well as all components of the HIV-2 envelope. This is why the gp80 can be related to the HIV-2 envelope. The glycoprotein gp80 is associated with the virus; it is probably a mature product.
IDENTIFICATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX 1H8 DIRIGES
CONTRE LA aD80 SPECIFIQUE DE LA GLYCOPROTEINE
TRANSMEMBRANAIRE DE HIV-2.IDENTIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES 1H8 DIRECTED
AGAINST GLYCOPROTEIN-SPECIFIC aD80
TRANSMEMBRANE OF HIV-2.
L'anticorps monoclonal mAb 1H8 a été utilisé dans un test Western blot pour déterminer quelles protéines virales peuvent être identifiées. Dans les cellules infectées par HIV-2, mAb 1H8 a identifié la gap3001 la gap140 et la gp80 alors que dans les particules de
HIV-2 il a identifié principalement la gp80 et faiblement la gp36 et la gp300 (figure 4). La présence d'un faible taux de gp300 dans l'agrégat viral était probablement due à des contaminations venant des cellules lysées puisqu'il s'agit d'une protéine cellulaire (13). Le signal faible avec la gp36 reflète probablement le faible niveau de cette protéine. mAb 1H8 n'a pas reconnu la glycoprotéine extracellulaire gp125 (figure 4).De plus, ' aucune protéine des extraits de cellules infectées par HIV-1 ou de l'agrégat de virus n'a été reconnue. Ces résultats montrent qu'il existe une spécificité de l'anticorps mAb 1H8 pour les précurseurs d'enveloppe de HIV-2 (gp140 et gp300) et la glycoprotéine transmembranaire (gp36). La réactivité de mAb 1H8 a été localisée avec la séquence d'acides aminés 579-604 de la glycoprotéine transmembranaire de HIV-2, en utilisant un peptide synthétique p39'.MAb 1H8 monoclonal antibody was used in a Western blot test to determine which viral proteins can be identified. In cells infected with HIV-2, mAb 1H8 identified the gap3001 gap140 and gp80 whereas in
HIV-2 he identified mainly gp80 and weakly gp36 and gp300 (Figure 4). The presence of a low level of gp300 in the viral aggregate was probably due to contaminations from the lysed cells since it is a cellular protein (13). The weak signal with gp36 probably reflects the low level of this protein. mAb 1H8 did not recognize the extracellular glycoprotein gp125 (Figure 4). Furthermore, no protein from HIV-1 infected cell extracts or virus aggregate was recognized. These results show that there is a specificity of the mAb 1H8 antibody for the HIV-2 envelope precursors (gp140 and gp300) and the transmembrane glycoprotein (gp36). The reactivity of mAb 1H8 was localized with the amino acid sequence 579-604 of the transmembrane glycoprotein of HIV-2, using a synthetic peptide p39 '.
Pour montrer la spécificité de la réactivité de mAb 1H8 avec gp80, un test Western blot, utilisant des extraits d'agrégat viral de HIV-2 a été réalisé. Après le transfert des protéines, des feuilles de nitrocellulose ont été incubées avec des anticorps mAb 1H8 ou des anticorps polyclonaux contre la gp300, en l'absence ou en présence de peptides 39' (figure 5). To show the specificity of the reactivity of mAb 1H8 with gp80, a Western blot test using extracts of viral aggregate of HIV-2 was performed. Following protein transfer, nitrocellulose sheets were incubated with mAb 1H8 antibodies or polyclonal antibodies against gp300 in the absence or presence of 39 'peptides (Figure 5).
Le mAb 1H8 a donné un signal fort avec la gp80. De plus, un signal pour la gp36 a été observé mais uniquement après une exposition prolongé de l'autoradiogramme. Des anticorps anti-gp300 ont réagi avec la gp125, la gp80 et la gp36 ; le signal obtenu avec la protéine 60-kKa n'était pas spécifique (comme dans la figure 3). L'addition de peptide p39' a complètement aboli les signaux obtenus avec mAb 1H8 mais pas ceux obtenus avec les anticorps anti-gp300 (figure 5). Ces observations confirment que la réactivité de mAb 1H8 pourrait être spécifique du résidu de 26 acides aminés correspondant à la séquence 579 à 604 de la glycoprotéine transmembranaire de
HIV-2. En conséquence, une séquence correspondant à celle du peptide p39' pourrait être présente dans la gp80.La réactivité des anticorps anti-gp300 n'a pas été modifiée par le peptide P39'. C'est pourquoi ces anticorps polyclonaux pourraient interagir avec d'autres épitopes que ceux correspondant au peptide p39'.The mAb 1H8 gave a strong signal with the gp80. In addition, a signal for gp36 was observed but only after prolonged exposure of the autoradiogram. Anti-gp300 antibodies reacted with gp125, gp80 and gp36; the signal obtained with the 60-kKa protein was not specific (as in Figure 3). The addition of p39 'peptide completely abolished the signals obtained with mAb 1H8 but not those obtained with the anti-gp300 antibodies (FIG. 5). These observations confirm that the reactivity of mAb 1H8 could be specific for the residue of 26 amino acids corresponding to the sequence 579 to 604 of the transmembrane glycoprotein of
HIV-2. Consequently, a sequence corresponding to that of the p39 'peptide could be present in the gp80. The reactivity of the anti-gp300 antibodies was not modified by the P39' peptide. This is why these polyclonal antibodies could interact with other epitopes than those corresponding to the p39 'peptide.
IMMUNOPRECIPITATION DE LA aD80 PAR DES ANTICORPS
POLYCLONAUX ANTI-an300 ET PAR mAb 1H8
Des anticorps polyclonaux ont immunoprécipité la gp300, la gp140 et la gp125 ainsi que la gp80, alors que mAb 1H8 a immunoprécipité la gp300, la gp140 et la gp80 (figure 6). Deux protéines cellulaires (60 et 45-kDa) ont également été associées avec les préparations de complexes immuns en utilisant à la fois les anticorps polyclonaux et monoclonaux (figure 6, lignes 0 et 2 heures). La présence de protéines de 60 et 45 kDa dans la préparation de complexes immuns était due à leur accrochage avec la protéine A
Sepharose ; cette dernière a été utilisée de façon à récupérer les complexes immuns formés avec les différents anticorps.IMMUNOPRECIPITATION OF αD80 BY ANTIBODIES
POLYCLONAL ANTI-AN300 AND BY mAb 1H8
Polyclonal antibodies immunoprecipitated gp300, gp140 and gp125 as well as gp80, whereas mAb 1H8 immunoprecipitated gp300, gp140 and gp80 (Figure 6). Two cellular proteins (60 and 45-kDa) were also associated with immune complex preparations using both polyclonal and monoclonal antibodies (Figure 6, lines 0 and 2 hours). The presence of 60 and 45 kDa proteins in the preparation of immune complexes was due to their attachment with protein A
Sepharose; the latter was used to recover the immune complexes formed with the different antibodies.
Des cellules infectées par HIV-2 ont été marquées pendant 30 minutes par la technique "pulse" et le marqueur a été suivi (chase) pendant 2 et 4 heures. HIV-2 infected cells were labeled for 30 minutes by the "pulse" technique and the marker was followed (chase) for 2 and 4 hours.
Des extraits de cellules marquées (temps 0,2 et 4 heures) et l'agrégat viral récupéré après 4 heures de suivi (chase) ont été analysés par test d'immunop;récipitation en utilisant des anticorps polyclonaux contre la gp300 et l'anticorps mAb 1H8 (figure 6). Avec les anticorps polyclonaux et monoclonaux, la gp80 ne pouvait être détectée pendant la période de marquage (pulse). Elle est devenue clairement apparente après 2 heures de suivi (chase) dans les cellules infectées. Lorsque le suivi (chase) a été prolongé jusqu'à 4 heures, alors la gp80 marquée à la [35S]méthionine est devenue indétectable dans les cellules infectées.L'analyse de l'agrégat viral produit après 4 heures a montré que, comme la glycoprotéine extracellulaire gp125, la gp80 était associée aux particules virales (figure 6).- On peut penser que la gp80 est un produit de maturation de l'enveloppe de HIV-2. Le fait que la gp80 a été identifiée par des anticorps monoclonaux spécifiques de la glycoprotéine transmembranaire de HIV-2 a montré qu'elle correspond à la forme dimérique de la gp36 (confirné par les résultats montré sur les figures 8 et 9). La détection de gp80 n'était pas restreinte aux cellules CEM infectées puisqu'elle a également été détectée dans les lymphocytes T4 infectés par HIV-2.Extracts of labeled cells (time 0.2 and 4 hours) and the viral aggregate recovered after 4 hours of follow-up (chase) were analyzed by immunop assay, recipitation using polyclonal antibodies against gp300 and antibody mAb 1H8 (Figure 6). With polyclonal and monoclonal antibodies, gp80 could not be detected during the pulse period. It became clearly apparent after 2 hours of tracking (chase) in the infected cells. When the chase was extended to 4 hours, then the [35 S] methionine-labeled gp80 became undetectable in the infected cells. the extracellular glycoprotein gp125, the gp80 was associated with the viral particles (Figure 6). It is possible to think that the gp80 is a product of maturation of the envelope of HIV-2. The fact that gp80 has been identified by monoclonal antibodies specific for the transmembrane glycoprotein of HIV-2 has shown that it corresponds to the dimeric form of gp36 (confirmed by the results shown in FIGS. 8 and 9). The detection of gp80 was not restricted to infected CEM cells since it was also detected in HIV-2 infected T4 cells.
La comparaison des résultats obtenus par des analyses Western blot et par des tests d'immunoprécipitation montre que les sérums humains positifs pour HIV-2, les anticorps polyclonaux murins et mAb 1H8 reconnaissent les formes dénaturées de gp80 et gpl25 mieux que les formes natives (figure 1, 2, 3, 4 et 6). Les formes natives de ces glycoprotéines natures ont probablement des conformations qui masquent les épi topes identifiés par les différents anticorps. The comparison of the results obtained by Western blot analyzes and by immunoprecipitation tests shows that HIV-2 positive human sera, murine polyclonal antibodies and mAb 1H8 recognize the denatured forms of gp80 and gp125 better than the native forms (FIG. 1, 2, 3, 4 and 6). The native forms of these naturally occurring glycoproteins probably have conformations that mask the epitopes identified by the different antibodies.
INCORPORATION DE GLUCOSAMINE ET DE FUCOSE DANS LA pt80
Des extraits de cellules infectées par le virus
HIV-2, métaboliquement marquées avec t3Hlglucosamine et [H]fucose ont été immunoprécipités en utilisant des anticorps mAb 1H8 et des anticorps polyclonaux anti-gp300. Conformément aux résultats précédents (figures 3-6 > les anticorps anti-gp300 ont immunoprécipité des glycoprotéines arquées avec les sucres, à savoir les gp300, gp140, gp125 et gp80 alors que mAb 1H8 a immunoprécipité les gp300, gp140 et gp80.Toutes ces protéines ont incorporé le [3H]glucosamine alors que l'incorporation de [ H]fucose apparaissait la plupart du temps dans les gp125 et gp80 (figure 7A > . Dans ces expériences, le marquage de la gp36 avec [H]fucose a été observé faiblement après une exposition prolongée de l'autoradiogramme. La gp80 peut aussi incorporer du [3H]mannose de la même façon que les gp300, gpl40 et gp125. L'incorporation de ces sucres marqués dans la gp80 et dans d'autres glycoprotéines a été totalement bloquée avec de la tunicamycine (15) un antibiotique qui inhibe la glycosylation des protéines liées sur l'azote.INCORPORATION OF GLUCOSAMINE AND FUCOSE IN PO80
Extracts from cells infected with the virus
HIV-2, metabolically labeled with Glucosamine and [H] fucose were immunoprecipitated using mAb 1H8 antibodies and polyclonal anti-gp300 antibodies. In accordance with the previous results (FIGS. 3-6), the anti-gp300 antibodies immunoprecipitated glycosylated glycoproteins with the sugars gp300, gp140, gp125 and gp80 whereas mAb 1H8 immunoprecipitated gp300, gp140 and gp80. incorporated [3H] glucosamine whereas incorporation of [H] fucose appeared most of the time in gp125 and gp80 (Figure 7A>. In these experiments, labeling of gp36 with [H] fucose was observed weakly After prolonged exposure of the autoradiogram, gp80 can also incorporate [3H] mannose in the same way as gp300, gp140 and gp125, and incorporation of these labeled sugars into gp80 and other glycoproteins was totally blocked with tunicamycin (15) an antibiotic that inhibits the glycosylation of protein bound on nitrogen.
Les oligosaccharides de glycoprotéines, liés sur l'asparagine (contenant la N-acétylglucosamine, le mannose et le glucose) subissent une maturation plus importante après leur attachement à des protéines natives (11). Les chaînes oligosaccharidiques sont coupées aux extrémités dans le réticulum endoplasmique et dans l'appareil de Golgi avant le transfert des résidus fucose et de l'acide sialique. C'est pourquoi l'incorporation des résidus fucose a lieu longtemps après les étapes de glycosylation. Dans les cellules infectées par HIV-2, le (3H]fucose est incorporé en majorité dans la gp125 et la gp80 (figure 7) deux protéines qui correspondent à des produits matures de précurseurs d'enveloppe de HIV-2 (figure 6).Pour confirmer que la gp120 a été produite pendant la maturation du précurseur d'enveloppe, des cellules infectées avec HIV-2 ont été marquées avec la [35S]méthionine en l'absence ou en présence d'un inhibiteur de glucosidase, la castanospermine (14). Glycoprotein oligosaccharides, bound to asparagine (containing N-acetylglucosamine, mannose and glucose) undergo greater maturation after attachment to native proteins (11). The oligosaccharide chains are cut at the ends in the endoplasmic reticulum and in the Golgi apparatus before the transfer of fucose residues and sialic acid. This is why the incorporation of fucose residues takes place long after the glycosylation steps. In HIV-2 infected cells, (3H) fucose is incorporated predominantly in gp125 and gp80 (Fig. 7) two proteins that correspond to mature HIV-2 envelope precursor products (Fig. 6). To confirm that gp120 was produced during maturation of the envelope precursor, cells infected with HIV-2 were labeled with [35S] methionine in the absence or in the presence of a glucosidase inhibitor, castanospermine ( 14).
Les surnageants de culture ont ensuite été testés par immunoprscipitation en utilisant un sérum d'un patient positif pour HIV-2 qui reconnaissait plusieurs protéines virales. En présence de castanospermine, la production de gp80 et de gp125 a été considérablement réduite alors que la production de la protéine majeure de nucléocapside (core) (p26) n'a pas été significativement affectée (figure 7b > . Culture supernatants were then assayed by immunoprecipitation using a serum from an HIV-2 positive patient that recognized several viral proteins. In the presence of castanospermine, the production of gp80 and gp125 was significantly reduced while the production of the major core protein (p26) was not significantly affected (Figure 7b).
DISSOCIATION DE aD80 EN am36
Des expériences ont été réalisées pour optimiser les conditions dans lesquelles la dissociation de gp80 pouvait avoir lieu, ces conditions correspondant à un milieu fortement salin, un pH acide, un détergent ionique EDTA ou EGTA. Nous avons testé la méthode telle que décrite dans (13) permettant de dissocier la gp300 par incubation dans un tampon faiblement acide.DISSOCIATION OF aD80 IN am36
Experiments were carried out to optimize the conditions under which the dissociation of gp80 could take place, these conditions corresponding to a highly saline medium, an acidic pH, an ionic detergent EDTA or EGTA. We tested the method as described in (13) to dissociate the gp300 by incubation in a weakly acidic buffer.
Bien que cette méthode puisse convenir à la dissociation de gp80, avec un tampon a pH inférieur à pH6, la plupart des glycoprotéines gp80 ont été dégradées. Dans toutes les expériences on a préparé des extraits de cellules infectées ou d'agrégats viraux en mettant en oeuvre un tampon de lyse contenant un détergent non ionique, le Triton X-100. Although this method may be suitable for dissociation of gp80, with a buffer pH below pH6, most gp80 glycoproteins have been degraded. In all experiments, extracts of infected cells or viral aggregates were prepared using a lysis buffer containing a nonionic detergent, Triton X-100.
Dans ces conditions, la gp300 et la gp80 ne sont pas dissociées, même après addition de détergent ionique
SDS. On a recherché l'effet du SDS lorsqu'il est substitué au Triton pour la préparation des extraits.Under these conditions, gp300 and gp80 are not dissociated, even after addition of ionic detergent
SDS. The effect of SDS when substituted for Triton for the preparation of extracts was investigated.
Les cellules infectées par HIV ont été marquées avec la L35Simétionine avant préparation des extraits par solubilisation dans un tampon de lyse contenant soit 1% de Triton X-100 soit 1% de SDS. Ces extraits ont ensuite été dilués 10 fois dans un tampon de lyse sans détergent et immunoprécipités en utilisant mAb 1H8.HIV-infected cells were labeled with L35Simetidine prior to preparation of the extracts by solubilization in lysis buffer containing either 1% Triton X-100 or 1% SDS. These extracts were then diluted 10-fold in lysing buffer without detergent and immunoprecipitated using mAb 1H8.
Les préparations de complexes immuns à partir des extraits au Triton ont montré la présence de bandes marquées à la [35S]méthionine correspondant à la gp300, la gpl40 et la gp80, et des bandes faibles de gp36 (figure 8, section C ligne 1). Par tailleurs, lorsque les extraits ont été préparés avec le SDS, alors la gp300 et la gp80 étaient pratiquement indétectables alors que le niveau de gp140 et de gp36 étaient accrus (figure 8, section C, ligne 2). Donc en présence d'un détergent ionique les formes dimériques gp300 et gp80 ont été dissociées en donnant lieu à la production de gp140 et de gp36 respectivement. La dissociation de gp300 purifiée, marquée à la [35S]méthionine a donné lieu seulement à la formation de gp140 (13). La gp36 ne doit donc exister qu'après la dissociation de la gp80.On remarque que la dégradation de protéines peut également avoir-lieu en présence de SDS dès lors que toutes les protéines gp300 et gp80 marquées n'ont pas été récupérées parmi les protéines dissociées (figure 8 section C). La présence de 200 unités/ml d'aprotinine et de 0,2mM
PMSF n'a pas empêché une telle dégradation pendant l'incubation avec SDS. Il se peut que les formes dimériques des protéines présentent une conformation telles qu'elles résistent à la protéolyse. La dissociation de gp300 et gp80 peut ensuite conduire à des modifications conformationnelles rendant les sites protéolytiques accessibles.Immune complex preparations from Triton extracts showed the presence of [35 S] methionine labeled bands corresponding to gp300, gp140 and gp80, and weak bands of gp36 (Figure 8, section C line 1). . By tailors, when the extracts were prepared with SDS, then gp300 and gp80 were virtually undetectable while the level of gp140 and gp36 were increased (Figure 8, Section C, line 2). Thus in the presence of an ionic detergent the gp300 and gp80 dimeric forms were dissociated giving rise to the production of gp140 and gp36 respectively. Dissociation of purified [35 S] methionine-labeled gp300 resulted in only the formation of gp140 (13). The gp36 should therefore exist only after the dissociation of the gp80. Note that the degradation of proteins can also take place in the presence of SDS since all the gp300 and gp80 labeled proteins have not been recovered among the proteins. dissociated (Figure 8 section C). The presence of 200 units / ml aprotinin and 0.2mM
PMSF did not prevent such degradation during SDS incubation. The dimeric forms of proteins may be conformationally resistant to proteolysis. The dissociation of gp300 and gp80 can then lead to conformational changes making the proteolytic sites accessible.
Les expériences de dissociation ont également été menées avec des agrégats viraux de HIV-2. Les protéines virales marquées à la (esSjméthionine ont été solubilisées dans un tampon de lyse contenant 1% de Triton ou 1% de SDS dans un tampon RIPA contenant 0,1* de SDS et 1% de déoxycholate. Les extraits dans le tampon de lyse contenant 1% de SDS ont également été chauffés à 950C. Tous les extraits ont ensuite été immunoprécipités avec mAb 1H8 et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (figure 8 section V}. Dissociation experiments were also conducted with viral aggregates of HIV-2. Esimethionine-labeled viral proteins were solubilized in lysis buffer containing 1% Triton or 1% SDS in RIPA buffer containing 0.1% SDS and 1% deoxycholate extracts in lysis buffer. containing 1% SDS was also heated to 950 C. All extracts were then immunoprecipitated with mAb 1H8 and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (Fig. 8 section V).
Dans le complexe immun préparé à partir des extraits au Triton, la gp80 et la gp36 étaient les principales protéines immunoprécipitées par l'anticorps 1H8. Par ailleurs, la gp80 est devenue indétectable alors que le niveau de gp36 était sensiblement accru dans les extraits au SDS. Le degré de dégradation des extraits au SDS était probablement particulièrement important puisque la plupart des constituants marqués ont disparu. Un résultat meilleur a été obtenu avec le tampon RIPA dans lequel la plupart des gp80 ont été dissociéeset environ 30% du marquage a été retrouvé sur les gp36 (figure 8 section
V).Pour montrer que la gp80 est composé uniquement de gp36 des expériences de dissociation ont été conduites en utilisant la gp80 marquée à la [asSjméthionine purifiée par inmunoprécipitation avec les anticorps mAb 1H8 et par électrophorèse préparative sur gel. Les préparations de gp80 lyophilisées ont ensuite été suspendues directement dans un tampon acétate contenant du SDS, à pH 6,8, 5,8 et 4,8. A pH 4,8 toutes les gp80 étaient converties en gp36 (figure 9).In the immune complex prepared from Triton extracts, gp80 and gp36 were the major proteins immunoprecipitated by the 1H8 antibody. On the other hand, the gp80 became undetectable while the gp36 level was significantly increased in the SDS extracts. The degree of degradation of SDS extracts was probably particularly important since most of the labeled constituents have disappeared. A better result was obtained with the RIPA buffer in which most of the gp80 were dissociated and about 30% of the labeling was found on the gp36 (Figure 8 section
To demonstrate that gp80 is composed solely of gp36 dissociation experiments were conducted using purified [aS] methionine gp80 by immunoprecipitation with mAb 1H8 antibodies and preparative gel electrophoresis. The lyophilized gp80 preparations were then suspended directly in acetate buffer containing SDS at pH 6.8, 5.8 and 4.8. At pH 4.8 all gp80 were converted to gp36 (Figure 9).
CARACTERISATION D'UNE GLYCOPROTEINE TRANSMEMBRANAIRE
SOUS FORME DIMERIQUE CHEZ SIV-mac
On a recherché si la glycoprotéine transmembranaire était détectable sous forme de dimère dans des échantillons SIV.CHARACTERIZATION OF A TRANSMEMBRANE GLYCOPROTEIN
IN DIMERIC FORM AT SIV-mac
It was investigated whether the transmembrane glycoprotein was detectable as a dimer in SIV samples.
Des cellules infectées par SIV et HIV-2 ont été marquées avec [sH]glucosamine et des extraits ont été préparés dans un tampon de lyse contenant du Triton, puis immunoprécipités avec l'anticorps mAb 1H8. Comme le montre la figure 7, l'anticorps monoclonal a précipité les gp300, gp140 et gp80 des cellules infectées par HIV-2, alors que seulement la gp80 a été trouvée dans les particules virales (figure 10). Dans les cellules infectées par SIV, l'anticorps monoclonal a précipité 3 protéines glycosylées : le précurseur d'enveloppe gp140, le précurseur dimérique gp300 et une protéine de 65 kDa (gp65) qui correspond probablement à la contrepartie de la gp80 de HIV-2. SIV and HIV-2 infected cells were labeled with [sH] glucosamine and extracts were prepared in Triton-containing lysis buffer and then immunoprecipitated with the mAb 1H8 antibody. As shown in Figure 7, the monoclonal antibody precipitated gp300, gp140 and gp80 from HIV-2 infected cells, whereas only gp80 was found in virus particles (Figure 10). In SIV-infected cells, the monoclonal antibody precipitated 3 glycosylated proteins: the gp140 envelope precursor, the gp300 dimeric precursor, and a 65 kDa protein (gp65) that probably corresponds to the HIV-2 gp80 counterpart. .
Comme la gp80, la gp65 est apparue associée avec les particules virales de SIV (figure 10).Like gp80, gp65 appeared to be associated with viral SIV particles (Figure 10).
On remarque que dans ces expériences, les formes monomériques de la glycoprotéine transmembranaire de HIV-2oD et SIV-mac n'étaient pas détectables. La séquence d'acides aminés 579-604 de HIV-2o D correspond à la séquence d'acides aminés 595-620 de
SIV-mac (19,7). Ces deux séquences présentent une forte homologie et l'anticorps mAb 1H8 réagit de façon croisée avec les protéines d'enveloppe à la fois de HIV-2ioD et de SIV-mac.It is noted that in these experiments, the monomeric forms of the transmembrane glycoprotein of HIV-2oD and SIV-mac were not detectable. The amino acid sequence 579-604 of HIV-2o D corresponds to the amino acid sequence 595-620 of
SIV-mac (19.7). Both of these sequences show strong homology and mAb 1H8 antibody cross-reacts with envelope proteins of both HIV-2αD and SIV-mac.
Les inventeurs ont donc maintenant mis en évidence qu'une protéine d'un poids moléculaire d'environ 65 kDa correspond à une forme dimérique de la gp32 du virus SIV-mac. The inventors have now demonstrated that a protein with a molecular weight of approximately 65 kDa corresponds to a dimeric form of the gp32 of the SIV-mac virus.
DISCUSSION
La dissociation des formes dimériques (gp300 et gp80) peut avoir lieu à pH légèrement acide.DISCUSSION
The dissociation of the dimeric forms (gp300 and gp80) can take place at slightly acidic pH.
Conformément à ce résultat on peut supposer que la dimérisation de gp140 peut être dépendante du pH et avoir lieu dans un compartiment du réticulum endoplasiique qui favorise la fusion de 2 molécules du précurseur gp140.In accordance with this result it can be assumed that the dimerization of gp140 may be pH dependent and take place in a compartment of the endoplasmic reticulum which promotes the fusion of 2 molecules of the gp140 precursor.
Le poids moléculaire de la forme dimérique du précurseur d'enveloppe gp300 de HIV-2 a été estimé par électrophorèse sur- gel de polyacrylamide dans les conditions dénaturantes (13 > . Dans un gel de polyacrylamide 5%, contenant 0,1% de bisacrylamide au lieu de 0,2% (wt x vol), ce précurseur dimérique a migré à une position correspondant à une protéine de 280-kDa. Pour confirmer le poids moléculaire du dimère dans les conditions natives, des expériences de filtration sur gel en utilisant une colonne Séphacryl 5-300, et des extraits de cellules infectées par HIV-2 marquées à la t3S]méthionine préparés sur un tampon de lyse contenant du Triton, ont été réalisées. Dans ces conditions expérimentales, la gp300 a été éluée sous la forme d'un second pic après le pic des protéines agrégées.Le dimère de glycoprotéines transmembranaires correspond à une protéine éluée ayant un poids moléculaire de 75-80 kDa après le pic de la gp125 et avant le pic de la sérum-albumine bovine (68 kDa) utilisée comme marqueur. Ces observations montrent que les estimations de poids moléculaire des dimères natifs et dénaturés gp300 et gp80 sont comparables. In vitro la dissociation de ces formes dimériques a lieu à pH acide et également en présence d'un détergent ionique SDS. Lorsque les extraits ont été préparés dans le tampon de lyse contenant du Triton, les formes dimériques gp300 et gp80 ont résisté à la dissociation par SDS. Le détergent non ionique Triton conserve donc les formes natives des digères de l'enveloppe gp300 et gp80. The molecular weight of the dimeric form of the HIV-2 gp300 envelope precursor was estimated by polyacrylamide over-gel electrophoresis under denaturing conditions (13%) in a 5% polyacrylamide gel containing 0.1% bisacrylamide. instead of 0.2% (wt x vol), this dimeric precursor migrated to a position corresponding to a 280-kDa protein To confirm the molecular weight of the dimer under native conditions, gel filtration experiments using Sephacryl 5-300 column, and extracts of t3S] methionine-labeled HIV-2 infected cells prepared on Triton-containing lysis buffer were performed, and under these experimental conditions, gp300 was eluted as of a second peak after peak aggregated proteins.The transmembrane glycoprotein dimer corresponds to an eluted protein having a molecular weight of 75-80 kDa after the peak of gp125 and before the peak of bovine serum albumin (68 kDa) used as a marker. These observations show that the molecular weight estimates of the native and denatured dimer gp300 and gp80 are comparable. In vitro dissociation of these dimeric forms takes place at acid pH and also in the presence of an SDS ionic detergent. When the extracts were prepared in Triton-containing lysis buffer, the gp300 and gp80 dimeric forms resisted dissociation by SDS. The nonionic detergent Triton thus retains the native forms of digests of the envelope gp300 and gp80.
Les formes dimériques du précurseur d'enveloppe gp300 et de la glycoprotéine transmembranaire ont également été observées dans les cellules infectées par SIV mais pas par HIV-1. De façon particulière les dimères transmembranaires de HIV-2 (gp80) et SIV (gp65) résistent à la dissociation par des agents réducteurs. C'est pourquoi la dimérisation de la glycoprotéine transmembranaire d'enveloppe peut être considérée comme une propriété spécifique de l'expression des gènes d'enveloppe de HIV-2 et SIV. The dimeric forms of the gp300 envelope precursor and the transmembrane glycoprotein were also observed in SIV-infected cells but not in HIV-1 cells. In particular, the transmembrane dimers of HIV-2 (gp80) and SIV (gp65) resist dissociation by reducing agents. This is why dimerization of the envelope transmembrane glycoprotein can be considered as a specific property of the expression of the HIV-2 and SIV envelope genes.
Cette propriété peut être utilisée pour la caractérisation de nouveaux isolats HIV, à titre de marqueur adapté pour décrire la relation de l'isolat détecté avec au type HIV-1 ou au type HIV-2. La dimérisation du précurseur d'enveloppe pourrait être indispensable pour sa maturation afin de produire des glycoprotéines d'enveloppe matures. Alors que la forme dimérique de la glycoprotéine transmembranaire peut être essentielle pour la formation optimale de la structure du virion et ainsi pour sa capacité à fusionner avec les membranes cellulaires et à être infectieux, la dissociation in vitro du dimère transmembranaire conduit à une dégradation très importante. Ceci peut être dû à la capacité de la forme dimérique de cette glycoprotéine de résister à la protéolyse grâce à sa conformation.This property can be used for the characterization of new HIV isolates, as a marker adapted to describe the relationship of the isolate detected with the type HIV-1 or type HIV-2. The dimerization of the envelope precursor could be essential for its maturation in order to produce mature envelope glycoproteins. While the dimeric form of the transmembrane glycoprotein may be essential for the optimal formation of the virion structure and thus for its ability to fuse with cell membranes and to be infectious, the in vitro dissociation of the transmembrane dimer leads to a very significant degradation. . This may be due to the ability of the dimeric form of this glycoprotein to resist proteolysis through its conformation.
Le tableau ci-après et le schéma des étapes d'obtention des glycoprotéines gp125 et gp80 de HIV-2 résument certains aspects de l'invention exposés dans les exemples. The following table and the diagram of the steps for obtaining glycoproteins gp125 and gp80 of HIV-2 summarize certain aspects of the invention set out in the examples.
GLYPROTEINES D'ENVELOPPE DE HIV-1, HIV-2 et SIV
GLYCOPROTEINE HIV-1 HIV-2 SIV
D'ENVELOPPE Bru ROD MAC
Précurseur gp160 gp140 gp140
Dimère
Précurseur aucun gp300 gp300
Extracellulaire gp120 gp125 gp130
Transmembranaire gp41 gp36 gp32
Dimère
Transmembranaire aucun gp80 gp75
GLYCOPROTEIN HIV-1 HIV-2 SIV
OF ENVELOPE Bru ROD MAC
Precursor gp160 gp140 gp140
dimer
Forerunner no gp300 gp300
Extracellular gp120 gp125 gp130
Transmembrane gp41 gp36 gp32
dimer
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