SE506025C2 - Monoclonal antibodies and peptides and their preparations for the treatment and diagnosis of HIV infection as well as cell lines for antibody production - Google Patents

Abstract

Disclosed are monoclonal antibodies reactive with one or more neutralizing regions of HIV proteins, peptides or homologs of such neutralizing regions, and nucleic acid segments coding for said peptides. Neutralizing regions include portions of the env and gag genes from various HIV isolates. The monocional antibodies may be used to treat HIV infection or in diagnosis and the peptides may be used to elicit antibodies and to block HIV infection.

Description

506 025 Höljes-glykoproteinerna hos de flesta retrovirus anses rea- gera med receptormolekyler på ytan av känsliga celler, vilket därigenom bestämmer virusets infektivitet med avse- ende på vissa värddjur. Antikroppar, som binder till glyko- proteinerna, kan blockera virusets interaktion med cell- receptorerna och neutralisera virusets infektivitet. §g allmänt The Molecular Biolodv of Tumor Viruses, 534 1973) och RNA Tumor Viruses, 226, 236 1982), vilka båda införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. åg även Gonza- (J. Tooze, red., (R. Weiss et al., red., lez-Scarano et al., 1982, Virology 120:42 (La Crosse Virus); Matsuno och Inouye, 1983, Infect. Immun. 39:l55 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); och Mathews et al., 1982, J. Immunol., l29:2763 (Encephalomyelitis Virus). 506 025 The envelope glycoproteins of most retroviruses are thought to react with receptor molecules on the surface of sensitive cells, thereby determining the infectivity of the virus with respect to certain host animals. Antibodies that bind to the glycoproteins can block the virus 'interaction with the cell receptors and neutralize the virus' infectivity. §G generally The Molecular Biolodv of Tumor Viruses, 534 1973) and RNA Tumor Viruses, 226, 236 1982), both of which are incorporated herein by reference. see also Gonza- (J. Tooze, ed., (R. Weiss et al., eds., lez-Scarano et al., 1982, Virology 120: 42 (La Crosse Virus); Matsuno and Inouye, 1983, Infect). Immun. 39: 155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); and Mathews et al., 1982, J. Immunol., 19: 2763 (Encephalomyelitis Virus).

Den allmänna strukturen hos HIV är strukturen hos en ribo- nukleoprotein-kärna, som omges av ett lipidhaltigt hölje, vilket viruset erhåller under knoppningsförloppet från mem- branet hos den infekterade värdcellen. Inbäddade i höljet och utskjutande därifrån återfinner man de virala kodade glykoproteinerna. Höljes-glykoproteinerna hos HIV synteti- seras initiellt i den infekterade cellen som en förstadie- molekyl med en molekylvikt av 150000 - 160000 dalton (gp150 eller gpl60), som därefter bearbetas i cellen till ett N- ändstående fragment med molekylvikten 110000 - 120000 dalton (gp110 eller gp120) för generering av det yttre glykoproteinet och ett C-ändstående fragment med molekyl- vikten 41000 - 46000 dalton (gp4l), som representerar transmembran-höljes-glykoproteinet.The general structure of HIV is the structure of a ribonucleoprotein nucleus, which is surrounded by a lipid-containing envelope, which the virus receives during the budding process from the membrane of the infected host cell. Embedded in the envelope and protruding therefrom are the viral encoded glycoproteins. The envelope glycoproteins of HIV are initially synthesized in the infected cell as a precursor molecule having a molecular weight of 150,000 - 160,000 daltons (gp150 or gp160), which is then processed in the cell into an N-terminal fragment having a molecular weight of 110000 - 120,000 daltons ( gp110 or gp120) to generate the outer glycoprotein and a C-terminal fragment having a molecular weight of 41,000-46,000 daltons (gp41), which represents the transmembrane envelope glycoprotein.

Av ovan angivna skäl har gp110-glykoproteinet hos HIV varit föremål för mycken undersökning som ett pontentiellt mål för att avbryta virusets livscykel. Sera från HIV-infek- terade individer har visat sig neutralisera HIV in yitgg och antikroppar, som binder till renat gp110, Robert-Guroff et al., 1985, flggggg 316:72; Nature 316:69; och Mathews et al., 1986, är närvarande i sera, WBÅSS et 1985, ELQQ; al., '506 025 3 Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:9709. Renat och rekombinant gpll0 stimulerade produktionen av neutraliserande seruman- tikroppar vid användning för immunisering av djur, Robey et al., 1986, Prcc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:7023; Lasky 1986, Science 233:209; och en människa, Zagury et al., 1986, Nature 326:249. Bindning av gpl10-molekylen till CD4 (T4)-receptorn har även påvisats och monoklonala antikroppar, som känner igen vissa epitoper hos CD4-recep- torn, har visat sig blockera HIV-bindning, syncytia-bild- ning och infektivitet. McDougal et al., 1986, Science 23l:382. Putney et al. (1986, Science 234:l392) framkallade neutraliserande serumantikroppar hos djur efter immuniser- ing med ett rekombinant fusionsprotein innehållande den karboxylterminala halvan av gpl10-molekylen och visade vidare att glykosylering av höljesproteinet icke är nödvän- dig för ett neutraliserande antikroppsvar. et al., Ett subenhetsvaccin för AIDS, som utnyttjar HIV-gp1l0-mole- kylen eller delar därav, kan således vara önskvärt. Suben- hetsvacciner utgör ett alternativ till vacciner framställda från inaktiverade eller försvagade virus. Inaktiverade vacciner är besvärliga till följd av den eventuella oförmå- gan att döda samtliga virala partiklar och försvagade virus kan äga förmågan att mutera och återfå sin sjukdomsalstran- de förmåga. Med subenhetsvacciner används för immunisering av värddjuret endast de delar av viruset som innehåller de antigener eller epitoper som kan framkalla immunsvar, dvs. neutraliserande antikroppar, ADCC och cytotoxiskt T-cel1- svar. En stor fördel med subenhetsvacciner är att irrele- vant viralt material utesluts.For the reasons stated above, the gp110 glycoprotein in HIV has been the subject of much research as a potential target for interrupting the life cycle of the virus. Sera from HIV-infected individuals have been shown to neutralize HIV in yitgg and antibodies that bind to purified gp110, Robert-Guroff et al., 1985, fl ggggg 316: 72; Nature 316: 69; and Mathews et al., 1986, are present in sera, WBÅSS et 1985, ELQQ; al., '506 025 3 Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 9709. Purified and recombinant gp110 stimulated the production of neutralizing serum antibodies when used to immunize animals, Robey et al., 1986, Prcc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 7023; Lasky 1986, Science 233: 209; and a human, Zagury et al., 1986, Nature 326: 249. Binding of the gp110 molecule to the CD4 (T4) receptor has also been demonstrated and monoclonal antibodies, which recognize certain epitopes of the CD4 receptor, have been shown to block HIV binding, syncytia formation and infectivity. McDougal et al., 1986, Science 231: 382. Putney et al. (1986, Science 234: 1352) elicited neutralizing serum antibodies in animals after immunization with a recombinant fusion protein containing the carboxyl-terminal half of the gp110 molecule and further showed that glycosylation of the envelope protein is not necessary for a neutralizing antibody response. et al., A subunit vaccine for AIDS that utilizes the HIV gp110 molecule or portions thereof may thus be desirable. Subunit vaccines are an alternative to vaccines produced from inactivated or attenuated viruses. Inactivated vaccines are troublesome due to the possible inability to kill all viral particles and attenuated viruses may have the ability to mutate and regain their disease-causing ability. With subunit vaccines, only those parts of the virus that contain the antigens or epitopes that can elicit an immune response are used to immunize the host animal, ie. neutralizing antibodies, ADCC and cytotoxic T-cell1 response. A major advantage of subunit vaccines is that irrelevant viral material is excluded.

Virala subenheter för användning i ett vaccin kan framstäl- las medelst olika metoder. Så exempelvis kan höljes-glyko- proteinet uttryckas och renas från en bakterievärd, ehuru denna molekyl skulle sakna de flesta post-translationella modifikationer (såsom glykosylering) eller andra variatio- ner. En dylik modifikation kan uppnås under användning av ett eukaryotiskt expressionssystem, såsom jäst eller odlade 506 025 4 däggdjursceller. Virala gener har införlivats med dägg- djursceller under användning av vaccinia-viruset som en vektor. Se exempelvis Mackett, M., et al., 1982, Acad. Sci. USA 79:7415; Panicali, D. och Paoletti, E., 1982, Nat. Acad. Sci. USA 79:4927. nia-virus kan konstrueras enligt den metod som har angivits av Hu et al., Nature 320:537 (1986) eller Chakrabarti et al., Nature 320:535 (1986), vilka båda införlivas med denna Proc. Nat.Viral subunits for use in a vaccine can be prepared by various methods. For example, the envelope glycoprotein can be expressed and purified from a bacterial host, although this molecule would lack most post-translational modifications (such as glycosylation) or other variations. Such a modification can be achieved using a eukaryotic expression system, such as yeast or cultured mammalian cells. Viral genes have been incorporated into mammalian cells using the vaccinia virus as a vector. See, e.g., Mackett, M., et al., 1982, Acad. Sci. USA 79: 7415; Panicali, D. and Paoletti, E., 1982, Nat. Acad. Sci. USA 79: 4927. nia virus can be constructed according to the method set forth by Hu et al., Nature 320: 537 (1986) or Chakrabarti et al., Nature 320: 535 (1986), both of which are incorporated into this Proc. Nat.

Proc. Rekombinant vacci- beskrivning genom hänvisning därtill. I dessa system glyko- syleras på lämpligt sätt virala glykoproteiner, som produ- ceras av celler infekterade med rekombinant vaccinia, och kan transporteras till cellytan för extrusion och slutlig isolering.Proc. Recombinant vaccine description by reference thereto. In these systems, viral glycoproteins, which are produced by cells infected with recombinant vaccinia, are suitably glycosylated and can be transported to the cell surface for extrusion and final isolation.

Ett viktigt steg vid framställningen av ett subenhetsvaccin är adekvat rening av det önskade glykoproteinet från den komplexa expressionssystemblandningen. Flera metoder kan användas för att uppnå reningen. Dessa innefattar, men är ej begränsade till preparativ polyakrylamidgel-elektro- fores, gelfiltreringskromatografi och olika kromatografe- ringsmetoder (dvs. jonbyte, omvänd faskromatografering, im- munoaffinitet, hydrofob interaktion) och andra. De flesta av dessa metoder används i olika kombinationer för att upp- nå i huvudsak rena preparat (Kleid, D.G., et al., 1981, Science ¿l¿:1125; Cabradilla, C.D., et al., 1986, Biotech- nology 4:128, Dowbenko, D.J., 1985, Nat. Acad.An important step in the preparation of a subunit vaccine is adequate purification of the desired glycoprotein from the complex expression system mixture. Several methods can be used to achieve the purification. These include, but are not limited to, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, gel filtration chromatography, and various chromatography methods (ie, ion exchange, reverse phase chromatography, immunoaffinity, hydrophobic interaction), and others. Most of these methods are used in various combinations to obtain substantially pure preparations (Kleid, DG, et al., 1981, Science ¿l¿: 1125; Cabradilla, CD, et al., 1986, Biotechnology 4 : 128, Dowbenko, DJ, 1985, Nat. Acad.

QSA 82:7748) som införlivas med denna beskrivning genom Proc. Sci. hänvisning därtill.QSA 82: 7748) which is incorporated herein by Proc. Sci. reference thereto.

Metoder, som skulle kunna reducera antalet steg som krävs för att uppnå maximal rening av ett speciellt viralt anti- gen från en komplex expressionsblandning, krävs för fram- ställning av subenhetsvacciner. Effektiv separation av antigenerna från främmande komponenter skulle kunna åstad- kommas under användning av immunoaffinitet-kromatografi.Methods that could reduce the number of steps required to achieve maximum purification of a particular viral antigen from a complex expression mixture are required for the production of subunit vaccines. Effective separation of the antigens from foreign components could be accomplished using immunoaffinity chromatography.

Denna teknik, som även är känd som immunoadsorption, består i princip av selektiv adsorption av ett antigen på en fast bärare, på vilken en specifik antikropp har bundits konva- lent. Det selektivt adsorberade antigenet elueras där- efter från ett dylikt antikropp-affinitets-adsorbens genom exempelvis ändring av pH och/eller jonstyrkan hos buffer- ten.This technique, also known as immunoadsorption, basically consists of the selective adsorption of an antigen on a solid support, to which a specific antibody has been covalently bound. The selectively adsorbed antigen is then eluted from such an antibody affinity adsorbent by, for example, changing the pH and / or ionic strength of the buffer.

Polyklonala antikroppar, som erhålls från djur immuniserade med det önskade antigenet eller från naturligt infekterade individer (se exempelvis LASKY et al., ovan), har ofta an- vänts som immunadsorbanter men i allmänhet uppvisar dessa reagens väsentliga nackdelar såsom att (i) icke samtliga antikroppar, som är bundna till den olösliga bäraren, är specifika med avseende på molekylen av intresse, vilket nödvändiggör ytterligare rening; (ii) utbytet av det öns- kade antigenet ofta är lågt; och (iii) antikroppsaffini- teterna ofta varierar från ett preparat till ett annat, vilket kräver modifikationer i elueringsprocessen. Använd- ningen av monoklonala antikroppar, som är specifika med av- seende på det önskade virala antigen som skall användas i subenhetsvaccinpreparatet, i stället för polyklonala anti- kroppar skulle kunna eliminera dessa svårigheter.Polyclonal antibodies obtained from animals immunized with the desired antigen or from naturally infected individuals (see, for example, LASKY et al., Supra), have often been used as immunoadsorbents, but in general these reagents have significant disadvantages such as (i) not all antibodies bound to the insoluble carrier are specific for the molecule of interest, necessitating further purification; (ii) the yield of the desired antigen is often low; and (iii) the antibody affinities often vary from one preparation to another, requiring modifications in the elution process. The use of monoclonal antibodies specific for the desired viral antigen to be used in the subunit vaccine preparation instead of polyclonal antibodies could eliminate these difficulties.

Monoklonala råttdjursantikroppar, som binder till HIV-anti- gener, har beskrivits. Flera grupper har rapporterat mono- klonala antikroppar, som är specifika för kärnproteinet p25 (se exempelvis di Marzo Veronese, et al., 1985, Proc. Nat.Rat monoclonal antibodies that bind to HIV antigens have been described. Several groups have reported monoclonal antibodies specific for the nuclear protein p25 (see, e.g., di Marzo Veronese, et al., 1985, Proc. Nat.

Acad. Sci. USA 82:5l99 och Chassagne, J., et al., 1986, Q¿_lmmgngl¿ 136:l442). Monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende på membranglykoproteinet gp4l, har även rapporterats (se exempelvis di Marzo Veronese, et al., 1985, Science ;;g:1402).Acad. Sci. USA 82: 5199 and Chassagne, J., et al., 1986, (136: 1442). Monoclonal antibodies specific for the membrane glycoprotein gp41 have also been reported (see, for example, di Marzo Veronese, et al., 1985, Science ;; g: 1402).

Det föreligger ett behov inom tekniken av monoklonala anti- kroppar, som är specifika med avseende på epitoper inom väl definierade regioner av det viktiga höljes-glykoproteinet gp110. Monoklonala antikroppar, som binder till dessa regioner och orsakar en reduktion av eller eliminering av replikationen och överförbarheten av HIV, skulle ha väsent- lig terapeutisk och profylaktisk användbarhet. Vidare skul- le exempelvis de monoklonala antikropparna även kunna an- 506 025 506 025 6 vändas för rening av den önskade regionen hos gpI1O från upplöst virus eller rekombinanta expressionssystem för an- vändning i vacciner. Dessutom skulle den region som inne- håller den epitop eller de epitoper som känns igen av de monoklonala antikropparna kunna syntetiseras kemiskt, var- igenom man skulle undvika de svårigheter som är förknippade med rening och administrering av större fragment av gp110- molekylen. Föreliggande uppfinning fyller dessa och andra relaterade behov.There is a need in the art for monoclonal antibodies that are specific for epitopes within well-defined regions of the important envelope glycoprotein gp110. Monoclonal antibodies, which bind to these regions and cause a reduction or elimination of HIV replication and transmissibility, would have significant therapeutic and prophylactic utility. Furthermore, for example, the monoclonal antibodies could also be used to purify the desired region of gpI10 from dissolved virus or recombinant expression systems for use in vaccines. In addition, the region containing the epitope or epitopes recognized by the monoclonal antibodies could be chemically synthesized, thereby avoiding the difficulties associated with purification and administration of larger fragments of the gp110 molecule. The present invention meets these and other related needs.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Uppfinningen tillhandahåller peptider med förmåga att immunologiskt imitera neutraliserande epitoper hos HIV- proteiner, nukleinsyrapreparat, som kodar för dylika pep- tider, och monoklonala antikroppar, som är reaktiva med dylika peptider, liksom andra peptider som interfererar med HIV-infektivitet.SUMMARY OF THE INVENTION The invention provides peptides capable of immunologically imitating neutralizing epitopes of HIV proteins, nucleic acid preparations encoding such peptides, and monoclonal antibodies reactive with such peptides, as well as other peptides that interfere with HIV.

Dessa nya material finner exempelvis användning i diagnos- tiska analysmetoder för påvisande av HIV-infektioner och i terapeutiska kurer för behandling av eller vaccination mot dylika infektioner.These new materials find use, for example, in diagnostic analysis methods for the detection of HIV infections and in therapeutic cures for the treatment of or vaccination against such infections.

BESKRIVNING AV DE SPECIFIKA UTFÖRINGSFORMERNA Föreliggande uppfinning tillhandahåller nya beredningar och förfaranden för neutralisering av HIV-infektioner, dvs. för att förhindra eller väsentligen inhibera bildningen av eller cellulär överföring av infektiöst HIV till ett värd- djur. Närmare bestämt används peptider, som imiterar en neutraliserande region av HIV, och monoklonala antikroppar, som är reaktiva med avseende på en dylik region, för diag- nos och behandling av och vaccination mot HIV-infektioner.DESCRIPTION OF THE SPECIFIC EMBODIMENTS The present invention provides novel preparations and methods for neutralizing HIV infections, i.e. to prevent or substantially inhibit the formation or cellular transmission of infectious HIV to a host animal. More specifically, peptides which mimic a neutralizing region of HIV and monoclonal antibodies which are reactive with respect to such a region are used for the diagnosis and treatment of and vaccination against HIV infections.

I detta avseende avser "neutraliserande region" de delar av HIV, speciellt HIV-proteiner_som innehåller aminosyraseg- ment, vilka definierar en eller flera epitoper, som är reaktiva med antikroppar, vilka antingen individuellt eller 506 025 7 i kombination med andra antikroppar enligt föreliggande uppfinning har förmåga att neutralisera ÉIV-infektioner.In this regard, "neutralizing region" refers to those portions of HIV, especially HIV proteins, which contain amino acid segments which define one or more epitopes which are reactive with antibodies which either individually or in combination with other antibodies of the present invention has the ability to neutralize ÉIV infections.

Lämpliga metoder för neutralisation är väl kända och kan innefatta reducering av HIV-infektioner i T-cellinjer, re- ducering av plackbildande enheter av VSV(HIV) pseudotyper, som uppbär höljes-glykoproteinerna hos HIV, syncytiella inhibitionstester och virion-receptor-bindningstester. Om så önskas kan den neutraliserande aktiviteten jämföras med antikroppsreaktiviteten vid immunokemiska tester såsom immunofluorescens-, immunoblotting- och radioimmunoprecipi- tations-analysmetoder.Suitable methods of neutralization are well known and may include reduction of HIV infections in T cell lines, reduction of plaque-forming units of VSV (HIV) pseudotypes carrying the envelope glycoproteins of HIV, syncytial inhibition tests and virion receptor binding tests. If desired, the neutralizing activity can be compared to the antibody reactivity in immunochemical assays such as immunofluorescence, immunoblotting and radioimmunoprecipitation assay methods.

Enligt en aspekt innehåller de nya peptiderna, som typiskt består av mindre än cirka 50 aminosyror, fem eller flera angränsande aminosyror, som bildar epitoper, vilka väsent- ligt liknar epitoper lokaliserade på neutraliserande regio- ner hos HIV gp1l0 eller p25, som kodas av ggg- resp. gag- regionerna hos HIV-genomen. Av speciellt intresse är de regioner som sträcker sig från ungefär aminosyraresten 301 till cirka 336 i gp1l0 eller från cirka 278 till cirka 319 och från cirka 315 till 363 i p25, samtliga från den HIV- stam som betecknar LAVBRU. Aminosyrarestbeteckningarna är från the Los Alamos Data Bank (AIDS virus sequence data- base, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).In one aspect, the novel peptides, which typically consist of less than about 50 amino acids, contain five or more contiguous amino acids that form epitopes that are substantially similar to epitopes located on neutralizing regions of HIV gp110 or p25 encoded by ggg. - resp. gag regions of the HIV genome. Of particular interest are the regions ranging from about amino acid residue 301 to about 336 in gp110 or from about 278 to about 319 and from about 315 to 363 in p25, all from the LAVBRU HIV strain. The amino acid residue designations are from the Los Alamos Database (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).

Fackmannen inser att ytterligare analoga regioner (“homo- loger“) från andra HIV-isolat kan identifieras baserat på deras lokalisation i besläktade proteiner från olika iso- lat. I praktiken kan dylika homologer identifieras genom hänvisning till LAVBRU-sekvensdata som följer: (a) Aminosyrasekvenserna i HIV-isolat och LAVBRU kan bringas i rät linje för erhållande av maximal homologi mellan de två sekvenserna; (b) Peptider innefattande HIV-isolatens aminosyrasekvenser motsvarande lokalisationen av LAVBRU-peptider, som immuno- logiskt imiterar LAVBRU-proteiner, kan identifieras. De 506 025 8 peptider som innefattar HIV-isolat-aminosyrasekvenser och som identifieras på så sätt imiterar typiskt immunologiskt mot-svarande HIV-isolat-proteiner.Those skilled in the art will recognize that additional analogous regions ("homologs") from other HIV isolates can be identified based on their location in related proteins from different isolates. In practice, such homologues can be identified by reference to LAVBRU sequence data as follows: (a) The amino acid sequences in HIV isolates and LAVBRU can be aligned to obtain maximum homology between the two sequences; (b) Peptides comprising the amino acid sequences of the HIV isolates corresponding to the localization of LAVBRU peptides, which immunologically mimic LAVBRU proteins, can be identified. The 506,025 peptides comprising HIV isolate amino acid sequences and thus identified typically mimic immunologically corresponding HIV isolate proteins.

Denna metod kan tillämpas på HIV-stammar, som ännu icke har upptäckts. När exempelvis nya stammar av HIV identifieras kan deras höljes- och kärnaminosyrasekvenser bringas i rät linje med motsvarande hos LAVBRU för erhållande av maximal homologi. De metoder medelst vilka sekvenserna bringas i rät linje är kända för fackmannen. Då man bringar sekven- serna i rät linje är det önskvärt att bibehålla så mycken homologi som möjligt mellan cysteinrester. Den aminosyra- sekvens hos den nya HIV-stammen eller -arten som motsvarar lokalisationen av de peptider som specifikt avslöjas i föreliggande sammanhang kan syntetiseras och användas i en- lighet med uppfinningen.This method can be applied to HIV strains that have not yet been detected. For example, when new strains of HIV are identified, their envelope and core amino acid sequences can be aligned with those of LAVBRU to obtain maximum homology. The methods by which the sequences are aligned are known to those skilled in the art. When aligning the sequences, it is desirable to maintain as much homology as possible between cysteine residues. The amino acid sequence of the novel HIV strain or species corresponding to the location of the peptides specifically disclosed in the present context can be synthesized and used in accordance with the invention.

En annan metod för bestämning av sekvenserna av en homolog region hos andra HIV-stammar beskrivs av Scharf et al., Science (1986) 233:1076. Den utnyttjar två oligonukleotid- primers, som binder till konserverade sekvenser utanför sekvensregionen av intresse och innehåller olika restrik- tiva ställen i varje primer. DNA från HIV-stammar kan därefter förstärkas in yitgg och därefter kan de erhållna oligonukleotiderna klonas i vektorer för sekvensanalys och införlivas med ett vaccin som en kassett representerande en speciell epitop från HIV-stammen.Another method for determining the sequences of a homologous region of other HIV strains is described by Scharf et al., Science (1986) 233: 1076. It utilizes two oligonucleotide primers, which bind to conserved sequences outside the sequence region of interest and contain different restrictive sites in each primer. DNA from HIV strains can then be amplified in vitro and then the resulting oligonucleotides can be cloned into vectors for sequence analysis and incorporated into a vaccine as a cassette representing a particular epitope from the HIV strain.

Det är icke nödvändigt enligt föreliggande uppfinning att de epitoper som ingår i dylika sekvenser är korsreaktiva med avseende på antikroppar mot alla stammar eller arter av HIV. Peptider, som innefattar immunologiska epitoper, vilka skiljer en art eller serogrupp från en annan, kommer till användning vid identifiering av speciella arter eller sero- grupper och kan i själva verket medverka till att identifi- era individer, som är infekterade med en eller flera arter eller serogrupper av HIV. De kan även vara användbara i kombination med andra peptider, från antingen en homolog 506 025 9 region eller en annan neutraliserande region, i terapeutis- ka beredningar.It is not necessary according to the present invention that the epitopes included in such sequences be cross-reactive with respect to antibodies to all strains or species of HIV. Peptides, which comprise immunological epitopes that distinguish one species or serogroup from another, are used in the identification of particular species or serogroups and may in fact help to identify individuals who are infected with one or more species. or serogroups of HIV. They may also be useful in combination with other peptides, from either a homologous region or another neutralizing region, in therapeutic formulations.

Peptiderna av intresse härrör företrädesvis från virusets gp110-region. Av speciellt intresse i denna region är pep- tider, som kodar i den öppna egg-läsram som sträcker sig från ungefär basparet (bp) 6667 till cirka 6774 i LAVBRU- isolatet. Således innefattar olika homologa regioner av andra HIV-isolat de homologa sekvenser som erhålls från Los Alamos Data Bank (med undantag av LAV2), såsom framgår av tabell I.The peptides of interest are preferably derived from the gp110 region of the virus. Of particular interest in this region are peptides, which encode in the open edge reading frame extending from about the base pair (bp) 6667 to about 6774 in the LOWBRU isolate. Thus, different homologous regions of other HIV isolates include the homologous sequences obtained from Los Alamos Data Bank (with the exception of LAV2), as shown in Table I.

Andra peptider, som är lämpliga för generering eller screening med avseende på monoklonala antikroppar, innefat> tar sådana som kodar i den öppna egg-läsramen från cirka bp 7246 till cirka 7317 i LAVBRU. Dylika antikroppar och reaktiva peptider är speciellt användbara i immunoanalys- metoder. 506 nXB2 BH102 BH8 HXB3 HQM BRU ELI ARV2 UHJ2 RFENV 26 Z3 NY5 CDC42 LAV2 HXB2 BH102 BH8 HXB3 H9M BRU EL1 ARV2 WHJ2 RFENV Z6 Z3 NY5 CDC42 LAV2 HXB2 BH102 BH8 HXB3 H9M BRU HAL :LI ARV2 HMJ2 RFLNV 26 Z3 NY5 CDC42 LAV2 025 TABLE 1 TGTACAAGACCCAACAACAATACAACAAAAAGA...............ATCCGTATC CysïhrAr3?roAsnAsnAsnThrArgLysArg...............I1eArgI1e -------------------------- ---Ser------------------------ ---------------------------- --Ly5----------------------_- ---------------------------- --Lys------------------------ ---------------------------- --Ser------------------------ -------------------------- ---Ser------------------------ ---------- --Cly------------ArgGly------------------HisPhe ---Ala-~----TyrGln ------ --Gln ---------------- --ThrPro--- ---------------------------- --Ser------------------Tyr--- ---------- --Tyr------Val---ArgSer---------------LeuSer--- - -------------------------- --Set ---------------- --ThrLys -------- ---TyrLys---------GlnSer---------------ThrPro--- ---------- --GlySerAspLysLys1le------------------ClnSer--- ---------------------- --Lys---Cly------------------A1a--- ---------------- --His------------ValThrLeu...............Other peptides suitable for generation or screening for monoclonal antibodies include those encoding in the open edge reading frame from about bp 7246 to about 7317 in LAVBRU. Such antibodies and reactive peptides are particularly useful in immunoassay methods. 506 nXB2 BH102 BH8 HXB3 HQM BRU ELI ARV2 UHJ2 RFENV 26 Z3 NY5 CDC42 LAV2 HXB2 BH102 BH8 HXB3 H9M BRU EL1 ARV2 WHJ2 RFENV Z6 Z3 NY5 CDC42 LAV2 HXB2 BH102 HHB2 HHB2 HHB2 1 TGTACAAGACCCAACAACAATACAACAAAAAAGA ............... ATCCGTATC CysïhrAr3? RoAsnAsnAsnThrArgLysArg ............... I1eArgI1e ------------- ------------- ---Looks------------------------ --------- ------------------- --Ly5 ----------------------_- ---- ------------------------ --Lys ----------------------- - ---------------------------- --Looks------------------ ------ -------------------------- ---Looks-------------- ---------- ---------- --Cly ------------ ArgGly -------------- ---- HisPhe --- Ala- ~ ---- TyrGln ------ --Gln ---------------- --ThrPro --- --- ------------------------- --See ------------------ Tyr --- ---------- --Tyr ------ Val --- ArgSer --------------- LeuSer --- - ------ -------------------- --Set ---------------- --ThrLys -------- --- TyrLys --------- GlnSer --------------- ThrPro --- ------- --- --GlySerAspLysLys1le ------------------ ClnSer --- ---------------------- --Lys --- Cly ------------------ A1a --- ---------------- --His-- ---------- ValThrLeu ...............

---------- --Gly---Lys---Val---Cln------------------MetLeu CAGAGA.........GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGCAAAAATAGGAAATATG GlnArg. . . . . . . ..GlyProGlyArgAlaPheValTht11eGlyLysI1eGlyAsnMet ...... ---------------- --G1n---LeuTyr---Thr---IleVal---Asplle C1yLeu ---------- --...G1nSerLeuTyrThr---Arg---IlevalSerArgSer ...... ------------------------- --His---Thr---Arg---1leGlyAsp ...... ------------------------- --Arg---Argülu...---Ileßlylle ------------------------- --ValI1eTyrAlaThr---Gln---IleGlyAsp G1yLeu ---------- --...G1nAlaLeuTyrThr---Arg---ArgThrLysIleIle Argïle ---------------- --Lysva1---TyrAlaLys---Gly..... . . . . . ..---------- --Gly --- Lys --- Val --- Cln ------------------ MetLeu CAGAGA ..... .... GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGCAAAAATAGGAAATATG GlnArg. . . . . . . ..GlyProGlyArgAlaPheValTht11eGlyLysI1eGlyAsnMet ...... ---------------- --G1n --- LeuTyr --- Thr --- IleVal --- Asplle C1yLeu ----- ----- --... G1nSerLeuTyrThr --- Arg --- IlevalSerArgSer ...... ------------------------- --His --- Thr --- Arg --- 1leGlyAsp ...... ------------------------- --Arg- --Argülu ...--- Ileßlylle --------------------------ValI1eTyrAlaThr --- Gln --- IleGlyAsp G1yLeu --- ------- --... G1nAlaLeuTyrThr --- Arg --- ArgThrLysIleIle Argïle ---------------- --Lysva1 --- TyrAlaLys --- Gly. ..... . . . . ..

ClyPro ---------- --... ---- --ThrLeuTyrA1aArgGlu ------- --Asplle ............... ---------- --ValTrpTyr---Thr---Glu---LeuGlyAsn Mecser --------------- --Hisval--HisSerHisTyrGlnProIle---Lys ...AGA...CAAGCACATTGT ...Atg...G1nAlaHisCys 331 ------------------ -- 331 ------------------- -- 331 ------------------ -- 331 ------------------- -- 331 ---------------- --- 336 ------- --Arg---Tyr--- 330 I1eI1eGly ---------- -- 330 Ile--Lys... ------- -- 333 Ile ---------------- -- 326 Ile---Lys... ------- -- 343 Gly... ------------- -- 334 Ilefhrßly ---------- -- 326 ------------------- -- 325 Ile ---------------- -- 341 ArgProArg ---- --Met--- 330 309 309 309 309 309 314 316 310 312 306 322 311 306 306 320 302 326 326 326 326 326 331 329 323 327 320 337 327 319 320 335 323 506 025 11 I gag-regionen av LAVBRU-isolatet är p25-aminosyrasekven- serna från cirka 278 till 319 och från 315 till 363 ytter- ligare neutraliserande regioner av HIV. Fackmannen inser att ytterligare neutraliserande regioner av HIV kan identi- fieras baserat på vad som avslöjas i denna patentskrift - i synnerhet uppvisar kombinationer av monoklonala antikrop- par, som är reaktiva med olika HIV-epitoper, neutraliseran- de aktivitet.ClyPro ---------- --... ---- --ThrLeuTyrA1aArgGlu ------- --Asplle ............... - -------- --ValTrpTyr --- Thr --- Glu --- LeuGlyAsn Mecser --------------- --Hisval - HisSerHisTyrGlnProIle --- Lys. ..AGA ... CAAGCACATTGT ... Atg ... G1nAlaHisCys 331 ------------------ - 331 ------------- ------ - 331 ------------------ - 331 ------------------- - - 331 ---------------- --- 336 ------- --Arg --- Tyr --- 330 I1eI1eGly --------- - - 330 Ile - Lys ... ------- - 333 Ile ---------------- - 326 Ile --- Lys ... - ------ - 343 Gly ... ------------- - 334 Ilefhrßly ---------- - 326 ------- ------------ - 325 Ile ---------------- - 341 ArgProArg ---- --Met --- 330 309 309 309 309 309 314 316 310 312 306 322 311 306 306 320 302 326 326 326 326 326 331 329 323 327 320 337 327 319 320 335 323 506 025 11 In the gag region of the LAVBRU isolate, the p25 amino acid sequences are from about 278 to 319 and from 315 to 363 additional neutralizing regions of HIV. Those skilled in the art will recognize that additional neutralizing regions of HIV can be identified based on what is disclosed in this patent specification - in particular, combinations of monoclonal antibodies reactive with various HIV epitopes exhibit neutralizing activity.

Peptid I, som även betecknas peptid 29, kodar i den öppna gg!-läsramen från ungefär aminosyraresten nr. 308 till cirka 328 och har följande aminosyrasekvens, där oligo- peptider som ingår i följande sekvens innefattar linjära epitoper inuti en dylik sekvens: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gin-Arg-Gly- Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y' vari Y och Y', om de är närvarande, var och en represente- rar sekvenser med upp till cirka tjugo aminosyror. När Y och/eller Y' är närvarande kan dessa exempelvis innefatta en eller flera aminosyror från sekvenser med flankamino- syrarester 308 till 328 i HIV-höljessekvensen eller någon del av dessa flanksekvenser. Så exempelvis, men ej begrän- sat härtill, kan Y innefatta hela eller delar av LAVBRU- höljes-aminosyrasekvensen från ungefär rest nr. 301 till 307; och Y' kan innefatta hela eller delar av LAV3RU-höl- jes-aminosyra-sekvensen från ungefär rest nr. 329 till 336: II (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile- Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.Peptide I, also referred to as peptide 29, encodes in the open μg reading frame from approximately amino acid residue no. 308 to about 328 and has the following amino acid sequence, wherein oligopeptides included in the following sequence comprise linear epitopes within such a sequence: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gin-Arg-Arg Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y 'wherein Y and Y', if present, each represent sequences of up to about twenty amino acids . When Y and / or Y 'are present, they may, for example, comprise one or more amino acids from sequences having flank amino acid residues 308 to 328 in the HIV envelope sequence or any part of these flank sequences. Thus, for example, but not limited to, Y may comprise all or part of the LOWBRUB envelope amino acid sequence from approximately residue no. 301 to 307; and Y 'may comprise all or part of the LAV3RU envelope amino acid sequence from approximately residue no. 329 to 336: II (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala- Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

Alternativt kan trunkerade sekvenser av peptider enligt föreliggande uppfinning framställas. I detta avseende kan följande sekvenser från peptid 29 vara speciellt använd- bara: III (29b) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly- Y, vari Y och Y', 506 025 12 vari Y och/eller Y', om de är närvarande, var och en repre- senterar sekvenser med upp till cirka tjugo aminosyra- rester.Alternatively, truncated sequences of peptides of the present invention can be prepared. In this regard, the following sequences from peptide 29 may be particularly useful: III (29b) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Y, wherein Y and Y ', wherein Y and / or Y', if present, each represent sequences of up to about twenty amino acid residues.

IV (29c) Y-I1e-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile- Gly-Lys-Ile-Y' om de är närvarande, var och en represente- rar sekvenser med upp till cirka tjugo aminosyrarester.IV (29c) Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y 'if present, each represents sequences with up to about twenty amino acid residues.

Enligt en annan utföringsform kodar homologa regioner av ARV-2-isolatet av speciellt intresse i den öppna ggy-läs- ramen från ungefär aminosyrarest nr. 306 till cirka 323 och uppvisar typiskt följande aminosyrasekvens, där oligopep- tider som ingår i följande aminosyrasekvens innefattar lin- jära epitoper inom en dylik sekvens: V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala- Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y' vari Y och Y', om de är närvarande, var och en represente- rar från en upp till cirka tjugo eller flera aminosyra- rester. När Y och/eller Y' är närvarande kan de innefatta en eller flera aminosyrarester från sekvenser med flankami- nosyrarester 306 till 323 i ARV-2-höljes-sekvensen eller någon del av dessa flanksekvenser. I synnerhet kan Y inne- fatta hela eller delar av HIV-höljes-aminosyrasekvensen från ungefär rest nr. 299 till 306; Y' kan innefatta hela eller delar av HIV-höljes-aminosyrasekvensen från ungefär rest nr. 324 till 333.In another embodiment, homologous regions of the ARV-2 isolate of particular interest in the open ggy reading frame encode approximately amino acid residue no. 306 to about 323 and typically exhibits the following amino acid sequence, wherein oligopeptides included in the following amino acid sequence include linear epitopes within such a sequence: V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly -Pro-Gly-Arg-Ala- Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y 'wherein Y and Y', if present, each represent from one up to about twenty or more amino acid residues. When Y and / or Y 'are present, they may comprise one or more amino acid residues from sequences having flank amino acid residues 306 to 323 in the ARV-2 envelope sequence or any part of these flank sequences. In particular, Y may comprise all or part of the HIV envelope amino acid sequence from approximately residue no. 299 to 306; Y 'may comprise all or part of the HIV envelope amino acid sequence from approximately residue no. 324 to 333.

Alternativt kan trunkerade sekvenser av peptiden V fram- ställas. I detta avseende kan följande sekvenser vara spe- ciellt användbara: VI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y'; och VII Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala- Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys-Y' vari Y och/eller Y', om de är närvarande, var och en repre- 13 senterar sekvenser med upp till tjugo eller flera amino- syrarester.Alternatively, truncated sequences of peptide V can be prepared. In this regard, the following sequences may be particularly useful: VI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y '; and VII Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys-Y ' wherein Y and / or Y ', if present, each represent sequences of up to twenty or more amino acid residues.

Ett ytterligare exempel innefattar homologa regioner av LAV-2-isolatet, såsom de som kodar i den öppna eng-läsramen från ungefär aminosyrarest nr. 311 till 330, och har typiskt följande sekvens: VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val- Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y' vari Y och/eller Y', om de är närvarande, var och en repre- senterar sekvenser med upp till tjugo eller flera amino- (gg Nature 326:662 (1987), denna beskrivning genom hänvisning därtill.) syrarester. som införlivas med I enlighet med en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahålls nya cellinjer med förmåga att producera monoklonala antikroppar och beredningar innefattande dylika antikroppar, vilka antikroppar har förmåga att i extremt höga titrar (från 102, till 104 - cirka 107 eller däröver) selektivt känna igen neutraliserande regioner, som ingår i en förutbestämd sekvens av höljes-glykoproteinet gp110 eller p25, deras protein-förstadieföreningar, biologiskt uttryckta rekombinanta fusionsproteiner och syntetiska peptider, som innehåller en eller flera epitoper inom den förutbestämda sekvensregionen av gpl10 eller p25. Förelig- gande hybridceller har en identifierbar kromosom, i vilken mikroblinje-DNA har omlagrats till att koda för en anti- kropp med ett bindningsställe för en epitop på gp110 eller p25 som är gemensam för vissa eller samtliga kliniska HIV- isolat. Dessa monoklonala antikroppar kan användas på många olika sätt innefattande diagnos och terapi liksom för att identifiera andra korsreaktiva antikroppar, såsom blocke- rande antikroppar. Peptider eller polypeptider, som inne- håller den epitop eller de epitoper med vilken eller vilka de reagerar, kan finna separat användning som immunogener för vacciner eller som terapeutiska medel. 506 025' 506 025 14 Blockerande peptider Huvudsakligen för användning i samband med föregående pep- tider eller neutraliserande monoklonala antikroppar inne- fattar en annan utföringsform av föreliggande uppfinning användningen av ytterligare peptider eller antikroppar, som interfererar med HIV-bindningen till receptorer för att ytterligare lindra HIV-infektivitet. Företrädesvis kan s.k. "blockerande peptider" med förmåga att inhibera virus- proliferation liksom monoklonala antikroppar, som är speci- fika med avseende på epitoper som ingår i dylika blocke- rande peptider, användas för att öka effektiviteten hos be- handlingar mot HIV-infektioner. HIV-blockerande peptider motsvarar typiskt aminosyrasekvenser hos HIV som antas vara väsentliga för virusets bindning till en värdcell, såsom eng-kodade aminosyrarester ungefär 190 till ungefär 197 av LAVBRU och ungefär 185 till ungefär 192 av ARV2 och HTLV- III(BH-10). Dessa innefattar peptiden T-oktapeptid (Ala- Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) och dess olika derivat (exem- pelvis IX nedan) och analoger (exempelvis XI nedan), vilka beskrivs av Pert et al. (1986, Proc. Natl. Acad. USA 83:9254-9258, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill), lokaliserade på höljes-glykoproteiner (gp1l0 eller 120).A further example includes homologous regions of the LAV-2 isolate, such as those encoded in the open English reading frame from approximately amino acid residue no. 311 to 330, and typically has the following sequence: VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser- His-Tyr-Gln-Pro-Y 'wherein Y and / or Y', if present, each represent sequences of up to twenty or more amino- (gg Nature 326: 662 (1987), this disclosure by reference thereto.) acid residues. Incorporated in accordance with another aspect of the present invention, there are provided novel cell lines capable of producing monoclonal antibodies and preparations comprising such antibodies, which antibodies are capable of selectively sensing in extremely high titers (from 102, to 104 - about 107 or more). neutralizing regions included in a predetermined sequence of the envelope glycoprotein gp110 or p25, their protein precursors, biologically expressed recombinant fusion proteins and synthetic peptides containing one or more epitopes within the predetermined sequence region of gp110 or p25. The present hybrid cells have an identifiable chromosome, in which microbial DNA has been rearranged to encode an antibody with a binding site for an epitope of gp110 or p25 that is common to some or all of the clinical HIV isolates. These monoclonal antibodies can be used in many different ways including diagnosis and therapy as well as to identify other cross-reactive antibodies, such as blocking antibodies. Peptides or polypeptides containing the epitope or epitopes with which they react may find separate use as immunogens for vaccines or as therapeutic agents. Blocking Peptides Mainly for use in connection with the foregoing peptides or neutralizing monoclonal antibodies, another embodiment of the present invention involves the use of additional peptides or antibodies which interfere with HIV binding to receptors to further alleviate HIV infectivity. Preferably, so-called "blocking peptides" capable of inhibiting viral proliferation as well as monoclonal antibodies specific for epitopes contained in such blocking peptides are used to increase the effectiveness of treatments for HIV infections. HIV-blocking peptides typically correspond to amino acid sequences of HIV that are thought to be essential for the binding of the virus to a host cell, such as eng-encoded amino acid residues about 190 to about 197 of LAVBRU and about 185 to about 192 of ARV2 and HTLV-III (BH-10). These include the peptide T-octapeptide (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) and its various derivatives (e.g. IX below) and analogs (e.g. XI below), which are described by Pert et al. (1986, Proc. Natl. Acad. USA 83: 9254-9258, which is incorporated herein by reference), located on envelope glycoproteins (gp110 or 120).

Sci.Sci.

Så exempelvis är blockerande peptider med följande sek- venser av speciellt intresse, företrädesvis med NH2-ter- minal acetylering och COH-terminal amidering: IX (l73D) Y-dAla-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y'; XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y'; XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y'; xïv (190) A Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y'; XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y'; där för varje peptid Y och Y', om de är närvarande, var och en innefattar en aminosyrasekvens med upp till cirka tjugo aminosyror. Epitoper eller antigeniska determinanter inom dessa peptider definieras typiskt av minst ungefär fem angränsande aminosyror och finner exempelvis användning vid imitation av naturligt förekommande antigeniska HIV-ställen för produktion av HIV-reaktiva antikroppar och vacciner.For example, blocking peptides with the following sequences are of particular interest, preferably with NH 2 -terminal acetylation and COH-terminal amidation: IX (1973D) Y-dAla-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr- Y '; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y '; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y '; XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y '; XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y '; xïv (190) A Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y '; XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y '; where for each peptide Y and Y ', if present, each comprises an amino acid sequence of up to about twenty amino acids. Epitopes or antigenic determinants within these peptides are typically defined by at least about five adjacent amino acids and find use, for example, in imitating naturally occurring antigenic HIV sites for the production of HIV-reactive antibodies and vaccines.

Alstring av monoklonala antikroppar Framställning av monoklonala antikroppar kan åstadkommas genom immortalisering av expressionen av nukleinsyrasek- venser, som kodar för antikroppar specifika för HIV, genom att man inför dylika sekvenser, typiskt cDNA som kodar för antikroppen, i ett värddjur med förmåga att odlas i kultur.Generation of Monoclonal Antibodies Production of monoclonal antibodies can be accomplished by immortalizing the expression of nucleic acid sequences encoding antibodies specific for HIV by introducing such sequences, typically cDNA encoding the antibody, into a host animal capable of being cultured. .

Den immortaliserade cellinjen kan vara en däggdjurscel- linje, som har transformerats via onkogenes, genom trans- fektion, mutation eller liknande. Dylika celler innefattar myelomlinjer, lymfomlinjer eller andra cellinjer med för- måga att stödja expressionen och utsöndringen av antikrop- pen in vitro. Antikroppen kan vara ett naturligt förekom- mande immunoglobulin från ett däggdjur, som framställs genom transformation av en lymfocyt, speciellt en spleno- cyt, med hjälp av ett virus eller genom fusion av lymfocy- ten med en neoplastisk cellinje, exempelvis ett myelom, för framställning av en hybridcellinje. Typiskt erhålls spleno- cyten från ett djur, som har immuniserats mot HIV-virus eller ett fragment därav innehållande ett epitopiskt stäl- le.The immortalized cell line may be a mammalian cell line which has been transformed via oncogenesis, by transfection, mutation or the like. Such cells include myeloma lines, lymphoma lines or other cell lines capable of supporting the expression and secretion of the antibody in vitro. The antibody may be a naturally occurring mammoglobulin from a mammal, which is produced by transformation of a lymphocyte, especially a splenocyte, by means of a virus or by fusion of the lymphocyte with a neoplastic cell line, for example a myeloma, to produce of a hybrid cell line. Typically, the splenocyte is obtained from an animal that has been immunized against the HIV virus or a fragment thereof containing an epitopic site.

Immuniseringsprotokoll är väl kända och kan variera i avsevärd grad men ändå vara effektiva. 5; Goding, Monoclo- nal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 2:a upplagan (1986), som införlivas med denna beskrivning 506 025 506 025 16 genom hänvisning därtill. Upplöst virus, syntetiska pep- tider och bakteriella fusionsproteiner, som innehåller antigeniska fragment av gpl10- eller p25-molekylen, kan användas som immunogener. Företrädesvis anrikas immunogenen av upplöst virus, peptider eller rekombinanta proteiner med avseende på proteiner eller fragment därav, som innehåller de epitoper för vilka antikropproducerande B-celler eller splenocyter önskas. Närmare bestämt kan lösningar, som innehåller upplösta viruslysat eller -extrakt, eller över- liggande vätskor av biologiskt uttryckta rekombinanta pro- teiner eller upplösta expressionsvektorer anrikas med avseende på glykoproteiner, om så önskas under användning av reningsmetoder, exempelvis polyakrylamidgel-elektrofo- Lektinaffinitetsrening är en föredragen och bekväm metod för rening av gpll0 och andra glykoproteiner, exem- IBS . pelvis affinitetsrening under användning av linslektin. Den utsträckning i vilken glykoproteinerna renas från lös- ningarna för användning som immunogen kan variera inom vida gränser, exempelvis från mindre än 50%, vanligen minst 75 till 95%, företrädesvis 95 till 99% och i synnerhet till absolut homogenitet.Immunization protocols are well known and can vary considerably but still be effective. 5; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 2nd Edition (1986), which is incorporated herein by reference. Dissolved viruses, synthetic peptides and bacterial fusion proteins, which contain antigenic fragments of the gp110 or p25 molecule, can be used as immunogens. Preferably, the immunogen is enriched for dissolved virus, peptides or recombinant proteins with respect to proteins or fragments thereof which contain the epitopes for which antibody-producing B cells or splenocytes are desired. More specifically, solutions containing dissolved virus lysates or extracts, or supernatants of biologically expressed recombinant proteins or dissolved expression vectors may be enriched for glycoproteins, if desired using purification methods, for example polyacrylamide gel electrophoresis. preferred and convenient method for the purification of gp110 and other glycoproteins, e.g. IBS. pelvic affinity purification using lens lectin. The extent to which the glycoproteins are purified from the solutions for use as an immunogen can vary within wide limits, for example from less than 50%, usually at least 75 to 95%, preferably 95 to 99% and in particular to absolute homogeneity.

Då proteinerna har renats i önskad utsträckning kan de suspenderas eller spädas i en lämplig fysiologisk bärare för immunisering eller kan kopplas till ett adjuvans. En föredragen teknik innebär exempelvis att man adsorberar proteinerna och fragment därav på linslektinagaros eller någon annan makromolekylär bärare för injektion. Immunogena mängder av antigeniska preparat, som är anrikade med av- seende på HIV-proteiner innefattande gpll0-glykoprotein och p25-kärnprotein eller antigeniska delar därav, injiceras, vanligen i koncentrationer inom intervallet från 1 pg till mg/kg värddjur. Administreringen kan ske genom injek- tion, exempelvis intramuskulärt, peritonealt, subkutant, intravenöst, etc. Administrering kan ske en gång eller vid ett flertal tillfällen, vanligen med en till fyra veckors intervall. Immuniserade djur övervakas med avseende på produktion av antikropp mot de önskade antigenerna, där- 506 025 17 efter avlägsnas mjältarna och B-mjältlymfocyter isoleras och fusioneras med en myelomcellinje eller transformeras.Once the proteins have been purified to the desired extent, they can be suspended or diluted in a suitable physiological carrier for immunization or can be coupled to an adjuvant. A preferred technique involves, for example, adsorbing the proteins and fragments thereof on lentil lectin agarose or another macromolecular carrier for injection. Immunogenic amounts of antigenic preparations enriched for HIV proteins including gp1010 glycoprotein and p25 core protein or antigenic moieties thereof are injected, usually in concentrations ranging from 1 pg to mg / kg of host animal. The administration can be by injection, for example intramuscularly, peritoneally, subcutaneously, intravenously, etc. Administration can be done once or on several occasions, usually at one to four week intervals. Immunized animals are monitored for the production of antibody to the desired antigens, after which the spleens are removed and B-spleen lymphocytes are isolated and fused with a myeloma cell line or transformed.

Transformationen eller fusionen kan utföras på konventio- nellt sätt och fusionstekniken beskrivs i ett stort antal patent, exempelvis i amerikanska patenten 4 172 124, 4 350 683, 4 363 799, 4 381 292 och 4 423 147. åg ëygg Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980) och däri givna hänvisningar, vilka samtliga införlivas med denna beskriv- ning genom hänvisning därtill, och Goding ovan.The transformation or fusion can be performed in a conventional manner and the fusion technique is described in a large number of patents, for example in U.S. Patents 4,172,124, 4,350,683, 4,363,799, 4,381,292 and 4,423,147. And Kennett et al. Monoclonal Antibodies (1980) and references therein, all of which are incorporated herein by reference, and Goding above.

De immortaliserade cellinjerna kan klonas och underkastas screening i enlighet med konventionell teknik och antikrop- par i de överliggande cellvätskorna påvisas, vilka har för- måga att binda till de önskade virala gpll0 - eller p25- HIV-proteinerna, rekombinanta fusionsproteiner eller synte- tiska peptider, som innehåller den önskade epitopiska regionen. De lämpliga immortaliserade cellinjerna kan där- efter få växa in vitro eller injicieras i peritonealhålan hos ett lämpligt värddjur för produktion av askitesvätska.The immortalized cell lines can be cloned and screened according to conventional techniques and antibodies in the overlying cell fluids are detected which are capable of binding to the desired viral gp110 or p25 HIV proteins, recombinant fusion proteins or synthetic peptides. , which contains the desired epitopic region. The appropriate immortalized cell lines may then be grown in vitro or injected into the peritoneal cavity of a suitable host animal for the production of ascites fluid.

Eftersom de överliggande vätskorna innehåller vissa anti- kroppar enligt föreliggande uppfinning, som är kända att vara specifika med avseende på ingående epitoper, exempel- vis inom de regioner som kodas av den genomiska LAVBRU- regionen från cirka bp6688 till cirka bp6750 (kodande pep- tid 29) eller från cirka bp7246 till cirka 7317 (kodande peptid 36) (bp-numreringen enligt Wain-Hobson et al., Cell 44:9 1985, som införlivas med denna beskrivning genom hän- visning därtill), kan de underkastas screening i konkurrens med föreliggande monoklonala antikroppar i en konkurrens- analys. Således kan ytterligare immortaliserade hybridom- cellinjer med de önskade bindningsegenskaperna lätt fram- ställas från en mångfald källor baserat på tillgängligheten av föreliggande antikroppar, som är specifika med avseende på det speciella antigenet i fråga. Alternativt kan dessa cellinjer fusioneras med andra neoplastiska B-celler, där dylika andra B-celler kan tjäna som recipienter för geno- misk DNA, som kodar för antikroppen. 506 025 18 Ehuru neoplastiska B-celler från gnagare, i synnerhet rått- djur, föredras kan andra däggdjursarter användas såsom har- djur, nötkreatur, får, häst, svin, fågel eller liknande.Since the supernatants contain certain antibodies of the present invention, which are known to be specific for constituent epitopes, for example within the regions encoded by the LAVBRU genomic region from about bp6688 to about bp6750 (coding peptide 29) or from about bp7246 to about 7317 (coding peptide 36) (the bp numbering of Wain-Hobson et al., Cell 44: 9 1985, which is incorporated herein by reference), they may be subjected to competitive screening. with the present monoclonal antibodies in a competition assay. Thus, additional immortalized hybridoma cell lines with the desired binding properties can be readily prepared from a variety of sources based on the availability of the present antibodies, which are specific for the particular antigen in question. Alternatively, these cell lines may be fused to other neoplastic B cells, where such other B cells may serve as recipients of genomic DNA encoding the antibody. Although rodent neoplastic B cells, especially rat animals, are preferred, other mammalian species may be used such as hares, cattle, sheep, horses, pigs, birds or the like.

Immunisering av dessa djur kan lätt utföras och deras lymfocyter, i synnerhet splenocyter, kan erhållas för fusioner.Immunization of these animals can be easily performed and their lymphocytes, in particular splenocytes, can be obtained for fusions.

De monoklonala antikroppar som utsöndras av de transforme- rade eller hybrida cellinjerna kan tillhöra vilken som helst av immunoglobulinklasserna eller -underklasserna, såsom IgM, IgD, IgA, IgG1_4, eller IgE. Eftersom IgG är den isotop som vanligast utnyttjas vid diagnostisk analyser föredras den ofta. De monoklonala antikropparna kan använ- das intakta eller som fragment såsom Fv, Fab, F(ab')2, men vanligtvis intakta.The monoclonal antibodies secreted by the transformed or hybrid cell lines may belong to any of the immunoglobulin classes or subclasses, such as IgM, IgD, IgA, IgG1_4, or IgE. Because IgG is the isotope most commonly used in diagnostic assays, it is often preferred. The monoclonal antibodies can be used intact or as fragments such as Fv, Fab, F (ab ') 2, but usually intact.

För att komma förbi den eventuella antigeniciteten hos en människa för en monoklonal antikropp, som härrör från ett annat djur än människa, kan chimera antikroppar konstrue- ras, vari det antigenbindande fragmentet av en immunoglobu- linmolekyl (variabel region) via en peptidbindning kopplas till åtminstone en del av ett annat protein som ej känns igen som främmande av människor, såsom en del av en human- immunoglobulinmolekyl. Detta kan åstadkommas genom fusione- ring av exonerna inom djurets variabla region med human- kappa - eller - gamma-konstant region-exoner. Olika tekni- ker är kända för fackmannen, såsom de som beskrivs i PCT 86/01533, EPl71496, och EP173494, med denna beskrivning genom hänvisning därtill. vars innehåll införlivas Farmaceutiska beredningar och användning De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning, som uppvisar neutraliserande aktivitet, såsom de som reagerar med ett epitopiskt ställe på gpll0 eller p25 eller som reagerar med en blockerande peptid, kan även införlivas som komponenter i farmaceutiska beredningar för att försvaga HIV-infektioner. Beredningen bör innehålla en terapeutisk vatten, alkohol, 19 eller profylaktisk mängd av minst en av de monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning med en farmaceutiskt effektiv bärare. En farmaceutisk bärare bör vara en kom- patibel ogiftig substans, som är lämplig för administrering av de monoklonala antikropparna till patienten. Sterilt fetter, vaxer och inerta fasta ämnen kan användas som bärare. Farmaceutiskt godtagbara adjuvantia (buffertmedel, dispergeringsmedel) kan även införlivas med den farmaceutiska beredningen. Dylika beredningar kan innehålla en enda monoklonal antikropp, som är specifik för stammar av HIV med höljes-glykoproteiner, som innehåller ett epitopiskt ställe inom en region, som kodas av bp6688- bp6750. Alternativt kan en farmaceutisk beredning innehålla en eller flera monoklonala antikroppar för bildning av en "cocktail". Så exempelvis är en cocktail, som innehåller monoklonala antikroppar mot de olika stammarna av HIV, en universalprodukt med terapeutisk eller profylaktisk aktivi- tet mot det stora flertalet av de kliniska isolaten av HIV.To bypass the possible antigenicity of a human to a monoclonal antibody derived from a non-human animal, chimeric antibodies can be constructed in which the antigen-binding fragment of an immunoglobulin molecule (variable region) is linked via a peptide bond to at least a portion of another protein that is not recognized as foreign by humans, such as a portion of a human immunoglobulin molecule. This can be accomplished by fusing the exons within the animal's variable region with human - or - gamma - constant region exons. Various techniques are known to those skilled in the art, such as those described in PCT 86/01533, EP171496, and EP173494, with this description by reference thereto. The contents of which are incorporated Pharmaceutical preparations and uses The monoclonal antibodies of this invention which exhibit neutralizing activity, such as those which react with an epitopic site on gp110 or p25 or which react with a blocking peptide, may also be incorporated as components in pharmaceutical preparations for attenuation. HIV infections. The formulation should contain a therapeutic water, alcohol, or prophylactic amount of at least one of the monoclonal antibodies of this invention with a pharmaceutically effective carrier. A pharmaceutical carrier should be a compatible non-toxic substance suitable for administering the monoclonal antibodies to the patient. Sterile fats, waxes and inert solids can be used as carriers. Pharmaceutically acceptable adjuvants (buffering agents, dispersants) may also be incorporated into the pharmaceutical formulation. Such formulations may contain a single monoclonal antibody specific for strains of HIV with envelope glycoproteins which contain an epitopic site within a region encoded by bp6688-bp6750. Alternatively, a pharmaceutical preparation may contain one or more monoclonal antibodies to form a "cocktail". For example, a cocktail containing monoclonal antibodies to the various strains of HIV is a universal product with therapeutic or prophylactic activity against the vast majority of the clinical isolates of HIV.

Cocktailen kan innehålla monoklonala antikroppar, som binder till andra proteiner eller glykoproteiner av HIV än gp110 eller p25, såsom exempelvis gp41-glykoprotein eller p34-nukleas/integras. Molförhållandet mellan de olika mono- klonala antikroppskomponenterna skiljer sig vanligen icke åt med mer än en faktor 10, vanligen icke mer än en faktor och molförhållandet är vanligen cirka 1:1-2 för var och en av de övriga antikroppskomponenterna.The cocktail may contain monoclonal antibodies that bind to HIV proteins or glycoproteins other than gp110 or p25, such as, for example, gp41 glycoprotein or p34 nuclease / integrase. The molar ratio of the various monoclonal antibody components usually does not differ by more than one factor, usually not more than one factor, and the molar ratio is usually about 1: 1-2 for each of the other antibody components.

De monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning kan användas som separat administrerade beredningar, som ges tillsammans med andra anti-retrovirala medel innefat- tande blockerande peptider. Den nuvarande ståndpunkten vad gäller utvecklingen av anti-retrovirala medel och av anti- HIV-medel i synnerhet har sammanfattat av Mitsuya et al., Nature 325:773-778, 1987, som införlivas med denna beskriv- ning genom hänvisning därtill.The monoclonal antibodies of the present invention can be used as separately administered formulations, which are co-administered with other antiretroviral agents including blocking peptides. The present position regarding the development of anti-retroviral agents and of anti-HIV agents in particular has been summarized by Mitsuya et al., Nature 325: 773-778, 1987, which is incorporated herein by reference.

De monoklonala antikropparna, peptiderna och farmaceutiska beredningarna därav enligt denna uppfinning är speciellt 506 025 506 025 användbara för oral eller parenteral administrering. Före- trädesvis kan de farmaceutiska beredningarna administreras parenteralt, dvs. subkutant, intramuskulärt eller intra- venöst. Således tillhandahåller denna uppfinning bered- ningar för parenteral administrering, vilka innefattar en lösning av den monoklonala antikroppen, en peptid eller en cocktail därav upplöst i en godtagbar bärare, företrädesvis en vattenhaltig sådan. En mångfald vattenhaltiga bärare kan användas, exempelvis vatten, buffrat vatten, O,4% saltlös- ning, O,3% glycin och liknande. Dessa lösningar är sterila och allmänt fria från partikelformigt material. Bered- ningarna kan steriliseras medelst konventionell välkänd steriliseringsteknik. Beredningarna kan innehålla sådana farmaceutiskt godtagbara hjälpsubstanser som krävs för att approximera fysiologiska betingelser, såsom pH-reglerande medel och buffertmedel, toxicitetsreglerande medel och liknande, exempelvis natriumacetat, natriumklorid, kalium- klorid, kalciumklorid, natriumlaktat, etc. Koncentrationen av antikropp i dessa beredningar kan variera inom vida gränser, dvs. från mindre än cirka 0,5 vikt-%, vanligen minst cirka 1 vikt-%, till så mycket som 15 eller 20 vikt-% och valet därav baserar sig primärt på vätskevolymer, vis- kositeter, etc. alltefter det valda administreringssättet.The monoclonal antibodies, peptides and pharmaceutical formulations thereof of this invention are particularly useful for oral or parenteral administration. Preferably, the pharmaceutical preparations can be administered parenterally, i.e. subcutaneously, intramuscularly or intravenously. Thus, this invention provides formulations for parenteral administration which comprise a solution of the monoclonal antibody, a peptide or a cocktail thereof dissolved in an acceptable carrier, preferably an aqueous one. A variety of aqueous carriers can be used, for example, water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine and the like. These solutions are sterile and generally free of particulate matter. The preparations can be sterilized by conventional well-known sterilization techniques. The formulations may contain such pharmaceutically acceptable excipients as are required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting agents and buffering agents, toxicity adjusting agents and the like, for example, sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate, etc. The concentration of antibody in these formulations vary within wide limits, ie. from less than about 0.5% by weight, usually at least about 1% by weight, to as much as 15 or 20% by weight, and the choice thereof is based primarily on liquid volumes, viscosities, etc., depending on the mode of administration chosen.

Således kan en typisk farmaceutisk beredning för intramus- kulär injektion framställas innehållande 1 ml sterilt buffrat vatten och 50 mg monoklonal antikropp. En typisk beredning för intravenös infektion kan framställas inne- hållande 250 ml steril Ringers lösning och 150 mg mono- klonal antikropp. Aktuella metoder för framställning av parenteralt administrerbara beredningar är kända för fack- mannen och beskrivs närmare i detalj exempelvis i Reming- ton's Pharmaceutical Science, 15:e upplagan, Mack Publish- ing Company, Easton, Pennsylvania (1980), som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.Thus, a typical pharmaceutical preparation for intramuscular injection can be prepared containing 1 ml of sterile buffered water and 50 mg of monoclonal antibody. A typical preparation for intravenous infection may be prepared containing 250 ml of sterile Ringer's solution and 150 mg of monoclonal antibody. Current methods for preparing parenterally administrable preparations are known to those skilled in the art and are described in more detail, for example, in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), which is incorporated herein by reference. by reference thereto.

De monoklonala antikropparna och peptiderna enligt denna uppfinning kan lyofiliseras för lagring och rekonstitueras 506 025 21 i en lämplig bärare före användning. Denna teknik har visats sig vara effektiv med konventionella immunoglobuli- ner och inom tekniken känd lyofiliserings- och rekonstitue- ringsteknik kan användas. Det är uppenbart för fackmannen att lyofilisering och rekonstituering kan leda till varie- rande grad av förlust av antikroppsaktivitet (exempelvis med konventionella immunoglobuliner tenderar IgM-antikrop- par att uppvisa större aktivitetsförlust än IgG-antikrop- par) och att användningsnivàerna mäste justeras för kompen- sation därav.The monoclonal antibodies and peptides of this invention may be lyophilized for storage and reconstituted in a suitable vehicle prior to use. This technique has been shown to be effective with conventional immunoglobulins and lyophilization and reconstitution techniques known in the art can be used. It is obvious to those skilled in the art that lyophilization and reconstitution can lead to varying degrees of loss of antibody activity (for example, with conventional immunoglobulins, IgM antibodies tend to show greater loss of activity than IgG antibodies) and that levels of use must be adjusted for sation thereof.

Beredningarna, som innehåller föreliggande monoklonala antikroppar, peptider eller cocktailer därav, kan admini- streras för profylaktisk och/eller terapeutisk behandling av HIV-infektioner. För terapeutiskt bruk administreras beredningarna till en patient, som redan har infekterats med HIV, i en mängd som är tillräcklig för att bota eller åtminstone partiellt hindra infektionen och dess komplika- tioner. En mängd, som är adekvat för att åstadkomma detta, definieras som en "terapeutiskt effektiv dos". Mängder, som är effektiva för detta ändamål, beror på infektionens svårighetsgrad och det allmänna tillståndet hos patientens eget immunsystem men varierar i allmänhet från cirka 1 till cirka 200 mg antikropp per kilogram kroppsvikt, varvid doser av 5 - 25 mg per kilogram vanligen används. Man måste hålla i minnet att materialen enligt denna uppfinning allmänt kan användas för allvarliga sjukdomstillstånd, dvs. livshotande eller potentiellt livshotande situationer. I vissa fall är det möjligt och kan kännas önskvärt av den behandlande läkaren att administrera ett avsevärt överskott av dessa antikroppar.The formulations containing the present monoclonal antibodies, peptides or cocktails thereof may be administered for the prophylactic and / or therapeutic treatment of HIV infections. For therapeutic use, the preparations are administered to a patient who has already been infected with HIV in an amount sufficient to cure or at least partially prevent the infection and its complications. An amount adequate to accomplish this is defined as a "therapeutically effective dose". Amounts effective for this purpose depend on the severity of the infection and the general condition of the patient's own immune system but generally range from about 1 to about 200 mg of antibody per kilogram of body weight, with doses of 5 to 25 mg per kilogram usually being used. It must be borne in mind that the materials of this invention can generally be used for serious disease states, i.e. life-threatening or potentially life-threatening situations. In some cases, it is possible and may be desirable for the attending physician to administer a significant excess of these antibodies.

Vid profylaktiska tillämpningar administreras beredningar, som innehåller föreliggande peptider, antikroppar eller en cocktail därav, till en patient, som ej redan har infek- terats av HIV men kanske nyligen har exponerats eller miss- tänks ha exponerats härför eller löper risk att exponeras för viruset, i syfte att förstärka patientens motstånd mot _ mg/kg, speciellt 0,5 - 506 025 22 en dylik potentiell infektion eller att vaccinera mot viruset. En sådan mängd definieras som en "profylaktiskt effektiv dos". exakta mängderna på patientens hälsotillstånd och allmänna Vid denna användning beror även här de immunitetsnivå men varierar i allmänhet från 0,1 till 25 2,5 mg/kg.In prophylactic applications, preparations containing the present peptides, antibodies or a cocktail thereof are administered to a patient who has not already been infected with HIV but may have recently been exposed or is suspected of being exposed to it or is at risk of being exposed to the virus. in order to strengthen the patient's resistance to _ mg / kg, in particular 0.5 - 506 025 22 such a potential infection or to vaccinate against the virus. Such an amount is defined as a "prophylactically effective dose". exact amounts on the patient's state of health and general In this use, too, they depend on the level of immunity but generally vary from 0.1 to 2.5 mg / kg.

Enkel- eller multipeladministreringar av beredningarna kan utföras med dosnivåer och doseringsmönster som bestämmes av den behandlande läkaren. Under alla omständigheter bör de farmaceutiska beredningarna tillhandahålla en mängd av antikroppen eller antikropparna enligt denna uppfinning som är tillräcklig för effektiv behandling av patienten.Single or multiple administrations of the formulations can be performed with dosage levels and dosage patterns determined by the attending physician. In any case, the pharmaceutical preparations should provide an amount of the antibody or antibodies of this invention that is sufficient for effective treatment of the patient.

Vidare kan de monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning finna användning som en målspecifik bärarmole- kyl. ett immunotoxin eller ett radioaktivt material eller läke- medel för bildning av en radiofarmakon. Metoder för fram- En antikropp kan bindas till ett toxin för bildning av ställning av immunotoxiner och radiofarmakoner är väl kända (se exempelvis Cancer Treatment Reports 68:31? (1984)).Furthermore, the monoclonal antibodies of the present invention may find use as a target-specific carrier molecule. an immunotoxin or a radioactive material or medicament for the formation of a radiopharmaceutical. Methods for developing An antibody can be bound to a toxin to form immunotoxin and radiopharmaceuticals are well known (see, for example, Cancer Treatment Reports 68:31? (1984)).

Det är även möjligt att heteroaggregat av monoklonala antikroppar enligt föreliggande uppfinning och humana T- cellaktivatorer, såsom monoklonala antikroppar mot CD3- antigenet eller mot FC-gamma-receptorn på T-celler, kan förmå humana T-celler eller FC-gamma-bärande celler (såsom K-celler eller neutrofiler) att döda HIV-infekterade celler via antikroppberoende cellstyrd cytolys (ADCC). Dylika heteroaggregat kan exempelvis sammanfogas genom kovalent förnätning av anti-HIV-antikropparna till anti-CD3-anti- kropparna under användning av det hetero-bifunktionella reagenset N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol-propionat, såsom beskrivs av Karpowsky et al., Q¿ Exp. Med. 160:1686 (1984), som införlivas med denna beskrivning genom hänvis- ning därtill.It is also possible that heteroaggles of monoclonal antibodies of the present invention and human T cell activators, such as monoclonal antibodies to the CD3 antigen or to the FC gamma receptor on T cells, may induce human T cells or FC gamma-bearing cells. (such as K cells or neutrophils) to kill HIV-infected cells via antibody-dependent cell-directed cytolysis (ADCC). Such heteroaggregates can be joined, for example, by covalent crosslinking of the anti-HIV antibodies to the anti-CD3 antibodies using the hetero-bifunctional reagent N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol-propionate, as described by Karpowsky et al. , Q¿ Exp. Med. 160: 1686 (1984), which is incorporated herein by reference.

Föreliggande peptidberedningar kan som sådana även finna 506 025 23 användning terapeutiskt, varvid administrering därav resul- terar i reduktion eller eliminering av HIV hos ett infek- terat värddjur. Dessa beredningar, såsom peptid 29, de blockerande peptiderna och peptid 126, vilken sistnämnda avlöjas i den samtidigt anhängiga amerikanska patentan- sökningen 930,785, vilken införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill, kan administreras i lämpliga fysiologiska bärare intravenöst, subkutant, intramuskulärt, intraperitonealt, etc. Olika bärare innefattar fosfatbuff- rad saltlösning, vatten, kaliumklorid, natriumlaktat eller liknande. Koncentrationen av peptiderna kommer att variera inom vida gränser beroende på den slutliga användningen, aktiviteten och administreringssättet. Företrädesvis har peptiderna COOH-terminal amidering, NH2-terminal amidering, NH2-terminal formylering eller annan farmaceutiskt godtag- bar derivatisering. Tillsatsen av blockerande peptider till peptiderna immiterar en neutraliserande HIV-region och/ eller de specifikt reaktiva antikropparna enligt förelig- gande uppfinning resulterar i signifikant ökad terapeutisk effektivitet. Andra anti-HIV-medel kan även införlivas med beredningarna (andra medel än de monoklonala antikroppar som binder peptiderna), såsom 3'-azido-3'-deoxitymidin, 2', 3'-dideoxicytidin, 2',3'-dideoxi-2',3'-didehydrocytidin, etc.As such, the present peptide formulations may also find therapeutic use, the administration thereof resulting in the reduction or elimination of HIV in an infected host animal. These formulations, such as peptide 29, the blocking peptides and peptide 126, the latter of which is disclosed in co-pending U.S. Patent Application 930,785, which is incorporated herein by reference, may be administered in suitable physiological carriers intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, etc. Various carriers include phosphate buffered saline, water, potassium chloride, sodium lactate or the like. The concentration of the peptides will vary widely depending on the end use, activity and route of administration. Preferably, the peptides have COOH-terminal amidation, NH2-terminal amidation, NH2-terminal formylation or other pharmaceutically acceptable derivatization. The addition of blocking peptides to the peptides mimics a neutralizing HIV region and / or the specifically reactive antibodies of the present invention results in significantly increased therapeutic efficacy. Other anti-HIV agents may also be incorporated into the formulations (agents other than the monoclonal antibodies that bind the peptides), such as 3'-azido-3'-deoxythymidine, 2 ', 3'-dideoxycytidine, 2', 3'-dideoxy 2 ', 3'-didehydrocytidine, etc.

Användning av monoklonala antikroppar vid immunoaffinitets- rening Monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende på polypeptider innehållande gp11O eller andra antigeniska determinanter, speciellt sådana antigeniska determinanter som erhålls från biologiskt uttryckta rekombinanta fusions- proteiner eller lysat eller extrakt av odlad HIV, är spe- ciellt fördelaktiga för användning i reningsprotokoll. I allmänhet har antikropparna affinitetsassociations-konstan- ter av storleksordningen 108 till l012M. Dylika antikroppar kan användas för att rena de rekombinanta fusionsproteiner- na från odlingsmediet i rekombinanta expressionssystem, om 506 025 24 det uttryckta proteinet utsöndras, eller från komponenterna av det upplösta biologiska expressionssystemet, om det ej utsöndras. I allmänhet kopplas de monoklonala antikroppar som har förmåga att reagera med gpl1O eller andra antige- niska determinanter till eller immobiliseras på ett sub- strat eller bärare. Den lösning som innehåller de HIV- antigeniska determinanterna bringas därefter i kontakt med den immobiliserade antikroppen under betingelser, som är lämpliga för bildning av immunkomplex mellan antikroppen och de polypeptider som innehåller de antigeniska gpll0- determinanterna. Icke-bundet material separeras från de bundna immunkomplexen, vilka komplex eller antigeniska gpl10-fragment därefter separeras från bäraren.Use of Monoclonal Antibodies in Immunoaffinity Purification Monoclonal antibodies specific for polypeptides containing gp110 or other antigenic determinants, especially those antigenic determinants obtained from biologically expressed recombinant fusion proteins or lysates or extracts of cultured HIV, are specific. advantageous for use in purification protocols. In general, the antibodies have affinity association constants on the order of 108 to 100 M. Such antibodies can be used to purify the recombinant fusion proteins from the culture medium in recombinant expression systems, if the expressed protein is secreted, or from the components of the dissolved biological expression system, if it is not secreted. In general, those monoclonal antibodies capable of reacting with gp110 or other antigenic determinants are coupled to or immobilized on a substrate or carrier. The solution containing the HIV antigenic determinants is then contacted with the immobilized antibody under conditions suitable for the formation of immune complexes between the antibody and the polypeptides containing the antigenic gp110 determinants. Unbound material is separated from the bound immune complexes, which complex or antigenic gp110 fragments are then separated from the carrier.

Typiskt renas de monoklonala antikropparna grovt från askitesvätska eller överliggande cellodlingsvätskor innan kopplingen till en bärare. Dylika förfaranden är väl kända av fackmannen och kan innefatta fraktionering med neutrala salter i hög koncentraion. Andra metoder, såsom DEAE-kroma- tografi, gelfiltreringskromatografi, preparativ gelelektro- fores eller protein A-affinitets-kromatografi, kan även användas för att rena den monoklonala antikroppen innan den används som ett immunoadsorbens.Typically, the monoclonal antibodies are roughly purified from ascites fluid or overlying cell culture fluids prior to coupling to a carrier. Such processes are well known to those skilled in the art and may involve fractionation with neutral salts in high concentration. Other methods, such as DEAE chromatography, gel filtration chromatography, preparative gel electrophoresis or protein A affinity chromatography, can also be used to purify the monoclonal antibody before it is used as an immunoadsorbent.

Den bärare på vilken de monoklonala antikropparna immobili- seras bör ha följande allmänna egenskaper: (a) svaga in- teraktioner med proteiner i allmänhet för att till ett minimum nedbringa icke-specifik bindning, (b) goda flödes- egenskaper, som medger genomflöde av högmolekylära mate- rial, (c) skall uppvisa kemiska grupper, som kan aktiveras eller modifieras för att medge kemisk bindning av den monoklonala antikroppen, (d) fysikaliskt och kemiskt stabil under de betingelser som används för att koppla den mono- klonala antikroppen och (e) stabil mot de betingelser och de beståndsdelar i buffertmedlen som krävs för adsorption och eluering av antigenet. Vissa bärare, som vanligen används, är agaros, derivatiserade polystyrener, polysacka- rider, polyakrylamidkulor, aktiverad cellulosa, glas och 506 025 liknande. Olika kemiska metoder finns för koppling av antikroppar till substratbärare. Se allmänt Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology 36:29 (1972). Antikropparna enligt föreliggande uppfinning kan kopplas direkt till bäraren eller alternativt via en "länkare“ eller distans- ärm.The carrier on which the monoclonal antibodies are immobilized should have the following general characteristics: (a) weak interactions with proteins in general to minimize non-specific binding, (b) good flow properties, which allow flow of high molecular weight materials, (c) have chemical moieties that can be activated or modified to allow chemical binding of the monoclonal antibody, (d) physically and chemically stable under the conditions used to couple the monoclonal antibody; and ( e) stable to the conditions and constituents of the buffering agents required for adsorption and elution of the antigen. Some carriers commonly used are agarose, derivatized polystyrenes, polysaccharides, polyacrylamide beads, activated cellulose, glass and the like. Various chemical methods exist for coupling antibodies to substrate carriers. See generally Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology 36:29 (1972). The antibodies of the present invention can be coupled directly to the carrier or alternatively via a "linker" or spacer sleeve.

Allmänna betingelser, som krävs för immobilisering av mono- klonola antikroppar på kromatografiska bärare, är väl kända inom tekniken. Se exempelvis Tijssen, P., 1985, som införlivas med denna Practice and Theorv of Enzvme Immunoassav, beskrivning genom hänvisning därtill. De kopplingsförfaran- den som används beror något på egenskaperna och typen av den antikropp som skall kopplas. Monoklonala antikroppar uppvisar egenskaper, som vanligen är oföränderliga från sats till sats, vilket därför möjliggör att sådana be- tingelser kan optimeras. Koppling sker typiskt via kovalen- ta bindningar.General conditions required for the immobilization of monoclonal antibodies on chromatographic carriers are well known in the art. See, for example, Tijssen, P., 1985, which is incorporated herein by reference in this Practice and Theorv of Enzyme Immunoassav. The coupling procedures used depend somewhat on the properties and type of antibody to be coupled. Monoclonal antibodies exhibit properties that are usually unchanged from batch to batch, which therefore enables such conditions to be optimized. Coupling typically takes place via covalent bonds.

En suspension av extrakt eller lysat av HIV-virus, den överliggande vätskan från ett odlat biologiskt expression- system eller en suspension av de upplösta cellerna sätts därefter till separationsmatrisen. Blandningen inkuberas under sådana betingelser och under en sådan tid att immun- komplexbilding kan ske, vanligen minst 30 min, mera vanligt 2 - 24 timmar. De immunkomplex som innehåller polypeptider med antigeniska delar av gpl10 separeras därefter från blandningen. Typiskt avlägsnas blandningen exempelvis genom eluering och de bundna immunkomplexen tvättas med rikligt med adsorptionsbuffert. Immunkomplexen kan därefter elueras från separationsmatrisen under användning av ett eluerings- medel, som är kompatibelt med den speciella bärare i fråga som används och som är välkänd för fackmannen. Även de i polypeptider som innehåller gp110 eller andra antigeniska delar kan selektivt avlägsnas. Så exempelvis kan peptider, som innehåller en epitop, vilken känns igen av antikroppar- na, användas för att konkurrera med antikroppbindningsstäl- let, vilket innebär en alternativ elueringsteknik, som kan 506 025 26 utföras under milda elueringsbetingelser. Den selektivt adsorberade polypeptid som innehåller gp110-antigenet kan elueras från ett antikropp-affinitetsadsorbermedel genom ändring av pH och/eller jonstyrkan hos bufferten. Chaotropa medel kan även finna användning för avlägsnande av det bundna antigenet. Valet av ett chaotropt medel, dess kon- centration och andra elueringsbetingelser är beroende på egenskaperna hos växelverkan mellan antikroppen och anti- genet men bör, då de väl har fastställts, ej ändras vilket vanligen är fallet i polyklonala affinitetseparationssys- tem.A suspension of HIV virus extract or lysate, the supernatant from a cultured biological expression system or a suspension of the dissolved cells is then added to the separation matrix. The mixture is incubated under such conditions and for such a time that immune complex formation can take place, usually at least 30 minutes, more usually 2-24 hours. The immune complexes containing polypeptides with antigenic moieties of gp110 are then separated from the mixture. Typically, the mixture is removed, for example, by elution and the bound immune complexes are washed with plenty of adsorption buffer. The immune complex can then be eluted from the separation matrix using an eluent which is compatible with the particular carrier in question and which is well known to those skilled in the art. Even those in polypeptides that contain gp110 or other antigenic moieties can be selectively removed. For example, peptides containing an epitope that is recognized by the antibodies can be used to compete with the antibody binding site, which involves an alternative elution technique that can be performed under mild elution conditions. The selectively adsorbed polypeptide containing the gp110 antigen can be eluted from an antibody affinity adsorbent by changing the pH and / or ionic strength of the buffer. Chaotropic agents may also find use in removing the bound antigen. The choice of a chaotropic agent, its concentration and other elution conditions depend on the properties of the interaction between the antibody and the antigen but should, once established, not change, as is usually the case in polyclonal affinity separation systems.

Det eluerade materialet kan kräva inställning till ett fysiologiskt pH om buffertar används med lågt eller högt pH eller låg eller hög jonstyrka för att separera de bundna gpl10-antigenerna från separationsmatrisen. Dialys eller gelfiltreringskromatografi kan även krävas för att avlägsna överskottet av salter, som används i elueringsmedlet, för att medge rekonstituering av gpll0 eller polypeptider, som innehåller antigeniska fragment av gpl10, till nativa kon- formationer.The eluted material may require adjustment to a physiological pH if buffers with low or high pH or low or high ionic strength are used to separate the bound gp110 antigens from the separation matrix. Dialysis or gel filtration chromatography may also be required to remove excess salts used in the eluent to allow reconstitution of gp110 or polypeptides containing antigenic fragments of gp110 to native conformations.

Förfarandena enligt denna uppfinning ger exempelvis väsent- ligt renat gp110 eller polypeptider, som innehåller antige- niska fragment därav antingen naturligt producerade av in- fekterade cellkulturer eller av rekombinanta expressions- system av bakterier, jäst eller odlade insekts- eller dägg- djursceller. gpl10 och fragment eller andra renade protei- ner kommer typiskt att ha en renhet över 50%, vanligen minst 75% och ofta mer än 55 - 99%. Dessa molekyler kan därefter finna användning i en mångfald tillämpningar.The methods of this invention yield, for example, substantially purified gp110 or polypeptides which contain antigenic fragments thereof either naturally produced by infected cell cultures or by recombinant expression systems of bacteria, yeast or cultured insect or mammalian cells. gp110 and fragments or other purified proteins will typically have a purity above 50%, usually at least 75% and often more than 55-99%. These molecules can then find use in a variety of applications.

HIV-gp1l0-proteinerna, polypeptider, som innehåller de antigeniska fragmenten därav, eller andra proteiner, som har renats väsentligt medelst förfarandena enligt förelig- gande uppfinning, kan finna användning i en mångfald till- lämpningar innefattande AIDS-subenhetsvaccin-beredningar, vari immunogenen innefattar en effektiv dos av antigeniska 506 025 27 determinanter av exempelvis gpl10 eller en neutraliserande region därav. Andra komponenter i beredningen innefattar sådana antigeniska delar av HIV-proteiner eller -glyko- proteiner som stimulerar produktionen av antikropp (före- trädesvis neutraliserande antikroppar) hos ett immuniserat värddjur, vilka antikroppar har förmåga att skydda mot efterföljande infektion av HIV.The HIV gp110 proteins, polypeptides containing the antigenic fragments thereof, or other proteins that have been substantially purified by the methods of the present invention may find use in a variety of applications including AIDS subunit vaccine formulations, wherein the immunogen comprises an effective dose of antigenic determinants of, for example, gp110 or a neutralizing region thereof. Other components of the preparation include those antigenic moieties of HIV proteins or glycoproteins that stimulate the production of antibody (preferably neutralizing antibodies) in an immunized host animal, which antibodies are capable of protecting against subsequent infection with HIV.

Diagnostiska användningar av monoklonala antikroppar Monoklonala antikroppar enligt föreliggande uppfinning är även användbara för diagnostiska ändamål. De kan antingen vara märkta eller omärkta för detta ändamål. Typiskt inne- fattar diagnostiska analysmetoder detektering av bildningen av ett komplex genom bindning av den monoklonala antikrop- pen till ett HIV-antigen. I omärkt form finner antikroppar- na användning exempelvis i agglutinationsanalyser. Vidare kan omärkta antikroppar användas i kombination med andra märkta antikroppar (sekundära antikroppar), som är reaktiva med den monoklonala antikroppen, såsom antikroppar speci- fika för immunoglobulin. Alternativt kan de monoklonala antikropparna märkas direkt. En mångfald markörer kan användas, såsom radionuklider, fluorescerande medel, en- zymer, enzymsubstrat, enzym-cofaktorer, enzym-inhibitorer, ligander (speciellt haptener), etc. Talrika typer av im- munoanalysmetoder finns tillgängliga och som exempel härpå hänvisas till de amerikanska patentskrifterna 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 och 4 098 876, vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.Diagnostic Uses of Monoclonal Antibodies Monoclonal antibodies of the present invention are also useful for diagnostic purposes. They can be either marked or unmarked for this purpose. Typically, diagnostic assay methods involve detecting the formation of a complex by binding the monoclonal antibody to an HIV antigen. In unlabeled form, the antibodies find use, for example, in agglutination assays. Furthermore, unlabeled antibodies can be used in combination with other labeled antibodies (secondary antibodies) that are reactive with the monoclonal antibody, such as antibodies specific for immunoglobulin. Alternatively, the monoclonal antibodies can be labeled directly. A variety of markers can be used, such as radionuclides, fluorescent agents, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially haptens), etc. Numerous types of immunoassay methods are available and by way of example reference is made to the U.S. Pat. Patents 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 and 4,098,876, all of which are incorporated herein by reference.

Vanligen utnyttjas de monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning i enzym-immunoanalyser, där före- liggande antikroppar eller sekundära antikroppar från en annan art konjugeras till ett enzym. När ett biologiskt prov, som innehåller HIV-antigener såsom humanblodserum, saliv, sädesvätska, vaginalsekret eller viral infekterad cellkultursuspension, kombineras med föreliggande antikrop- 506 025 28 par inträder bindning mellan antikropparna och de molekyler som uppvisar den önskade epitopen. Dylika proteiner eller virala partiklar kan därefter separeras från icke-bundna reagens och en sekundär antikropp (märkt med ett enzym) tillsättes. Därefter bestämmes närvaron av det antikropp- enzym-konjugat som är specifikt bundet till antigenet.Typically, the monoclonal antibodies of the present invention are utilized in enzyme immunoassays, where present antibodies or secondary antibodies from another species are conjugated to an enzyme. When a biological sample containing HIV antigens such as human blood serum, saliva, semen, vaginal secretions or virally infected cell culture suspension is combined with the present antibody, binding occurs between the antibodies and the molecules exhibiting the desired epitope. Such proteins or viral particles can then be separated from unbound reagents and a secondary antibody (labeled with an enzyme) added. Next, the presence of the antibody-enzyme conjugate that is specifically bound to the antigen is determined.

Annan konventionell teknik, som är välkänd för fackmannen, kan även utnyttjas.Other conventional techniques well known to those skilled in the art may also be employed.

Testsatser kan även tillhandahållas för användning med föreliggande antikroppar för att påvisa HIV-infektion eller närvaron av HIV-antigen. Således kan föreliggande mono- klonala antikroppsberedningar tillhandahållas vanligen i lyofiliserad form, antingen separat eller tillsammans med ytterligare antikroppar, som är specifika med avseende på andra epitoper av HIV. Antikropparna, som kan vara kon- jugerade till en markör eller vara okonjugerade, ingår i testsatserna med buffertämnen, såsom TRIS, fosfat, kar- bonat, etc, stabiliseringsmedel, biocider, inerta protein- er, exempelvis bovinserumalbumin, eller liknande. I allmän- het är dessa material närvarande i en mängd mindre än cirka vikt-%, räknat på mängden av aktiv antikropp, och är vanligen närvarande i en total mängd av minst cirka 0,001 vikt-%, ånyo räknat på antikroppskoncentrationen. Ofta är det önskvärt att införliva ett inert utdrygningsmedel eller excipient för utspädning av de aktiva beståndsdelarna, varvid excipienten kan vara närvarande i en mängd från cirka 1 till 99 vikt-% av den totala beredningen. När en sekundär antikropp med förmåga att binda till den mono- klonala antikroppen användes, är denna vanligen närvarande i en separat ampull. Den sekundära antikroppen är typiskt konjugerad till en markör och bereds på ett sätt analogt med ovan beskrivna antikroppsberedningar.Test kits may also be provided for use with the present antibodies to detect HIV infection or the presence of HIV antigen. Thus, the present monoclonal antibody preparations can be usually provided in lyophilized form, either separately or together with additional antibodies, which are specific for other epitopes of HIV. The antibodies, which may be conjugated to a marker or be unconjugated, are included in the test kits with buffer substances, such as TRIS, phosphate, carbonate, etc., stabilizers, biocides, inert proteins, for example bovine serum albumin, or the like. In general, these materials are present in an amount less than about% by weight, based on the amount of active antibody, and are usually present in a total amount of at least about 0.001% by weight, again based on the antibody concentration. It is often desirable to incorporate an inert excipient or excipient to dilute the active ingredients, the excipient being present in an amount of from about 1 to 99% by weight of the total formulation. When a secondary antibody capable of binding to the monoclonal antibody is used, it is usually present in a separate vial. The secondary antibody is typically conjugated to a marker and is prepared in a manner analogous to the antibody preparations described above.

Detekteringen av gp1l0- eller p25-antigener eller helviru- set i olika biologiska prov kan finna användning vid diag- nostisering av en pågående infektion av HIV-virus. Biolo- giska prover kan innefatta, men är ej begränsade till 506 025 29 blodserum, saliv, sädesvätska, vävnadsbiopsiprover (hjär- na, hud, lymfkörtlar, mjälte, etc.), överliggande cell- odlingsvätskor, upplösta i eukaryotiska och bakteriella expressionsystem och liknande. Närvaron av virus testas genom att man inkuberar den monoklonala antikroppen med det biologiska provet under betingelser som leder till immun- lkomplexbildning, följt av detektering av komplexbildningen.The detection of gp110 or p25 antigens or the whole virus in various biological samples may find use in diagnosing an ongoing HIV virus infection. Biological samples may include, but are not limited to, blood serum, saliva, semen, tissue biopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spleen, etc.), overlying cell culture fluids, dissolved in eukaryotic and bacterial expression systems, and the like. . The presence of virus is tested by incubating the monoclonal antibody with the biological sample under conditions leading to immune complex formation, followed by detection of complex formation.

Enligt ännu en utföringsform detekteras komplexbildning genom användning av en andra antikropp med förmåga att binda till den monoklonala antikroppen och som typiskt är konjugerad till en markör och beredd på ett sätt analogt med ovan beskrivna antikroppsberedningar. Enligt en annan utföringsform kopplas den monoklonala antikroppen till en fastfasbärare, som därefter bringas i kontakt med ett biologiskt prov. Efter ett inkuberingssteg tillsätts märkt monoklonal antikropp för att detektera det bundna anti- genet.In yet another embodiment, complex formation is detected using a second antibody capable of binding to the monoclonal antibody and which is typically conjugated to a marker and prepared in a manner analogous to the antibody formulations described above. In another embodiment, the monoclonal antibody is coupled to a solid phase support, which is then contacted with a biological sample. Following an incubation step, labeled monoclonal antibody is added to detect the bound antigen.

Framställning och användning av syntetiska peptider Nya peptider tillhandahålls enligt föreliggande uppfinning, vilka bl.a. immunologiskt immiterar proteinepitoper kodade av HIV-retroviruset, speciellt epitoper kodade inom egy- eller ggg-regionerna av den virala genom som kodar gp1l0 resp. p25. För anpassning av variationer från stam till stam bland olika isolat kan inställningar göras för konser- vativa substitutioner och selektion bland de alternativ där icke-konservativa substitutioner är involverade. Dessa peptider kan användas som immunogener för att inhibera eller eliminera HIV-antigenproduktion in yitrg eller in yiyg och för detektering av viruset eller av antikroppar mot viruset i ett fysiologiskt prov. Beroende på protokol- lets beskaffenhet kan peptiderna konjugeras till en bärare eller andra föreningar, som är märkta eller icke-märkta, bundna till en fast yta eller liknande.Preparation and use of synthetic peptides Novel peptides are provided according to the present invention, which i.a. immunologically, protein epitopes encoded by the HIV retrovirus, especially epitopes encoded within the egy or ggg regions of the viral genome encoding gp110 and p25. For adaptation of variations from strain to strain among different isolates, settings can be made for conservative substitutions and selection among the alternatives where non-conservative substitutions are involved. These peptides can be used as immunogens to inhibit or eliminate HIV antigen production in vitro or in vitro and to detect the virus or of antibodies to the virus in a physiological sample. Depending on the nature of the protocol, the peptides may be conjugated to a carrier or other compounds, which are labeled or unlabeled, bound to a solid surface or the like.

Enligt en utföringsform härrör peptider av intresse från gp110-regionen hos viruset. Av speciellt intresse är den 506 025 region inom den öppna env-läsram som sträcker sig från ungefär baspar (bp) 6688 till ungefär bp6750 och från ungefär bp7246 till ungefär 7317.In one embodiment, peptides of interest are derived from the gp110 region of the virus. Of particular interest is the 506,025 region within the open env reading frame ranging from about base pair (bp) 6688 to about bp6750 and from about bp7246 to about 7317.

Peptiderna av intresse som innefattar blockerande peptider, innefattar minst fem, ibland åtta, ibland 12, ibland 21 och vanligen färre än cirka 50, mera vanligt färre än cirka 35 och företrädesvis färre än cirka 25 ibland sex, aminosyror i en sekvens som kodas av ett HIV-retrovirus.The peptides of interest comprising blocking peptides comprise at least five, sometimes eight, sometimes 12, sometimes 21 and usually less than about 50, more usually less than about 35 and preferably less than about 25 sometimes six, amino acids in a sequence encoded by a HIV retrovirus.

Med fördel är peptiden så liten som möjligt under det att den fortfarande uppvisar i huvudsak hela immunoreaktivite- ten eller den antivirala aktiviteten hos den större pep- tiden. I vissa fall kan det vara önskvärt att förena två eller flera oligopeptider, som är icke-överlappande, för bildning av en enda peptidstruktur eller att använda den som individuella peptider samtidigt, vilka separat eller tillsammans tillhandahåller ekvivalent känslighet mot modersubstansen.Advantageously, the peptide is as small as possible while still exhibiting substantially all of the immunoreactivity or antiviral activity of the larger peptide. In some cases, it may be desirable to combine two or more oligopeptides, which are non-overlapping, to form a single peptide structure or to use it as individual peptides simultaneously, which separately or together provide equivalent sensitivity to the parent substance.

Peptiden kan modifieras genom att man inför konservativa eller icke-konservativa substitutioner i peptiden, vanligen färre än 20 antalsprocent, vanligare färre än 10 antalspro- cent av de aminosyror som bytts ut. I sådana fall där regioner befinns vara polymorfa kan det vara önskvärt att variera en eller flera speciella aminosyror för att effek- tivt imitera de olika epitoperna hos de olika retrovirala stammarna. I många fall kan metionin ersättas av norleucin (Nor) för att tillhandahålla kemisk stabilitet.The peptide can be modified by introducing conservative or non-conservative substitutions into the peptide, usually less than 20 percent, more commonly less than 10 percent of the amino acids exchanged. In such cases where regions are found to be polymorphic, it may be desirable to vary one or more particular amino acids to effectively mimic the different epitopes of the different retroviral strains. In many cases, methionine can be replaced by norleucine (Nor) to provide chemical stability.

Det torde inses att den peptid som används enligt förelig- gande uppfinning icke behöver vara identisk med någon speciell HIV-polypeptidsekvens, så länge som föreliggande förening har förmåga att tillhandahålla immunologisk kon- kurrens med proteiner från minst en av stammarna av HIV- retroviruset. Därför kan föreliggande peptid underkastas olika modifikationer såsom insertioner, deletioner och substitutioner, antingen konservativa eller icke-konser- vativa, där dylika ändringar kan tillhandahålla vissa för- 506 025 31 delar vid deras användning. Med konservativa substitutioner avses substitutioner inom sådana grupper som gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; och nor, met. Vanligen skiljer sig sekvensen icke med mer än 20% från sekvensen hos minst en stam av ett HIV-retrovi- rus, med undantag av då ytterligare aminosyror kan tillsät- tas vid endera änden i syfte att tillhandahålla en "arm" medelst vilken peptiden enligt denna uppfinning bekvämt kan immobiliseras. Armarna har vanligen en längd av minst en aminosyra och kan innefatta 50 eller flera aminosyror, oftare 1 - 10 aminosyror.It will be appreciated that the peptide used in the present invention need not be identical to any particular HIV polypeptide sequence, as long as the present compound is capable of providing immunological competition with proteins from at least one of the strains of the HIV retrovirus. Therefore, the present peptide may be subjected to various modifications such as insertions, deletions and substitutions, either conservative or non-conservative, where such changes may provide certain benefits in their use. Conservative substitutions refer to substitutions within such groups as gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; light, angry; phe, tyr; and nor, met. In general, the sequence does not differ by more than 20% from the sequence of at least one strain of an HIV retrovirus, except when additional amino acids may be added at either end for the purpose of providing an "arm" by which the peptide of this term invention can be conveniently immobilized. The arms are usually at least one amino acid in length and may comprise 50 or more amino acids, more often 1 to 10 amino acids.

Den peptid i vilken aminosyrasekvensen modifieras genom substitution, addition eller deletion av aminosyrarester bör bibehålla i huvudsak all immunoreaktivitet eller an- tiviral aktivitet hos de omodifierade peptiderna, vilket bekvämt kan fastställas medelst olika analystekniker som avslöjas häri. d-isomerformen av en eller flera aminosyror kan användas, om så önskas, för att modifiera biologiska egenskaper såsom aktivitet, nedbrytningshastighet, etc.The peptide in which the amino acid sequence is modified by substitution, addition or deletion of amino acid residues should retain substantially all of the immunoreactivity or antiviral activity of the unmodified peptides, as can be conveniently determined by various assay techniques disclosed herein. The d-isomeric form of one or more amino acids can be used, if desired, to modify biological properties such as activity, degradation rate, etc.

Vidare kan en, tvâ eller flera aminosyror sättas till ändarna av en oligopeptid eller peptid för att underlätta kopplingen av peptider till varandra, för att koppla en bärare eller större peptid av skäl som diskuteras nedan, för att modifiera de fysikaliska eller kemiska egenskaperna hos peptiden eller oligopeptiden eller liknande.Furthermore, one, two or more amino acids may be added to the ends of an oligopeptide or peptide to facilitate the coupling of peptides to each other, to couple a carrier or larger peptide for reasons discussed below, to modify the physical or chemical properties of the peptide or the oligopeptide or the like.

Aminosyror såsom tyrosin, cystein, lysin, glutaminsyra eller asparaginsyra eller liknande kan införas vid C-eller N-änden av peptiden eller oligopeptiden för att tillhanda- hålla en användbar funktionalitet för koppling. Cystein föredrages speciellt för att underlätta kovalent koppling till andra peptider eller för att bilda polymerer genom oxidation.Amino acids such as tyrosine, cysteine, lysine, glutamic acid or aspartic acid or the like can be introduced at the C- or N-terminus of the peptide or oligopeptide to provide useful coupling functionality. Cysteine is especially preferred to facilitate covalent coupling to other peptides or to form polymers by oxidation.

Vidare kan peptid- eller oligopeptidsekvenserna skilja sig från den naturliga sekvensen när det gäller den sekvens som 506 025 32 modifieras genom terminal NH2-acylering, exempelvis ace- tylering, eller tioglykolsyraamidering, terminal karboxi- amidering, exempelvis med ammoniak eller metylamin, för att tillhandahålla stabilitet, ökad hydrofobitet för koppling eller bindning till en bärare eller annan molekyl eller för polymerisation.Furthermore, the peptide or oligopeptide sequences may differ from the natural sequence in the sequence modified by terminal NH 2 acylation, for example acetylation, or thioglycolic acid amidation, terminal carboxyamidation, for example with ammonia or methylamine, to provide stability, increased hydrophobicity for coupling or binding to a carrier or other molecule or for polymerization.

När det således exempelvis gäller de ovan avslöjade pep- tiderna I-VIII och IX-XV, i det fall då Y eller Y' är närvarande, innebär en föredragen utföringsform att Y eller Y' innefattar en eller flera cysteinrester eller en kom- bination av en eller flera cysteinrester med distanshål- lare-aminosyror. Glycin är en speciellt föredragen distans- hållare. Föredragna peptider för användning vid oxidativ polymerisation är sådana, vari Y eller Y' representerar minst två cysteinrester. När två cysteinrester är närva- rande vid samma ände av peptiden, innebär en föredragen utföringsform att cysteinresterna är åtskilda från varandra medelst en till tre distanshållare-aminosyrarester, före- trädesvis glycin. Närvaron av cysteinresterna kan medge bildning av dimerer av peptiden och/eller öka hydrofobite- ten hos den resulterande peptiden, vilket underlättar immobilisering av peptiden i fastfas- eller immobilisa- tionssanalys-system.Thus, for example, in the case of the peptides I-VIII and IX-XV revealed above, in the case where Y or Y 'is present, a preferred embodiment means that Y or Y' comprises one or more cysteine residues or a combination of one or more cysteine residues with spacer amino acids. Glycine is a particularly preferred spacer. Preferred peptides for use in oxidative polymerization are those in which Y or Y 'represents at least two cysteine residues. When two cysteine residues are present at the same end of the peptide, a preferred embodiment means that the cysteine residues are separated from each other by one to three spacer amino acid residues, preferably glycine. The presence of the cysteine residues may allow the formation of dimers of the peptide and / or increase the hydrophobicity of the resulting peptide, which facilitates immobilization of the peptide in solid phase or immobilization assay systems.

Av speciellt intresse är användningen av merkaptangruppen i cysteiner eller tioglykolsyror, som används för acylering av terminala aminogrupper eller liknande för koppling av två av peptiderna eller oligopeptiderna eller kombinationer därav medelst en disulfidbindning eller en längre bindning för framställning av polymerer, som innehåller ett antal epitoper. Dylika polymerer har fördelen att uppvisa ökad immunologisk reaktion. När olika peptider används för framställning av polymeren uppvisar de ytterligare förmåga att inducera antikroppar, som immunoreagerar med flera antigeniska determinanter hos olika HIV-isolat.Of particular interest is the use of the mercaptan group in cysteines or thioglycolic acids used for acylation of terminal amino groups or the like for coupling two of the peptides or oligopeptides or combinations thereof by means of a disulfide bond or a longer bond to produce polymers containing a number of epitopes. Such polymers have the advantage of exhibiting increased immunological response. When different peptides are used to prepare the polymer, they further demonstrate the ability to induce antibodies, which immunoreact with several antigenic determinants of different HIV isolates.

För att åstadkomma bildningen av antigeniska polymerer 5Û6 025 33 (syntetiska multimerer), kan man utnyttja föreningar med gig-haloacetylgrupper, nitroarylhalider eller liknande, där reagensen är specifika med avseende på tiogrupper. Således kan kopplingen mellan de två merkaptogrupperna i de olika peptiderna eller oligopeptiderna vara en enkel bindning eller en kopplingsgrupp bestående av minst 2, vanligen minst 4 och icke mer än cirka 16 och i synnerhet icke mer än cirka 14 kolatomer.To effect the formation of antigenic polymers (synthetic multimers), one may use compounds having gig-haloacetyl groups, nitroaryl halides or the like, where the reagents are specific for ten groups. Thus, the coupling between the two mercapto groups in the different peptides or oligopeptides may be a single bond or a coupling group consisting of at least 2, usually at least 4 and not more than about 16 and in particular not more than about 14 carbon atoms.

Förliggande peptid kan användas kopplad till en löslig makromolekylär (exempelvis icke mindre än 5kDal) bärare.The present peptide can be used coupled to a soluble macromolecular (eg not less than 5kDal) carrier.

Lämpligen kan bäraren vara en poly(aminosyra), antingen naturligt förekommande eller syntetisk, vilka antikroppar det är osannolikt att stöta på i humanserum. Exempel på dylika bärare är poly-L-lysin "keyhole limpet"-hemocyanin, tyroglobulin, albuminer såsom bovinserumalbumin, tetanus- toxoid, etc. Valet av bärare är primärt beroende på den slutliga användningen av antigenet och på lämplighet och tillgänglighet.Suitably the carrier may be a poly (amino acid), either naturally occurring or synthetic, which antibodies are unlikely to be encountered in human serum. Examples of such carriers are poly-L-lysine keyhole limpet hemocyanin, thyroglobulin, albumins such as bovine serum albumin, tetanus toxoid, etc. The choice of carrier is primarily dependent on the end use of the antigen and on suitability and availability.

Med dylika konjugat kommer det att finnas minst en molekyl av minst en peptid enligt uppfinningen per makromolekyl och icke mer än cirka 1 per 0,5 kDal, vanligen icke mer än cirka 1 per 2kDal av makromolekylen. En eller flera olika peptider kan vara kopplade till samma makromolekyl.With such conjugates, there will be at least one molecule of at least one peptide of the invention per macromolecule and no more than about 1 per 0.5 kDal, usually no more than about 1 per 2 kDal of the macromolecule. One or more different peptides may be linked to the same macromolecule.

Kopplingssättet är konventionellt, varvid man utnyttjar sådana reagens som p-maleimidobensoesyra, p-metylditioben- soesyra, maleinsyraanhydrid, bärnstensyraanhydrid, glutar- aldehyd, etc. Kopplingen kan ske vid N-änden, C-änden eller vid ett ställe mellan molekylernas ändar. Föreliggande peptid kan derivatiseras genom koppling, kan kopplas medan den är bunden till en bärare eller liknande.The coupling method is conventional, using such reagents as p-maleimidobenzoic acid, p-methyldithiobenzoic acid, maleic anhydride, succinic anhydride, glutaraldehyde, etc. The coupling can take place at the N-terminus, C-terminus or at a point between the ends of the molecules. The present peptide can be derivatized by coupling, can be coupled while bound to a carrier or the like.

Olika analysprotokoll, som är välkända för fackmannen, kan användas för detektering av närvaron av antingen antikrop- par mot retrovirala proteiner eller retrovirala proteiner som sådana. Av speciellt intresse är användningen av pep- 506 025 34 tiden som märkt reagens, där markören medger en detekterbar signal, eller bindning av peptiden, antingen direkt eller indirekt, till en yta, där antikroppen mot peptiden i provet blir bunden till peptiden på ytan. Närvaron av humanantikropp, som är bunden till peptiden, kan därefter detekteras genom användning av en xenogenisk antikropp, som är specifik för humanimmunoglobulin, normalt både human-IgM och IgG, eller ett märkt protein, som är specifikt för immunkomplex, exempelvis Rf-faktorn av S. aureus-protein A.Various assay protocols, well known to those skilled in the art, can be used to detect the presence of either antibodies to retroviral proteins or retroviral proteins as such. Of particular interest is the use of the peptide as a labeled reagent, where the marker allows a detectable signal, or binding of the peptide, either directly or indirectly, to a surface where the antibody to the peptide in the sample becomes bound to the peptide on the surface. The presence of human antibody bound to the peptide can then be detected using a xenogenic antibody specific for human immunoglobulin, normally both human IgM and IgG, or a labeled protein specific for immune complexes, for example the Rf factor of S. aureus protein A.

Exempel på en analysteknik är användningen av en provbehål- lare, exempelvis facken i mikrotiterplattor, där förelig- gande polypeptid eller konjugat därav adsorberas till behållarens botten och/eller väggar, antingen kovalent eller icke-kovalent. Provet, som normalt är humanblod eller -serum, som har spätts i ett lämpligt buffrat medium, sättes till behållaren och en tillräcklig tid får förflyta för komplexbildning mellan polypeptiden eller polypeptider- na och eventuella relaterade antikroppar i provet. Den överliggande vätskan avlägsnas och behållaren tvättas för avlägsnande av icke-specifikt bundna proteiner. Ett speci- fikt märkt bindningsprotein, som specifikt binder till komplexet, såsom xenogeniskt antiserum mot humanimmunoglo- bulin, används för detektering.An example of an assay technique is the use of a sample container, for example the compartments in microtiter plates, where the present polypeptide or conjugate thereof is adsorbed to the bottom and / or walls of the container, either covalently or non-covalently. The sample, which is normally human blood or serum, which has been diluted in a suitable buffered medium, is added to the container and a sufficient time is allowed for complex formation between the polypeptide or polypeptides and any related antibodies in the sample. The supernatant is removed and the container is washed to remove non-specifically bound proteins. A specifically labeled binding protein that specifically binds to the complex, such as xenogenic antiserum to human immunoglobulin, is used for detection.

Peptiden kan framställas på en mångfald olika sätt. Pep- tiden kan på grund av sin relativt lilla storlek synte- tiseras i lösning eller på en fast bärare i enlighet med konventionell teknik. Olika automatiska syntetisorer finns kommersiellt tillgängliga idag och kan användas i enlighet med kända protokoll. Se exempelvis Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2:a uppl., 1984; och Tam et al., J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6442.The peptide can be prepared in a variety of different ways. Due to its relatively small size, the pep time can be synthesized in solution or on a solid support in accordance with conventional technology. Various automatic synthesizers are commercially available today and can be used in accordance with known protocols. See, e.g., Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984; and Tam et al., J. Am. Chem. Soc. (1983) 105: 6442.

Pierce Chemical Co., Alternativt kan hybrid-DNA-teknik användas, där en syn- tetisk gen kan framställas genom användning av enkelsträn- gar, som kodar för polypeptiden, eller i huvudsak komple- mentära strängar därav, där enkelsträngarna överlappar och C506 025 kan sammanföras i ett ligeringsmedium för hybridisering. De hybridiserade strängarna kan därefter ligeras för bildning av den kompletta genen och genom val av lämpliga ändstående grupper kan genen införas i expressionsvektorer, som är lätt tillgängliga idag. Se exempelvis Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Eller också kan regionen av den virala genom som kodar för peptiden klonas medelst konven- tionell rekombinant DNA-teknik och uttryckas (se Maniatis ovan).Pierce Chemical Co., Alternatively, hybrid DNA technology can be used, where a synthetic gene can be produced using single strands encoding the polypeptide, or substantially complementary strands thereof, where the single strands overlap and C506 025 can combined in a ligation medium for hybridization. The hybridized strands can then be ligated to form the complete gene, and by selecting appropriate terminal groups, the gene can be introduced into expression vectors, which are readily available today. See, e.g., Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Or, the region of the viral genome encoding the peptide can be cloned by conventional recombinant DNA technology and expressed (see Maniatis supra). ).

DNA-kodande sekvenser från LAVBRU- och ARV 2-isolat av HIV, som kan användas för expression av peptiderna, innefattar följande: AAC AAT ACA AGA AAA AGT GGA CCA GGG AGA GCA TTT ATA GGA AAT ATG AGA CAA TGT ATC GTT GCA TGT ATC ACA CAT ACA AGA CCC AAC CGT ATC CAG AGG ACA ATA GGA AAA CAT TGT ACA AGA CCC AAC TAT ATA GGA CCA GGA AGA ATA ATA TGT LAVBRU ACA AGA AAA AGT GLA TTT CAT ACA ATA AGA AAA GCA ARV-2 AAC AAT GGG AGA GGA GAT Fragment från en sekvens kan användas för expression av peptidfragment, konservativa bas-modifikationer kan göras, där den modifierade kodonen eller de modifierade kodonerna kodar för samma aminosyra eller aminosyror, eller icke- konservativa modifikationer i kodningssekvensen kan göras där den resulterande aminosyran kan vara en konservativ eller icke-konservativ modifikation i aminosyrasekvensen, såsom har diskuterats ovan.DNA coding sequences from LAVBRU and ARV 2 isolates of HIV that can be used to express the peptides include the following: AAC AAT ACA AGA AAA AGT GGA CCA GGG AGA GCA TTT ATA GGA AAT ATG AGA CAA TGT ATC GTT GCA TGT ATC ACA CAT ACA AGA CCC AAC CGT ATC CAG AGG ACA ATA GGA AAA CAT TGT ACA AGA CCC AAC TAT ATA GGA CCA GGA AGA ATA ATA TGT LAVBRU ACA AGA AAA AGT GLA TTT CAT ACA ATA AGA AAA GCA ARG-G AGA AA AA AA GAT Fragments from a sequence can be used to express peptide fragments, conservative base modifications can be made, where the modified codon or codons encode the same amino acid or amino acids, or non-conservative modifications in the coding sequence can be made where the resulting amino acid can be a conservative or non-conservative modification in the amino acid sequence, as discussed above.

Kodningssekvensen kan förlängas vid antingen 5'- eller 3'- änden eller vid båda ändarna för att förlänga peptiden, under det att dess epitopiska ställe eller epitopiska ställen bibehålls. Förlängningen kan tillhandahålla en arm för koppling, exempelvis till en markör såsom ett enzym, 506 025 36 för koppling av två eller samtliga peptider tillsammans i samma kedja, för tillhandahållande av antigenisk aktivitet, lämpligare restriktionsställen för kloning eller liknande.The coding sequence can be extended at either the 5 'or 3' end or at both ends to extend the peptide, while maintaining its epitopic site or epitopic sites. The extension may provide an arm for coupling, for example to a marker such as an enzyme, for coupling two or all peptides together in the same chain, for providing antigenic activity, more suitable restriction sites for cloning or the like.

DNA-sekvensen som sådan, fragment därav eller större sek- venser, av vanligen minst 15 baser, företrädesvis minst 18 baser, kan användas som nukleotid-provpreparat för detek- tering av retroviral RNA eller proviral DNA eller för identifiering av homologa regioner för kloning eller sek- ventiering. Talrika tekniker har beskrivits, såsom Grun- stein-Hogness-tekniken, Southern-tekniken, Northern-tekni- ken, dot-blot, förbättringar därav liksom annan metodik så som avslöjas i US 4 358 535, beskrivning genom hänvisning därtill. som införlivas med denna Föreliggande peptider, innefattande blockerande peptider, och deras analoger finner användning som sådana eller i kombination i vaccinet. Likaledes kan man i vacciner även använda anti-idiotyp-antikroppar, dvs. som är reaktiva med idiotyperna av antikropparna enligt föreliggande uppfinning och därigenom innehåller epitoper, som imiterar neutralise- rade regioner av HIV. Peptiderna eller anti-idiotyp-anti- kropparna kan beredas på konventionellt sätt, i allmänhet i koncentrationer inom intervallet från llpg till 20 mg/kg värddjur. Fysiologiskt godtagbara medel kan användas som bärare såsom sterilt vatten, saltlösning, fosfatbuffrad saltlösning och liknande. Adjuvantia kan användas såsom aluminiumhydroxidgel, ytaktiva substanser såsom lysoleci- tin, pluronic-polyoler, polyanjoner, peptider, proteiner (exempelvis difteri- eller koleratoxiner) och oljeemul- sioner. Peptiderna kan även införlivas med liposomer eller konjugeras till polysackarider, polypeptider eller polyme- rer för användning i vaccinberedning. Administrering kan ske genom injektion, exempelvis intramuskulärt, perito- nealt, subkutant, intravenöst, etc. Administrering av en immunogeniskt effektiv dos kan ske en gång eller ett fler- tal gånger, vanligen med en till fyra veckors intervall. En "immunogeniskt effektiv dos" är den mängd av ett vaccin som 506 025 37 är lämplig för att framkalla ett immunsvar hos ett värd- djur, där värddjuret uppvisar ökad infektion.The DNA sequence as such, fragments thereof or larger sequences, usually of at least 15 bases, preferably at least 18 bases, can be used as nucleotide sample preparations for the detection of retroviral RNA or proviral DNA or for the identification of homologous regions for cloning or sequencing. Numerous techniques have been described, such as the Grunstein-Hogness technique, the Southern technique, the Northern technique, dot-blot, improvements thereof as well as other methodologies as disclosed in US 4,358,535, description by reference thereto. The present peptides, including blocking peptides, and their analogs find use as such or in combination with the vaccine. Similarly, vaccines can also use anti-idiotype antibodies, ie. which are reactive with the idiotypes of the antibodies of the present invention and thereby contain epitopes which mimic neutralized regions of HIV. The peptides or anti-idiotype antibodies may be formulated in conventional manner, generally in concentrations ranging from llpg to 20 mg / kg of host animal. Physiologically acceptable agents can be used as carriers such as sterile water, saline, phosphate buffered saline and the like. Adjuvants can be used as aluminum hydroxide gel, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, proteins (eg diphtheria or cholera toxins) and oil emulsions. The peptides can also be incorporated into liposomes or conjugated to polysaccharides, polypeptides or polymers for use in vaccine formulation. Administration can be by injection, for example intramuscularly, peritoneally, subcutaneously, intravenously, etc. Administration of an immunogenically effective dose may be once or several times, usually at one to four week intervals. An "immunogenically effective dose" is the amount of a vaccine suitable for eliciting an immune response in a host animal, where the host animal is at increased infection.

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande ut- föríngsexempel, som icke är avsedda att begränsa uppfin- ningen.The invention is further illustrated by the following working examples, which are not intended to limit the invention.

EXEMPEL I Alstring och karakterisering av monoklonala antikroppar Exempel I beskriver alstringen av hybridcellinjer, vilka producerar monoklonala antikroppar, som är specifika för höljes-glykoproteinerna hos HIV. Denna metod innefattar användningen av lektinrenade extrakt av LAVBRU, som är kopplade till linslektinagaros som immunogen. De mono- klonala antikroppar som därefter alstras av hybridcell- linjerna utmärkes av sin förmåga att genom immunoblotting och radioimmunoanalys utfälla gp110 från renad LAV och som biologiskt uttryckt rekombinant fusionsprotein. De mono- klonala antikroppar som binder till epitoper på gp110 är även reaktiva vid ELISA med upplöst helvirus, fusionspro- v teiner och syntetiska peptider och reagerar med helvirus vid indirekta fluorescensanalyser.EXAMPLE I Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies Example I describes the generation of hybrid cell lines which produce monoclonal antibodies specific for the envelope glycoproteins of HIV. This method involves the use of lectin-purified extracts of LAVBRU, which are linked to lentil lectin agarose as an immunogen. The monoclonal antibodies subsequently generated by the hybrid cell lines are characterized by their ability to precipitate gp110 from purified LAV by immunoblotting and radioimmunoassay and as a biologically expressed recombinant fusion protein. The monoclonal antibodies that bind to epitopes on gp110 are also reactive in ELISA with dissolved whole virus, fusion proteins and synthetic peptides and react with whole virus in indirect fluorescence analyzes.

Protokollen för alstring av de hybridcellinjer som produce- rar monoklonal antikropp och karaktäriseringen av anti- kropparna var som följer.The protocols for generating the hybrid cell lines that produce monoclonal antibody and the characterization of the antibodies were as follows.

LAV-virus, som hade renats från infekterade CEM-celler (A.T.T.C. nr. CRL8904), upplöstes i 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15, M Naci, 1,02; Aprotinin, 2,o% Nonidet P-4o(R> (NP-w) (oktylfenoxipolyetoxietanol). Extraktet klarades två gånger genom centrifugering och inställdes på 0,5% NP-40 genom tillsats av tre volymer upplösningsbuffert utan NP-40.LAV virus, which had been purified from infected CEM cells (A.T.T.C. No. CRL8904), was dissolved in 50 mM Tris, pH 7.4, 0.15, M Naci, 1.02; Aprotinin, 2.0% Nonidet P-40 (R> (NP-w) (octylphenoxypolyethoxyethanol) The extract was clarified twice by centrifugation and adjusted to 0.5% NP-40 by adding three volumes of dissolution buffer without NP-40.

Linslektin-Sepharose (Pharmacia, Piscataway N.J.) förtvät- tades i upplösningsbuffert utan NP-40 och ekvilibrerades i adsorptionsbuffert (50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1,0% Aprotinin, O,5% NP-40). Klarat viralt extrakt adsorberades 506 025 38 med linslektin-Sepharose under 42 timmar vid 4°C. Icke- adsorberat material avlägsnades genom tvättning med ett överskott av adsorptionsbuffert. Eluering av adsorberat material utfördes med 0,2 M alfa-metylmannosid i adsorp- tionsbuffert. Elueringsmedlet dialyserades mot PBS för avlägsnande av sockret och materialet återadsorberades på linslektin-Sepharose.Lentil Sectarose (Pharmacia, Piscataway NJ) was pre-diluted in dissolution buffer without NP-40 and equilibrated in adsorption buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 1.0% Aprotinin, 0.5% NP- 40). Clarified viral extract was adsorbed with lens lectin-Sepharose for 42 hours at 4 ° C. Non-adsorbed material was removed by washing with an excess of adsorption buffer. Elution of adsorbed material was performed with 0.2 M alpha-methyl mannoside in adsorption buffer. The eluent was dialyzed against PBS to remove the sugar and the material was reabsorbed on lens lectin-Sepharose.

Glykoprotein-linslektin-Sepharose-komplexet användes för immunisering av BALB/c-möss genom tre intraperitoneala injektioner utan adjuvans med 2-3 veckors mellanrum. Mjäl- tarna avlägsnades från immuniserade möss, vilka uppvisade cirkulerande antikropp mot glykoproteiner av HIV genom immunoblotting, RIP och/eller ELISA.The glycoprotein-lens lectin-Sepharose complex was used to immunize BALB / c mice by three intraperitoneal injections without adjuvant at 2-3 week intervals. The spleens were removed from immunized mice, which showed circulating antibody to HIV glycoproteins by immunoblotting, RIP and / or ELISA.

Protokoll, som används för alstring av cellinjer, var i allmänhet de protokoll som har anvisats av Kohler och Milstein (Nature 256:495 (1985)) med de modifikationer som har angetts av Goldstein, L.C., et al., (Infect. Immun. 38:273 (1982)). Mjält-B-lymfocyter från de immuniserade mössen fusionerades med NS-1-myelomceller under användning av 40% (vikt/volym) polyetylenglykol. Efter fusionen åter- suspenderades cellblandningen i HAT-medium (RPMI - 1640- medium kompletterat med 15% kalvfosterserum, lx10'4 M hypoxantin, 4xl0'7 M aminopterin och 1,6x10'5 M tymidine) för selektering för tillväxt av hybridceller och applicera- des därefter i mikrokulturplattor med 96 fack i en kon- centration av 1-3x106 celler/ml och inkuberades vid 37°C i fuktig atmosfär innehållande 6% C02. Kulturerna matades genom att man ersatte hälften av den överliggande vätskan med färskt HAT-medium. Facken observerades under ett in- verterat mikroskop med avseende på tecken på cellprolifera- tion och när cellerna hade uppnått tillräcklig densitet testades de överliggande vätskorna med avseende på anti- LAV-antikropp.Protocols used to generate cell lines were generally those protocols instructed by Kohler and Milstein (Nature 256: 495 (1985)) with the modifications indicated by Goldstein, LC, et al., (Infect. Immun. 38: 273 (1982)). Spleen B lymphocytes from the immunized mice were fused with NS-1 myeloma cells using 40% (w / v) polyethylene glycol. Following fusion, the cell mixture was resuspended in HAT medium (RPMI - 1640 medium supplemented with 15% fetal calf serum, 1x10 -4 M hypoxanthine, 4x10 7 M aminopterin and 1.6x10 -5 M thymidine) for selection for hybrid cell growth and application. was then placed in 96-well microculture plates at a concentration of 1-3x106 cells / ml and incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 6% CO 2. The cultures were fed by replacing half of the supernatant with fresh HAT medium. The compartments were observed under an inverted microscope for signs of cell proliferation, and when the cells had reached sufficient density, the supernatants were tested for anti-LAV antibody.

Fack, som innehöll hybridceller, vilka producerade antik- ropp mot LAV, identifierades medelst ELISA genom mätning av 506 025 39 bindningen till antingen renat upplöst helvirus eller biologiskt uttryckta fusionsproteiner. ELISA-analyser under användning av upplöst virus slutfördes på LAV EIA-plattor (Genetic Systems, Seattle, Washington). Plattorna inkubera- des med cellkulturfluida vid 37°C under 45 min och tvät- tades därefter tre gånger med 0,05% Tween 20 i fosfatbuf- frad saltlösning (PBS-Tween).Compartments containing hybrid cells that produced antibodies to LAV were identified by ELISA by measuring the binding to either purified dissolved whole virus or biologically expressed fusion proteins. ELISA assays using dissolved virus were performed on LAV EIA plates (Genetic Systems, Seattle, Washington). The plates were incubated with cell culture fluids at 37 ° C for 45 minutes and then washed three times with 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline (PBS-Tween).

Peroxidas-get-anti-mus-IgG (spädning 1:2000 i PBS-Tween; Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Kalifornien, tillsattes (100)ul per fack) och plattorna inkuberades under 45 min vid 37°C och tvättades som ovan. Substrat (0,025 M citronsyra, 0,05 M dibasiskt natriumfosfat, pH ,0, innehållande 14 mg o-fenylendiamin och 10)u1 30%-ig väteperoxid per 50 ml) tillsattes och plattorna inkuberades under 30 min vid rumstemperatur i mörker. Reaktionen av- bröts med 3N svavelsyra och kolorimetriska reaktioner kvantifierades med en automatiserad mikroplatta-avläsare.Peroxidase goat anti-mouse IgG (1: 2000 dilution in PBS-Tween; Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, California, was added (100 μl per well) and the plates were incubated for 45 minutes at 37 ° C and washed as above. Substrates (0.025 M citric acid, 0.05 M dibasic sodium phosphate, pH 0, containing 14 mg of o-phenylenediamine and 10 μl of 30% hydrogen peroxide per 50 ml) were added and the plates were incubated for 30 minutes at room temperature in the dark. The reaction was quenched with 3N sulfuric acid and colorimetric reactions were quantified with an automated microplate reader.

Fack, som gav positiva resultat, subklonades genom gräns- spädning, återtestades med avseende på specificitet och expanderades därefter. De monoklonala antikroppar som utsöndrades av de erhållna hybridcellinjerna karaktärisera- des ytterligare med avseende på specificitet och reaktivi- tet medelst immunoblotting, immunoprecipitation och ELISA under användning av upplöst LAV-virus, rekombinanta LAV- fusionsproteiner och syntetiska LAV-peptider. Samtliga antikroppar bestämdes vara av IgG1-isotyp. Cellinjerna HIV- gp1l0-1, HIV-gp110-2 och HIV-gp110-3 har deponerats hos American Type Culture Collection före inlämningen av denna ansökan och har erhållit depositionsnumren A.T.C.C. nr.HB 9175, HB 9176 resp.Trays that gave positive results were subcloned by border dilution, retested for specificity and then expanded. The monoclonal antibodies secreted by the resulting hybrid cell lines were further characterized for specificity and reactivity by immunoblotting, immunoprecipitation and ELISA using dissolved LAV virus, recombinant LAV fusion proteins and synthetic LAV peptides. All antibodies were determined to be of the IgG1 isotype. The cell lines HIV-gp110-1, HIV-gp110-2 and HIV-gp110-3 have been deposited with the American Type Culture Collection prior to the submission of this application and have received the deposit numbers A.T.C.C. nr.HB 9175, HB 9176 resp.

HB 9177.HB 9177.

Rekombinanta fusionsproteiner, som har testats med avseende på reaktivitet, har tidigare betecknats ENV2, ENV3, ENV4 och ENV5. Protein ENV2 uttryckes från pENV2 (A.T.C.C. nr. 53071), som är en region av LAV från baspar (bp) 6598 till bp 7178 (numrerade enligt Wain-Hobson et al., gel; 44:9 506 025 40 (1985)), ENV3 uttryckes från pENv3 (A.T.C.c. nr. 53072), som innefattar LAV-regionen från bp 7178 till bp 7698; ENV4 uttryckes från pENV4 (A.T.C.C. nr. 53073) och innefattar bp 7698 till bp 8572; och ENV5 uttryckes från pENV5 (A.T.C.C. nr. 53074), som innefattar LAV-regionen bp 5889 till bp 7§98. Produktionen av de rekombinanta fusionsproteinerna beskrivs i detalj i den samtidigt anhängiga amerikanska patentansökningen 721 237, vars innehåll införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.Recombinant fusion proteins, which have been tested for reactivity, have previously been designated ENV2, ENV3, ENV4 and ENV5. Protein ENV2 is expressed from pENV2 (ATCC No. 53071), which is a region of LAV from base pair (bp) 6598 to bp 7178 (numbered according to Wain-Hobson et al., Gel; 44: 9 506 025 40 (1985)). ENV3 is expressed from pENv3 (ATCc No. 53072), which includes the LAV region from bp 7178 to bp 7698; ENV4 is expressed from pENV4 (A.T.C.C. No. 53073) and includes bp 7698 to bp 8572; and ENV5 is expressed from pENV5 (A.T.C.C. No. 53074), which includes the LAV region bp 5889 to bp 7§98. The production of the recombinant fusion proteins is described in detail in co-pending U.S. Patent Application 721,237, the contents of which are incorporated herein by reference.

Sammanfoqninq av syntetiska peptider Peptider I (29) och VIII (110-2-2) sammanfogades på ett benzhydrylamin (polystyren/divenylbensen)-harts (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien). Peptid V (177) sammanfogades på ett t-butyloxikarbonyl(Boc)-etylbensylcys- tein-fenylacetamidometyl (PAM)-polystyren/divinylbensen- harts. Symmetriska anhydridkopplingar utfördes i en Applied Biosystems 430A syntetisator. Cystein tillsattes som första rest i båda peptiderna.Synthesis of Synthetic Peptides Peptides I (29) and VIII (110-2-2) were joined on a benzhydrylamine (polystyrene / divenylbenzene) resin (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Peptide V (177) was joined on a t-butyloxycarbonyl (Boc) -ethylbenzylcysteine-phenylacetamidomethyl (PAM) -polystyrene / divinylbenzene resin. Symmetrical anhydride couplings were performed in an Applied Biosystems 430A synthesizer. Cysteine was added as the first residue in both peptides.

Dicyklohexylkarbodiimid-kopplingar i närvaro av hydroxyl- bensotriazol användes för asparagin och glutamin. Bensyl- baserat sidokedjeskydd och Boc-alfa-amin-skydd användes.Dicyclohexylcarbodiimide couplings in the presence of hydroxylbenzotriazole were used for asparagine and glutamine. Benzyl-based side chain protection and Boc-alpha-amine protection were used.

Annat sidokedjeskydd som rutinmässigt användes var Boc (formyl)-tryptofan, Boc-metionin-sulfoxid, Boc (tosyl)- arginin, Boc (metylbensyl)-cystein, Boc (tosyl)-histidin, Boc (klorbensyloxikarbonyl)-lysin och Boc (brombensyloxi~ karbonyl)-tyrosin.Other side chain protections routinely used were Boc (formyl) -tryptophan, Boc-methionine sulfoxide, Boc (tosyl) -arginine, Boc (methylbenzyl) -cysteine, Boc (tosyl) -histidine, Boc (chlorobenzyloxycarbonyl) -lysine and Boc (brocyloxyl) ~ carbonyl) -tyrosine.

När peptiderna märktes radioaktivt skedde detta genom acetylering av aminoänden med 3H-ättiksyra och ett över- skott av dicyklohexylkarbodiimid.When the peptides were radiolabeled, this was done by acetylation of the amino terminus with 3H-acetic acid and an excess of dicyclohexylcarbodiimide.

Avlägsnande av skyddsgrupper och spjälkning av peptiden från hartset skedde medelst Tam "low-high" HF-protokollet (Tam et al., ovan). Extraktion från hartset skedde med %-ig ättiksyra och extraktet underkastades gelfiltrerings- 41 kromatografi i 5%-ig ättiksyra.Removal of protecting groups and cleavage of the peptide from the resin was accomplished by the Tam "low-high" HF protocol (Tam et al., Supra). Extraction from the resin was performed with% acetic acid and the extract was subjected to gel filtration chromatography in 5% acetic acid.

Syntetiska HIV-peptider, som testades med avseende på reaktivitet med monoklonala antikroppar, innefattande peptiderna 29, 36, 39. Peptid 29 kodas av den LAVBRU-geno- miska regionen från ungefär bp 6688 till bp 6750; peptid 36 kodas av regionen från ungefär bp 7246 till bp 7317; och peptid 39 kodas av regionen från ungefär bp 7516 till bp 7593. Peptiderna 36 och 39 beskrivs i detalj i US 4 629 783, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.Synthetic HIV peptides tested for reactivity with monoclonal antibodies, including peptides 29, 36, 39. Peptide 29 is encoded by the LAVBRU genomic region from about bp 6688 to bp 6750; peptide 36 is encoded by the region from about bp 7246 to bp 7317; and peptide 39 is encoded by the region from about bp 7516 to bp 7593. Peptides 36 and 39 are described in detail in US 4,629,783, which is incorporated herein by reference.

De blockerande peptiderna IX-XV sammanfogades i huvudsak också som beskrivits ovan på ett metyl-benshydrylamin (polystyren/divinylbensen)-harts (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien). Symmetriska anhydridkopplingar utfördes på en Applied Biosystems 430A syntetisator. Di- cyklohexylkarbodiimid-kopplingar i närvaro av hydroxylben- sotriazol användes för asparagin. För skydd användes ben- sylbaserad sidokedja och Boc alfa-amin-skydd, medan Boc (brombensyloxikarbonyl) användes specifikt för tyrosin- sidokedjor. Acetylering, om sådan förekom, utfördes under användning av ättiksyraanhydrid eller isättika och dicyklo- hexylkarbodiimid. Avlägsnande av skyddsgrupper och spjälk- ning av peptiden från hartset utfördes medelst “high"-HF- standardprotokollet (Stewart et al., ovan). Extraktion från hartset utfördes med 50%-ig ättiksyra och extraktet under- kastades därefter gelfiltreringskromatografi i 20%-ig ättiksyra. Om så önskas kunde högprestandavätskekromato- grafi utföras pà en Vydac C18-kolonn (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) under användning av en gradient av O,1% trifluorättiksyra och acetonitril.The blocking peptides IX-XV were also joined essentially as described above on a methylbenzhydrylamine (polystyrene / divinylbenzene) resin (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California). Symmetrical anhydride couplings were performed on an Applied Biosystems 430A synthesizer. Dicyclohexylcarbodiimide couplings in the presence of hydroxylbenzotriazole were used for asparagine. For protection, benzyl-based side chain and Boc alpha-amine protection were used, while Boc (bromobenzyloxycarbonyl) was used specifically for tyrosine side chains. Acetylation, if any, was performed using acetic anhydride or glacial acetic acid and dicyclohexylcarbodiimide. Removal of protecting groups and cleavage of the peptide from the resin were performed by the "high" HF standard protocol (Stewart et al., Supra). Extraction from the resin was performed with 50% acetic acid and the extract was then subjected to gel filtration chromatography for 20%. If desired, high performance liquid chromatography could be performed on a Vydac C18 column (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) using a gradient of 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile.

Immunoblotting Karaktärisering medelst immunoblotting utfördes på överlig- gande klonvätskor eller askitesvätska under användning av renat LAV-virus och rekombinanta fusionsproteiner som 506 025' 506 025 42 antigener. Antigenerna separerades först medelst polyakryl- amid-gradient-gelelektrofores (7,0-l5,0%) och överfördes till nitrocellulosamembran (NCM) genom elektrofores under fyra timmar vid 25 V i 25 mM natriumfosfat (pH 7,0). Efter överföring blockerade NCM för att förhindra icke-specifika interaktioner genom inkubering i PBS-Tween eller Blotto (5% fettfri torrmjölk i PBS) under en timme vid rumstemperatur.Immunoblotting Immunoblotting characterization was performed on overlying clone fluids or ascites fluid using purified LAV virus and recombinant fusion proteins as 506 025, 506 025 42 antigens. The antigens were first separated by polyacrylamide gradient gel electrophoresis (7.0-1.05%) and transferred to nitrocellulose membranes (NCM) by electrophoresis for four hours at 25 V in 25 mM sodium phosphate (pH 7.0). After transfer, NCM blocked to prevent non-specific interactions by incubating in PBS-Tween or Blotto (5% fat-free dry milk in PBS) for one hour at room temperature.

NCM inkuberades med överliggande cellodlingsvätska eller askitesvätska, som hade spätts med PBS-Tween, under en timme vid rumstemperatur och sköljdes med tre modifikatio- ner av PBS-Tween. I det andra steget inkuberades NCM med get-anti-mus-IgG-pepparrotsperoxidas, som hade spätts i PBS-Tween, under en timme vid rumstemperatur. Denna in- kubering följdes av tvättning med PBS-Tween och därefter neddoppning i pepparrotsperoxidas-färgframkallarlösning (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) under 20 min.The NCM was incubated with overlying cell culture fluid or ascites fluid, which had been diluted with PBS-Tween, for one hour at room temperature and rinsed with three modifications of PBS-Tween. In the second step, NCM was incubated with goat anti-mouse IgG horseradish peroxidase, which had been diluted in PBS-Tween, for one hour at room temperature. This incubation was followed by washing with PBS-Tween and then immersion in horseradish peroxidase dye developer solution (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) for 20 minutes.

Reaktionen avbröts genom neddoppning i avjoniserat vatten.The reaction was quenched by immersion in deionized water.

Monoklonal antikroppreaktivitet jämfördes med ett positivt kontrollserum, som var reaktivt med avseende på renat upp- löst virus eller uttryckt fusionsprotein. Resultaten visade att samtliga antikroppar band till gpl10 och dess för- stadiemolekyl, gpl50, under användning av upplösta virus- preparat. Antikropparna 110-1 och 110-2 kände även igen fusionsproteinet ENV3, medan antikropparna 110-3, 110-4, 110-5 och 110-6 bildade immunokomplex med ENV2.Monoclonal antibody reactivity was compared with a positive control serum, which was reactive for purified dissolved virus or expressed fusion protein. The results showed that all antibodies bound to gp110 and its precursor molecule, gp150, using dissolved virus preparations. Antibodies 110-1 and 110-2 also recognized the ENV3 fusion protein, whereas antibodies 110-3, 110-4, 110-5 and 110-6 formed immunocomplexes with ENV2.

Immunoprecipitation Virala extrakt för radioimmunoprecipitation framställdes från CEM-celler infekterade med LAVBRU-isolatet av HIV adapterat till lytisk tillväxt genom kontinuerlig passage.Immunoprecipitation Viral extracts for radioimmunoprecipitation were prepared from CEM cells infected with the LAVBRU isolate of HIV adapted to lytic growth by continuous passage.

Då tidigt cytopatiska effekter var uppenbara transfererades cellerna till markörmedier innehållande 35[S]-metionin (0,05 mCi/ml) eller 3[H]-glukosamin (0,025 mCi/ml), in- kuberades därefter under 24 timmar till dess de flesta cellerna hade lyserat, vilket frigjorde viruset i den överliggande odlingsvätskan. Viruset pelleterades (1 timme vid 100000 x g) från den cellfria överliggande vätskan och 506 025 43 detergentextrakt framställdes i P-RIPA-buffert (fosfatbuff- rad saltlösning innehållande 1,0% Triton X-100, 1,0% deoxi- cholat, 0,l% SDS och 1% Aprotinin). Liknande extrakt fram- ställdes från de överliggande vätskorna av icke-infekterade CEM-celler.When early cytopathic effects were evident, the cells were transferred to marker media containing [S] -methionine (0.05 mCi / ml) or 3 [H] -glucosamine (0.025 mCi / ml), then incubated for 24 hours until most the cells had lysed, releasing the virus into the overlying culture fluid. The virus was pelleted (1 hour at 100,000 xg) from the cell-free supernatant and detergent extracts were prepared in P-RIPA buffer (phosphate buffered saline containing 1.0% Triton X-100, 1.0% deoxycholate, , 1% SDS and 1% Aprotinin). Similar extracts were prepared from the supernatants of non-infected CEM cells.

Immunoprecipitationsanalyser utfördes med 100 pl virus- extrakt, inkuberat med 100 pl överliggande odlingsvätska från hybridcellinjerna, under 1 timme på is. Fyralnl kanin- anti-mus-Ig (Zymed Laboratories, So. San Francisco, Kali- fornien) sattes till varje prov och inkuberades under 30 min. Immunoprecipitin (100 pl; Bethesda Research Labora- tory, Bethesda, Maryland), som hade återsuspenderats i P- RIPA-buffert innehållande 1,0% oval bumin, sattes till varje prov och inkuberades under ytterligare 30 min. De bundna komplexen tvättades och separerades medelst SDS- polyakrylamid-gelelektrofores (15,0% akrylamid; DATD-gel).Immunoprecipitation assays were performed with 100 μl of virus extract, incubated with 100 μl of supernatant from the hybrid cell lines, for 1 hour on ice. Four rabbit anti-mouse Ig (Zymed Laboratories, San Francisco, California) was added to each sample and incubated for 30 minutes. Immunoprecipitin (100 μl; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland), which had been resuspended in P-RIPA buffer containing 1.0% oval bumin, was added to each sample and incubated for an additional 30 minutes. The bound complexes were washed and separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (15.0% acrylamide; DATD gel).

Efter elektrofores fixerades gelerna, neddoppades i Enhance (New England Nuclear, Boston, MA), torkades och exponerades för Kodak XR-5-film. Ett positivt referensserum, som im- munoprecipiterade alla virala HIV-proteiner, fick reagera med viral-infekterade och sken-infekterade överliggande CEM-cellvätskor som positiva och negativa kontroller.After electrophoresis, the gels were fixed, immersed in Enhance (New England Nuclear, Boston, MA), dried and exposed to Kodak XR-5 film. A positive reference serum, which immunoprecipitated all viral HIV proteins, was reacted with viral-infected and sham-infected overlying CEM cell fluids as positive and negative controls.

Resultaten visade att samtliga sex monoklonala antikroppar specifikt immunoprecipiterade gpl1O och gp150.The results showed that all six monoclonal antibodies specifically immunoprecipitated gp110 and gp150.

Enzymlänkad immunoadsorbensanalys För att kartlägga de gp1l0-epitoper som känns igen av de monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning karaktäriserades ytterligare överliggande odlingsvätskor från hybridcellinjer eller askitesvätska med avseende pà reaktiviteten vid ELISA med biologiskt uttryckta fusions- proteiner och syntetiska peptider. Förfarandena var de som har beskrivits ovan med undantag av att fusionsproteiner eller syntetiska peptider ersatte renat virus som det antigen som adsorberades på ytan av mikrotiterfacken.Enzyme-linked immunoadsorbent assay To map the gp110 epitopes recognized by the monoclonal antibodies of the present invention, additional overlying culture fluids from hybrid cell lines or ascites fluid were characterized for reactivity by ELISA with biologically expressed fusion proteins and synthetic peptides. The procedures were those described above except that fusion proteins or synthetic peptides replaced purified virus as the antigen adsorbed on the surface of the microtiter compartments.

När peptiderna användes som antigen var utstrykningsproto- 506 025 44 kollet som följer. Lyofiliserad peptid upplöstes i 6M guanidin-HCl. Strax före utstrykning i plattorna med 96 fack späddes guanidin-lösningen i 0,05 M karbonat/bikar- bonat-buffert (pH 9,6) till en slutlig peptidkoncentration av upp till 100/pg/ml. 50Ipl av den utspädda peptiden infördes i varje mikrotiterfack och plattorna inkuberades därefter över natten vid 4°C. Överskottet peptidlösning "avskakades", plattorna blockerades i Blotto och det ovan beskrivna förfarandet följdes för återstoden av ELISA- testet. Likaledes späddes rekombinant protein till en slutlig koncentration av cirka 2 pg/ml i 0,05 M karbonat/ bikarbonat-buffert (pH 9,6) innan samma förfarande följdes.When the peptides were used as antigen, the smear protocol was as follows. Lyophilized peptide was dissolved in 6M guanidine-HCl. Shortly before plating in the 96-well plates, the guanidine solution was diluted in 0.05 M carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) to a final peptide concentration of up to 100 / pg / ml. 50 μl of the diluted peptide was introduced into each microtiter compartment and the plates were then incubated overnight at 4 ° C. Excess peptide solution was "shaken off", the plates were blocked in Blotto, and the procedure described above was followed for the remainder of the ELISA test. Similarly, recombinant protein was diluted to a final concentration of about 2 pg / ml in 0.05 M carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) before following the same procedure.

Resultaten visas i tabell II. Monoklonala antikroppar Vproducerade av cellinjerna HIV gp1l0-1 och HIV gp110-2 reagerade med ENV3, ENV5, peptid 36 och upplöst virus.The results are shown in Table II. Monoclonal antibodies V produced by the cell lines HIV gp110-1 and HIV gp110-2 reacted with ENV3, ENV5, peptide 36 and dissolved virus.

Antikroppar från cellinjerna HIV-gpl10-3, HIV-gp110-4, HIV- gp1l0-5 och HIV-gp1l0-6 reagerade med ENV2 och peptid 29 liksom med upplöst virus. ll0-l ll0-2 ll0-3 ll0-4 ll0-5 ll0-6 TABELL II ELISA-analys uppvisande reaktiviteten hos monoklonala antikroppar med rekombinanta proteiner och syntetiska peptider Rekombinant fusionsprotein ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 0,077 3,000 0,113 3,000 -0,003 3,000 0,000 3,000 3,000 0,011 EB EB 3,000 0,020 EB EB 3,000 0,014 EB EB 3,000 0,033 EB EB EB= Syntetisk peptid LAV CEM 29 36 39 Kontroll Kontroll EB 2,421 0,054 0,908 0,125 EB 2,305 -0,005 1,214 0,009 3,000 EB 0,017 0,363 0,046 3,000 EB 0,016 0,383 0,067 3,000 EB 0,016 0,368 0,025 1,937 EB 0,017 0,486 0,032 ej bestämd sos 025 45 Resultaten i tabell II visar att monoklonala antikroppar 110-1 och 110-2 kände igen en antigenisk determinant, som kodades av en DNA-sekvens inom pENV3-regionen, närmare bestämt av den region i HIV-genomen som definieras av en sekvens av aminosyror inom peptid 36. Dvs, monoklonala antikroppar gp110-1 och 110-2 binder till en peptidregion av gp1l0, kodad inom bp7246 till 7317, såsom framgår av bildningen av immunkomplex med peptid 36 och ENV3. Denna region av HIV-genomen har tidigare identifierats som kon- serverad, dvs. ringa förändring i DNA-sekvensen i den region som kodas av peptid 36 bland olika virala isolat från olika geografiska lokaliteter. Se Starcich et al., Qgll 46:63? (1986). I motsats härtill binder monoklonala antikroppar gp1l0-3, -4, -5 och -6 till peptider i HIV, vilka definieras av den region som kodas av peptid 29 från bp6688 till ungefär bp6750. Den region i gp1l0 som definie- ras av peptid 29 har identifierats som innehållande flera nukleotidsubstitutioner bland olika virala isolat. Mono- klonala antikroppar, som selektivt binder till gpl10-poly- peptider, vilka innehåller konserverade epitoper, såsom antikroppar 110-1 och 110-2, kan ha ökad användbarhet i en mångfald fall, såsom vid affinitetskromatografi etc. Även vid ELISA-analysförfarandet reagerade peptid 110-2-2 med sera från den individ från vilken LAV-2 isolerades.Antibodies from the cell lines HIV-gp110-3, HIV-gp110-4, HIV-gp110-5 and HIV-gp110-6 reacted with ENV2 and peptide 29 as well as with dissolved virus. ll0-l ll0-2 ll0-3 ll0-4 ll0-5 ll0-6 TABLE II ELISA assay showing the reactivity of monoclonal antibodies with recombinant proteins and synthetic peptides Recombinant fusion protein ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 0.077 3,000 0.113 3,000 -0.003 3,000 0,000 0.011 EB EB 3,000 0.020 EB EB 3,000 0.014 EB EB 3,000 0.033 EB EB EB = Synthetic Peptide LOW CEM 29 36 39 Control Control EB 2.421 0.054 0.908 0.125 EB 2.305 -0.005 1.214 0.009 3,000 EB 0.017 0.363 0.046 3,000 EB 0.016 0.383 0.067 3,000 EB 0.016 0.368 0.025 1.937 EB 0.017 0.486 0.032 undetermined sos 025 The results in Table II show that monoclonal antibodies 110-1 and 110-2 recognized an antigenic determinant encoded by a DNA sequence within the pENV3 region, more specifically by that region. in the HIV genome defined by a sequence of amino acids within peptide 36. That is, monoclonal antibodies gp110-1 and 110-2 bind to a peptide region of gp110, encoded within bp7246 to 7317, as evidenced by the formation of immune complexes with p eptide 36 and ENV3. This region of the HIV genome has previously been identified as conserved, ie. slight change in the DNA sequence of the region encoded by peptide 36 among different viral isolates from different geographical locations. See Starcich et al., Qgll 46:63? (1986). In contrast, monoclonal antibodies gp110-3, -4, -5 and -6 bind to HIV peptides, which are defined by the region encoded by peptide 29 from bp6688 to approximately bp6750. The region of gp110 defined by peptide 29 has been identified as containing several nucleotide substitutions among different viral isolates. Monoclonal antibodies that selectively bind to gp110 polypeptides that contain conserved epitopes, such as antibodies 110-1 and 110-2, may have increased utility in a variety of cases, such as by affinity chromatography, etc. Also reacted in the ELISA assay procedure. peptide 110-2-2 with sera from the individual from which LAV-2 was isolated.

Indirekt immunofluorescensanalys Indirekta immunofluorescensanalyser under användning av monoklonala antikroppar, riktade mot gp110-antigenet i HIV, utfördes på acetonfixerade och levande celler. Acetonfixe- rade objektglaspreparat, som hade preparerats från LAV- infekterade CEM-celler, odlingsvätska eller askitesvätska under en timme vid 37°C inkuberade med utspädd överliggande medan levande celler inkuberades med överliggande odlings- vätska eller askitesvätska under en timme vid 4°C innan cellerna placerades på objektglas och acetonfixerades. Båda metoderna utnyttjade fluorescein-isotiocyanat-märkt anti- 506 025 46 mus-IgG för att detektera de celler som uppbar det reaktiva gp110-antigenet. Monoklonal antikropp HIV-gp110-1 gav positiva resultat under användning av både levande och acetonfixerade LAV-infekterade celler.Indirect immunofluorescence assay Indirect immunofluorescence assays using monoclonal antibodies directed against the gp110 antigen in HIV were performed on acetone-fixed and living cells. Acetone-fixed slide preparations prepared from LAV-infected CEM cells, culture broth or ascites fluid for one hour at 37 ° C incubated with dilute overlay while living cells were incubated with supernatant culture broth or ascites fluid for one hour at 4 ° C for 1 hour. was placed on slides and acetone fixed. Both methods utilized fluorescein isothiocyanate-labeled anti-mouse IgG to detect the cells carrying the reactive gp110 antigen. Monoclonal antibody HIV-gp110-1 gave positive results using both live and acetone-fixed LAV-infected cells.

EXEMPEL II Neutralisation av HIV-infektivitet med monoklonala anti- gp110-antikroppar Detta exempel beskriver och karaktäriserar neutralisationen av HIV-infektivitet under användning av monoklonala anti- kroppar, som binder till gp1l0 och peptider inom gp1l0.EXAMPLE II Neutralization of HIV Infectivity by Monoclonal Anti-gp110 Antibodies This example describes and characterizes the neutralization of HIV infectivity using monoclonal antibodies that bind to gp110 and gp110 peptides.

Resultaten visar att de monoklonala antikropparna gpllO-3, -4, -5 och -6 uppvisar neutraliserande aktivitet och att gpl10-3 och -4 uppvisar speciellt höga nivåer av neutrali- serande aktivitet.The results show that the monoclonal antibodies gp1010-3, -4, -5 and -6 show neutralizing activity and that gp110-3 and -4 show particularly high levels of neutralizing activity.

Neutralisationsanalvs En känslig neutralisationsanalys har utvecklats för att kvantifiera effekten av monoklonala antikroppar på HIV- infektivitet. En CD4+-cellinje, som är högkänslig för HIV- infektion, CEM, valdes som målcell för infektivitetsjäm- förelser. Askitesvätska, som hade framställts såsom be- skrivs i exempel I, eller IgG-fraktionen därav, som hade renats under användning av ammoniumsulfatutfällning, vär- meinaktiverades vid 56°C under 30 min. och späddes därefter efter behov i RPMI-medium innehållande 10% kalvfosterserum.Neutralization assay A sensitive neutralization assay has been developed to quantify the effect of monoclonal antibodies on HIV infectivity. A CD4 + cell line, which is highly susceptible to HIV infection, CEM, was chosen as the target cell for infectivity comparisons. Ascites liquid, which had been prepared as described in Example I, or the IgG fraction thereof, which had been purified using ammonium sulfate precipitate, was heat inactivated at 56 ° C for 30 minutes. and then diluted as needed in RPMI medium containing 10% fetal calf serum.

En suspension av HIV-stammen LAVBRU skördades från cirka fyra dagar gamla kulturer av CEM i tillväxt-log-fasen, filtrerades genom 0,2 eller 0,45 mikronfilter, alikvote- rades och frystes vid -70°C. En alikvot tinades, titrerades för bestämning av TCID50 och efterföljande analyser utför- des med nytinade alikvoter, spädda 1:50O i odlingsmedium till en koncentration av cirka 10 gånger den mängd som krävdes för att infektera 50% av CEM-cellerna i kultur (10 TCID50). Virussuspensionen blandades med en lika stor volym (250'pl) av ett preparat av monoklonal antikropp i femfal- 506 025 47 diga spädningar från 1:5 till 1:9765625. Virus/antikropp- blandningen inkuberades under 45 min. vid 37°C och därefter användes dubbelprover om 200¿ul för ympning av fack, som innehöll 1,0 ml av cirka 2xl05 CEM-celler per fack. Kul- turerna inkuberades vid 37°C i fuktig atmosfär innehållande % C02 under 14 dagar. Cellerna skördades, pelleterades och lyserades med 1% Triton X-100 i PBS under cirka 10 min. Den mängd virus (eller viralt antigen) som var närvarande i de lyserade cellerna kvantifierades under användning av en känslig HIV-antigen-fångst-"sandwich“-enzymimmunoanalys, som beskrivs nedan. Titern av eventuell neutraliserande aktivitet bestämdes som det inverterade värdet av den spädning av monoklonal antikropp som inhiberade antigenpro- duktionen med mer än 50% av viruskontrollkulturer, som hade inkuberats utan antikropp eller med en monoklonal antikropp av samma isotyp, vilken tidigare hade visat sig sakna neutraliserande aktivitet.A suspension of the HIV strain LAVBRU was harvested from approximately four day old cultures of CEM in the growth log phase, filtered through a 0.2 or 0.45 micron filter, aliquoted and frozen at -70 ° C. An aliquot was thawed, titrated to determine TCID50, and subsequent assays were performed with freshly thawed aliquots, diluted 1: 50O in culture medium to a concentration of about 10 times the amount required to infect 50% of the CEM cells in culture (TCID50). ). The virus suspension was mixed with an equal volume (250 μl) of a monoclonal antibody preparation in five-fold dilutions from 1: 5 to 1: 9765625. The virus / antibody mixture was incubated for 45 minutes. at 37 ° C and then 200 μl duplicate samples were used to inoculate compartments containing 1.0 ml of approximately 2x10 5 CEM cells per compartment. The cultures were incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere containing% CO 2 for 14 days. The cells were harvested, pelleted and lysed with 1% Triton X-100 in PBS for about 10 minutes. The amount of virus (or viral antigen) present in the lysed cells was quantified using a sensitive HIV antigen capture "sandwich" enzyme immunoassay, as described below. The titer of any neutralizing activity was determined as the inverted value of the dilution of monoclonal antibody that inhibited antigen production by more than 50% of virus control cultures, which had been incubated without antibody or with a monoclonal antibody of the same isotype, which had previously been shown to lack neutralizing activity.

Ovan angivna HIV-antigen-fångst-analys utnyttjade två monoklonala antikroppar riktade mot p25-antigener som fångstreagens. Dessa hybridomcellinjer alstrades medelst de metoder som har beskrivits ovan med mindre modifikationer, inklusive användning av ett renat rekombinant ggg-fusions- protein som immunogen och karaktärisering av de erhållna monoklonala antikropparna med avseende på specificitet och reaktivitet under användning av rekombinanta fusionspro- teiner, som tidigare har betecknats GAG-1, GAG-2 och GAG-3, och den syntetiska peptiden 141. Protein GAG-1 uttryckes från pGAG-1 (A.T.C.C. nr. 53379), GAG-2 uttryckes från pGAG-2 (A.T.C.C. nr. 53111) och GAG-3 uttryckes från pGAG-3 (A.T.C.C. nr. 53112). Framställningen av de rekombinanta fusionsproteinerna beskrivs närmare i detalj i de samtidigt anhängiga amerikanska patentansökningarna 764 460 och 828 828, vilka införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. Den syntetiska peptiden 141 kodas av den genomiska LAVBRU-region som motsvarar aminosyra- resterna 198-242. Monoklonal antikropp, som produceras av hybridomcellinjerna p25-2 och p25-3, har visat sig vara 506 025 48 reaktiva med de rekombinanta fusionsproteinerna GAG-1, GAG-2 och GAG-3 och monoklonalen av p25-3 är även reaktiv med den syntetiska peptiden 141.The above HIV antigen capture assay utilized two monoclonal antibodies directed against p25 antigens as capture reagents. These hybridoma cell lines were generated by the methods described above with minor modifications, including the use of a purified recombinant ggg fusion protein as an immunogen and characterization of the resulting monoclonal antibodies for specificity and reactivity using recombinant fusion proteins, as previously have been designated GAG-1, GAG-2 and GAG-3, and the synthetic peptide 141. Protein GAG-1 is expressed from pGAG-1 (ATCC No. 53379), GAG-2 is expressed from pGAG-2 (ATCC No. 53111) and GAG-3 is expressed from pGAG-3 (ATCC No. 53112). The preparation of the recombinant fusion proteins is described in more detail in co-pending U.S. Patent Applications 764,460 and 828,828, which are incorporated herein by reference. The synthetic peptide 141 is encoded by the LAVBRU genomic region corresponding to amino acid residues 198-242. Monoclonal antibody produced by the hybridoma cell lines p25-2 and p25-3 has been shown to be reactive with the recombinant fusion proteins GAG-1, GAG-2 and GAG-3 and the monoclonal of p25-3 is also reactive with the synthetic peptides 141.

För utförande av antigen-fångst-analysen adsorberades först fångstreagensen på en fast bärare. Askitesvätska, som härrörde från hybridomcellinjerna p25-2 och p25-3, späddes 1:5000 i 25 mM Tris-buffert, pH 8,5 och 200,pl infördes i facken till mikrotiterplattor. Facken förseglades och inku- berades under cirka 16 timmar vid 4°C. Lösningen avlägsna- des från facken genom sug innan en blockerande lösning av 0,3% Blotto i PBS tillsattes. Blockeringen utfördes under min. vid rumstemperatur. Den blockerande lösningen avsögs och provet tillsattes. 200,pl av den lyserade cell- suspensionen och 5,0 pl detektionskonjugat, som hade fram- ställts enligt nedan, sattes till varje fack. Remsorna eller plattorna med fack inkuberades under tvâ timmar vid 37°C, varefter suspensionen avsögs och facken tvättades fyra gånger med buffert (0,05% Tween 20 i PBS). Detektions- konjugatet framställdes som följer. Monoklonala antikroppar p25-6 och p25-7 konjugerades till pepparrotsperoxidas (HRP) i ett molförhàllande 3:1 (Ab:HRP) under tre timmar under användning av ett perjodatoxidationsförfarande (Nakane, et al., J. Histochem. Cytochem. 22:1084 (1974)). Konjugaten späddes l:1500 i 2,5% (vikt/volym) fettfri torrmjölk, 0,01% timerosal och 0,005% Antifoam A i 20mM natriumcitrat. Återstoden av ELISA-förfarandet utfördes såsom beskrivits i exempel I.To perform the antigen capture assay, the capture reagents were first adsorbed on a solid support. Ascites fluid, derived from the hybridoma cell lines p25-2 and p25-3, was diluted 1: 5000 in 25 mM Tris buffer, pH 8.5 and 200, μl was introduced into the compartments of microtiter plates. The compartments were sealed and incubated for about 16 hours at 4 ° C. The solution was removed from the compartments by suction before a blocking solution of 0.3% Blotto in PBS was added. The block was performed during min. at room temperature. The blocking solution was filtered off with suction and the sample was added. 200 .mu.l of the lysed cell suspension and 5.0 .mu.l of detection conjugate, which had been prepared as below, were added to each compartment. The strips or plates with compartments were incubated for two hours at 37 ° C, after which the suspension was filtered off and the compartments were washed four times with buffer (0.05% Tween 20 in PBS). The detection conjugate was prepared as follows. Monoclonal antibodies p25-6 and p25-7 were conjugated to horseradish peroxidase (HRP) in a 3: 1 molar ratio (Ab: HRP) for three hours using a periodate oxidation method (Nakane, et al., J. Histochem. Cytochem. 22: 1084 (1974)). The conjugates were diluted 1: 1500 in 2.5% (w / v) fat-free dry milk, 0.01% thimerosal and 0.005% Antifoam A in 20 mM sodium citrate. The remainder of the ELISA procedure was performed as described in Example I.

Resultaten av bestämningen av den neutraliserande aktivite- ten med antikropparna gp1l0-3, -4, -5, och -6 är som föl- De högsta titrar som bibehöll neutraliserande aktivi- 625; gp1l0-4 = 9 765 625. jer. tet fastställdes vara: gp1l0-3 = 625; gpl10-5 = 125; och gpll0-6 = Till följd av den förutsägbara genetiska variationen hos den region som definieras av peptid 29, undersöktes för- mågan hos den monoklonala antikroppen gpl10-4 att känna 506 025 49 igen andra isolat av HIV. Immunofluorescens-analyser utför- des som beskrivits ovan. Antikroppen gpl10-4 detekterade antigen i kulturer av minst 3 av 16 testade HIV-isolat.The results of the determination of the neutralizing activity with the antibodies gp110-3, -4, -5, and -6 are as follows- The highest titers which retained neutralizing activity 625; gp1l0-4 = 9 765 625. jer. the tet was determined to be: gp110-3 = 625; gpl10-5 = 125; and gp110-6 = Due to the predictable genetic variation of the region defined by peptide 29, the ability of the monoplonal antibody gp110-4 to recognize other isolates of HIV was examined. Immunofluorescence assays were performed as described above. The gp110-4 antibody detected antigen in cultures of at least 3 of 16 HIV isolates tested.

Antikroppen gp1l0-4 kunde neutralisera virus, som hade isolerats under 15 veckor från en chimpans, som hade ympats med LAVBRU, som kontrolldjur vid ett AIDS-vaccinförsök. Den monoklonala antikroppen kunde neutralisera isolaten även om djuret hade serumantikroppar, som neutraliserade HIV in vitro och hade utvecklat ett mätbart cellförmedlat immun- svar mot HIV-infektionen. Detta visar brist på antigenisk drift in yiyg för den epitop som känns igen av antikroppen gp110-4.The gp110-4 antibody was able to neutralize viruses that had been isolated for 15 weeks from a chimpanzee vaccinated with LAVBRU as a control animal in an AIDS vaccine trial. The monoclonal antibody could neutralize the isolates even if the animal had serum antibodies that neutralized HIV in vitro and had developed a measurable cell-mediated immune response to the HIV infection. This indicates a lack of antigenic drive in yiyg for the epitope recognized by the antibody gp110-4.

EXEMPEL III Neutralisation av HIV-infektivitet medelst en cocktail av monoklonala anti-gp110- och anti-gp25-antikroppar Detta exempel beskriver neutralisation av HIV-infektivitet under användning av monoklonala antikroppar, som binder till gp110 och peptider inom gpll0, i kombination med mono- klonala antikroppar, som binder till p25 och peptider inom p25, vilka separat visar ringa eller ingen neutraliserande aktivitet. Resultaten visar att den monoklonala antikroppen gpll0-2 i kombination med antingen p25-6 eller p25-7 upp- visar speciellt höga nivåer av neutraliserande aktivitet.EXAMPLE III Neutralization of HIV Infectivity by a Cocktail of Anti-gp110 and Anti-gp25 Monoclonal Antibodies This example describes the neutralization of HIV infectivity using monoclonal antibodies that bind to gp110 and gp110 peptides in combination with monoplonal antibodies. clonal antibodies that bind to p25 and peptides within p25 that separately show little or no neutralizing activity. The results show that the monoclonal antibody gp110-2 in combination with either p25-6 or p25-7 shows particularly high levels of neutralizing activity.

Hybridomcellinjer p25-6 och p25-7 alstrades medelst ovan beskrivna metoder med modifikationer, som innefattade användning av upplöst virus eller ett renat rekombinant gag-fusionsprotein, uttryckt i E. ggli, som immunogen och karaktärisering av de erhållna monoklonala antikropparna med avseende på specificitet och reaktivitet under använd- ning av de rekombinanta fusionsproteiner som tidigare har betecknats GAG-1, GAG-2 och GAG-3 och de syntetiska pep- tiderna 15, 88, 150, 147 och 148. De syntetiska peptiderna kodades av den genomiska LAVBRU-region som motsvarar amino- syrarester enligt följande: peptid 15, aminosyraresterna 506 025 50 329 till 350; peptid 88, aminosyraresterna 315 till 350; peptid 150, aminosyraresterna 318 till 363; peptid 147, aminosyraresterna 278 till 319; och peptid 148, aminosyra- resterna 290 till 319. De monoklonala antikroppar som producerades av hybridomcellinjerna p25-6 och p25-7 är _reaktiva med det rekombinanta fusionsproteinet GAG-3, p25-6 är reaktiv med de syntetiska peptiderna 147 och 148 och p25-7 är reaktiv med de syntetiska peptiderna 15, 88 och 150.Hybridoma cell lines p25-6 and p25-7 were generated by the methods described above with modifications, which included the use of dissolved virus or a purified recombinant gag fusion protein, expressed in E. ggli, as immunogen and characterization of the obtained monoclonal antibodies with respect to specificity and reactivity using the recombinant fusion proteins previously designated GAG-1, GAG-2 and GAG-3 and the synthetic peptides 15, 88, 150, 147 and 148. The synthetic peptides were encoded by the genomic LAVBRU region corresponding to amino acid residues as follows: peptide 15, amino acid residues 506 025 50 329 to 350; peptide 88, amino acid residues 315 to 350; peptide 150, amino acid residues 318 to 363; peptide 147, amino acid residues 278 to 319; and peptide 148, amino acid residues 290 to 319. The monoclonal antibodies produced by the hybridoma cell lines p25-6 and p25-7 are reactive with the recombinant fusion protein GAG-3, p25-6 are reactive with the synthetic peptides 147 and 148 and p25- 7 is reactive with the synthetic peptides 15, 88 and 150.

Neutralisationsanalyser utfördes såsom beskrivits ovan med undantag av att, när cocktails användes, individuella mono- klonala antikroppar först späddes 1:5 i odlingsmedium och därefter blandades i lika förhållanden för erhållande av en slutlig spädning av 1:10. Återstoden av analysen utfördes såsom beskrivits ovan.Neutralization assays were performed as described above except that, when cocktails were used, individual monoclonal antibodies were first diluted 1: 5 in culture medium and then mixed in equal proportions to obtain a final dilution of 1:10. The remainder of the assay was performed as described above.

De monoklonala antikropparna gp110-2, p25-6 och p25-7 visar mindre än 50% neutraliserande aktivitet vid användning separat. Vid användning i en cocktail, som innefattar de monoklonala antikropparna gp110-2 med p25-6 eller gp110-2 med p25-7 i en spädning av 1:10, erhölls total neutralisa- tion. En cocktail innefattande de monoklonala antikropparna p25-6 i kombination med p25-7 gav en neutraliserande ak- tivitet inom intervallet 60-90%.The monoclonal antibodies gp110-2, p25-6 and p25-7 show less than 50% neutralizing activity when used separately. When used in a cocktail comprising the monoclonal antibodies gp110-2 with p25-6 or gp110-2 with p25-7 at a dilution of 1:10, total neutralization was obtained. A cocktail comprising the monoclonal antibodies p25-6 in combination with p25-7 gave a neutralizing activity in the range of 60-90%.

EXEMPEL IV Immunopotens hos peptid 29 och homoloqer Förmågan hos peptid 29 och homologa peptider innefattade peptid 177 att stimulera ett immunsvar mot HIV undersöktes på två musstammar. Förfarandena för framställning av pep- tidimmunogenerna, immuniseringsprotokoll och för karak- tärisering av det alstrade immunsvaret beskrivs närmare nedan.EXAMPLE IV Immunopotency of Peptide 29 and Homologues The ability of peptide 29 and homologous peptides including peptide 177 to stimulate an immune response to HIV was tested on two mouse strains. The methods for preparing the peptide immunogens, immunization protocols and for characterizing the generated immune response are described in more detail below.

Peptid 29 framställdes för immunisering genom konjugation till ett renat tyroglobulin. Tyroglobulin kan derivatiseras 506 025 51 med N-succinimidyl-4-(N-maleimidometyl) cyklohexan-1-kar- boxylat (SMCC) för konjugation enligt det förfarande som anges i US 4 629 783, spalt 10, raderna 28-51. Som en andra immunogen derivatiserades tyroglobulin med glutaraldehyd som följer. Svin-tyroglobulin, 27 mg, upplöstes i 1 ml 0,1 M natriumbikarbonat, till vilken 8,3 pl av en 25%-ig glu- taraldehydlösning sattes droppvis, och blandningen omrördes över natten vid rumstemperatur. 1 ml natriumkarbonat/bikar- bonat-buffert, pH 9,3, sattes till lösningen och dialyse- rades därefter under 8 timmar mot 2 liter av samma buffert vid 4°C med ett fullständigt utbyte av dialysat efter 4 timmar. Peptid 29 sattes därefter till det derivatiserade tyroglobulinet i ett ungefärligen 100-molärt överskott och blandningen omrördes över natten vid rumstemperatur. Orea- gerad glutaraldehyd blockerades med 200,nl av en 0,2 M lysin-lösning, vilken blandning omrördes under flera timmar (eller över natten) vid rumstemperatur. Peptid-tyroglo- bulin-konjugatet dialyserades därefter extensivt mot PBS vid 4°C.Peptide 29 was prepared for immunization by conjugation to a purified thyroglobulin. Thyroglobulin can be derivatized with N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) for conjugation according to the procedure set forth in U.S. 4,629,783, column 10, lines 28-51. As a second immunogen, thyroglobulin was derivatized with glutaraldehyde as follows. Pig thyroglobulin, 27 mg, was dissolved in 1 ml of 0.1 M sodium bicarbonate, to which 8.3 μl of a 25% glutaraldehyde solution was added dropwise, and the mixture was stirred overnight at room temperature. 1 ml of sodium carbonate / bicarbonate buffer, pH 9.3, was added to the solution and then dialyzed for 8 hours against 2 liters of the same buffer at 4 ° C with a complete exchange of dialysate after 4 hours. Peptide 29 was then added to the derivatized thyroglobulin in an approximately 100 molar excess and the mixture was stirred overnight at room temperature. Unreacted glutaraldehyde was blocked with 200 .mu.l of a 0.2 M lysine solution, which mixture was stirred for several hours (or overnight) at room temperature. The peptide-thyroglobulin conjugate was then extensively dialyzed against PBS at 4 ° C.

Två musstammar (C57 svart och BALB/c) ympades med peptider, som hade framställts medelst vardera konjugationsmetoden.Two mouse strains (C57 black and BALB / c) were inoculated with peptides prepared by each conjugation method.

Samtliga djur var ungefär 2-4 veckor gamla vid ympnings- tillfället. Ympningssätten innefattade tass/svans-skari- fikation, subkutant, intranasalt eller intraperitonialt.All animals were approximately 2-4 weeks old at the time of inoculation. Inoculation methods included paw / tail scarification, subcutaneously, intranasally or intraperitoneally.

Ymppreparatet bestod av 25¿ug konjugerad peptid, suspende- rad i 0,5 ml av Freunds kompletta adjuvans, med booster- ympningar upprepade veckorna 2, 3 och 5 med samma immunogen suspenderad i Freunds ofullständiga adjuvans. Serumprover från individuella möss tillvaratogs före immunisering, 4 dagar efter booster-immuniseringen vid 3 veckor och 4 dagar efter den slutliga booster-immuniseringen vid 5 veckor.The inoculum consisted of 25 μg of conjugated peptide, suspended in 0.5 ml of Freund's complete adjuvant, with booster inoculations repeated at weeks 2, 3 and 5 with the same immunogen suspended in Freund's incomplete adjuvant. Serum samples from individual mice were collected before immunization, 4 days after the booster immunization at 3 weeks and 4 days after the final booster immunization at 5 weeks.

Serumproverna analyserades med avseende på antikroppar mot homologa peptider eller helvirus genom ELISA-screening.The serum samples were assayed for antibodies to homologous peptides or whole viruses by ELISA screening.

Sera,som uppvisade antikroppsaktivitet mot LAV, underkas- tades ytterligare screening med avseende på neutraliserande aktivitet, följt av analys av sera genom immunoblotting mot upplöst LAV-antigen och radioimmunoprecipitationsanalys med 506 025 52 radioaktivt märkt gpl10.Sera showing antibody activity to LAV were further screened for neutralizing activity, followed by analysis of sera by immunoblotting against dissolved LAV antigen and radioimmunoprecipitation assay with 506 025 52 radiolabeled gp110.

Resultaten av immuniseringarna visade att möss, immunise- rade med peptid 29, utvecklade antikroppar, som var reak- tiva med peptid 29 och upplöst LAV-1-virus vid ELISA. Kon- jugation av peptid 29 via glutaraldehyd framkallade allmänt en högre titer av antikroppar mot peptid 29 hos Balb/c- möss, ehuru konjugation via maleimid ej med framgång ut- vecklade anti-peptid 29-antikroppar hos vissa Balb/c-möss.The results of the immunizations showed that mice immunized with peptide 29 developed antibodies that were reactive with peptide 29 and dissolved LAV-1 virus by ELISA. Conjugation of peptide 29 via glutaraldehyde generally elicited a higher titer of antibodies to peptide 29 in Balb / c mice, although conjugation via maleimide did not successfully develop anti-peptide 29 antibodies in some Balb / c mice.

Möss, immuniserade med peptid 177, utvecklade antikroppar mot peptiden och konjugation av peptid 177 via glutaral- dehyd var bättre när det gällde att framkalla ett immuno- logiskt svar. C57-möss var mera responsiva på immunstimule- ring med peptid 177 än Balb/c-möss. Möss, immuniserade med LAV-2-peptiden 110-2-2, utvecklade antikroppar mot 110-2-2 (och LAV-2-virus såsom framgick av ELISA. Peptid 110-2-2, konjugerad via glutaraldehyd, var immunogen hos både C57- och Balb/c-möss ehuru titrar mot 110-2-2-peptiden allmänt var högre hos Balb/c-möss än hos C57-möss, medan titrar mot LAV-2-virus allmänt var högre hos C57-möss än hos Balb/c- möss.Mice, immunized with peptide 177, developed antibodies to the peptide, and conjugation of peptide 177 via glutaraldehyde was better at eliciting an immunological response. C57 mice were more responsive to immune stimulation with peptide 177 than Balb / c mice. Mice, immunized with the LAV-2 peptide 110-2-2, developed antibodies to 110-2-2 (and LAV-2 virus as evidenced by ELISA. Peptide 110-2-2, conjugated via glutaraldehyde, was immunogenic in both C57 and Balb / c mice, although titers against the 110-2-2 peptide were generally higher in Balb / c mice than in C57 mice, while titers against LAV-2 virus were generally higher in C57 mice than in C57 mice. Balb / c mice.

Allmänt visar serumprover från immuniserade möss, vilka (i) uppvisar antikroppar mot helvirus; (ii) har förmåga att neutralisera HIV, såsom vid de analyser som har beskrivits i exempel II; och (iii) är reaktiva med peptid 29 vid ELISA, kumulativt effektiviteten vid användning av peptid 29 i en vaccinberedning.In general, serum samples from immunized mice show, which (i) show antibodies to whole virus; (ii) is capable of neutralizing HIV, as in the assays described in Example II; and (iii) are reactive with peptide 29 in ELISA, cumulatively the efficacy of using peptide 29 in a vaccine formulation.

EXEMPEL V Immunoaffinitetsseparation av gpll0 under användninq av monoklonal antikropp Monoklonala antikroppar mot gp110-antigenerna av HIV kan användas vid immunoaffinitetspreparation-förfaranden för att väsentligt rena bakteriellt uttryckta rekombinanta fusionsproteiner. Om det uttryckta proteinet utsöndras av bakterierna kan det isoleras från den överliggande odlings- 506 025 53 vätskan; om proteinet ej utsöndras kan upplösning av bak- teriecellerna vara nödvändig.EXAMPLE V Immunoaffinity Separation of gp110 Using Monoclonal Antibody Monoclonal antibodies to the gp110 antigens of HIV can be used in immunoaffinity preparation methods to substantially purify bacterially expressed recombinant fusion proteins. If the expressed protein is secreted by the bacteria, it can be isolated from the supernatant culture fluid; if the protein is not secreted, dissolution of the bacterial cells may be necessary.

Konstruktion av plasmiden pENV-5 (A.T.C.C. nr. 53074) beskrivs i den samtidigt anhängiga amerikanska patentansök- ningen 721 237, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. Plasmiden pENV-5 kodar för en huvuddel av karboxyländen av gp1lO och en del av aminoänden av gp41 av LAV införd i ggp-expressionsvektorn. §¿ ggli C600, som transformeras av denna vektor, uttrycker men utsöndrar ej gp110-fusionsproteinet. §¿ ggli C600, som innehåller plasmiden pENV-5, får växa i ett medium innehållande tryptofan (20 mikrogram/ml) och ampicilin (100 pg/ml) över natten vid 37°C under luftning.Construction of plasmid pENV-5 (A.T.C.C. No. 53074) is described in co-pending U.S. Patent Application 721,237, which is incorporated herein by reference. Plasmid pENV-5 encodes a major portion of the carboxyl terminus of gp110 and a portion of the amino terminus of gp41 of LAV inserted into the gpg expression vector. The G600 C600, which is transformed by this vector, expresses but does not secrete the gp110 fusion protein. Section C600, which contains the plasmid pENV-5, is grown in a medium containing tryptophan (20 micrograms / ml) and ampicillin (100 pg / ml) overnight at 37 ° C under aeration.

De kulturer som har fått växa över natten ympas därefter vid 1:100 i färskt minimalmedium innehållande ampicillin (100 pg/ml) men ej tryptofan. Dessa kulturer får växa under luftning 2-3 timmar (upp till tidig log-fas) vid 37°C.The cultures that have been allowed to grow overnight are then inoculated at 1: 100 in fresh minimal medium containing ampicillin (100 pg / ml) but not tryptophan. These cultures are allowed to grow during aeration for 2-3 hours (up to early log phase) at 37 ° C.

Induceringsmedlet, 3-B-indolakrylsyra (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), tillsätts därefter till en slutkoncentra- tion av 20Apg från nyframställda förrådslösningar om 20 mg/ml i 95% etanol. De inducerade kulturerna får därefter växa vid 37°C 4-5 timmar under luftning och pelleteras därefter och fryser eventuellt. Proteinutbyten från pENV-5 är typiskt mindre än 1 mg/l.The inducer, 3-β-indolacrylic acid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), is then added to a final concentration of 20Apg from freshly prepared stock solutions of 20 mg / ml in 95% ethanol. The induced cultures are then allowed to grow at 37 ° C for 4-5 hours during aeration and then pelleted and optionally frozen. Protein yields from pENV-5 are typically less than 1 mg / l.

De pelleterade bakteriecellerna lyseras under användning av P-RIPA-buffert (PBS innehållande 1% Triton X-100, 1% deoxi- cholat, 0,1% natriumdodecylsulfat och 1% Aprotinin), som lyserar E. coli-celler. Suspensionen kan ultraljudbehandlas för skjuvning av DNA och RNA, följt av centrifugering för avlägsnande av partikelformigt material. Ett spädning- eller koncentreringssteg kan därefter vara erforderligt för att standardisera proteinkoncentrationen.The pelleted bacterial cells are lysed using P-RIPA buffer (PBS containing 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate and 1% Aprotinin), which lyses E. coli cells. The suspension can be sonicated to shear DNA and RNA, followed by centrifugation to remove particulate matter. A dilution or concentration step may then be required to standardize the protein concentration.

Den monoklonala antikroppen HIV-gp110-1 utfälles initiellt från askitesvätska eller överliggande odlingvätskor vid 506 025 54 rumstemperatur eller i kyla med (NH4)2SO4-eller Na2SO4- lösningar buffrade vid pH 7,3 till en slutlig mättnad av 33 respektive 18%. Utfällda proteiner avlägsnas genom centri- fugering och återupplöses i PBS och utfälles en andra gång med 33% (NH4)2SO4 eller 12-15% Na2SO4. Detta steg kan upprepas om så erfordras. Pelleten upplöses ånyo i PBS och överskottet av salter avlägsnas genom gelfiltrering genom en avsaltningsmatris eller genom extensiv dialys mot PBS.The HIV-gp110-1 monoclonal antibody is initially precipitated from ascites fluid or supernatants at room temperature or in cold with (NH 4) 2 SO 4 or Na 2 SO 4 solutions buffered at pH 7.3 to a final saturation of 33 and 18%, respectively. Precipitated proteins are removed by centrifugation and redissolved in PBS and precipitated a second time with 33% (NH 4) 2 SO 4 or 12-15% Na 2 SO 4. This step can be repeated if required. The pellet is redissolved in PBS and the excess salts are removed by gel filtration through a desalting matrix or by extensive dialysis against PBS.

Renad monoklonal 110-1-antikropp kan därefter kopplas till cyanogenbromidaktiverad Sepharose. Den nödvändiga gel- mängden får svälla i lO“3 M HCl-lösning på ett glasfilter (1 g frystorkat material ger en slutlig gelvolym av cirka 3,5 ml) och tvättas under 15 min med samma lösning och antikroppen tillsätts omedelbart därefter. I allmänhet fortgår kopplingsreaktionen effektivast inom ett pH-inter- vall av 8-10 men ett lägre pH-värde kan användas, om så erfordras för antikroppens stabilitet. Antikroppen bör upplösas i PBS eller en karbonat/bikarbonat- eller borat- buffert med 150 mM NaCl och med hög jonstyrka. Den aktive- rade Sepharose- och antikroppsuspensionen omröres försik- tigt under 2-4 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4°C och tvättas därefter på ett grovt glasfilter med kopplingsbuffert. Eventuellt kvarvarande aktiva grupper blockeras genom behandling med 1,0 M etanolamin vid pH 8 under 2 timmar. Den slutliga antikropp-Sepharose-produkten tvättas därefter alternerande med buffertlösningar med högt och lågt pH (boratbuffert, 0,1M, pH 8,5, l M NaCl resp. acetatbuffert, 0,lM, pH 4,0, 1 M NaCl) fyra eller fem gånger. Denna tvättning avlägsnar spår av icker-kovalent adsorberat material. Den slutliga immunoaffinitetsepara- tions-matrisen förvaras vid en temperatur under 8°C i närvaro av ett lämpligt bakteriostatiskt medel såsom 0,01% azid.Purified 110-1 monoclonal antibody can then be coupled to cyanogen bromide-activated Sepharose. The required amount of gel is allowed to swell in 10 ”3 M HCl solution on a glass filter (1 g of lyophilized material gives a final gel volume of about 3.5 ml) and washed for 15 minutes with the same solution and the antibody is added immediately afterwards. In general, the coupling reaction proceeds efficiently within a pH range of 8-10, but a lower pH may be used, if required for the stability of the antibody. The antibody should be dissolved in PBS or a carbonate / bicarbonate or borate buffer with 150 mM NaCl and high ionic strength. The activated Sepharose and antibody suspension is gently stirred for 2-4 hours at room temperature or overnight at 4 ° C and then washed on a coarse glass filter with coupling buffer. Any remaining active groups are blocked by treatment with 1.0 M ethanolamine at pH 8 for 2 hours. The final antibody-Sepharose product is then washed alternately with high and low pH buffer solutions (borate buffer, 0.1M, pH 8.5, 1 M NaCl and acetate buffer, 0.1M, pH 4.0, 1 M NaCl, respectively) four or five times. This washing removes traces of non-covalently adsorbed material. The final immunoaffinity separation matrix is stored at a temperature below 8 ° C in the presence of a suitable bacteriostatic agent such as 0.01% azide.

Tillsatsen av suspensionen av uttryckt protein till im- munoaffinitetseparations-matrisen resulterar i selektivt avlägsnande av gpllO-antigenet. Blandningen får reagera '506 025 55 under 2-24 timmar, företrädesvis 12-18 timmar, under lång- sam omröring eller skakning. En kolonn kan även användas, varvid immunoaffinitetsmatrisen hälles i en kolonn och får anta jämvikt och suspensionen av uttryckt protein långsamt sättes till kolonnen. Efter det att proteinsuspensionen har tillsatts bör flödet avbrytas för att medge maximal immun- komplexbildning.The addition of the suspension of expressed protein to the immunoaffinity separation matrix results in the selective removal of the gp110 antigen. The mixture is allowed to react for 2-24 hours, preferably 12-18 hours, with slow stirring or shaking. A column can also be used, the immunoaffinity matrix being poured into a column and allowed to equilibrate and the suspension of expressed protein is slowly added to the column. After the protein suspension has been added, the flow should be stopped to allow maximum immune complex formation.

Icke-bundet material borttvättas eller separeras genom omsorgsfull tvättning med adsorptionsbuffert. Ett grovt glasfilter med vakuum kan användas eller kolonngenomström- ning. Det bundna materialet elueras därefter under använd- ning av buffert med högt eller lågt pH-värde (acetatbuf- fert, pH 4,0, eller boratbuffert, pH 8,56) eller ett chao4 tropt medel.Unbound material is washed away or separated by careful washing with adsorption buffer. A coarse glass filter with vacuum can be used or column flow. The bound material is then eluted using a high or low pH buffer (acetate buffer, pH 4.0, or borate buffer, pH 8.56) or a chao4 tropic agent.

EXEMPEL V1 Immunoaffinitetsrening av rekombinant gp110 från ett ex- pressionssystem från däggdjur De monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning finner användning vid immunoaffinitetsrening av rekombinant fusions-gp110, som uttrycks av däggdjursceller. Däggdjurs- celler infekteras med rekombinant vaccinia (Mackett et al., Q. Virol. 49:85? (1984), som införlivas med denna beskriv- ning genom hänvisning därtill), som innehåller sekvenser, vilka kodar för åtminstone den del av gp110 som är antige- nisk och framkallar neutraliserande antikroppar.EXAMPLE V1 Immunoaffinity Purification of Recombinant Gp110 from a Mammalian Expression System The monoclonal antibodies of the present invention find use in immunoaffinity purification of recombinant fusion gp110 expressed by mammalian cells. Mammalian cells are infected with recombinant vaccinia (Mackett et al., Q. Virol. 49:85? (1984), which is incorporated herein by reference), which contain sequences which encode at least the portion of gp110 which is antigenic and produces neutralizing antibodies.

Det rekombinanta vaccinia konstrueras enligt den metod som har beskrivits i den amerikanska patentansökningen 842 984, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. I korthet innebär detta att sekvenser, för höljesglykoproteinet av HIV, införs i en plasmidvektor (pGS20) nedströms om ett transkriptionellt vaccinia- kontrolllelement. Denna chimera gen flankeras av sekvenser, som kodar som kodar för den virala tymidin-kinas (TK)-genen. 506 025 56 Chimera plasmidvektorer, som innehåller vacciniaviruspro- motor ligerad till LAV-höljesgenen, används för transforma- ggli-stammen MCIOOO.The recombinant vaccinia is constructed according to the method described in U.S. Patent Application 842,984, which is incorporated herein by reference. Briefly, this means that sequences, for the envelope glycoprotein of HIV, are introduced into a plasmid vector (pGS20) downstream of a transcriptional vaccinia control element. This chimeric gene is flanked by sequences encoding the viral thymidine kinase (TK) gene. 506 025 56 Chimeric plasmid vectors containing vaccinia virus promoter ligated to the LAV envelope gene are used for the transformaggli strain MCIOOO.

LAV-env-sekvenserna i vacciniavirusgenomet uppnåddes genom tion av Q. Införande av de chimera rekombination in yiyg, som möjliggjordes av det faktum att de chimera generna i plasmiderna pv-env5 flankeras av vacciniavirussekvenser, som kodar för TK-genen. Denna plasmid införs därefter i celler, som tidigare har infek- terats med vacciniavirus av vildtyp, och rekombination med- ges inträda mellan TK-sekvenserna på plasmiden och de homologa sekvenserna i den virala vacciniagenomen, var- igenom den chimera genen införs. Njurceller från afrikansk grönapa (stam BSC-40, en linje härrörande från BSC-l-cel- A.T.C.C. nr. sionssystemet. ler, CCL26) används som värdceller i expres- Konfluenta BSC-40-celler infekteras i en infektionsmul- tiplicitet av 10 med rekombinant vaccinia-virus. Infek- tionen får fortgå under 12 timmar, efter vilken tid celler- na skördas, tvättas en gång med PBS och tillvaratas genom centrifugering. Cellpelleter återsuspenderas i lys-buffert (l,O% NP 40, 2,5% natriumdioxicholat, 0,1 M NaCl, 0,01 M Triss-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) och lysatet klaras därefter genom centrifugering. Immunoaffinitetseparation av det uttryckta rekombinanta fusionsproteinet utförs därefter såsom beskrivits ovan för det bakteriella expressionssys- temet under utnyttjande av den monoklonala antikroppen gpll0-1. De proteiner som produceras av detta expressions- system liknar mera naturligt producerad HIV-gpl10 på grund av den bearbetning och glykosylering som tillhandahålls av däggdjurscellerna.The LAV env sequences in the vaccinia virus genome were achieved by the addition of Q. Introduction of the chimeric recombination in vivo, which was made possible by the fact that the chimeric genes in the plasmids pv env5 are flanked by vaccinia virus sequences encoding the TK gene. This plasmid is then introduced into cells previously infected with wild-type vaccinia virus, and recombination is allowed to occur between the TK sequences of the plasmid and the homologous sequences of the viral vaccinia genome, thereby introducing the chimeric gene. African green monkey kidney cells (strain BSC-40, a line derived from the BSC-1 cell ATCC No. system, CCL26) are used as host cells in expression. Confluent BSC-40 cells are infected at an infection multiplicity of 10 with recombinant vaccinia virus. The infection is allowed to continue for 12 hours, after which time the cells are harvested, washed once with PBS and recovered by centrifugation. Cell pellets are resuspended in lysis buffer (1.0% NP 40, 2.5% sodium dioxicholate, 0.1 M NaCl, 0.01 M Triss-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA) and the lysate is then clarified by centrifugation. Immunoaffinity separation of the expressed recombinant fusion protein is then performed as described above for the bacterial expression system using the monoclonal antibody gp110-1. The proteins produced by this expression system are more similar to the naturally produced HIV-gp110 due to the processing and glycosylation provided by the mammalian cells.

EXEMPEL VII Inhibition av HIV-infektion med blockerande Deøtider Effektiviteten av blockerande peptider när det gäller att inhibera infektion av vävnadskulturceller med LAVBRU-stam- men av HIV studerades under utnyttjande av en modifikation 506 025 57 av de protokoll för peptid T-utvärdering som har publi- cerats av Pert et al., ovan. Den föredragna HIV-inhibi- tionsananlysrutinen innefattar att man kombinerar lika stora volymer av blockerande peptid och CEM-celler (2,5 x 105) i medium (RPMI, 10% FCS och 2 mg/ml polybren) och inkubering under 45 min vid 37°C. Virus tillsätts därefter i olika doser (10, 50, 500 TCID 50), blandningen inkuberas under 14 dagar vid 37°C och därefter analyseras den över- liggande vätskan med avseende på virusantigen (exempelvis p25-kärna)-produktion.EXAMPLE VII Inhibition of HIV Infection with Blocking Deotides The effectiveness of blocking peptides in inhibiting infection of tissue culture cells with the LAVBRU strain of HIV was studied using a modification 506 025 57 of the peptide T-evaluation protocols published in - certified by Pert et al., supra. The preferred HIV inhibition assay routine involves combining equal volumes of blocking peptide and CEM cells (2.5 x 105) in medium (RPMI, 10% FCS and 2 mg / ml polybrene) and incubating for 45 minutes at 37 minutes. ° C. Viruses are then added in different doses (10, 50, 500 TCID 50), the mixture is incubated for 14 days at 37 ° C and then the supernatant is analyzed for virus antigen (eg p25 core) production.

Förinkubering av CEM-cellerna med peptiderna före tillsats av virus till kulturerna förstärkte den inhiberande effek- ten vid analyserna. Inhibitionen visade sig vara beroende av virusdosen och uppvisade kraftig aktivitet vid låga och måttliga doser men minst effekt vid de högsta virusdoserna.Pre-incubation of the CEM cells with the peptides before adding virus to the cultures enhanced the inhibitory effect in the assays. The inhibition was found to be dependent on the virus dose and showed strong activity at low and moderate doses but least effect at the highest virus doses.

Cirka 60-90% inhibition av virusantigenproduktionen vid lågdosvirusförsök uppnåddes med peptid T. Ytterligare försök med peptider X-XV, typiskt COOH-ändamiderade och NH2-ändacetylerade, gav liknande resultat, medan peptid XI var speciellt effektiv inom ett brett doseringsintervall.Approximately 60-90% inhibition of viral antigen production in low dose virus experiments was achieved with peptide T. Further experiments with peptides X-XV, typically COOH-endamidated and NH 2 -tercetylated, gave similar results, while peptide XI was particularly effective over a wide dosage range.

Neutraliserande antikroppar kan tillsättas antingen under förinkuberingsperioden eller vid tidpunkten för tillsatsen av viruset för framkallande av en additiv eller synergis- tisk inhibition av virusantigenproduktionen.Neutralizing antibodies can be added either during the pre-incubation period or at the time of the addition of the virus to induce an additive or synergistic inhibition of viral antigen production.

Av det föregående framgår att de monoklonala antikropparna och peptiderna, innefattande blockerande peptider, enligt föreliggande uppfinning tillhandahåller förbättrade metoder för neutralisation och/eller inhibition av HIV-infektioner.From the foregoing, it is apparent that the monoclonal antibodies and peptides, including blocking peptides, of the present invention provide improved methods for neutralizing and / or inhibiting HIV infections.

Detta möjliggör att profylaktiska och terapeutiska bered- ningar lättare kan framställas, vilka kan vara effektiva mot infektioner orsakade av de flesta om ej alla HIV-stam- marna. Vidare finner de nya materialen användning vid diagnostiska analyser och andra välkända förfaranden.This allows prophylactic and therapeutic preparations to be more readily prepared, which can be effective against infections caused by most if not all of the HIV strains. Furthermore, the new materials find use in diagnostic analyzes and other well-known procedures.

MIKROORGANISM-DEPONERINGSDATA 506 025 58 Följande mikroorganismer, som utgör del av föreliggande uppfinning, har deponerats hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. Data beträffande deponeringarna är som föl- jer: Vetenskaplig Depone- beskrivning Deponatorns ref. ATCC-ref. ringsdatum Mushybridom HIV-gp 110-1 HB 9175 15 aug. 1986 (balb c/NS-1) " HIV-gp 110-2 HB 9176 15 aug. 1986 " HIV-gp 110-3 HB 9177 15 aug. 1986 " luv-gp llo-s HB 9404 30 april 1987 " HIV-gp l1o-4 HB 9405 30 april 1987 " HIV-gp llo-s ma 9406 30 april 1987 “ HIV-p 25-2 HB 9407 30 april 1987 “ HIV-p 25-3 HB 9408 30 april 1987 " HIV-p 25-6 HB 9409 30 april 1987 " HIV-p 25-7 HB 9410 30 april 1987 Hybridomen HB 9175, HB 9176 och HB 9177 testades och be- fanns levande den 26 augusti 1986. Övriga hybridom testades och befanns levande den 4 maj 1987.MICROORGANISM DISPOSAL DATA 506 025 58 The following microorganisms, which form part of the present invention, have been deposited with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. Data regarding the deposits are as follows: Scientific Deposit Description The depositor's ref. ATCC ref. ring date Mushybridoma HIV-gp 110-1 HB 9175 15 aug. 1986 (balb c / NS-1) "HIV-gp 110-2 HB 9176 15 aug. 1986" HIV-gp 110-3 HB 9177 15 aug. 1986 "luv-gp llo-s HB 9404 30 April 1987" HIV-gp l1o-4 HB 9405 30 April 1987 "HIV-gp llo-s ma 9406 30 April 1987" HIV-p 25-2 HB 9407 30 April 1987 " HIV-p 25-3 HB 9408 April 30, 1987 "HIV-p 25-6 HB 9409 April 30, 1987" HIV-p 25-7 HB 9410 April 30, 1987 The hybridomas HB 9175, HB 9176 and HB 9177 were tested and found alive on August 26, 1986. Other hybridomas were tested and found alive on May 4, 1987.

Claims (16)

10 15 20 25 30 35 PATENTKRAV 5910 15 20 25 30 35 CLAIMS 59 1. Beredning av monoklonal antikropp, k ä n n e t e c k - n a d d ä r a v , att den är specifikt reaktiv med en antigendeterminant i en neutraliserande region lokaliserad på HIV-gp110 med en aminosyrasekvens från cirka 301 till 336 eller 308 till 328 eller homologa sekvenser av andra HIV-isolat.Preparation of a monoclonal antibody, characterized in that it is specifically reactive with an antigenic determinant in a neutralizing region located on HIV-gp110 having an amino acid sequence from about 301 to 336 or 308 to 328 or homologous sequences of other HIV -isolate. 2. Peptid, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v , att den innefattar minst cirka fem angränsande aminosyror från följande HIV-gp110-aminosyrasekvens eller homologa sekven- ser av andra HIV-isolat. II (298) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile- Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. varvid de angränsande aminosyrorna definierar minst en antigenisk determinant med förmåga att utveckla anti- kroppar vid immunisering i ett värddjur, varvid anti- kropparna är protektiva mot HIV-infektioner.2. A peptide, characterized in that it comprises at least about five contiguous amino acids from the following HIV-gp110 amino acid sequence or homologous sequences of other HIV isolates. II (298) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val- Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. wherein the adjacent amino acids define at least one antigenic determinant capable of developing antibodies upon immunization in a host animal, the antibodies being protective against HIV infections. 3. Peptid, att den innefattar någon av följande HIV-gp110-aminosyrasekvenser k å n n e t e c k n a d d ä r a v , eller homologa sekvenser av andra HIV-isolat: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro- Gly-Arg-A1a-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y'; v (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg- Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y'; eller VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val- Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y'; 506 025 10 15 20 25 30 35 506 025 QO vari Y och Y', om de är närvarande, vardera innefattar en aminosyrasekvens med upp till cirka 20 aminosyror.A peptide comprising any of the following HIV-gp110 amino acid sequences characterized by, or homologous sequences of other HIV isolates: I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile- Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-A1a-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y '; v (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y '; or VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y '; Q 50 wherein Y and Y ', if present, each comprise an amino acid sequence of up to about 20 amino acids. 4. Peptid enligt patentkrav 3, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v , att Y och/eller Y' innefattar en länknings- rest, som utgörs av glycin, tyrosin, cystein, glutaminsyra eller asparagin.A peptide according to claim 3, characterized in that Y and / or Y 'comprises a linker residue, which consists of glycine, tyrosine, cysteine, glutamic acid or aspartic. 5. Vaccin mot HIV-infektion, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att det innefattar en immunologiskt effektiv dos av en eller flera peptider enligt krav 2, 3 eller 4, varvid peptiderna föreligger i blandning med en fysiolo- giskt godtagbar bärare.A vaccine against HIV infection, characterized in that it comprises an immunologically effective dose of one or more peptides according to claim 2, 3 or 4, wherein the peptides are in admixture with a physiologically acceptable carrier. 6. Immortaliserad cellinje, som producerar en monoklonal antikropp med förmåga att reagera med en antigen gp1lO- höljesglykoprotein-determinant ingående i en neutraliseran- de region lokaliserad på HIV-gpl10 med en aminosyrasekvens fràn cirka 301 till 336 eller 308 till 328 eller homologa sekvenser från andra HIV-isolat.Immortalized cell line, which produces a monoclonal antibody capable of reacting with an antigenic gp110 envelope glycoprotein determinant contained in a neutralizing region located on HIV-gp110 having an amino acid sequence of from about 301 to 336 or 308 to 328 or homologous other HIV isolates. 7. En cellinje vald fràn HIV-gpll0-l, HIV-gp1lO-2, HIV- gp11o-3, HIv-gp11o-4, HIv-gpno-s, HIv-gpiio-s, HIv-pzs-s och HIV-p25-7.A cell line selected from HIV-gp110-1, HIV-gp110-2, HIV-gp11o-3, HIv-gp11o-4, HIv-gpno-s, HIv-gpiio-s, HIv-pzs-s and HIV- p25-7. 8. Monoklonal antikropp producerad av en cellinje enligt krav 7.A monoclonal antibody produced by a cell line according to claim 7. 9. Monoklonal antikropp med förmåga att specifikt reagera med en antigenisk determinant av HIV, varvid den monoklo- nala antikroppen blockerar bindningen av en antikropp producerad av cellinjerna enligt krav 7.A monoclonal antibody capable of specifically reacting with an antigenic determinant of HIV, wherein the monoclonal antibody blocks the binding of an antibody produced by the cell lines of claim 7. 10. Sätt att alstra cellinjer, vilka producerar anti- kroppar, som är reaktiva med antigena determinanter av HIV- k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att man till gp110, ett värddjur administrerar en immunogen mängd av ett 10 15 20 25 30 35 51 506 025 antigent preparat anrikat med avseende på HIV-proteiner; övervakar det immuniserade värddjuret med avseende på produktion av antikroppar, som är reaktiva med antigena gp110-determinanter; tillvaratar antikropproducerande celler från värddjuret och immortaliserar nämnda celler; utväljer de immortaliserade celler som producerar anti- kroppar som är specifikt reaktiva med en antigen determi- nant i en neutraliserande region lokaliserad på HIV-gp11O med en aminosyrasekvens från cirka 301 till 336 eller 308 till 328 eller homologa sekvenser från andra HIV-isolat och klonar de immortaliserade cellerna för framställning av cellinjer.10. A method of generating cell lines which produce antibodies which are reactive with antigenic determinants of HIV-characterized by administering to gp110, a host animal, an immunogenic amount of an antibody. antigenic preparation enriched for HIV proteins; monitors the immunized host animal for the production of antibodies reactive with antigenic gp110 determinants; recovering antibody-producing cells from the host animal and immortalizing said cells; selects the immortalized cells that produce antibodies that are specifically reactive with an antigenic determinant in a neutralizing region located on HIV gp11O having an amino acid sequence of about 301 to 336 or 308 to 328 or homologous sequences from other HIV isolates and clones the immortalized cells to produce cell lines. 11. Sätt enligt krav 10, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att HIV-proteinerna är rekombinanta fusions- proteiner, som uttrycks av en eukaryot eller bakteriell värd, eller att HIV-proteinerna erhålls från ett extrakt eller lysat av HIV.11. The method of claim 10, wherein the HIV proteins are recombinant fusion proteins expressed by a eukaryotic or bacterial host, or the HIV proteins are obtained from an extract or lysate of HIV. 12. Sätt att diagnostisera närvaron av HIV i ett biologiskt prov, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att man med nämnda biologiska prov inkuberar en monoklonal antikropp enligt krav 1 och påvisar närvaron av immunkomplex bildade mellan den monoklonala antikroppen och den antigena determinanten i det biologiska provet och med ledning därav fastställer närvaron eller frånvaron av HIV i provet.A method of diagnosing the presence of HIV in a biological sample, characterized in that said biological sample incubates a monoclonal antibody according to claim 1 and detects the presence of immune complexes formed between the monoclonal antibody and the antigenic determinant in the biological sample. and consequently determines the presence or absence of HIV in the sample. 13. Sätt enligt krav 12, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att den monoklonala antikroppen har förmåga att reagera med en neutraliserande region eller blockerande peptid av gp110.13. The method of claim 12, wherein the monoclonal antibody is capable of reacting with a neutralizing region or blocking peptide of gp110. 14. Sätt att diagnostisera närvaron av antikroppar mot HIV i ett biologiskt prov, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att man med det biologiska provet inkuberar en peptid enligt något av kraven 2-4; påvisar närvaron av immunkomplex bildade mellan peptiden och antikroppar i 10 15 20 506 025 69- provet, vilka är reaktiva med peptiden, och med ledning därav fastställer närvaron eller frånvaron av HIV i provet.A method of diagnosing the presence of antibodies to HIV in a biological sample, characterized in that a peptide according to any one of claims 2-4 is incubated with the biological sample; detects the presence of immune complexes formed between the peptide and antibodies in the sample, which are reactive with the peptide, and consequently determines the presence or absence of HIV in the sample. 15. Sätt att diagnostisera närvaron av HIV i ett biologiskt prov, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att man med nukleinsyra i det biologiska provet under hybridiserings- betingelser inkuberar ett nukleinsyrasegment, som kodar för en antigen determinant i en neutraliserande region lokali- serad pà HIV-gpl10 med en aminosyrasekvens fràn cirka 301 till 336 eller 308 till 328 eller homologa sekvenser från andra HIV-isolat och påvisar närvaron av hybridkomplex bildade mellan nukleinsyrasegmentet och nukleinsyran i provet och med ledning därav fastställer närvaron eller frånvaron av HIV i provet.15. A method of diagnosing the presence of HIV in a biological sample, characterized in that nucleic acid is incubated in the biological sample under hybridization conditions under a nucleic acid segment encoding an antigenic determinant in a neutralizing region located on HIV. -gp110 having an amino acid sequence of from about 301 to 336 or 308 to 328 or homologous sequences from other HIV isolates and detecting the presence of hybrid complexes formed between the nucleic acid segment and the nucleic acid in the sample and thereby determining the presence or absence of HIV in the sample. 16. Sätt att fastställa en stam av HIV i ett infekterat värddjur, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , att man med en peptid enligt något av kraven 2-4 inkuberar ett biologiskt prov från nämnda värddjur; och påvisar närvaron av immunkomplex bildade mellan peptiden och antikropparna i provet och med ledning därav fastställer den stam av HIV som infekterar värddjuret.A method of determining a strain of HIV in an infected host animal, characterized in that a biological sample from said host animal is incubated with a peptide according to any one of claims 2-4; and detects the presence of immune complexes formed between the peptide and the antibodies in the sample and, consequently, determines the strain of HIV that infects the host animal.