NL8701950A - MONOCLONAL ANTIBODIES AND PEPTIDES, SUITABLE FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF HIV INFECTIONS. - Google Patents

Description

VO 9272VO 9272

Monoclonale antilichamen en peptiden, geschikt voor de behandeling en diagnose van HIV infecties.Monoclonal antibodies and peptides, suitable for the treatment and diagnosis of HIV infections.

De uitvinding heeft in het algemeen betrekking op de diagnose, behandeling en preventie van virale infecties. In het bijzonder verschaft de uitvinding composities en werkwijzen voor de bereiding van monoclonale antilichamen en peptiden,geschikt voor de diagnose, 5 neutralisering en vaccinering tegen "Human Immunodeficiency \irus" (HIV) infecties.The invention generally relates to the diagnosis, treatment and prevention of viral infections. In particular, the invention provides compositions and methods for the preparation of monoclonal antibodies and peptides suitable for the diagnosis, neutralization and vaccination against "Human Immunodeficiency \ irus" (HIV) infections.

Het infecterende agens, dat verantwoordelijk is voor "acquired immunodeficiency syndrome"(AIDS) en zijn prodromale fasen, "AIDS-related complex" (ARC) en "lymphadenopathy syndrome" (LAS) 10 is een nieuw lymfotrofisch retrovirus. Het virus wordt op verschillende manieren aangeduid als LAV, HTLV-III, ARV en meest recentelijk HIV.The infecting agent responsible for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and its prodromal phases, AIDS-related complex (ARC) and lymphadenopathy syndrome (LAS) 10 is a new lymphotrophic retrovirus. The virus is variously referred to as LAV, HTLV-III, ARV and most recently HIV.

Nu de verbreiding van H~IV pandemische proporties aanneemt is de behandeling van geïnfecteerde individuen en de preventie van overdracht op ongeïnfecteerde, maar bedreigde individuen van alles 15 overheersend belang. Een variëteit van therapeutische strategieën is gericht op verschillende stadia in de levenscyclus van het virus en zijn beschreven in Nature 325 (1987) 773.Een benadering omvat het gebruik van antilichamen, die zich binden aan het virus en virale replicatie verhinderen, hetzij door belemmering van virale intrede 20 in gastheercellen, hetzij door een ander mechanisme. Wanneer eenmaal de virale component of componenten, die vatbaar zijn voor antilichaam-interventie zijn geïdentificeerd, valt te hopen dat antibody titers, die voldoende zijn om de infectiviteit van het virus te neutraliseren, kunnen worden opgewekt door vaccinering of anders door de passieve 25 toediening van imuun globuline of monoclonale antilichamen van de gewenste specificiteit.With the spread of H ~ IV pandemic proportions, the treatment of infected individuals and the prevention of transmission to uninfected, but threatened individuals is of paramount importance. A variety of therapeutic strategies target different stages in the virus life cycle and are described in Nature 325 (1987) 773. One approach involves the use of antibodies that bind to the virus and prevent viral replication, either by inhibiting viral entry into host cells, either by some other mechanism. Once the viral component or components susceptible to antibody intervention have been identified, it is hoped that antibody titers sufficient to neutralize the infectivity of the virus can be induced by vaccination or otherwise by the passive administration of immune globulin or monoclonal antibodies of the desired specificity.

Verondersteld wordt dat de omhullende glycoproteïnen van de meeste retrovirussen reageren met receptormoleculen op het oppervlak van vatbare cellen, waardoor de infectiviteit van het virus voor be-30 paalde gastheren wordt bepaald. Antilichamen, die zich binden aan de glycoproteïnen, kunnen de wisselwerking van het virus met de cel-receptors blokkeren en daardoor de infectiviteit van het virus neutraliseren. Zie in het algemeen The Molecular Biology of Tumor Viruses, biz. 534 (1973) en RNA Tumor Viruses, biz.226 en 236 (1982) 8 7 0 1 S 5 0 -2- *>It is believed that the envelope glycoproteins of most retroviruses react with receptor molecules on the surface of susceptible cells, thereby determining the infectivity of the virus for certain hosts. Antibodies, which bind to the glycoproteins, can block the interaction of the virus with the cell receptors and thereby neutralize the infectivity of the virus. See generally The Molecular Biology of Tumor Viruses, biz. 534 (1973) and RNA Tumor Viruses, biz. 226 and 236 (1982) 8 7 0 1 S 5 0 -2- *>

Zie ook Virology 120 (1982) 42, Infect. Immun. 39 (1983), 155 en J. Immunol. 129 (1982) 2763.See also Virology 120 (1982) 42, Infect. Immun. 39 (1983), 155 and J. Immunol. 129 (1982) 2763.

De algemene structuur van HIV is die van een ribonucleo-proteinekern, omgeven door een lipide-bevattende omhulling, die het 5 virus verkrijgt tijdens het uitbotten uit het membraan van de geïnfecteerde gastheercel. Ingebed binnen de omhulling en uitstekend naar buiten zijn de virale gecodeerde glycoproteïnen. De omhulling glycoproteïnen van HIV worden aanvankelijk in de geïnfecteerde cel gesynthetiseerd als een precursor molecuul van 150.000-160.000 dalton 10 (gpl50 of gpl60), dat vervolgens in de cel wordt verwerkt tot een N-terminaal fragment van 110.000-120.000 dalton (gpllO of gpl20) voor generering van externe glycoproteïne, en een C-terminaal fragment van 41.000-46.000 dalton (gp41), dat het transmembraan-omhullende glycoproteïne vertegenwoordigt.The general structure of HIV is that of a ribonucleoprotein nucleus, surrounded by a lipid-containing sheath, which the virus obtains during budding from the membrane of the infected host cell. Embedded within the shell and protruding outward are the viral encoded glycoproteins. The envelope glycoproteins of HIV are initially synthesized in the infected cell as a precursor molecule of 150,000-160,000 daltons (gpl50 or gpl60), which is then processed in the cell into an N-terminal fragment of 110,000-120,000 daltons (gpl10 or gpl20 ) for external glycoprotein generation, and a C-terminal fragment of 41,000-46,000 daltons (gp41), representing the transmembrane-enveloping glycoprotein.

15 Om de bovengenoemde redenen is het gpllO glycoproteïne van HIV het object geweest van veel onderzoek als potentieel aangrijpingspunt voor onderbreking van de levenscyclus van het virus.For the above reasons, the gpl10 glycoprotein of HIV has been the subject of much research as a potential trigger for interruption of the virus life cycle.

Gebleken is dat sera, afkomstig van met HIV geïnfecteerde individuen, HIV in vitro neutraliseren, en antilichamen, die zich binden aan 20 gezuiverd gpllO zijn in de sera aanwezig. Zie Nature 316 (1985) 72,Sera from HIV infected individuals have been found to neutralize HIV in vitro, and antibodies that bind to purified gpl10 are present in the sera. See Nature 316 (1985) 72,

Nature 316 (1985), 69 en Proc. Natl. Acad. Sci. ü.S.A. 83 (1986)9709.Nature 316 (1985), 69 and Proc. Natl. Acad. Sci. ü.S.A. 83, 9709 (1986).

Gezuiverd en recombinant gpllO stimuleerde de produktie van neutraliserende serum antilichamen bij gebruik voor het immuniseren van dieren, (Proc. Natl. Acad. Sci. Ü.S.A. £33 (1986) 7023 en Science 233 (1986) 209) 25 en een mens (Nature 326 (1986) 249). Binding van het gpllO molecuul aan de CD4 (T4) receptor heeft eveneens getoond, en monoclonale antilichamen, die bepaalde epitopen van de CD4 receptor herkennen, zijn gebleken HIV binding, syncytiavorming en ïnfectiviteit te blokkeren.Purified and recombinant gpl10 stimulated the production of neutralizing serum antibodies when used to immunize animals, (Proc. Natl. Acad. Sci. Ü.SA £ 33 (1986) 7023 and Science 233 (1986) 209) and a human ( Nature 326 (1986) 249). Binding of the gpl10 molecule to the CD4 (T4) receptor has also been shown, and monoclonal antibodies, which recognize certain epitopes of the CD4 receptor, have been shown to block HIV binding, syncytia formation and infectivity.

(Science 231 (1986) 382). Putney et al. (Science 234 (1986) 1392) wekte op 30 neutraliserende serumanitlichamen in dieren na immunisering met een recombinant fusieproteine dat de carboxyl-terminale helft van het gpllO molecule bevatte, en toonde verder aan dat glycosylering van het omhullend proteine onnodig is voor een neutraliserende antilichaamreactie.(Science 231 (1986) 382). Putney et al. (Science 234 (1986) 1392) awakened neutralizing serum antibodies in animals after immunization with a recombinant fusion protein containing the carboxyl-terminal half of the gpl10 molecule, further demonstrating that glycosylation of the envelope protein is unnecessary for a neutralizing antibody response.

Een sub-eenheid vaccin voor AIDs onder benutting van het 35 HIV gpllO molecuul of gedeelten daarvan kan derhalve gewenst zijn.A subunit vaccine for AIDs using the HIV gpl10 molecule or parts thereof may therefore be desirable.

8701950 -3-8701950 -3-

Sub-eenheid vaccins vormen een alternatief voor vaccins, bereid uit gedeactiveerde of verzwakte virussen. Gedeactiveerde vaccins zijn zorg-barend wegens het mogelijke falen om alle virale deeltjes te doden, en verzwakte virussen kunnen het vermogen bezitten om te muteren en een 5 ziekte veroorzakend vermogen te herwinnen. Met sub-eenheid vaccin worden alleen die gedeelten van het virus, dat de antigenen of epitopen bevat, die immuunreacties kunnen opwekken, met name neutraliserende antilichamen, ADCC, en cytotoxische T-cel reactie, gebruikt voor het immuniseren van de gastheer. Ben belangrijk voordeel van sub-eenheid 10 vaccin is dat irrelevant viraal materiaal wordt uitgesloten.Subunit vaccines are an alternative to vaccines prepared from deactivated or attenuated viruses. Deactivated vaccines are worrying because of the potential failure to kill all viral particles, and attenuated viruses may have the ability to mutate and regain disease-causing ability. With vaccine subunit, only those parts of the virus containing the antigens or epitopes that can elicit immune responses, especially neutralizing antibodies, ADCC, and cytotoxic T cell response, are used to immunize the host. A major advantage of subunit 10 vaccine is that irrelevant viral material is excluded.

Virale sub-eenheden voor gebruik in een vaccin kunnen volgens diverse methoden worden gegenereerd. Zo kan bijvoorbeeld het omhullende glycoproteine tot expressie worden gebracht en gezuiverd uit een bacte-riele gastheer, hoewel dit molecuul de meeste post-translationele modifi-15 caties (zoals glycosylering) of andere bewerking zal missen. Een dergelijke modificatie kan worden verkregen door gebruik van een eukaryotisch expressiesysteem, zoals gist of gekweekte zoogdiercellen. Men heeft virale genen in zoogdiercellen geïntroduceerd met koepokvirus als vector. Zie bijvoorbeeld Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 79 (1982) 7415 en 4927.Viral subunits for use in a vaccine can be generated by various methods. For example, the envelope glycoprotein can be expressed and purified from a bacterial host, although this molecule will lack most post-translational modifications (such as glycosylation) or other processing. Such a modification can be achieved using a eukaryotic expression system, such as yeast or cultured mammalian cells. Viral genes have been introduced into mammalian cells using cowpox virus as a vector. See, for example, Proc. Wet. Acad. Sci. U.S.A. 79 (1982) 7415 and 4927.

20 Recombinant koepokvirus kan worden geconstrueerd volgens de methode van Hu et al., Nature 320 (1986) 537 of van Chakrabarti et al.,Recombinant cowpox virus can be constructed according to the method of Hu et al., Nature 320 (1986) 537 or Chakrabarti et al.,

Nature 320 (1986) 535. Virale glycoproteïnen, geproduceerd door cellen, die met recombinant koepokstof zijn geïnfecteerd, worden in deze systemen op passende wijze geglycosyleerd en kunnen worden getrans-25 porteerd naar het celoppervlak voor extrusie en uiteindelijke isolering.Nature 320 (1986) 535. Viral glycoproteins produced by cells infected with recombinant cowpox are suitably glycosylated in these systems and can be transported to the cell surface for extrusion and final isolation.

Een belangrijke stap in de produktie van een sub-eenheid vaccin is voldoende zuivering van het gewenste glycoproteine uit het complexe mengsel van het expressiesysteem. Diverse methoden kunnen worden toegepast om deze zuivering tot stand te brengen. Zij omvatten, maar zijn niet 30 beperkt tot preparatieve polyacrylamidegel elektroforese, gelpermeatie-chromatografie en diverse methoden van chromatografie (met name ionenuitwisseling, reverse fase, immuno-affiniteit,hydrofobe wisselwerking) en andere. De meeste van deze methoden worden toegepast in diverse combinaties ter verkrijging van nagenoeg zuivere preparaten (Science 214 35 (1981) 1125, Biotechnology 4 (1986) 128, en Proc. Nat. Acad. Sci.U.S.A.An important step in the production of a subunit vaccine is sufficient purification of the desired glycoprotein from the complex mixture of the expression system. Various methods can be used to accomplish this purification. They include, but are not limited to, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, gel permeation chromatography, and various methods of chromatography (especially ion exchange, reverse phase, immunoaffinity, hydrophobic interaction), and others. Most of these methods are used in various combinations to obtain substantially pure formulations (Science 214 35 (1981) 1125, Biotechnology 4 (1986) 128, and Proc. Nat. Acad. Sci.U.S.A.

82 (1985) 7748.82 (1985) 7748.

8 7 0 1 3 5 0· * it -4-8 7 0 1 3 5 0 * it -4-

Voor de bereiding van sub-eenheidsvaccins zijn methoden nodig, die het aantal trappen reduceren, die nodig zijn voor het bereiken van maximale zuivering van een bepaald viraal antigeen uit een complex expressiemengsel. De efficiënte scheiding van de antigenen van externe 5 componenten zou kunnen geschieden door toepassing van immuno-affiniteits-chromatografie. Deze techniek, ook bekend als immunoabsorptie, bestaat in principe uit de selectieve adsorptie van een antigen aan een vaste drager, waarop een specifiek antilichaam covalent is gehecht. Het selectief geadsorbeerde antigen wordt dan uit zulk een uit een dergelijk anti-10 lichaam-affiniteitsadsorbens geëlueerd door verandering van bijvoorbeeld de pH en/of ionsterkte van de buffer.The preparation of subunit vaccines requires methods that reduce the number of steps required to achieve maximum purification of a given viral antigen from a complex expression mixture. The efficient separation of the antigens from external components could be accomplished using immunoaffinity chromatography. This technique, also known as immunoabsorption, basically consists of the selective adsorption of an antigen to a solid support on which a specific antibody is covalently attached. The selectively adsorbed antigen is then eluted from such an antibody affinity adsorbent by such changes as, for example, the pH and / or ionic strength of the buffer.

Polyclonale antilichamen, verkregen uit dieren, die met het gewenste antigen geïmmuniseerd zijn, of uit op natuurlijke wijze geïnfecteerde individuen (zie bijvoorbeeld Science 233 (1986) 209), zijn dik-15 wijls gebruikt als immunoadsorbanten, maar in het algemeen hebben deze reagentia aanmerkelijke nadelen, doordat (i) van de aan de onoplosbare drager gebonden antilichamen niet alle specifiek zijn voor het van belang zijnde molecuul, zodat verdere zuivering nodig is; (ii) opbrengsten van het gewenste antigen dikwijls gering zijn; en (iii) antilichaam affi-20 niteiten dikwijls van het ene preparaat tot het andere variëren, waardoor modificaties in de elutieprocedure nodig zijn. Deze moeilijkheden zouden worden ontgaan indien in plaats van polycyclonale antilichamen monoclonale antilichamen zouden worden gebruikt, die specifiek zijn voor het gewenste virale antigen, dat men in het sub-eenheid vaccin 25 preparaat wil gebruiken.Polyclonal antibodies, obtained from animals immunized with the desired antigen, or from naturally infected individuals (see, for example, Science 233 (1986) 209), have been widely used as immunoadsorbants, but generally these reagents have significant disadvantages in that (i) of the antibodies bound to the insoluble carrier are not all specific to the molecule of interest, so that further purification is needed; (ii) yields of the desired antigen are often low; and (iii) antibody affinities often vary from one preparation to another, requiring modifications in the elution procedure. These difficulties would be avoided if instead of polycyclonal antibodies, monoclonal antibodies specific for the desired viral antigen to be used in the vaccine subunit preparation were used.

Er zijn van muizen afkomstige monoclonale antilichamen beschreven, die HIV antigenen binden. Diverse onderzoeksgroepen hebben monoclonale antilichamen gerapporteerd, die specifiek zijn voor het kern-proteïne p25 (zie bijvoorbeeld Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985) 30 5199 en J. Immunol. 136 (1986) 1442). Ook zijn monoclonale antilichamen gerapporteerd, die specifiek zijn voor het membraan glycoproteine gp41 (zie bijvoorbeeld Science 229 (1985) 1402).Mouse monoclonal antibodies have been described which bind HIV antigens. Various research groups have reported monoclonal antibodies specific for the core protein p25 (see, e.g., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82 (1985) 30 5199 and J. Immunol. 136 (1986) 1442). Monoclonal antibodies specific for the membrane glycoprotein gp41 have also been reported (see, for example, Science 229 (1985) 1402).

Er blijft behoefte aan monoclonale antilichamen, die specifiek zijn voor epitopen binnen gedetineerde gebieden van het voornaamste 35 omhullende glycoproteine gpllO. Monoclonale antilichamen die zich aan deze gebieden binden en een vermindering in of uitschakeling van 8 7 (Π ö (· -5- de replikatie en overdraagbaarheid van HIV veroorzaken, zouden aanmerkelijk therapeutisch en profylactisch nut hebben. Bovendien zouden de monoclonale antilichamen ook kunnen worden gebruikt voor zuivering van het gewenste gebied van gpllO van verbroken virus of recombinant expres-5 siesystemen voor toepassing in bijvoorbeeld vaccin. Verder zal het gebied, dat de door de monoclonale antilichamen herkende epitope of epitopen bevat, chemisch kunnen worden gesynthetiseerd, waardoor de moeilijkheden zouiei worden vermeden, die inherent zijn aan de zuivering en toediening van grotere fragmenten van het gpllO molecuul. De uitvin-10 ding voldoet aan deze en andere verwante behoeften.There remains a need for monoclonal antibodies specific for epitopes within detained regions of the major envelope glycoprotein gpl10. Monoclonal antibodies that bind to these regions and cause a reduction in or elimination of 8 7 (Π ö (· -5-), the replication and transmissibility of HIV would have significant therapeutic and prophylactic benefits. In addition, the monoclonal antibodies could also be used for purification of the desired region of gpl10 from disrupted virus or recombinant expression systems for use in, for example, vaccine Furthermore, the region containing the epitope or epitopes recognized by the monoclonal antibodies may be chemically synthesized, thereby avoiding the difficulties. avoided, which are inherent in the purification and administration of larger fragments of the gpl10 molecule The invention satisfies these and other related needs.

De uitvinding verschaft peptiden, die in staat zijn tot immunologische nabootsing van neutraliserende epitopen van HIV proteïnen, nucle-ine-zuurproben, die zulke peptiden coderen en monoclonale antilichamen die met zulke peptiden reactief zijn, alsmede andere peptiden, die 15 het infecterend vermogen van HIV belemmeren. Deze nieuwe materialen kunnen worden gebruikt in bijvoorbeeld diagnostische proeven voor de detectie van HIV infecties en in therapeutische voorschriften voor de behandeling van of vaccinatie tegen zulke infecties.The invention provides peptides capable of immunologically mimicking neutralizing epitopes of HIV proteins, nucleic acid probes encoding such peptides, and monoclonal antibodies reactive with such peptides, as well as other peptides which have the infectivity of HIV. hinder. These new materials can be used in, for example, diagnostic tests for the detection of HIV infections and in therapeutic regimens for the treatment of or vaccination against such infections.

De uitvinding verschaft nieuwe composities en werkwijzen 20 voor het neutraliseren van HIV infecties, met name het voorkomen of nagenoeg inhibiteren van de vorming of cellullaire transmissie van infectieus HIV in een gastheer. Meer specifiek werden peptiden,die een neutraliserend gebied van HIV nabootsen, en monoclonale antilichamen, die met een dergelijk gebied reactief zijn, gebruikt voor de diagnose , 25 behandeling en vaccinatie tegen HIV-infecties. In dit verband heeft de uitdrukking "neutraliserend gebied" betrekking op die gedeelten van HIV, in het bijzonder HIV proteïnen, die aminozuursegmenten bevatten, die een of meer epitopen definiëren, welke reactief zijn met antilichamen, die individueel of in combinatie met andere antilichamen volgens 30 de uitvinding in staat zijn HIV infecties te neutraliseren. Geschikte toetsen voor neutralisatie zijn bekend en kunnen omvatten reductie van HIV-infecties in T-cellijnen, reductie van plakvormende eenheden van VSV (HIV) pseudotypen, die de omhullende glycoproteïnen van HIV dragen, syncytiale inhibitieproeven en virion-receptor bindingsproeven.The invention provides new compositions and methods for neutralizing HIV infections, in particular preventing or substantially inhibiting the formation or cellular transmission of infectious HIV in a host. More specifically, peptides that mimic a neutralizing region of HIV and monoclonal antibodies reactive with such a region have been used for the diagnosis, treatment and vaccination against HIV infections. In this regard, the term "neutralizing region" refers to those portions of HIV, especially HIV proteins, which contain amino acid segments, which define one or more epitopes, which are reactive with antibodies, individually or in combination with other antibodies according to the invention are able to neutralize HIV infections. Suitable neutralization assays are known and may include reduction of HIV infections in T cell lines, reduction of plaque-forming units of VSV (HIV) pseudotypes carrying HIV envelope glycoproteins, syncytial inhibition assays and virion receptor binding assays.

35 Des-*gewenst kan de neutraliserende activiteit worden vergeleken met antilichaam-reactievermogen in immunochemische proeven, zoals immuno- 8701350 -6- * fluorescentie, imntunovloei en radioimmunoprecipitatietoets.If desired, the neutralizing activity can be compared to antibody responsiveness in immunochemical assays, such as immuno-8701350-6- * fluorescence, immuno-flow and radioimmunoprecipitation assay.

De nieuwe peptiden, typisch minder dan ongeveer 50 aminozuren, bevatten in een aspect van de uitvinding vijf of meer aan elkaar grenzende aainceurenvormende epitopen, nagenoeg soortgelijk aan epitopen 5 op neutraliserende gebieden van HIV gpllO of p25, gecodeerd door respectievelijk de env en gag gebieden van het HIV genome. Van bijzonder belang zijn de gebieden, die zich uitstrekken van ongeveer aminozuur-rest 301 tot ongeveer 336 van gpllO, en van ongeveer 278 tot ongeveer 319 en van ongeveer 315 tot ongeveer 363 van p25, alle uit de HIV stam, 10 aangeduid als LAV . De aanduidingen van de aminozuurresten zijn van deThe novel peptides, typically less than about 50 amino acids, contain, in one aspect of the invention, five or more contiguous acetate-forming epitopes, substantially similar to epitopes 5 on neutralizing regions of HIV gpl10 or p25, encoded by the env and gag regions, respectively, of the HIV genome. Of particular interest are the regions ranging from about amino acid residue 301 to about 336 of gpl10, and from about 278 to about 319 and from about 315 to about 363 of p25, all from the HIV strain, designated LAV. The designations of the amino acid residues are of the

BRUBRU

Los Alamos Data Bank (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).Los Alamos Data Bank (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).

Het zal de deskundige duidelijk zijn dat verdere analoge gebieden ("homologen") uit andere HIV-isolaten kunnen worden geïdenti-15 ficeerd op basis van hun locatie binnen verwante proteïnen uit diverse isolaten. In de praktijk kunnen willekeurige homologen worden geïdentificeerd door referentie aan LAV sequentiedata als volgt:It will be apparent to those skilled in the art that further analogous regions ("homologs") from other HIV isolates can be identified based on their location within related proteins from various isolates. In practice, random homologs can be identified by reference to LAV sequence data as follows:

BRUBRU

(a) De aminozuurseqeunties van HIV isolaten en LAV kunnen in een lijn worden gebracht ter verkrijging van maximale homologie 20 tussen de twee sequenties; (b) Peptiden, die aminozuursequenties van HIV isolaten bevatten corresponderende met de lokaties van LAV peptiden, die immunologisch LAVgR^ proteïnen nabootsen, kunnen worden geïdentificeerd.De peptiden, die aldus geïdentificeerde aminozuursequenties van HIV isolaten bevatten, 25 zullen typisch corresponderende HIV isolaatproteïnen immunologisch nabootsen.(a) The amino acid functions of HIV isolates and LAV can be aligned to obtain maximum homology between the two sequences; (b) Peptides containing amino acid sequences of HIV isolates corresponding to the locations of LAV peptides that mimic immunologically LAVgR proteins can be identified. The peptides containing amino acid sequences of HIV isolates thus identified will typically mimic corresponding HIV isolate proteins .

Deze methode kan worden toegepast op HIV stammen, die nog moeten worden ontdekt. Als bijvoorbeeld nieuwe stammen van HIV worden geïdentificeerd, kunnen de aminozuursequenties van hun 30 omhulling en kern in lijn worden gebracht met die van LAV ter ver-krijging van maximale homologie. De manieren waarop de sequenties in lijn worden gebracht zijn de deskundige bekend. Bij het in lijn brengen van de sequenties is het gewenst zoveel mogelijk homologie tussen cysteïneresidus te handhaven als mogelijk is. De aminozuursequentie van 35 de nieuwe HIV stam of species, die correspondeert met de lokatie van de hier specifiek geopenbaarde peptiden, kan worden gesynthetiseerd en vol- 87 0 1 1: 0 -7- gens de uitvinding worden gebruikt.This method can be applied to HIV strains that are yet to be discovered. For example, when new strains of HIV are identified, the amino acid sequences of their envelope and core can be aligned with those of LAV to achieve maximum homology. The ways in which the sequences are aligned are known to those skilled in the art. When aligning the sequences, it is desirable to maintain as much homology between cysteine residue as possible. The amino acid sequence of the new HIV strain or species, which corresponds to the location of the peptides specifically disclosed herein, can be synthesized and used according to the invention.

Een andere methode voor de bepaling van sequenties van een homoloog gebied in andere HIV stammen is beschreven in Science 233 (1986) 1076. Hierbij worden twee oligonucleotide primers gebruikt, 5 die zich binden aan geconserveerde sequenties buiten het van belang zijnde sequentiegebied en verschillende restrictieve plaa-Kfen in elke primer bevatten DNA uit HIV stammen kunnen dan in vitro worden geamplificeerd waarna de resulterende oligonucleotiden kunnen worden gecloond in vector voor sequentieanalyse en opgenomen in een vaccin als een cassette die een 10 bepaald epitoop uit de HIV stam vertegenwoordigt.Another method for sequencing a homologous region in other HIV strains is described in Science 233 (1986) 1076. It uses two oligonucleotide primers that bind to conserved sequences outside the sequence region of interest and different restrictive sites. Kfen in each primer contain DNA from HIV strains can then be amplified in vitro, after which the resulting oligonucleotides can be cloned into vector for sequence analysis and included in a vaccine as a cassette representing a particular epitope from the HIV strain.

Het is voor de uitvinding niet noodzakelijk dat de in zulke sequenties aanwezige epitopen kruisreactief zijn met antilichamen voor alle stammen of species van HIV. Peptiden die immunologische epitopen bevatten, welke een species of serogroep van een andere onderscheiden, 15 zullen toepassing vinden bij de identificatie van een bepaalde species of serogroep, en kunnen in feite assisteren bij de identificatie van individuen die met een of meer species of serogroepen van HIV geïnfecteerd zijn. Zij kunnen ook bruikbaar zijn in combinatie met andere peptiden, hetzij uit een homoloog gebied, hetzij een ander neutraliserend 20 gebied, in therapeutische composities.It is not necessary for the invention that the epitopes contained in such sequences be cross-reactive with antibodies to all strains or species of HIV. Peptides containing immunological epitopes, distinguishing one species or serogroup from another, will find utility in the identification of a particular species or serogroup, and may in fact assist in the identification of individuals with one or more species or serogroups of HIV are infected. They can also be useful in combination with other peptides, either from a homologous region or another neutralizing region, in therapeutic compositions.

De van belang zijnde peptiden zijn liefst afgeleid van het gpllO gebied van het virus. Van bijzonder belang in dit gebied zijn peptiden, gecodeerd binnen de env open leesraam, zich uitstrekkend van ongeveer basispaar (bp) 6667 tot ongeveer 6774 van het LAVgRU isolaat.The peptides of interest are most preferably derived from the gpl10 region of the virus. Of particular interest in this region are peptides encoded within the env open reading frame ranging from about base pair (bp) 6667 to about 6774 of the LAVgRU isolate.

25 Aldus bevatten diverse homologe gebieden van andere HIV isolaten de homologe sequenties, verkregen van Los Alamos Data Bank (behalve LAV2), zoals vermeld in tabel A.Thus, various homologous regions of other HIV isolates contain the homologous sequences obtained from Los Alamos Data Bank (except LAV2) as listed in Table A.

8 7 0 1 , 5 0 £ J* -8-8 7 0 1, 5 0 £ J * -8-

TABEL ATABLE A

HXB2 tgtacaagacccaacaacaatacaagaaaaaga...............ATCCGTATCHXB2 tgtacaagacacaacaacaatacaagaaaaaga ............... ATCCGTATC

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg...............IleArglle 309 BH 102--------------------- Ser---------------------— 309 H9M ------------------------Ser------------------------- 309 BRU ---------------------------Ser-------------------- — 314 MAL -----------Gly------------ArgGly—--------------HisPhe 314 ELI ---Ala----TyrGln--------Gin—--------------ThrPro-- 310 WMJ2 —————1Tyr------Val---ArgSer—————LeuSer-- 306 10 RFENV---------------------------Ser------------------ThrLys 322 Z6 ----------TyrLys--------GlnSer--------·——ThrPro--- 311 23 ——--------GlySerAspLysLyslle————————GlnSer--- 306 CDC42------*-----------Hls------------ValThrLeu............... 320 . LAV2 ----------Gly Lys---Val---Gin------------------HetLeu 302CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg ............... IleArglle 309 BH 102 --------------------- Ser -------- -------------— 309 H9M ------------------------ Ser --------- ---------------- 309 BRU --------------------------- Ser ---- ---------------- - 314 MAL ----------- Gly ------------ ArgGly —----- --------- HisPhe 314 ELI --- Ala ---- TyrGln -------- Gin —-------------- ThrPro-- 310 WMJ2 ————— 1Tyr ------ Val --- ArgSer ————— LeuSer-- 306 10 RFENV ---------------------- ----- Ser ------------------ ThrLys 322 Z6 ---------- TyrLys -------- GlnSer --- ----- · ——ThrPro --- 311 23 ——-------- GlySerAspLysLyslle ———————— GlnSer --- 306 CDC42 ------ * ---- ------- Hls ------------ ValThrLeu ............... 320. LAV2 ---------- Gly Lys --- Val --- Gin ------------------ HetLeu 302

HXB2 CAGAGA. /.......GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATGHXB2 CAGAGA. /.......GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATG

** GlnArg.........GlyProGlyArgAlaPheValThrlleGlyLysIleGlyAsnMet 326 BH102 ----------- — 326 H9M ------------------------------------------------------- 326 BRU -----------------------------------------------------331 MAL ........——----------Gin LeuTyr—-Thr--IleVal Aspile 329 20 ELI GlyLeu ---------.. .GlnSerLeuTyrThr---Arg—-IleValSerArgSer 323 ARV2 ......-----————-----His---Thr Arg---IleGlyAsp 327 WMJ2 ......--—--------------------Arg—-ArgGlu...—-IleGlylle 320 RFENV......—----------------—VallleTyrAlaThr---Gin IleGlyAsp 337 Z6 GlyLeu--— -----—...GlnAlaLeuTyrThr---Arg---ArgThrLysIlelle 327 Z3 Arglle------------------Lys Val---TyrAlaLys-—Gly............ 319 NY5 GlyPro————..—ThrLeuTyrAlaArgGlu—-----—Aspile 320 CDC42 .........................ValTrpTyr---Thr----Glu LeuGlyAsn 335 25 LAV2 MetSer——————----His Val--HlsSerHlsTyrGlnProIle---Lys 323** GlnArg ......... GlyProGlyArgAlaPheValThrlleGlyLysIleGlyAsnWith 326 BH102 ----------- - 326 H9M --------------------- ---------------------------------- 326 BRU -------------- --------------------------------------- 331 MAL ........— —---------- Gin LeuTyr —- Thr - IleVal Aspile 329 20 ELI GlyLeu --------- .. .GlnSerLeuTyrThr --- Arg —- IleValSerArgSer 323 ARV2 .... ..-----————----- His --- Thr Arg --- IleGlyAsp 327 WMJ2 ......--—------------- ------- Arg —- ArgGlu ...—- IleGlylle 320 RFENV ......—----------------— VallleTyrAlaThr --- Gin IleGlyAsp 337 Z6 GlyLeu --— -----—... GlnAlaLeuTyrThr --- Arg --- ArgThrLysIlelle 327 Z3 Arglle ------------------ Lys Val --- TyrAlaLys ——Gly ............ 319 NY5 GlyPro ————..— ThrLeuTyrAlaArgGlu —-----— Aspile 320 CDC42 .............. ........... ValTrpTyr --- Thr ---- Glu LeuGlyAsn 335 25 LAV2 MetSer ——————---- His Val - HlsSerHlsTyrGlnProIle --- Lys 323

HXB2 ...AGA...CAAGCACATTGTHXB2 ... AGA ... CAAGCACATTGT

...Arg...GlnAlaHisCys 331 BH 102 ---- 331 HXB3 -------------------331 30 H9M ------------------ 331 BRU ------------------336 MAL -------Arg—-Tyr--334 ELI IlelleGly------------330 ARV2 lie--Lys...---------333 WMJ2 Ile------------------326 RFENV Ile—Lys...------343 26 Gly...---------------334 35 23 IleThrGly------------326 NY5 -------------------325 CDC42 Ile------------------341 LAV2 ArgProArg——Met---330 8701350 -9-... Arg ... GlnAlaHisCys 331 BH 102 ---- 331 HXB3 ------------------- 331 30 H9M ----------- ------- 331 BRU ------------------ 336 MAL ------- Arg —- Tyr - 334 ELI IlelleGly ----- ------- 330 ARV2 lie - Lys ...--------- 333 WMJ2 Ile ------------------ 326 RFENV Ile— Lys ...------ 343 26 Gly ...--------------- 334 35 23 IleThrGly ------------ 326 NY5 - ------------------ 325 CDC42 Ile ------------------ 341 LAV2 ArgProArg —— With --- 330 8701350 -9-

Andere peptiden geschikt voor het genereren of onderzoeken op monoclonale antilichamen zijn die welke zijn gecodeerd in het env open leesraam vanaf ongeveer bp 7246 tot ongeveer 7317 van LAVBRy. Dergelijke antilichamen en reactieve peptiden zijn bijzonder nuttig 5 in immunotoetsen.Other peptides suitable for generating or assaying for monoclonal antibodies are those encoded in the env open reading frame from about bp 7246 to about 7317 of LAVBRy. Such antibodies and reactive peptides are particularly useful in immunoassays.

In het gag gebied van het LAV isolaat, zijn de p25In the gag region of the LAV isolate are the p25

I BRUI BRU

aminozuursequenties van ongeveer 278 tot 319 en 315 tot 363 additionele neutraliserende gebieden van H1V. De deskundige zal het duidelijk zijn dat additionele neutraliserende gebieden van HIV kunnen worden gelden-10 tificeerd op basis van de onderhavige openbaring, in het bijzonder combinaties van monoclonale antilichamen, die reactief zijn met diverse verschillende HIV epitopen, die neutraliserende activiteit vertonen.amino acid sequences from about 278 to 319 and 315 to 363 additional neutralizing regions of H1V. Those skilled in the art will appreciate that additional neutralizing regions of HIV may be validated based on the present disclosure, particularly combinations of monoclonal antibodies, which are reactive with various different HIV epitopes, which exhibit neutralizing activity.

Peptide I, ook aangeduid als peptide 29, is gecodeerd in het env open leesraam vanaf ongeveer aminozuurrest nummers 308 tot onge-15 veer 328 en zal de volgende aminozuursequentie hebben, waar oligöpeptiden binnen de volgende sequentie lineaire epitopen binnen zulke sequenties zullen bevatten: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-20 Pro-Gly-Arg-Ala Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Peptide I, also referred to as peptide 29, is encoded in the env open reading frame from approximately amino acid residue numbers 308 to approximately 328 and will have the following amino acid sequence, where oligopeptides within the following sequence will contain linear epitopes within such sequences: I ( 29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-20 Pro-Gly-Arg-Ala Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-

Ile-Y' waarin Y en Y', indien aanwezig, elk sequenties van aminozuren tot een aantal van ongeveer twintig voorstellen. Wanneer Y en/of Y' aanwezig is, kunnen deze omvatten bijvoorbeeld een of meer aminozuren uit se-25 quenties, die aminozuurresidus 308-328 van de HIV omhullingssequenties flankeren of enig gedeelte van deze flankerende sequenties. Bij wijze van niet beperkend voorbeeld kan Y alle of gedeelten van de omhullingsaminozuursequenties omvatten vanaf ongeveer residunummers 301 tot 307; en Y' kan alle of gedeelten van de LAV omhullingsamino-Ile-Y 'wherein Y and Y', when present, each represent sequences of amino acids up to about twenty. When Y and / or Y 'is present, they may include, for example, one or more amino acids from sequences flanking amino acid residue 308-328 of the HIV envelope sequences or any portion of these flanking sequences. By way of non-limiting example, Y may comprise all or parts of the shell amino acid sequences from about residue numbers 301 to 307; and Y 'can contain all or parts of the LAV envelope amino

BRUBRU

30 zuursequentie omvatten vanaf ongeveer residunummers 329 tot 336, als volgt: II (29a)Acid sequence includes from about residue numbers 329 to 336 as follows: II (29a)

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-35 Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-35 Ile -Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

870 f950 -10-870 f950 -10-

Ook kunnen afgeknotte sequenties van peptiden volgens de uitvinding worden bereid. In dit opzicht kunnen de volgende sequenties uit peptide 29 bijzonder nuttig zijn: III (29b) 5 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly- Y' waarin Y en/of Y'f indien aanwezig, elk sequenties van aminozuurresten tot een aantal van ongeveer twintig voorstelt.Truncated sequences of peptides of the invention can also be prepared. In this regard, the following sequences from peptide 29 may be particularly useful: III (29b) 5 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Y 'wherein Y and / or Y'f, if present, each represents sequences of amino acid residues up to about twenty.

IV (29c) 10 Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-IV (29c) 10 Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-

Ile-Gly-Lys-Ile-Y' waarin Y en Y', indien aanwezig, elk sequenties van aminozuurresten tot een aantal van ongeveer twintig voorstelt.Ile-Gly-Lys-Ile-Y 'wherein Y and Y', if any, each represent sequences of amino acid residues up to about twenty.

In een andere belichaming zijn homologe gebieden van het 15 ARV-2 isolaat van bijzonder belang gecodeerd in het env open leesraam van ongeveer aminozuurrest nummers 306 tot ongeveer 323 en zullen typisch de volgende aminzuursequenties hebben, waarin oligopeptiden binnen de volgende aminozuursequenties lineaire epitopen binnen zulke sequenties bevatten: 20 V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-In another embodiment, homologous regions of the ARV-2 isolate of particular interest are encoded in the env open reading frame from about amino acid residue numbers 306 to about 323 and will typically have the following amino acid sequences, wherein oligopeptides within the following amino acid sequences are linear epitopes within such sequences. contain: 20 V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-

Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y' waarin Y en Y', indien aanwezig, elk een tot ongeveer twintig of meer aminozuurresten voorstelt. Wanneer Y en/of Y' aanwezig is, kunnen deze 25 een of meer aminozuurresten omvatten uit sequenties, die aminozuurresten 306 tot 323 van de ARV-2 omhullingssequentie flankeren of enig gedeelte van deze flankerende sequenties. In het bijzonder kan Y alle of gedeelten van de HIV omhulling-aminozuursequentie van ongeveer residunummers 299 tot 306 omvatten; Y’ kan alle of gedeelten van HIV 30 omhullingsaminozuursequentie van ongeveer residunummers 324-333 omvatten.Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y 'wherein Y and Y', when present, each represent one to about twenty or more amino acid residues. When Y and / or Y 'is present, they may comprise one or more amino acid residues from sequences flanking amino acid residues 306 to 323 of the ARV-2 envelope sequence or any portion of these flanking sequences. In particular, Y may comprise all or parts of the HIV envelope amino acid sequence from about residue numbers 299 to 306; Y 'may include all or parts of HIV 30 envelope amino acid sequence from approximately residue numbers 324-333.

Ook kunnen afgeknotte sequenties van peptide V worden bereid.Truncated sequences of peptide V can also be prepared.

In dit opzicht kunnen de volgende sequenties bijzonder nuttig zijn: 8701350 -11-In this regard, the following sequences can be particularly useful: 8701350 -11-

VV

VI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y'; enVI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y '; and

VIIVII

Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro 5 Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro 5 Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-

Cys-Y' waarin Y en/of Y', indien aanwezig, elk sequenties van aminozuurresten tot een aantal van twintig of meer voorstelt.Cys-Y 'wherein Y and / or Y', if any, each represents amino acid residue sequences up to a number of twenty or more.

Een verder voorbeeld omvat homologe gebieden van het 10 LAV-2 isolaat, zoals gecodeerd in het env open leesraam van ongeveer aminozuurrest nummers 311 tot 330, met typisch de volgende sequentie: .VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y1 15 waarin Y en/of Y', indien aanwezig, sequenties voorstelt van aminozuurresten tot een aantal van twintig of meer.(Zie Nature, 326 (1987)662).A further example includes homologous regions of the LAV-2 isolate, as encoded in the env open reading frame of approximately amino acid residue numbers 311 to 330, typically with the following sequence: VII (110-2-2) Y-Lys-Thr- Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y1 15 wherein Y and / or Y ', if present, represents sequences of amino acid residues up to a number of twenty or more (See Nature, 326 (1987) 662).

Volgens een ander aspect van de uitvinding worden nieuwe cellijnen verschaft, die in staat zijn tot produktie van monoclonale antilichamen, alsmede composities, die zulke antilichamen bevatten, welke 20 antilichamen in staat zijn tot selectief herkennen bij extreem hoge titers 2 4 7 (van 10 tot 10 tot ongeveer 10 of meer) neutraliserende gebieden, aan-wezig binnen een gekozen sequentie van omhullings-glycoproteine gpllO of p25, hun proteineprecursor, biologisch tot uitdrukking gebrachte recombinant fusieproteïne en synthetische peptiden, die een of meer epitopen 25 binnen het gekozen sequentiegebied van gpllO of p25 bevatten. De onder-werpelijke hybridecellen hebben een identificeerbaar chromosoom, waarin de kiemlijn DNA herrangschikt voor codering van een antilichaam met een bindingsplaats voor een epitoop op gpllO of p25, gemeenschappelijk voor sommige of alle HIV klinische isolaten. Deze monoclonale antilicha-30 men kunnen op een grote variëteit van manieren worden gebruikt, waaronder diagnose en therapie, alsmede voor identificatie van andere kruis-reactieve antilichamen, zoals blokkerende antilichamen. Peptiden of polypeptiden, die een of meer epitopen bevatten , waarmee zij reageren, kunnen af zonderlijke toepassing vinden als immunogenen voor vaccins of als thera-35 peutische middelen.According to another aspect of the invention, novel cell lines capable of producing monoclonal antibodies, as well as compositions containing such antibodies, capable of selective recognition at extremely high titers (from 10 to 10 to about 10 or more) neutralizing regions, present within a selected sequence of envelope glycoprotein gpl10 or p25, their protein precursor, biologically expressed recombinant fusion protein and synthetic peptides, which contain one or more epitopes within the selected sequence region of gpl10 or p25. The subject hybrid cells have an identifiable chromosome, in which the germline DNA rearranges to encode an antibody with an epitope binding site on gpl10 or p25, common to some or all HIV clinical isolates. These monoclonal antibodies can be used in a wide variety of ways, including diagnosis and therapy, as well as for identification of other cross-reactive antibodies, such as blocking antibodies. Peptides or polypeptides containing one or more epitopes with which they react can find separate use as immunogens for vaccines or as therapeutic agents.

Blokkerende peptidenBlocking peptides

Primair voor gebruik in samenwerking met de beschreven peptiden 8701950 fc 2 -12- of neutraliserende monoclonale antilichamen omvat een andere belichaming van de uitvinding het gebruik van verdere peptiden of antilichamen, die de binding van HIV aan receptors belemmeren ter verdere mitigering van HIV infectiviteit. Zogenaamde "blokkerende peptiden", die in 5 staat zijn virusproliferatie te inhibiteren, alsmede monoclonale antilichamen, die specifiek zijn voor epitopen binnen dergelijke blokkerende peptiden, kunnen bij voorkeur worden gebruikt ter verhoging van de doelmatigheid van behandelingen tegen HIV-infecties. HIV blokkerende peptiden corresponderen typisch met aminozuursequenties van HIV, die 10 essentieel worden geacht voor hechting van het virus aan een gastheercel, zoals env-gecodeerde aminozuurresten van ongeveer 190 tot ongeveer 197 van LAVbru en ongeveer 185 tot ongeveer 192 van ARV2 en HTLV-III (BH-10). Deze omvatten het peptide T octapeptide (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Tyr-Thr) en zijn diverse derivaten (bijvoorbeeld IX onder-15 staand) en analoge (bijvoorbeeld XI onderstaand), beschreven inPrimary for use in conjunction with the disclosed peptides 8701950 fc 2-12 or neutralizing monoclonal antibodies, another embodiment of the invention includes the use of further peptides or antibodies, which hinder the binding of HIV to receptors to further mitigate HIV infectivity. So-called "blocking peptides", which are capable of inhibiting virus proliferation, as well as monoclonal antibodies specific for epitopes within such blocking peptides, can preferably be used to enhance the effectiveness of treatments against HIV infections. HIV blocking peptides typically correspond to amino acid sequences of HIV, which are considered essential for attachment of the virus to a host cell, such as env encoded amino acid residues from about 190 to about 197 of LAVbru and about 185 to about 192 of ARV2 and HTLV-III ( BH-10). These include the peptide T octapeptide (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Tyr-Thr) and its various derivatives (e.g. IX below-15) and analog (e.g. XI below) described in

Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83 (1986) 9254-9258, aanwezig op het omhullende glycoproteine (gpllO of 120).Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83 (1986) 9254-9258, present on the envelope glycoprotein (gpl10 or 120).

Zo zijn bijvoorbeeld blokkerende peptiden met de volgende sequenties van bijzonder belang, bij voorkeur met acetylering van de 20 eindstandige NH^ en amidering van de eindstandige C00H.For example, blocking peptides of the following sequences are of particular interest, preferably with acetylation of the terminal NH 2 and amidation of the terminal C00H.

IX (173D) Y-^Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y’; 25 XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y'; XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y1; XIII (189) 30 Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y'; XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y'? XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y';IX (173D) Y- ^ Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y '; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y "; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y '; XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y1; XIII (189) 30 Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y '; XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y '? XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y ';

s / i ; y 5 Cs / i; y 5 C

35 -13- waarin voor elk peptide Y en Y', indien aanwezig, elk een aminozuur-sequentie bevat met tot ongeveer 20 aminozuren. Epitopen of antigene determinanten binnen deze peptiden worden typisch gedefinieerd door ten minste ongeveer 5 aan elkaar grenzende aminozuren en vinden toepassing 5 voor bijvoorbeeld nabootsing van natuurlijk voorkomende HIV antigenische plaatsen voor produktie van HIV reactieve antilichamen en vaccin. Generering van monoclonale antilichamen-13- wherein for each peptide Y and Y ', if any, each contains an amino acid sequence with up to about 20 amino acids. Epitopes or antigenic determinants within these peptides are typically defined by at least about 5 contiguous amino acids and find use, for example, for mimicking naturally occurring HIV antigenic sites for production of HIV reactive antibodies and vaccine. Generation of monoclonal antibodies

De bereiding van monoclonale antilichamen kan geschieden door immortalisering van de expressie van nucleinezuursequenties, die 10 coderen voor antilichamen, die specifiek zijn voor HIV, door introductie van zulke sequenties, typisch cDNA coderen voor het antilichaam, in een gastheer, die in staat is tot cultuurkweek. De gelmmortaliseerde cellijn kan een zoogdiercellijn zijn, die getransformeerd is door oncogenese, 15 door transfectie, mutatie of dergelijke. Dergelijke cellen omvatten myelom lijnen,lymfomalijnen of andere cellijnen, die in staat is de expressie en secretie van het antilichaam in vitro te ondersteunen.The preparation of monoclonal antibodies can be accomplished by immortalizing the expression of nucleic acid sequences encoding antibodies specific for HIV, by introducing such sequences, typically cDNA encoding the antibody, into a host capable of culture culture. . The immortalized cell line can be a mammalian cell line transformed by oncogenesis, by transfection, mutation or the like. Such cells include myelom lines, lymphoma lines, or other cell lines capable of supporting the expression and secretion of the antibody in vitro.

Het antilichaam kan een natuurlijk voorkomend immunoglobuline van een zoogdier zijn, geproduceerd door transformatie van een lymfocyt, in het ^ bijzonder een splenocyt, door middel van een virus of door fusie van de lymfocyt met een neoplastische cel, bijvoorbeeld een myeloom, onder vorming van een hybridecellijn. Het splenocyt zal typisch worden verkregen van een dier, dat tegen het HIV virus is geïmmuniseerd, of een fragment daarvan, dat een epitopische plaats bevat.The antibody may be a naturally occurring mammalian immunoglobulin produced by transformation of a lymphocyte, in particular a splenocyte, by a virus or by fusion of the lymphocyte with a neoplastic cell, for example a myeloma, to form a hybrid cell line. The splenocyte will typically be obtained from an animal immunized against the HIV virus or a fragment thereof containing an epitopic site.

^ Immuniseringsprotocols zijn algemeen bekend en kunnen aanmerke lijk variëren, en toch effectief blijven. Zie, Goding, Monoclononal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 2e editie (1986). Ontwricht virus, synthetische peptiden en bacteriele fusieproteinen, die antigenische fragmenten van het gpllO of p25 molecuul bevatten, kunnen als immunogenen worden gebruikt. Bij voorkeur zal het immunogeen van ontwricht virus, peptiden of recombinantproteïnen verrijkt zijn voor proteïnen of fragmenten daarvan die de epitopen bevatten, waarvoor antilichaam producerende B cellen of splenocyten gewenst zijn.^ Immunization protocols are well known and can vary significantly, yet remain effective. See, Goding, Monoclononal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 2nd edition (1986). Disrupted virus, synthetic peptides and bacterial fusion proteins containing antigenic fragments of the gpl10 or p25 molecule can be used as immunogens. Preferably, the immunogen of disrupted virus, peptides or recombinant proteins will be enriched for proteins or fragments thereof containing the epitopes for which antibody producing B cells or splenocytes are desired.

Meer in het bijzonder kunnen oplossingen die ontwricht viruslysaten of -extracten bevatten, of bovenstaande vloeistoffen van biologisch tot expressie gebrachte recombinant proteïnen of ontwrichte expressie-vectoren verrijkt worden voor glycoproteïnen onder toepassing van zuiveringsmethoden, zoals bijvoorbeeld polyacrylamidegel elektroforese.More particularly, solutions containing disrupted virus lysates or extracts, or supernatants from biologically expressed recombinant proteins or disrupted expression vectors can be enriched for glycoproteins by purification methods, such as, for example, polyacrylamide gel electrophoresis.

8 7 0 1 ï t» {) -14-8 7 0 1 ï t »{) -14-

Lectine affiniteitszuivering is een geschikte en bij voorkeur toe te passen methode voor zuivering van gpllO en andere glycoproteinen, bijvoorbeeld affiniteitszuivering onder toepassing van linzelectine..Lectin affinity purification is a suitable and preferred method of purifying gpl10 and other glycoproteins, for example affinity purification using linzelectin.

De mate, waarin de glycoproteinen worden gezuiverd van de oplossingen 5 voor toepassing als een immunogeen kan binnen ruime grenzen variëren, bijvoorbeeld van minder dan 50%, gewoonlijk of ten minste 75% -95%, liefst 95-99% en met de meeste voorkeur tot absolute homogeniteit.The degree to which the glycoproteins are purified from the solutions 5 for use as an immunogen can vary within wide limits, for example from less than 50%, usually or at least 75% -95%, most preferably 95-99% and most preferably to absolute homogeneity.

Wanneer de proteïnen eenmaal in de gewenste mate gezuiverd zijn, kunnen zij worden gesuspendeerd of verdund in een geschikte fysiologische 10 drager voor immunisering of worden gekoppeld aan een hulpstof.Een voorkeurstechniek omvat bijvoorbeeld de adsorptie van de proteinen en fragmenten daarvan aan linzelectine agarose of andere macromoleculaire drager voor injectie. Immunogene hoeveelheden van antigenische preparaten, verrijkt in HIV proteinen, waaronder gpllO glycoproteine en p25 kern-15 proteïne , of antigenische delen daarvan, worden geïnjecteerd, in het algemeen in concentraties van 1 microgram tot 20 mg/kg gastheer.Once the proteins have been purified to the desired degree, they can be suspended or diluted in a suitable physiological carrier for immunization or coupled with an adjuvant. A preferred technique includes, for example, the adsorption of the proteins and fragments thereof to linzelectin agarose or other macromolecular carrier for injection. Immunogenic amounts of antigenic preparations enriched in HIV proteins, including gpl10 glycoprotein and p25 core-15 protein, or antigenic parts thereof, are injected, generally in concentrations from 1 microgram to 20 mg / kg host.

De toediening kan geschieden door injectie, bijvoorbeeld intramusculair, peritoneaal, subcutaan, intraveneus enz. De toediening kan eenmaal of een aantal malen geschieden, gewoonlijk met intervallen van een tot vier 20 weken. Geïmmuniseerde dieren worden gecontroleerd op produktie van anti-lichaam voor de gewenste antigenen, waarna de milt wordt verwijderd en milt B-lymfocyten worden geïsoleerd en gefuseerd met een myeloma cellijn of getransformeerd. De transformatie of fusie kan worden uitgevoerd op conventionele wijze, de fusietechniek is beschreven in een groot aantal 25 octrooischriften, bijvoorbeeld de Amerikaanse octrooischriften 4.172.124, 4.350.683, 4.363.799, 4.381.292, en 4.423.147. Zie ook Kenttett e.a.. Monoclonal Antibodies (1980) en de referenties daarin, alsmede het bovengenoemde boek van Goding.Administration may be by injection, for example, intramuscular, peritoneal, subcutaneous, intravenous, etc. Administration may be once or several times, usually at one to four week intervals. Immunized animals are monitored for antibody production for the desired antigens, the spleen is removed and spleen B lymphocytes are isolated and fused to a myeloma cell line or transformed. The transformation or fusion can be carried out in a conventional manner, the fusion technique is described in a large number of patents, for example, US patents 4,172,124, 4,350,683, 4,363,799, 4,381,292, and 4,423,147. See also Kenttett et al. Monoclonal Antibodies (1980) and the references therein, as well as the aforementioned book by Goding.

De geïmmortaliseerde cellijnen kunnen worden gecloond en gescreend 30 volgens conventionele technieken en antilichamen in de bovenstaande cel-vloeistoffen gedetecteerd die in staat zijn tot binding aan de gewenste gpllO of p25 HIV virale proteinen, recombinantfusieproteinen of synthe- . tische peptiden, die het gewenste epitopische gebied bevatten. De geschikte geïmmortaliseerde cellijnen kunnen dan in vitro worden gekweekt 35 of worden geïnjecteerd in de peritonale holte van een geschikte gastheer voor produktie van ascites vloeistof. Door het hebben van antilichamen volgens de uitvinding, waarvan bekend is dat zij specifiek zijn voor 8701950 -15- epitopen, aanwezig bijvoorbeeld binnen de gebieden, gecodeerd door het LAV genomische gebied vanaf ongeveer bp6688 tot ongeveer bp6750 (coderend peptide 29), of vanaf ongeveer bp7246 tot ongeveer 7317 (coderend peptide 36) (bp nummering volgens Wain-Hobson e.a., 5 Cell 44 (1985) 9) kunnen de bovenstaande vloeistoffen worden gescreend in competitie met de onderwerpelijke monoclonale antilichamen in een competitieve toets. Aldus kunnen verdere geimmortaliseercfe hybridom cellijnen met de gewenste bindingskarakteristieken gemakkelijk worden geproduceerd uit een variëteit van bronnen, op basis van de beschik-10 baarheid van de onderhavige antilichamen die specifiek zijn voor het bepaalde antigen. Ook kunnen deze.cellijnen worden gefuseerd met andere neoplastische B-cellen, waarbij zulke andere B-cellen kunnen dienen als recipiënten voor genomisch DNA coderend voor het antilichaam.The immortalized cell lines can be cloned and screened according to conventional techniques and antibodies detected in the supernatant cell fluids capable of binding to the desired gp10 or p25 HIV viral proteins, recombinant fusion proteins or synthesis. optical peptides containing the desired epitopic region. The appropriate immortalized cell lines can then be grown in vitro or injected into the peritoneal cavity of a suitable host for production of ascites fluid. For example, having antibodies of the invention known to be specific for 8701950 -15 epitopes contained within the regions encoded by the LAV genomic region from about bp6688 to about bp6750 (encoding peptide 29), or from about bp7246 to approximately 7317 (encoding peptide 36) (bp numbering according to Wain-Hobson et al., Cell 44 (1985) 9), the supernatants can be screened in competition with the subject monoclonal antibodies in a competitive assay. Thus, further immortalized hybridom cell lines with the desired binding characteristics can be easily produced from a variety of sources, based on the availability of the subject antibodies specific for the particular antigen. Also, these cell lines can be fused to other neoplastic B cells, such other B cells serving as recipients for genomic DNA encoding the antibody.

Hoewel neoplastische B-cellen van knaagdieren, in het bijzonder 15 muizen, de voorkeur verdienen, kunnen ook andere zoogdierspecies worden gebruikt, zoals van runderen, schapen, vaarsen, varkens,apen en dergelijke . Immunisering van deze dieren kan gemakkelijk worden uitgevoerd en hun lymf ocy«-ten, in het bijzonder splenocyten kunnen voor fusies worden verkregen.While neoplastic rodent B cells, especially mice, are preferred, other mammalian species can also be used, such as from cattle, sheep, heifers, pigs, monkeys and the like. Immunization of these animals can be easily performed and their lymphocytes, especially splenocytes, can be obtained for fusions.

20 Het monoclonale antilichaam afgescheiden door de getransformeerde of hybride cellijnen, kan van elk van de klassen of subklassen van immunoglobulinen zijn, zoals IgM, IgD, IgA, IgG^ ^ of IgE. Daar IgG het meest gebruikelijke isotype is dat in diagnostische toetsen worden toegepast, heeft meestal de voorkeur. De monoclonale antilichamen 25 kunnen intact of als fragmenten, zoals Fv, Fab, Fiab'^ worden toegepast, maar worden gewoonlijk intact gebruikt.The monoclonal antibody secreted by the transformed or hybrid cell lines can be of any of the classes or subclasses of immunoglobulins, such as IgM, IgD, IgA, IgG, or IgE. Since IgG is the most common isotype used in diagnostic tests, it is usually preferred. The monoclonal antibodies can be used intact or as fragments, such as Fv, Fab, Fiab ', but are usually used intact.

Om de mogelijke antigeniciteit in een menselijke gastheer van een monoclonaal antilichaam, dat niet van een mens, maar van een dier afkomstig is, te ontgaan, kunnen chimerische antilichamen worden ge-30 construeerd, waarin het antigen bindende fragment van een immunoglobuline molecuul (variabel gebied) door een peptidebinding is verbonden met ten minste een gedeelte van een ander proteïne dat door mensen niet als vreemd wordt erkend, zoals het uitgeworpen gedeelte van een menselijk immunoglobulinemolecuul.Dit kan geschieden door fusie van de dierlijke 35 variabele gebied exons met menselijke kappa of gamma constant gebied exons. De deskundigen zijn diverse technieken bekend, zoals beschreven 870 1 95 0 « -16- in PCT 86/01533, EE-171496, en EP173494.To evade the possible antigenicity in a human host of a monoclonal antibody, which is not from a human, but from an animal, chimeric antibodies can be constructed in which the antigen binding fragment of an immunoglobulin molecule (variable region ) is linked by peptide bond to at least a portion of another protein not recognized as foreign by humans, such as the ejected portion of a human immunoglobulin molecule, which may be by fusion of the animal variable region exons with human kappa or gamma constant area exons. Those skilled in the art are familiar with various techniques, such as described in 870-195-016-in PCT 86/01533, EE-171496, and EP173494.

Farmaceutische composities en gebruikPharmaceutical compositions and uses

De monoclonale antilichamen volgens de uitvinding die neutraliserende activiteit vertonen, zoals zulke die reageren met een epitopische plaats 5 op gpllO of p25 of die reageren met een blokkerend peptide, kunnen ook als componenten in farmaceutische composities worden opgenomen om HIV infecties te verzwakken.De compositie dient een therapeutische of profylactische hoeveelheid van ten minste een van de monoclonale antilichamen volgens de uitvinding te bevatten met een farmaceutisch doel-10 matige drager. Een farmaceutische drager is elke verenigbare, niet-toxische stof, die geschikt is om de monoclonale antilichamen aan de patient te leveren. Steriel water, alcohol, vetten, wassen en inerte vaste stoffen kunnen als de drager worden gebruikt. In de farmaceutische compositie kunnen ook farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen (buffer-15 middelen, dispergeermiddelen) worden opgenomen. Dergelijke composities kunnen een enkel monoclonaal antilichaam bevatten, teneinde bijvoorbeeld specifiek te zijn voor stammen van HIV met omhullende glycoprotelnen, die een epitopische plaats bevatten binnen een gebied, gecodeerd door bp6688-bp6750. Ook kan een farmacetüsche compositie een of meer mono-20 clonale antilichamen bevatten, onder vorming van een "cocktail".The monoclonal antibodies of the invention that exhibit neutralizing activity, such as those that respond with an epitopic site 5 to gpl10 or p25 or that react with a blocking peptide, may also be included as components in pharmaceutical compositions to attenuate HIV infections. containing a therapeutic or prophylactic amount of at least one of the monoclonal antibodies of the invention with a pharmaceutically effective carrier. A pharmaceutical carrier is any compatible, non-toxic substance suitable for delivering the monoclonal antibodies to the patient. Sterile water, alcohol, fats, waxes and inert solids can be used as the carrier. Pharmaceutical acceptable excipients (buffer 15, dispersants) can also be included in the pharmaceutical composition. Such compositions may contain a single monoclonal antibody, for example, to be specific for strains of enveloping glycoproteins containing an epitopic site within a region encoded by bp6688-bp6750. Also, a pharmaceutical composition may contain one or more monoclonal antibodies to form a "cocktail".

Zo zou bijvoorbeeld een cocktail, die monoclonale antilichamen tegen de diverse stammen van HIV bevat, een universeel produkt zijn met therapeutische of profylactische activiteit tegen de grote meerderheid van de klinische isolaten van HIV. De cocktail kan monoclonale anti-25 lichamen bevatten, die zich binden aan andere proteïnen of glyco- proteinen van HIV dan gpllO of p25, zoals bijvoorbeeld aan gp41 glyco-proteïnen of p34 nuclease/integrase. De moiverhouding van de diverse monoclonale antilichaamcomponenten zal gewoonlijk niet meer dan een factor 10 verschillen, meestal niet meer dan een factor 5 en zal ge-30 woonlijk in een moiverhouding van ongeveer 1:1-2 zijn ten opzichte van elk van de andere antilichaamcomponenten.For example, a cocktail containing monoclonal antibodies to the various strains of HIV would be a universal product with therapeutic or prophylactic activity against the vast majority of HIV clinical isolates. The cocktail may contain monoclonal antibodies which bind to HIV proteins or glycoproteins other than gpl10 or p25, such as, for example, gp41 glycoproteins or p34 nuclease / integrase. The ratio of the various monoclonal antibody components will usually differ by no more than a factor of 10, usually by no more than a factor of 5, and will usually be in a ratio of about 1: 1-2 to each of the other antibody components.

De monoclonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen worden toegepast als afzonderlijk toegediende composities, verkregen in samen-werkinc/met andere anti-retrovirale middelen, waaronder blokkerende 35 peptiden. De huidige stand van de ontwikkeling van anti-retrovirale middelen, en van anti-HIV middelen in het bijzonder, is beproken in 870 1 if 5 0 -17-The monoclonal antibodies of the invention can be used as separately administered compositions obtained in collaboration with other anti-retroviral agents, including blocking peptides. The current state of development of anti-retroviral agents, and of anti-HIV agents in particular, has been discussed in 870 1 if 5 0 -17-

Nature 325 (1987) 773-778.Nature 325 (1987) 773-778.

De monoclonale antilichamen, peptiden en farmaceutische composities daarvan volgens de uitvinding zijn bijzonder geschikt voor orale of paren-terale toediening. Bij voorkeur worden de farmaceutische composities 5 parenteraal toegediend, met name subcutaan, intramusculair of intraveneus. Aldus verschaft de uitvinding composities voor parenterale toediening, omvattende een oplossing van het monoclonale antilichaam, peptide of een cocktail daarvan in een aanvaardbare drager, bij voorkeur een waterige drager. Er. kan een variëteit van waterige dragers worden 10 gebruikt, bijvoorbeeld water, gebufferd water, 0,4% zoutoplossing, 0,3% glycineoplossing en dergelijke. Deze oplossingen zijn steriel en in het algemeen vrij van deeltjesvormig materiaal. Deze composities kunnen worden gesteriliseerd volgens conventionele, algemeen bekende sterilisatietechnieken. De composities kunnen farmaceutisch aanvaardbare 15 hulpstoffen bevatten, voorzover nodig om fysiologische omstandigheden te benaderen, zoals pH-regelende en bufferende middelen, toxiciteits-regelende middelen en dergelijke, bijvoorbeeld natriumacetaat, natrium-chloride, kaliumchloride, calciumchloride, natriumlactaat enz. De antilichaamconcentratie in deze samenstellingen kan binnen ruime grenzen 20 variëren, met name van minder dan ongeveer 0,5 gew.%, gewoonlijk 1 gew.% of ten minste ongeveer 1 gew.% tot 15 of 20 gew.%, en wordt voornamelijk gekozen op basis van vloeistofvolume, viscositeit en dergelijke, die de voorkeur hebben voor de gekozen wijze van toediening.The monoclonal antibodies, peptides and pharmaceutical compositions thereof of the invention are particularly suitable for oral or parenteral administration. Preferably, the pharmaceutical compositions are administered parenterally, especially subcutaneously, intramuscularly or intravenously. Thus, the invention provides compositions for parenteral administration comprising a solution of the monoclonal antibody, peptide or a cocktail thereof in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. There. a variety of aqueous carriers can be used, for example, water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine solution and the like. These solutions are sterile and generally free from particulate matter. These compositions can be sterilized by conventional, well known sterilization techniques. The compositions may contain pharmaceutically acceptable excipients as necessary to approximate physiological conditions such as pH regulators and buffering agents, toxicity regulators and the like, eg sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate etc. The antibody concentration in this compositions can vary within wide limits, typically from less than about 0.5 wt%, usually 1 wt% or at least about 1 wt% to 15 or 20 wt%, and are selected primarily based on fluid volume , viscosity and the like, which are preferred for the chosen mode of administration.

25 Een typische farmaceutische compositie voor 'intramusculaire injectie kan 1 ml steriel gebufferd water en 50 mg monoclonaal antilichaam bevatten. Een typische compositie voor intraveneuze infusie kan 250 ml steriele Ringer's oplossing, en 150 mg monoclonaal antilichaam bevatten. Methoden voor de bereiding van parenteraal toedienbare 30 composities zijn de deskundige bekend en zijn beschreven in bijvoorbeeld Remington's Pharmaceutical Science, 15e editie, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).A typical pharmaceutical composition for intramuscular injection may contain 1 ml of sterile buffered water and 50 mg of monoclonal antibody. A typical intravenous infusion composition may contain 250 ml of sterile Ringer's solution, and 150 mg of monoclonal antibody. Methods for preparing parenterally administrable compositions are known to those skilled in the art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

De monoclonale antilichamen en peptiden volgens de uitvinding kunnen voor opslag worden gelyofiliseerd en voor het gebruik in 35 een geschikte drager worden gereconstitueerd. Deze techniek is effectief gebleken met conventionele immuneglobulinen, bekende lyofiliserings- 8701950 -18- en reconstitutietechnieken kunnen worden toegepast. Het zal de deskundige duidelijk zijn dat lyofilisering en reconstitutie kunnen leiden tot verlies van antilichaamactiviteit in variëren mate (zo vertonen bijvoorbeeld met conventionele immuunglobuline, IgM antilichamen neiging 5 tot groter activiteitsverlies dan IgG antilichamen) en dat gebruiks-niveaus kunnen moeten worden aangepast ter compensatie.The monoclonal antibodies and peptides of the invention can be lyophilized for storage and reconstituted in a suitable carrier before use. This technique has proven effective with conventional immuneglobulins, known lyophilization and reconstitution techniques. It will be appreciated by those skilled in the art that lyophilization and reconstitution may result in loss of antibody activity to varying degrees (for example, with conventional immunoglobulin, IgM antibodies tend to exhibit greater loss of activity than IgG antibodies) and use levels may need to be adjusted for compensation.

De composities die de onderhavige monoclonale antilichamen, peptiden of cocktails daarvan bevatten, kunnen worden toegediend voor de profylactische en/6f therapeutische behandeling van HIV infecties. Bij 10 therapeutische toepassing worden composities toegediend aan een patient, die reeds met HIV" is geinfecteerd, in voldoende hoeveelheid om de infectie en zijn complicaties te genezen of althans partieel tot staan te brengen. Een hoeveelheid, die geschikt is om dit te bereiken, wordt gedefinieerd als een "therapeutisch effectieve dosis. " Voor dit doel 15 effectieve hoeveelheden zijn afhankelijk van deerrst van de infectie en de algemene toestand van het immuuisysteem van de patient zelf, maar bedragen in het algemeen ongseer 1 tot ongeveer 200 mg antilichaam per kg lichaamsgewicht, waarbij gewoonlijk doses van 5-25 mg per kg worden toegepast. Bedacht moet worden dat de materialen volgens de 20 uitvinding in het algemeen worden toegepast in ernstige ziektetoestanden, d.w.z. levensbedreigende of potentieel levensbedreigende situaties. In dergelijke gevallen is het mogelijk en kan het door de behandelende arts gewenst worden geacht om een aanmerkelijke overmaat van deze antilichamen toe te dienen.The compositions containing the subject monoclonal antibodies, peptides or cocktails thereof can be administered for the prophylactic and / 6f therapeutic treatment of HIV infections. In therapeutic application, compositions are administered to a patient already infected with HIV in sufficient amount to cure or at least partially arrest the infection and its complications. An amount suitable to achieve this is defined as a "therapeutically effective dose. "For this purpose, effective amounts depend on the severity of the infection and the general state of the patient's immune system, but are generally about 1 to about 200 mg of antibody per kg of body weight, usually containing doses of 5-25 mg per kg should be considered It should be borne in mind that the materials according to the invention are generally used in serious disease states, ie life-threatening or potentially life-threatening situations In such cases it is possible and may be considered desirable by the attending physician to have a significant to administer excess of these antibodies.

25 Bij profylactische toepassingen worden composities, die de onder havige peptiden, antilichamen of een cocktail daarvan bevatten, toegediend aan een patient, die nog niet door HIV is geïnfecteerd, maar wellicht recentelijk daaraan blootgesteld is geweest of waarschijnlijk blootgesteld is geweest of het risico loopt om aan het virus te wor-30 den blootgesteld, ter verhoging van de weerstand van de patient tegen zulke mogelijke infectie of om te vaccineren tegen het virus.In prophylactic applications, compositions containing the present peptides, antibodies or a cocktail thereof are administered to a patient who has not yet been infected by HIV, but may have recently been exposed or likely to have been exposed or is at risk of be exposed to the virus, to increase the patient's resistance to such potential infection or to vaccinate against the virus.

Een hoeveelheid wordt gedefinieerd als een "profylactisch effectieve dosis". Bij deze toepassing zijn de preciese hoeveelheden eveneens . afhankelijk van de gezondheidstoestand en het algemene niveau van 35 immuniteit van de patient, maar bedragen in het algemeen 0,1 mg tot 25 mg per kg, in het bijzonder 0,5 mg tot 2,5 mg per kg.An amount is defined as a "prophylactically effective dose." In this application, the exact amounts are also. depending on the state of health and general level of patient immunity, but are generally from 0.1 mg to 25 mg per kg, in particular from 0.5 mg to 2.5 mg per kg.

870 1 9 5 C870 1 9 5 C

-19--19-

Enkelvoudige of meervoudige toedieningen van de composities kunnen geschieden met doses en volgens een patroon,zoals gekozen door de behandelende arts. In elk geval dienende farmaceutische composities een hoeveelheid van een of meer antilichamen volgens de uitvinding 5 te verschaffen, die voldoende is voor effectieve behandeling van de patient.Single or multiple administrations of the compositions can be done in doses and according to a pattern selected by the treating physician. In any case, pharmaceutical compositions should provide an amount of one or more antibodies of the invention sufficient for effective treatment of the patient.

Verder kunnen de monoclonale antilichamen volgens de uitvinding toepassing vinden als een doel-specifiek dragermolecuul.Een anti-lichaam kan worden gebonden aan een toxine onder vorming van een 10 immunotoxine of een radioactief materiaal of een geneesmiddel onder vorming van een radiofarmaceuticum of farmaceuticum. Methoden voor de produktie van immunotoxinen en radiofarmaceutica zijn algemeen bekend (zie bijvoorbeeld Cancer Treatment Reports 68 (1984) 317.Furthermore, the monoclonal antibodies of the invention can find use as a target-specific carrier molecule. An antibody can be bound to a toxin to form an immunotoxin or a radioactive material or a drug to form a radiopharmaceutical or pharmaceutical. Methods for the production of immunotoxins and radiopharmaceuticals are well known (see, for example, Cancer Treatment Reports 68 (1984) 317.

Ook is mogelijk dat heteroaggregaten van monoclonale antilichamen 15 volgens de uitvinding en menselijke T-cell activators, zoals monoclonale antilichamen voor het CD3 antigen of voor de Fc gamma -receptor op op T-cellen, menselijke T-cellen of F__-gamma dragende cellen (zoals K cellen of neutrofielen) in staat stellen met HIV geïnfecteerde cellen te doden via antilichaam-afhankelijke, door tussenkomst van 20 cellen tot stand gebrachte cytolyse (ADCC). Dergelijke heteroaggregaten kunnen bijvoorbeeld worden samengesteld door covalente dwarsverknoping van de anti-HIV antilichamen met de anti-CD3 antilichamen met behulp van het heterobifunctionele reagens N-succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithioDpropionaat, zoals beschreven in J. Exp. Med. 160 (1984) 1686.Hetero aggregates of monoclonal antibodies of the invention and human T-cell activators, such as monoclonal antibodies to the CD3 antigen or to the Fc gamma receptor, may also be on T cells, human T cells or F __ gamma-bearing cells ( such as K cells or neutrophils) to kill HIV-infected cells via antibody-dependent 20-mediated cytolysis (ADCC). For example, such heteroaggregates can be formulated by covalently cross-linking the anti-HIV antibodies with the anti-CD3 antibodies using the heterobifunctional reagent N-succinimidyl-3- (2-pyridyl dithioDpropionate, as described in J. Exp. Med. 160 (1984) 1686.

25 De onderhavige peptide composities kunnen ook zelf therapeutische toepassing vinden waar toediening resulteert in de vermindering of eliminering van HIV in een geïnfecteerde gastheer.Deze composities, zoals peptide 29, de blokkerende peptiden en peptide 126, welke laatstgenoemde in de Amerikaanse octrooiaanvrage 930.785 is geopen-30 baard, kunnen in geschikte fysologische dragers intraveneus, subcutaan, intramusculair, intraperitoneaal en dergelijke worden toegediend. Voorbeelden van dragers zijn met fosfaat gebufferde zoutoplossing, zoutoplossing, water, kaliumchloride, natriumlactaat en dergelijke.The present peptide compositions may also find therapeutic application themselves where administration results in the reduction or elimination of HIV in an infected host. These compositions, such as peptide 29, the blocking peptides and peptide 126, the latter of which is disclosed in US patent application 930,785. Beard, can be administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally and the like in suitable physiological vehicles. Examples of carriers are phosphate buffered saline, saline, water, potassium chloride, sodium lactate and the like.

De concentratie van de peptide kan binnen ruime grenzen variëren, 35 afhankelijk van het uiteindelijke gebruik, de activiteit en de wijze van toediening.Bij voorkeur hebben de peptiden amidering van de eind-standige COOH, formulering van de eindstandige NH^ of andere farmaceu- 8701650 -20- tisch aanvaardbare derivaten. De toevoeging van blokkerende peptiden aan de peptiden, die een neutraliserend HIV gebied nabootsen, en/of de specifieke reactieve antilichamen volgens de uitvinding resulteren in aanmerkelijk verhoogde therapeutische doelmatigheid. Andere anti-5 HIV middelen kunnen eveneens in de composities worden opgenomen (andere dan de monoclonale antilichamen, die de peptiden binden) zoals 3'-azido-3'-deoxythymidine, 21,3*-dideoxycytidine, 2',31-dideoxy-2',3'-didehydro-cytidine enz.The concentration of the peptide may vary within wide limits depending on the final use, activity and mode of administration. Preferably, the peptides have amidation of the terminal COOH, formulation of the terminal NH4 or other pharmaceuticals. 8701650 -20- acceptable derivatives. The addition of blocking peptides to the peptides that mimic a neutralizing HIV region, and / or the specific reactive antibodies of the invention result in markedly increased therapeutic efficacy. Other anti-5 HIV agents may also be included in the compositions (other than the monoclonal antibodies, which bind the peptides) such as 3'-azido-3'-deoxythymidine, 21,3 * -dideoxycytidine, 2 ', 31-dideoxy- 2 ', 3'-didehydro-cytidine etc.

Gebruik van monoclonale antilichamen bij immunoaffiniteitszuivering.Use of monoclonal antibodies in immunoaffinity purification.

10 Monoclonale antilichamen, specifiek voor polypeptiden, die gpllOMonoclonal antibodies, specific for polypeptides, containing gpl10

of andere antigenische determinanten bevatten, in het bijzonder zulke antigenische determinanten, die verkregen zijn uit biologisch tot expressie gebrachte recombinantfusieproteïnen of lysaten of extracten van gekweekt HIV, zijn bijzonder voordelig voor toepassing in zuiverings- 15 protocols. In het algemeen hebben de antilichamen affiniteit associatie- 8 12 constanten van de orde van 10 -10 M. Dergelijke antilichamen kunnen worden gebruikt voor zuivering van de recombinantfusieproteïnen van het cultuurmedium van het recombinant expressiesysteem indien het tot expressie gebrachte proteine wordt afgescheiden, of van de componenten van 20 het ontwrichte biologische expressiesysteem, indien het niet wordt afgescheiden. In het algemeen zijn de monoclonale antilichamen, die in staat zijn tot reactie met gpllO of andere antigenische determinanten, gehecht aan of geïmmobiliseerd op een substraat of drager.De oplossing, die de HIV antigenische determinanten bevat, wordt in aanraking gebracht 25 met het geïmmobiliseerde antilichaam onder omstandigheden, die geschikt zijn voor de vorming van immuuncomplexen tussen het antilichaam en de polypeptiden, die de gpllO antigenische determinanten bevatten. Ongebonden materiaal wordt afgescheiden van de gebonden immuuncomplexen, welke complexen of gpllO antigenische fragmenten vervolgens van de drager 30 worden gescheiden.or contain other antigenic determinants, especially such antigenic determinants obtained from biologically expressed recombinant fusion proteins or lysates or extracts of cultured HIV, are particularly advantageous for use in purification protocols. Generally, the antibodies have affinity association constants of the order of 10 -10 M. Such antibodies can be used for purification of the recombinant fusion proteins from the culture medium of the recombinant expression system when the expressed protein is secreted, or from the expressed protein. components of the disrupted biological expression system, if not separated. Generally, the monoclonal antibodies capable of reaction with gpl10 or other antigenic determinants are attached to or immobilized on a substrate or support. The solution containing the HIV antigenic determinants is contacted with the immobilized antibody under conditions suitable for the formation of immune complexes between the antibody and the polypeptides containing the gp10 antigenic determinants. Unbound material is separated from the bound immune complexes, which complexes or gp10 antigenic fragments are then separated from the support.

De monoclonale antilichamen worden typisch ruw gezuiverd van ascitesvloeistof of bovenstaande celcultuur vloeistof alvorens aan een drager te worden gehecht. Dergelijke procedures zijn de deskundige bekend en kunnen fractionering met neutrale zouten bij hoge concen-35 traties omvatten. Ook kunnen andere methoden, zoals DEAE chromatografie, 8 7 0 1 9 ï> 0 -21- gelfiltratiechromatografie, preparatieve gelelektroforese of Proteine A affiniteitschromatografie, worden toegepast voor de zuivering van het monoclonale antilichaam, voordat het wordt gebruikt als immuno-adsorbant.The monoclonal antibodies are typically crude purified from ascites fluid or supernatant cell culture fluid before being attached to a support. Such procedures are known to those skilled in the art and may include fractionation with neutral salts at high concentrations. Also, other methods, such as DEAE chromatography, gel filtration chromatography, preparative gel electrophoresis, or Protein A affinity chromatography, may be used for the purification of the monoclonal antibody before it is used as an immunoadsorbant.

5 De drager, waarop de monoclonale antilichamen worden geïmmobiliseerd dienen de volgende algemene eigenschappen te bezitten: (a) zwakke wisselwerking met proteïnen in het algemeen om niet-specifieke binding tot een minimum te beperken, (b) goede vloei-eigenschappen, die het doorstromen van hoogmoleculaire materialen mogelijk maken, (c) het bezit 10 van chemische groepen, die kunnen worden geactiveerd of gemodificeerd om chemische binding van het monoclonale antilichaam mogelijk te maken, (d) fysische en chemische stabiliteit onder de omstandigheden, die voor de binding van het monoclonale antilichaam worden toegepast, en (e) stabiliteit ten opzichte van de omstandigheden en bestanddelen 15 van de buffers, die nodig zijn voor adsorptie en elutie van het antigen. Voorbeelden van gewoonlijk toegepaste dragers zijn agarose, gederivati-seerde polystyrenen , polysacchariden, polyacrylamide parels, geactiveerd cellulose, glas en dergelijke. Voor de hechting van antilichamen aan substraatdragers bestaan diverse chemische methoden. Zie in het 20 algemeen Advances in Enzymology j56 (1972) 29. De antilichamen volgens de uitvinding kunnen direct aan de drager worden gehecht of ook via een verbindingsmiddel of afstandarm.The support on which the monoclonal antibodies are immobilized should have the following general properties: (a) weak interaction with proteins in general to minimize nonspecific binding, (b) good flow properties, which flow through of high molecular materials, (c) possessing chemical groups, which can be activated or modified to allow chemical bonding of the monoclonal antibody, (d) physical and chemical stability under the conditions required for bonding of the monoclonal antibody. monoclonal antibody, and (e) stability to the conditions and constituents of the buffers necessary for adsorption and elution of the antigen. Examples of commonly used carriers are agarose, derivatized polystyrenes, polysaccharides, polyacrylamide beads, activated cellulose, glass and the like. Various chemical methods exist for the attachment of antibodies to substrate supports. See generally Advances in Enzymology j56 (1972) 29. The antibodies of the invention can be attached directly to the support or also via a linker or spacer.

Algemene omstandigheden, nodig voor immobilisatie van monoclonale antilichamen aan chromatografische dragers zijn algemeen bekend.General conditions necessary for immobilization of monoclonal antibodies to chromatographic supports are well known.

25 Zie bijvoorbeeld Tijssen,P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, (1985). De toe te passen koppelingsprocedures zijn enigszins afhankelijk van de eigenschappen en het type van het te koppelen antilichaam. Monoclonale antilichamen bezitten eigenschappen, die gewoonlijk van lading tot lading consistent zijn zodat zulke omstandigheden kunnen 30 worden geoptimaliseerd.De hechting geschiedt typisch via covalente bindingen.25 See, for example, Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, (1985). The coupling procedures to be used depend somewhat on the properties and type of the antibody to be coupled. Monoclonal antibodies possess properties that are usually consistent from charge to charge so that such conditions can be optimized. Adhesion typically occurs through covalent bonds.

Aan de scheidingsmatrix wordt vervolgens een suspensie van extracten of derivaten van HIV virus, de bovenstaande vloeistof van een gekweekt biologisch expressiesysteem, of een suspensie van de ontwrichte 35 cellen toegevoegd. Het mengsel wordt geïncubeerd onder geschikte omstandigheden en gedurende voldoende tijd om de immuuncomplexvorming te doen plaatsvinden, gewoonlijk ten minste 30 minuten, meestal 8701950 -22- 2-24 uur. De immuuncomplexen, die polypeptiden met antigenische gedeelten van gpllO bevatten, werden vervolgens uit het mengsel afgescheiden. Typisch wordt het mengsel verwijderd, bijvoorbeeld door elutie, waarna de gebonden immuuncomplexen uitvoerig worden gewassen met adsorptie-5 buffer. De immuuncomplexen kunnen vervolgens uit de scheidingsmatrix worden geëlueerd met een elueermiddel dat verenigbaar is met de gebruikte drager, welke elueermiddelen de deskundige bekend zijn. Ook kunnen de polypeptiden, . die de gpllO of andere antigenische gedeelten bevatten, selectief worden verwijderd. Zo kunnen bijvoorbeeld peptiden, die een door de antilichamen 10 erkend epitoop omvatten, worden gebruikt om voor de bindingsplaat van het antilichaam te concurreren, hetgeen een alternatieve elutietechniek biedt, die onder milde elutie-omstandigheden kan worden uitgevoerd.A suspension of extracts or derivatives of HIV virus, the supernatant of a cultured biological expression system, or a suspension of the disrupted cells is then added to the separation matrix. The mixture is incubated under suitable conditions and for sufficient time for the immune complex formation to occur, usually at least 30 minutes, usually 8701950-22-24 hours. The immune complexes containing polypeptides with antigenic portions of gp10O were then separated from the mixture. Typically, the mixture is removed, for example, by elution, after which the bound immune complexes are washed extensively with adsorption-5 buffer. The immune complexes can then be eluted from the separation matrix with an eluent compatible with the vehicle used, which eluents are known to those skilled in the art. Also, the polypeptides,. containing the gpl10 or other antigenic portions are selectively removed. For example, peptides comprising an epitope recognized by the antibodies can be used to compete for the antibody binding plate, providing an alternative elution technique that can be performed under mild elution conditions.

Het selectief geadsorbeerde polypeptide, dat het gpllO antigen bevat, kan uit een antilichaam affiniteit adsorbant worden geelueerd door 15 wijziging van de pH en/of ionsterkte van de buffer. Ook kunnen chaotrope middelen toepassing vinden bij de verwijdering van het gebonden antigen.The selectively adsorbed polypeptide containing the gpl10 antigen can be eluted from an antibody affinity adsorbant by altering the pH and / or ionic strength of the buffer. Chaotropic agents can also find use in the removal of the bound antigen.

De keuze van een chaotroopmiddel, zijn concentratie en de andere elueringsomstandigheden zijn afhankelijk van de karakteristieken van de wisselwerking van antilichaam en antigen, maar eenmaal vastgesteld 20 zijn zij niet vatbaar voor veranderingen, tenzij zulks noodzakelijk is in polyclonale affiniteitscheidingssystemen.The choice of a chaotropic agent, its concentration and the other elution conditions depend on the characteristics of the interaction of antibody and antigen, but once established they are not subject to change unless necessary in polyclonal affinity separation systems.

Het geëlueerde materiaal kan aanpassing vereisen aan een fysiologische pH, indien buffers met lage of hoge pH of ionsterkte zijn gebruikt ter afscheiding van de gebonden gpllO antigenen van de schei-25 dingsmatrix. Ook kan dialyse of gelfiltratiechromatografie nodig zijn ter verwijdering van een overmaat zouten, gebruikt in het eluerings-middel, teneinde gpllO of polypeptiden, die antigenische fragmenten van gpllO bevatten, te reconstitueren tot natieve conformatie.The eluted material may require adjustment to a physiological pH if low or high pH or ionic strength buffers have been used to separate the bound gp10O antigens from the separation matrix. Also, dialysis or gel filtration chromatography may be necessary to remove excess salts used in the eluent to reconstitute gpl10 or polypeptides containing gpl10 antigenic fragments to native conformation.

De werkwijzen volgens de uitvinding leveren bijvoorbeeld nagenoeg 30 gezuiverde gpllO of polypeptiden, die antigenische fragmenten daarvan bevatten, hetzij op natuurlijke wijze geproduceerd door geïnfecteerde cel-culturen of door recombinant expressiesystemen van bacteriën, gist, of gekweekte insect- of zoogdiercellen. De gpllO en fragmenten of andere gezuiverde proteïnen zullen typisch zuiverder zijn dan 50%, meestal ten 35 minste 75% zuiver en dikwijls meer dan 95% tot 99% zuiver. Deze moleculen 8701950 -23- kunnen dan verder worden gebruikt voor een ruime variëteit van toepassingen.For example, the methods of the invention provide substantially purified gpl10 or polypeptides containing antigenic fragments thereof, either produced naturally by infected cell cultures or by recombinant expression systems of bacteria, yeast, or cultured insect or mammalian cells. The gp10 and fragments or other purified proteins will typically be purer than 50%, usually at least 75% pure, and often more than 95% to 99% pure. These molecules 8701950 -23- can then be further used for a wide variety of applications.

De HIV gpllO proteïnen, polypeptiden, die de antigenische fragmenten daarvan bevatten, of andere proteïnen, nagenoeg ge-5 zuiverd volgens de methoden van de uitvinding, kunnen worden gebruikt in een ruime variëteit van toepassingen, waaronder AIDS sub-eenheid vaccinsamenstellingen, waarin het immunogen een effectieve dosis omvat van antigenische determinanten van bijvoorbeeld gpllO of een neutraliserend gebied daarvan.The HIV gpl10 proteins, polypeptides containing their antigenic fragments, or other proteins substantially purified according to the methods of the invention can be used in a wide variety of applications, including AIDS subunit vaccine compositions, wherein the immunogen includes an effective dose of antigenic determinants of, for example, gpl10 or a neutralizing region thereof.

10 Andere componenten van de samenstelling kunnen die antigenische gedeelten van HIV proteïnen of glycoproteïnen zijn, die de produktie van antilichaam (bij voorkeur neutraliserende anti-lichamen) in een geïmmuniseerde gastheer stimuleren, welke antilichamen in staat zijn tot bescherming tegen latere 15 infectie door HIV.Other components of the composition may be those antigenic portions of HIV proteins or glycoproteins that stimulate the production of antibody (preferably neutralizing antibodies) in an immunized host, which antibodies are capable of protection against subsequent infection by HIV.

Diagnostische toepassingen van monoclonale antilichamenDiagnostic Applications of Monoclonal Antibodies

Monoclonale antilichamen volgens de uitvinding zijn ook geschikt voor diagnostische doeleinden. Voor dit doel kunnen zij al dan niet een label dragen. Diagnos- 20 tische toetsen brengen typisch met zich de detectie van de vorming van een complex door de binding van het monoclonale antilichaam aan een HIV antigen. Indien niet voorzien van een label vinden de antilichamen bijvoorbeeld toepassing in agglutinatie-toetsen. Verder kunnen anti-25 lichamen zonder label worden gebruikt m combinatie met andere, van een label voorziene antilichamen (tweede antilichamen), die reactief zijn met het monoclonale antilichaam, zoals antilichamen, die specifiek zijn voor immunoglobuline. Ook kunnen de monoclonale antilichamen 30 direct van een label worden voorzien.Monoclonal antibodies of the invention are also suitable for diagnostic purposes. They may or may not have a label for this purpose. Diagnostic tests typically involve detection of complex formation by the binding of the monoclonal antibody to an HIV antigen. If not labeled, the antibodies find use, for example, in agglutination tests. Furthermore, unlabelled antibodies can be used in combination with other labeled antibodies (second antibodies) reactive with the monoclonal antibody, such as antibodies specific for immunoglobulin. Also, the monoclonal antibodies can be directly labeled.

8701950 -24-8701950 -24-

Er kan een ruime variëteit van labels worden gebruikt, zoals radio-nucliden, fluorescenten, enzymen, enzymsubstraten, enzymcofactors, enzyme-inhibitors, liganden (in het bijzonder haptens), enz. Er zijn vele typen van immunotoetsen beschikbaar, bijvoorbeeld zoals beschreven 5 in de Amerikaanse octrooischriften 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 en. 4.098.876.A wide variety of labels can be used, such as radio-nuclides, fluorescents, enzymes, enzyme substrates, enzyme co-factors, enzyme inhibitors, ligands (particularly haptens), etc. Many types of immunoassays are available, for example as described in U.S. Patents 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 and. 4,098,876.

Gewoonlijk werden de monoclonale antilichamen en peptiden volgens de uitvinding gebruikt in enzyme-immunotoetsen, waarbij bijvoorbeeld de onderwerpelijke antilichamen of tweede, antilichamen van een 10 verschillende species worden geconjugeerd aan een enzyme. Wanneer een biologisch monster, dat HIV antigenen bevat, zoals menselijk bloedserum, speeksel, sperma, vaginale afscheidingen of viraal geïnfecteerde celcul-tuursuspensie, wordt gecombineerd met de onderwerpelijke antilichamen, treedt een binding op tussen de antilichamen en de moleculen, die het 15 gewenste epitoop vertonen. Dergelijke proteïnen of virale deeltjes kunnen dan van de ongebonden reagentia worden gescheiden, waarna een tweede antilichaam (met een enzyme-label) wordt toegevoegd. Daarna wordt de aanwezigheid van het antilichaam-enzymeconjugaat, dat specifiek aan het antigen is gebonden, bepaald. Ook kunnen andere conventionele technieken 20 worden toegepast, die de deskundige bekend zijn.Usually, the monoclonal antibodies and peptides of the invention have been used in enzyme immunoassays, for example, the subject antibodies or second antibodies of a different species are conjugated to an enzyme. When a biological sample containing HIV antigens, such as human blood serum, saliva, sperm, vaginal secretions, or virally infected cell culture suspension, is combined with the subject antibodies, a bond occurs between the antibodies and the molecules that make up the desired epitope exhibit. Such proteins or viral particles can then be separated from the unbound reagents and a second antibody (with an enzyme label) is added. Then, the presence of the antibody-enzyme conjugate, which is specifically bound to the antigen, is determined. Other conventional techniques which are known to the person skilled in the art can also be used.

Ook kunnen kits worden verschaft voor gebruik met de onderwerpelijke antilichamen voor de detectie van HIV infectie of de aanwezigheid van HIV antigen. Zo kunnen de onderwerpelijke monoclonale anti-lichaamcomposities volgens de uitvinding worden verschaft, gewoonlijk in 25 gelyofiliseerde vorm, hetzij alleen, hetzij in samenwerking met additionele antilichamen, die specifiek zijn voor andere epitopen van HIV. De antilichamen, die geconjugeerd kunnen zijn aan een label of ongeconjugeerd, worden in de kits opgenomen met buffers, zoals Tris, fosfaat, carbonaat, enz. stabilisatoren, biociden, inerte proteïne, bijvoorbeeld 30 runderserumalbumine, of dergelijke. In het algemeen zullen deze materialen aanwezig zijn in hoeveelheden van minder dan ongeveer 5 gew. %, berekend op de hoeveelheid actief antilichaam, gewoonlijk in een totale hoeveelheid van ten minste ongeveer 0,001 gew.%, berekend op de anti-lichaamconcentratie. Dikwijls zal het gewenst zijn een inert versnijdings-35 middel of excipient op te nemen voor verdunning van de actieve bestanddelen, waarbij het excipient aanwezig kan zijn in een hoeveelheid van 87 0 IS 5 0 -25- ongeveer 1% tot 99 gew.% van de totale compositie. Waar een tweede anti-lichaam, dat in staat is tot binding aan het monoclonale antilichaam, wordt gebruikt zal dit gewoonlijk in een aparte ampul aanwezig zijn. Het tweede antilichaam is typisch geconjugeerd aan een label en samengesteld 5 op analoge wijze met de bovenbeschreven antilichaamsamenstellingen.Kits can also be provided for use with the subject antibodies for the detection of HIV infection or the presence of HIV antigen. Thus, the subject monoclonal antibody compositions of the invention can be provided, usually in lyophilized form, either alone or in conjunction with additional antibodies specific for other epitopes of HIV. The antibodies, which may be conjugated to a label or unconjugated, are included in the kits with buffers such as Tris, phosphate, carbonate, etc. stabilizers, biocides, inert protein, for example, bovine serum albumin, or the like. Generally, these materials will be present in amounts less than about 5 wt. %, based on the amount of active antibody, usually in a total amount of at least about 0.001% by weight, based on the antibody concentration. Often it will be desirable to include an inert excipient or excipient for dilution of the active ingredients, wherein the excipient may be present in an amount of 87% IS-25- about 1% to 99% by weight of the total composition. Where a second antibody capable of binding to the monoclonal antibody is used, it will usually be in a separate ampoule. The second antibody is typically conjugated to a label and assembled in an analogous manner to the above-described antibody compositions.

De detectie van gpllO of p25 antigenen of het gehele virus in diverse biologische monsters kan toepassing vinden bij de diagnose van een heersende infectie door het HIV virus. Niet beperkende voorbeelden van biologische monsters zijn bloedserum, speeksel, sperma, weefselbiopsie-10 monsters (hersens, huid, lymfknobbels, milt, enz.), celcultuurvloeistof-fen, ontwrichte eukaryotische en b.acteriële expressiesystemen en dergelijke. De aanwezigheid van virus wordt beproefd door incubatie van het monoclonale antilichaam met het biologische monster onder omstandigheden die leiden tot immuuncomplexvorming, gevolgd door de detectie van de 15 complexvorming. In een belichaming wordt complexvorming gedetecteerd door gebruik van een tweede antilichaam, dat in staat is tot binding aan het monoclonale antilichaam, dat typisch is geconjugeerd aan een label en samengesteld op analoge wijze met de bovenbeschreven antilichaamsamen-stellingen. In een andere belichaming wordt het monoclonale antilichaam 20 gehecht aan een vaste drager, die dan met een biologisch monster in aanraking wordt gebracht. Na een incubatie wordt van een label voorzien monoclonaal antilichaam toegevoegd ter detectie van het gebonden antigen. Bereiding en gebruik van synthetische peptiden.The detection of gpl10 or p25 antigens or the whole virus in various biological samples can be useful in the diagnosis of a prevailing infection by the HIV virus. Nonlimiting examples of biological samples are blood serum, saliva, sperm, tissue biopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spleen, etc.), cell culture fluids, disrupted eukaryotic and bacterial expression systems and the like. The presence of virus is assayed by incubation of the monoclonal antibody with the biological sample under conditions leading to immune complex formation, followed by detection of complex formation. In an embodiment, complex formation is detected using a second antibody, capable of binding to the monoclonal antibody, which is typically conjugated to a label and assembled analogously to the antibody compositions described above. In another embodiment, the monoclonal antibody 20 is attached to a solid support, which is then contacted with a biological sample. After an incubation, labeled monoclonal antibody is added to detect the bound antigen. Preparation and use of synthetic peptides.

De uitvinding verschaft nieuwe peptiden, die onder andere proteïne-25 epitopen, gecodeerd door het HIV retrovirus, immunologisch nabootsen, in het bijzonder epitopen, gecodeerd binnen de env of gag gebieden van het virale genome, die respectievelijk de gpllO of p25 coderen. Om te voorzien in van stam tot stam optredende variaties onder verschillende isolaten kunnen aanpassingen worden verricht voor conservatieve substi-30 tuties en selectie onder de alternatieven, in geval van niet-conserva-tieve substituties. Deze peptiden kunnen worden gebruikt als immunogenen voor inhibitering of eliminering van HIV antigen produktie in vitro of in vivo, voor de detectie van het virus of van antilichamen voor het virus in een fysiologisch monster. Afhankelijk van de aard van het pro-35 tocol kunnen de peptiden worden geconjugeerd aan een drager of andere verbindingen, al dan niet van een label worden voorzien, worden gebonden fc'/ 0 1 9 δ Ü -26- aan een vast oppervlak, of dergelijke.The invention provides novel peptides, which, among other things, immunologically mimic protein epitopes encoded by the HIV retrovirus, especially epitopes encoded within the env or gag regions of the viral genome, encoding the gpl10 or p25, respectively. To provide for strain-to-strain variations among different isolates, adjustments can be made for conservative substitutions and selection among the alternatives, in case of non-conservative substitutions. These peptides can be used as immunogens for inhibiting or eliminating HIV antigen production in vitro or in vivo, for the detection of the virus or antibodies to the virus in a physiological sample. Depending on the nature of the protocol, the peptides may be conjugated to a carrier or other compounds, labeled or unlabelled, bound fc '/ 0 1 9 δ Ü -26- to a solid surface, or of such.

In een belichaming zullen van belang zijnde peptiden zijn afgeleid van het gpllO gebied van het virus. Van bijzonder belang is het gebied binnen het env open leesraam, zich uitstrekkend van ongeveer basispaar 5 (bp) 6688 tot ongeveer bp 6750 en van ongeveer bp 7246 tot ongeveer 7317.In an embodiment, peptides of interest will be derived from the gpl10 region of the virus. Of particular interest is the region within the env open reading frame, ranging from about base pair 5 (bp) 6688 to about bp 6750 and from about bp 7246 to about 7317.

De van belang zijnde peptiden, waaronder blokkerende peptiden, zullen ten minste vijf, soms zes, soms acht, soms twaalf, soms eenentwintig, gewoonlijk minder dan ongeveer vijftig, vaker minder dan ongeveer vijf-10 endertig en bij voorkeur minder dan ongeveer vijfentwintig aminozuren bevatten binnen een sequentie, gecodeerd door een HIV retrovirus. Het is gewenst dat het peptide zo klein mogelijk is, maar toch nagenoeg alle immunoreactiviteit of antivirale activiteit van het grotere peptide bezit. In sommige gevallen kan het gewenst zijn twee of meer oligopeptiden 15 die elkaar niet overlappen, te verbinden onder vorming van een enkele pep-tidestructuur of ze als individuele peptiden tegelijkertijd te gebruiken, die dan afzonderlijk of tezamen gelijkwaardige gevoeligheid met de moeder verschaffen.The peptides of interest, including blocking peptides, will contain at least five, sometimes six, sometimes eight, sometimes twelve, sometimes twenty one, usually less than about fifty, more often less than about five-10 thirty and preferably less than about twenty five amino acids within a sequence encoded by an HIV retrovirus. Desirably, the peptide is as small as possible, yet still possesses substantially all of the larger peptide's immunoreactivity or antiviral activity. In some instances, it may be desirable to join two or more non-overlapping oligopeptides to form a single peptide structure or to use them as individual peptides simultaneously, which then individually or together provide equivalent sensitivity to the mother.

Het peptide kan worden gemodificeerd door introductie van conserva-20 tieve of niet-conservatieve substituties in het peptide, gewoonlijk minder dan 20 getals%, vaker minder dan 10 getals% van de uitgewisselde aminozuren. In die situaties, waarin gebieden polymorf blijken, kan het gewenst zijn een of meer bijzondere aminozuren te variëren teneinde meer doelmatig de verschillende epitopen van de verschillende retrovirale 25 stammen na te bootsen. In vele gevallen kan voor verschaffing van chemische stabiliteit methionine worden vervangen door norleucine (Nor).The peptide can be modified by introducing conservative or non-conservative substitutions into the peptide, usually less than 20 number%, more often less than 10 number% of the exchanged amino acids. In those situations where regions appear to be polymorphic, it may be desirable to vary one or more particular amino acids to more effectively mimic the different epitopes of the different retroviral strains. In many instances, to provide chemical stability, methionine can be replaced with norleucine (Nor).

Het zal duidelijk zijn dat het volgens de uitvinding gebruikte peptide niet identiek behoeft te zijn met enige bijzondere HIV polypeptide sequentie, zolang de onderwerpelijke verbinding in staat is tot 30 immunologische competitie met proteïnen van ten minste een van de stammen van het HIV retrovirus. Het onderwerpelijke peptide is daartoe vatbaar voor diverse veranderingen, zoals inlassen, coupures en substituties, conservatief of niet-conservatief, waar zulke veranderingen bepaalde voordelen in hun gebruik opleveren. Onder conservatieve substituties 35 worden substituties verstaan binnen groepen, zoals gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; en nor, met.It will be understood that the peptide used according to the invention need not be identical with any particular HIV polypeptide sequence, as long as the subject compound is capable of immunological competition with proteins from at least one of the strains of the HIV retrovirus. The subject peptide is therefore susceptible to various changes, such as insertion, denomination and substitution, conservative or non-conservative, where such changes yield certain advantages in their use. Conservative substitutions are understood to mean substitutions within groups such as gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; and nor, with.

8/01950 -27-8/01950 -27-

Gewoonlijk zal de sequentie niet meer dan 20% verschillen van de sequentie van ten minste een stam van een HIV retrovirus, behalve waar additionele aminozuren eindstandig worden toegevoegd ter verschaffing van een "arm", waardoor het peptide volgens de uitvinding op geschikte wijze kan 5 worden geïmmobiliseerd. De armen hebben gewoonlijk een lengte van ten minste 1 aminozuur en kunnen 50 of meer aminozuren bevatten, dikwijls echter 1-10 aminozuren.Ordinarily, the sequence will be no more than 20% different from the sequence of at least one strain of an HIV retrovirus, except where additional amino acids are added terminally to provide an "arm," allowing the peptide of the invention to be conveniently immobilized. The arms are usually at least 1 amino acid in length and may contain 50 or more amino acids, but often 1-10 amino acids.

Het peptide, waarin de aminozuursequentie is gemodificeerd door substitutie, toevoeging of coupure van aminozuurresten behoudt liefst 10 alle immunoreactiviteit of antivirale activiteit van de ongemodificeerde peptiden, op geschikte wijze gemeten volgens diverse toetstechnieken.The peptide in which the amino acid sequence has been modified by substitution, addition or cut of amino acid residues desirably retains any immunoreactivity or antiviral activity of the unmodified peptides, suitably measured by various assay techniques.

D.e d-isomeervorm van een of meer aminozuren kan desgewenst worden gebruikt voor modificatie van biologische eigenschappen, zoals activiteit, snelheid van afbraak, enz.The d-isomeric form of one or more amino acids can be used if desired for modification of biological properties, such as activity, rate of degradation, etc.

15 Verder kunnen een, twee of meer aminozuren aan de uiteinden van een oligopeptide of peptide worden toegevoegd om verbinding van peptiden aan elkaar te vergemakkelijken, voor koppeling aan een drager of een groter peptide, om nog nader te bespreken redenen, voor modificatie van de fysische of chemische eigenschappen van het peptide of oligopeptide, 20 of dergelijke.Furthermore, one, two or more amino acids can be added to the ends of an oligopeptide or peptide to facilitate joining of peptides together, for coupling to a carrier or a larger peptide, for reasons to be discussed further, for modification of the physical or chemical properties of the peptide or oligopeptide, or the like.

Aminozuren, zoals tyrosine, cysteine, lysine, glutamine of aspar-tinezuur of dergelijke kunnen aan het C- of N-uiteinde van het peptide of oligopeptide worden geïntroduceerd ter verschaffing van een nuttige functionaliteit voor verbinding. Cysteine verdient bijzondere voorkeur 25 voor bevordering van covalente koppeling aan andere peptiden of voor vorming van polymeren door oxydatie.Amino acids, such as tyrosine, cysteine, lysine, glutamine or aspartic acid or the like, can be introduced at the C or N end of the peptide or oligopeptide to provide useful compound functionality. Cysteine is particularly preferred for promoting covalent coupling to other peptides or for polymer formation by oxidation.

Verder kunnen de peptide- of oligopeptidesequenties verschillen van de natuurlijke sequentie doordat de sequentie is gemodificeerd door eindstandige -NH2 acylering, bijvoorbeeld acetylering, of thioglycolzuur-30 amidering, eindstandig carboxy-amidering, bijvoorbeeld met ammoniak of methylamine, ter verschaffing van stabiliteit, verhoogde hydrofobiciteit voor verbinding of binding aan een drager of een ander molecuul of voor polymerisatie.Furthermore, the peptide or oligopeptide sequences may differ from the natural sequence in that the sequence has been modified by terminal -NH2 acylation, for example acetylation, or thioglycolic acid amidation, terminal carboxy amidation, for example with ammonia or methylamine, to provide stability, increased hydrophobicity for connection or binding to a support or other molecule or for polymerization.

Zo bestaat bijvoorbeeld in de hierboven beschreven peptiden I-VIII 35 en IX-XV bij aanwezigheid van Y of Y' een voorkeursbelichaming, waarin Y of Y' een of meer cyste’ineresten of een combinatie van een of meerFor example, in the peptides I-VIII 35 and IX-XV described above, in the presence of Y or Y ', there is a preferred embodiment, wherein Y or Y' is one or more cystine residues or a combination of one or more

8 7 0 1 9 5 P8 7 0 1 9 5 P

-28- cystelneresten met spacer aminozuren omvat. Glycine is een spacer, die bijzondere voorkeur verdient. Voorkeurspeptiden voor toepassing bij oxy-datieve polymerisatie zijn zulke, waarin ï of ï' ten minste twee cyste-ineresten voorstelt. Wanneer twee cysteineresten aan hetzelfde uiteinde 5 van het peptide aanwezig zijn, bestaat een voorkeursbelichaming waarin de cystexneresten gescheiden zijn door een tot drie spacer aminozuurres-ten, bij voorkeur glycine. De aanwezigheid van cysterneresten kan de vorming van dimeren van het peptide mogelijk maken en/of de hydrofobiciteit van het resulterende peptide verhogen, hetgeen immobilisering van het 10 peptide in vaste fase of geïmmobiliseerde toetssystemen vergemakkelijkt.-28- cystelle residues with spacer amino acids. Glycine is a particularly preferred spacer. Preferred peptides for use in oxidative polymerization are those wherein 1 or 1 represents at least two cysteine residues. When two cysteine residues are present at the same end of the peptide, there is a preferred embodiment in which the cysteine residues are separated by one to three spacer amino acid residues, preferably glycine. The presence of cysteine residues can allow the formation of dimers of the peptide and / or increase the hydrophobicity of the resulting peptide, which facilitates immobilization of the solid phase peptide or immobilized test systems.

Van bijzonder belang is het gebruik van de mercaptangroep van cysteine of thioglycolzuren, gebruikt voor acylering van eindstandige aminogroepen of dergelijke voor verbinding van twee van de peptiden of oligopeptiden of combinaties daarvan door een disulfidebinding of een 15 langere binding ter vorming van polymeren, die een aantal epitopen bevatten. Dergelijke polymeren hebben het voordeel van verhoogde immunologische reactie. Waar verschillende peptiden worden gebruikt voor vorming van het polymeer, bezitten zij het additionele vermogen antilichamen te induceren, die immunoreageren met verscheidene antigenische determinanten 20 van verschillende HIV isolaten.Of particular interest is the use of the mercaptan group of cysteine or thioglycolic acids, used for acylation of terminal amino groups or the like for joining two of the peptides or oligopeptides or combinations thereof through a disulfide bond or a longer bond to form polymers contain epitopes. Such polymers have the advantage of increased immunological response. Where different peptides are used to form the polymer, they have the additional ability to induce antibodies which immunoreact with various antigenic determinants of different HIV isolates.

Voor de vorming van antigenische polymeren (synthetische multimeren) kunnen verbindingen worden gebruikt met bis-haloacetylgroepen, nitro-arylhalogeniden of dergelijke, waar de reagentia specifiek zijn voor thiogroepen. De verbinding tussen de twee mercaptogroepen van de ver-25 schillende peptiden of oligopeptiden kan een enkele binding zijn of een verbindende groep van ten minste twee, gewoonlijk ten minste vier en niet meer dan ongeveer zestien, gewoonlijk niet meer dan ongeveer veertien koolstofatomen.For the formation of antigenic polymers (synthetic multimers), compounds can be used with bis-haloacetyl groups, nitroaryl halides or the like, where the reagents are specific for thio groups. The connection between the two mercapto groups of the different peptides or oligopeptides can be a single bond or a linking group of at least two, usually at least four, and no more than about sixteen, usually no more than about fourteen carbon atoms.

Het onderwerpelijke peptide kan worden gebruikt, gebonden aan een 30 oplosbare macromoleculaire (bijvoorbeeld niet minder dan 5kDal} drager.The subject peptide can be used bound to a soluble macromolecular (eg no less than 5kDal} support.

De drager kan een natuurlijk voorkomend of synthetisch poly(aminozuur) zijn, waarvoor geen antilichamen in menselijk serum te verwachten zijn. Voorbeelden van zulke dragers zijn poly-L-lysine, "keyhole limpet" hemo cyanine, thyroglobuline, albuminen, zoals runderserumalbumine, tetanus-35 toxoïde enz. De keuze van de drager is primair afhankelijk van het uiteindelijk beoogde gebruik voor het antigen en verder van gemak en beschikbaarheid .The carrier can be a naturally occurring or synthetic poly (amino acid) for which no antibodies in human serum are to be expected. Examples of such carriers are poly-L-lysine, keyhole limpet, hemo cyanine, thyroglobulin, albumins, such as bovine serum albumin, tetanus-35 toxoid, etc. The choice of the carrier depends primarily on the ultimate intended use for the antigen and further on. convenience and availability.

6701950 -29-6701950 -29-

Met deze conjugaten zal er ten minste een molecuul van ten minste een onderwerpelijk peptide per macromolecuul en niet meer dan ongeveer een per 0,5 kDal, gewoonlijk niet meer dan ongeveer 1 per 2kDal van het macromolecuul zijn. Aan hetzelfde macromolecuul kunnen een of meer ver-5 schillende peptiden zijn gebonden.With these conjugates, there will be at least one molecule of at least one subject peptide per macromolecule and no more than about one per 0.5 kDal, usually no more than about 1 per 2kDal of the macromolecule. One or more different peptides may be attached to the same macromolecule.

De wijze van verbinding is conventioneel onder toepassing van reagentia, zoals p-maleimidobenzoëzuur, p-methyldithiobenzoëzuur, male-inezuuranhydride, barnsteenzuuranhydride, glutaalaldehyde, enz. De verbinding kan geschieden aan het eindstandige stikstofatoom, eindstandige 10 koolstofatoom of op een plaats tussen de beide uiteinden van het molecuul. Het peptide kan gederivatiseerd worden door verbinding, kan verbonden worden terwijl het aan een drager gebonden is, of dergelijke.The mode of connection is conventional using reagents such as p-maleimidobenzoic acid, p-methyl dithiobenzoic acid, maleic anhydride, succinic anhydride, glutalaldehyde, etc. The compound can be at the nitrogen terminal, 10 carbon atom or at a location between the two ends of the molecule. The peptide can be derivatized by compound, joined while bound to a carrier, or the like.

Diverse toetsprotocols, die de deskundige bekend zijn, kunnen worden toegepast voor detectie van de aanwezigheid van antilichamen voor 15 retrovirale proteïnen of van retrovirale proteïnen zelf. Van bijzonder belang is het gebruik van het peptide als het van een label voorziene reagens, waar de label een detecteerbaar signaal mogelijk maakt of binding van het peptide, hetzij direct, hetzij indirect, aan een oppervlak, waar antilichaam voor het peptide in het monster zal worden gebonden aan 20 het peptide op het oppervlak. De aanwezigheid van menselijk antilichaam, gebonden aan het peptide, kan dan worden gedetecteerd door gebruik van een xenogenisch antilichaam, dat specifiek is voor menselijk immunoglo-buline, normaliter menselijk IgM en IgG, of een van een label voorziene proteïne, dat specifiek is voor immuuncomplexen, bijvoorbeeld Rf factor 25 van S. aureus proteïne A.Various testing protocols known to those skilled in the art can be used to detect the presence of antibodies to retroviral proteins or retroviral proteins themselves. Of particular interest is the use of the peptide as the labeled reagent, where the label allows a detectable signal or binding of the peptide, either directly or indirectly, to a surface, where antibody to the peptide in the sample will are bound to the peptide on the surface. The presence of human antibody bound to the peptide can then be detected using a xenogenic antibody specific for human immunoglobulin, typically human IgM and IgG, or a labeled protein specific for immune complexes , for example Rf factor 25 of S. aureus protein A.

Illustratief voor een toetstechniek is het gebruik van een vat, bijvoorbeeld putten van microputplaten, waar het onderwerpelijke polypeptide of conjugaten daarvan covalent of niet-covalent worden geadsorbeerd aan de vatbodem en/of wanden. Het monster, normaliter menselijk 30 bloed of serum, verdund in een op geschikte wijze gebufferd medium, wordt aan het vat toegevoegd, waarna voldoende tijd wordt gelaten voor complex-vorming tussen het polypeptide of de polypeptiden en eventuele verwante antilichamen in het monster. De bovenstaande vloeistof wordt verwijderd en het vat wordt gewassen ter verwijdering van niet-specifiek gebonden 35 proteïnen. Voor de detectie wordt een van een label voorzien proteïne gebruikt, dat zich specifiek bindt aan het complex, zoals xenogenisch antiserum aan menselijk immunoglobuline.Illustrative of a testing technique is the use of a vessel, for example wells of microplates, where the subject polypeptide or conjugates thereof are covalently or non-covalently adsorbed to the vessel bottom and / or walls. The sample, usually human blood or serum, diluted in an appropriately buffered medium, is added to the vessel, allowing sufficient time for complex formation between the polypeptide or polypeptides and any related antibodies in the sample. The supernatant is removed and the vessel is washed to remove non-specifically bound proteins. For the detection, a labeled protein is used which specifically binds to the complex, such as xenogenic antiserum to human immunoglobulin.

87 0 1S? 5 087 0 1S? 5 0

VV

-30--30-

Het peptide kan op vele verschillende manieren worden bereid. Door zijn betrekkelijk geringe grootte kan het worden gesynthetiseerd in oplossing of op een vaste drager volgens conventionele technieken. Er zijn momenteel diverse automatische synthetisators in de handel verkrijgbaar, 5 die volgens bekende protocols kunnen worden gebruikt. Zie bijvoorbeeld Stewart en Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2e editie, Pierce Chemical Co., 1984 en J.Am.Chem.Soc. 105 (1983) 6442.The peptide can be prepared in many different ways. Due to its relatively small size, it can be synthesized in solution or on a solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesizers are currently commercially available, which can be used according to known protocols. See, for example, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Co., 1984 and J.Am.Chem.Soc. 105, 6442 (1983).

Ook kan hibride DNA technologie worden toegepast, waarbij een synthetisch gen kan worden bereid door gebruik van enkelvoudige strengen, die 10 coderen voor het polypeptide, of nagenoeg complementaire strengen daarvan, waarbij de enkelvoudige strengen elkaar overlappen en tezamen kunnen worden gebracht in een ontlaadmedium, teneinde te hibridiseren. De gehibridiseerde strengen kunnen worden geligateerd onder vorming van het complete gen, en door een geschikte keuze van de uiteinden kan het gen 15 worden ingelast in expressiefactors, die momenteel gemakkelijk beschikbaar zijn. Zie bijvoorbeeld Maniatis e.a., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Ook kan het gebied van het virale genome, dat codeert voor het peptide, worden gecloond door conventionele recombinant DNA technieken en tot expressie 20 worden gebracht (zie Maniatis).Hibrid DNA technology can also be used, in which a synthetic gene can be prepared using single strands encoding the polypeptide, or substantially complementary strands thereof, wherein the single strands overlap and can be put together in a discharge medium to to hybridize. The vibrated strands can be ligated to form the complete gene, and by an appropriate choice of ends, the gene 15 can be inserted into expression factors, which are currently readily available. See, for example, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Also, the region of the viral genome encoding the peptide can be cloned by conventional recombinant DNA techniques and expressed ( see Maniatis).

DNA coderende sequenties uit de LAV en ARV 2 isolatenDNA coding sequences from the LAV and ARV 2 isolates

BRUBRU

van HIV, die kunnen worden gebruikt voor de expressie van de peptiden, omvatten de volgende: iavbbt. tgt aca aga ccc aac aac aat aca aga aaa agt 25 **κυof HIV, which can be used for the expression of the peptides, include the following: iavbbt. tgt aca aga ccc aac aac aat aca aga aaa agt 25 ** κυ

ATC CGT ATC GAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGTATC CGT ATC GAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGT

ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGTARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT

ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACAATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA

3030

ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA CAT TGTACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA CAT TGT

Fragmenten uit een sequentie kunnen worden gebruikt voor expressie van peptidefragmenten, conservatieve baseveranderingen kunnen worden gemaakt, waarbij de een of meer gemodificeerde codons coderen voor de 35 een of meer zelfde aminozuren of er kunnen niet-conservatieve verande- 8 7 0 1 ·. ; -31- ringen in de coderingssequentie worden gemaakt, waarbij het resulterende aminozuur een conservatieve of niet-conservatieve verandering in de aminozuursequentie kan zijn, hetgeen eerder werd besproken.Fragments from a sequence can be used for expression of peptide fragments, conservative base changes can be made, with the one or more modified codons encoding the one or more same amino acids or non-conservative changes. ; Rings in the coding sequence are made, where the resulting amino acid may be a conservative or non-conservative change in the amino acid sequence, which was discussed previously.

De coderingssequentie kan worden verlengd bij het 5'- of 3'-uit-5 einde of bij beide uiteinden ter verlenging van het peptide onder behoud van zijn één of meer epitopischeplaatsen. De verlenging kan een arm verschaffen voor binding, bijvoorbeeld aan een label, zoals een enzyme, voor verbinding van twee of alle peptiden tezamen in dezelfde keten,vóór verlening van antigenische activiteit, geschikte restrictieplaatsen voor 10 clonen, of dergelijke.The coding sequence may be extended at the 5 'or 3' out-5 end or at both ends to extend the peptide while retaining its one or more epitopic sites. The extension can provide an arm for binding, for example, to a label, such as an enzyme, for joining two or all peptides together in the same chain, before conferring antigenic activity, suitable restriction sites for 10 clones, or the like.

De DNA sequentie zelf, fragmenten daarvan of grotere sequenties, gewoonlijk ten minste 15 basen, bij voorkeur ten minste 18 basen, kan worden gebruikt als nucleotideproben voor detectie van retroviraal RNA of proviraal DNA, of voor identificatie van homologe gebieden voor clonen 15 of sequentievorming. Hiervoor zijn vele technieken beschreven, zoals deThe DNA sequence itself, fragments thereof or larger sequences, usually at least 15 bases, preferably at least 18 bases, can be used as nucleotide probes for detection of retroviral RNA or proviral DNA, or for identification of clone 15 or sequencing homologous regions. Many techniques have been described for this, such as the

Grunstein-Hogness techniek, Southern techniek, Northen techniek, dot-blot, verbeteringen daarin, alsmede andere methodologie, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.358.535.Grunstein-Hogness technique, Southern technique, Northen technique, dot blot, improvements therein, as well as other methodology as described in U.S. Patent 4,358,535.

De onderwerpelijke peptide, waaronder blokkerende peptiden en hun 20 analogen vinden toepassing op zichzelf of in combinatie in vaccins. Evenzo kunnen anti-idiotype antilichamen, met name reactief met de idiotypen van de antilichamen volgens de uitvinding en daarbij epitopen bevattend, die neutraliserende gebieden van HIV nabootsen, in vaccins worden gebruikt. De peptiden of anti-idiotype antilichamen kunnen op geschikte 25 wijze worden geformuleerd, in het algemeen in concentraties van l^ug tot 20^ug/kg gastheer. Fysiologisch aanvaardbare media kunnen als dragers worden gebruikt, zoals steriel water, zoutoplossing, met fosfaat gebufferde zoutoplosssing en dergelijke. Ook kunnen hulpstoffen worden gebruikt, zoals aluminiumhydroxydegel, capillair actieve stoffen, 30 zoals lysolecithine , pluronic polyolen, polyanionen, peptiden, proteïnen (bijvoorbeeld difterie- of choleratoxine) en olieëmulsies. De peptiden kunnen ook worden opgenomen in liposomen of geconjugeerd worden aan polysacchariden, polypeptiden of polymeren voor gebruik in vaccin-formulering. De toediening kan geschieden door injectie, bijvoorbeeld 35 intramusculair, peritonaal, subcutaan, intraveneus, en dergelijke.The subject peptide, including blocking peptides and their analogs, find application alone or in combination in vaccines. Likewise, anti-idiotype antibodies, particularly reactive with the idiotypes of the antibodies of the invention and containing epitopes mimicking neutralizing regions of HIV, can be used in vaccines. The peptides or anti-idiotype antibodies can be suitably formulated, generally in concentrations from 1 µg to 20 µg / kg host. Physiologically acceptable media can be used as carriers such as sterile water, saline, phosphate buffered saline and the like. Excipients can also be used, such as aluminum hydroxide gel, surfactants, such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, proteins (eg diphtheria or cholera toxin) and oil emulsions. The peptides can also be incorporated into liposomes or conjugated to polysaccharides, polypeptides or polymers for use in vaccine formulation. Administration can be by injection, for example, intramuscular, peritoneal, subcutaneous, intravenous, and the like.

De toepassing van een immunogenisch effectieve dosis kan eenmaal of -32- een aantal malen geschieden, gewoonlijk met intervallen van 1-4 weken. Een "immunogenisch effectieve" dosis is die hoeveelheid van een vaccin, die geschikt is voor het opwekken van een immuunreactie in een gastheer, waarbij de gastheer verhoogde infectie vertoont.The application of an immunogenically effective dose can be done once or -32- several times, usually at intervals of 1-4 weeks. An "immunogenically effective" dose is that amount of a vaccine suitable for eliciting an immune response in a host, the host exhibiting increased infection.

5 De uitvinding wordt toegelicht aan de hand vein de volgende niet beperkende voorbeelden.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

Voorbeeld IExample I

Generering en karakterisering van monoclonale antilichamen.Generation and characterization of monoclonal antibodies.

Voorbeeld I beschrijft het genereren van hibride-cellijnen, 10 welke monoclonale antilichamen produceren, die specifiek zijn voor de omhullende glycoproteïnen van HIV. Deze werkwijze omvat het gebruik van met lectine gezuiverde extracten van LAV , gehecht aan linzelectine_ agarose als het immunogen. De vervolgens door de hibride-cellijnen gegenereerde antilichamen worden gekarakteriseerd door een vermogen om 15 door immunovloei en radioimmuun gpllO uit gezuiverd LAV te precipiteren en als biologisch tot expressie gebracht recombinant fusieproteine.Example I describes the generation of hibrid cell lines producing monoclonal antibodies specific for the envelope glycoproteins of HIV. This method involves the use of lectin purified extracts of LAV attached to linzelectin agarose as the immunogen. The antibodies subsequently generated by the hybrid cells lines are characterized by an ability to precipitate from purified LAV by immunofluid and radioimmune gpl10 and as biologically expressed recombinant fusion protein.

De monoclonale antilichamen, die zich binden aan gpllO, zijn eveneens reactief in ELISA's met ontwricht geheel virus, fusieproteïnen en synthetische peptiden en reageren met het gehele virus in indirecte fluores-20 centietoetsen.The monoclonal antibodies, which bind to gpl10, are also reactive in disrupted whole virus ELISAs, fusion proteins and synthetic peptides and react with the whole virus in indirect fluorescence assays.

De protocols voor het genereren van de hibridecellijnen, die monoclonaal antilichaam produceren, en de karakterisering van de antilichamen waren als volgt» LAV virus, gezuiverd uit geïnfecteerde CEM cellen (A.T.T.C.The protocols for generating the hibrid cell lines producing monoclonal antibody and characterizing the antibodies were as follows: LAV virus purified from infected CEM cells (A.T.T.C.

25 No. CRL8904) werd ontwricht in 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15M NaCl, 1,0% (R)25 No. CRL8904) was disrupted in 50 mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 1.0% (R)

Aprotinin, 2,0 Nonidet P-40 (NP-40) (octylfenoxypolyethoxyethanol).Aprotinin, 2.0 Nonidet P-40 (NP-40) (octylphenoxy polyethoxyethanol).

Het extract werd tweemaal geklaard door centrifugeren en op 0,5% NP-40 gebracht met de toevoeging van drie volumen ontwrichtingsbuffer zonder NP-40. De linzelectine Cepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) werd voor-30 gewassen in ontwrichtingsbuffer zonder NP-40 en vervolgens tot evenwicht gebracht in absorptiebuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1,0% Aprotinin, 0,5% NP-40), Geklaard viraal extract werd gedurende 42 uur bij 4°C geadsorbeerd met linzelectine Cepharose. Ongeadsorbeerd materiaal werd verwijderd door wassen met een overmaat adsorptiebuffer.The extract was clarified twice by centrifugation and brought to 0.5% NP-40 with the addition of three volumes of disruption buffer without NP-40. The linzelectin Cepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) was pre-washed in disruption buffer without NP-40 and then equilibrated in absorption buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 1.0% Aprotinin, 0.5% NP-40), Clarified viral extract was adsorbed with linzelectin Cepharose for 42 hours at 4 ° C. Unadsorbed material was removed by washing with an excess of adsorption buffer.

35 Elutie van geadsorbeerd materiaal werd uitgevoerd met 0,2 M alpha-methyl-mannoside in adsorptiebuffer. Het eluent werd gedialyseerd tegen PBS ter 8 7 0 1 § 5 0 -33- verwijdering van de suiker en het materiaal werd opnieuw geadsorbeerd aan het linzelectine Sepharose.Elution of adsorbed material was performed with 0.2 M alpha-methyl-mannoside in adsorption buffer. The eluent was dialyzed against PBS to remove the sugar and the material was re-adsorbed on the linzelectin Sepharose.

Het complex van glycoproteïne en linzelectine Sepharose werd gebruikt voor het immuniseren van BALB/c muizen door drie intraperiteonale 5 injecties zonder hulpstof, die met intervallen van 2-3 weken werden gegeven. De milten werden uit de geïmmuniseerde muizen verwijderd en toonden circulerend antilichaam voor glycoproteïnen van HIV door immuno-vloei RIP en/of ELISA.The glycoprotein and linzelectin Sepharose complex was used to immunize BALB / c mice by three intraperiteonal injections without vehicle given at 2-3 week intervals. The spleens were removed from the immunized mice and showed circulating antibody to HIV glycoproteins by immunofluid RIP and / or ELISA.

De voor het genereren van cellijnen toegepaste protocols waren in 10 het algemeen die van Kohier en Milstein (Nature 256 (1985) 495) met de modificaties van Goldstein, e.a. (Infect. Immun. 38 (1982) 273).The protocols used to generate cell lines were generally those of Kohler and Milstein (Nature 256 (1985) 495) with the modifications of Goldstein et al. (Infect. Immun. 38 (1982) 273).

B-lymfosieten van de milten van de geïmmuniseerde muizen werden gefuseerd met NS-1 myeloomcellen met behulp van 40% (gew./vol.) polyethyleenglycol.B lymphosites from the spleens of the immunized mice were fused with NS-1 myeloma cells using 40% (w / v) polyethylene glycol.

Na de fusie werd het celmengsel weer gesuspendeerd in HAT medium (RPMI- -4 15 1640 medium, aangevuld met 15% feutaal kalfserum, 1x10 M hypoxanthme, 7 -5 4x1ο"' M aminopterine en 1,6x10 M thymidine) per selectie voor de groei van hibridecellen, en vervolgens gedoseerd in 96-puts microcul-tuurschotels in een concentratie van 1-3x10 cellen/ml en gelncubeerd bij 37°C in een bevochtigde atmosfeer, die 6% CC>2 bevatte. De culturen 20 werden gevoed door vervanging van de helft van de bovenstaande vloeistof door vers HAT medium. De putten werden geobserveerd met behulp van een omgekeerde microscoop voor tekenen van celproliferatie, en toen de cellen voldoende dichtheid hadden werden de bovenstaande vloeistoffen beproefd op anti-LAV antilichaam.After the fusion, the cell mixture was resuspended in HAT medium (RPMI-4 15 1640 medium supplemented with 15% fetal calf serum, 1x10 M hypoxanthme, 7 -5 4x1O "M aminopterin and 1.6x10 M thymidine) per selection for the growth of hibrid cells, then dosed into 96-well microculture dishes at a concentration of 1-3x10 cells / ml and incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 6% CC> 2. Cultures were fed by replacement half of the supernatant by fresh HAT medium The wells were observed using an inverted microscope for signs of cell proliferation, and when the cells were sufficiently dense, the supernatants were assayed for anti-LAV antibody.

25 Putten, die hibridecellen bevatten, welke antilichaam voor LAVWells containing hibrid cells containing antibody to LAV

procudeerden, werden geïdentificeerd door ELlSA's, waarbij de binding aan gezuiverd ontwricht geheel virus of biologisch tot expressie gebrachte proteïne werd gemeten. ELISA toetsen met ontwricht virus werden uitgevoerd op LAV EIA platen (Genetic Systems, Seattle, Washington).were identified by ELlSAs, where the binding to purified disrupted whole virus or biologically expressed protein was measured. ELISA tests with disrupted virus were performed on LAV EIA plates (Genetic Systems, Seattle, Washington).

30 De platen werden gedurende 45 minuten bij 37°C gelncubeerd met celcul-tuurvloeistoffen en vervolgens driemaal gewassen met 0,05% Tween 20 in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS-Tween).The plates were incubated with cell culture fluids at 37 ° C for 45 minutes and then washed three times with 0.05% Tween 20 in a phosphate buffered saline (PBS-Tween).

Peroxydase-geit antimuis IgG (verdunning 1:2000 in PBS-Tween;Peroxidase-goat anti-mouse IgG (dilution 1: 2000 in PBS-Tween;

Zymed Laboratories, Ine., South San Francisco, California) werd toege-35 voegd (100 microliter per put) en de platen werden gedurende 45 minuten bij 35°C gelncubeerd en gewassen zoals boven beschreven. Substraat 8/01950 fZymed Laboratories, Ine., South San Francisco, California) was added (100 microliters per well) and the plates incubated at 35 ° C for 45 minutes and washed as described above. Substrate 8/01950 f

XX

-34- (0,025 M citroenzuur, 0,5 M dibasisch fosfaat, pH 5,0, bevattende 14 mg o-fenyleendiamine en 10 microliter 30%'s waterstofperoxide per 50 ml) werd toegevoegd en de platen werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. De reactie werd met 3N zwavelzuur tot 5 stilstand gebracht en er werden colorimetrische reacties kwantitatief uitgevoerd met een automatische microplaatlaser. Putten, die positieve resultaten gaven werden onderworpen aan subclonen door beperkte verdunning, opnieuw beproefd op specificiteit en vervolgens geëxpandeerd.-34- (0.025 M citric acid, 0.5 M dibasic phosphate, pH 5.0 containing 14 mg of o-phenylenediamine and 10 microliters of 30% hydrogen peroxide per 50 ml) was added and the plates were placed in room temperature for 30 minutes incubated dark. The reaction was stopped with 3N sulfuric acid and colorimetric reactions were performed quantitatively with an automatic microplate laser. Wells giving positive results were subjected to limited dilution subclones, retested for specificity and then expanded.

De door de resulterende hibridecellijnen afgescheiden monoclonale 10 antilichamen werden verder gekarakteriseerd op specificiteit en reactiviteit door immunovloei, immunoprecipitatie en ELISA met behulp van ontwricht LAV virus, recombinant LAV fusie-proteïnen en synthetische LAV peptiden. Alle antilichamen bleken van het IgG^ isotype te zijn. Voor de indiening van deze aanvrage werden cellijnen HIV-gpllQ-1, HIV-gpll0-2 en 15 HIV-gpllO-3 gedeponeerd bij de American Type Culture Collection waar zij worden aangeduid als respectievelijk A.T.C.C. nos HB 9175, HB 9176 en HB 9177.The monoclonal antibodies secreted by the resulting hibrid cell lines were further characterized for specificity and reactivity by immunoflower, immunoprecipitation and ELISA using disrupted LAV virus, recombinant LAV fusion proteins and synthetic LAV peptides. All antibodies were found to be of the IgG ^ isotype. For the filing of this application, cell lines HIV-gpl10-1, HIV-gpl10-2 and HIV-gpl10-10 were deposited with the American Type Culture Collection where they are designated as A.T.C.C. nos HB 9175, HB 9176 and HB 9177.

Op reactiviteit beproefde recombinant fusieproteïnen kregen eerder de aanduiding ENV2, ENV3, ENV4 en ENV5. Proteïne ENV2 is tot expressie 20 gebracht uit pENV2 (A.T.C.C. no. 53071), dat een gebied van LAV is vanaf basispaar (bp) 6598 tot en met bp 7178 (nummering volgens Wain-Hobson et al., Cell 44 (1985) 9), ENV3 is tot expressie gebracht uit pENV3 (A.T.C.C. no. 53072), dat het LAV gebied vanaf bp 7178 tot en met pb7698 omvat; ENV4 is tot expressie gebracht uit pENV4 ( A.T.C.C. nr.53073), en 25 omvat bp 7698 tot en met bp 8572; en ENV5 is tot expressie gebracht uit pENV5 (A.T.C.C. nr.53074) dat het LAV gebied pb5889 tot en met pb 7698 omvat. De produktie van de recombinantfusie-proteïne is beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage 721.237.Reactivity-tested recombinant fusion proteins were previously designated ENV2, ENV3, ENV4 and ENV5. Protein ENV2 is expressed from pENV2 (ATCC No. 53071), which is a region of LAV from base pair (bp) 6598 through bp 7178 (numbering according to Wain-Hobson et al., Cell 44 (1985) 9) , ENV3 is expressed from pENV3 (ATCC No. 53072), which includes the LAV region from bp 7178 to pb7698; ENV4 is expressed from pENV4 (A.T.C.C. No. 53073), and encompasses bp 7698 through bp 8572; and ENV5 is expressed from pENV5 (A.T.C.C. No. 53074) comprising the LAV region pb5889 through pb 7698. The production of the recombinant fusion protein is described in U.S. Patent Application 721,237.

Samenstelling van synthetische peptiden.Synthetic peptides composition.

30 Peptiden I (29) en VIII (110-2-2) werden samengesteld op een benz- hydrylamine (polystyreen/divinylbenzeen)hars (Applied Biosystems, Ine.,Peptides I (29) and VIII (110-2-2) were formulated on a benzhydrylamine (polystyrene / divinylbenzene) resin (Applied Biosystems, Ine.,

Foster City, California). Peptide V (177) werd samengesteld op een tertiair butyloxycarbonyl (Boc-ethylbenzylcysteïne-fenylacetamidomethyl (PAM) polystyreen/divinylbenzeen hars. Symmetrische anhydride-koppelin-35 gen werden uitgevoerd in een Applied Biosystems 430A synthesizer. In beide peptiden werd cysteine toegevoegd als het eerste residu.Foster City, California). Peptide V (177) was composed on a tertiary butyloxycarbonyl (Boc-ethylbenzylcysteine-phenylacetamidomethyl (PAM) polystyrene / divinylbenzene resin. Symmetric anhydride linkers were performed in an Applied Biosystems 430A synthesizer. In both peptides, cysteine was added as the first residue.

Voor asparagine en glutamine werden dicyclohexylcarbodiimide-kop- 8 70 IS 5 0 -35- pelingen in tegenwoordigheid van hydroxylbenzotriazool gebruikt. Zij-ketenbescherming op benzylbasis en Boe alpha-aminebescherming werden toegepast. Andere zijketenbescherming, die routinematig werd toegepast, was Boe (formyl) tryptofan, Boe methioninesulfoxyde, Boe (tosyl) arginine, 5 Boe (methylbenzyl) cysteine, Boe (tosyl) histidine, Boe (chloorbenzyl-oxycarbonyl) lysine en Boe (broombenzyloxycarbonyl) tyrosine.For asparagine and glutamine, dicyclohexylcarbodiimide linkages in the presence of hydroxylbenzotriazole were used. Benzyl based side chain protection and Boe alpha amine protection were used. Other side chain protection, which was routinely applied, was Boe (formyl) tryptophan, Boe methionine sulfoxide, Boe (tosyl) arginine, 5 Boe (methylbenzyl) cysteine, Boe (tosyl) histidine, Boe (chlorobenzyloxycarbonyl) lysine and Boe (bromobenzyloxycarbonyl) .

Wanneer de peptiden van een radiolabel werden voorzien, geschiedde 3 zulks door acetylering van de exndstandige aminogroep met H-azijnzuur en een overmaat dicyclohexylcarbodiimide.When the peptides were radiolabelled, this was done by acetylation of the terminal amino group with H-acetic acid and an excess of dicyclohexylcarbodiimide.

Deprotectie en splijting van het peptide van de hars geschiedden volgens het Tam "laag-hoog" HF protocol (J.Am.Chem.Soc. 105 (1983) 6442).Deprotection and cleavage of the peptide from the resin was done according to the Tam "low-high" HF protocol (J.Am.Chem.Soc. 105 (1983) 6442).

Extractie uit de hars geschiedde met 5%'s azijnzuur en het extract werd onderworpen aan celfiltratiechromatografie in 5%'s azijnzuur.Extraction from the resin was carried out with 5% acetic acid and the extract was subjected to cell filtration chromatography in 5% acetic acid.

Synthetische peptiden, beproefd op reactiviteit met de monoclonale 15 antilichamen, omvatten peptiden 29, 36 en 39. Peptide 29 is gecodeerdSynthetic peptides tested for reactivity with the monoclonal antibodies include peptides 29, 36 and 39. Peptide 29 is encoded

door het LAV genomische gebied vanaf ongeveer bp 6688 tot en met BRUby the LAV genomic region from approximately bp 6688 to BRU

bp 6750; peptide 36 is gecodeerd door het gebied vanaf ongeveer bp 7246 tot en met bp 7317; peptide 39 is gecodeerd door het gebied vanaf ongeveer bp 7516 tot en met bp 7593. Peptiden 36 en 39 zijn beschreven in 20 het Amerikaanse octrooischrift 4.629.783.bp 6750; peptide 36 is encoded by the region from about bp 7246 to bp 7317; peptide 39 is encoded in the region from about bp 7516 to bp 7593. Peptides 36 and 39 are described in U.S. Patent No. 4,629,783.

De blokkerende peptiden IX-XV worden in hoofdzaak op de beschreven wijze samengesteld op een methyl-benzhydrylamine (polystyreen/divinyl-benzeen) hars (Applied Biosystems, Inc.,Foster City, California). Symmetrische anhydridekoppelingen werden uitgevoerd op een Applied Bio-25 systems 430A synthesizer. Voor asparagine werden dicyclohexylcarbodi-imidekoppelingen in tegenwoordigheid van hydroxylbenzotriazol toegepast. Voor bescherming werden benzyl-basiszijketen en Boe alpha-aminebescherming gebruikt, terwijl Boe (broombenzyloxycarbonyl) specifiek voor tyro-sine-zijketens werd toegepast· Acetylering, voorzover aanwezig, werd 30 uitgevoerd met azijnzuuranhydride of ijsazijn en dicyclohexylcarbodiimide. Deprotectie en splijting van het peptide van de hars geschiedden volgens het standaard "hoog" HF protocol (zie Stewart en Young). Extractie uit de hars werd uitgevoerd met 50%'s azijnzuur en het extract werd vervolgens onderworpen aan celfiltratiechromatografie in 20%'s azijnzuur. 35 Naar wens wordt "high performance" vloeistof chromatografie uitgevoerd op een Vydac C18 kolom (Rainin Instrument Co. Eneryville, Canada) met een 0,1% trifluorazijnzuur, acetonitrile gradient.The blocking peptides IX-XV are composed essentially on a methyl benzhydrylamine (polystyrene / divinyl benzene) resin in the manner described (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Symmetrical anhydride linkages were performed on an Applied Bio-25 systems 430A synthesizer. For asparagine, dicyclohexylcarbodiimide linkages in the presence of hydroxylbenzotriazole were used. For protection, benzyl base side chain and Boe alpha-amine protection were used, while Boe (bromobenzyloxycarbonyl) was used specifically for tyrosine side chains. Acetylation, if any, was performed with acetic anhydride or glacial acetic acid and dicyclohexylcarbodiimide. Deprotection and cleavage of the peptide from the resin was done according to the standard "high" HF protocol (see Stewart and Young). Extraction from the resin was performed with 50% acetic acid and the extract was then subjected to cell filtration chromatography in 20% acetic acid. Desirably, "high performance" liquid chromatography is performed on a Vydac C18 column (Rainin Instrument Co. Eneryville, Canada) with a 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile gradient.

8701950 * -36-8701950 * -36-

Immunovloei.Immuno Flow.

Karakterisering door immunovloei werd uitgevoerd boven clonen staande vloeistof of ascites vloeistof met gezuiverd LAV virus en recombinant fusieproteïnen als antigenen. De antigenen werden eerst afgeschei-5 den door polyacrylamine gradient gelelectroforese (7,0-15,0%) en overgebracht op een nitrocellulosemembraan (NCM) door electroforese gedurende 4 uur bij 25V in 25 mM natriumfosfaat (pH 7,0). Na de overdracht werd het NCM ter voorkoming van niet-specifieke wisselwerkingen geblokkeerd door incubatie in PBS-Tween of Blotto (5% niet-vette droge melk in PBS) gedu-10 rende 1 uur bij kamertemperatuur. Het NCM werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met bovenstaande celcultuurvloeistof of ascites vloeistof verdund in PBS-Tween en werd gespoeld met drie porties PBS-Tween. In de tweede trap werd het NCM gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met geit anti-muis IgG-mierikswortel per oxydase, ver-15 dund in PBS-Tween. Deze incubatie werd gevolgd door wassen met PBS-Tween en dan onderdompeling gedurende 20 minuten in mierikswortelperoxydase kleurontwikkelingsoplossing (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California).Immunofluid characterization was performed over clone fluid or ascites fluid with purified LAV virus and recombinant fusion proteins as antigens. The antigens were first separated by polyacrylamine gradient gel electrophoresis (7.0-15.0%) and transferred to a nitrocellulose membrane (NCM) by electrophoresis for 4 hours at 25V in 25 mM sodium phosphate (pH 7.0). After the transfer, the NCM to prevent nonspecific interactions was blocked by incubation in PBS-Tween or Blotto (5% non-fat dry milk in PBS) for 1 hour at room temperature. The NCM was incubated with supernatant cell culture fluid or ascites fluid diluted in PBS-Tween for 1 hour at room temperature and rinsed with three portions of PBS-Tween. In the second step, the NCM was incubated for 1 hour at room temperature with goat anti-mouse IgG horseradish per oxidase diluted in PBS-Tween. This incubation was followed by washing with PBS-Tween and then immersion for 20 minutes in horseradish peroxidase color development solution (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California).

De reactie werd tot stilstand gebracht door dompeling in gedeioniseerd water. De reactiviteit van het monoclonale antilichaam werd vergeleken 20 met een positief controleserum, reactief met gezuiverd ontwricht virus of tot expressie gebracht fusieproteïne- De resultaten toonden dat alle antilichamen zich bonden aan gpllO en zijn precursor molecule gpl50 bij gebruik van ontwrichte viruspreparaten. Antilichamen 110-1 en 110-2 herkenden het fusieproteïne ENV3 terwijl antilichamen 110-3, 110-4, 25 110-5 en 110-6 immunocomlexen vormden met ENV2.The reaction was stopped by immersion in deionized water. The reactivity of the monoclonal antibody was compared to a positive control serum, reactive with purified disrupted virus or expressed fusion protein. The results showed that all antibodies bound to gpl10 and its precursor molecule gpl50 using disrupted virus preparations. Antibodies 110-1 and 110-2 recognized the fusion protein ENV3 while antibodies 110-3, 110-4, 110-5 and 110-6 immunocomplexed with ENV2.

Immunoprecipitatie.Immunoprecipitation.

Virale extracten voor radio-immuunprecipitatie werden bereid uit CEM cellen, geïnfecteerd met het LAV isolaat van HIV, aangepast aanViral extracts for radioimmunoprecipitation were prepared from CEM cells infected with the LAV isolate of HIV adapted to

BRUBRU

lytische groei door continue doorgang. Toen vroege cytopatische effecten 30 duidelijk werden, werden de cellen overgebracht naar labelmedia, bevat-tende ƒS/-methionine (0,05 mCi/ml) of /^/-glucosamine (0,025 mCi/ml), daarna gedurende 24 uur geïncubeerd totdat de meeste cellen waren ge-lyseerd, waarbij virus in de bovenstaande cultuurvloeistof vrijkwam. Het virus werd gepelleteerd (een uur bij 100.000 xg) uit de celvrije boven-35 staande vloeistof en detergentextracten werden bereid in P-RIPA buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing, omvattende 1,0% Triton X-100, 8/01950 * -37- 1/0% deoxycholaat, 0,1% SDS en 1% Aprotinin). Analoge extracten werden bereid uit de bovenstaande vloeistoffen van niet-geïnfecteerde CEM cellen.lytic growth through continuous passage. When early cytopathic effects became apparent, the cells were transferred to label media containing SS / methionine (0.05 mCi / ml) or ^ / gluc -glucosamine (0.025 mCi / ml), then incubated for 24 hours until most cells were lysed with virus released into the culture supernatant. The virus was pelleted (one hour at 100,000 xg) from the cell-free supernatant and detergent extracts were prepared in P-RIPA buffer (phosphate buffered saline containing 1.0% Triton X-100, 8/01950 * -37 - 1/0% deoxycholate, 0.1% SDS and 1% Aprotinin). Analogous extracts were prepared from the supernatants of uninfected CEM cells.

Er werden immunoprecipitatietoetsen uitgevoerd met 100 microliter virusextract, geïncubeerd met 100 microliter bovenstaande cultuurvloei-5 stof uit de hibridecellijnen gedurende 1 uur op ijs. Aan elk monster werd 4 microliter konijn anti-muis Ig (Zymed Laboratories, San Francisco California) toegevoegd, waarna gedurende 30 minuten werd geïncubeerd. Vervolgens werd aan elk monster immunoprecipitine (100 microliter;Immunoprecipitation assays were performed with 100 microliters of virus extract incubated with 100 microliters of supernatant culture fluid from the hibride cell lines for 1 hour on ice. 4 microliters of rabbit anti-mouse Ig (Zymed Laboratories, San Francisco California) were added to each sample and incubated for 30 minutes. Immunoprecipitin (100 microliters;

Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland), gesuspendeerd in 10 P-RIPA buffer bevattende 1,0 ovalbumine, waarna nog 30 minuten werd ge-incubeerd. De gebonden complexen werden gewassen en afgescheiden door SDS-polyacrylamidegel electroforese (15,0% acrylamide: DATD gel). Na de electroforese werden de gels gefixeerd, geweekt in Enhance (New England Nuclear, Boston), gedroogd en blootgesteld aan Kodak XR-5 film. Een posi-15 tief referentieserum, dat alle HIV virale proteïne immunoprecipiteerde, werd tot reactie gebracht met viraal-geïnfecteerde en namaak-geïnfecteerde CEM bovenstaande celvloeistoffen als positieve en negatieve controles.Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland), suspended in 10 P-RIPA buffer containing 1.0 ovalbumin and incubated for an additional 30 minutes. The bound complexes were washed and separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (15.0% acrylamide: DATD gel). After the electrophoresis, the gels were fixed, soaked in Enhance (New England Nuclear, Boston), dried and exposed to Kodak XR-5 film. A positive reference serum, which immunoprecipitated all HIV viral protein, was reacted with virally-infected and counterfeit-infected CEM supernatants as positive and negative controls.

De resultaten toonden dat alle zes monoclonale antilichamen gpllO en gpl50 specifiek immunoprecipiteerden.The results showed that all six monoclonal antibodies gpl10 and gpl50 specifically immunoprecipitated.

20 Enzyme-gebonden immunoabsorbanttoets.20 Enzyme-linked immunoabsorbant assay.

Ter indeling van de gpllO epitopen, die door de monoclonale antilichamen volgens de uitvinding worden herkend, werden bovenstaande cul-tuurvloeistoffen uit hibridecellijnen of ascitesvloeistof verder gekarakteriseerd door reactiviteit in ELISA's met biologisch tot uitdrukking 25 gebrachte fusieproteïnen en synthetische peptiden. De procedures waren dezelfde als hierboven beschreven, met dit verschil dat fusieproteïne of synthetische proteïnen gezuiverd virus vervingen als het antigen, geadsorbeerd aan het oppervlak van de microtiterputten.To classify the gpl10 epitopes recognized by the monoclonal antibodies of the invention, supernatant culture fluids from hibrid cell lines or ascites fluid were further characterized by reactivity in ELISAs with biologically expressed fusion proteins and synthetic peptides. The procedures were the same as described above, except that fusion protein or synthetic proteins replaced purified virus as the antigen adsorbed on the surface of the microtiter wells.

Bij gebruik van peptiden als antigen was het protocol als volgt.When using peptides as antigen, the protocol was as follows.

30 Gelyofiliseerd peptide werd opgelost in 6M guanidine HCL. Vlak voor het aanbrengen in de 96-putsplaten werd de guanidineoplossing verdund in een 0,05 M carbonaat/dicarbonaatbuffer (pH 9,6) tot een uiteindelijke peptideconcentratie van ten hoogste 100^ig/ml. Een volume van 50 ^μΐ van het verdunde peptide werd in elke microtiterput aangebracht, waarna de 35 platen overnacht bij 4°C werden geïncubeerd. Overmaat peptide-oplossing werd "uitgeschud", platen geblokkeerd Blotto, en de hierboven beschreven 8 7 0 1 0. ï 0 -38- procedure werd voor de rest van de ELISA gevolgd. Evenzo werd recombinant proteïne verdund tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 2 yug/ml in 0,05 M carbonaat/bicarbonaatbuffer (pH 9,6) voordat dezelfde procedure werd gevolgd.Lyophilized peptide was dissolved in 6M guanidine HCL. Just before loading into the 96-well plates, the guanidine solution was diluted in a 0.05 M carbonate / dicarbonate buffer (pH 9.6) to a final peptide concentration of up to 100 µg / ml. A volume of 50 μm of the diluted peptide was placed in each microtiter well and the 35 plates were incubated overnight at 4 ° C. Excess peptide solution was "shaken out", plates blocked Blotto, and the above-described 8 7 0 1 0. 038-procedure was followed for the rest of the ELISA. Likewise, recombinant protein was diluted to a final concentration of about 2 yug / ml in 0.05 M carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) before following the same procedure.

5 De resultaten zijn vermeld in tabel B. Monoclonale antilicha- men, geproduceerd door cellijnen HIV gpllO-1 en HIV gp 110-2 reageerden met ENV3, ENV5, peptide 36 en ontwricht virus. Antilichamen uit cellijnen HIV gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV gpllO-5 en HIV gpllO-6 reageerden met ENV2 en peptide 29, alsmede met ontwricht virus.The results are shown in Table B. Monoclonal antibodies produced by HIV gpl10-1 and HIV gp 110-2 cell lines reacted with ENV3, ENV5, peptide 36 and disrupted virus. Antibodies from HIV gpl10-3, HIV-gpl10-4, HIV gpl10-5 and HIV gpl10-6 cell lines reacted with ENV2 and peptide 29, as well as with disrupted virus.

10 TABEL B10 TABLE B

ELISA's tonende de reactiviteit van monoclonale antilichamen met recombinant proteïne en synthetische peptiden.ELISAs showing the reactivity of monoclonal antibodies with recombinant protein and synthetic peptides.

Recombinant fusie-proteïne Synthetische peptide LAV CEMRecombinant Fusion Protein Synthetic Peptide LAV CEM

15 ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 29 36 39 controle controle 110-1 0,077 3,000 0,113 3,000 ND 2,421 0,054 0,908 0,125 110-2 0,003 3,000 0,000 3,000 ND 2,305 -0,005 1,214 0,009 110-3 3,000 0,011 ND ND 3,000 ND 0,017 0,363 0,046 20 110-4 3,000 0,020 ND ND 3,000 ND 0,016 0,383 0,067 110-5 3,000 0,014 ND ND 3,000 ND 0,016 0,368 0,025 110-6 3,000 0,033 ND ND 1,937 ND 0,017 0,486 0,03215 ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 29 36 39 control control 110-1 0.077 3,000 0.113 3,000 ND 2,421 0.054 0.908 0.125 110-2 0.003 3,000 0.000 3,000 ND 2,305 -0.005 1,214 0.009 110-3 3,000 0.011 ND N,000 3,000 ND 0.017 0.363 0.046 20 110- 4 3,000 0.020 ND ND 3,000 ND 0.016 0.383 0.067 110-5 3,000 0.014 ND ND 3,000 ND 0.016 0.368 0.025 110-6 3,000 0.033 ND 1,937 ND 0.017 0.486 0.032

De in tabel B vermelde resultaten toonden dat monoclonale antilichamen 25 110-1 en 110-2 een antigenisch determinant herkenden, gecodeerd door een DNA sequentie binnen het pENV3 gebied, meer in het bijzonder door het gebied van de HIV genomen, gedefinieerd door sequentie van aminozuren binnen peptide 36. Dat wil zeggen dat monoclonale antilichamen gpll0-l en 110-2 zich binden aan een peptidegebied van gpllO, gecodeerd binnen 30 pb7246 tot en met 7317, zoals blijkt uit de vorming van immuuncomplexen met peptide 36 en ENV3. Dit gebied van de HIV genomen is eerder geïdentificeerd als geconserveerd, dus weinig verandering heeft ondergaan in de DNA sequentie in het gebied, gecodeerd door peptide 36 onder verschil- 8701950The results reported in Table B showed that monoclonal antibodies 110-1 and 110-2 recognized an antigenic determinant encoded by a DNA sequence within the pENV3 region, more particularly, by the region of the HIV genome, defined by amino acid sequence within peptide 36. That is, monoclonal antibodies gpl10-1 and 110-2 bind to a peptide region of gpl10 coded within 30 pb7246 through 7317, as evidenced by the formation of immune complexes with peptide 36 and ENV3. This region of the HIV genome has been previously identified as conserved, so has undergone little change in the DNA sequence in the region encoded by peptide 36 under different 8701950

VV

-39- lende virale isolaten uit diverse geografische locaties. Zie Cell 46 (1986) 637. Daarentegen binden monoclonale antilichamen gpll0-3, -4, -5, -6 zich aan peptiden van HIV, gedefinieerd door het gebied gecodeerd door peptide 29 vanaf bp 6688 tot en met ongeveer bp 6750. Het gebied in 5 gpllO, gedefinieerd door peptide 29, is geïdentificeerd als bevattende verscheidene nucleotide substituties onder verschillende virale isolaten. Monoclonale antilichamen, die zich selectief binden aan gpllO polypeptiden, welke geconserveerde epitopen bevatten, zoals antilichamen 110-1 en 110-2, kunnen vergrote bruikbaarheid bezitten in een variëteit van omstandig-10 heden, zoals in affiniteitschromatografie, enz, In een ELISA toets reageerde het peptide 110-2-2 met sera van het individu, waaruit LAV-2 was geïsoleerd.-39- viral isolates from various geographical locations. See Cell 46 (1986) 637. In contrast, gp10-3, -4, -5, -6 monoclonal antibodies bind to HIV peptides, defined by the region encoded by peptide 29 from bp 6688 to approximately bp 6750. The region in 5 gpl10, defined by peptide 29, has been identified as containing several nucleotide substitutions among different viral isolates. Monoclonal antibodies, which selectively bind to gpl10 polypeptides containing conserved epitopes, such as antibodies 110-1 and 110-2, may have enhanced utility in a variety of conditions, such as in affinity chromatography, etc., responded in an ELISA test the peptide 110-2-2 with sera of the subject from which LAV-2 was isolated.

Indirecte immunofluorescentietoets.Indirect immunofluorescence test.

Er werden indirecte immunofluorescentietoetsen uitgevoerd 15 met monoclonale antilichamen, gericht tegen het gpllO antigen van HIV, op aceton-gefixeerde en levende cellen. Aceton-gefixeerde glaasjes, bereid uit met LAV-geïnfecteerde CEM cellen werden geïncubeerd met verdunde bovenstaande cultuurvloeistof of ascites vloeistof gedurende 1 uur bij 37°C, terwijl levende cellen werden geïncubeerd met bovenstaande cultuur-20 vloeistof of ascites vloeistof gedurende 1 uur bij 4°C, voordat de cellen werden aangebracht op glaasjes en met aceton gefixeerd. Bij beide methoden werd van een fluoresceïne isothiocyanaatlabel voorziene anti-muis igG gebruikt voor detectie van cellen, die het reactieve gpllO antigen droegen. Monoclonaal antilichaam HIV-gpllO-1 gaf positieve resultaten 25 met zowel levende als aceton-gefixeerde LAV geïnfecteerde cellen.Indirect immunofluorescence assays were performed with monoclonal antibodies directed against the gpl10 antigen of HIV on acetone-fixed and live cells. Acetone-fixed slides prepared from LAV-infected CEM cells were incubated with diluted culture supernatant or ascites liquid for 1 hour at 37 ° C, while living cells were incubated with culture supernatant or ascites liquid for 1 hour at 4 ° C C, before cells were plated and fixed with acetone. In both methods, a fluorescein isothiocyanate-labeled anti-mouse igG was used to detect cells carrying the reactive gpl10 antigen. Monoclonal antibody HIV-gpl10-1 gave positive results with both live and acetone-fixed LAV infected cells.

Voorbeeld IIExample II

Neutralisatie van HIV besmettelijkheid door anti-gpllO monoclonale antilichamen.Neutralization of HIV infectivity by anti-gpl10 monoclonal antibodies.

Dit voorbeeld beschrijft en karakteriseert de neutralisatie 30 van HIV besmettelijkheid met monoclonale antilichamen, die zich binden aan gpllO en peptiden binnen gpllO. De resultaten tonen dat monoclonale antilichamen gpll0-3, -4, -5 en -6 neutraliserende activiteit bezitten en dat gpll0-3 en -4 bijzonder hoge niveaus van neutraliserende activiteit bezitten.This example describes and characterizes the neutralization of HIV infectivity with monoclonal antibodies that bind to gpl10 and peptides within gpl10. The results show that monoclonal antibodies gpl10-3, -4, -5 and -6 have neutralizing activity and that gpl10-3 and -4 have particularly high levels of neutralizing activity.

,„ Neutralisatietoets., "Neutralization test.

35 -------35 -------

Een gevoelige neutralisatietoets werd ontwikkeld om het effect van de monoclonale antilichamen op HIV besmettelijkheid te kwantifi- b / ü 1 9 δ 0 -40- ceren. Een CD4+ cellijn met hoge vatbaarheid voor HIV infectie werd gekozen als doelwitcel voor besmettelijkheidsvergelijkingen. Ascites-vloei-stof/ bereid zoals beschreven in voorbeeld I, of de IgG fractie daarvan, gezuiverd onder toepassing van amoniumsulfaatprecipitatie, werd door 5 warmte gedesactiveerd gedurende 30 minuten bij 56°C, vervolgens verdund voorzover nodig in RPMI medium, dat 10% feutaal kalfsserum bevatte. Een suspensie van HIV stam LAV^^ werd geoogst uit ongeveer 4 dagen oude culturen van CEM in loggroeifase, gefiltreerd over 0,2 of 0,45 micro-meterfliters, in porties verdeeld en bevroren bij -70°C. Eén portie werd 10 ontdooid, getitreerd ter bepaling van de TCID^, en verdere toetsen werden uitgevoerd met vers ontdooide porties, verdund 1:500 in cultuurmedium tot een concentratie van ongeveer 10 maal de hoeveelheid, benodigd voor infectie van 50% CEM cellen in cultuur (10 TCID^q). De virussuspensie werd gemengd met een gelijk volume (250 microliter) van een monoclonale 15 antilichaambereiding van vijfvoudige verdunningen van 1:5 tot 1:9,765.625. Het mengsel van virus en antilichaam werd gedurende vijfenveertig minuten bij 37°C geïncubeerd, waarna duplicaatmonsters van 200 microliter werden gebruikt voor enting van putten, die 1,0 ml van ongeveer 2x10^ CEM cellen per put bevatten. De culturen werden gedurende veertien dagen 20 geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde, 5% CO^ bevattende atmosfeer. De cellen werden geoogst, gekorreld en gelyseerd met 1% Triton X-100 in PBS gedurende ongeveer 10 minuten. De hoeveelheid virus (of viraal antigen) aanwezig in gelyseerde cellen, werd kwantitatief bepaald door toepassing van een nader te beschrijven gevoelige HIV antigen vangst "sandwich" 25 enzymeimmunotoets. De titer van eventuele neutraliserende activiteit werd bepaald als de reciproke waarde van de verdunning van het monoclonale antilichaam, die de antigenproduktie van viruscontroleculturen, geïncubeerd zonder antilichaam of met een monoclonaal antilichaam van hetzelfde isotype, waarvan tevoren was getoond dat het geen neutralise-30 rende activiteit vertoonde voor meer dan 50% inhibiteerde. Voor de bovengenoemde HIV antigenische vangsttoets werden als vangstreagentia twee monoclonale antilichamen gebruikt, gericht tegen p25 antigenen. Deze hibridoom cellijnen werden gegenereerd volgens de hierboven beschreven methoden met ondergeschikte modificaties, waaronder het gebruik van een 35 gezuiverd gag recombinantfusie-proteïne als het immunogen, en karakterisering van de resulterende monoclonale antilichamen voor wat specifici- Ö / Ü 1 9 5 0 -41- teit en reactiviteit betreft, onder toepassing van recombinantfusie-pro-teïne, eerder aangeduid als GAG-1, GAG-2, en GAG-3 en het synthetische peptide 141. Proteïne GAG-1 wordt tot expressie bedraagt uitpGAG-1 (A.T.C.C.no.53379), GAG-2 wordt tot expressie gebracht uit pGAG-2 (A.T.A sensitive neutralization test was developed to quantify the effect of the monoclonal antibodies on HIV infectivity. A CD4 + cell line with high susceptibility to HIV infection was chosen as the target cell for infectious comparisons. Ascites liquid / prepared as described in Example I, or the IgG fraction thereof, purified by ammonium sulfate precipitation, was heat deactivated for 30 minutes at 56 ° C, then diluted as necessary in RPMI medium containing 10% fatal calf serum. A suspension of HIV strain LAV4 was harvested from approximately 4 days old cultures of log growth phase CEM, filtered through 0.2 or 0.45 micron flashes, aliquoted and frozen at -70 ° C. One aliquot was thawed, titrated to determine the TCID, and further assays were performed with freshly thawed aliquots diluted 1: 500 in culture medium to a concentration of about 10 times the amount required for infection of 50% CEM cells in culture (10 TCID ^ q). The virus suspension was mixed with an equal volume (250 microliters) of a monoclonal antibody preparation of 5-fold dilutions from 1: 5 to 1: 9,765,625. The virus and antibody mixture was incubated at 37 ° C for forty-five minutes, after which 200 microliter duplicate samples were used for inoculation of wells containing 1.0 ml of approximately 2x10 4 CEM cells per well. The cultures were incubated for 14 days at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2. The cells were harvested, granulated and lysed with 1% Triton X-100 in PBS for about 10 minutes. The amount of virus (or viral antigen) present in lysed cells was quantitated using a sensitive HIV antigen capture "sandwich" enzyme immunoassay to be further described. The titer of any neutralizing activity was determined as the reciprocal of the dilution of the monoclonal antibody, which incubated the antigen production of virus control cultures, without antibody or with a monoclonal antibody of the same isotype, previously shown to have no neutralizing activity. showed more than 50% inhibition. For the above HIV antigenic capture assay, two monoclonal antibodies directed against p25 antigens were used as capture reagents. These hibridoma cell lines were generated according to the methods described above with minor modifications, including the use of a purified gag recombinant fusion protein as the immunogen, and characterization of the resulting monoclonal antibodies for some specificity. and reactivity refers, using recombinant fusion protein, previously designated GAG-1, GAG-2, and GAG-3 and the synthetic peptide 141. Protein GAG-1 is expressed from pGAG-1 (ATCCno. 53379), GAG-2 is expressed from pGAG-2 (AT

5 C.C. nr. 53111) en GAG-3 wordt tot expressie gebracht uit pGAG-3 (A.T.C. C. nr. 53112). De productie van de recombinantfusie-proteïne is beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvragen 764.460 en 828.828. Synthetisch peptide 141 wordt gecodeerd door het LAV genomische gebied, overeen-5 C.C. No. 53111) and GAG-3 is expressed from pGAG-3 (A.T.C. C. No. 53112). The production of the recombinant fusion protein is described in U.S. patent applications 764,460 and 828,828. Synthetic peptide 141 is encoded by the LAV genomic region, corresponding

BRUBRU

komend met de aminozuurresten 198-242. Monoclonaal anitlichaam, geprodu-10 ceerd door hibridoomcellijnen p25-2 en p25-3 zijn reactief gebleken met recombinantfusie-proteïne GAG-1, GAG-2 en GAG-3 en het monoclonale anti-lichaam van p25-3 is tevens reactief met synthetisch peptide 141.coming with the amino acid residues 198-242. Monoclonal antibody produced by hibridoma cell lines p25-2 and p25-3 have been shown to be reactive with recombinant fusion protein GAG-1, GAG-2 and GAG-3, and the p25-3 monoclonal antibody is also reactive with synthetic peptide 141.

Ter uitvoering van de anitgenvangsttoets werden de vangstreagen-tia eerst geadsorbeerd aan een vaste drager. Ascitesvloeistoffen afkom-15 stig van hibrodoomcellijnen p25-2 en p25-3 werden 1:5000 verdund in 25mM Trisbuffer, pH 8,5, waarna 200 microliter in de putten van micro-putplaten werd gebracht. De putten werden gesloten en gedurende ongeveer 16 uur bij 4°C gelncubeerd. De oplossing werd door zuigen uit de putten verwijderd, voordat een blokkerende oplossing van 0,3% Blotto in PBS 20 werd toegevoegd. De blokkering werd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur uitgevoerd. De blokkerende oplossing werd door zuigen verwijderd en het monster werd toegevoegd. Aan elke put werden 200 microliter van de gelyseerde cellulaire suspensie en 5,0 ml detectieconjugaat, bereid zoals onderstaand beschreven, toegevoegd. De putstroken of vaten werden 25 2 uur bij 37°C gelncubeerd, waarna de suspensie werd weggezogen en de wanden viermaal werden gewassen met buffer (0,05% Tween 20 in PBS). Het detectieconjugaat werd als volgt bereid. Monoclonale antilichamen p25-6 en p25-7 werden geconjugeerd aan mierikswortelperoxydase (HRP) in een 3:1 molaire verhouding (AB:HRP) gedurende 3 uur onder toepassing van een 30 periodaat oxydatieprocedure (J. Histochem. Cytochem. 22 (1974) 1084). De conjugaten werden verdund 1:1500 in 2,5% (gew./vol) niet-vette droge melk, 0,01% thimerisal en 0,05% Antifoam A in 20 mM natriumcitraat. De rest van de ELISA procedure werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld I.To perform the anti-capture test, the capture reagents were first adsorbed on a solid support. Ascites fluids derived from hibrodome cell lines p25-2 and p25-3 were diluted 1: 5000 in 25mM Tris buffer, pH 8.5, after which 200 microliters were placed in the wells of microwell plates. The wells were closed and incubated at 4 ° C for about 16 hours. The solution was removed from the wells by suction before adding a blocking solution of 0.3% Blotto in PBS 20. Blocking was performed at room temperature for 15 minutes. The blocking solution was removed by suction and the sample was added. 200 microliters of the lysed cellular suspension and 5.0 ml of detection conjugate prepared as described below were added to each well. The well strips or vessels were incubated for 2 hours at 37 ° C, after which the suspension was aspirated and the walls washed four times with buffer (0.05% Tween 20 in PBS). The detection conjugate was prepared as follows. Monoclonal antibodies p25-6 and p25-7 were conjugated to horseradish peroxidase (HRP) in a 3: 1 molar ratio (AB: HRP) for 3 hours using a periodic oxidation procedure (J. Histochem. Cytochem. 22 (1974) 1084 ). The conjugates were diluted 1: 1500 in 2.5% (w / v) non-fat dry milk, 0.01% thimerisal and 0.05% Antifoam A in 20 mM sodium citrate. The rest of the ELISA procedure was performed as described in Example I.

35 De resultaten van de toets op neutraliserende activiteit met antilichamen gpll0-3, -4, -5 en -6 zijn als volgt: de hoogste titers, 8701950 -42- die neutraliserende aktiviteit behielden bleken te zijn: gpll0-3=15.625; gpll0-4=9.765.625; gpll0-5=125; en gpll0-6=625.The results of the neutralization activity test with antibodies gpl10-3, -4, -5 and -6 are as follows: the highest titers, 8701950 -42-, which retained neutralizing activity were found to be: gpl10-3 = 15,625; gpl10-4 = 9,765,625; gpl10-5 = 125; and gpl10-6 = 625.

In verband met de voorspelde genetische variabiliteit gedefinieerd door peptide 29, werd het vermogen van monoclonaal antilichaam 5 gpllO-4 om andere isolaten van HIV te herkennen, onderzocht. De immuno-fluorescentietoetsen worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven.Antilichaam gpllO-4 detecteerde antigen in culturen van ten minste 3 van 16 beproefde HIV isolaten.In connection with the predicted genetic variability defined by peptide 29, the ability of monoclonal antibody 5 gpl10-4 to recognize other HIV isolates was investigated. The immunofluorescence assays are performed as described above. Antibody gpl10-4 detected antigen in cultures of at least 3 of 16 tested HIV isolates.

Antilichaam gpllO-4 was in staat tot neutralisatie van virus-10 sen, in de loop van vijftien weken geïsoleerd uit een chimpansee, die als controledier bij een beproeving van een AIDS vaccin met LAV was geënt. Het monoclonale antilichaam was in staat tot neutralisatie van de isolaten, hoewel het dier serum antilichamen had, die HIV in vitro neutraliseerden, en een meetbare, door cellen tot stand gebracht immuun-15 reactie tegen de HIV infectie had ontwikkeld. Dit duidt op een gebrek aan antigenische neiging in vivo voor het epitoop herkend door het gpllO-4 antilichaam.Antibody gpl10-4 was capable of neutralizing virus-10 isolated over a 15 week period from a chimpanzee inoculated as a control animal in an AIDS vaccine test with LAV. The monoclonal antibody was able to neutralize the isolates, although the animal had serum antibodies, which neutralized HIV in vitro, and had developed a measurable cell-mediated immune response against the HIV infection. This indicates a lack of antigenic tendency in vivo for the epitope recognized by the gpl10-4 antibody.

Voorbeeld IIIExample III

Neutralisatie van HIV besmettelijkheid door een coctail van anti-gpllO 20 en anti-p25 monoclonale antilichamen.Neutralization of HIV infectivity by a cocktail of anti-gpl10 20 and anti-p25 monoclonal antibodies.

Dit voorbeeld beschrijft de neutralisatie van HIV besmettelijkheid met behulp van monoclonale antilichamen, die zich binden aan gpllO en peptiden binnen gpllO in combinatie met monoclonale antilichamen, die zich binden aan p25 en peptiden binnen p25, die op zichzelf 25 weinig of geen neutraliserende activiteit vertonen. Deze resultaten tonen dat monoclonaal antilichaam gpllO-2 in combinatie met p25-6 of p25-7 bijzonder hoge niveaus van neutraliserende activiteit vertoont.This example describes the neutralization of HIV infectivity using monoclonal antibodies that bind to gpl10 and peptides within gpl10 in combination with monoclonal antibodies that bind to p25 and peptides within p25, which in themselves show little or no neutralizing activity. These results show that monoclonal antibody gpl10-2 in combination with p25-6 or p25-7 exhibits particularly high levels of neutralizing activity.

Hibridoomcellijnen p25-6 en p25-7 werdén gegenereerd volgens de hierboven beschreven methoden met modificaties, omvattende het ge-30 bruik van gedesactiveerd ontwricht virus of gezuiverd gag recombinant-fusieproteïne, tot expressie gebracht in E. coli als het immunogen, de resulterende monoclonale antilichamen karakteriserend wat specificiteit en reactiviteit betreft onder toepassing van de recombinant-fusieproteïne, eerder aangeduid als GAG-1, GAG-2 en GAG-3, en de syn-35 thetischepeptiden 15, 88, 150, 147 en 148. De synthetische peptiden 8 7 0 1 Si0 -43- « zijn gecodeerd door het LAV genomische gebied, als volgt overeen-komen met aminozuurresten: peptide 15, aminozuurresten 329 tot en met 350; peptide 88, aminozuurresten 315 tot en met 355; peptide 150, aminozuurresten 318 tot en met 363; peptide 147, aminozuurresten 278 5 tot en met 319; en peptide 148, aminozuurresten 290 tot en met 319. Monoclonale antilichamen, geproduceerd door hibridoomcellijnen p25-6 en p25-7 zijn reactief met het recombinantfusie-proteïne GAG-3, p25-6 is reactief met synthetische peptiden 147 en 148, en p25-7 is reactief met synthetische peptiden 15, 88 en 150.Hibridoma cell lines p25-6 and p25-7 were generated according to the above-described methods with modifications, comprising using deactivated disrupted virus or purified gag recombinant fusion protein expressed in E. coli as the immunogen, the resulting monoclonal antibodies. characterizing in terms of specificity and reactivity using the recombinant fusion protein, previously designated GAG-1, GAG-2 and GAG-3, and the synthetic peptides 15, 88, 150, 147 and 148. The synthetic peptides 0 1 SiO -43- «are encoded by the LAV genomic region, corresponding to amino acid residues as follows: peptide 15, amino acid residues 329 to 350; peptide 88, amino acid residues 315 to 355; peptide 150, amino acid residues 318 to 363; peptide 147, amino acid residues 278 to 319; and peptide 148, amino acid residues 290 to 319. Monoclonal antibodies, produced by hibridoma cell lines p25-6 and p25-7 are reactive with the recombinant fusion protein GAG-3, p25-6 is reactive with synthetic peptides 147 and 148, and p25- 7 is reactive with synthetic peptides 15, 88 and 150.

10 Neutralisatietoetsen werden uitgevoerd als boven beschreven, behalve dat bij gebruik van coctails individuele monoclonale antilichamen eerst 1:5 werden verdund in cultuurmedium en vervolgens in gelijke verhoudingen werden gemengd onder vorming van een uiteindelijke verdunning van 1:10. De rest van de toets werd uitgevoerd als boven be-15 schreven.Neutralization assays were performed as described above, except that using coctails, individual monoclonal antibodies were first diluted 1: 5 in culture medium and then mixed in equal proportions to give a final dilution of 1:10. The rest of the test was performed as described above.

Monoclonale antilichamen gpllO-2, p25-6 en p25-7 vertonen, indien op zichzelf gebruikt, minder dan 50% neutraliserende activiteit. Bij gebruik in een coctail, die monoclonale antilichamen gp-110-2 met p25-6 of gpllO-2 met p25-7 in een verdunning van 1:10 bevatte, 20 was er totale neutralisatie. Een coctail, die de monoclonale antilichamen p25-6 in combinatie met p25-7 bevatte, gaf een neutraliserings-activiteit van 60-90% .Monoclonal antibodies gpl10-2, p25-6 and p25-7, when used alone, exhibit less than 50% neutralizing activity. When used in a cocktail containing monoclonal antibodies gp-110-2 with p25-6 or gpl10-2 with p25-7 at a dilution of 1:10, there was total neutralization. A cocktail containing the monoclonal antibodies p25-6 in combination with p25-7 gave a neutralization activity of 60-90%.

87 0 1 9ï> 0 _ 44 _87 0 1 9ï> 0 _ 44 _

Voorbeeld XVExample XV

Immunopotentie van peptide 29 en homologaImmunopotency of peptide 29 and homologs

Het vermogen van peptide 29 en homologe peptiden met inbegrip van peptide 177, om een immuunrespons tegen HIV te stimuleren, werd in twee 5 muizenstammen onderzocht. De procedures voor de bereiding van de peptide immunogenen, immunisatieprotocols en voor de karakterisering van de opgewekte immuunrespons worden onderstaand in detail beschreven.The ability of peptide 29 and homologous peptides, including peptide 177, to stimulate an immune response against HIV was investigated in two mouse strains. The procedures for the preparation of the peptide immunogens, immunization protocols and for the characterization of the evoked immune response are described in detail below.

Peptide 29 werd voor immunisatie gereedgemaakt door conjugatie met een gezuiverd thyroglobuline. Van thyroglobuline kunnen derivaten 10 worden gemaakt van N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) voor conjugatie volgens de in het Amerikaanse octrooischrift 4.629.783, kolom 10, regels 28-51 beschreven procedure.Peptide 29 was prepared for immunization by conjugation with a purified thyroglobulin. Thyroglobulin can be made derivatives of N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) for conjugation according to the procedure described in U.S. Patent 4,629,783, column 10, lines 28-51.

Als een tweede immunogeen, werd op de volgende wijze met glutaar-aldehyde een thyroglobulinederivaat bereid. Varkensthyroglobuline 15 (27 mg) werd opgelost in 1 ml 0,1 M natriumbicarbonaat, waaraan 8,3 ul van een 25%-ige glutaaraldehydeoplossing druppelsgewijze werd toegevoegd, en het mengsel werd gedurende een nacht bij kamertemperatuur geroerd. Aan de oplossing werd 1 ml natriumcarbonaat/bicarbonaat-buffer met een pH van 9,3 toegevoegd en daarna volgde gedurende 8 uur 20 een dialyse tegen 2 liter van dezelfde buffer bij 4°C met een volledige vervanging van dialysaat na 4 uur. Peptide 29 wordt daarna toegevoegd aan het verkregen thyroglobuline derivaat in een overmaat van ongeveer 100 molair en werd het mengsel gedurende een nacht bij kamertemperatuur geroerd. Glutaaraldehyde dat niet gereageerd had, 25 werd geblokkeerd met 200 ul van 0,2 M lysineoplossing, en het mengsel werd gedurende verscheidene uren (of gedurende een nacht) bij kamertemperatuur geroerd. Het peptide-thyroglobuline conjugaat werd daarna aan een uitgebreide dialyse tegen PBS bij 4°C onderworpen.As a second immunogen, a thyroglobulin derivative was prepared in the following manner with glutaraldehyde. Pig thyroglobulin 15 (27 mg) was dissolved in 1 ml of 0.1 M sodium bicarbonate, to which 8.3 µl of a 25% glutaraldehyde solution was added dropwise, and the mixture was stirred overnight at room temperature. To the solution was added 1 ml of sodium carbonate / bicarbonate buffer with a pH of 9.3 and then dialysis for 2 hours against 2 liters of the same buffer at 4 ° C with complete replacement of dialysate after 4 hours. Peptide 29 is then added to the obtained thyroglobulin derivative in an excess of about 100 molar and the mixture was stirred at room temperature overnight. Unreacted glutaraldehyde was blocked with 200 µl of 0.2 M lysine solution, and the mixture was stirred at room temperature for several hours (or overnight). The peptide-thyroglobulin conjugate was then subjected to extensive dialysis against PBS at 4 ° C.

Twee muizenstammen (C57 zwart en BALB/c) werden inge-30 ent met peptiden die met elke conjugatiemethode waren bereid.Two strains of mice (C57 black and BALB / c) were inoculated with peptides prepared by any conjugation method.

Alle dieren waren op het moment van inenting ongeveer 2-4 weken oud.All animals were approximately 2-4 weeks old at the time of vaccination.

De inentingswegen omvatten de voetzool, insnijden van de staart, subcutaan, intranasaal, of intraperitoneaal. Het inoculum bestond uit 25 ug geconjugeerd peptide, gesuspendeerd in 0,5 ml van compleet Freund 's 35 adjuvant, waarbij na de weken 2,3 en 5 versterkingsinentingen werden 8701950 - 45 - herhaald met hetzelfde immunogeen gesuspendeerd in incompleet Freund's adjuvans. Serummonster van individuele muizen werden verzameld voorafgaande aan de immunisatie, 4 dagen na de versterkings-immunisatie die na 3 weken plaatsvond, en 4 dagen na de laatste 5 versterking die na 5 weken werd uitgevoerd. De serummonsters werden geanalyseerd op antilichamen tegen homologe peptiden of volledig virus door ELISA's onderzoek. De sera die antilichaamactiviteit tegen LAV demonstreerden, werden verder onderzocht op neutraliserende activiteit, gevolgd door analyse van de sera in immunoblots tegen verbroken 1AV antigeen en radioimmunoprecipitatie analyses met radio-labeled gpllO.The vaccination routes include the sole of the foot, incision of the tail, subcutaneously, intranasally, or intraperitoneally. The inoculum consisted of 25 µg of conjugated peptide suspended in 0.5 ml of complete Freund's 35 adjuvant, with reinforcement vaccinations after weeks 2,3 and 5 8701950-45 repeated with the same immunogen in incomplete Freund's adjuvant. Serum samples from individual mice were collected before immunization, 4 days after the boost immunization that occurred after 3 weeks, and 4 days after the last boost that was performed after 5 weeks. The serum samples were analyzed for antibodies to homologous peptides or whole virus by ELISA's test. The sera that demonstrated antibody activity against LAV were further examined for neutralizing activity, followed by analysis of the sera in immunoblots against disrupted 1AV antigen and radioimmunoprecipitation analyzes with radio-labeled gpl10.

De immunisatieresultaten lieten zien dat muizen die met peptide 29 waren geïmmuniseerd, antilichamen ontwikkelden die reactief waren met peptide 29 en verbroken LAV-1 virus in ELISA's onderzoeken.The immunization results showed that mice immunized with peptide 29 developed antibodies reactive with peptide 29 and tested LAV-1 virus in ELISAs.

Conjugatie van peptide 29 via glutaaraldehyde riep in het algemeen een hoog antilichamentiter tegen peptide 29 op in Balb/c muizen, hoewel conjugatie via maleïmide succes had in het oproepen van anti-peptide 29 antilichamen in enkele Balb/c muizen. Muizen die geïmmuniseerd waren met peptide 177 ontwikkelden antilichamen tegen het peptide, en conju-20 gatie van peptide 177 via glutaaraldehyde was beter wat betreft het oproepen van een immunologisch respons. C57 muizen gaven meer respons op immuunstïmulatie met peptide 177 dan Balb/c muizen. Muizen die geïmmuniseerd waren met het LAV-2 peptide 110-2-2 ontwikkelden antilichamen tegen 110-2-2 en LAV-2 virus zoals door ELISA's onderzoeken 25 werd aangetoond. Peptide 110-2-2 dat via glutaaraldehyde was geconjugeerd was zowel in C57 als in Balb/c muizen immunogeen, hoewel titers tegen het 110-2-2 peptide in het algemeen hoger waren in Balb/c muizen dan in C57 muizen, terwijl titers tegen LAV-2 virus in het algemeen hoger waren in C57 muizen dan Balb/c muizen.Conjugation of peptide 29 via glutaraldehyde generally evoked a high antibody titer against peptide 29 in Balb / c mice, although conjugation via maleimide was successful in raising anti-peptide 29 antibodies in some Balb / c mice. Mice immunized with peptide 177 developed antibodies to the peptide, and conjugation of peptide 177 via glutaraldehyde was better in evoking an immunological response. C57 mice responded more to immune stimulation with peptide 177 than Balb / c mice. Mice immunized with the LAV-2 peptide 110-2-2 developed antibodies against 110-2-2 and LAV-2 virus as demonstrated by ELISA's studies. Peptide 110-2-2 conjugated via glutaraldehyde was immunogenic in both C57 and Balb / c mice, although titers against the 110-2-2 peptide were generally higher in Balb / c mice than in C57 mice, while titers against LAV-2 virus were generally higher in C57 mice than Balb / c mice.

30 In het algemeen geven serummonsters van geïmmuniseerde muizen die (i) antilichamen tegen volledig virus laten zien; (ii) in staat zijn om HIV te neutraliseren, zoals in de in Voorbeeld II beschreven proeven, en (iii) reactief zijn ten opzichte van peptide 29 in ELISA's onderzoeken, cumulatief aanwijzen voor de doeltreffendheid van het gebruik 35 van peptide 29 in een vaccin preparaat.Generally, serum samples from immunized mice showing (i) antibodies against complete virus; (ii) being able to neutralize HIV, as in the experiments described in Example II, and (iii) being reactive to peptide 29 in ELISA studies, cumulatively indicating the effectiveness of the use of peptide 29 in a vaccine preparation.

b i ü \ 9 5 C' 46 -b i ü \ 9 5 C '46 -

Aa

Voorbeeld VExample V

Immunoaffiniteit-scheiding van gpllO onder toepassing van monoclonaal antilichaamImmunoaffinity separation of gpl10 using monoclonal antibody

Monoclonale antilichamen voor het gpllO antigen van HIV 5 leunnen worden toegepast in immunoaffiniteitscheidingsprocedures om bacterieel tot expressie gebrachte recombinant fusieproteïnen nagenoeg te zuiveren. Indien het tot expressie gebrachte proteine wordt afgescheiden door de bacteriën, kan het proteïne uit de bovenstaande cultuur-vloeistof worden geïsoleerd; indien het proteine niet is afgescheiden, 10 kan ontwrichting van de bacteriele cellen noodzakelijk zijn.Monoclonal antibodies to the gpl10 antigen of HIV 5 leans are used in immunoaffinity separation procedures to substantially purify bacterially expressed recombinant fusion proteins. If the expressed protein is secreted by the bacteria, the protein can be isolated from the supernatant culture fluid; if the protein is not secreted, disruption of the bacterial cells may be necessary.

Constructie van plasmide pENV-5 (A.T.C.C. No. 53074) is beschreven in de Amerikaanse octrooiaanvrage 721.237. Plasmide pENV-5 codeert een overwegend gedeelte van het carboxyluiteinde van gpllO en een gedeelte van het amino-uiteinde van gp41 van LAV, ingelast in de 15 trp-expressievector♦ E. coli C600, getransformeerd door deze vector, brengt het gpllO fusieproteine tot expressie, maar scheidt het niet af.Construction of plasmid pENV-5 (A.T.C.C. No. 53074) is described in U.S. Patent Application 721,237. Plasmid pENV-5 encodes a major portion of the carboxyl terminus of gpl10 and a portion of the amino terminus of gp41 of LAV inserted into the trp expression vector ♦ E. coli C600 transformed by this vector expresses the gpl10 fusion protein but does not separate it.

E. coli C600, die het plasmide pENV-5 bevatten, worden overnacht bij 37°C met beluchting gekweekt in een medium, dat tryptofan (20 ]ig/ml) en ampicilline (100 jig/ml) bevat.De overnacht verkregen 20 culturen worden dan geënt bij 1:100 in vers minimaal medium, dat ampicilline (100 jig/ml) maar geen tryptofan bevat. Deze culturen worden bij 37°C onder beluchting gekweekt gedurende 2-3 uren (tot de vroege logfase). Het inductiemiddel, 3-B-indool-acrylzuur (Sigma Chemical Co.,E. coli C600 containing the plasmid pENV-5 are cultured overnight at 37 ° C in a medium containing tryptophan (20 µg / ml) and ampicillin (100 µg / ml). 20 cultures obtained overnight are then seeded at 1: 100 in fresh minimal medium containing ampicillin (100 µg / ml) but no tryptophan. These cultures are grown under aeration at 37 ° C for 2-3 hours (until the early log phase). The inducer, 3-B-indole acrylic acid (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO), wordt tot een uiteindelijke concentratie van 20 jig/ml 25 toegevoegd uit een vers bereide voorraadoplossing van 20 mg/rnl in 95%'s ethanol. Geïnduceerde culturen worden onder beluchting bij 37°C gegroeid gedurende 4-5 uur en vervolgens gekorreld en desgewenst bevroren*St. Louis, MO), is added to a final concentration of 20 µg / ml from a freshly prepared stock solution of 20 mg / ml in 95% ethanol. Induced cultures are grown under aeration at 37 ° C for 4-5 hours and then granulated and frozen if desired *

De proteineopbrengsten uit pENV-5 zijn typisch minder dan 1 mg/1.The protein yields from pENV-5 are typically less than 1 mg / l.

De gekorrelde bacteriele cellen worden gelyseerd onder toepas-30 sing van P-RIPA buffer (PBS, bevattende 1% Triton X-100, 1% deoxy- cholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat en 1% Aprotinin), dat E.coli cellen lyseert. De suspensie kan worden blootgesteld aan supersone trillingen ter afschuiving van DNA en RNA, gevolgd door centrifugeren ter verwijdering van deeltjesvormig materiaal. Er kan dan een verdunning of con-35 centratie nodig zijn om de proteineconcentratie te standaardiseren.The granulated bacterial cells are lysed using P-RIPA buffer (PBS containing 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate and 1% Aprotinin) which lyses E.coli cells . The suspension can be exposed to supersonic vibrations to shear DNA and RNA, followed by centrifugation to remove particulate matter. A dilution or concentration may then be required to standardize the protein concentration.

Monoclonaal antilichaam HIV-gpllO-1 wordt eerst geprecipiteerd 8701950 -47- uit ascites vloeistof of bovenstaande celculturevloeistof bij kamertemperatuur of in de koude met ammoniumsulfaat of natriumsulfaatoplossin-gen, gebufferd op een pH 7,3 ,tot een uiteindelijke verzadiging van respectievelijk 33% of 18%. Geprecipiteerde proteïnen worden verwijderd 5 door centrifugeren en opnieuw opgelost in PBS, en dan een tweede maal geprecipiteerd met 33% ammoniumsulfaat of 12-15% natriumsulfaat. Deze behandeling kan indien nodig worden herhaald. Het korrelvormige materiaal wordt nogmaals opgelost in PBS en de overmaat· zouten wordt verwijderd door gelfiltratie via een ontzoutingsmatrix of door uit-10 puttende dialyse tegen PBS.Monoclonal antibody HIV-gpl10-1 is first precipitated from ascites fluid or supernatant cell culture fluid at room temperature or in the cold with ammonium sulfate or sodium sulfate solutions buffered at pH 7.3 to a final saturation of 33% or 18%. Precipitated proteins are removed by centrifugation and redissolved in PBS, then precipitated a second time with 33% ammonium sulfate or 12-15% sodium sulfate. This treatment can be repeated if necessary. The granular material is redissolved in PBS and the excess salts are removed by gel filtration via a desalting matrix or by exhaustive dialysis against PBS.

Gezuiverd 110-1 monoclonaal antilichaam kan dan worden gekoppeld aan het met cyanogeen bromide geactiveerde Sepharose. De be- -3 nodigde hoeveelheid gel wordt tot zwelling gebracht in 10 M HC1-oplossing op een glazen filter (1 g gevriesdroogd materiaal levert 15 een uiteindelijk gelvolume van ongeveer 3,5 ml) en gedurende 15 minuten met dezelfde oplossing gewassen, onmiddellijk daarna het antilichaam wordt toegevoegd. In het algemeen verloopt de koppelingsreactie het doelmatigst in een pH-traject van 8-10, maar indien nodig voor anti-lichaamstabiliteit kan ook een lagere pH worden toegepast. Het anti-20 lichaam is liefst opgelost in PBS of een carbonaat/bicarbonaat- of boraatbuffer met hoge ionsterkte met 150 mM NaCl. De suspensie van het geactiveerde Sepharose en antilichaam wordt 2-4 uren bij kamertemperatuur of overnacht bij 4°C zacht geroerd en vervolgens gewassen met een 25 koppelingsbuffer op een grof fritglasfilter. Eventueel resterende actieve groepen worden geblokkeerd door behandeling gedurende 2 uur met 1,0 M ethanolamine bij pH 8. Het uiteindelijke antilichaam-Sepharose produkt wordt vervolgens beurtelings 4-of 5 maal gewassen met buffer-oplossingen met hoge en lage pH (respectievelijk boraatbuffer, 30 0,1M, pH 8,5, 1M NaCl en acetaatbuffer, 0,1M, pH 4,0, 1 M NaCl).Purified 110-1 monoclonal antibody can then be coupled to the cyharogen bromide activated Sepharose. The required amount of gel is swelled in 10 M HCl solution on a glass filter (1 g of lyophilized material provides a final gel volume of about 3.5 ml) and washed with the same solution for 15 minutes, immediately after the antibody is added. Generally, the coupling reaction proceeds most efficiently in a pH range of 8-10, but a lower pH may also be used if necessary for antibody stability. The anti-20 body is most preferably dissolved in PBS or a high ionic strength carbonate / bicarbonate or borate buffer with 150 mM NaCl. The suspension of the activated Sepharose and antibody is gently stirred for 2-4 hours at room temperature or overnight at 4 ° C and then washed with a coupling buffer on a coarse frit glass filter. Any remaining active groups are blocked by treatment with 1.0 M ethanolamine at pH 8 for 2 hours. The final antibody Sepharose product is then washed alternately 4 or 5 times with high and low pH buffer solutions (borate buffer, respectively). 0.1M, pH 8.5, 1M NaCl and acetate buffer, 0.1M, pH 4.0, 1M NaCl).

Door dit wassen worden sporen van niet-covalent geadsorbeerde materialen verwijderd. De gerede immmunoaffiniteitscheiding matrix wordt bij temperaturen beneden 8°C bewaard in tegenwoordigheid van een geschikt bacteristatisch middel, zoals 0,01% azide.Traces of non-covalently adsorbed materials are removed by this washing. The finished immunoaffinity separation matrix is stored at temperatures below 8 ° C in the presence of a suitable bacteristatic agent, such as 0.01% azide.

35 De toevoeging van de suspensie van het tot expressie gebrachte 8701950 * -48- proteine aan de immunoaffiniteitscheidingmatrix resulteert in de selectieve verwijdering van het gpllO antigen. Men laat het mengsel 2-24 uur, bij voorkeur 12-18 uur, onder langzaam roeren of schudden reageren.Ook kan een kolom worden gebruikt, waarin de immunoaffiniteit -5 matrix wordt gegoten en tot evenwicht gebracht, waarna de suspensie van het tot expressie gebrachte proteïne langzaam aan de kolom wordt toegevoegd. Nadat de proteinesuspensie is toegevoegd wordt de stroom tot stilstand gebracht teneinde maximale immuuncomplexvorming mogelijk te maken.The addition of the suspension of the expressed 8701950 * -48 protein to the immunoaffinity separation matrix results in the selective removal of the gpl10 antigen. The mixture is allowed to react for 2 to 24 hours, preferably 12 to 18 hours, with slow stirring or shaking. A column may also be used into which the immunoaffinity -5 matrix is poured and equilibrated, after which the suspension of the protein is slowly added to the column. After the protein suspension is added, the flow is stopped to allow maximum immune complex formation.

10 Ongebonden materiaal wordt uitgewassen of afgescheiden door uitvoerig wassen met adsorptiebuffer. Men kan een grof fritglasfilter met vacuum gebruiken of doorstroming door de kolom. Vervolgens wordt het materiaal geêlueerd met buffers met lage of hoge pH (acetaatbuffer, pH 4,0, of boraatbuffer, pH 8,56) of een chaotroop middel.Unbound material is washed or separated by extensive washing with adsorption buffer. A coarse frit glass filter with vacuum or flow through the column can be used. The material is then eluted with low or high pH buffers (acetate buffer, pH 4.0, or borate buffer, pH 8.56) or a chaotropic agent.

15 Voorbeeld VIExample VI

Immunoaffiniteitszuivering van recombinant gpllO uit een zoogdierexpressiesysteemImmunoaffinity purification of recombinant gpl10 from a mammalian expression system

De monoclonale antilichamen volgens de uitvinding vinden toepassing in de immunoaffiniteitszuivering van recombinantfusie gpllO, 20 tot expressie gebracht door zoogdiercellen. Zoogdiercellen worden geïnfecteerd met recombinant vaccins (J. Virol 49 (1984)857), die sequenties bevatten , welke ten minste het gedeelte van gpllO coderen, dat antigenisch is en neutraliserende antilichamen opwekt.The monoclonal antibodies of the invention find use in the immunoaffinity purification of recombinant fusion gpl10 expressed by mammalian cells. Mammalian cells are infected with recombinant vaccines (J. Virol 49 (1984) 857) containing sequences encoding at least the portion of gpl10 which is antigenic and elicits neutralizing antibodies.

Het recombinant vaccin wordt geconstrueerd op de in de Ameri-25 kaanse octrooiaanvrage 842.984 beschreven wijze. Sequenties, coderend voor het omhullend glycoproteine van HIV, worden ingelast in een plas-mide vector (pGS20), benedenstrooms, van een transcriptioneel controle-element. Dit chimerische gen wordt geflankeerd door sequenties, die het virale thymidine kinase (TK) gen coderen.The recombinant vaccine is constructed in the manner described in U.S. Patent Application No. 842,984. Sequences encoding the envelope glycoprotein of HIV are inserted into a plasmid vector (pGS20) downstream of a transcriptional control element. This chimeric gene is flanked by sequences encoding the viral thymidine kinase (TK) gene.

30 Chimerische plasmide vectors, die vaccin virus promotor ge- ligateerd aan het LAV omhulling gen bevatten, worden gebruikt voor de transformering van E. coli stam MC1000. Inlassing van dit chimerische LAV-env sequenties in het vaccin virus genome geschiedde door in vivo recombinatie, mogelijk gemaakt door het feit dat de chimerische 35 genen in plasmiden pv-env5 worden geflankeerd door vaccin virus sequenties die voor het TK-gen coderen. Dit plasmide was dan ingevoerd in tevoren door wild-type vaccin virus geïnfecteerde cellen, waarna men recombinatie o i 0 1 8 0 -49- laat optreden tussen de TK sequenties op het plasmide en de homologe sequenties in het vaccin virale genome, onder inlassing van het chimere gen. African Green Monkey niercellen (stam BSC-40, een lijn afgeleid van BSC-1 cellen, ATCC no. CCL26) worden als gastheer in het expressie-5 systeem gebruikt.Chimeric plasmid vectors containing vaccine virus promoter ligated to the LAV envelope gene are used for the transformation of E. coli strain MC1000. Insertion of this chimeric LAV env sequences into the vaccine virus genome was done by in vivo recombination, enabled by the fact that the chimeric genes in plasmids pv-env5 are flanked by vaccine virus sequences encoding the TK gene. This plasmid was then introduced into cells previously infected by wild-type vaccine virus and recombination between the TK sequences on the plasmid and the homologous sequences in the vaccine viral genome is allowed to occur, inserting the chimeric gene. African Green Monkey kidney cells (strain BSC-40, a line derived from BSC-1 cells, ATCC no. CCL26) are used as hosts in the expression 5 system.

Confluerende BSC-40 cellen worden geïnfecteerd door recombinant vaccin virus in een infectieveelvoud van 10. Men laat de infectie gedurende 12 uur voortschrijden, waarna de cellen worden geoogst, eenmaal gewassen met PBS en door centrifugeren verzameld. De celkorrels worden 10 opnieuw gesuspendeerd in lysebuffer (1,0% NP 40, 2,5% natrium deoxy-cholaat, 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA), waarna het lysaat door centriiugeren wordt geklaard. Immunoaffiniteitsscheiding van het tot expressie gebrachte recombinant fusieproteine geschiedt zoals bovenbeschreven voor het bacteriele expressiesysteem, onder toe-15 passing van het monoclonale antilichaam gpllO-l. De door dit expressiesysteem geproduceerde proteïnen geli jken sterker op natuurlijk geproduceerde HIV gpllO door de verwerking en de door de zoogdiercellen verschafte glycosilering.Confluent BSC-40 cells are infected by recombinant vaccine virus in an infection multiple of 10. The infection is allowed to progress for 12 hours, after which the cells are harvested, washed once with PBS and collected by centrifugation. The cell pellets are resuspended in lysis buffer (1.0% NP 40, 2.5% sodium deoxycholate, 0.1 M NaCl, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA), after which the lysate is clarified by centrifugation. Immunoaffinity separation of the expressed recombinant fusion protein is as described above for the bacterial expression system, using the monoclonal antibody gpl10-1. The proteins produced by this expression system more closely resemble naturally produced HIV gpl10 through processing and glycosylation provided by the mammalian cells.

Voorbeeld VIIExample VII

20 Inhibitering van HIV infectie met blokkerende peptiden20 Inhibition of HIV infection with blocking peptides

De doelmatigheid van blokkerende peptiden voor het inhibiteren van de infectie van weefselcultuurcellen door de stam van HIVThe effectiveness of blocking peptides in inhibiting the infection of tissue culture cells by the strain of HIV

werd bestudeerd onder toepassing van een modificatie van het protocol voor peptide T evaluering, gepubliceerd in Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 25 (1986) 9254-9258. De bij voorkeur toe te passen HIV inhibiteringstoets omvat het combineren van gelijke volumes blokkerend peptide en CEM cellen (2,5x10^) in het medium (RPMI, 10% FCS en 2 mg/ml polybreen) en incubatie gedurende 45 minuten bij 37°C. Vervolgens wordt het virus toegevoegd in diverse doses (10,50,500 TCID 50), waarna het mengsel gedurende 14 da-30 gen bij 37°C wordt geïncubeerd en vervolgens de bovenstaande vloeistof wordt getoetst op virus antigen (b.v. p25 kern ) produktie.was studied using a modification of the protocol for peptide T evaluation published in Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 (1986) 9254-9258. The preferred HIV inhibition assay comprises combining equal volumes of blocking peptide and CEM cells (2.5x10 ^) in the medium (RPMI, 10% FCS and 2 mg / ml polybrene) and incubation at 37 ° C for 45 minutes. . The virus is then added in various doses (10,50,500 TCID 50), the mixture is incubated at 37 ° C for 14 days and then the supernatant is assayed for virus antigen (e.g., p25 core) production.

Voorincubatie van CEM cellen met de peptiden voor de toevoeging van het virus aan de Cultures versterkt het inhibiterende effect bij de toetsen. De inhibitering bleek afhankelijk te zijn van de virusdosis, 35 waarbij sterke activiteit werd vertoond bij lage en heliumdoses, maar weinig effect bij de hoogste virus doses.Preincubation of CEM cells with the peptides for addition of the virus to the Cultures enhances the inhibitory effect in the assays. The inhibition appeared to be dependent on the virus dose, showing strong activity at low and helium doses, but little effect at the highest virus doses.

8701950 ƒ 5 -50-8701950 ƒ 5 -50-

Ongeveer 60% tot 90% inhibitering van virus antigen produktie bij de proeven met lage virusdosis werd bereikt met Peptide T.About 60% to 90% inhibition of virus antigen production in the low virus dose experiments was achieved with Peptide T.

Verdere proeven met peptiden X-XV, typisch met geamideerde eindstandige carboxylgroep en geacetyleerde eindstandige aminogroep, produceerden 5 soortgelijke resultaten, waarbij peptide XI bijzonder effectief was over een breed dosistraject. Neutraliserende antilichamen kunnen worden toegevoegd tijdens de voorincubatieperiode of op het moment, dat het virus wordt toegevoegd, voor het verkrijgen van een additieve of syner-gistische inhibitering van virale antigen produktie.Further experiments with peptides X-XV, typically with amidated carboxyl terminal group and acetylated amino terminal group, produced similar results, with peptide XI being particularly effective over a wide dose range. Neutralizing antibodies can be added during the pre-incubation period or at the time the virus is added, to obtain an additive or synergistic inhibition of viral antigen production.

10 Uit het voorgaande moge het duidelijk zijn, dat de monoclonale antilichamen en peptiden, waaronder blokkerende peptiden, volgens de uitvinding, verbeterde werkwijzen voor het neutraliseren en/of inhibitering van HIV-infecties opleveren . Dit maakt het mogelijk profylactische en therapeutische composities te ontwikkelen, die effectief kunnen zijn 15 tegen infecties, veroorzaakt door de meeste, zo niet alle, HIV-stammen.From the foregoing, it should be understood that the monoclonal antibodies and peptides, including blocking peptides, of the invention provide improved methods for neutralizing and / or inhibiting HIV infections. This makes it possible to develop prophylactic and therapeutic compositions that can be effective against infections caused by most, if not all, HIV strains.

Verder vinden de nieuwe materialen toepassing in diagnostische toetsen en andere bekende procedures.The new materials are also used in diagnostic tests and other known procedures.

De volgende microörganismen, die deel uitmaken van de uitvinding, werden gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, 20 Rockville, Maryland, Verenigde Staten van Amerika. De gegeven van de depots zijn als volgt:The following microorganisms, which are part of the invention, have been deposited with the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, United States of America. The details of the depots are as follows:

Wetenschappelijke Referentie van Referentie Depot datumScientific Reference of Reference Deposit date

omschrijving de deposant ATCCdescription the depositor ATCC

Muis hybridoma HlV-gp 110-1 HB 9175 15 augustus 1986 25 (balb c/NS-1) " HIV-gp 110-2 HB 9176 15 augustus 1986 " HIV-gp 110-3 HB 9177 15 augustus 1986 " HIV-gp 110-6 HB 9404 30 april 1987 " HIV-gp 110-4 HB 9405 30 april 1987 30 " HIV-gp 110-5 HB 9406 30 april 1987 HIV-p 25-2 HB 9407 30 april 1987 n HIV-p 25-3 HB 9408 30 april 1987 ” HIV-p 25-6 HB 9409 30 april 1987 " HIV-p 25-7 HB 9410 30 april 1987 35 Hybridomas HB 9175, HB 9176 en HB 9177 bleken bij beproeving op 26 augustus 1986 levensvatbaar. De resterende hybridomas werden op 4 mei 1987 beproefd en bleken levensvatbaar te zijn.Mouse hybridoma HlV-gp 110-1 HB 9175 August 15, 1986 25 (balb c / NS-1) "HIV-gp 110-2 HB 9176 August 15, 1986" HIV-gp 110-3 HB 9177 August 15, 1986 "HIV-gp 110-6 HB 9404 April 30, 1987 "HIV-gp 110-4 HB 9405 April 30, 1987 30" HIV-gp 110-5 HB 9406 April 30, 1987 HIV-p 25-2 HB 9407 April 30, 1987 n HIV-p 25- 3 HB 9408 April 30, 1987 "HIV-p 25-6 HB 9409 April 30, 1987" HIV-p 25-7 HB 9410 April 30, 1987 35 Hybridomas HB 9175, HB 9176 and HB 9177 were tested viable on August 26, 1986. The remaining hybridomas were tested on May 4, 1987 and found to be viable.

87 0 1 ?ï 5 087 0 1? Ï 5 0

Claims (44)

1. Compositie voor gebruik bij de behandeling van HIV infecties, gekenmerkt door een therapeutisch effectieve dosis van ten minste een monoclonaal antilichaam, dat specifiek reactief is met een of meer neutraliserende gebieden van HIV, en een farmaceutisch effectieve drager. 5A composition for use in the treatment of HIV infections, characterized by a therapeutically effective dose of at least one monoclonal antibody, which is specifically reactive with one or more neutralizing regions of HIV, and a pharmaceutically effective carrier. 5 2. Compositie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de neutra liserende gebieden epitopen omvatten, gecodeerd binnen de env of gag gebieden van het HIV genome.The composition according to claim 1, characterized in that the neutralizing regions comprise epitopes encoded within the env or gag regions of the HIV genome. 3. Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val- Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y1 waarin Y en Y', indien aanwezig, elk een aminozuursequentie van ten hoogste ongeveer 20 aminozuren omvatten.3. Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y1 where Y and Y ', if each comprising an amino acid sequence of at most about 20 amino acids. 3. Compositie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de neutraliserende gebieden epitopen omvatten op HIV proteïnen gpllO of 10 p25.Composition according to claim 1, characterized in that the neutralizing regions comprise epitopes on HIV proteins gpl10 or p25. 4. Compositie volgens conclusie 1, gekenmerkt door een of meer blokkerende peptiden, die in staat zijn HIV besmettelijkheid te verzwakken, en/of monoclonale antilichamen, die reactief zijn met epitopen van de genoemde peptiden. 15Composition according to claim 1, characterized by one or more blocking peptides capable of attenuating HIV infectivity and / or monoclonal antibodies reactive with epitopes of said peptides. 15 5 . Compositie volgens conclusie 4, gekenmerkt door een cocktail van monoclonale antilichamen, die reactief zijn met verschillende homologen van de sequentie.5. Composition according to claim 4, characterized by a cocktail of monoclonal antibodies reactive with different sequence homologues. 6. Compositie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een monoclonaal antilichaam reactief is met ten minste éên epitoop vanComposition according to claim 1, characterized in that a monoclonal antibody is reactive with at least one epitope of 7. Compositie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een mono- 25 clonaal antilichaam reactief is met ten minste een epitoop van HIV p25 en een tweede monoclonaal antilichaam reactief is met ten minste een epitoop HIV gpllO.7. A composition according to claim 1, characterized in that a monoclonal antibody is reactive with at least one epitope of HIV p25 and a second monoclonal antibody is reactive with at least one epitope HIV gpl10. 8. Compositie volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de p25 epitoop zich bevindt binnen de LAV aminozuursequentie 278 - 319 of 30 315 - 363 of homologen van die sequentie.8. A composition according to claim 7, characterized in that the p25 epitope is located within the LAV amino acid sequence 278-319 or 315-3363 or homologs of that sequence. 9. Compositie volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de gpllO epitoop is gelegen binnen de LAV aminozuursequentie 308-328 of BRU homologen daarvanComposition according to claim 7, characterized in that the gpl10 epitope is located within the LAV amino acid sequence 308-328 or BRU homologues thereof 10. Monoclonaal antilichaam compositie, specifiek react ief met een 35 neutraliserend gebied van HIV.10. Monoclonal antibody composition, specifically reactive with a neutralizing region of HIV. 870. S50' -52-870. S50 '-52- 11. Compositie volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het neutraliserende gebied is gelegen op HIV gpllO.Composition according to claim 10, characterized in that the neutralizing region is located on HIV gpl10. 12. Compositie volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het gebied HIV gpllO aminozuursequentie vanaf ongeveer 301 tot 336 of 5 308 tot 328 of homologen van deze sequenties omvat.The composition according to claim 11, characterized in that the region comprises HIV gp10 amino acid sequence from about 301 to 336 or 308 to 328 or homologs of these sequences. 13. Compositie volgens conclusie 11, gekenmerkt door een mono-clonaal antilichaam, dat reactief is met een blokkerend peptide van HIV.Composition according to claim 11, characterized by a monoclonal antibody which is reactive with a blocking peptide of HIV. 14. Compositie volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het neutraliserende gebied is gelegen op HIV p25.Composition according to claim 10, characterized in that the neutralizing region is located on HIV p25. 15. Peptide, omvattende ten minste ongeveer vijf aan elkaar grenzende aminozuren uit de volgende HIV gpllO aminozuursequentie of homologen daarvan: II (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-15 Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.A peptide comprising at least about five contiguous amino acids from the following HIV gp10 amino acid sequence or homologues thereof: II (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile -15 Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. 16. Peptide volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de aan elkaar grenzende aminozuren ten minste één antigenische determinant definiëren, die in staat is antilichamen op te wekken bij immunisering 20 in een gastheer, welke antilichamen beschermend zijn tegen HIV infecties.16. Peptide according to claim 15, characterized in that the contiguous amino acids define at least one antigenic determinant capable of raising antibodies upon immunization in a host, which antibodies are protective against HIV infections. 17. Peptide, gekenmerkt door een van de volgende HIV gpllO aminozuursequenties of homologen daarvan: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-25 Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y' V (177 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y' of VIII (110-2-2)Peptide, characterized by any of the following HIV gp10 amino acid sequences or homologues thereof: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-25 Gly-Arg- Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y 'V (177 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-His -Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y 'or VIII (110-2-2) 18. Peptide volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat Y en/of 35 y· een verbindende rest omvat, gekozen uit glycine, tyrosine, cysteine, lysine, glutaminezuur of asparagine. 870195P -53-Peptide according to claim 17, characterized in that Y and / or 35 y comprises a linking moiety selected from glycine, tyrosine, cysteine, lysine, glutamic acid or asparagine. 870195P -53- 19. Nucleïnezuursequenties, coderende de peptiden van conclusie 15 of 18.Nucleic acid sequences encoding the peptides of claim 15 or 18. 20 Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y1, waarin Y en Y' indien aanwezig, elk een aminozuursequentie van ten hoogste ongeveer 20 aminozuren omvat.Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y1, wherein Y and Y ', if present, each comprise an amino acid sequence of at most about 20 amino acids. 20. Compositie gekenmerkt door een nucleinezuursegment van ongeveer 150 nucleotiden of minder.coderende een peptide uit een 5 neutraliserend gebied van HIV.20. Composition characterized by a nucleic acid segment of about 150 nucleotides or less encoding a peptide from a neutralizing region of HIV. 20 LAVbru aminozuursecIuentie 278 tot 319 en/of homologen daarvan, en een tweede monoclonaal antilichaam reactief is met ten minste één epitoop in LAV p25 aminozuursequentie 315-363 en/of homologen BRU daarvan.LAVbru amino acid sequence 278 to 319 and / or homologues thereof, and a second monoclonal antibody is reactive with at least one epitope in LAV p25 amino acid sequence 315-363 and / or homologues BRU thereof. 21. Nucleinezuursegment volgens conclusie 20, verder coderend een blokkerend peptide van HIV.The nucleic acid segment of claim 20, further encoding an HIV blocking peptide. 22. Nucleinezuursegment volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat het peptide ten minste ongeveer 5 aminozuren omvat uit LAV gpllO cKU 10 aminozuren 301-336 of uit aminozuur sequenties 278-319 of 315-363 en homologen van de sequenties.Nucleic acid segment according to claim 20, characterized in that the peptide comprises at least about 5 amino acids from LAV gpl10 CKU 10 amino acids 301-336 or from amino acid sequences 278-319 or 315-363 and homologues of the sequences. 23. Voor gebruik in diagnostische hybridiseringstoetsen, een paneel van proben omvattende ten minste twee nucleïnezuursequenties, die de peptiden in Tabel A coderen.23. For use in diagnostic hybridization assays, a panel of probes comprising at least two nucleic acid sequences encoding the peptides in Table A. 24. Vaccin tegen HIV infectie, gekenmerkt door een immunologisch effectieve dosis van een of meer peptiden van minder dan ongeveer 50 aminozuren, bevattende neutraliserende gebieden uit gpllO en/of p25, welke peptiden gemengd zijn met een fysiologisch aanvaardbare drager.Vaccine against HIV infection, characterized by an immunologically effective dose of one or more peptides of less than about 50 amino acids, containing neutralizing regions of gpl10 and / or p25, which peptides are mixed with a physiologically acceptable carrier. 25. Vaccin volgens conclusie 24,gekenmerkt door ten minste ongeveer vijf aminozuren uit een blokkerend peptide.Vaccine according to claim 24, characterized by at least about five amino acids from a blocking peptide. 26. Geïmmortaliseerde cellijn, die een monoclonaal antilichaam produceert, dat in staat is tot reactie met een omhullend glycoproteïne gpllO antigenisch determinant, aanwezig binnen een neutraliserend ge- 25 bied of blokkerend peptide van HIV.26. An immortalized cell line that produces a monoclonal antibody capable of reacting with an envelope glycoprotein gpl10 antigenic determinant contained within a neutralizing region or blocking peptide of HIV. 27. De cellijnen HIV-gpllO-1, HIV-gpll0-2,HIV-gpll0-3, HIV-gpll0-4, HIV-gpll0-5, HIV-gpllO-6, HIV-p25-6, en HIV-p25-7.27. The HIV-gpl10-1, HIV-gpl10-2, HIV-gpl10-3, HIV-gpl10-4, HIV-gpl10-5, HIV-gpl10-6, HIV-p25-6, and HIV-p25 cell lines -7. 28. Monoclonaal antilichaam, geproduceerd door een cellijn volgens conclusie 27.The monoclonal antibody produced by a cell line according to claim 27. 29. Monoclonaal antilichaam dat in staat is tot specifieke reactie met een antigenische determinant van HIV, welk monoclonaal antilichaam de binding van een door de cellijnm vigens conclusie 27 geproduceerd antilichaam blokkeert.29. Monoclonal antibody capable of specific reaction with an antigenic determinant of HIV, which monoclonal antibody blocks the binding of an antibody produced by the cell line according to claim 27. 30. Monoclonaal antilichaam dat in staat is tot reactie met een 35 antigenische determinant van omhullend glycoproteïne gpllO van HIV. 8701950 » -54-30. Monoclonal antibody capable of reacting with an antigenic determinant of HIV envelope glycoprotein gpl10. 8701950 »-54- 31. Werkwijze voor het genereren van cellijnen, welke anti-lichamen produceren, die reactief zijn met antigenische determinanten van HIV gpllO, met het kenmerk, dat aan een gastheer een immunogene hoeveelheid van een antigenisch preparaat, verrijkt voor HIV proteïnen 5 wordt toegediend, de geïmmuniseerde gastheer wordt bewaakt voor de produktie van antilichamen, die reactief zijn met gpllO antigenische determinanten, uit de gastheer antilichamen producerende cellen worden verkregen en deze cellen worden geïmmortaliseerd, de geïmmortaliseerde cellen, die antilichamen voor HIV gpllO produceren, worden geselecteerd, 10 en de geïmmortaliseerde cellen worden gecloond onder vorming van de cellijnen.31. A method of generating cell lines producing antibodies reactive with antigenic determinants of HIV gpl10, characterized in that a host is administered an immunogenic amount of an antigenic preparation enriched for HIV proteins, the immunized host is monitored for the production of antibodies reactive with gpl10 antigenic determinants, obtained from the host antibody producing cells and these cells are immortalized, the immortalized cells, which produce antibodies to HIV gpl10, are selected, and the immortalized cells are cloned to form the cell lines. 32. Werkwijze volgens conclusie 31, met het kenmerk, dat de HIV proteïnen recombinant fusieproteïnen zijn, tot expressie gebracht door een eucaryotische of bacteriele gastheer dan wel dat de HIV proteïnen 15 zijn verkregen uit een extract of lysaat van HIV.32. A method according to claim 31, characterized in that the HIV proteins are recombinant fusion proteins expressed by a eucaryotic or bacterial host or that the HIV proteins are obtained from an extract or lysate of HIV. 33. Werkwijze voor de diagnose van de aanwezigheid van HIV in een biologisch monster, met het kenmerk, dat een monoclonaal antilichaam, dat in staat is tot reactie met HIV gpllO, met het biologisch monster wordt geïncubeerd en de aanwezigheid van immuuncom- 20 plexen, gevormd tussen het monoclonale antilichaam en de antigenische determinant in het biologische monster wordt gedetecteerd, en daaruit de aanwezigheid of afwezigheid van HIV in het monster wordt vastgesteld.33. Method for diagnosing the presence of HIV in a biological sample, characterized in that a monoclonal antibody capable of reacting with HIV gpl10 is incubated with the biological sample and the presence of immune complexes, formed between the monoclonal antibody and the antigenic determinant in the biological sample is detected, and the presence or absence of HIV in the sample is determined therefrom. 34. Werkwijze volgens conclusie 33, met het kenmerk, dat het 25 monoclonale antilichaam in staat is tot reactie met een neutraliserend gebied of blokkerend peptide van gpllO.34. A method according to claim 33, characterized in that the monoclonal antibody is capable of reacting with a neutralizing region or blocking peptide of gpl10. 35. Werkwijze voor de diagnose van de aanwezigheid van antilichamen voor HIV in een biologisch monster, met het kenmerk, dat een peptide uit een neutraliserend gebied van HIV gpllO of p25 30 met het biologische monster wordt geïncubeerd en de aanwezigheid van immuuncomplexen, gevormd tussen het peptide en antilichamen in het monster, die reactief zijn met het peptide, wordt gedetecteerd en daaruit de aanwezigheid of afwezigheid van HIV in het monster wordt vastgesteld.35. A method for the diagnosis of the presence of antibodies to HIV in a biological sample, characterized in that a peptide from a neutralizing region of HIV gpl10 or p25 is incubated with the biological sample and the presence of immune complexes formed between the peptide and antibodies in the sample, which are reactive with the peptide, are detected and the presence or absence of HIV in the sample is determined therefrom. 36. Werkwijze voor de diagnose van de aanwezigheid van HIV in een 870195C 4 -55- biologisch monster, met het kenmerk, dat een nucleinezuur segment, dat tenminste een gedeelte van een neutraliserend gebied van HIV codeert, met nucleinezuur in het biologische monster onder hybridise-ringsomstandigheden wordt geincubeerd en de aanwezigheid van hybride-5 complexen, gevormd tussen het nucleïnezuursegment en het nucleinezuur in het monster werd gedetecteerd, en daaruit de aanwezigheid of afwezigheid van HIV in het monster wordt vastgesteld.36. Method for diagnosing the presence of HIV in an 870195C 4-5 biological sample, characterized in that a nucleic acid segment encoding at least a portion of a neutralizing region of HIV with nucleic acid in the biological sample under hybridization ring conditions are incubated and the presence of hybrid-5 complexes formed between the nucleic acid segment and the nucleic acid in the sample was detected, thereby determining the presence or absence of HIV in the sample. 37. Werkwijze voor de behandeling van een patient,die verdacht wordt van blootstelling aan HIV, met het kenmerk, dat een therapeu- 10 tisch of immunologisch effectieve dosis van ten minste één monoclonaal antilichaam, dat reactief is met een neutraliserend gebied van HIV, wordt toegediend.37. A method of treatment for a patient suspected of exposure to HIV, characterized in that a therapeutically or immunologically effective dose of at least one monoclonal antibody reactive with a neutralizing region of HIV is administered. 38. Werkwijze voor het vaststellen van een stam van HIV in een geïnfecteerde gastheer, met het kenmerk, dat een biologisch monster 15 uit de gastheer met een peptide uit een neutraliserend gebied van HIV wordt geincubeerd en de aanwezigheid van immuuncomplexen, gevormd tussen het peptide en antilichamen in het monster, wordt gedetecteerd, en daaruit de stam van HIV, die de gastheer infecteert, wordt vastgesteld.38. A method of determining a strain of HIV in an infected host, characterized in that a biological sample from the host is incubated with a peptide from a neutralizing region of HIV and the presence of immune complexes formed between the peptide and antibodies in the sample are detected and the strain of HIV infecting the host is determined therefrom. 39. Werkwijze voor behandeling van een patient, geïnfecteerd 20 met HIV, met het kenmerk, dat een biologisch monster uit de patient met een peptide uit een neutraliserend gebied van HIV wordt geincubeerd, de aanwezigheid van immuuncomplexen, gevormd tussen het peptide en antilichamen in het monster, wordt gedetecteerd en daaruit de stam van HIV die de patient infecteert, wordt vastgesteld en een 25 monoclonaal antilichaam, dat specifiek reactief is met een neutraliserend gebied van de HIV stam, wordt toegediend.39. A method of treatment of a patient infected with HIV, characterized in that a biological sample from the patient is incubated with a peptide from a neutralizing region of HIV, the presence of immune complexes formed between the peptide and antibodies in the sample is detected and therefrom the strain of HIV infecting the patient is determined and a monoclonal antibody, which is specifically reactive with a neutralizing region of the HIV strain, is administered. 40. Werkwijze voor het vaccineren van een patient tegen HIV infecties, met het kenmerk, dat aan de patient een immunologisch effectieve dosis wordt toegediend van een antidiotypisch monoclonaal 30 antilichaam, dat specifiek reactief is met een idiotype van een tweede monoclonaal antilichaam, dat in staat is tot binding aan een neutraliserend gebied van HIV.40. A method of vaccinating a patient against HIV infection, characterized in that the patient is administered an immunologically effective dose of an antidiotypic monoclonal antibody which is specifically reactive with an idiotype of a second monoclonal antibody capable of is binding to a neutralizing region of HIV. 41. Compositie, gekenmerkt door (a) ten minste een monoclonaal antilichaam, dat reactief is met een neutraliserend gebied van HIV 35 en (b) een blokkerend peptide, omvattende ten minste ongeveer vijf aan41. Composition characterized by (a) at least one monoclonal antibody reactive with a neutralizing region of HIV 35 and (b) a blocking peptide comprising at least about five 87 OH'5 δ β -56- elkaar grenzende aminozuren uit de volgende HIV gpllO aminozuursequenties of homologen daarvan: IX (173) Y-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y', of 5 XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', waarin Y en Y', indien aanwezig, elk een aminozuursequentie van ten hoogste ongeveer 20 aminozuren omvatten.87 OH'5 δ β -56- contiguous amino acids from the following HIV gpl10 amino acid sequences or homologues thereof: IX (173) Y-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y ', or 5 XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y ', wherein Y and Y', when present, each comprise an amino acid sequence of up to about 20 amino acids. 42. Compositie, gekenmerkt door (a) een monoclonaal anti- 10 lichaam, dat specifiek is voor een neutraliserend gebied van HIV en (b) een peptide, omvattend ten minste een van de volgende aminozuursequenties of homologen daarvan: XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y *,of 15 XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', of XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y', of XIV (190)42. A composition characterized by (a) a monoclonal antibody specific for a neutralizing region of HIV and (b) a peptide comprising at least one of the following amino acid sequences or homologues thereof: XI (187) Y- Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y *, or 15 XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y ', or XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly -Y ', or XIV (190) 43. Compositie volgens conclusie 12 of 13, met het kenmerk, dat het blokkerende peptide ten minste een antigenische determinant definieert, 25 die in staat is antilichamen op te wekken bij immunisering van een gastheer, welke opgewekte antilichamen beschermen tegen HIV infecties.43. A composition according to claim 12 or 13, characterized in that the blocking peptide defines at least one antigenic determinant capable of generating antibodies upon immunization of a host which protect raised antibodies against HIV infections. 44. Werkwijze voor het behandelen van een patient, die verdacht wordt van blootstelling aan HIV, gekenmerkt door toediening van een therapeutisch of profylactisch effectieve dosis van een of meer monoclonale anti- 30 lichamen, die reactief zijn met een neutraliserend gebied van HIV, en toediening van blokkerende peptiden, die in staat zijn tot verzwakking van HIV besmettelijkheid en/of monoclonale antilichamen, die reactief zijn met de blokkerende peptiden. o70 ! 95044. A method of treating a patient suspected of exposure to HIV, characterized by administering a therapeutically or prophylactically effective dose of one or more monoclonal antibodies reactive with a neutralizing region of HIV and administering of blocking peptides, capable of attenuating HIV infectivity and / or monoclonal antibodies, which are reactive with the blocking peptides. o70! 950