KR20240010762A - 변형 이중-가닥 rna 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 하나의 양태는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제의 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드, 및 안티센스 가닥의 씨드 영역(2번 내지 8번 위치)에 반대되는 부위에서 발생하는 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 포함하며; dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 2'-OMe 변형의 입체 장애와 동등 이하인 뉴클레오타이드 입체 장애를 제공하는 2개 이상의 변형 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 변형 뉴클레오타이드는 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다. 본 발명의 다른 양태는 치료적 용도에 적절한 이들 dsRNA 제제를 포함하는 약학적 조성물, 및 예를 들어, 다양한 질환 상태의 치료를 위해, 이들 dsRNA 제제를 투여함으로써 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.

Description

변형 이중-가닥 RNA 제제{MODIFIED DOUBLE-STRANDED RNA AGENTS}
본 출원은 2014년 12월 18일에 출원된 U.S. 가출원 62/093,919, 2014년 11월 24일에 출원된 U.S. 가출원 62/083,744, 및 2014년 8월 20일에 출원된 U.S. 가출원 62/039,507에 대한 우선권 이익을 청구하며, 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은, 타겟 유전자 발현의 억제에 유리한 특정 모티프를 가진 RNAi 듀플렉스 제제, 뿐만 아니라 치료 용도에 적절한 RNAi 조성물에 관한 것이다. 부가적으로는, 본 발명은, 예를 들어, 다양한 질환들의 치료를 위해, 이들 RNAi 듀플렉스 제제를 투여함으로써 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
RNA 간섭 또는 "RNAi"는, 이중-가닥 RNAi(dsRNA)가 유전자 발현을 차단할 수 있다는 관찰을 설명하기 위해 Fire와 그의 동료들이 처음으로 사용한 용어이다(Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811; Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15, 188-200). 짧은 dsRNA는 척추동물을 비롯한 다수의 개체들에서 유전자-특이적, 전사-후 사일런싱(silencing)을 지시하는 것이며, 유전자의 기능을 연구하기 위한 새로운 툴을 제공하였다. RNAi는, 사일런싱 촉발제(silencing trigger)에 상동성인 메신저 RNA를 파괴하는 서열-특이적인 다성분 뉴클레아제인 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC)에 의해 매개된다. RISC는 이중-가닥 RNA 촉발제로부터 유래된 짧은 RNA(약 22개의 뉴클레오타이드)를 함유하는 것으로 알려져 있지만, 이런 활성의 단백질 구성분은 알려지지 않았다.
양호한 유전자-사일런싱 특성을 가진 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자는 RNA 간섭(RNAi)을 토대로 한 약물 개발에 필요하다. RNAi의 초기 단계는, dsRNA 듀플렉스의 센스 가닥의 분해를 필요로 하는 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC)의 활성화이다. 센스 가닥은, 듀플렉스 영역의 중간에 있는 아르고노트 2(Argonaute 2)에 의해 분해되는 제1 RISC 기질로서 작용하는 것으로 알려졌다. 센스 가닥의 분해된 5' 말단 및 3' 말단 분절이 엔도뉴클레아제 Ago2로부터 제거된 직후, RISC는 안티센스 가닥에 의해 활성화된다(Rand et al. (2005) Cell 123, 621).
센스 가닥의 분해가 억제된 경우, 타겟 mRNA의 엔도뉴클레오리틱 분해(endonucleolytic cleavage)가 감소되는 것으로 생각되었다(Leuschner et al. (2006) EMBO Rep., 7, 314; Rand et al. (2005) Cell 123, 621; Schwarz et al. (2004) Curr. Biol.14, 787). Leuschner 등은, 센스 가닥의 Ago2 분해 부위에 2'-O-Me 리보스를 삽입하면 HeLa 세포에서 RNAi를 억제하는 것을 확인하였다(Leuschner et al. (2006) EMBO Rep., 7, 314). 유사한 효과는 포스포로티오에이트 변형으로 관찰되었으며, 이는 센스 가닥의 분해가 포유류에서도 효율적인 RNAi에 필요함을 확인하였다.
Morrissey 등은, 다른 부위들 중에서 2'-F 변형된 잔기 및 Ago2 분해 부위에서도 변형을 포함하는 siRNA 듀플렉스를 사용하였으며, 비변형된 siRNA와 비교해 적절한(compatible) 사일런싱을 수득하였다(Morrissey et al. (2005) Hepatology 41, 1349). 그러나, Morrissey의 변형은 모티프 특이적이지 않은데, 예를 들어, 하나의 변형은, 피리미딘 잔기가 존재하는 한 선택성이 없이, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다에 있는 모든 피리미딘 상에 2'-F 변형을 포함하며; 그러므로, 이들 교시를 토대로 해서는, 센스 가닥의 분해 부위에서의 특이적인 모티프 변형이 유전자 사일런싱 활성에 실질적인 효과를 가질 수 있는지 확실치 않다.
Muhonen 등은, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 Ago2 분해 부위에 2'-F 변형된 잔기를 2개 포함하는 siRNA 듀플렉스를 사용하였으며, 이것이 관용화된 것을 발견하였다(Muhonen et al. (2007) Chemistry & Biodiversity 4, 858-873). 그러나, Muhonen의 변형은 또한, 서열 특이적인데, 예를 들어, 각각의 특정 가닥에 있어, Muhonen은 단지 임의의 선택성 없이, 모든 피리미딘 또는 모든 퓨린을 변형한다.
Choung 등은, 혈청 내 siRNA를 Sur10058에 대해 안정화시키기 위해, 2'-OMe에 의한 다른 변형, 또는 2'-F 변형, 2'-OMe 변형과 포스포로티오에이트 변형의 다양한 조합을 포함하는 siRNA 듀플렉스를 사용하였다(Choung et al. (2006) Biochemical and Biophysical Research Communication 342, 919-927). Choung은, siRNA의 안정성을 높이기 위해서는, 안티센스 가닥의 분해 부위의 잔기가 2'-OMe으로 변형되어서는 안된다고 제시하였다.
따라서, siRNA 유전자 치료의 유전자 사일런싱 효능을 개선하기 위한 iRNA 듀플렉스 제제가 계속해서 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구에 관한 것이다.
본 발명은, 타겟 유전자 발현의 억제에 유리한, 하나 이상의 리간드에 선택적으로 접합된 dsRNA 제제를 위한 효과적인 뉴클레오타이드 또는 화학적 모티프, 뿐만 아니라 치료 용도에 적절한 RNAi 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. dsRNA 제제는 화학식 I로 나타낸다:
(화학식 I)
화학식 I에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 2'-OMe 변형을 함유한다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 2'-OMe 또는 2'-F 변형을 함유한다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4' 중 하나 이상은 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형을 함유한다.
C1은 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)과 반대되는 부위에 배치된 열적 탈안정화 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, C1은 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에서 뉴클레오타이드와 쌍을 이루는 센스 가닥의 위치에 있다. 일례에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 15번 위치에 있다. C1 뉴클레오타이드는 무염기 변형을 포함할 수 있는 열적 탈안정화 변형; 듀플렉스에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예를 들어 비잠김 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)을 보유한다. 일 구현예에서, C1은 i) 안티센스 가닥에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; ii) 으로 구성된 군으로부터 선택된 무염기 변형; 및 iii) , 및 으로 구성된 군으로부터 선택된 당 변형으로 구성된 군으로부터 선택되는 열적 탈안정화 변형을 가지며, 식에서, B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 일 구현예에서, C1에서의 열적 탈안정화 변형은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, 및 U:T로 구성된 군으로부터 선택된 미스매치이며; 선택적으로, 미스매치 쌍에서 뉴클레오베이스 중 하나 이상은 2'-데옥시 뉴클레오베이스이다. 일례에서, C1에서의 열적 탈안정화 변형은 GNA 또는 이다.
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형의 입체 장애와 동등 이하인 입체 장애의 뉴클레오타이드를 제공하는 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 입체 장애는 변형의 입체 효과의 합을 나타낸다. 뉴클레오타이드 변형의 입체 장애의 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 변형은 뉴클레오타이드 리보스 당의 2' 위치에 있거나, 또는 리보스 당의 2' 위치와 유사하거나 동등하고 2'-OMe 변형의 입체 장애와 동등 이하인 입체 장애를 뉴클레오타이드에 제공하는 비-리보스 뉴클레오타이드에 대한 변형, 비사이클릭 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 백본일 수 있다. 예를 들어, T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로부터 선택된다. 일 구현예에서, T1은 DNA이다. 일 구현예에서, T1'은 DNA, RNA 또는 LNA이다. 일 구현예에서, T2'은 DNA 또는 RNA이다. 일 구현예에서, T3'은 DNA 또는 RNA이다.
n1, n3, 및 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이다.
n5, q3, 및 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
n4, q2, 및 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다; 대안적으로, n4는 0이다.
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
n2 및 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
대안적으로, n4는 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
일 구현예에서, n4는 0일 수 있다. 일례에서, n4는 0이고, q2 및 q6은 1이다. 또 다른 예에서, n4는 0이고, q2 및 q6은 1이고, (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, n4, q2, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에서, n2, n4, q2, q4, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에 있고, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n4는 1이다. 일 구현예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 15번 위치에 있다.
일 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 위치에서 시작된다. 일례에서, T3'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 위치에 있고 q6은 1이다.
일 구현예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번 위치에서 시작된다. 일례에서, T1'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번 위치에 있고 q2는 1이다.
예시적인 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 2번 위치로부터 시작하고, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단의 14번 위치로부터 시작한다. 일례에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 2번 위치로부터 시작하고 q6은 1이며, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단의 14번 위치로부터 시작하고 q2는 1이다.
일 구현예에서, T1' 및 T3'은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다(즉, T1' 및 T3' 뉴클레오타이드는 계수하지 않음).
일 구현예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번 위치에 있다. 일례에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 14번 위치에 있고 q2는 1이며, 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본 내 2' 위치 또는 위치들에서의 변형은 2'-OMe 리보스보다 작은 입체 장애를 제공한다.
일 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 위치에 있다. 일례에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 2번 위치에 있고 q6은 1이며, 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본 내 2' 위치 또는 위치들에서의 변형은 2'-OMe 리보스와 동등 이하의 입체 장애를 제공한다.
일 구현예에서, T1은 센스 가닥의 분해 부위에 있다. 일례에서, T1은 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있으며, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n2는 1이다. 예시적 구현예에서, T1은 센스 가닥의 분해 부위에서 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있으며, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n2는 1이다,
일 구현예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 위치에서 시작된다. 일례에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 내지 10번 위치에 있고 q4는 1이다.
예시적 구현예에서, T1은 센스 가닥의 분해 부위, 예를 들어 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있으며, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n2는 1이다; T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 14번 위치에 있으며, q2는 1이고, T1'에 대한 변형은 리보스 당의 2' 위치 또는 2'-OMe 리보스보다 작은 입체 장애를 제공하는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서의 위치들에 있으며; T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 내지 10번 위치에 있고, q4는 1이고; T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 2번 위치에 있고, q6은 1이고, T3'에 대한 변형은 2'-OMe 리보스와 동등 이하의 입체 장애를 제공하는 2' 위치 또는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서의 위치들에 있다.
일 구현예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 8번 위치에서 시작된다. 일례에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 8번 위치에서 시작되고 q4는 2이다.
일 구현예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 9번 위치에서 시작된다. 일례에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 9번 위치에 있고, q4는 1이다.
일 구현예에서, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, n4 는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에서 2개 이상의 추가 TT를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개 이상의 추가 TT를 포함하고, (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
dsRNA 제제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함할 수 있다. 5'-말단 인-함유기는 5'-말단 포스페이트(5'-P), 5'-말단 포스포로티오에이트(5'-PS), 5'-말단 포스포로디티오에이트(5'-PS2), 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP), 5'-말단 메틸포스포네이트(MePhos), 또는 5'-데옥시-5'-C-말로닐()일 수 있다. 5'-말단 인-함유기가 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP)인 경우, 5'-VP는 5'-E-VP 이성질체(즉, 트랜스-비닐포스페이트, ), 5'-Z-VP 이성질체(즉, 시스-비닐포스페이트, ), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-P를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-PS를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-E-VP를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-Z-VP를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%가 변형된다. 예를 들어, dsRNA 제제의 50%가 변형되는 경우, dsRNA 제제에 존재하는 모든 뉴클레오타이드의 50%가 본원에 기재된 바와 같은 변형을 함유한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-ara-F로 변형된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 2개 이상의 상이한 변형을 함유한다.
일 구현예에서, 화학식 I의 dsRNA 제제는 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들)을 추가로 포함한다. 일례에서, 화학식 I의 dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 3' 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 포함한다. 또 다른 예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 5' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 임의의 2'-F 변형을 함유하지 않는다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일례에서, 센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개의 블록을 포함한다. 일례에서, 안티센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 2개의 블록은 16개 내지 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖는다. 일례에서, 센스 가닥은 19개 내지 22개 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 19개 내지 25개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 예에서, 센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 구현예에서, 듀플렉스에서 안티센스 가닥의 5' 말단의 1번 위치의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1, 제2, 및 제3 염기쌍 중 하나 이상은 AU 염기쌍이다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 이에 혼성화하는 타겟 RNA와 100% 상보적이며 RNA 간섭을 통해 그 발현을 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 타겟 RNA와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 또는 50% 이상 상보적이다.
일 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 본원에 정의된 dsRNA 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 상기 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에)과 반대 부위에 또는 그 근처에서 발생한다. 화학식 I로 나타내는 dsRNA에 관해 본 명세서에 기재된 구현예 및 양태는 각각 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하는 dsRNA에도 적용할 수 있다.
열적 탈안정화 뉴클레오타이드는, 예를 들어 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생할 수 있다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다. 바람직하게는 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다. 예를 들어, 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 하나 이상의 ASGPR 리간드를 추가로 포함한다. 예를 들어, ASGPR 리간드는 다음과 같은 2가 또는 3가 분지화 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다: . 일례에서, ASGPR 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
예를 들어, 본원에 정의된 dsRNA 제제는 i) 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기; ii) (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개; 및 iii) 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단 또는 3'-말단에 리간드, 예컨대 ASGPR 리간드(예를 들어, 하나 이상의 GalNAc 유도체)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 13번, 17번, 19번, 및 21번 위치에서의 2'-F 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 14번 내지 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2'-OMe 변형
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 19번, 21번, 및 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 6번 내지 8번, 10번, 14번, 16번, 18번, 20번, 및 22번 위치에서의 2'F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 위치에서의 2'-F 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2'-OMe 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 10번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2' F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번 내지 6번, 8번, 10번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 7번 및 9번 위치에서의 2'-F 변형 및 11번 위치에서의 데옥시-뉴클레오타이드(예를 들어, dT); 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 7번, 9번, 11번, 13번, 15번, 17번, 및 19번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번 내지 6번, 8번, 10번, 12번, 14번, 16번, 및 18번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 6번, 8번, 10번, 12번, 14번, 및 16번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 7번, 9번, 11번, 13번, 및 15번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 5번, 7번, 9번, 11번, 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번 내지 4번, 6번, 8번, 10번, 12번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 9번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 10번, 및 11번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 10번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2' F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 및 13번 위치에서의 2'-F 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 및 14번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번 내지 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번 내지 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 8번, 10번, 14번, 16번, 및 20번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번, 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 14번, 15번, 17번, 및 19번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 13번, 16번, 및 18번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 25개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 4번, 6번, 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 및 19번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 2번, 3번, 5번, 8번, 10번, 14번, 16번, 및 18번 위치에서의 2'-F 변형, 및 24번 및 25번 위치에서의 데스옥시-뉴클레오타이드(예를 들어, dT); 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 4개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 6번, 8번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 7번, 및 9번 내지 11번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번 내지 5번, 7번, 8번, 10번 내지 13번, 15번, 및 17번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 6번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 6번, 8번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 7번, 및 9번 내지 11번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번 내지 5번, 7번, 10번 내지 13번, 15번, 및 17번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 6번, 8번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 4번, 6번, 및 10번 내지 19번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 5번, 및 7번 내지 9번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번 내지 5번, 7번, 10번 내지 13번, 15번, 및 17번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 6번, 8번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 19번 및 20번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 20번 및 21번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 dsRNA 제제는 안티센스의 5'-말단으로부터 계수하여 7번 위치, 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 15번 위치, 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 21번 위치, 또는 이들의 조합으로 열적 탈안정화 변형을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 상기 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)에 반대되는 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된, 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 2개의 변형 핵산을 포함한다. 예를 들어, 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥은 센스 가닥의 분해 부위에서 엔도뉴클레아제에 취약한 변형 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일례에서, 엔도뉴클레아제에 취약한 변형 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 2'-OMe 변형의 입체 장애와 동등 이하인 입체 장애를 뉴클레오타이드에 제공하는 제3 변형 뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 제3 변형 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 내지 10번 위치에 있다. 예를 들어, 제3 변형 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 10번 위치에 있다.
열적 탈안정화 뉴클레오타이드에 대한 구현예는 화학식 I에서 C1에 대해 상술된 다양한 구현예와 유사하다. 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 변형 핵산에 대한 구현예는 화학식 I에서 T1', T2', 및 T3'에 대해 상술된 다양한 구현예와 유사하다. 상기 화학식 I의 dsRNA 제제의 길이, 오버행, 추가 변형, 및 이에 대한 리간드 접합을 설명하는 구현예는 본원에서 적절하다.
본 발명은 추가로 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위해 본원에 정의된 dsRNA 제제의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 추가로 시험관내 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 dsRNA 제제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 용도에 대해 본원에 정의된 dsRNA 제제에 관한 것이다. 피험자는 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 양, 소, 개, 고양이, 또는 인간일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 센스 가닥은 센스 가닥의 분해 부위 근처에 엔도뉴클레아제에 취약한 변형 뉴클레오타이드(예를 들어, DNA, RNA, 또는 2'-F)를 포함한다. 예를 들어, 엔도뉴클레아제에 취약한 변형 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있다. 분해 부위 근처에서 발생하는 엔도뉴클레아제에 취약한 변형은 분해 부위의 취약성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 분해 부위 근처의 열적 탈안정화 변형은 분해 부위에 엔도뉴클레아제 취약성을 제공할 수 있다. 안티센스 가닥은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된, 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 2개의 변형 핵산을 포함한다. 예를 들어, 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 추가로 피하 또는 정맥내 투여에 의해 피험자에서 특정 타겟에 대한 본 발명의 dsRNA 제제의 전달 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 피하 또는 정맥내 투여에 의해 피험자에서 특정 타겟에 대한 상기 제제의 전달 방법에서의 용도를 위한 본 발명의 dsRNA 제제를 제공한다.
도 1a 내지 1c는 10 nM 및 0.1 nM 농도에서 평가되는 시험관내 유효성에 대한 센스 가닥 17번 위치에서 상이한 변형의 효과를 나타내는 그래프이다. (a) 모체 AS-가닥과 쌍을 이룬 비-F 센스 가닥을 갖는 mTTR을 타겟으로 하는 siRNA; (B) 비-F AS-가닥과 쌍을 이룬 비-F 센스 가닥을 갖는 mTTR을 타겟으로 하는 siRNA; (C) 모체 AS-가닥과 쌍을 이룬 비-F 센스 가닥을 갖는 ANG, ApoC3 및 TTRSC를 타겟으로 하는 siRNA.
도 2는 10 nM 및 0.1 nM 농도에서 평가되는 센스 가닥 16번 내지 18번 위치에 걸친 열적 탈안정화 GNA 변형의 시험관내 유효성에 대한 위치별 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 10 nM 및 0.1 nM 농도에서 평가되는 mTTR, ApoC3, TTRSC 및 TMP를 타겟으로 하는 siRNA의 시험관내 유효성에 대한 안티센스 가닥 2번 위치에서 변형의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 10 nM 및 0.1 nM 농도에서 평가되는 mTTR, ApoC3, 및 TTRSC를 타겟으로 하는 siRNA의 시험관내 유효성에 대한 안티센스 가닥 14번 위치에서 변형의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 2.5 mg/kg의 단회 SC 투여 후 마우스에서 mTTR 사일런싱을 나타내는 그래프이다.
도 6은 모체 2PS(AD-43527) 및 6 PS(AD-57727) 대비 비-F siRNA AD-61398 및 AD-64273의 용량 반응; 단회 SC 투여, 투여 96 h 후 측정된 단백질 수준을 나타내는 그래프이다.
도 7은 비-F AD-61398과 모체 모티프 AD-57727을 비교하는 마우스에서 1 mg/kg siRNA의 QW SC 투여 후 혈장 중 mTTR 단백질 감소를 나타내는 그래프이다.
도 8은 마우스(n=3/군)에서 3 mg/kg의 단회 SC 투여 후 TMPRSS6 mRNA의 사일런싱:비-F 설계와 모체 모티프 AD-60490의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 9는 마우스(n=3/군)에서 3 mg/kg의 단회 SC 투여 7일 후 TMPRSS6 mRNA의 사일런싱:비-F 설계와 모체 모티프 AD-60490의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 10은 모체 화합물 AD-57727 대비 2가지 모티프, 모티프 1 및 모티프 2 활성의 시험관내 활성 결과를 나타낸다.
도 11은 mTTR을 타겟으로 하는 siRNA의 사일런싱 활성의 생체내 평가를 나타낸다.
도 12는 간을 투여 7일 후 활성(mRNA)에 대해 평가한, 안정성 증강 접합 화학(SEC-C)을 이용하는 증강된 활성을 나타낸다.
도 13은 모체 화합물 대비 신규 모티프(모티프 1 및 2)를 이용하여 활성에서의 대략 4배 개선을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 14는 3가지 서열에 걸쳐 모티프 1 및 모티프 2의 현저히 개선된 기간을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 15는 단회 3 mg/kg SC 투여 hAAV 1x 1011 GC/마우스에서, ApoC3-GalNAc3 SAR의 결과를 나타내는 그래프를 보여준다.
도 16은 Ago2 로딩 siRNA 및 안정한 포스페이트를 모방하는 변형 포스페이트인 5'-비닐포스포네이트(5'-VP)의 모식도를 나타낸다. 5'-포스포네이트는 세포질 Clp1 키나아제에 의해 부가되며 Ago2 로딩을 위한 중추적 앵커로서 작용한다.
도 17은 5'-VP의 존재가 일반적으로 어떻게 생체내 활성을 개선하는지를 나타내는 그래프를 보여준다. 평가는 4가지 상이한 ApoB 서열에 대해 수행하였다. 3 mg/kg의 단회 SC 투여 7일 후 LDL 수준을 4가지 접합체(5'-VP 변형을 포함하거나 포함하지 않음)에 대해 분석하였다.
도 18은 포스포로디티오에이트(PS2), 및 메틸포스포네이트(MePhos)를 포함하는, PS 결합을 대체하고 더 안정한 화학을 제공할 수 있는 상이한 화학적 변형을 나타내며, 이는 내인성 인산화를 촉진한다.
도 19는 2'-OMe-MePhos, 2'-OMe-PS, dN(PS2), 및 2'F-PS를 포함하는, 말단 변형의 시험관내 평가 그래프를 나타낸다. 10 nM 및 0.1 nM에서 일차 마우스 간세포(n=4)의 형질감염을 2가지 ApoB 접합체 상에서 수행하였다.
도 20은 안티센스 5'-말단에서의 작은 변화가 어떻게 생체내 유효성을 유의미하게 개선할 수 있는지를 나타내는 2가지 그래프를 보여준다. 왼쪽 그래프는 안티센스 가닥의 1번 위치에서 2' F-PS가 5' P-의존적 서열의 활성을 개선할 수 있음을 나타낸다(단회 3 mg/kg SC 투여 포함, F9 활성을 3일째에 측정하였음). 오른쪽 그래프는 VP와 유사하게, 모체에 비해 dN(PS)2에 의해 약 3배 개선된 효능을 나타낸다(단회 10 mg/kg SC 투여 포함, LDL을 ApoB에 대해 3일째에 측정하였음).
도 21a-b는 (안티센스 가닥의 5' 말단에) 5'-OH 대 5'-E-VP 변형을 함유하는 ApoB siRNA의 시험관내 및 생체내 활성의 SAR 분석을 나타낸다. 도 21a는 마우스 일차 간세포의 시험관내 형질감염 결과를 나타낸다. 도 21b는 단회 투여(SC 투여) 3일 후 LDL 수준을 나타낸다.
도 22는 mTTR 및 F9 siRNA-GalNAc 접합체에 대한 5'-E-VP 변형 대 5'-Z-VP 변형의 시험관내 효능의 결과를 나타낸다. 결과는 마우스 일차 간세포의 시험관내 형질감염으로부터 얻었다.
도 23은 F9 siRNA-GalNAc 접합체(단회 SC 투여)에 대한 5'-E-VP 변형 대 5'-Z-VP 변형의 생체내 비교 결과를 나타낸다.
도 24a-c는 시험관내 PTEN 사일런싱 분석법에서 일차 마우스 간세포에서 (A) 5'-OH, (B) 5'-C-말로닐, 및 (C) 5′-포스페이트 PTEN siRNA에 대한 용량-반응 곡선을 나타내는 그래프이다. 모든 값은 3회 실험에서 얻었다.
도 25는 래트 간 트리토좀에서 인큐베이션된 5'-OH, 5'-C-말로닐, 및 5′-포스페이트 siRNA의 효소적 안정성 결과를 나타낸다. siRNA 타겟 서열을 표 10에 나타낸다. 데이터는 미처리 대조군에 대해 정상화하였다.
도 26은 일차 마우스 간세포로부터 Ago2의 면역침전에 의해 그리고 Ago2-로딩 단일 가닥의 RT-PCR 증폭에 의해 결정되는, 5'-OH, 5'-C-말로닐, 및 5′-포스페이트 siRNA의 RISC 로딩(안티센스 가닥 상의 5'-변형) 결과를 나타낸다. 대조군으로 내인성 miR122의 수준을 결정하였다. siRNA 타겟 서열을 표 10에 나타낸다.
도 27은 단일 (S)-GNA 뉴클레오타이드로 변형된 siRNA를 이용한 TTR의 시험관내 녹다운을 나타내는 그래프이다. TTR mRNA 수준을 24시간 동안 일차 마우스 간세포에서 10 nM siRNA와의 인큐베이션 후 측정하였다. TTR mRNA를 RT-qPCR을 이용하여 평가하고, PBS 처리 세포에 대해 정상화하였다. 모든 데이터 포인트는 4회 측정의 평균이었다.
도 28a는 단일 (S)-GNA 염기쌍으로 변형된 siRNA를 이용한 TTR의 시험관내 녹다운을 나타내는 그래프이다. TTR mRNA 수준을 24시간 동안 일차 마우스 간세포에서 10 nM siRNA와의 인큐베이션 후 측정하였다. TTR mRNA를 RT-qPCR을 이용하여 평가하고, PBS 처리 세포에 대해 정상화하였다. 모든 데이터 포인트는 4회 측정의 평균이었다. 도 28b는 단일 (S)-GNA 뉴클레오타이드를 함유하는 센스 및 안티센스 가닥이 GNA:RNA 헤테로-염기쌍으로서 쌍을 이룬 믹스 매치 듀플렉스를 나타낸다.
도 29는 마우스 혈청 중 TTR의 생체내 수준을 나타내는 그래프이다. 동물은 2.5 mg/kg siRNA의 단회 용량을 수여받았다. 투여-전 또는 투여-후 나타낸 시점에, 동물을 방혈시키고 450 nm에서 판독을 위해 HRP-접합체 항체 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 이용하는 샌드위치 ELISA 분석법을 이용하여 혈청 샘플을 측정하였다. 모든 샘플은 2회씩 측정하였고, 각각의 데이터 포인트는 각 코호트(n=3)에서 마우스의 평균이다.
도 30은 TTR mRNA 수준의 생체내 정량을 나타내는 그래프이다. 동물은 2.5 mg/kg siRNA의 단회 용량을 수여받았다. 투여 후 나타낸 시점에, 전체-간 균질화물 상에서 RNA 추출을 수행하였다. TTR mRNA는 GAPDH를 대조군 전사체로서 ΔΔCt 방법을 이용하여 RT-qPCR에 의해 상기와 같이 평가하였고, PBS-처리 동물에 대해 정상화하였다. 검은 막대는 21일에 대한 결과를 나타내며; 흰 막대는 7일에 대한 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 내지 14번 뉴클레오타이드 위치에 2'-OMe 변형을 갖는 것이 dsRNA 제제의 유전자 사일런싱 활성을 약화시킴을 확인하였다. 안티센스 및/또는 센스 가닥에서 특정 위치에서의 2'-OMe 변형보다 작은 입체 장애를 제공하는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서의 2' 위치 또는 동등 위치들에 화학적 변형을 도입함으로써, dsRNA 제제는 유전자 사일런싱 활성을 재획득할 수 있었다. 본 발명자들은 또한 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)에 반대되는 부위에서 센스 가닥 상에 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 도입하는 것이 더 우수한 유전자 사일런싱 활성을 제공한다고 결정하였다.
dsRNA 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 완전 변형될 수 있다. dsRNA 제제는, 예를 들어 센스 가닥 상에서, 아시알로당단백질 수용체(ASGPR) 리간드와 선택적으로 접합한다. 생성 dsRNA 제제는 생체내 유전자 사일런싱 활성에서 효과적으로 나타난다.
따라서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 RNAi(dsRNA) 제제를 제공한다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. dsRNA 제제의 각각의 가닥은 12개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이 범위일 수 있다. 예를 들어, 각각의 가닥은 14개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 37개의 뉴클레오타이드 길이, 25개 내지 37개의 뉴클레오타이드 길이, 27개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이, 17개 내지 19개의 뉴클레오타이드 길이, 19-25개의 뉴클레오타이드 길이, 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이, 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이, 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 듀플렉스 dsRNA를 형성한다. dsRNA 제제의 듀플렉스 영역은 12개 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 14개 내지 40개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 25개 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이, 27개 내지 35개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17개 내지 19개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 또는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 및 27개의 뉴클레오타이드 쌍 길이로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 가닥의 3' 말단, 또는 5' 말단 또는 양 말단에 dsRNA 제제의 오버행 영역 및/또는 캡핑기(capping group)를 하나 이상 포함한다. 오버행은 1개 내지 10개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 2개 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이, 2개 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이, 2개 내지 4개의 뉴클레오타이드 길이, 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이, 2개 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 오버행은 하나의 가닥이 다른 가닥보다 더 길어서 생기는 것이거나, 또는 동일한 길이의 가닥 2개가 서로 엇갈려서 생기는 것일 수 있다. 오버행은 타겟 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 오버행은 타겟화된 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 기타 서열일 수 있다. 제1 가닥과 제2 가닥은 또한, 예를 들어, 부가의 염기에 의해 결합되어 헤어핀을 형성할 수 있거나, 또는 다른 비-염기 링커에 의해 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 오버행 영역에 있는 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로, 2-F 2'-O메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이들의 임의의 조합과 같은 2'-당 변형을 포함하나 이로 한정되지 않는, 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, TT는 어느 한 가닥에 있는 어느 한 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 타겟 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 오버행은 타겟화된 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 기타 서열일 수 있다.
본 발명의 dsRNA 제제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥 모두에 있는 5' 또는 3' 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 가지는 뉴클레오타이드를 2개 포함하며, 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥의 3' 말단에 존재한다. 일 구현예에서, 이런 3'오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 구현예에서, 이런 3'오버행은 센스 가닥에 존재한다.
본 발명의 dsRNA 제제는, dsRNA의 전체적인 안정성에 영향을 미치지 않으면서 이의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단에 위치하거나, 또는 다르게는, 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치한다. dsRNA는 또한, 안티센스 가닥의 5' 말단 (또는 센스 가닥의 3' 말단)에 위치하거나 또는 그 반대로 위치하는 블런트 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, dsRNA의 안티센스 가닥은 3' 말단에 뉴클레오타이드 오버행을 가지며, 5' 말단이 블런트이다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 안티센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단 오버행에서의 비대칭성 블런트 말단은 가이드 가닥이 RISC 공정으로 로딩되는 것을 선호한다. 예를 들어, 하나의 오버행은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 또한, dsRNA 듀플렉스의 양 말단에 2개의 블런트 말단을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 길이가 19 nt인 이중 말단 블런트머(double ended bluntmer)로서, 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 내지 8번 위치)과 반대되는 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다; 바람직하게는, 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 길이가 20 nt인 이중 말단 블런트머로서, 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 내지 8번 위치에서)과 반대되는 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다; 바람직하게는, 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 길이가 21 nt인 이중 말단 블런트머로서, 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 내지 8번 위치에서)과 반대되는 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다; 바람직하게는, 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 21개 뉴클레오타이드(nt) 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드(nt) 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 내지 8번 위치에서)과 반대되는 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다; 바람직하게는, 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있고, dsRNA의 한 말단은 블런트인 반면, 다른 말단은 2 nt 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2 nt 오버행은 안티센스의 3'-말단에 있다. 선택적으로, dsRNA는 리간드(바람직하게는 수용체 리간드, 즉 ASGPR 리간드)를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 25개 내지 30개 뉴클레오타이드 잔기 길이이고, 5' 말단 뉴클레오타이드(1번 위치)로부터 시작해서, 상기 센스 가닥의 1번 내지 23번 위치는 8개 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 36개 내지 66개 뉴클레오타이드 잔기 길이이며, 3' 말단 뉴클레오타이드로부터 시작해서, 센스 가닥의 1번 내지 23번 위치와 쌍을 이룬 위치에서 8개 이상의 리보뉴클레오타이드는 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않음으로써 1개 내지 6개 뉴클레오타이드의 3' 단일-가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 이루지 않는 10개 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함함으로써 10개 내지 30개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 5' 오버행을 형성하고; 센스 및 안티센스 가닥이 최적 상보성을 위해 정렬된 경우 적어도 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이룸으로써 센스 및 안티센스 가닥 간에 실질적으로 듀플렉스화된 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 안티센스 가닥 길이의 19개 이상의 리보뉴클레오타이드를 따라 타겟 RNA와 충분히 상보적이어서 상기 이중-가닥 핵산이 포유류 세포 내로 도입되는 경우 타겟 유전자 발현을 감소시키고; 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에서)과 반대되는 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다, 예를 들어, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다; 바람직하게는, 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNA 제제는 25 개 이상 29개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 11번 위치에 효소 분해에 취약한 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작고 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있는 2개의 변형 핵산을 포함하며; 상기 센스 가닥의 상기 3' 말단 및 상기 안티센스 가닥의 상기 5' 말단은 블런트 말단을 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 센스 가닥보다 그 3' 말단이 1개 내지 4개 뉴클레오타이드가 더 길고, 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이인 듀플렉스 영역에서, 상기 안티센스 가닥은 상기 안티센스 가닥 길이의 19개 이상의 nt를 따라 타겟 mRNA와 충분히 상보적이어서 상기 dsRNA 제제가 포유류 세포 내로 도입되는 경우 타겟 유전자 발현을 감소시키며, 상기 dsRNA의 다이서(dicer) 분해는 우선적으로 상기 안티센스 가닥의 상기 3' 말단을 포함하는 siRNA를 생성함으로써 포유류에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, dsRNA 제제는 리간드를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 11번 위치에 효소 분해에 취약한 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작고 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있는 2개의 변형 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작고 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있는 2개의 변형 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 있는 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는, 비-연결 포스페이트 산소의 하나 또는 둘다 및/또는 연결 포스페이트 산소 하나 이상의 변화; 리보스 당의 구성분, 예를 들어, 리보스 당의 2'-하이드록실의 변화; 포스페이트 모이어티의 "탈포스포" 링커의 전체 치환; 자연적으로 존재하는 염기의 변형 또는 치환; 및 리보스-포스페이트 백본의 치환 또는 변형을 하나 이상 포함할 수 있는 동일 또는 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
핵산이 하위단위의 중합체이기 때문에, 다수의 변형들은 핵산에서 반복되는 위치에서 발생할 수 있으며, 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형이다. 일부 경우에, 변형은 핵산의 모든 위치에서 발생할 것이지만, 많은 경우 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있으며, 가닥의 말단 영역, 예를 들어 말단 뉴클레오타이드 상의 위치, 또는 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 두 영역 모두에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나, 또는 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-연결 O 위치에서의 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 말단 또는 양 말단 모두에서만 발생할 수 있거나, 가닥의 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치 또는 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5' 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 증대시키거나, 오버행에 특정 염기들을 포함하거나, 또는 단일 가닥 오버행, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 또는 둘 다에 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서로게이트(surrogate)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 또는 5' 오버행에 있는 염기들 중 모두 또는 일부는 변형되는데, 예를 들어, 본원에서 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형으로는, 예를 들어, 당해 기술분야에 공지된 변형을 가지는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 뉴클레오베이스의 리보당 대신에 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸의 사용, 및 인산기에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 타겟 서열과 동종성일 필요가 없다.
일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 변형된다. 가닥은 변형을 하나 초과로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 잔기는 각각 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다.
2가지 이상의 상이한 변형은 전형적으로, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 존재한다. 2개의 변형들은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 비사이클릭 뉴클레오타이드 또는 그외의 변형일 수 있다.
일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택되는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 2개 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각의 잔기가 독립적으로, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-데옥시플루오로 뉴클레오타이드, 2'-O-N-메틸아세타미도(2'-O-NMA) 뉴클레오타이드, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE) 뉴클레오타이드, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 뉴클레오타이드, 또는 2'-ara-F 뉴클레오타이드로 변형된다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 교대 패턴의 변형을, 특히 화학식 I에 나타낸 바와 같은 B1, B2, B3, B1', B2', B3', B4' 영역에 포함한다. 본원에서, 용어 "교대 모티프" 또는 "교대 패턴"은 하나 이상의 변형을 포함하는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 하나의 가닥의 교대 뉴클레오타이드에서 발생한다. 교대 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 2개마다 하나, 또는 뉴클레오타이드 3개마다 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C가 각각 뉴클레오타이드에 대한 일 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 모티프는 "ABABABABABAB...," "AABBAABBAABB...," "AABAABAABAAB...," "AAABAAABAAAB...," "AAABBBAAABBB...," 또는 "ABCABCABCABC..." 등일 수 있다.
교대 모티프에 포함되는 변형의 유형은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D가 각각 일 유형의 뉴클레오타이드 상에서의 변형을 나타내는 경우, 교대 패턴, 즉 2개 뉴클레오타이드마다의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 각각 교대 모티프 예컨대 "ABABAB...," "ACACAC...," "BDBDBD..." 또는 "CDCDCD..." 등에서의 몇몇 변형 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, 안티센스 가닥에서의 교대 모티프에 대한 변형 패턴이 이동된 것에 대해, 센스 가닥에서의 교대 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 이 이동은, 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형된 기가 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형된 기에 상응하도록 이루어질 수 있으며, 그 반대이기도 하다. 예를 들어, dsRNA 듀플렉스에서 안티센스 가닥과 쌍을 이루는 경우의 센스 가닥, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "ABABAB"로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역의 가닥의 3'5'으로부터 "BABABA"로 시작할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "AABBAABB"로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역의 3'-5'으로부터 "BBAABBAA"로 시작할 수 있으며, 따라서 센스 가닥과 안티센스 가닥의 변형 패턴의 완전하거나 또는 부분적인 이동이 존재한다.
본 발명의 dsRNA 제제는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 가닥의 임의의 위치 모두의 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있으며; 각각의 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 교대 패턴에서 발생할 수 있으며; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴에서 뉴클레오타이드간 결합 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴에 대해 이동을 가질 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 간에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 가지는 뉴클레오타이드를 2개 포함한다. 뉴클레오타이드간 결합 변형은 또한, 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍의 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 통해 연결될 수 있으며, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드의 옆에 존재하는 쌍으로 된 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하는 부가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재할 수 있다. 예를 들어, 말단의 3개의 뉴클레오타이드 간에는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 2개 이상 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이며, 세번째 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍으로 된 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 이들 말단의 뉴클레오타이드 3개는 안티센스 가닥의 3' 말단에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 2개 내지 10개 중 1개 내지 10개의 블록을 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 임의의 조합을 포함하는 안티센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 또는 16개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 3개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 또는 14개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 4개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 5개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 6개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 7개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 8개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합 9개에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 블록을 2개 포함하며, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 놓이며, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 말단 위치(들) 1 내지 10 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 하나 이상 추가로 포함한다. 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 뉴클레오타이드는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 통해 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 듀플렉스의 내부 영역 1 내지 10 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 하나 이상 추가로 포함한다. 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5' 말단에서부터 계수하여 듀플렉스의 8번 내지 16번 위치에서 포스포로티오에이트 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 통해 연결될 수 있으며; dsRNA 제제는 선택적으로, 말단 위치(들) 1 내지 10 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 하나 이상 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 1개 내지 5개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 1개 내지 5개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 내지 5개 및 18번 내지 23번 위치 내에 1개 내지 5개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에서 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 가닥의 (5' 말단에서부터 계수하여) 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 가닥의 (5' 말단에서부터 계수하여) 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 (5' 말단에서부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 (5' 말단에서부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들)을 2개, 및 20번 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들)을 1개, 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 1개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 20번 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들)을 2개, 및 21번 및 22번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들)을 1개, 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 1개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 21번 및 22번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들)을 2개, 및 22번 및 23번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개, 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 1개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는, (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들)을 1개, 및 21번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형(들) 1개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 23번 및 23번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 듀플렉스 내에서 타겟과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 특성을 토대로 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 페어링(pairing)의 결합 또는 해리의 자유 에너지에서, 가장 간단한 방법은 개별 쌍 기준으로 쌍을 시험하지만, 옆의 인접한 또는 유사한 분석이 또한 사용될 수 있음). 해리의 촉진 면에서, A:U는 G:C보다 바람직하며; G:U는 G:C보다 바람직하고; I:C는 G:C보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-원형(canonical) 또는 원형 페어링 이외의 페어링(전술한 바와 같음)은 원형(A:T, A:U, G:C) 페어링보다 바람직하며; 보편적인 염기를 포함하는 페어링이 원형 페어링보다 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 제1의 염기쌍 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 중 하나 이상을 포함하며, 듀플렉스의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 독립적으로 A:U, G:U, I:C, 및 미스매칭된 쌍, 예를 들어, 비-원형 또는 원형 페어링 이외의 페어링 또는 보편적인 염기를 포함하는 페어링의 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1번 위치의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 구성된 군으로부터 선택된다. 다르게는, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1의 염기쌍 1개, 2개 또는 3개 중 하나 이상은 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
본 발명자들은 단일-가닥 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 포스포디에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 및/또는 포스포로디티오에이트(PS2) 결합의 3'-말단에 대한 4'-변형 및/또는 5'-변형 뉴클레오타이드의 도입이 뉴클레오타이드간 결합에 대해 입체 효과를 발휘함으로써, 이를 뉴클레아제에 대해 보호하거나 안정화할 수 있음을 확인하였다.
일 구현예에서, 5'-변형 뉴클레오사이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 siRNA의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입된다. 예를 들어, 5'-알킬화 뉴클레오사이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 siRNA의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 5' 위치에서의 알킬기는 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, 4'-변형 뉴클레오사이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 siRNA의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입된다. 예를 들어, 4'-알킬화 뉴클레오사이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 siRNA의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 4' 위치에서의 알킬기는 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 대안적으로, 4'-O-알킬화 뉴클레오사이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 siRNA의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보스 당의 4'-O-알킬은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, 5'-알킬화 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의 위치에 도입되며, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지하거나 개선한다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, 4'-알킬화 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의 위치에 도입되며, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지하거나 개선한다. 4'-알킬은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, 4'-O-알킬화 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의 위치에 도입되며, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지하거나 개선한다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄 순수 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥 서열은 화학식 Is로 나타난다:
(화학식 Is)
식에서,
B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 안티센스 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)의 반대에 배치된 열적 탈안정화 뉴클레오타이드(예를 들어, 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예컨대 UNA 또는 GNA, 미스매치, 무염기, 또는 DNA)이고;
T1은 2'-OMe 변형보다 작은 입체 장애를 뉴클레오타이드에 제공하는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서 2' 위치 또는 동등 위치에 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내며; 예를 들어, T1은 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되고;
n1 또는 n3은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5는 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4는 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고, 및
n2는 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 19개, 20개, 21개, 또는 22개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 서열은 화학식 Is로 나타난다:
(화학식 Is)
식에서,
B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 안티센스 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)의 반대에 배치된 열적 탈안정화 뉴클레오타이드(예를 들어, 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예컨대 UNA 또는 GNA, 미스매치, 무염기, 또는 DNA)이고;
T1은 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
n1 또는 n3은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5는 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4는 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고, 및
n2는 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
일 구현예에서, 화학식 Is의 dsRNA 제제는 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들)을 추가로 포함한다. 일례에서, 화학식 Is의 dsRNA 제제는 5' 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번, 15번, 16번 또는 17번 위치에 1개의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA), 미스매치, 무염기, 또는 DNA이다. 하나의 구체예에서, C1은 GNA이다.
일 구현예에서, T1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 11번 위치에 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 또는 2'-F-5'-메틸을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 가닥(Is)을 포함하며, C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA), 미스매치, 무염기, 또는 DNA이고; T1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 11번 위치에 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 또는 2'-F-5'-메틸을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥 서열은 화학식 Ia로 나타난다:
(화학식 Ia)
식에서,
B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형보다 작은 입체 장애를 뉴클레오타이드에 제공하는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서 2' 위치 또는 동등 위치에 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내며; 예를 들어, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되고;
q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 안티센스 가닥 서열은 화학식 Ia로 나타난다:
(화학식 Ia)
식에서,
B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
일 구현예에서, 화학식 Ia의 dsRNA는 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들)을 추가로 포함한다. 일례에서, 화학식 Ia의 dsRNA는 3' 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA)이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
n1, n3, 또는 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2 또는 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 안티센스 및/또는 센스 가닥(들)의 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들)을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA)이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
n1, n3, 또는 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2 또는 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 안티센스의 3'-말단에 2개 뉴클레오타이드 길이의 3' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 15개 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 변형 2'-OMe를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드 GNA이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA 또는 RNA이고;
n1, n3, 또는 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2 또는 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 1개 내지 6개 뉴클레오타이드 길이의 3' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 19개 내지 23개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드 GNA이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 독립적으로 DNA 또는 RNA이고;
n1, n3, q1 또는 q3은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2, q4 또는 q5는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 안티센스의 3'-말단에 2개 뉴클레오타이드 길이의 3' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA)이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
n1, n3, 또는 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2 또는 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 센스의 5'-말단에 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 5' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA)이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
n1, n3, 또는 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2 또는 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 센스의 5'-말단에 1개 내지 6개 뉴클레오타이드 길이의 5' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다.
(화학식 I)
식에서,
B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내며;
C1은 비사이클릭 뉴클레오타이드(예를 들어, UNA 또는 GNA)이고;
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
n1, n3, 또는 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이고;
n5, q3 또는 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
n4, q2 또는 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 대안적으로, n4는 0이고,
n2 또는 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이고;
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이고; 및
dsRNA 제제는 센스의 5'-말단에 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 5' 오버행 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 오버행을 갖는다.
열적 탈안정화 변형.
dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)에 반대되는 부위에서 센스 가닥에 열적 탈안정화 변형을 도입함으로써 dsRNA 듀플렉스의 해리 또는 용융 경향성을 증가시켜(듀플렉스 회합의 자유 에너지를 감소시켜) RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 상기 변형은 듀플렉스가 안티센스 가닥의 씨드 영역에서 해리하거나 용융하는 경향성을 증가시킬 수 있다.
열적 탈안정화 변형에는 무염기 변형; 대항하는 가닥에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예를 들어 비잠김 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)이 포함될 수 있다.
예시되는 무염기 변형은 다음과 같다:
예시되는 당 변형은 다음과 같다:
용어 "비사이클릭 뉴클레오타이드"는 비사이클릭 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 나타낸다, 예를 들어 리보스 탄소 간 임의의 결합(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4')이 부재하고/하거나 1개 이상의 리보스 탄소 또는 산소(예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4')가 독립적으로 또는 조합으로 뉴클레오타이드에 부재한다. 일부 구현예에서, 비사이클릭 뉴틀레오타이드는 이고, B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당이다). 용어 "UNA"는 비잠김 비사이클릭 핵산을 나타내며, 임의의 당 결합이 제거되어 비잠김 "당" 잔기를 형성한다. 일례에서, UNA는 또한 C1'-C4' 간 결합(즉, C1' 및 C4' 탄소 간 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2' 및 C3' 탄소 간 공유 탄소-탄소 결합)이 제거된다(문헌[Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)] 참고, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 비사이클릭 유도체는 왓슨-크릭 쌍 형성에 영향을 미치지 않고 더 큰 백본 유연성을 제공한다. 비사이클릭 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 결합을 통해 연결될 수 있다.
용어 'GNA'는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복 글리세롤 단위로 이루어진다는 점에서 그 "백본"의 조성이 상이한 중합체인 글리콜 핵산을 나타낸다:
열적 탈안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내 대항하는 가닥에서 열적 탈안정화 뉴클레오타이드 및 대항하는 뉴클레오타이드 간 미스매치(즉, 비상보적 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍에는 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T, 또는 이들의 조합이 포함된다. 당분야에 공지된 다른 미스매치 염기쌍도 본 발명에 적합하다. 미스매치는 천연 생성 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 간에 발생할 수 있다, 즉 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보스 당의 변형과 무관하게 각각의 뉴클레오타이드로부터의 뉴클레오베이스 간에 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNA 제제는 2'-데옥시 뉴클레오베이스인 미스매치 쌍 형성에 1개 이상의 뉴클레오베이스를 함유한다; 예를 들어, 2'-데옥시 뉴클레오베이스가 센스 가닥에 있다.
무염기 뉴클레오타이드, 비사이클릭 뉴클레오타이드 변형(UNA 및 GNA 포함), 및 미스매치 변형의 더 많은 예는 WO 2011/133876에 상세히 기재되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
열적 탈안정화 변형에는 또한 대항하는 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범(universal) 염기, 및 포스페이트 변형이 포함될 수 있다.
반대 가닥에서의 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전 폐지된 뉴클레오베이스 변형이 WO 2010/0011895에 기재된 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 탈안정화에 대해 평가되었으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예시적인 뉴클레오베이스 변형은 다음과 같다:
천연 포스포디에스테르 결합 대비 dsRNA 듀플렉스의 열적 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적인 포스페이트 변형은 다음과 같다:
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 2'-5' 결합(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe 포함 및 P=O 또는 P=S 포함)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'-5' 결합 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하기 위해 또는 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 이용될 수도 있고, 또는 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 이용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 L 당(예를 들어, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe 포함 L 리보스, L-아라비노스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 L 당 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하기 위해 또는 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 이용될 수도 있고, 또는 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 이용될 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 화학식 I로 표시되는 듀플렉스를 2개 이상 포함하는 다량체(multimer)로서, 상기 듀플렉스들은 링커에 의해 연결된다. 링커는 분해형 또는 비-분해형일 수 있다. 선택적으로, 상기 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. dsRNA 제제 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 타겟으로 할 수 있거나; 또는 dsRNA 제제 각각은 2개의 상이한 타겟 부위에 있는 동일한 유전자를 타겟으로 할 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 화학식 I로 표시되는 듀플렉스를 3개, 4개, 5개, 6개 이상 포함하는 다량체로서, 상기 듀플렉스들은 링커에 의해 연결된다. 링커는 분해형 또는 비-분해형일 수 있다. 선택적으로, 상기 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. dsRNA 제제 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 타겟으로 할 수 있거나; 또는 dsRNA 제제 각각은 2개의 상이한 타겟 부위에 있는 동일한 유전자를 타겟으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 I로 표시되는 2개의 dsRNA 제제들은 5' 말단에서 서로 연결되며, 3' 말단 중 하나 또는 둘 다는 리간드에 선택적으로 접합된다. dsRNA 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 타겟으로 할 수 있거나; 또는 dsRNA 각각은 2개의 상이한 타겟 부위에 있는 동일한 유전자를 타겟으로 할 수 있다.
다양한 공개문헌들은 다량체성 siRNA를 기술하였으며, 모두 본 발명의 siRNA와 함께 사용될 수 있다. 이런 공개 문헌들로는, WO2007/091269, 미국 특허 No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 및 WO2011/031520를 포함하며, 이들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되어 있다.
하나 이상의 탄수화물 모이어티가 dsRNA 제제에 접합된 dsRNA 제제는 dsRNA 제제의 특성들 중 하나 이상을 최적화할 수 있다. 많은 경우, 탄수화물 모이어티는 dsRNA 제제의 변형된 하위단위에 부착될 것이다. 예를 들어, dsRNA 제제의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 하위단위의 리보스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드에 결합되는 비-탄수화물 (바람직하게는 사이클릭) 담체로 치환될 수 있다. 하위단위의 리보스 당이 치환된 리보뉴클레오타이드 하위단위는 본원에서, 리보스 치환 변형 하위단위(RRMS)로 지칭된다. 사이클릭 담체는 카르보사이클릭 고리 시스템일 수 있는데, 즉 모든 고리 원자들이 탄소 원자이며, 또는 헤테로사이클릭 고리 시스템일 수 있는데, 즉, 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소, 황과 같은 헤테로원자일 수 있다. 사이클릭 담체는 모노사이클릭 고리 시스템일 수 있거나, 또는 융합 고리와 같은 고리를 2개 이상 포함할 수 있다. 사이클릭 담체는 완전히 포화된 고리 시스템일 수 있거나, 또는 이중 결합을 하나 이상 포함할 수 있다.
리간드는 담체를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 담체로는, (i) 하나 이상의 "백본 부착점", 바람직하게는 2개의 "백본 부착점", 및 (ii) 하나 이상의 "에테르 부착점"을 포함한다. 본원에서, "백본 부착점"은 하이드록실기와 같은 작용기, 또는 일반적으로 백본으로의 담체의 삽입에 적절하며 이에 이용가능한 결합, 예를 들어, 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예를 들어, 리보핵산의 황 함유 백본을 포함한다. 일부 구현예에서, "에테르 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는 (백본 부착점을 제공하는 원자와 구별되는) 탄소 원자 또는 헤테로원자와 같은 사이클릭 담체의 구성원 고리 원자를 지칭한다. 모이어티는, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류와 같은 탄수화물이다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 사이클릭 담체에의 개입 테터링에 의해 연결된다. 따라서, 사이클릭 담체는 종종 아미노기와 같은 작용기를 포함하거나, 또는 일반적으로 구성분 고리에의 리간드와 같은 또 다른 화학적 엔터티(entity)의 삽입 또는 테터링에 적절한 결합을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 담체를 통해 리간드에 접합되며, 담체는 사이클릭기 또는 비-사이클릭기일 수 있으며; 바람직하게는, 사이클릭기는 피로릴디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비-사이클릭기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본으로부터 선택된다.
본 발명의 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제는 선택적으로 하나 이상의 리간드에 접합될 수 있다. 리간드는 3' 말단, 5' 말단 또는 양 말단에서 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥 모두에 부착될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥, 특히 센스 가닥의 3' 말단에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 5' 인산화되거나 5' 말단에 포스포릴 유사체가 포함된다. 5'-포스페이트 변형에는 RISC 매개 유전자 사일런싱과 상용성인 것들이 포함된다. 적합한 변형에는 5'-모노포스페이트((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비-메틸화)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황이 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가 조합(예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포로아미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'-, 5'-알케닐포스포네이트(즉, 비닐, 치환 비닐), (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트(R=알킬에테르=메톡시메틸(MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'-)가 포함된다. 일례에서, 변형은 dsRNA 제제의 안티센스 가닥에 배치될 수 있다.
리간드
매우 다양한 엔터티들이 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 바람직한 모이어티는 리간드로서, 이는 개입 테터를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 커플링, 바람직하게는 공유 결합되어 있다.
바람직한 구현예에서, 리간드는, 이것이 삽입되는 분자의 분포, 타겟화 또는 수명을 변경한다. 바람직한 구현예에서, 리간드는 선별된 타겟, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 신체의 구획, 수용체, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 영역에 대해, 이런 리간드가 존재하지 않는 화학종과 비교해, 증대된 친화성을 제공한다. 선별된 타겟에 대해 증대된 친화성을 제공하는 리간드는 또한, 타겟화 리간드로도 일컬어진다.
일부 리간드들은 엔도좀분해 특성을 가질 수 있다. 엔도좀분해성 리간드는 엔도좀의 파쇄 및/또는 본 발명의 조성물 또는 이의 구성분의 세포의 엔도좀에서 세포질로의 수송을 촉진한다. 엔도좀분해성 리간드는 pH-의존성 막 활성 및 융합생성을 나타내는 폴리음이온성 펩타이드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 일 구현예에서, 엔도좀분해성 리간드는 엔도좀의 pH에서 이의 활성 형태를 취한다. "활성" 형태란, 엔도좀분해성 리간드가 엔도좀의 파쇄 및/또는 본 발명의 조성물 또는 이의 구성분의 세포의 엔도좀에서 세포질로의 수송을 촉진하는 형태이다. 예시적인 엔도좀분해성 리간드로는, GALA 펩타이드(Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972, 그 전체가 원용에 의해 포함됨), EALA 펩타이드(Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586, 그 전체가 원용에 의해 포함됨), 및 이들의 유도체(Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68, 그 전체가 원용에 의해 포함됨)를 포함한다. 일 구현예에서, 엔도좀분해성 구성분은 pH 변화에 반응하여 전하의 변화 또는 양성자화를 수행할 화학적 기(예를 들어, 아미노산)를 포함한다. 엔도좀분해성 구성분은 선형 또는 분지형일 수 있다.
리간드는 수송, 혼성화, 및 특이성을 향상시킬 수 있으며, 또한 생성되는 천연 또는 변형된 올리고리보뉴클레오타이드, 또는 본원에서 기술되는 단량체 및/또는 천연 또는 변형된 리보뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 중합체성 분자의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있다.
리간드는 일반적으로, 예를 들어 흡수 증대를 위한 치료 변형제; 예를 들어 분포를 모니터링하기 위한 진단 화합물 또는 리포터 기; 가교제; 및 뉴클레아제-내성 부여 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적인 예로는, 지질, 스테로이드, 비타민, 당, 단백질, 펩타이드, 폴리아민, 및 펩타이드 모방체를 포함한다.
리간드는 자연적으로 존재하는 성분, 예컨대 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL), 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한, 제조합 또는 합성 분자, 예컨대 합성 중합체, 예를 들어, 합성 폴리아미노산, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 앱타머(aptamer))일 수 있다. 폴리아미노산의 예로는, 폴리아미노산을 포함하며, 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜라이드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예로는, 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선형 펩타이드를 포함한다.
리간드는 또한, 신장 세포와 같은 특정 유형의 세포에 결합하는, 타겟화 기, 예를 들어, 세포 또는 조직 타겟화 제제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 항체를 포함할 수 있다. 타겟화기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-글루코사민, N-아세틸-굴루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, RGD 펩타이드, RGD 펩타이드 모방체 또는 앱타머일 수 있다. 표 2는 리간드 및 이들과 관련된 수용체들을 타겟으로 하는 일부 예들을 보여주고 있다.
리간드의 다른 예로는, 염료, 삽입(intercalating) 제제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 프소랄렌(psoralen), 미토마이신 C), 포피린(TPPC4, 텍사피린(texaphyrin), 사피린(Sapphyrin)), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 또는 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 담즙산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올(borneol), 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레일)리토콜릭산, O3-(올레일)콜레닉산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합제(예를 들어, 안테나페디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지 마커, 효소, 헵텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는, 암세포, 내피 세포 또는 뼈 세포와 같은 특정 유형의 세포에 결합하는, 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어, 코-리간드에 대해 특이적인 친화성을 가지는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 항체이다. 리간드는 또한, 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 또는 앱타머와 같은 비-펩티드성 화학종을 포함할 수도 있다. 리간드는 예를 들어, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제, 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 세포의 세포골격을 붕괴함으로써, 예를 들어 세포의 미세소관, 미세섬유 및/또는 중간 섬유를 붕괴함으로써 iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 약물과 같은 성분일 수 있다. 약물은 예를 들어, 탁손(taxon), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 사이토칼라신(cytochalasin), 노코다졸(nocodazole), 야플라키놀리드(japlakinolide), 라트룬쿨린 A(latrunculin A), 팔로이딘(phalloidin), 스윈홀라이드 A(swinholide A), 인다노신(indanocine), 또는 마이오세르빈(myoservin)일 수 있다.
리간드는 예를 들어, 염증 반응을 활성화시킴으로써 올리고뉴클레오타이드의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이런 효과를 가지는 예시적인 리간드로는, 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론을 포함한다.
일 양태에서, 리간드는 지질 또는 지질-기재 분자이다. 이런 지질 또는 지질-기재 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합한다. HSA 결합 리간드는, 신체의 비-신장 타겟 조직과 같은 타겟 조직에의 접합을 분포시킬 수 있다. 예를 들어, 타겟 조직은 간의 실질 세포를 비롯하여 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 기타 분자가 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센(naproxen) 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질-기재 리간드는, (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시키며, (b) 타겟화 또는 타겟 세포 또는 세포막에의 수송을 증가시키며, 및/또는 (c) HSA와 같은 혈청 단백질에의 결합을 조정하는 데 사용될 수 있다.
지질-기재 리간드는 타겟 조직에의 접합체의 결합을 조정, 예를 들어 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, HSA에 보다 강하게 결합하는 지질 또는 지질-기재 리간드는 신장으로 타겟화되는 경향이 낮으며 따라서 신체로부터 소거되는 경향도 낮을 것이다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질-기재 리간드는 신장에의 접합을 타겟화하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 지질-기재 리간드는 HSA에 결합한다. 바람직하게는, 이는, 접합이 바람직하게는 비-신장 조직에 분포되도록 충분한 친화성으로 HSA에 결합한다. 그러나, 이 친화성은 HSA-리간드 결합이 역행될 수 없을 정도로 강하지 않은 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 지질-기재 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 또는 전혀 결합하지 않아, 접합체는 바람직하게는 신장에 분포될 것이다. 신장 세포를 타겟으로 하는 기타 모이어티는 또한, 지질-기재 리간드 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 리간드는 증식 세포와 같은 타겟 세포에 의해 취해지는 비타민과 같은 모이어티이다. 이들은 특히, 암세포와 같은 악성 유형 또는 비-악성 유형의 세포의 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 유용하다. 예시적인 비타민으로는, 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 또한, HAS, 저밀도 지질단백질(LDL) 및 고밀도 지질단백질(HDL)이 포함된다.
또 다른 양태에서, 리간드는 세포-투과 제제, 바람직하게는 나선형(helical) 세포-투과 제제이다. 바람직하게는, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테나페디아(antennapedia)와 같은 펩타이드이다. 제제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜미메틱(peptidylmimetic), 인버토머(invertomer), 비-펩타이드 또는 슈도-펩타이드 결합 및 D-아미노산의 사용을 비롯하여 변형될 수 있다. 나선형 제제는 바람직하게는 알파-나선형 제제로서, 바람직하게는 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 가진다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 펩티도미메틱(본원에서 올리고펩티도미메틱으로도 지칭됨)은 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱 모이어티는 약 5개 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어, 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드, 또는 소수성 펩타이드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 이루어짐)일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 덴드리머 펩타이드, 속박된(constrained) 펩타이드 또는 가교된 펩타이드일 수 있다. 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩타이드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP을 가지는 RFGF이다. 소수성 MTS를 포함하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP)는 또한 타겟화 모이어티일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 "전달" 펩타이드일 수 있으며, 이는 세포막을 가로질러 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 및 단백질을 포함하는 거대 극성 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ) 및 초파리 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK)의 서열은 전달 펩타이드로서 작용할 수 있는 것으로 확인되었다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱은, 파지-디스플레이 라이브러리 또는 원-비드-원-화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 동정되는 펩타이드와 같이, DNA의 랜덤 서열에 의해 코딩될 수 있다(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). 바람직하게는 혼입된 단량체 단위를 통해 iRNA 제제에 테터링된 펩타이드 또는 펩티도미메틱은, 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩타이드, 또는 RGD 모방체와 같은 세포 타겟화 펩타이드이다. 펩타이드 모이어티는 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 길이의 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 예컨대 안정성을 높이거나 또는 형태적 특성을 지시하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기에 기술한 구조적 변형 중 임의의 변형이 이용될 수 있다. RGD 펩타이드 모이어티는 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포와 같은 종양 세포를 타겟으로 하는 데 사용될 수 있다(Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). RGD 펩타이드는 iRNA 제제를 폐, 신장, 비장 또는 간을 비롯한 기타 다양한 조직의 종양으로 타겟화하는 것을 촉진할 수 있다(Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). 바람직하게는, RGD 펩타이드는 iRNA 제제를 신장에게 타겟화하는 것을 촉진할 것이다. RGD 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있으며, 특정 조직으로의 타겟화를 촉진하기 위해 글리코실화되거나 또는 메틸화되는 것과 같이 변형될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화된 RGD 펩타이드는 iRNA 제제를 ανβ3를 발현하는 종양 세포에 전달할 수 있다(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). 타겟 마커가 증식 세포에 농화된 펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, RGD 함유 펩타이드 및 펩티도미메틱은 암세포, 특히 인테그린을 제시하는 세포를 타겟으로 할 수 있다. 따라서, 당업자는 RGD 펩타이드, RGD 함유 사이클릭 펩타이드, D-아미노산을 포함하는 RGD 펩타이드, 뿐만 아니라 합성 RGD 모방체를 사용할 수 있다. RGD 외에도, 당업자는 인테그린 리간드를 타겟화하는 기타 모이어티를 사용할 수 있다. 일반적으로, 이런 리간드는 증식 세포 및 혈관신생을 조절하는 데 사용될 수 있다. 이런 유형의 바람직한 접합은, PECAM-1, VEGF, 또는 기타 암 유전자, 예를 들어, 본원에서 기술된 암 유전자를 타겟으로 하는 리간드이다.
"세포 투과 펩타이드"는 박테리아 세포 또는 진균류 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포와 같은 세포를 투과할 수 있는 펩타이드이다. 미생물 세포-투과성 펩타이드는 예를 들어, α-나선형 선형 펩타이드(예를 들어, LL-37 또는 Ceropin P1), 이황화 결합-함유 펩타이드(예를 들어, α-데펜신, β-데펜신 또는 박테네신(bactenecin)), 또는 지배(dominating) 아미노산을 단지 1개 또는 2개 함유하는 펩타이드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘(indolicidin))일 수 있다. 세포 투과 펩타이드는 또한, 핵 위치화 신호(NLS)를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩타이드는 SV40 거대 T 항원의 NLS 및 HIV-1 gp41의 융합 펩타이드 도메인으로부터 유래되는 MPG와 같은 바이파타이트(bipartite) 양친매성 펩타이드일 수 있다(Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003, 그 전체가 원용에 의해 포함됨).
일 구현예에서, 타겟화 펩타이드는 양친매성 α-나선형 펩타이드일 수 있다. 예시적인 양친매성 α-나선형 펩타이드로는, 세크로핀(cecropin), 라이코톡신(lycotoxin), 파라닥신(paradaxin), 부포린(buforin), CPF, 봄비닌-유사(bombinin-like) 펩타이드(BLP), 카텔리시딘(cathelicidin), 세라토톡신(ceratotoxin), S. 클라바(S. clava) 펩타이드, 하그피쉬 장 항균 펩타이드(hagfish intestinal antimicrobial peptide)(HFIAP), 마가이닌(magainine), 브레비닌-2(brevinin-2), 데르마셉틴(dermaseptin), 멜리틴(melittin), 플레우로시딘(pleurocidin), H2A 펩타이드, 제노푸스(Xenopus) 펩타이드, 에스쿨렌티니스-1(esculentinis-1), 및 캐린(caerin)이 포함되나, 이로 한정되지 않는다. 다수의 인자들은 바람직하게는, 나선형 안정성의 온전성(integrity)을 유지하는 것으로 여겨질 수 있다. 예를 들어, 최대 수의 나선 안정화 잔기가 이용될 것이며(예를 들어, leu, ala, 또는 lys), 최소 수의 나선 탈안정화 잔기가 이용될 것이다(예를 들어, 프롤린, 또는 사이클릭 단량체성 단위). 캡핑 잔기가 고려될 것이며, 예를 들어, Gly은 예시적인 N-캡핑 잔기이며 및/또는 C-말단 아미드화가 사용되어 나선을 안정화시키기 위한 여분의 H-결합을 제공할 수 있다. i±3, 또는 i±4번 위치에 의해 분리된, 반대 전하를 가진 잔기들 간의 염 다리의 형성은 안정성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 호모-아르기닌, 오르니틴 또는 히스티딘과 같은 양이온성 잔기는 음이온성 잔기인 글루타메이트 또는 아스파테이트와 염 다리를 형성할 수 있다.
펩타이드 및 펩티도미메틱 리간드는, 자연적으로 존재하는 펩타이드 또는 변형된 펩타이드, 예를 들어, D 또는 L 펩타이드; α, β, 또는 γ 펩타이드; N-메틸 펩타이드; 아자펩타이드; 하나 이상의 아미드를 가지는 펩타이드, 즉, 하나 이상의 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 또는 설포닐 우레아 결합으로 치환된 연결을 가진 펩타이드; 또는 사이클릭 펩타이드를 가진 것들을 포함한다.
타겟화 리간드는 특정 수용체를 타겟화할 수 있는 임의의 리간드일 수 있다. 예로는, 폴레이트, GalNAc, 갈락토스, 만노스, 만노스-6P, GalNAc 클러스터, 만노스 클러스터, 갈락토스 클러스터와 같은 당의 클러스터, 또는 앱타머이다. 클러스터는 당 단위 2개 이상의 조합이다. 타겟화 리간드는 또한, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 비오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL 및 HDL 리간드를 포함한다. 리간드는 또한, 앱타머와 같은 핵산을 기재로 할 수 있다. 앱타머는 비변형될 수 있거나, 또는 본원에서 개시되는 변형의 조합을 가질 수 있다.
엔도좀 방출제로는, 이미다졸, 폴리이미다졸 또는 올리고이미다졸, PEI, 펩타이드, 융합생성 펩타이드, 폴리카르복실레이트, 폴리양이온, 마스킹된(masked) 올리고 또는 폴리 양이온 또는 음이온, 아세탈, 폴리아세탈, 케탈/폴리케탈, 오르토에스테르, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 가진 중합체, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 가진 덴드리머를 포함한다.
PK 조절제는 약동학적 조절제를 나타낸다. PK 조절제로는, 친유성제(lipophile), 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제로는, 콜레스테롤, 지방산, 담즙산, 리토콜릭산, 디알킬글리세라이드, 디아실글리세라이드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 백본에서 포스포로티오에이트 결합을 복수 개로 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오타이드와 같은 짧은 올리고뉴클레오타이드는 또한, 본 발명에서 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드로서) 용이하다.
또한, 혈청 구성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 앱타머는 또한, 본 발명에서 PK 조절 리간드로서 용이하다.
본 발명에 용이한 기타 리간드 접합체는, 2004년 10월 10일에 출원된 미국 특허 출원 USSN: 10/916,185; 2004년 9월 21일에 출원된 USSN: 10/946,873; 2007년 8월 3일에 출원된 USSN: 10/833,934; 2005년 4월 27일에 출원된 USSN: 11/115,989 및 2007년 11월 21일에 출원된 USSN: 11/944,227에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.
2개 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 모두 동일한 특성을 가질 수 있으며, 모두 서로 다른 특성들을 가질 수 있거나, 또는 일부 리간드들은 동일한 특성들을 가지는 한편 다른 것들은 서로 다른 특성들을 가진다. 예를 들어, 리간드는 타겟화 특성을 가지거나, 엔도좀분해성 활성을 가지거나, 또는 PK 조절 특성을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리간드들은 모두 서로 다른 특성들을 가진다.
리간드는 3' 말단, 5' 말단, 및/또는 내부 위치와 같은 다양한 위치에서 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리간드는 본원에서 기술되는 담체와 같은 개입 테터를 통해 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 리간드 또는 테터링된 리간드는, 단량체가 성장중인 가닥에 혼입되는 경우, 상기 단량체 상에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는, "전구체" 다량체가 성장중인 가닥에 혼입된 후에, 상기 "전구체" 단량체에 커플링을 통해 혼입될 수 있다. 예를 들어, 아미노-말단화된 테터를 가진(즉, 관련된 리간드를 가지지 않는) 단량체, 예를 들어, TAP-(CH2)nNH2는 성장중인 올리고뉴클레오타이드 가닥에 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 가닥에 삽입한 후, 친전자성 기를 가지는 리간드, 예를 들어, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알데하이드 기는 후속해서, 전구체 단량체의 테터의 말단 친핵성 기와 함께 리간드의 친전자성 기를 커플링함으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.
또 다른 예에서, 클릭 화학 반응에 참여하는데 적절한 화학 기를 가지는 단량체, 예를 들어, 아자이드 또는 알카인 말단화된 테터/링커가 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 가닥에 삽입한 후, 알카인 또는 아자이드와 같은 상보적인 화학 기를 가지는 리간드는 알카인 및 아자이드를 함께 커플링함으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 경우, 리간드는 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 센스 가닥에 접합된 리간드를 포함한다. 다른 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥에 접합된 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 리간드는 핵산 분자의 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합될 수 있다. 퓨린 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에의 접합은 엔도사이클릭 원자 및 엑소사이클릭 원자를 비롯한 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 퓨린 뉴클레오베이스의 2-위치, 6-위치, 7-위치, 또는 8-위치는 접합 모이어티에 부착된다. 피리미딘 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에의 접합은 임의의 위치에서 발생할 수도 있다. 일부 구현예에서, 피리미딘 뉴클레오베이스의 2-위치, 5-위치, 및 6-위치는 접합 모이어티로 치환될 수 있다. 뉴클레오사이드의 당 모이어티에의 접합은 임의의 탄소 원자에서 발생할 수 있다. 접합 모이어티에 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 1' 위치는 또한, 무염기(abasic) 잔기와 같은 접합 모이어티에 부착될 수도 있다. 뉴클레오사이드간 결합은 또한, 접합 모이어티를 가질 수 있다. 인-함유 결합의 경우(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트 등), 접합 모이어티는 인 원자, 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 직접 부착될 수 있다. 아민-함유 또는 아미드-함유 뉴클레오사이드간 결합(예를 들어, PNA)의 경우, 접합 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.
RNA 간섭 분야에서 임의의 적절한 리간드가 사용될 수 있지만, 리간드는 전형적으로 탄수화물, 예를 들어 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 다당류이다.
리간드를 핵산에 접합시키는 링커로는 전술한 것들을 포함한다. 예를 들어, 리간드는, 1가, 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc(N-아세틸글루코사민) 유도체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA는 2가 및 3가 분지형 링커에 접합되며 이로는 화학식 IV 내지 화학식 VII에 나타낸 구조들을 포함하며:
식에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각각 독립적으로 0 내지 20을 표시하며, 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T5A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 부재이거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이며;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각 독립적으로 부재이거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이며, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 방해를 받거나 또는 종료될 수 있으며;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각 독립적으로 부재이거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, 또는 헤테로사이클릴을 나타내며;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드를 나타내는데; 즉, 각각 독립적으로 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 다당류, 올리고당류, 또는 다당류이며; 및
Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다.
3가 접합 GalNAc 유도체는 특히, 화학식 VII의 것과 같은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제와 함께 사용하기에 유용하며:
식에서, L5A, L5B 및 L5C는 단당류, 예컨대 GalNAc 유도체이다.
GalNAc 유도체를 접합시키는 적절한 2가 및 3가 분지형 링커의 예로는, 다음 화합물을 포함하나, 이로 한정되지 않는다:
, 또는
정의
본원에서, 용어 "dsRNA", "siRNA" 및 "iRNA" 제제는 타겟 RNA, 예를 들어, mRNA, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 유전자의 전사체의 사일런싱을 매개할 수 있는 제제와 상호교환적으로 사용된다. 편의상, 이런 mRNA는 본원에서 사일런싱되는 mRNA로도 지칭된다. 이런 유전자는 또한 타겟 유전자로도 지칭된다. 일반적으로, 사일런싱되는 RNA는 내인성 유전자 또는 병원체 유전자이다. 또한, mRNA 이외의 RNA, 예를 들어, tRNA, 및 바이러스 RNA가 또한 타겟화될 수 있다.
본원에서, 문구 "RNAi를 매개한다"는, 타겟 RNA를 서열 특이적 방식으로 사일런싱시키는 능력을 지칭한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 사일런싱은 RNAi 머시너리(machinery) 또는 공정 및 가이드 RNA, 예를 들어, 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드로 이루어진 siRNA 제제를 사용하는 것으로 여겨진다.
본원에서, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은, 안정하고 특이적인 결합이 본 발명의 화합물과 타겟 RNA 분자 간에 발생하도록 충분한 정도의 상보성을 지시하는 데 사용되는 용어이다. 특이적 결합은, 특이적 결합이 바람직한 조건 하에, 즉, 분석법 또는 치료적 치료의 경우 생리학적 조건 하에, 또는 시험관 내 분석법의 경우 분석법이 수행되는 조건 하에, 올리고머 화합물이 비-타겟 서열에 비-특이적 결합하는 것을 피하기 위해 충분한 정도의 상보성을 필요로 한다. 비-타겟 서열은 전형적으로, 뉴클레오타이드 5개 이상이 차이난다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 타겟 mRNA와 같은 타겟 RNA와 "충분히 상보적"이어서, dsRNA 제제는 타겟 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 생성을 사일런싱시킨다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 타겟 mRNA와 같은 타겟 RNA와 "정확하게 상보적"이며, dsRNA 듀플렉스 제제는 어닐링되어, 예를 들어 정확한 상보성 영역에서 왓슨-크릭 염기쌍만으로 만들어진 하이브리드를 형성할 수 있다. "충분히 상보적인" 타겟 RNA는 타겟 RNA와 정확히 상보적인 내부 영역(예를 들어, 10개 이상의 뉴클레오타이드)을 포함할 수 있다. 더욱이, 일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 단일-뉴클레오타이드 차이를 특이적으로 구별한다. 이 경우, dsRNA 제제는, 정확한 상보성이(예를 들어, 7개의 뉴클레오타이드 내의) 영역에서 발견되는 경우 RNAi를 매개할 뿐이다.
본원에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 예를 들어, 100개, 200개, 300개, 또는 400개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 핵산 분자(RNA 또는 DNA)를 지칭한다.
용어 'BNA'는 가교 핵산을 나타내며, 종종 제약 또는 비접근성 RNA로 나타낸다. BNA는 "고정된" C3'-내부 당 주름(puckering)을 갖는 5-원, 6-원, 또는 심지어 7-원 가교 구조를 함유할 수 있다. 가교는 전형적으로 리보스의 2'-,4'-위치에 혼입되어 2',4'-BNA 뉴클레오타이드(예를 들어, LNA, 또는 ENA)를 산출한다. BNA 뉴클레오타이드의 예에는 다음 뉴클레오사이드가 포함된다:
용어 'LNA'는 잠긴 핵산을 나타내며, 종종 제약 또는 비접근성 RNA로 나타낸다. LNA는 변형 RNA 뉴클레오타이드이다. LNA 뉴클레오타이드의 리보스 모이어티는 추가 가교(예를 들어 메틸렌 가교 또는 에틸렌 가교)로 변형되어 2' 하이드록실을 동일한 리보스 당의 4' 탄소로 연결한다. 예를 들어, 가교는 3'-내부 노스(North) 입체형태에서 리보스를 "잠글" 수 있다:
용어 'ENA'는 에틸렌-가교 핵산을 나타내며, 종종 제약 또는 비접근성 RNA로 나타낸다.
본원에서 "분해 부위"는 iRNA 제제의 이용에 의한 RISC 기구에 의해 분해되는 센스 가닥 또는 타겟 유전자에서의 백본 결합을 의미한다. 그리고 타겟 분해 부위 영역은 분해 부위의 양측에서 1개 이상 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 센스 가닥에 있어서, 분해 부위는 센스 가닥 자체가 RNAi 기구에 의해 분해될 타겟인 경우, 분해될 센스 가닥 내의 백본 결합이다. 분해 부위는 당분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌[Soutschek et al., Nature (2004) 432, 173-178, 그 전체가 원용에 의해 포함됨]에 상세히 기재된 5'-RACE 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 당분야에서 널리 이해되는 바와 같이, 21개 뉴클레오타이드 길이 가닥을 2개 포함하는 원뿔형 이중-가닥 RNAi 제제에 대한 분해 부위 영역(가닥은 3'-말단에 2개-뉴클레오타이드의 단일-가닥 오버행을 갖는 19개 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성함)으로서, 분해 부위 영역은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 9번 내지 12번 위치에 대응한다.
용어 "할로"는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드의 임의의 라디칼을 지칭한다. 용어 "알킬"은, 지시된 수의 탄소 원자를 포함하며 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 포화 및 불포화된 비-방향족 탄화수소 사슬을 지칭하며(이들로는 프로필, 알릴, 또는 프로파길을 포함하나, 이로 한정되지 않음), 이는 선택적으로는 N, O, 또는 S가 삽입되어 있을 수 있다. 예를 들어, C1-C10은, 1개 내지 10개(종점 포함)의 탄소 원자를 가질 수 있는 기를 말한다. 용어 "알콕시"는 -O-알킬 라디칼을 지칭한다. 용어 "알킬렌"은 2가 알킬(즉, -R-)을 지칭한다. 용어 "알킬렌디옥소"는 -O-R-O- 구조의 2가 화학종을 지칭하며, 여기서 R은 알킬렌을 나타낸다. 용어 "아미노알킬"은 아미노로 치환된 알킬을 지칭한다. 용어 "머캅토"는 -SH 라디칼을 지칭한다. 용어 "티오알콕시"는 -S-알킬 라디칼을 지칭한다.
용어 "아릴"은 6-탄소 모노사이클릭 또는 10-탄소 바이사이클릭 방향족 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 각 고리의 0개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 원자는 치환기에 의해 치환될 수 있다. 아릴기의 예로는, 페닐, 나프틸 등을 포함한다. 용어 "아릴알킬" 또는 용어 "아르알킬"은 아릴로 치환된 알킬을 지칭한다. 용어 "아릴알콕시"는 아릴로 치환된 알콕시를 지칭한다.
본원에서, 용어 "사이클로알킬"은, 3개 내지 12개의 탄소, 예를 들어, 3개 내지 8개의 탄소, 및 예를 들어, 3개 내지 6개의 탄소를 포함하는 포화 및 부분적으로 불포화된 환형 탄화수소를 포함하며, 여기서 사이클로알킬기는 또한 선택적으로 치환될 수 있다. 사이클로알킬기로는, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
용어 "헤테로아릴"은, 모노사이클릭인 경우 1개 내지 3개의 헤테로원자, 바이사이클릭인 경우 1개 내지 6개의 헤테로원자, 또는 트리사이클릭인 경우 1개 내지 9개의 헤테로원자를 포함하는, 방향족 5-8원 모노사이클릭, 8-12원 바이사이클릭, 또는 11-14원 트리사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 상기 헤테로원자는 O, N, 또는 S(예를 들어, 각각 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트리사이클릭인 경우 N, O, 또는 S의 1개 내지 3개, 1개 내지 6개, 또는 1개 내지 9개의 헤테로원자 및 탄소 원자)로부터 선택되며, 각각의 고리 중 0개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 원자는 치환기로 치환될 수 있다. 헤테로아릴기의 예로는, 피리딜, 푸릴 또는 푸라닐, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미딜, 티오페닐, 또는 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 티아졸릴 등을 포함한다. 용어 "헤테로아릴알킬" 또는 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴로 치환된 알킬을 지칭한다. 용어 "헤테로아릴알콕시"는 헤테로아릴로 치환된 알콕시를 지칭한다.
용어 "헤테로사이클릴"은, 모노사이클릭인 경우 1개 내지 3개의 헤테로원자, 바이사이클릭인 경우 1개 내지 6개의 헤테로원자, 또는 트리사이클릭인 경우 1개 내지 9개의 헤테로원자를 포함하는, 비-방향족 5-8원 모노사이클릭, 8-12원 바이사이클릭, 또는 11-14원 트리사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 상기 헤테로원자는 O, N, 또는 S(예를 들어, 각각 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트리사이클릭인 경우 N, O, 또는 S의 1개 내지 3개, 1개 내지 6개, 또는 1개 내지 9개의 헤테로원자 및 탄소 원자)로부터 선택되며, 각각의 고리 중 0개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 원자는 치환기로 치환될 수 있다. 헤테로사이클릴기의 예로는, 트리졸릴, 테트라졸릴, 피페라지닐, 피롤리디닐, 디옥사닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐 등을 포함한다.
용어 "옥소"는 탄소에 부착된 경우 카르보닐을 형성하며, 질소에 부착된 경우 N-옥사이드를 형성하며, 황에 부착된 경우 설폭사이드 또는 설폰을 형성하는, 산소 원자를 지칭한다.
용어 "아실"은 알킬카르보닐, 사이클로알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 헤테로사이클릴카르보닐, 또는 헤테로아릴카르보닐 치환기를 지칭하며, 이들 중 임의의 것은 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있다.
용어 "치환된"은, 주어진 구조에서 하나 이상의 수소 라디칼을, 할로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클릴, 티올, 알킬티오, 아릴티오, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬설포닐, 알킬설포닐알킬, 아릴설포닐알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아르알콕시, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 할로알킬, 아미노, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬아미노알킬, 아릴아미노알킬, 아미노알킬아미노, 하이드록시, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노카르보닐알킬, 아실, 아르알콕시카르보닐, 카르복실산, 설폰산, 설포닐, 포스폰산, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 및 지방족을 포함하나, 이로 한정되지 않는 특정 치환기의 라디칼로 치환하는 것을 지칭한다. 치환기는 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
분해형 연결 기
분해형 연결 기는, 세포 외부에서는 충분히 안정하지만 타겟 세포 내로 들어가는 경우 분해되어, 링커가 함께 고정하고 있는 2개의 파트를 방출하는 기이다. 본 발명에 따른 dsRNA 제제의 바람직한 구현예에서, 분해형 연결 기는 피험자의 혈액보다는(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 또는 나타내도록 선택될 수 있는) 제1의 대조군 조건 하에서, 또는 (예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건들을 모방하거나 또는 나타내도록 선택될 수 있는) 제2의 대조군 조건 하에서, 타겟 세포에서 적어도 10배 이상, 바람직하게는 적어도 100배 이상 더 빠르게 분해된다.
분해형 연결 기는 분해 제제, 예를 들어, pH, 산화환원 퍼텐셜 또는 분해성 분자의 존재에 취약하다. 일반적으로, 분해 제제는 혈청 또는 혈액에서보다 세포 내에서 더욱 만연하거나 보다 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 이런 분해성 제제의 예로는, 환원에 의해 산화환원 분해형 연결 기를 분해할 수 있으며, 세포에 존재하는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 머캅탄과 같은 환원제를 비롯하여 특정 기질에 선택되거나 또는 기질 특이성을 가지지 않는 산화환원 제제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 만들 수 있는 제제, 예를 들어, pH가 5 이하로 되게 하는 제제; 일반 산으로서 작용함으로써 산 분해형 연결 기를 가수분해하거나 또는 분해할 수 있는 효소, (기질 특이성일 수 있는) 펩티다제, 및 포스파타제를 포함한다.
이황화 결합과 같은 분해형 연결 기는 pH에 취약할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4이며, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮아 약 7.1 내지 7.3의 범위이다. 엔도좀은 5.5 내지 6.0 범위의 보다 산성의 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 보다 더 산성인 pH를 가진다. 일부 링커들은 바람직한 pH에서 분해되는 분해형 연결 기를 가질 것이며, 이로써 세포 내에서 리간드로부터 또는 세포의 목적하는 구획으로 양이온성 지질을 방출할 것이다.
링커는 특정 효소에 의해 분해될 수 있는 분해형 연결 기를 포함할 수 있다. 링커에 혼입되는 분해형 연결 기의 유형은 타겟화되는 세포에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 간 타겟화 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간세포는 에스테라제가 풍부하므로, 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서보다 간세포에서 보다 효율적으로 분해될 것이다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형으로는, 폐세포, 신피질 세포, 및 고환 세포를 포함한다.
펩타이드 결합을 포함하는 링커는, 간세포 및 활막세포와 같이 펩티다제가 풍부한 세포를 타겟화하는 경우에 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보물질 분해형 연결 기의 적합성은 분해성 제제(또는 조건)가 후보물질 연결 기를 분해하는 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 혈액, 또는 기타 비-타겟 조직과 접촉한 경우의 분해에 대해 저항성을 나타내는 능력에 대해 후보물질 분해형 연결 기를 또한 시험하는 것도 바람직할 것이다. 따라서, 당업자는 제1 조건과 제2 조건 사이에서 분해에 대한 상대적인 취약성을 측정할 수 있으며, 제1 조건은 타겟 세포에서의 분해의 지표인 것으로 선택되며 제2 조건은 기타 조직 또는 혈액이나 혈청과 같은 생물학적 유체에서의 분해의 지표인 것으로 선택된다. 평가는 세포 무함유 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 세포-무함유 또는 배양 조건에서 초기 평가를 하고 전체 동물에서 추가로 평가하여 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보물질 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)과 비교해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 빠르게 분해된다.
산화환원 분해형 연결 기
분해형 연결 기의 일 클래스는 환원 또는 산화 시 분해되는 본 발명에 따른 dsRNA 제제에서 이용될 수 있는, 산화환원 분해형 연결 기이다. 환원에 의해 분해되는 연결 기의 일례는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 후보물질인 분해형 연결기가 적절한 "환원 분해형 연결기"이거나 또는 특정 iRNA 모이어티 및 특정 타겟화 제제와 사용하기에 적절한지 결정하기 위해, 당업자는 본원에서 기술된 방법을 고찰할 수 있다. 예를 들어, 후보물질은, 타겟 세포와 같은 세포에서 관찰되는 분해의 속도를 모방하는, 디티오트레이톨(DTT) 또는 당해 기술분야에 공지된 시약을 사용하는 기타 환원제와 함께 인큐베이션함으로써 평가될 수 있다. 후보물질은 또한, 혈액 또는 혈청 조건을 모방하는 조건 하에 평가될 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 후보물질 화합물은 혈액에서 10% 이하 분해된다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보물질 화합물은, 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)과 비교해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 2배, 4배, 10배 또는 100배 더 빠르게 분해된다. 후보물질 화합물의 분해 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 하에서 표준 효소 카이네틱스 분석법을 이용해 측정되며, 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교될 수 있다.
포스페이트-기재의 분해형 연결기
본 발명에 따른 dsRNA 제제에서 이용될 수 있는, 포스페이트-기재의 분해형 연결기는 포스페이트기를 분해하거나 또는 가수분해하는 제제에 의해 분해된다. 세포에서 포스페이트기를 분해하는 제제의 일례는, 세포에서 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트-기재의 연결 기의 예는, -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
산 분해형 연결 기
본 발명에 따른 dsRNA 제제에서 이용될 수 있는, 산 분해형 연결 기는 산성 조건 하에 분해되는 연결 기이다. 바람직한 구현예에서, 산 분해형 연결 기는, pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)인 산성 환경에서, 또는 일반 산(general acid)으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 분해된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같이 pH가 낮은 특정 세포소기관은 산 분해형 연결 기에 대해 분해 환경을 제공할 수 있다. 산 분해형 연결 기의 예로는, 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 산 분해 기는 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 구현예는, 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시기)가 아릴기, 치환된 알킬기, 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 3차 알킬기인 경우이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
에스테르-기재의 연결 기
본 발명에 따른 dsRNA 제제에서 이용될 수 있는, 에스테르-기재의 분해형 연결기는 세포 내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 분해된다. 에스테르-기재의 분해형 연결기의 예로는, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 에스테르 분해형 연결 기는 화학식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 가진다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
펩타이드-기재의 분해기
본 발명에 따른 dsRNA 제제에서 이용될 수 있는, 펩타이드-기재의 분해형 연결기는 세포 내 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 분해된다. 펩타이드-기재의 분해형 연결기는 아미노산들 사이에 형성되어 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 제공하는 펩타이드 결합이다. 펩타이드-기재의 분해 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알킨렌 간에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산들 간에 형성되어 펩타이드 및 단백질을 제공하는 아미드 결합의 특수한 유형이다. 펩타이드-기재의 분해 기는 일반적으로, 아미노산들 간에 형성되어 펩타이드 및 단백질을 제공하는 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 한정되며, 전체의 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드-기재의 분해형 연결기는 화학식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 가지며, 여기서, RA 및RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 기이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다. 본원에서, "탄수화물"은, 그 자체가 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 (선형, 분지형 또는 환형일 수 있는) 6개 이상의 탄소 원자를 가진 하나 이상의 단당류 단위로 이루어진 탄수화물인 화합물; 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 (선형, 분지형 또는 환형일 수 있는) 6개 이상의 탄소 원자를 가진 하나 이상의 단당류 단위로 이루어진 탄수화물 모이어티를 이의 일부로서 가지는 화합물이다. 대타겟인 탄수화물로는, 당(단당류, 이당류, 삼당류 및 약 4개 내지 9개의 단당류 단위를 포함하는 올리고당류), 및 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 다당류 검과 같은 다당류를 포함한다. 특정 단당류는 C5 이상의(바람직하게는 C5 내지 C8) 당을 포함하며; 이당류 및 삼당류는 단당류 단위(바람직하게는 C5 내지 C8)를 2개 또는 3개 포함한다.
본 발명은 추가로 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 본원에 정의된 dsRNA 제제의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 추가로 시험관내 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 dsRNA 제제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 용도를 위한 본원에 정의된 dsRNA 제제에 관한 것이다. 피험자는 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 예를 들어, 마우스, 래트, 양, 소, 개, 고양이, 또는 인간일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 완충액에서 투여된다.
일 구현예에서, 본원에서 기술되는 siRNA 화합물은 피험자에게 투여하기 위해 제형될 수 있다. 제형된 siRNA 조성물은 여러 가지 상태를 취할 수 있다. 일부 예들에서, 조성물은 적어도 부분적으로 결정질이거나, 균일하게 결정질이거나, 및/또는 무수(예를 들어, 80%, 50%, 30%, 20%, 또는 10% 미만이 물임)일 수 있다. 또 다른 예에서, siRNA는 수성상에 존재하는데, 예를 들어, 물을 포함하는 용액에 존재한다.
수성상 또는 결정질 조성물은, 예를 들어, 리포좀(특히, 수성상의 경우) 또는 입자(예를 들어, 마이크로입자가 결정질 조성물에 적절할 수 있음)와 같은 전달 비히클 내에 혼입될 수 있다. 일반적으로, siRNA 조성물은 본원에서 기술된 의도하는 투여 방법과 상용성인 방식으로 제형된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 조성물은 다음 방법들 중 하나 이상에 의해 제조된다: 분무 건조, 동결건조, 진공 건조, 증발, 유동상 건조, 또는 이들 기술들의 조합; 또는 지질을 이용한 소니케이션(sonication), 냉동-건조, 축합 및 기타 자가-조립(self-assembly).
siRNA 제제는 다른 제제, 예를 들어, 다른 치료 제제 또는 siRNA를 안정화시키는 제제, 예를 들어, siRNA와 복합체화되어 iRNP를 형성하는 단백질과 조합하여 제형될 수 있다. 보다 다른 제제로는, 킬레이트제, 예를 들어, EDTA(예를 들어, Mg2+와 같은 2가 양이온을 제거하기 위한 것), 염, RNAse 억제제(예를 들어, RNAsin과 같이 광범위한 특이성 RNAse 억제제) 등을 포함한다.
일 구현예에서, siRNA 제제로는, 제2 유전자 또는 동일한 유전자에 대해 RNAi를 매개할 수 있는 제2 siRNA와 같은 또 다른 siRNA 화합물을 포함한다. 보다 다른 제제는, 적어도 3, 5, 10, 20, 50 또는 100가지 이상의 서로 다른 siRNA 화학종을 포함할 수 있다. 이런 siRNA는 유사한 수의 서로 다른 유전자들에 대해 RNAi를 매개할 수 있다.
일 구현예에서, siRNA 제조는 적어도 제2 치료 제제(예를 들어, RNA 또는 DNA 이외의 제제)를 포함한다. 예를 들어, HIV와 같은 바이러스 질환의 치료를 위한 siRNA 조성물은 공지된 안티바이러스 제제(예를 들어, 프로테아제 억제제 또는 역전사효소 억제제)를 포함할 것이다. 또 다른 예에서, 암 치료용의 siRNA 조성물은 화학치료제를 추가로 포함할 것이다.
본 발명에 따른 dsRNA 제제의 투여를 위해 이용될 수 있는 예시적인 제형은 다음에 논의된다.
리포좀. 제형을 보다 쉽게 설명하기 위해, 본 섹션의 조성물 및 방법은 비변형된 siRNA 화합물과 관련하여 광범위하게 논의된다. 그러나, 이들 제형, 조성물 및 방법은 변형된 siRNA와 같이 기타 siRNA 화합물을 사용해 시행될 수 있으며, 이러한 시행은 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 수 있다. siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA) 제제는 리포좀 또는 미셀과 같은 막 분자 조립에서 전달을 위해 제형될 수 있다. 본원에서, 용어 "리포좀"은 하나 이상의 이중층, 예를 들어, 하나의 이중층 또는 복수의 이중층에 배열된 양친매성 지질로 구성된 비히클을 지칭한다. 리포좀은 친유성 물질 및 수성의 내부로부터 형성된 막을 가지는 단일막 및 다중막 비히클을 포함한다. 수성 부위는 siRNA 조성물을 포함한다. 친유성 물질은 수성 내부를, 전형적으로 siRNA 조성물을 포함하지 않는 수성 외부로부터 분리하지만, 일부 예들에서는 포함할 수 있다. 리포좀은 활성 성분들을 작용 부위에 수송 및 전달하는 데 유용하다. 리포좀 막이 생물학적 막과 구조상 유사하기 때문에, 리포좀이 조직에 적용되는 경우, 리포좀의 이중층은 세포막의 이중층과 융합된다. 리포좀 및 세포의 병합이 진행됨에 따라, siRNA를 포함하는 내부의 수성 내용물은 siRNA가 타겟 RNA에 특이적으로 결합하여 RNAi를 매개할 수 있는 세포 내로 전달된다. 일부 경우에, 리포좀은 또한, 예를 들어, siRNA를 특정 유형의 세포로 지시하기 위해, 특이적으로 타겟화된다.
siRNA를 포함하는 리포좀은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 일례에서, 리포좀의 지질 구성분은 세제에서 용해되어, 지질 구성분을 이용해 미셀이 형성된다. 예를 들어, 지질 구성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합일 수 있다. 세제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있으며 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제로는, 콜레이트(콜레이트), CHAPS, 옥틸글루코사이드, 데옥시콜레이트 및 라우릴 사코신(lauroyl sarcosine)을 포함한다. 그 후, siRNA 제제는 지질 구성분을 포함하는 미셀에 첨가된다. 지질 상의 양이온성 기는 siRNA와 상호작용하고 siRNA 부근에서 축합되어, 리포좀을 형성한다. 축합 후, 세제는 예를 들어, 투석에 의해 제거되어, siRNA의 리포좀 제제가 수득된다.
필요한 경우, 축합을 돕는 담체 화합물이 축합 반응 동안에, 예를 들어, 조절된 첨가에 의해, 첨가될 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산보다는 중합체일 수 있다(예를 들어, 스페르민(spermin) 또는 스페르미딘(spermidine)). pH 또한 축합에 바람직하도록 조정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드/양이온성 지질 복합체를 전달 비히클의 구조적 구성분으로서 혼입하는 안정한 폴리뉴클레오타이드 전달 비히클을 제조하는 방법에 관한 부가적인 설명은, 예를 들어, WO 96/37194에 기술되어 있다. 리포좀 형성은 또한, [Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; 미국 특허 제4,897,355호; 미국 특허 제5,171,678호; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; 및 Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984, 그 전체가 원용에 의해 포함됨}에 기술된 예시적인 방법들의 양태들을 하나 이상 포함한다. 전달 비히클로서 사용되기에 적절한 크기의 지질 응집물을 제조하기 위해 보편적으로 사용되는 기술들로는, 소니케이션 및 냉동-해동 + 압출을 포함한다(예를 들어, [Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986, 그 전체가 원용에 의해 포함됨] 참조). 미세유체화(microfluidization)는, 일정하게 작으며(50 nm 내지 200 nm) 상대적으로 균일한 응집물이 바람직한 경우, 사용될 수 있다(Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). 이들 방법은 siRNA 제제를 리포좀에 포장하는 데에 쉽게 채택된다.
pH-감수성이거나 또는 음으로 하전된 리포좀들은 이들과 복합체를 이루기보다는 핵산 분자를 포획한다. 핵산 분자와 지질은 둘 다 유사하게 하전되기 때문에, 복합체 형성보다는 반발이 발생한다. 그렇지만, 일부 핵산 분자들은 이들 리포좀의 수성 내부에 포획된다. pH-감수성 리포좀이 사용되어, 티미딘 키나제를 코딩하는 DNA를 배양액 중 세포의 단층에 전달한다. 외인성 유전자의 발현은 타겟 세포에서 검출되었다(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 19, (1992) 269-274, 그 전체가 원용에 의해 포함됨).
리포좀 조성물의 한 주요 유형은, 자연적으로 유래된 포스파티딜콜린 이외의 인지질을 포함한다. 중성 리포좀 조성물은 예를 들어, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되며, 음이온성 융합형성 리포좀들은 본질적으로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은 포스파티딜콜린(PC), 예를 들어, 대두 PC, 및 달걀 PC로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
시험관 내에서 리포좀을 세포에 도입하는 다른 방법의 예로는, 미국 특허 제 5,283,185호; 미국 특허 제5,171,678호; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; 및 Strauss EMBO J. 11:417, 1992를 포함한다.
일 구현예에서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포좀은 세포막에 융합할 수 있다는 이점을 가진다. 비-양이온성 리포좀은 원형질막과 효율적으로 융합할 수 없다고 하더라도, 생체 내에서 대식세포에 의해 취해져서 siRNA를 대식 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다.
리포좀의 다른 이점으로는, 천연 인지질로부터 수득되는 리포좀이 생체적합성이며 생분해성이라는 점; 리포좀이 광범위한 물 및 지질 가용성 약물에 혼입될 수 있다는 점; 리포좀이 캡슐화된 siRNA의 내부 구획들이 대사 및 분해되는 것으로부터 이 siRNA를 보호하는 점을 포함한다(Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). 리포좀 제형의 제조에서 중요하게 고려되어야 할 점은, 지질의 표면 전하, 비히클의 크기, 및 리포좀의 수성 부피이다.
양으로 하전된 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)는, 핵산과 자발적으로 상호작용하여 지질-핵산 복합체를 형성하는 소형 리포좀을 형성하는 데 사용될 수 있으며, 이는 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 하전된 지질과 융합하여 siRNA를 전달할 수 있다(OTMA 및 DNA와 함께 이의 용도에 관한 설명에 대해서는 예를 들어, Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 및 미국 특허 제4,897,355호 참조, 그 전체가 원용에 의해 포함됨).
DOTMA 유사체, 1,2-비스(올레일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판(DOTAP)은 인지질과 함께 사용되어 DNA-복합체화 비히클을 형성할 수 있다. Lipofectin™(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)은, 음으로 하전된 폴리뉴클레오타이드와 자발적으로 상호작용하여 복합체를 형성하는 양으로 하전된 DOTMA 리포좀을 포함하는, 살아 있는 조직 배양 세포에 매우 음이온성인 핵산을 전달하는데 효과적인 제제이다. 양으로 하전된 리포좀이 충분하게 사용되는 경우, 생성되는 복합체 상의 순전하 또한 양성이다. 이런 방식으로 제조된 양으로 하전된 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 자발적으로 부착하고, 원형질막과 융합하고, 기능성 핵산을 예를 들어, 조직 배양 세포에 효율적으로 전달한다. 또 다른 시판중인 양이온성 지질인 1,2-비스(올레일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판("DOTAP")(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)은, 올레일 모이어티가 에테르 결합보다는 에스테르에 의해 결합되어 있는 DOTMA와 상이하다.
기타 보고된 양이온성 지질 화합물은, 예를 들어, 2가지 유형의 지질들 중 하나에 접합된 카르복시스페르민을 비롯하여 다양한 모이어티에 접합된 것들을 포함하며, 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레일아미드("DOGS")(Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드("DPPES")(예를 들어, 미국 특허 제5,171,678호 참조)와 같은 화합물을 포함한다.
또 다른 양이온성 지질 접합으로는, DOPE와 조합하여 리포좀으로 제형된 콜레스테롤을 이용한 지질의 유도체화("DC-Chol")를 포함한다(Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991 참조). 폴리리신을 DOPE에 접합시킴으로써 제조된 리포폴리리신은 혈청의 존재 하에서의 형질감염에 효과적인 것으로 보고된 바 있다(Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). 소정의 세포주에 있어서, 접합된 양이온성 지질을 포함하는 이들 리포좀은 DOTMA-함유 조성물보다 더 낮은 독성을 나타내며 보다 효율적인 형질감염을 제공하는 것으로 기술된다. 기타 시판중인 양이온성 지질 산물들은 DMRIE 및 DMRIE-HP(Vical, La Jolla, California) 및 리포펙타민(DOSPA)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적절한 기타 양이온성 지질은 WO 98/39359 및 WO 96/37194에 기술되어 있다.
리포좀 제형은 특히, 국소 투여에 적절하며, 리포좀은 다른 제형들을 능가하는 이점들을 몇몇 제시한다. 이런 이점들로는, 투여 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용의 감소, 목적하는 타겟에서의 투여 약물의 축적 증가, 및 siRNA를 피부에 투여하는 능력을 포함한다. 일부 시행들에서, 리포좀은 siRNA를 상피 세포에 전달하는데 사용되며, 또한 피부와 같은 진피 조직에의 siRNA의 침투를 증대시키기 위해서도 사용된다. 예를 들어, 리포좀은 국소 적용될 수 있다. 리포좀으로서 제형된 약물의 피부에의 국소 전달이 보고된 바 있다(예를 들어, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 및 du Plessis et al., Antivirus Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987 참조, 그 전체가 원용에 의해 포함됨).
비-이온성 리포좀 시스템은 또한, 비-이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 특정 시스템에서, 약물을 피부에 전달하는 유용성을 측정하기 위해 시험되었다. 노바좀(Novasome) I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 노바좀 II(글리세릴 디스테아레이트/ 콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비-이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 진피에 약물을 전달하는 데 사용되었다. siRNA를 포함하는 이런 제형은 피부학적 장애를 치료하는 데 유용하다.
siRNA를 포함하는 리포좀은 매우 변형적으로 제조될 수 있다. 이런 변형성(deformability)은 리포좀이, 리포좀의 평균 반경보다 작은 기공을 통해 침투될 수 있게 한다. 예를 들어, 트랜스페로좀(transferosome)은 변형성 리포좀의 일 유형이다. 트랜스페로좀은 표면 에지(surface edge) 활성화제, 통상 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. siRNA를 포함하는 트랜스페로좀은 예를 들어, 감염에 의해 피하로 전달되어, 피부의 케라티노사이트에 siRNA를 전달할 수 있다. 온전한 포유류의 피부를 가로지르기 위해서, 지질 비히클은, 적절한 경피 구배의 영향 하에, 각각의 직경이 50 nm 미만인 일련의 미세한 기공을 통과해야 한다. 또한, 지질 특성으로 인해, 이들 트랜스페로좀은, (기공, 예를 들어, 피부의 기공 모양에 맞도록) 자가-최적화, 자가-복구형일 수 있으며, 종종 분절 없이 이들의 타겟에 도달할 수 있으며, 종종 자가-로딩될 수 있다.
본 발명에 따라 처리될 수 있는 기타 제형은 2008년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제61/018,616호; 2008년 1월 2일에 출원된 제61/018,611호; 2008년 3월 26일에 출원된 제61/039,748호; 2008년 4월 22일에 출원된 제61/047,087호 및 2008년 5월 8일에 출원된 제61/051,528호에 기술되어 있다. 2007년 10월 3일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2007/080331 또한, 본 발명에 따라 처리될 수 있는 제형을 기술하고 있다.
계면활성제. 설명을 쉽게 하기 위해, 본 섹션에서 제형, 조성물 및 방법은 비변형된 siRNA 화합물과 관련하여 광범위하게 논의된다. 그러나, 이들 미셀 및 기타 제형, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 변형된 siRNA 화합물과 함께 시행될 수 있으며, 이런 시행은 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 수 있다. 계면활성제는 (마이크로에멀젼을 포함한) 에멀젼 및 리포좀(상기 참조)과 같은 제형에서 광범위하게 적용된다. siRNA(또는 전구체, 예를 들어, siRNA 화합물로 가공될 수 있는 거대 dsiRNA 화합물, 또는 siRNA 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA) 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, siRNA는 계면활성제를 포함하는 에멀젼으로서 제형된다. 다수의 서로 다른 유형의 계면활성제(천연 및 합성 포함)의 특성들을 분류하고 등급화하는 가장 보편적인 방법은 친수성/친유성 균형(HLB)을 이용하는 것이다. 친수성 기의 특성은 제형에서 사용되는 서로 다른 계면활성제를 범주화하는 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않는 경우, 비이온성 계면활성제로서 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약학적 산물에서 광범위하게 적용되며 넓은 pH 값에서 이용가능하다. 일반적으로 이들의 HLB 값의 범위는 이들의 구조에 따라 2 내지 약 18이다. 비이온성 계면활성제로는, 비이온성 에스테르, 예컨대 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르, 및 에톡실화된 에스테르를 포함한다. 비이온성 알카놀아미드 및 에테르, 예컨대 지방산 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화된 알코올, 및 에톡실화된/프로폭실화된 블록 중합체들도 이 클래스에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 클래스에서 가장 인기있는 구성원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산된 경우 음전하를 가지는 경우, 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제로는, 카르복실레이트, 예컨대 소프(soap), 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트와 같은 황산의 에스테르, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트와 같은 설포네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 클래스에서 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 소프이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산된 경우 양전하를 가지는 경우, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제로는, 4차 암모늄염 및 에톡실화된 아민을 포함한다. 4차 암모늄염은 이 클래스에서 가장 자주 사용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 가지는 능력을 가진 경우, 계면활성제는 양친매성으로 분류된다. 양친매성 계면활성제로는, 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
약품, 제형 및 에멀젼에서의 계면활성제의 사용은 검토된 바 있다(Rieger, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
미셀 및 기타 막성(membranous) 제형. 설명을 쉽게 하기 위해 본 섹션에서 미셀 및 기타 제형, 조성물 및 방법은 비변형된 siRNA 화합물과 관련하여 광범위하게 논의된다. 그러나, 이들 미셀 및 기타 제형, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 변형된 siRNA 화합물과 함께 시행될 수 있으며, 이런 시행은 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 수 있다. 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 가공될 수 있는 거대 siRNA 화합물, 또는 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체와 같은 siRNA 화합물을 코딩하는 DNA) 제제와 같은 siRNA 화합물은 미셀형 제형으로서 제공될 수 있다. 본원에서, "미셀"은, 분자의 소수성 부분이 모두 안으로 향해 있어서 친수성 부분은 주변의 수성상과 접촉한 상태로 있는 양친매성 분자가 구형 구조로 배열되어 있는 분자 조립의 특정 유형으로서 정의된다. 환경이 소수성인 경우, 반대의 배열이 존재한다.
경피막을 통해 전달하는 데 적절한 혼합형 미셀 제형은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 설페이트, 및 미셀 형성 화합물의 수용액을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예시적인 미셀 형성 화합물은, 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약학적으로 허용가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보라지 오일(borage oil), 달맞이꽃유, 멘톨, 트리하이드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 리신, 폴리리신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이의 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 이의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 미셀 형성 화합물은 알칼리 금속 알킬 설페이트의 첨가와 동시에 또는 이후에 첨가될 수 있다. 혼합형 미셀은 격렬한 혼합을 제외하고 임의의 유형의 혼합을 이용해 실질적으로 형성되어 보다 작은 크기의 미셀을 제공할 것이다.
일 방법에서, 제1 미셀 조성물은 siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 포함하도록 제조된다. 그 후, 제1 미셀 조성물은 3가지 이상의 미셀 형성 화합물과 혼합하여, 혼합형 미셀 조성물을 형성한다. 또 다른 방법에서, 미셀 조성물은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 하나 이상의 미셀 형성 화합물을 혼합하고, 잔여 미셀 형성 화합물을 첨가하고 격렬히 교반함으로써 제조된다.
페놀 및/또는 m-크레졸은 혼합형 미셀 조성물에 첨가되어, 제형을 안정화시키고 박테리아 생장에 대해 보호할 수 있다. 다르게는, 페놀 및/또는 m-크레졸은 미셀 형성 성분들과 함께 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장성 제제는 또한, 혼합형 미셀 조성물의 형성 후에 첨가될 수도 있다.
미셀 제형을 스프레이로서 전달하기 위해, 제형은 에어로졸 디스펜서에 투입될 수 있으며, 디스펜서는 압축가스(propellant)로 충전된다. 압력 하의 압축가스는 디스펜서에서 액체 형태로 존재한다. 성분들의 비율은 수성상 및 압축가스 상이 하나로 되도록, 즉, 하나의 상이 존재하도록 조정된다. 2개의 상이 존재하는 경우, 디스펜서를 흔든 후에 내용물의 일부를 예를 들어, 계량 밸브(metered valve)를 통해 분배할 필요가 있다. 분배된 투약량의 약학적 제제는 미세 스프레이에서 계량 밸브로부터 추진된다.
압축가스는 수소-함유 클로로플루오로카본, 수소-함유 플루오로카본, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, HFA 134a(1,1,1,2 테트라플루오로에탄)가 사용될 수 있다.
필수 성분들의 특정 농도는 상대적으로 간단한 실험으로 측정될 수 있다. 구강을 통한 흡수를 위해, 위장관을 통한 투여 또는 주사를 통한 투약량을 예를 들어, 2배 또는 3배 이상 높이는 것이 종종 바람직하다.
입자. 쉽게 설명하기 위해 본 섹션에서 입자, 제형, 조성물 및 방법은 변형된 siRNA 화합물과 관련하여 광범위하게 논의된다. 그러나, 이들 입자, 제형, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형된 siRNA 화합물과 함께 시행될 수 있으며, 이런 시행은 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 가공될 수 있는 거대 siRNA 화합물, 또는 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체와 같은 siRNA 화합물을 코딩하는 DNA) 제제와 같은 siRNA 화합물은 마이크로입자와 같은 입자에 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무-건조에 의해 생성될 수 있지만, 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조, 또는 이들 기술의 조합을 비롯한 기타 방법들에 의해 생성될 수도 있다.
약학적 조성물
본 발명의 iRNA 제제는 약학적 용도를 위해 제형될 수 있다. 본 발명은 추가로 본원에 정의된 dsRNA 제제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 약학적으로 허용가능한 조성물은 전술한 구현예들 중 임의의 구현예의 dsRNA 제제 중 하나 이상을 치료적 유효량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(첨가제), 부형제 및/또는 희석제와 함께 제형되어 포함한다.
약학적 조성물은 다음의 투여에 맞도록 조정된 것들을 비롯하여, 고체 또는 액체 형태로 투여용으로 특수하게 제형될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(drench)(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어, 협측, 설하, 및 전신 흡수를 타겟으로 하는 것들, 볼루스(bolus), 분말, 과립, 혀 적용용 페이스트(paste); (2) 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 서방성 제형으로서의 비경구 투여; (3) 국소 적용, 예를 들어, 크림, 연고, 또는 조절-방출형 패치 또는 피부에 적용되는 스프레이로서의 국소 적용; (4) 질내 또는 직장내 투여, 예를 들어, 페서리(pessary), 크림 또는 폼(foam)으로서의 투여; (5) 설하 투여; (6) 안내 투여; (7) 경피 투여; 또는 (8) 비내 투여. 피하 또는 정맥내 방법에 의한 전달이 특히 유익할 수 있다.
본원에서, 문구 "치료적 유효량"은, 의학적 치료에 적용될 수 있는 이상적인 이익 대 위험 비율(benefit/risk ratio)에서 동물의 하위 세포군(sub-population of cells)에서 바람직한 치료 효과를 어느 정도 유도하는데 효과적인, 본 발명의 화합물, 물질, 또는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 의미한다.
문구 "약학적으로 허용가능한"은, 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서, 이상적인 이익 대 위험 비율에 비례하며, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제점 또는 합병증을 유발하지 않으면서 인간 및 동물의 조직과 접촉해서 사용되기에 적절한, 이들 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭하는 것으로 본원에서 적용된다.
본원에서, 문구 "약학적으로 허용가능한 담체"는, 대상 화합물을 신체의 한 기관 또는 부위에서 신체의 다른 기관 또는 부위로 옮기거나 또는 이동시키는데 관여하는, 액체 또는 고체 충전재, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘, 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분들과 융화성이며 환자에게 상해를 입히지 않는 점에서 "허용가능해야" 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질들의 일부 예로는, (1) 락토스, 포도당 및 수크로스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 마그네슘 스테이트(state), 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 세삼오일(sesame oil), 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 피로젠-프리(pyrogen-free) 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 다가무수물; (22) 폴리펩타이드 및 아미노산과 같은 벌킹 제제(bulking agent); (23) 혈청 알부민, HDL 및 LDL과 같은 혈청 구성분; 및 (22) 약학적 제형에 사용되는 기타 비-독성의 융화성 성분들을 포함한다.
제형은 통상적으로, 단위 투약 형태로 존재할 수 있으며, 약학 분야에 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일 투약 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료를 받는 숙주, 특정 투여 방식에 따라 다를 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투약 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 화합물이 치료 효과를 유발하는 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 활성 성분 약 0.1% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 30% 범위일 것이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 제형은 사이클로덱스트린, 셀룰로스, 리포좀, 미셀 형성제, 예를 들어, 담즙산, 및 중합체성 담체, 예를 들어, 폴리에스테르 및 다가무수물로 구성된 군으로부터 선택되는 부형제; 및 본 발명의 화합물을 포함한다. 소정의 구현예에서, 전술한 제형은 본 발명의 화합물을 경구로 생체활용성이게 만든다.
iRNA 제제의 제조는 또 다른 제제, 예를 들어, 또 다른 치료제 또는 iRNA를 안정화시키는 제제, 예를 들어, iRNA와 복합체를 이루어 iRNP를 형성하는 단백질과 함께 제형될 수 있다. 보다 다른 제제로는, 킬레이트제, 예를 들어, EDTA(예를 들어, Mg2+와 같은 2가 양이온을 제거하기 위한 것), 염, RNAse 억제제(예를 들어, RNAsin과 같은 광범위한 특이성 RNAse 억제제) 등을 포함한다.
이들 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은, 본 발명의 화합물을 담체, 및 선택적으로는 하나 이상의 부가(accessory) 성분들과 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본 발명의 화합물을 액체 담체, 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하고 친밀하게 혼합한 다음, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써, 제조된다.
일부 경우, 약물의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터의 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는, 수용성이 불량한 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 그런 다음, 약물의 흡수율은 이의 용해 속도에 따라 다른데, 즉, 결정의 크기 및 결정질 형태에 따라 다를 수 있다. 다르게는, 비경구로 투여된 약물 형태의 흡수 지연은 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 또는 현탁함으로써 달성된다.
본 발명에 따른 화합물은 기타 약제학과 유추하여, 인간 또는 척추동물용 의약으로서 사용하기에 편리한 방식으로 투여하도록 제형될 수 있다.
용어 "치료"는 예방, 치료 및 치유를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 이런 치료를 받는 환자는 치료가 필요한 임의의 동물로서, 일반적으로 영장류, 특히 인간, 및 말, 소, 돼지 및 양과 같은 기타 포유류; 및 가금류 및 애완 동물을 포함한다.
이중-가닥 RNAi 제제는 생체 내에서 예를 들어, 세포에 전달되는 외인성 DNA 주형으로부터 생성된다. 예를 들어, DNA 주형은 벡터에 삽입되어 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여(미국 특허 제 5,328,470, 그 전체가 원용에 의해 포함됨), 또는 정위고정성 주사(stereotactic injection)에 의해 피험자에게 전달될 수 있다(예를 들어, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 참조, 그 전체가 원용에 의해 포함됨). 유전자 치료 벡터의 약학적 제제는 허용가능한 희석제에 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 내포된(imbedded) 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 주형은, dsRNA 제제의 상부 가닥을 포함하는 전사체를 생성하는 하나와 dsRNA 제제의 하부 가닥을 포함하는 전사체를 생성하는 하나인, 2개의 전사 단위를 포함할 수 있다. 주형이 전사되는 경우, dsRNA 제제가 생성되어, 유전자 사일런싱을 매개하는 siRNA 제제 분절로 가공된다.
전달 경로
본원에 정의된 dsRNA 제제 또는 본원에 정의된 dsRNA 제제를 포함하는 약학적 조성물은 다양한 전달 경로를 이용하여 피험자에게 투여될 수 있다. iRNA를 포함하는 조성물은 다양한 경로로 피험자에게 전달될 수 있다. 예시적인 경로로는, 정맥내, 피하, 국소, 직장, 항문, 질, 코, 폐, 눈을 포함한다.
본 발명의 iRNA 분자 및/또는 dsRNA 제제는 투여에 적절한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이런 조성물은 전형적으로, siRNA 화학종 하나 이상 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는, 약학적 투여와 융화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 성분에 대한 이런 매질 및 제제의 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비융화성인 점을 제외하고는, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물이 또한 이 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부, 및 치료 영역에 따라, 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 (안내, 질, 직장, 비내, 경피를 비롯하여) 국소 투여, 경구 투여 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여로는, 정맥내 드립(drip), 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
투여 경로 및 부위는 타겟화를 증대시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 타겟으로 하기 위해서는, 목적하는 근육으로 근육내 주사하는 것이 타당한 선택일 것이다. 폐세포는 iRNA를 에어로졸 형태로 투여함으로써 타겟화될 것이다. 혈관 내피 세포는 벌룬 카테터(balloon catheter)를 iRNA로 코팅하고 DNA를 기계적으로 도입함으로써 타겟화될 수 있다.
투약량
일 양태에서, 본 발명은 siRNA 제제와 같은 dsRNA 제제를 피험자(예를 들어, 인간 피험자)에게 투여하는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 용도에 대해 본원에 정의된 dsRNA 제제에 관한 것이다. 방법 또는 의학적 용도는 (a) 이중-가닥 부분이 14개 내지 40개 뉴클레오타이드(nt) 길이, 예를 들어 21개 내지 23개 nt이고, (b) 타겟 RNA(예를 들어, 내인성 또는 병원체 타겟 RNA)와 상보적이고, 선택적으로 (c) 1개 내지 5개 뉴클레오타이드 길이의 3' 오버행을 1개 이상 포함하는 dsRNA 제제, 예를 들어 siRNA 제제, 예를 들어 이중 가닥 siRNA 제제의 단위 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 단위 용량은 10 mg/kg 체중 미만, 또는 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 또는 0.00001 mg/kg 체중 미만, 및 200 nmole RNA 제제(예를 들어, 약 4.4 x 1016 카피)/kg 체중 미만, 또는 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015 nmole RNA 제제/kg 체중 미만이다.
정해진 양은 질환 또는 장애, 예를 들어, 타겟 RNA와 관련 있는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양일 수 있다. 예를 들어, 단위 투약량은 주사(예를 들어, 정맥내, 피하 또는 근육내), 흡입 투여, 또는 국소 적용에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투약량은 체중 kg 당 10 mg, 5 mg, 2 mg, 1 mg, 또는 0.1 mg 미만일 수 있다.
일부 구현예에서, 단위 투약량은 1일 1회 미만의 빈도로, 예를 들어, 2일, 4일, 8일 또는 30일마다 1회 미만의 빈도로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 단위 투약량은 임의의 빈도로 투여되지 않는다(예를 들어, 규칙적인 빈도로 투여되지 않음). 예를 들어, 단위 투약량은 1회 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 효과적인 투약량은 다른 전형적인 치료제(therapeutic modality)와 함께 투여된다. 일 구현예에서, 피험자는 바이러스에 감염되어 있으며, 치료제는 dsRNA 제제, 예를 들어 siRNA 제제 이외의 안티바이러스 제제이다. 또 다른 구현예에서, 피험자가 아테롬성 동맥경화증을 앓고 있으며 효과적인 투약량의 siRNA 제제와 같은 dsRNA 제제는 예를 들어, 혈관형성술과 같은 수술적 개입 후와 함께 투여된다.
일 구현예에서, 대상은 siRNA 제제와 같은 dsRNA 제제(예를 들어, 전구체, 예를 들어, siRNA 제제로 공정될 수 있는 거대 dsRNA 제제, 또는 siRNA 제제와 같은 dsRNA 제제를 코딩하는 DNA, 또는 이의 전구체)를 초기 투약량 및 하나 이상의 유지 투약량으로 투여받는다. 유지 투약량 또는 투약량은 초기 투약량과 동일하거나 또는 이보다 적을 수 있으며, 예를 들어, 초기 투약량의 1/2 미만일 수 있다. 유지 양생법은, 피험자를 하루에 체중 kg 당 0.01 ㎍ 내지 15 mg/kg 범위, 예를 들어, 하루에 체중 kg 당 10 mg, 1 mg, 0.1 mg, 0.01 mg, 0.001 mg, 또는 0.00001 mg의 투약량 또는 투약량들로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 유지 투약량은, 예를 들어, 2일, 5일, 10일, 또는 30일마다 1회 이하로 투여된다. 또한, 치료 양생법은, 특정 질환의 특성, 이의 중증도 및 환자의 전반적인 병태에 따라 상이한 기간 동안 지속될 수 있다. 소정의 구현예에서, 투약량은 1일 1회 이하, 예를 들어, 24시간, 36시간, 48시간 이상마다 1회 이하, 예를 들어, 5일 또는 8일마다 1회 이하로 전달될 수 있다. 치료 후, 환자의 상태 변화 및 질환 병태의 증상의 완화에 대해 환자를 모니터할 수 있다. 환자가 현재의 투약량 수준에 대해 유의하게 반응하지 않는 경우 화합물의 투약량은 증가될 수 있으며, 또는 질환 병태의 증상들의 완화가 관찰되거나, 질환 병태가 없어진 경우, 또는 원치않는 부작용이 관찰되는 경우에 투약량은 감소될 수 있다.
효과적인 투약량은, 특정 조건 하에 바람직하거나 또는 적절한 것으로 사료되는 경우, 단일 투약량 또는 2회 이상의 투약량으로 투여될 수 있다. 반복 투입 또는 빈번한 투입의 촉진이 요구되는 경우, 펌프, 반투과성(semi-permanent) 스텐트(예를 들어, 정맥내, 복강내, 수조내(intracisternal) 또는 캡슐내(intracapsular)), 또는 레저보어(reservoir)와 같은 전달 장치의 이식이 권고될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 dsRNA 제제 화학종을 다수 포함한다. 또 다른 구현예에서, dsRNA 제제 화학종은 자연적으로 존재하는 타겟 서열에 대해 또 다른 화학종과 비-오버랩핑되고 비-인접한 서열을 가진다. 또 다른 구현예에서, 복수의 dsRNA 제제 화학종은 서로 다른 자연적으로 존재하는 타겟 유전자에 대해 특이적이다. 또 다른 구현예에서, dsRNA 제제는 대립유전자(allele) 특이적이다.
본원에서 기술된 본 발명의 dsRNA 제제는 포유류, 특히 인간이 아닌 영장류 또는 인간과 같은 거대 포유류에 다수의 방식으로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, siRNA 제제와 같은 dsRNA 제제, 조성물의 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내(예를 들어, 볼루스 또는 분산형 투입), 피내, 복강내, 근육내, 척추강내, 뇌실내(intraventricular), 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경적, 직장, 경구, 질, 국소, 폐, 비내, 요도 또는 안내 투여일 수 있다. 투여는 피험자 또는 의료인과 같은 다른 사람에 의해 수행될 수 있다. 약제는 측정된 투약량, 또는 계량된 투약량을 전달하는 디스펜서(dispenser)로 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 다음에 보다 상세히 기술된다.
본 발명은 본원에서 기술된 dsRNA 제제의 직장 투여 또는 전달을 위한, 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상술된 방법에서 이용하기 위한 본 발명의 dsRNA 제제에 관한 것이다.
타겟 유전자의 발현 억제 방법
본 발명의 구현예는 또한 타겟 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다. 방법은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 충분한 양으로, 임의의 전술 구현예에서 dsRNA 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 추가로 타겟 세포에서 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 본원에 정의된 dsRNA 제제의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 추가로 시험관내 타겟 세포에서 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 dsRNA 제제의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 dsRNA 제제를 세포에 제공하는 단계를 포함하는, 상기 세포에서 타겟 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 타겟 유전자는 인자 VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 헵시덴(hepcidin), 활성화된 단백질 C, 사이클린 D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서바이빈(survivin) 유전자, Her2/Neu 유전자, 토포아이소머라제 I 유전자, 토포아이소머라제 II 알파 유전자에서의 돌연변이, p73 유전자에서의 돌연변이, p21(WAF1/CIP1) 유전자에서의 돌연변이, p27(KIP1) 유전자에서의 돌연변이, PPM1D 유전자에서의 돌연변이, RAS 유전자에서의 돌연변이, 카베올린(caveolin) I 유전자에서의 돌연변이, MIB I 유전자에서의 돌연변이, MTAI 유전자에서의 돌연변이, M68 유전자, 종양 억제자 유전자에서의 돌연변이, 및 p53 종양 억제자 유전자에서의 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상술된 방법에서의 용도를 위한 본 발명의 dsRNA 제제에 관한 것이다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 출원 전체에서 언급되는 모든 참조문헌, 계류중인 특허 출원 및 공개 특허의 내용들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1. siRNA 듀플렉스의 시험관 내 스크리닝
세포 배양 및 형질감염:
인간 Hep3B 세포 또는 래트 H.II.4.E 세포(ATCC, Manassas, VA)를 37℃, 5% CO2에서, 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 보충된 RPMI(ATCC)에서 거의 꽉 차게(confluence) 배양한 다음, 트립신으로 처리하여 플레이트에서 떼어내었다. 형질감염은, 웰 당 Opti-MEM 14.8 ㎕ + 리포펙타민 RNAiMax 0.2㎕(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를, 96-웰 플레이트의 웰 당 siRNA 듀플렉스 5 ㎕에 첨가하고, 실온에서 15분간 인큐베이션함으로써 수행하였다. 그 후, Hep3B 세포를 약 2 x 104개로 포함하는, 무-항생제 완전 성장 배지 80 ㎕를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포는 24시간 또는 120시간 동안 인큐베이션한 다음, RNA 정제하였다. 단일 용량 실험은 10 nM 및 0.1 nM의 최종 듀플렉스 농도에서 수행하고, 용량 반응 실험은 10 nM의 최종 듀플렉스 농도의 최대 용량을 8,4배 단계 희석하여 수행하였다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트를 사용한 총 RNA 분리(Invitrogen, part #: 610-12):
세포를 파쇄/결합 완충액 150 ㎕에서 수집 및 파쇄한 다음, Eppendorf Thermomixer를 사용해 850 rpm에서 5분간 혼합하였다(혼합 속도는 공정 전기간 동안 동일하였음). 자기 비드 10 ㎕ 및 파쇄/결합 완충액 혼합물 80 ㎕를 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고 1분간 혼합하였다. 자기 비드를 자기 스탠드를 사용해 포착하고, 비드를 건드리지 않고서 상층액을 제거하였다. 상층액 제거 후, 파쇄된 세포를 잔여 비드에 첨가하고, 5분간 혼합하였다. 상층액 제거 후, 자기 비드를 150 ㎕ 세정 완충액 A로 2회 세정하고 1분간 혼합하였다. 비드를 다시 포착하고, 상층액을 제거하였다. 그 후, 비드를 150 ㎕ 세정 완충액 B로 세정하고, 포착하고, 상층액을 제거하였다. 그런 다음, 비드를 150 ㎕ 용출 완충액으로 다시 세정하고, 포착하고, 상층액을 제거하였다. 비드가 건조되도록 2분간 방치하였다. 건조 후, 용출 완충액 50 ㎕를 첨가하고, 70℃에서 5분간 혼합하였다. 비드를 자석에서 5분간 포착하였다. 상층액 40 ㎕를 제거하고, 또 다른 96웰 플레이트에 첨가하였다.
ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystem, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성:
반응 당 1 ㎕ 10X 완충액, 0.4 ㎕ 25X dNTPs, 1 ㎕ 랜덤 프라이머, 0.5 ㎕ 역전사효소, 0.5 ㎕ RNAse 억제제 및 1.6 ㎕ H2O의 마스터 믹스(master mix)를 5 ㎕의 총 RNA에 첨가하였다. Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 유전자 증폭기(thermal cycler)(Hercules, CA)를 25℃ 10 min, 37℃ 120 min, 85℃ 5 sec, 4℃ 유지로 이루어진 단계들을 통해 사용함으로써 cDNA를 생성하였다.
실시간 PCR:
384웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)의 웰 당 0.5 ㎕ GAPDH TaqMan 프로브(Applied Biosystem Cat #4326317E (인간) Cat # 4308313 (설치류)), 0.5 ㎕ ANGPTL TaqMan 프로브(Applied Biosystem cat # HS00174914 _m1 (인간) cat # Rn00562124_m1 (래트)) 및 5 ㎕ Lightcycler 480 프로브 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 포함하는 마스터 믹스에 cDNA 2 ㎕를 첨가하였다. 실시간 PCR은 Roche LC 480 실시간 PCR 장비(Roche)에서 수행하였다. 다르게 주지하지 않는 한, 각각의 듀플렉스는 2개 이상의 독립적인 형질감염에서 시험하였으며, 각각의 형질감염은 이중으로 분석하였다.
상대 배수 변화(relative fold change)를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 △△Ct 방법으로 분석하고, 10 nM AD-1955로 형질감염된 세포, 또는 mock 형질감염된 세포로 수행한 분석법에 대해 정상화(normalization)하였다. IC50은 XLFit를 이용해 4개의 파라미터 피트 모델을 사용해 계산하고, 동일한 용량 범위 또는 이 자체의 최저 용량에서 AD-1955로 형질감염된 세포 또는 네이브(naive) 세포에 대해 정상화하였다. IC50은 각각의 개별 형질감염뿐만 아니라 조합의 경우에 대해서도 계산하였으며, 단일 IC50은 형질감염 두 경우 모두의 데이터에 맞게 조정하였다.
본 발명의 다양한 모티프 변형이 발생한 예시 siRNA 듀플렉스의 유전자 사일런싱 결과는 다음 표에 제시한다.
실시예 2. RNA 합성 및 듀플렉스 어닐링
1. 올리고뉴클레오타이드 합성:
모든 올리고뉴클레오타이드들은 AKTA올리고pilot 합성장치 또는 ABI 394 합성장치에서 합성하였다. 다르게 명시되지 않는 한, 시판중인 제어 기공 유리 고체 기판(dT-CPG, 500Å, Prime Synthesis) 및 RNA 포스포라미다이트를 표준 보호기, 5'O-디메톡시트리틸 N6-벤조일-2'-t-부틸디메틸실릴-아데노신-3'O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트, 5'O-디메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-t-부틸디메틸실릴-시티딘-3'O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트, 5'O-디메톡시트리틸-N2--이소부트릴-2'-t-부틸디메틸실릴-구아노신-3'O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트, 및 5'O-디메톡시트리틸-2'-t-부틸디메틸실릴-우리딘-3'O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트(Pierce Nucleic Acids Technologies)와 함께 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용하였다. 2'-F 포스포라미다이트, 5'O-디메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-플루오로-시티딘-3'O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸-포스포라미다이트 및 5'O-디메톡시트리틸-2'-플루오로-우리딘-3'O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸-포스포라미다이트를 구입하였다(Promega). 모든 포스포라미다이트는, 10% THF/ANC(v/v)에서 0.2 M 농도로 사용한 아세토니트릴(CH3CN)에서 0.2 M의 농도로 사용하였다. 커플링/재순환 시간은 16분으로 사용하였다. 활성화제는 5-에틸 티오테트라졸(0.75 M, American International Chemicals)이었으며, PO-산화의 경우 요오드/물/피리딘을 사용하였으며, PS-산화의 경우 2,6-루티딘/ACN(1:1 v/v) 중 PADS(2%)를 사용하였다.
리간드가 접합된 가닥은 상응하는 리간드를 포함하는 고체 지지체를 사용해 합성하였다. 예를 들어, 서열의 3' 말단에 탄수화물 모이어티/리간드(예를 들어, GalNAc)를 도입하는 것은, 상응하는 탄수화물 고체 지지체와의 합성을 시작함으로써 달성하였다. 유사하게는, 3' 말단의 콜레스테롤 모이어티는 콜레스테롤 지지체 상에서의 합성을 시작함으로써 도입하였다. 일반적으로, 리간드 모이어티를 이전의 실시예에서 기술한 바와 같이 선택적인 테터(tether)를 통해 트랜스-4-하이드록시프롤리놀에 테터링(tethering)하여, 하이드록시프롤리놀-리간드 모이어티를 수득하였다. 그 후, 하이드록시프롤리놀-리간드 모이어티를 숙시네이트 링커를 통해 고체 지지체에 결합시키거나, 또는 표준 포스피틸화 조건을 통해 포스포라미다이트로 전환시켜 바람직한 탄수화물 접합 빌딩 블록을 수득하였다. 형광단이 표지된 siRNA는, Biosearch Technologies에서 구입한 상응하는 포스포라미다이트 또는 고체 지지체로부터 합성하였다. 올레일 리토콜릭(lithocholic)(GalNAc)3 중합체 지지체는 38.6 μmol/g의 로딩량으로 하우스에서 제조하였다. 만노스(Man)3 중합체 지지체 또한, 42.0 μmol/g의 로딩량으로 하우스에서 제조하였다.
원하는 위치, 예를 들어 서열의 5' 말단에서의 선택적인 리간드의 접합은, 다르게 명시되지 않는 한, 표준 포스포라미다이트 커플링 조건 하에 상응하는 포스포라미다이트를 성장중인 사슬에 커플링함으로써 달성하였다. 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 활성화제의 존재 하에 무수 CH3CN 중 포스포라미다이트의 0.1 M 용액을 고체에 15분간 더 커플링시키는 것은 올리고뉴클레오타이드를 결합시켰다. 뉴클레오타이드간 포스파이트의 포스페이트로의 산화는, 보고한 바와 같이 표준 요오드-물을 사용하거나 (1) 또는 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드/아세토니트릴/물(10: 87: 3)을 10분간의 산화 대기 시간(oxidation wait time) 동안 접합된 올리고뉴클레오타이드와 처리함으로써, 수행하였다. 포스포로티오에이트는 DDTT(AM Chemicals에서 구입), PADS 및/또는 Beaucage 시약과 같은 황 전달 시약을 사용함으로써 포스파이트를 포스포로티오에이트로 산화시킴으로써 도입하였다. 콜레스테롤 포스포라미다이트는 하우스에서 합성하였으며, 디클로로메탄 중 0.1 M의 농도로 사용하였다. 콜레스테롤 포스포라미다이트의 경우 커플링 시간은 16분이었다.
2. 탈보호-I(뉴클레오베이스(nucleobase) 탈보호)
합성이 완료된 후, 지지체를 100 ml의 유리병(VWR)에 옮겼다. 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분해하고, 55℃에서 6.5시간 동안 에탄올계 암모니아의 혼합물[암모니아:에탄올(3:1)] 80 mL을 이용해 염기와 인산기를 동시에 탈보호하였다. 이 병을 얼음에서 간단히 냉각시킨 다음, 에탄올계 암모니아 혼합물을 250 ml의 새 병으로 여과하였다. CPG는 에탄올/물(1:1 v/v) 2 x 40 mL 분획으로 세정하였다. 그 후, 혼합물의 부피를 로토-뱁(roto-vap)에 의해 약 30 ml로 줄였다. 그런 다음, 혼합물을 건조 얼음에서 동결시키고, 스피드 백(speed vac)에서 진공 하에 건조하였다.
3. 탈보호-II(2' TBDMS 기의 제거)
건조된 잔기는 트리에틸아민, 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(TEA.3HF) 또는 피리딘-HF 및 DMSO(3:4:6) 26 ml에 재현탁시키고, 60℃에서 90분간 가열하여, 2' 위치에서 tert-부틸디메틸실릴(TBDMS)기를 제거하였다. 그런 다음, 반응은 20 mM 아세트산나트륨 50 ml로 켄칭하고, pH는 6.5로 조정한 다음, 정제할 때까지 냉동고에 보관하였다.
4. 분석
올리고뉴클레오타이드는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한 다음, 완충액을 정제 및 선별하고, 컬럼은 서열 및/또는 접합된 리간드의 특성에 따라 다르다.
5. HPLC 정제
리간드가 접합된 올리고뉴클레오타이드는 역상 제조 HPLC에 의해 정제하였다. 비-접합된 올리고뉴클레오타이드는 하우스에서 포장된 TSK 젤 컬럼 상에서의 음이온-교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충액은 10% CH3CN 중 20 mM 인산나트륨(pH 8.5)(완충액 A) 및 10% CH3CN, 1 M NaBr 중 20 mM 인산나트륨(pH 8.5)(완충액 B)이었다. 전장 올리고뉴클레오타이를 포함하는 분획을 풀링(pooling)하고, 탈염시키고, 동결건조하였다. 약 0.15 OD의 탈염된 올리고뉴클레오타이드를 물에서 희석시켜 150 ㎕로 만든 다음, CGE 및 LC/MS 분석용 특수 바이얼에 파이펫팅하였다. 화합물은 최종적으로 LC-ESMS 및 CGE로 분석하였다.
6. siRNA 제조
siRNA의 제조를 위해, 등몰량의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 1xPBS, 95℃에서 5분간 가열하고, 실온으로 서서히 냉각시켰다. 듀플렉스의 완전성(integrity)은 HPLC 분석에 의해 확인하였다.
실시예 3: ANGPTL3 siRNA 상에 다양한 화학적 변형이 발생한 경우의 시험관 내 사일런싱 활성
세포 배양 및 형질감염
Hep3B 세포(ATCC, Manassas, VA)는 37℃, 5% CO2에서, 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 보충된 RPMI(ATCC)에서 거의 꽉 차게 배양한 다음, 트립신으로 처리하여 플레이트에서 떼어낸다. 형질감염은, 웰 당 Opti-MEM 14.8 ㎕ + 리포펙타민 RNAiMax 0.2㎕(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를, 96-웰 플레이트의 웰 당 siRNA 듀플렉스 5 ㎕에 첨가하고, 실온에서 15분간 인큐베이션함으로써 수행하였다. 그 후, Hep3B 세포를 약 2 x 104개로 포함하는, 무-항생제 완전 성장 배지 80 ㎕를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포는 24시간 또는 120시간 동안 인큐베이션한 다음, RNA 정제하였다. 다르게 언급되지 않는 한, 단일 용량 실험은 10 nM 및 0.1 nM의 최종 듀플렉스 농도에서 수행하고, 용량 반응 실험은 10 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1,0.05 nM, 0.01 nM, 0.005 nM, 0.001 nM, 0.0005 nM, 0.0001 nM, 0.00005 nM 및 0.00001 nM의 최종 듀플렉스 농도에서 수행한다.
ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystem, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
반응 당 2 ㎕ 10X 완충액, 0.8 ㎕ 25X dNTPs, 2 ㎕ 랜덤 프라이머, 1 ㎕ 역전사효소, 1 ㎕ RNAse 억제제 및 3.2㎕ H2O의 마스터 믹스(master mix)를 10 ㎕의 총 RNA에 첨가하였다. Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 유전자 증폭기(thermal cycler)(Hercules, CA)를 25℃ 10 min, 37℃ 120 min, 85℃ 5 sec, 4℃ 유지로 이루어진 단계들을 통해 사용함으로써 cDNA를 생성하였다.
실시간 PCR
384웰로 구성된 50개의 플레이트(Roche cat # 04887301001)의 웰 당 0.5 ㎕ GAPDH TaqMan 프로브(Applied Biosystem Cat #4326317E), 0.5 ㎕ ANGPTL TaqMan 프로브(Applied Biosystem cat # Hs00205581_m1) 및 5 ㎕ Lightcycler 480 프로브 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 포함하는 마스터 믹스에 cDNA 2 ㎕를 첨가하였다. 실시간 PCR은 △△Ct(RQ) 분석법을 사용해 ABI 7900HT 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem)에서 수행하였다. 요약한 표에서 다르게 주지하지 않는 한, 각각의 듀플렉스는 2개의 독립적인 형질감염에서 시험하였으며, 각각의 형질감염은 이중으로 분석하였다.
상대 배수 변화를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 △△Ct 방법으로 분석하고, 10 nM AD-1955로 형질감염된 세포, 또는 mock 형질감염된 세포로 수행한 분석법에 대해 정상화하였다. IC50은 XLFit를 이용해 4개의 파라미터 피트 모델을 사용해 계산하고, 동일한 용량 범위 또는 이 자체의 최저 용량에서 AD-1955로 형질감염된 세포 또는 네이브(naive) 세포에 대해 정상화하였다. 음성 대조군으로서 사용되는 AD-1955 서열은 루시퍼라제를 타겟으로 하며 하기 서열을 가진다:
센스: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT;
안티센스: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT.
전술한 다양한 구현예들은 조합되어 추가적인 구현예들을 제공할 수 있다. 본 명세서에서 참조되는 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개들 모두는 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 구현예들의 양태들은, 다양한 특허, 출원, 및 공개의 개념들을 적용할 필요가 있는 경우 변형되어, 더욱 추가적인 구현예들을 제공할 수 있다.
전술한 설명의 구현예들에 이들 및 다른 변화들이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용되는 용어들은 청구항을 상세한 설명 및 청구항에서 개시되는 특정 구현예들에 한정해서는 안되며, 그보다는 이런 청구항들에 대한 등가물의 전 범위에서 모든 가능한 구현예들을 포함해야 한다. 따라서, 청구항들은 개시내용에 의해 한정되지 않는다.
실시예 4: siRNA 상의 화학적 변형 및 변형 siRNA의 시험관내 사일런싱.
센스 가닥 설계
리간드 설계 및 접합 부위
센스 가닥을 모체 화합물과 동일한, 3'-위치에서 GalNAc 리간드에 접합시켰다.
센스 11번 위치
추정 분해 부위에서 센스 가닥 11번 위치(센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥이 23개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 반대 AS 11번 위치)를 뉴클레아제 민감성 변형(예를 들어 DNA)으로 변형시켰다. 여러 상이한 접합체에 걸친 통계 분석으로부터의 데이터는 상기 위치의 중요성을 제시한다.
센스 3'-영역의 열적 탈안정화(16번 내지 18번 위치):
상기 영역을 열적 탈안정화 변형, 예컨대 반대 AS-가닥에 대한 미스매치 또는 GNA로 변형시켰다. 16번 또는 17번 위치의 변형이 가장 영향력 있는 것으로 나타났다. 도 1 및 표 1은 상기 위치/영역 및 시험관내 유효성에 대한 열적 탈안정화의 효과를 강조한다. GNA 또는 다른 열적 탈안정화 변형, 예컨대 무염기(Y34) 또는 안티센스 가닥에 대한 미스매치로 모체 주형 설계와 필적하는 유효한 녹다운을 수득하였다. 반면, 2'-OMe 또는 반대 AS-가닥과 상보적인 DNA 변형에 대해 일반적으로 감소된 사일런싱이 관찰되었다.
[표 1]
센스 가닥 17번 위치: 시험관내 평가된 siRNA의 서열 및 변형(도 1 참고).
도 2 및 표 2는 3'-영역(16번 내지 18번 위치)에 걸친 열적 탈안정화 변형 GNA의 긍정적 효과를 나타내었다. 결과는 16번 및 17번 위치에서의 GNA 변형이 모체 설계와 유사하게, 우수한 유효성을 나타낸 반면, 18번 위치에서의 GNA는 활성 감소를 나타내었음을 시사한다.
[표 2]
GNA를 포함하는 열적 탈안정화의 위치별 효과: 시험관내 평가된 siRNA의 서열 및 변형(도 2 참고).
[표 3]
안티센스 2번 위치: 시험관내 평가된 siRNA의 서열 및 변형(도 3 참고).
안티센스 가닥 설계
AS 2번 위치
상기 위치는 대규모 접합체 데이터세트의 통계 분석 및 AS-가닥을 통한 위치별 워킹에 의해 2'-OMe를 포함하여 입체적으로 까다로운 2'-변형에 민감한 것으로 확인되었다. 그러나 본 발명자들은, DNA, 그리고 일부 경우 RNA를 포함하는 몇몇 변형뿐만 아니라 2'-위치에 입체 장애를 갖지 않는 다른 변형이 비-F 설계의 맥락에서 잘 관용될 수 있음을 확인하였다. 시험관내 사일런싱 연구로부터의 결과를 도 3 및 표 3에 요약하며, 2번 위치에서의 DNA뿐만 아니라 RNA가 일반적으로 모체 주형 설계와 유사한 비-F 설계의 활성을 유지하는 반면, 2'-OME는 일반적으로 잘 관용되지 않고 감소된 활성으로 이어짐을 시사한다.
AS 14번 위치
상기 위치는 대규모 접합체 데이터세트의 통계 분석 및 AS-가닥을 통한 위치별 워킹에 의해 2'-OMe를 포함하여 입체적으로 까다로운 2'-변형에 민감한 것으로 확인되었다. 그러나 DNA, 그리고 일부 경우 RNA를 포함하는 몇몇 변형뿐만 아니라 2'-위치에 입체 장애를 갖지 않는 다른 변형이 비-F 설계의 맥락에서 잘 관용될 수 있음을 확인하였다. 시험관내 사일런싱 연구로부터의 결과를 도 4 및 표 4에 요약하며, 14번 위치에서의 DNA뿐만 아니라 RNA가 일반적으로 모체 주형 설계와 유사한 비-F 설계의 활성을 유지하는 반면, 2'-OME는 일반적으로 잘 관용되지 않고 감소된 활성으로 이어짐을 시사한다.
[표 4]
안티센스 14번 위치: 시험관내 평가된 siRNA의 서열 및 화학(도 4 참고)
[표 5]
마우스에서 생체내 연구에 이용된 mTTR을 타겟으로 하는 siRNA의 서열 및 화학
생체내 평가
mTTR을 타겟으로 하는 siRNA
동물(n=3/군)에 단회 siRNA 용량 2.5 mg/kg을 투여하고 FVII 혈청 단백질 수준을 투여-전 및 4일, 7일, 13일, 22일, 29일, 및 36일에 측정하였다. 도 5는 모체 화합물 AD-57727 대비 2가지 비-F siRNA AD-61398 및 64273에 대한 FVII 단백질 농도-시간 프로필을 나타낸다. 도 6에서, 모체 화합물 대비 3가지 상이한 용량 수준에서 2가지 비-F siRNA에 대해 투여 96 h 후 mTTR 단백질 감소가 나타난다. 도 7에서, mTTR 혈청 단백질 감소 프로필을 42일까지(총 6가지 용량) 반복-투여 양생법(1 mg/kg, QW)에 대해 나타낸다.
전반적으로, 연구들은 비-F siRNA AD-61398 및 AD-642733이 모체 주형 설계와 유사한 생체내 유효성 및 효능을 나타내었음을 시사한다.
TMPRSS6를 타겟으로 하는 siRNA
[표 6] TMPRSS6을 타겟으로 하는 siRNA의 서열 및 화학.
결과는 변형 정확한 배치 및 센스 및 AS-가닥의 조합에 따른 비-F 설계의 상이한 생체내 유효성을 시사한다. 시험관내 데이터는 비-F 화합물이 모체와 유사한 효능/유효성을 가졌고, 생체내에서 가장 활성이 있는 것으로 확인된 비-F 화합물 AD-64604가 여전히 모체 AD-60940에 비해 유의미하게 덜 유효하였음을 제시한다(도 8 참고).
비-F 설계의 추가 정련을 수행하고, 표 7에 요약된 바와 같이 평가하였다. 도 9는 3 mg/kg의 단회 SC 투여 7일 후 간에서의 TMPRSS6 mRNA 사일런싱을 나타낸다.
[표 7]
TMPRSS6을 타겟으로 하는 siRNA의 2번째 세트의 서열 및 화학.
도 9에 나타낸 바와 같이, 정련으로 모체(AD-60940) 대비 생체내 유효성을 갖는 1개 이상의 비-F 화합물(AD-65105)을 산출하였다. 화합물은 6번 및 11번 위치에 DNA를 갖는 센스 가닥 및 2번 위치에 RNA 및 10번, 14번 위치에 DNA를 갖는 안티센스 가닥을 함유한다.
모티프 설계
모티프 설계 시, 모체 화합물에 이용된 것과 동일한 절차를 이용하여, 센스 가닥을 3'-위치에서 GalNAc 리간드와 접합시켰다. 추가 모티프를 본 발명의 구현예에 따라 설계하였다. 대표 서열을 표 8에 기재한다.
[표 8] 대표 서열
시험관내 결과
도 10에 나타낸 바와 같이, 3가지 타겟을 나타내는 10개 서열에 걸쳐, 2가지 모티프, 모티프 1(센스 및 안티센스 가닥에 대한 6개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형; 센스 가닥의 5'-말단으로부터 센스 가닥의 7번 및 9번 내지 11번 위치에 4개의 2'-F 변형, 및 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 2번, 6번, 14번, 및 16번 위치에 4개의 2'-F 변형) 및 모티프 2(센스 및 안티센스 가닥에 대한 6개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형; 센스 가닥의 5'-말단으로부터 센스 가닥의 7번 및 9번 내지 11번 위치에 4개의 2'-F 변형, 및 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 2번, 6번, 8번 내지 9번, 14번, 및 16번 위치에 6개의 2'-F 변형)는 모체 화합물 AD-57727 대비 활성에서 통계적으로 유의미한 개선을 갖는 것으로 나타났다.
생체내 평가
siRNA의 타겟 사일런싱을 qPCR에 의해 평가하였다. 모티프의 성능을 타겟 mTTR에 대해 평가하였다. 동물(n=3/군)에 3 mg/kg의 단회 siRNA 용량을 투여하고, 도 11에 나타낸 바와 같이, 간 수준을 먼저 투여-전에, 그리고 7일 및 22일에 측정하였다.
도 12는 간을 투여 7일 후 활성(mRNA)에 대해 평가한 안정성 증강 접합체 화학(SEC-C)으로 증강된 활성을 나타난다. 동물은 3 mg/kg의 단회 용량을 수여받았다(s.c.). 데이터는 생체내 활성에 대한 모티프의 영향을 나타낸다.
도 13은 모체 화합물 대비 신규 모티프(모티프 1 및 2)로 증강된 활성(활성의 대략 4-배 개선)을 투여 7일 후 평가된 데이터와 함께 나타낸다. 데이터는 생체내 활성에 대한 모티프의 영향을 나타낸다. 배수 개선은 서열에 걸쳐 일관된다.
도 14는 모든 3가지 서열에 걸쳐 현저히 개선된 기간을 나타내며, 이는 신규 모티프가 증강된 기간을 나타냄을 보여준다.
도 15는 단회 3 mg/kg SC 투여 hAAV 1x 1011 GC/마우스에서, ApoC3-GalNAc3 SAR의 결과를 나타낸다.
실시예 5: 안티센스 가닥의 5' 말단에서의 VP 및 PS 2 변형
5'-비닐 포스포네이트(VP)를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성 및 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에서 포스포로디티오에이트(PS2) 결합을 통해 연결된 2'-데옥시티미딘을 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위한 예시적 프로토콜을 아래에 나타낸다. 당업자는 이러한 동일하거나 유사한 기술이 유사한 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위해 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 비제한적으로 문헌[Whittaket et al., "Stereoselective synthesis of highly functionalized P-stereogenic nucleosides via palladium-catalyzed P-C cross-coupling reactions," Tetrahedron Letters 49: 6984-87 (2008); Zhao and Caruthers, "Synthesis and Preliminary Biochemical Studies with 5'-Deoxy-5'-methylidyne Phosphonate Linked Thymidine Oligonucleotides," Tetrahedron Letters 37(35): 6239-42 (1996); 및 U.S. 특허 출원 공개 2013/0084576; 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨]에 개시된 합성 기술을 포함하는, 당업자에게 공지된 다른 합성 기술도 이들 및 유사한 올리고뉴클레오타이드 및 변형을 합성하고 제조하기 위해 이용될 수 있다.
5'-비닐 포스포네이트를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성 프로토콜
피발로일옥시메틸-(POM)-보호 VP의 도입
커플링 및 산화: 아미다이트의 커플링은 활성화를 위해 아세토니트릴 중 0.25 M 5-(에틸티오)-1H-테트라졸을 이용하는 표준 합성 조건 하에 수행하였다. 3-(디메틸아미노메틸렌) 아미노-3H-1,2,4-디티아졸-5-티온(DDTT) 또는 페닐아세틸 디설파이드(PADS)를 이용하는 표준 티올화 프로토콜을 수행하여 포스파이트 트리에스테르를 포스포로티오에이트 결합으로 전환하였다. 비닐 포스포네이트 빌딩 블록은 5'-위치에 DMT 보호기를 함유하지 않으므로, 최종 탈트리틸화 단계는 생략하였다.
탈보호 및 분해: 합성 후, 60℃에서 5시간 또는 35℃에서 16시간 동안 40% 메틸아민 용액이 1부피% 내지 2.5부피% 첨가된 수성 NH3 및 EtOH의 3:1 혼합물 중에서 비닐포스포네이트-함유 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하였다.
에틸-보호 VP의 도입
커플링 및 산화: 활성화를 위해 아세토니트릴 중 0.25 M 5-(에틸티오)-1H-테트라졸을 이용하는 표준 합성 조건 하에 아미다이트의 커플링을 수행하였다. 3-(디메틸아미노메틸렌) 아미노-3H-1,2,4-디티아졸-5-티온(DDTT) 또는 페닐아세틸 디설파이드(PADS)를 이용하는 표준 티올화 프로토콜을 수행하여 포스파이트 트리에스테르를 산화시키고 포스포로티오에이트 결합을 도입하였다. 비닐 포스포네이트 빌딩 블록은 5'-위치에 DMT 보호기를 함유하지 않으므로, 최종 탈트리틸화 단계는 생략하였다.
탈보호 및 분해: 아세토니트릴(ACN) 및 피리딘(Pyr)의 50:1(v/v) 용액을 제조하고, 3 Å 분자 체를 첨가하여 혼합물을 최대한 건조하게 유지하였다. 상기 혼합물에, 3.5 mL(5 g)의 트리메틸실릴 요오다이드(TMSI)를 ACN/Pyr 용액 135 mL마다 첨가하였다. 상기 용액은 새로 제조해야 하며, 최대 보관 기간은 1일이다. 다음으로, 1:1(v/v) 아세토니트릴-트리에틸아민 중 머캅토에탄올의 0.5 M 용액을 제조하고, 3 Å 분자 체를 첨가하였다. 수지 상에 그리고 합성 컬럼 내에서 5'-VP-함유 올리고뉴클레오타이드를 이용해서, TMSI 용액을 약 5 내지 10 CV로 천천히 첨가하고 15분 동안 반응하도록 두었다. 상기 단계를 2회 반복하여 약 45분의 총 노출 시간을 일으켰다. 이후, 수지를 ACN으로 광범위 세척한 뒤, 컬럼에 걸쳐 약 5 내지 10 컬럼 부피의 머캅토에탄올 용액을 흘리고, 10분 동안 반응하도록 두었다. 상기 단계를 총 20분의 노출 시간 동안 1회 반복하였다. ACN을 이용한 또 다른 광범위 세척 후, 지지체-결합 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고 표준 조건을 이용하여 지지체로부터 분해하였다.
올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에서 포스포로디티오에이트 결합을 통해 연결된 2'-데옥시티미딘을 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성 프로토콜
커플링 및 산화: 0.15 M 농도로 건조 아세토니트릴 중 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 dT-티오포스포르아미다이트(Glen Research)로부터 포스포르아미다이트 용액을 제조하였다. 17분의 총 커플링 시간 동안 아세토니트릴 중 0.25 M 5-(에틸티오)-1H-테트라졸을 이용하는 표준 조건 하에 커플링을 수행하였다. 합성 주기로부터 캡핑 단계는 생략하였다. 시약 전달 및 반응 시간을 3 x 10분으로 연장하여 3-(디메틸아미노메틸렌) 아미노-3H-1,2,4-디티아졸-5-티온(DDTT)을 이용하여 산화(티올화)를 수행하였다. 표준 합성 조건을 이용하여 최종 탈트리틸화를 수행하였다.
탈보호 및 분해: 고체 지지체(컬럼 상)를 ACN(2 x 15분 노출 시간) 중 0.5 M 피페리딘으로 세척한 뒤 수지를 적합한 용기로 옮기고 표준 조건(예를 들어 60℃에서 5시간 동안 또는 35℃에서 16시간 동안 3:1 수성 NH:EtOH 용액) 하에 처리하여 고체 지지체로부터 분해하고 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하였다.
올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 대한 나머지 절차는 실시예 2에 기재된 절차와 유사하다.
도 16은 Ago2 로딩 siRNA의 모식도를 나타낸다. 일반적으로, 5'-포스페이트-작용화 siRNA(ESC 화학)는 개선된 시험관내 활성을 나타낸다. 예를 들어, 평가된 약 80%의 서열이 시험관내 형질감염되었을 때 개선된 내재 효능을 나타내었고, 약 30%가 약 10-배 IC50 이익을 나타낸다. 그러나, 생체내 5'-포스페이트는 엔도좀/라이소좀 구획에서 신속히 소실된다. 안정한 포스페이트인 5'-비닐포스포네이트(5'-VP)를 모방하는 변형 포스페이트도 도 16에서 변형 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착된 것으로 나타난다. 상기 포스포네이트는 원래 Merck에 의해 설계되었다.
본 발명의 구현예는 효능 개선을 위한 5'-말단-변형(RISC 로딩)에 대한 것이다. 말단 변형은 안정한 포스페이트 모방체를 제공하며 내인성 인산화를 촉진한다.
도 17은 4가지 상이한 ApoB 서열의 평가에 근거하여, 5'-VP의 존재가 일반적으로 어떻게 생체내 활성을 개선하는지를 나타내는 그래프를 보여준다. 3 mg/kg의 단회 SC 투여 7일 후 LDL 수준을 4가지 접합체(5'-VP 변형을 포함하거나 포함하지 않음)에 대해 분석하였다. 그래프로부터 나타난 바와 같이, 특정한 ApoB 서열에서는 ED50에서 3-배 개선이 나타난다. ApoC3, Tmpssr6, 및 TTR을 포함하는 추가 화합물/타겟을 이용하여 생체내 이익을 확인하였다. ApoB 서열을 표 9에 기재한다.
[표 9]
도 18은 포스포로디티오에이트(PS2), 및 메틸포스포네이트(MePhos)를 포함하는, PS 결합을 대체할 수 있는 상이한 화학적 변형을 나타내며, 이는 내인성 인산화를 촉진한다. 아마도 AS 가닥의 제1 뉴클레오타이드에서 2' OMe 변형에 의한 간섭으로 인해, 변형 siRNA는 일반적으로 Clp1 키나아제에 대한 우수한 기질이 아니다. 그러나, 포스포로티오에이트 결합에 따른 2'-OMe 변형이 엑소뉴클레아제 보호를 위해 바람직하다. 예를 들어, 2' F를 이용한 2'-OMe 변형의 대체 및 PS 결합의 변형은 대사 안정성을 보유하면서 엑소뉴클레아제 보호를 촉진할 수 있다.
도 19는 2'-OMe-MePhos, 2'-OMe-PS, dN(PS2), 및 2'F-PS를 포함하는, 말단 변형의 시험관내 평가 그래프를 나타낸다. 그래프에 나타낸 바와 같이, dn(PS2) 결합 및 2' F-PS는 모체(2'OMe-PS) 대비 개선된 시험관내 활성을 나타내었다. 특히, dN(PS)2는 시험관내 트리토좀(tritosome) 검정에서 안정한 반면, 2' F-PS는 대사 책임을 나타내었다. 10 nM 및 0.1 nM(n=4)에서 일차 마우스 간세포의 형질감염을 2가지 ApoB 접합체 상에서 수행하였다.
도 20은 안티센스 5'-말단에서의 작은 변화가 어떻게 생체내 유효성을 유의미하게 개선할 수 있는지를 나타내는 2가지 그래프를 나타낸다. 도 20a는 안티센스 가닥의 1번 위치의 2'F-PS가 5'P-의존적 서열의 활성을 개선할 수 있음을 나타내며, 도 20b는 5'-VP와 유사하게, 모체에 비해 dN(PS)2에 의한 약 3-배 개선된 효능을 나타낸다.
실시예 6: siRNA 활성에 대한 5'-VP 변형 및 평가
피발옥시메틸 보호기를 이용한 5' 비닐포스포네이트 포스포르아미다이트의 합성
반응식 1
반응식 1을 위한 시약 및 반응 조건: (a) Dess-Martin 퍼요오디난, DCM, 0℃; (b) NaH, 테트라(피발로일옥시메틸) 비스포스포네이트, THF, -78℃, 이어서 0℃에서 교반, 70%(E 및 Z 이성질체); (c) 포름산:물, 1:1, 24시간, 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해 또는 RP-HPLC(역상 HPLC)에 의해 E 및 Z 이성질체를 분리함; (d) 2-시아노에틸 N,N,N′,N′-테트라이소프로필포스포르디아미다이트, 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, ACN, 6시간, 실온, 65%.
테트라(피발로일옥시메틸)-비스-포스포네이트(X)의 합성
테트라메틸 메틸렌비스포스포네이트(120 g, 0.51 mol), NaI(308 g, 2 mol), 클로로메틸 피발레이트(387 g, 2.5 mol) 및 아세토니트릴(400 ml)을 혼합하고 하룻밤 동안 환류시켰다. 5% 메탄올로 EtOAc 중 TLC(박층 크로마토그래피)로 산물의 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 에테르(1000 ml)로 희석하고 물(2 × 1000 ml)로 세척하고, Na2SO3로 건조하고 증발시켰다. 고체 잔여물을 저온 헥산으로 세척하고 진공 중 건조하여 148 g(45%)의 X를 담황색 고체로 얻었다.
1H NMR(500 MHz, CDCI3): d 5.73-5.63 (m, 8H), 2.65 (t, 2H), 1.22 (s, 36H); 31P NMR(500 MHz, CDCI3): d 18.61
화합물( 2 )의 제조
150 mL의 무수 디클로로메탄 중 화합물(1)의 빙냉 용액(3.0 g, 8 mmol)에 Dess-Martin 퍼요오디난(DMP)(1.4당량; 4.7 g, 11.2 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 0℃에서, 이어서 3시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 산물의 형성을 확인하였다. 이어서 반응 혼합물을 10% Na2S2O3 및 포화 NaHCO3의 200 ml 용액(1:1)에 첨가한 뒤, 200 ml 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 조정제 알데하이드를 에틸 아세테이트 중에 추출하고, 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 조정제 알데하이드를 임의 정제 없이 다음 단계를 위해 이용하였다.
수율 = 2.87 gm(97%); NMR에 의한 순도 약 70%; LC-MS: m/z 371.
화합물( 3 )의 제조
-78℃에서 20 mL의 THF 중 NaH(0.58 g, 24 mmol)의 현탁액에 14 ml의 THF 중 비스포스포네이트(X)(12.6 gm, 20 mmol)의 첨가에 의해 테트라 폴리옥소메탈레이트(POM)-비스포스포네이트 나트륨 염 용액을 제조하고, 15분 동안 교반하였다.
40 mL의 무수 THF 중 알데하이드 2(2.86 g)의 용액을 -78℃에서 상기 제조된 테트라(POM) 비스포스포네이트 나트륨 염 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 -78℃에서, 다음 1시간 동안 0℃에서, 그 뒤 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 산물의 형성을 확인하였다(EtOAc:헥산 7:3). 조정제 반응 혼합물을 300 ml 포화 염화 암모늄에 첨가하고, 300 ml 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, 황산 나트륨 상에서 건조하였다. 이어서 용액을 감압 하에 농축하고, 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc = 20 내지 100%)로 정제하여 화합물(3)(4.0 g)을 72% 수율로 E/Z 이성질체의 혼합물(88/12)로서 얻었다.
화합물(4)의 제조
200 mL의 HCOOH/H2O(1:1, v:v) 중 (3)의 용액(4 g, 5.7 mmol)을 24시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC로 산물의 형성을 확인하였다(MeOH:CH2Cl2 = 5:95).
용액을 감압 하에 농축하고 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(MeOH:CH2Cl2 = 7:93 v/v). 분획을 RP-HPLC(C18 컬럼, 완충액 A = 수중 0.05% TFA, 완충액 B = ACN 중 0.05% TFA; 25분에 걸쳐 5% 내지 95% 구배) 상에서 평가하여 2가지 이성질체(E 및 Z 이성질체)의 순도를 확인하였다: E 이성질체는 14.1분에 용출되며 Z 이성질체는 14.9분에 용출된다. 실리카 겔 크로마토그래피로부터의 최초 분획은 E 및 Z 이성질체의 혼합물을 함유하였고, 나머지 분획은 E 이성질체였다. E 및 Z 이성질체의 혼합물을 함유하는 분획을 RP-HPLC 상에서 정제하였다. 4-E 이성질체 2.3 g을, 71% 수율로 수득하였다.
E 이성질체:
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 8.98 (s, 1H), 7.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.80 (ddd, J = 23.7, 17.2, 5.0 Hz, 1H), 6.02 (ddd, J = 21.6, 17.1, 1.7 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.57 (m, 5H), 4.32 (m, 1H), 4.01 (dd, J = 7.0, 5.4 Hz, 1H), 3.82 (dd, J= 5.5, 3.2 Hz, 1H), 3.41 (s, 3H), 1.14 (d, J = 1.5 Hz, 18H);31P NMR (162 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 18.29.
Z 이성질체:
1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 9.50 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.69 (ddd, J = 54.4, 13.3, 8.7 Hz, 1H), 5.93 (ddd, J = 17.8, 13.3, 1.3 Hz, 1H), 5.80 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.69 - 5.58 (m, 5H), 5.22 (m, 1H), 4.01 (dd, J = 7.1, 5.3 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 5.3, 2.9 Hz, 1H), 3.49 (s, 3H), 1.19 (d, J = 5.8 Hz, 18H); 31P NMR (202 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 18.75.
화합물( 5 )의 제조
ACN(40 mL) 중 화합물(4)-E 이성질체(2.1 g, 3.62 mmol) 및 에틸티오 테트라졸(0.46 g, 3.62 mmol)의 용액에 2-시아노에틸 N,N,N′,N′-테트라이소프로필포스포르디아미다이트(1.311 g, 4.35 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 헥산:EtOAc (0.15% TEA 중, 2:8)에서의 TLC로 산물의 형성을 확인하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축하고, 실리카 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 TEA(0.15%) 함유 헥산 중 20% 내지 100% EtOAc로 용출하여 화합물(5)을 흰색 발포체로 산출하였다(1.75 g, 62%).
E 이성질체:
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 9.09 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.89 (m, 1H), 6.10 (dddd, J = 21.4, 17.1, 2.8, 1.7 Hz, 1H), 5.86 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 5.67 - 5.55 (m, 5H), 4.66 - 4.50 (m, 1H), 4.40 - 4.20 (m, 1H), 3.99 (m, 1H), 3.92 - 3.57 (m, 4H), 3.44 (s, 3H), 2.73 - 2.64 (m, 2H), 2.14 (s, 1H), 1.24 - 1.14 (m, 30H); 31P NMR (162 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 151.79 (d, J = 71.3 Hz), 18.07 (d, J = 54.0 Hz).
Z 이성질체:
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 9.02 (s, 1H), 7.41 (dd, J = 8.1, 1.6 Hz, 1H), 6.62 (dddd, J = 53.7, 13.1, 9.7, 7.0 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 17.4, 13.1 Hz, 1H), 5.80 (dd, J = 7.0, 3.5 Hz, 1H), 5.70 - 5.52 (m, 5H), 5.41 (m, 1H), 4.40 - 4.10 (m, 1H), 4.06 -3.98 (m, 1H), 3.93 - 3.56 (m, 4H), 3.47 (s, 3H), 2.68 (m, 2H), 2.14 (s, 1H), 1.33 - 1.1 1 (m, 30H); 31P NMR (202 MHz, 아세토니트릴-d 3): δ 150.81 (d, J = 141.4 Hz), 15.17.
5'-비닐 포스포네이트를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 합성 프로토콜
비닐포스포네이트 단량체 및 5'-VP 변형 올리고뉴클레오타이드 합성을 문헌[WO 2008/100447(Chen et al.); Lima et al. "Single-Stranded siRNAs Activate RNAi in Animals," Cell 150: 883-894 (2012); Prakash et al., "Identification of metabolically stable 5-phosphate analogs that support single-stranded siRNA activity," Nucleic Acids Research 43: 2993-3011(2015), 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨]에서의 절차와 유사하게 수행하였다. 간략하게, 5'-포스페이트를 에틸 에테르로 보호한 뒤, 에틸 에테르-보호 포스페이트로 2단계 탈보호를 거친다. 1) 무수 조건 하에 고체 지지체 상 TMS-I 및 2) 5'-VP 변형 올리고뉴클레오타이드를 수득하기 위한 표준 올리고뉴클레오타이드 탈보호. 상기 방법이 또한 실시예 5에서 논의된다.
siRNA 활성 상에서 대사적으로 안정한 (E-) 및 (Z-) 5′-비닐포스포네이트의 효과
5'-인산화 안티센스 가닥을 갖는 이중-가닥 소형 간섭RNA(siRNA)는 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC) 상으로의 효율적인 로딩을 촉진하여 강력한 RNAi 매개 유전자 사일런싱을 유발한다. 따라서, 합성 siRNA의 Clp1 키나제에 의한 내인성 5′-인산화가 RISC 로딩 및 가닥 선택을 위해 중추적이다(Weitzer et al., "The human RNA kinase hClp1 is active on 3' transfer RNA exons and short interfering RNAs," Nature 447: 222-226 (2007)). 대사적으로 안정한 결합을 갖는 포스페이트 모방체는 대응하는 비-인산화 siRNA, 특히 단일-가닥 siRNA에 비해 유전자 사일런싱 활성을 개선하기 위한 siRNA의 5'-말단 변형을 위해, 항바이러스제로서 뉴클레오사이드 변형을 위해 이용되었다(WO 2008/100447 to Chen et al.)(Lima et al. "Single-Stranded siRNAs Activate RNAi in Animals," Cell 150: 883-894 (2012); Prakash et al., "Identification of metabolically stable 5-phosphate analogs that support single-stranded siRNA activity," Nucleic Acids Research 43: 2993-3011 (2015)).
본 실시예에서, 이중-가닥 siRNA에서 포스페이트 모방체의 효과를 시험관내 및 생체내에서 모두 평가하였다.
본 실시예에서 이용된 siRNA 서열을 아래 표에 나타낸다.
E- 및 Z-기하구조를 갖는 5'-비닐포스포네이트(VP)의 이중-가닥 siRNA 활성에 대한 영향을 비교하였다. 결과는 화학적으로 변형된 siRNA에 대한 생체내 유효성이 천연 포스페이트를 잘 모방하는 5'-트랜스-(E-)VP로 개선될 수 있는 반면, 5'-시스-(Z-)VP는 유효성 개선을 나타내지 않았음을 나타내어, Z-이성질체가 천연 포스페이트를 잘 모방하지 않음을 제시한다.
도 21a-b는 (안티센스 가닥의 5' 말단에) 5'-OH 대 5'- E-VP 변형을 함유하는 ApoB siRNA의 시험관내 및 생체내 활성의 SAR 분석을 나타낸다. 도 21a는 시험관내 형질감염 마우스 일차 간세포를 이용한 결과를 나타낸다. 도 21b는 단회 투여(SC 투여) 3일 후 LDL 수준을 나타낸다. 도 21b의 결과는 5'-E-VP로 변형된 ApoB siRNA가 개선된 활성을 나타내었음을 보여준다.
도 22는 mTTR 및 F9 siRNA-GalNAc 접합체에 대한 5'-E-VP 변형 대 5'-Z-VP 변형의 시험관내 효능 결과를 나타낸다. 결과는 시험관내 형질감염 마우스 일차 간세포로부터 얻었다. 도면에 나타낸 바와 같이, 5'-E-VP로 변형된 siRNA 접합체는 유지되거나 개선된 효능을 나타낸 반면, 5'-Z-VP로 변형된 siRNA 접합체는 감소된 효능을 나타내었다.
도 23은 F9 siRNA-GalNAc 접합체(단회 SC 투여)에 대한 5'-E-VP 변형 대 5'-Z-VP 변형의 생체내 비교 결과를 나타낸다. 결과는 5'-E-VP로 변형된 siRNA 접합체가 5'-OH 대조군에 비해 개선된 유전자 사일런싱 활성을 나타낸 반면, 5'-Z-VP로 변형된 siRNA 접합체는 5'-OH 대조군에서와 유사한 활성을 나타내었음을 보여준다.
이들 도면의 결과는 안티센스 가닥의 5'-인산화가 효율적인 RNAi 매개 유전자 사일런싱에 대해 바람직함을 나타낸다. 화학적으로 변형된 siRNA의 유효성은 천연 포스페이트를 잘 모방하는 5'-트랜스-비닐포스포네이트(5'-E-VP)로 개선될 수 있다.
실시예 7: siRNA 활성에 대한 5'- C -말로닐 변형 및 평가
siRNA의 5'-말단으로의 5'- C -말로닐 뉴클레오타이드의 합성 및 혼입:
일반 실험 조건: 모든 수분-민감성 반응은 아르곤 분위기 하에서 무수 조건 하에 수행하였다. 사전-패킹된 ReadySep Teledyne ISCO 실리카 겔 컬럼을 이용하여 Teledyne ISCO(Lincoln, NE) Combi Flash 시스템 상에서 플래시 크로마토그래피를 수행하였다. 전기분무 이온화-고해상 질량 분광측정(ESI-HRMS) 스펙트럼을 포지티브 방식(모세관 = 3000 kV, 콘 = 35, 소스 온도 = 120℃, 및 탈용매화 온도 = 350℃)에서 직류 주입을 이용하여 Waters(Milford, MA) Q-Tof API-US 분광측정기 상에 기록하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 400 MHz(1H) 및 126 MHz(13C)에서 Varian 분광측정기(Palo Alto, CA) 상에 실온에서 기록하고, 화학적 이동 ppm은 잔여 용매 피크를 참조하였다. 커플링 상수는 Hertz로 제공하였다. 신호 분할 패턴을 단일선(s), 이중선(d), 삼중선(t), 사중선(q), 광범위 신호(br), 또는 다중선(m)으로 기재하였다. 31P NMR 스펙트럼을 양성자-탈커플링 방식 하에 162 MHz에서 기록하고, 화학적 이동은 외부 H3PO4(80%)를 참조하였다. LC/ESI-MS는 60℃에서 XBridge C8 컬럼(2.1 × 50 mm, 2.5 ㎛)을 이용하여 Agilent(Santa Clara, 6130 단일 사극자 LC/MS 시스템 상에서 수행하였다. 완충액 A는 H2O 중 100 mM 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP) 및 16.3 mM 트리에틸아민(TEA)으로 이루어졌고, 완충액 B는 100% 메탄올이었다.
반응식 2
반응식 2를 위한 시약 및 반응 조건: (a) 벤질옥시메틸 아세탈(BOM) 클로라이드, DBU, DMF, 30분, 0℃, 정량적(Kurosu et al., "Synthetic studies towards the identification of novel capuramycin analogs with mycobactericidal activity," Heterocycles 77: 217-225 (2009); Kurosu et al., "Concise Synthesis of Capuramycin," Org. Lett. 11:2393-2396 (2009), 그 전체가 원용에 의해 포함됨); (b) 메틸트리페녹시포스포늄 요오다이드, DMF, 15분, 실온, 92%; (c) 나트륨 메톡사이드, 디메틸 말로네이트, 1,2-DME, 24시간, 환류, 92%; (d) 10% Pd/C, H2 atm, i-PrOH/H2O(10:1, v/v), 0.05당량 포름산, 12시간, 실온, 98%(Aleiwi et al., "A reliable Pd-mediated hydrogenolytic deprotection of BOM group of uridine ureido nitrogen," Tetrahedron Lett. 53: 3758-3762 (2012), 그 전체가 원용에 의해 포함됨); (e) NEt3-3HF, THF, 48시간, 실온, 88%; (d) 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트, DIEA, DCM, 18시간, 실온, 56%; (g) 1 M 수성 피페리딘, 24시간, 실온; 이후 30% 수성 암모니아/에탄올(3:1, v/v), 36시간, 실온, 정량적, Z+ = 피페리디늄.
N 3 -벤질옥시메틸-2'- O -메틸-3'- O-tert -부틸디메틸실릴우리딘( 2 )의 합성
2'-O-메틸-3'-O-tert-부틸디메틸실릴-우리딘(1, 20 g, 53.7 mmol)을 이전에 보고된 절차의 변형을 따라 2(26.5 g, 정량적)로 변환시켰다.
N 3 -벤질옥시메틸-5'-데옥시-5'-요오도-2'- O -메틸-3'- O-tert -부틸디메틸실릴우리딘( 3 )의 합성
화합물(2)(10 g, 20.3 mmol)을 100 mL의 무수 DMF 중에 용해시키고, 20 g(40.6 mmol)의 메틸트리페녹시포스포늄 요오다이드를 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반하였다. 메탄올(200 mL)을 반응에 첨가하고, 혼합물을 추가 15분 동안 교반하였다. 용매를 증발 건조하였다; 잔여물을 디클로로메탄(DCM) 중에 용해시키고 Na2S2O3의 5% 용액으로 세척한 뒤 물 세척하였다. 유기층을 수집하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 조정제 잔여물을 용출액으로서 헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트(EtOAc)를 이용해서 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (3)을 흰색 발포체로 수득하였다(11.2 g, 92%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.30 (m, 5H), 5.90 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.33 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.23 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 3.87 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 10.6, 6.3 Hz, 1H), 3.39 (dd, J = 10.6, 6.3 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.14 (s, 3H), 0.12 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6): δ 161.7, 150.7, 140.2, 138.0, 128.2, 127.4, 127.3, 101.6, 87.9, 83.3, 80.8, 72.7, 71.0, 70.1, 57.6, 25.6, 17.7, 6.2, -4.7, -4.8.
HRMS-ESI: C24H35IN2NaO6Si(M+Na)+에 대한 계산치 625.1207; 실측치: 625.1205.
N 3 -벤질옥시메틸-5'-데옥시-5'- C -(디메틸말로닐)-2'- O -메틸-3'- O-tert -부틸디메틸실릴우리딘( 4 )의 합성
나트륨 메톡사이드(2 g, 33 mmol)를 건조한 둥근-바닥 플라스크에 배치하고, 디메틸 말로네이트(12 mL, 100 mmol) 및 무수 1,2-디메톡시에탄(DME, 100 mL)을 첨가하고, 혼합물을 환류시켰다. 화합물(3)(10 g, 16.5 mmol)을, 무수 아세토니트릴과 2회 공동-증발시킨 뒤, 70 mL의 무수 DME 중에 용해시키고 디메틸 말로네이트 및 나트륨 메톡사이드의 환류 용액에 첨가하였다. 환류를 24시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 메탄올(50 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 용매 및 휘발물을 진공 중에 증발시켰다. 조정제 잔여물을 용출액으로서 헥산 중 0~100% EtOAc를 이용해서 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물(4)을 무색 오일로 수득하였다(9.2 g, 92%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.66 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.30 (m, 5H), 5.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.33 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.64 (m, 4H), 3.60 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 2.37 - 2.09 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.08 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6): δ 169.1 , 168.8, 161.9, 150.6, 140.4, 138.0, 128.1, 127.4, 127.3, 101.3, 88.6, 88.5, 81.3, 80.9, 73.1, 71.0, 70.0, 59.7, 57.5, 52.5, 48.0, 31.5, 25.6, 17.7, -4.76, -5.06.
HRMS-ESI: C29H42N2NaO10Si(M+Na)+에 대한 계산치 629.2506; 실측치: 629.2508.
5'-데옥시-5'- C -(디메틸말로닐)-2'- O -메틸-3'- O-tert -부틸디메틸실릴우리딘( 5 )의 합성
화합물(4)(8.7 g, 14.3 mmol)을 660 mL의 이소-프로판올/물(10:1, v/v) 중에 용해시키고, 0.9 g의 10% Pd/C에 이어 27 mL(0.7 mmol)의 포름산을 첨가하였다. 플라스크로부터의 공기를 진공 하에 제거하였다; 반응 플라스크를 수소로 플러싱하고 12시간 동안 실온에서 정상압으로 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 에탄올로 헹구었다. 여액을 수집하고 증발 건조하였다. 조정제 잔여물을 용출액으로서 DCM 중 0~5% MeOH를 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 풀링하고 증발 건조하여 흰색 발포체로서 (5)를 수득하였다(6.7 g, 98%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 1 1.38 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.71 (d, J= 4.3 Hz, 1H), 5.65 (dd, J = 8.0 Hz, J = 2.1 Hz, 1H), 4.16 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.91 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.73 (m, 1H), 3.63 (m, 4H), 3.61 (s, 3H), 3.31 (s, 3H), 2.24 - 2.07 (m, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.08 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6): δ 169.2, 168.9, 163.0, 150.4, 141.2, 141.2, 102.1, 87.7, 81.2, 80.9, 73.1, 57.5, 52.5, 52.4, 52.3, 48.0, 31.6, 25.6, 17.7, -4.8, -5.1.
HRMS-ESI: C21H34N2NaO9Si(M+Na)+에 대한 계산치 509.1931; 실측치: 509.1929.
5'-데옥시-5'- C -(디메틸말로닐)-2'- O -메틸우리딘( 6 )의 합성
화합물(5)(6.7 g, 13.8 mmol)을 48시간 동안 실온에서 둥근-바닥 플라스크의 150 mL의 무수 THF 중 트리에틸아민-트리하이드로플루오라이드(11 mL, 202.5 mmol)와 함께 교반하였다. 용매를 원래 부피의 2/3까지 진공 중에 증발시켰다. 잔여물을 용출액으로서 DCM 중 0~10% MeOH를 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 풀링하고 증발 건조하여 흰색 발포체로서 (6)을 수득하였다(4.5 g, 88%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 1 1.37 (s, 1H), 7.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.94 (q, J = 5.7 Hz, 1H), 3.86 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.64 (m, 4H), 3.61 (m, 3H), 3.34 (s, 3H), 2.25 - 2.07 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d 6): δ 169.2, 169.0, 163.0, 150.3, 141.0, 102.0, 87.4, 81.6, 80.8, 71.9, 57.6, 52.5, 52.4, 48.0, 31.9.
HRMS-ESI: C15H20N2NaO9(M+Na)+에 대한 계산치 395.1067; 실측치: 395.1070.
5'-데옥시-5'- C -(디메틸말로닐)-2'- O -메틸우리딘-3'- O-(O -(2-시아노에틸)- N,N -디-이소프로필)포스포르아미다이트( 7 )의 합성
화합물(6)(3.0 g, 8 mmol)을 무수 아세토니트릴과 3회 공동-증발시킨 뒤 P2O5 상에서 진공 하에 하룻밤 건조하였다. 건조 잔여물을 60 mL의 무수 DCM 중에 용해시켰다; 디이소프로필에틸아민(4.5 mL, 24 mmol) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(2.2 mL, 10.0 mmol)를 후속 첨가하였다. 아르곤 분위기 하에 1시간 교반 후, 다시 1.0 mL(4.0 mmol)의 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트를 첨가하고, 18시간 더 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 150 mL의 DCM으로 희석하고, 200 mL의 포화 중탄산 나트륨 용액으로 세척하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고, 여과로 제거하였다. 용매를 진공 중에 증발시키고, 조정제 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 유출액은 헥산/EtOAc/NEt3,(66:33:1, v/v/v에서 헥산/EtOAc/NEt3 33:66:1, v/v/v로의 단계 구배)이었다. 적절한 분획을 풀링하고, 증발 건조하고, 무수 아세토니트릴과 공동-증발시키고, 고진공 하에 건조하여 (7)을 흰색 발포체로 수득하였다(3.2 g, 56%).
1H NMR (400 MHz, CD3CN, 부분입체이성질체의 혼합물): δ 8.97 (s, 1H), 7.36 (m, 1H), 5.78 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.23 - 3.80 (m, 4H), 3.77 - 3.59 (m, 8H), 3.45 - 3.41 (m, 3H), 2.68 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.44 - 2.31 (m, 2H), 1.42 -1.00 (m, 12H). 31P NMR (162 MHz, CD3CN, 부분입체이성질체의 혼합물): δ 151.8, 151.6. 13C NMR (126 MHz, CD3CN, 부분입체이성질체의 혼합물): δ 170.6, 170.2, 163.8, 151.3, 141.3, 1 19.6, 103.0, 102.9, 89.6, 89.2, 82.9, 82.5, 82.4, 81.8, 81.3, 81.2, 75.3, 75.2, 75.1, 75.0, 59.8, 59.7, 59.3, 59.1, 58.9, 58.8, 53.3, 53.2, 49.5, 49.4, 44.2, 44.15, 44.1, 44.0, 33.0, 25.0, 24.9, 24.8, 21.0, 20.9.
HRMS-ESI: C24H38N4O10P(M+H)+에 대한 계산치 573.2326; 실측치: 573.2321.
5'-데옥시-5'- C -말로닐-2'- O -메틸우리딘, 피페리디늄 염( 8 )의 합성
화합물(6)(0.1 g, 0.3 mmol)을 24시간 동안 실온에서 1 M 수성 피페리딘(10 mL, 10 mmol)과 함께 교반하였다. 용매를 진공 중에 증발시키고, 잔여물을 30% 암모니아/에탄올 혼합물(3:1, v/v) 중 용해시키고, 36시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 중에 증발시키고, (8)을 무색 오일로 수득하였다(정량적).
1H NMR (400 MHz, D20): δ 7.75 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.92 (m, 2H), 4.16 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 3.99 (m, 1H), 3.50 (s, 3H), 3.27 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.17 (t, J = 5.7 Hz, 6H), 2.27 - 2.06 (m, 2H), 1.87 - 1.54 (m, 8H). 13C NMR (126 MHz, D20): δ 179.5, 179.2, 168.0, 153.0, 142.5, 103.1, 88.5, 83.7, 83.3, 72.7, 58.9, 55.9, 45.3, 34.7, 23.0, 22.2.
HRMS-ESI (M+H)+: C13H17N2O9 산출치 345.0929; 실측치: 345.0919.
올리고뉴클레오타이드 합성:
기기에 제공되는 것에 근거한 변형 합성 주기를 이용해서 ABI-394 DNA/RNA 합성장치 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 아세토니트릴 중 0.25 M 5-(S-에틸티오)-1H-테트라졸 용액을 활성화제로 이용하였다. 포스포르아미다이트 용액은 무수 아세토니트릴 중 0.15 M이었다. 산화 시약은 THF/피리딘/H2O 중 0.02 M I2였다. 피리딘 중 0.1 M, N,N-디메틸-N'-(3-티옥소-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아마이드(DDTT)를 황화 시약으로 이용하였다. 탈트리틸화 시약은 DCM 중 3% 디클로로아세트산(DCA)이었다. 5'-포스페이트 화합물의 경우, Glen Research의 화학적 인산화 시약(Cat.# 10-1902-02)을 5'-모노포스페이트의 도입을 위해 이용하였다. 자동화 합성의 종료 후, 고체 지지체를 10분 동안 아세토니트릴 중 0.1 M 피페리딘으로 세척한 뒤 무수 아세토니트릴로 세척하고, 아르곤으로 건조하였다. 이어서 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 수동 방출시키고 55℃에서 6시간 또는 60℃에서 15분 동안 각각 30% NH4OH/에탄올(3:1, v/v) 또는 40% 메틸아민(0.5 mL/고체 지지체μmol)의 혼합물을 이용하여 탈보호하였다. 용매를 여과에 의해 수집하고, 지지체를 DMSO(1.5 mL/고체 지지체μmol)로 헹구었다.
5'-C-말로닐 고체-지지 올리고뉴클레오타이드를 먼저 실온에서 24시간 동안 1 M 수성 피페리딘(1.5 mL/고체 지지체μmol)으로 처리하고, 용액을 여과 제거하고 증발 건조하였다. 잔여물을 30% NH4OH/에탄올 혼합물(3:1, v/v, 2 mL/고체 지지체μmol) 중에 용해시키고 36시간 동안 실온에서 진탕한 뒤 증발 건조하였다. 조정제 올리고뉴클레오타이드를 실온에서 120~150분에 0.02M Tris-HCl, pH 8.5/50%(v) 아세토니트릴 중 0.22 M 내지 0.42 M NaClO4의 선형 구배를 이용하여 음이온-교환 HPLC로 정제하였다. 모든 단일 가닥을 85% 초과 HPLC(260 nm) 순도까지 정제한 뒤 Sephadex G25(GE Healthcare)로 맞춤-패킹된 AP-2 유리 컬럼(20 × 300 mm, Waters)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피로 탈염시키고, 멸균 뉴클레아제-프리 물로 용출하였다. 등몰량의 상보적 가닥을 1×PBS 완충액, pH 7.4 중 20 μM의 최종 농도로 혼합하고 5분 동안 95℃ 수조에서 가열한 뒤 실온까지 느리게 냉각하여 siRNA 듀플렉스를 생성하기 위한 혼성화를 수행하였다.
유전자 사일런싱 활성 및 안정성에 대한 5'-C-말로닐 변형의 평가
이중-가닥 RNA의 5'-인산화는 RNAi-매개 유전자 사일런싱을 일으키는 소형 간섭 RNA(siRNA)의 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)로의 효율적 로딩을 위해 바람직하다. 내인성 또는 외인성 siRNA는 일반적으로 세포질 키나아제에 의해 쉽게 인산화되며, 대부분의 경우, 합성 5'-모노포스페이트의 존재가 요구되지는 않는다. 그러나, 화학적으로 변형된 siRNA의 특정한 경우, 대사적으로 안정한 5'-포스페이트 모방체는 더 높은 안정성, 증가된 RISC 로딩 및 보다 강력한 유전자 사일런싱으로 이어질 수 있다.
본 실시예에서, 고상 합성을 이용하여 화학적으로 변형된 siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 변형 뉴클레오타이드로서 혼입된, 5'-C-말로닐 모이어티의 효과를 평가하였다. 5'-C-말로닐은 5'-모노포스페이트 2-양이온과 유사하게 생리적 pH에서 2-음이온으로서 존재할 수 있다. 안티센스 가닥 상에 5'-C-말로닐기를 함유하는 siRNA의 시험관내 유전자 사일런싱 활성, 대사 안정성 및 RISC 로딩을 평가하고, 대응하는 5'-인산화 및 비-인산화 대응물과 비교하였다.
세포 배양 및 형질감염
일차 마우스 간세포를 Life Technologies로부터 수득하고 10% 태아 소 혈청(FBS) 함유 Williams E 배지에서 배양하였다. 384-웰 플레이트 내 개별 웰에 대해 원하는 농도로 5 ㎕의 각각의 siRNA 듀플렉스에 웰 당 4.9 ㎕의 Opti-MEM과 0.1 ㎕의 Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)를 첨가하여 형질감염을 수행하였다. 혼합물을 20분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 5,000개 세포를 함유하는 40 ㎕의 완전 성장 배지를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포를 RNA 단리 전에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 10,000,000개 세포의 형질감염을 위해 유사한 절차를 따랐다. 20 nM 내지 75 pM 또는 50 nM 내지 187.5 pM 범위에 걸쳐 8개의 6-배 연속 희석을 이용하여 용량 반응 실험을 수행하였다.
RNA 단리
Dynabeads mRNA 단리 키트(Invitrogen)를 이용해서 RNA를 단리하였다. 세포를 웰 당 3 ㎕ 비드를 함유하는 75 ㎕의 용해/결합 완충액 중에 용해시키고, 정전기적 진탕기 상에서 10분 동안 혼합하였다. 완충액을 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 자기 플레이트 지지체를 이용하여 Biotek EL406 상에서 세척 단계가 자동화되었다. 비드를 세척 간 흡입 단계를 포함하며, 완충액 A에서 1회(90 ㎕), 완충액 B에서 1회, 그리고 완충액 E에서 2회 세척하였다.
cDNA 합성
ABI High capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)로 cDNA 합성을 수행하였다. 웰 당 1 ㎕ 10× 완충액, 0.4 ㎕ 25× dNTP, 1 ㎕ 무작위 프라이머, 0.5 ㎕ 역전사효소, 0.5 ㎕ RNase 저해제, 및 6.6 ㎕의 물의 혼합물을 반응 별로 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 정전기적 진탕기 상에서 10분 동안 진탕한 뒤, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 여기에 이어서, 플레이트를 8분 동안 80℃에서 진탕하였다.
실시간 PCR
384-웰의 50개 플레이트(Roche)에서 웰 당 0.5 ㎕ 마우스 GAPDH TaqMan 탐침(Applied Biosystems, Cat.# 4308313), 0.5 ㎕ 마우스 ApoB 또는 PTEN TaqMan 탐침(Applied Biosystems, 각각 Cat.# Mm01545156_m1 및 Mm01212532_m1), 및 5 ㎕ Lightcycler 480 탐침 마스터 믹스(Roche)를 함유하는 마스터 믹스에 cDNA(2 ㎕)를 첨가하였다. 실시간 PCR은 △△Ct(RQ) 분석법을 이용해서 ABI 7900HT RT-PCR 시스템(Applied Biosystem)에서 수행하였다. 각각의 듀플렉스 및 농도를 4개의 생물학적 복제물에서 평가하였다. 상대 배수 변화(relative fold change)를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 △Ct 방법을 이용해서 분석하고, 10 nM 비-특이적 siRNA로 형질감염된 세포로 수행된 분석법에 대해 정상화(normalization)하였다. XLFit을 이용한 4-파라미터 피팅 모델을 이용하여 IC50 값을 계산하였다.
[표 10]
세포-기반 분석법에서 PTEN 및 ApoB 사일런싱에서 5'-C-말로닐, 5'-포스페이트 및 5'-OH siRNA에 대한 IC50 값.
주:
a P는 5'-모노포스페이트를 나타내며; M은 5'-말로네이트(즉, 5'-C-말로닐)를 나타내고; 이탤릭체 윗첨자 및 일반 아래첨자는 각각 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F), 및 2'-O-메틸(2'-OMe) 당 변형을 나타내고; · 은 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타내고; dT는 2'-데옥시티미딘 뉴클레오타이드를 나타내고; GalNAc는 하이드록시프롤리닐 3가 N-아세틸-갈락토사민 리간드를 나타낸다(Nair et al., "Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing," J. Am. Chem. Soc. 136, 16958-16961 (2014), 그 전체가 원용에 의해 포함됨).
b 일차 마우스 간세포에서 유전자 사일런싱을 위한 절반 최대 억제 농도(IC50). 모든 값은 3회 실험에서 얻었다.
트리토좀(Tritosome) 안정성 분석법
래트 간 트리토좀(Xenotech, 맞춤 제품 PR14044)을 실온까지 해동하고, 20 mM 나트륨 시트레이트 완충액, pH 5.0 중 0.5 단위/mL로 희석하였다. 100 ㎕의 0.5 단위/mL 산 포스파타아제 트리토좀과 25 ㎕의 0.4 mg/mL siRNA를 미세원심분리 튜브에서 혼합하여 샘플을 제조하였다. 37℃ 및 300 rpm으로 설정된 Eppendorf Thermomixer에서 4시간 또는 24시간 동안 인큐베이션 후, 300 ㎕의 Phenomenex 용해 로딩 완충액 및 12.5 ㎕의 0.4 mg/mL 내부 표준 siRNA를 각각의 샘플에 첨가하였다. 100 ㎕의 0.5 단위/mL 산 포스파타아제 트리토좀과 25 ㎕의 0.4 mg/mL siRNA 샘플, 300 ㎕의 Phenomenex 용해 로딩 완충액, 및 12.5 ㎕의 0.4 mg/mL 내부 표준 siRNA를 혼합하여 0시간에 대한 샘플을 제조하였다. Phenomenex Clarity OTX Starter 키트를 이용해서 각각의 시점 샘플(0시간, 4시간, 24시간)로부터 siRNA를 추출하였다. 이어서 샘플을 500 ㎕의 뉴클레아제 프리 물로 재현탁하고, 50 ㎕의 샘플을 LC/MS로 분석하였다.
RISC 면역침전 및 RT-PCR 분석법
siRNA-형질감염 일차 마우스 간세포(10,000,000개 세포)를 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich) 함유 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS) 중에 용해시켰다. 용해물 농도를 단백질 BCA 키트(Thermo Scientific)로 측정하였다. 각 반응을 위해, 2 mg의 총 용해물을 이용하였다. 항-Ago2 항체는 Wako Chemicals(클론 번호: 2D4)에서 구매하였다. 대조군 마우스 IgG는 Santa Cruz Biotechnology(sc-2025)에서 입수하였다. Dynabeads(Life Technologies)를 이용하여 항체를 침전시켰다. Ago2-연관 siRNA 및 내인성 miR122를 전에 공개된 방법에 기반하여 Stem-Loop RT에 이어 TaqMan PCR 분석으로 측정하였다.
5'-데옥시-5'- C -말로닐우리딘 및 인간 Ago2 MID 도메인 간 계면의 컴퓨터 시뮬레이션
hAgo2 MID(아미노산 432~578; 잔기 440~572가 전자 밀도에서 분해됨) 및 UMP(PDB ID 코드 3LUJ) 및 전장 hAgo2 및 miR-20a(PDB ID 코드 4F3T)간 복합체의 이용 가능한 결정 구조의 인식 방식은 5'-말단 포스페이트의 인식이 매우 유사함을 드러내었다. 2개 구조 간의 유일한 차이는 전장 Ago2와의 복합체에서, PIWI 도메인으로부터의 잔기(Arg-812)가 5'-포스페이트의 인식에 기여한다는 것이다. 따라서 UMP:MID 복합체를 5'-말로닐우리딘 및 hAgo2 MID 도메인 간 계면 모델링을 위한 기준으로 이용하였다. UMP:MID 복합체의 3차원 좌표는 단백질 데이터 뱅크(http://www.rcsb.org)로부터 검색하였다. 프로그램 UCSF Chimera(버전 1.5.3)를 이용하여, 결정 구조로부터의 모든 물 분자를 삭제하고, 5'-포스페이트기를 5'-C-말로닐 모이어티로 전환하였다. 이어서 수소 원자를 추가하고, 5'-데옥시-5'-C-말로닐우리딘의 기하구조 및 그 배향 및 hAgo2 MID 도메인의 5'-포스페이트 포켓에서 H-결합/비-결합 상호작용을 UCSF Chimera에서 구현되는 Amber 역장(표준 아미노산 및 비-표준 잔기에 대해 각각 ff12SB 및 Gasteiger 전하)으로 최적화하였다.
도 24a~c는 시험관내 PTEN 사일런싱 분석법에서 일차 마우스 간세포 내 (a) 5'-OH, (b) 5'-C-말로닐, 및 (c) 5'-포스페이트 PTEN siRNA에 대한 용량-반응 곡선을 나타내는 그래프이다. 모든 값은 3회 실험에서 얻는다.
도 25는 래트 간 트리토좀에서 인큐베이션된 5'-OH, 5'-C-말로닐, 및 5'-포스페이트 siRNA의 효소적 안정성 결과를 나타낸다. siRNA 타겟 서열을 표 10에 나타낸다. siRNA를 트리토좀의 존재 하에, 4시간 및 24시간 동안 각각 0.4 mg/mL(대략 5 mM) 농도로 인큐베이션하였다. 전장 가닥%를 HPLC로 결정하였다. 데이터를 미처리 대조군에 대해 정상화하였다.
도 26은 일차 마우스 간세포로부터 Ago2의 면역침전에 의해 그리고 Ago2-로딩 단일 가닥의 RT-PCR 증폭에 의해 결정되는, 5'-OH, 5'-C-말로닐, 및 5'-포스페이트 siRNA(안티센스 가닥 상의 5'-변형)의 RISC 로딩 결과를 나타낸다. 대조군으로서 내인성 miR122의 수준을 결정하였다. siRNA 타겟 서열을 표 10에 나타낸다. siRNA 7, 8 및 9를 10 nM로 세포내 형질감염시켰다. 안티센스 가닥 수준을 세포 용해물 mg 당 siRNA 가닥의 nM로 제공한다.
이들 도면의 결과는 5'-C-말로닐 siRNA가 시험관내 유전자 사일런싱, 고수준의 Ago2 로딩을 유지하거나 개선하였고, 대응하는 5'-인산화 및 비-인산화 대응물에 비해, siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 대해 극적으로 개선된 대사 안정성을 부여하였음을 나타낸다. 컴퓨터내 모델링 연구는 hAgo2 MID의 5'-포스페이트 결합 포켓 내에서 5'-C 말로닐기의 바람직한 피팅을 나타내었다. 따라서, 대사적으로 안정한 5'-포스페이트 바이오이소스테어(bioisostere)인 5'-C-말로닐은 치료적 siRNA에서의 용도를 위해 뛰어난 생체모방 특성을 갖는다.
실시예 8: 트리알킬알루미늄 또는 디알킬아연을 이용한 5'-C-알킬 뉴클레오사이드의 입체선택적 합성 방법
5'-뉴클레오사이드 알데하이드에 대한 온화한 알킬 친핵제의 첨가에 의한 5'- C -알킬 뉴클레오사이드의 합성을 위한 일반 반응식
Figure pat00065
R = TBS, 임의의 보호기, 또는 임의의 치환체
X = H, F, OME, OMOE, ONMA, OPG(PG - 임의의 보호기), OR"(R" - 임의의 알킬기)
B = 미보호 또는 보호 U, T, C, A, G, 또는 임의의 변형 뉴클레오베이스
R' = Me 또는 임의의 알킬 치환체
대안적으로, AlR'3 또는 ZnR'2(상기 반응식 2에 기재됨) 대신, SnR'4, TiR'4, 및 Li와 Mg를 제외한 다양한 다른 금속을 R' 기와 함께 상기 반응식에서 이용할 수 있다.
반응식 3
무수-폐환을 통한 5'-알킬 뉴클레오사이드 에피머의 입체특이적 상호전환을 위한 일반 반응식
R = TBS, 임의의 보호기, 또는 임의의 치환체
X = H, F, OH, OMe, OMOE, ONMA, OPG(PG - 임의의 보호기), OR"(R" - 임의의 알킬기)
B = 미보호 또는 보호 U, T, C, 또는 임의의 변형 피리미딘 뉴클레오베이스
R' = Me 또는 임의의 알킬 치환체
LG = OMs, OTs, 또는 임의의 우수한 이탈기
LGX' = MsCl, TsCl, 또는 임의의 강산 코로무수물 또는 무수물
염기 = DBU 또는 임의의 염기 시약
용매 = THF, 디옥산 또는 임의의 수혼화성 유기 용매
반응식 4
Dess-Martin 퍼요오디난을 이용한 피리미딘 5'-알데하이드( 2a~2d )의 합성.
5'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-5'-옥소-우리딘 2a. Dess-Martin 퍼요오디난(40.7 g, 96 mmol)을 아르곤 분위기 하에 무수 DCM(600 mL) 중 3'-OTBS 보호 우리딘(1a)(29.8 g, 80 mmol)의 교반 냉각(0℃) 용액에 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반한 뒤, TLC에 의해 원료 알코올(1a)을 관찰할 수 없었다. 혼합물을 0℃까지 냉각하고 나트륨 티오설페이트(250 mL)의 10% 용액 및 중탄산 나트륨(350 mL) 포화 용액의 강력 교반 혼합물에 부었다. 45분 동안 실온에서 교반 후, 상당한 침전이 일어났다. 침전을 여과 제거하고 고체를 DCM(200 mL x 2)으로 세척하였다. 여액을 분리 깔때기에 놓고, 유기상을 분리하고 무수 황산 나트륨 상에서 건조하였다. 필터 깔때기로부터의 고체를 에를렌마이어 플라스크로 옮기고, 아세톤(450 mL)을 첨가하고, 현탁액을 15분 동안 교반하고, 여과하고, 고체를 아세톤(200 mL x 2)으로 세척하였다. 아세톤 추출물을 증발시키고, 잔여물을 DCM 추출물과 조합하고, 용매를 증발시키고, 잔여물을 ACN-아세톤 1:1 혼합물(200 mL) 중에 용해시키고, 용매를 다시 증발시키고, 고체 잔여물을 진공 중에 건조하여 조정제 알데하이드(2a) 27.6 g(93%)을 산출하였다. 약 71%의 알데하이드 함량(ACN-d3 중 H1 NMR의 CHO/NH 비로 결정함)을 다음 단계에서 추가 정제 없이 이용하였다. 산물은 아르곤 분위기 하에 -20℃에서 뚜렷한 분해 없이 보관할 수 있었다. 주성분의 1H NMR (400 MHz, ACN-d3): δ 0.15 (s, 6H); 0.93 (s, 9H); 3.37 (s, 3H); 3.62-3.68 (m, 2H); 3.81 (dd, J = 4.6, 5.9 Hz, 1H); 4.48 (d, J = 3.4 Hz, 1H); 4.59 (ddd, J = 0.4, 3.4, 4.5 Hz, 1H); 5.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H); 5.94 (d, J = 6.0 Hz, 1H); 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 1H); 9.17 (bs, 1H); 9.68 (d, J = 0.5 Hz, 1H).
2',5'-디데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'-플루오로-5'-옥소-우리딘(2b)을 무수 DCM(550 mL) 중 (1b)(13.8 g, 38 mmol) 및 DMP(19.5 g, 46 mmol)로부터 유사하게 제조하였다. 실온에서 하룻밤 교반 후, 혼합물을 냉각하고, 켄칭하고, DCM으로 추출하여 표제 산물(2b) 약 60%를 함유하는 조정제 알데하이드 12.7 g(93%)을 산출하였다. 주 성분의 1H NMR (400 MHz, ACN-d3): δ 0.13 (s, 3H); 0.14 (s, 3H); 0.92 (s, 9H); 4.41 (d, J = 6.0 Hz, 1H); 4.67 (ddd, J = 4.9, 6.0, 13.6 Hz, 1H); 5.15 (ddd, J = 2.8, 4.9, 52.5 Hz, 1H); 5.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 5.89 (dd, J = 2.8, 18.3 Hz, 1H); 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 9.26 (bs, 1H); 9.64 (d, J = 1.0 Hz, 1H).
5'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-5'-옥소-티미딘(2c)을 무수 DCM(500 mL) 중 (1c)(17.9 g, 50 mmol) 및 DMP(25.4 g, 60 mmol)로부터 유사하게 제조하였다. 0℃에서 3시간 동안 교반 후, 혼합물을 켄칭하고, DCM으로 추출하여 표제 산물(2c) 약 63%를 함유하는 조정제 알데하이드 20.0 g(quant.)을 산출하였다. 주 성분의 1H NMR (400 MHz, ACN-d3): δ 0.135 (s, 3H); 0.140 (s, 3H); 0.92 (s, 9H); 1.85 (d, J = 1.2 Hz, 3H); 2.08-2.24 (m, 2H); 4.38 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 4.75 (dt, J = 2.2, 5.7 Hz, 1H); 6.24 (dd, J = 6.2, 7.9 Hz, 1H); 7.55 (d, J = 1.3 Hz, lH); 9.18 (bs, 1H); 9.65 (d, J = 0.5 Hz, 1H).
N -아세틸-5'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-5'-옥소-시티딘(2d)을 무수 DCM(600 mL) 중 (1d)(33.1 g, 80 mmol) 및 DMP(40.7 g, 96 mmol)로부터 유사하게 제조하였다. 4시간 동안 실온에서 교반 후, 혼합물을 켄칭하고, (2a)의 경우와 유사하게 처리하여 표제 산물(2d) 약 56%를 함유하는 조정제 알데하이드 33.2 g(100%)을 산출하였다. 주 성분의 1H NMR (400 MHz, ACN-d3): δ 0.108 (s, 3H); 0.1 17 (s, 3H); 0.92 (s, 9H); 2.14 (s, 3H); 3.44 (s, 3H); 3.90-3.94 (m, 1H); 4.49-4.52 (m, 2H); 5.92 (d, J = 3.8 Hz, 1H); 7.33 (d, J = 7.5 Hz, 1H); 8.10 (d, J = 7.5 Hz, 1H); 9.13 (bs, 1H); 9.72 (s, 1H).
Dess-Martin 퍼요오디난을 이용한 퓨린 5'-알데하이드( 2e~2f )의 합성, "무수 켄칭"
N -벤조일-5'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-5'-옥소-아데노신(2e). Dess-Martin 퍼요오디난(20.4 g, 48 mmol)을 아르곤 분위기 하에 무수 DCM(300 mL) 중 3'-OTBS 보호 아데노신(1e)(20.0 g, 40 mmol)의 교반 냉각(0℃) 용액에 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반한 뒤, TLC에 의해 원료 알코올(1e)을 관찰할 수 없었다. 이소프로필 알코올(0.61 mL, 8 mmol)을 첨가하고, 1시간 더 교반을 계속하였다. 용매를 진공 중에 제거하고, 에틸 아세테이트(220 mL)를 첨가한 뒤 교반하며 4시간에 걸쳐 헥산(150 mL)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 하룻밤 실온에서 교반하고, 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트-헥산(1:1) 혼합물로 2회 세척하였다. 여액을 진공 중에 증발시키고 잔여물을 건조 아세토니트릴(300 mL)과 공동-증발시켰다. 아세토니트릴(100 mL)을 첨가하여 현탁액을 형성하고, 하룻밤 교반하고, 여과하고, 고체를 아세토니트릴로 2회 세척하였다. 여액을 진공 중에 증발시켜 흰색 발포성 잔여물을 산출하고, 고진공 하에 건조하여 표제 산물(2e) 약 54%를 함유하는 조정제 알데하이드 20.2 g(100%)을 산출하고, 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다. 주 성분의 1H NMR (400 MHz, ACN-d3): δ 0.188 (s, 3H); 0.190 (s, 3H); 0.97 (s, 9H); 3.34 (s, 3H); 4.49 (dd, J = 4.3, 6.3 Hz, 1H); 4.51 (dd, J = 1.0, 2.9 Hz, 1H); 4.90 (dd, J = 3.0, 4.2 Hz, 1H); 6.24 (d, J = 6.3 Hz, 1H); 7.54 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 7.61-7.67 (m, 1H); 7.97-8.03 (m, 2H); 8.44 (s, 1H); 8.66 (s, 1H); 9.50 (bs, 1H); 9.82 (d, J = 1.0 Hz, 1H).
N -이소부투릴-5'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-5'-옥소-구아노신(2f)을 무수 DCM(300 mL) 중 (1f)(19.3 g, 40 mmol) 및 DMP(20.4 g, 48 mmol)로부터 유사하게 제조하였다. 실온에서 3시간 동안 교반 후, 이소프로필 알코올(0.61 mL, 8 mmol)을 첨가하고, 1시간 더 교반을 계속하였다. 용매를 진공 중에 제거하고, 에틸 아세테이트(225 mL)를 첨가한 뒤 교반하며 30분에 걸쳐 헥산(150 mL)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 5시간 동안 실온에서 교반하고, 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트-헥산(1:1.5) 혼합물로 2회 세척하였다. 여액을 진공 중에 증발시키고, 잔여물을 톨루엔(250 mL) 및 건조 아세토니트릴(250 mL) 혼합물에 이어 아세토니트릴(250 mL)과 공동-증발시켰다. 흰색 발포성 잔여물을 고진공 중에 건조하여 표제 산물(2f) 약 53%를 함유하는 21.5 g의 조정제 알데하이드를 산출하고, 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다. 주성분의 1H NMR (400 MHz, ACN-d3): δ 0.167 (s, 3H); 0.175 (s, 3H); 0.95 (s, 9H); 1.18 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1.19 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 2.66-2.77 (m, 1H); 3.31 (s, 3H); 4.31 (dd, J = 4.3, 7.0 Hz, 1H); 4.48 (dd, J = 1.0, 2.3 Hz, 1H); 4.69 (ddd, J = 0.4, 2.4, 4.3 Hz, 1H); 6.01 (d, J = 7.0 Hz, 1H); 8.03 (s, 1H); 9.45 (s, 1H); 9.79 (d, J = 1.1 Hz, 1H); 12.05 (bs, 1H).
뉴클레오사이드 5'-알데하이드에 대한 온화한 Me-친핵제의 입체선택적 첨가.
a. 일반 관찰사항
입체선택성의 뉴클레오베이스-의존성: 아래 표에 나타난 바와 같이, 5'-Me 피리미딘 뉴클레오사이드의 (S)-에피머는 트리메틸알루미늄(AlMe3에 대해 표에 나타낸 바와 같음)을 이용하여 고수준의 입체선택적으로 합성할 수 있는 반면, 5'-Me 퓨린의 (S)-에피머는 디메틸아연(ZnMe2에 대해 표에 나타낸 바와 같음)을 이용하여 입체선택적으로 합성할 수 있다.
입체선택성의 용매-의존성: 표에 나타난 바와 같이, 5'-Me 피리미딘 뉴클레오사이드의 (S)-에피머는 THF 중 트리메틸알루미늄(AlMe3에 대해 표에 나타낸 바와 같음)을 이용하여 고수준의 입체선택성으로 합성할 수 있는 반면, 5'-Me 퓨린의 (S)-에피머는 비-배위 용매 중 디메틸아연(ZnMe2에 대해 표에 나타낸 바와 같음)을 이용하여 입체선택적으로 합성할 수 있다. 퓨린 입체이성질체의 등몰 혼합물은 THF 중 트리메틸알루미늄(A 유도체에 대해)으로 또는 비-배위 용매(DCM) 중(G-유도체에 대해) 수득할 수 있다.
2'-치환에 대한 입체선택성의 의존성: 배위 및 더 부피가 큰 2'-OMe 치환체는 더 작은, 비-배위 2'-F 또는 2'-H에 비해 더 우수한 선택성을 제공하였다.
b. 5'-옥소-뉴클레오사이드와 트리메틸알루미늄의 반응 절차
5'-( S )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-우리딘(3a) 및 5'-( R )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-우리딘(4a). 무수 THF(200 mL) 중 약 68%의 표제 화합물(25.3 g, ≤ 68 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2a)의 용액을 아르곤 분위기 하에 AlMe3(헵탄 중 2 M, 102 mL, 204 mmol) 및 무수 THF(200 mL)의 교반 냉각(0℃) 혼합물에 약 15분 동안 캐뉼라를 통해 천천히 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 17시간 동안 실온에서 교반하고, 0℃까지 냉각하고, 염화 암모늄의 포화 수용액 및 20% 인산의 500 mL 1:1 혼합물의 조심스러운 첨가에 이어 400 mL의 에틸아세테이트의 첨가에 의해 반응을 켄칭하였다. 유기상을 분리하고, 포화 염수로 2회 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조하고, 용매를 진공 중에 제거하여 25.6 g의 조정제 잔여물을 산출하였다. 헥산 중 1% 트리에틸아민을 함유하는 에틸 아세테이트 구배(50% 내지 90%)로 330 g CombiFlash 실리카 겔 컬럼 상에서 잔여물의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 (3a)(17.5 g, 67%), 및 (3a) 및 (4a)의 혼합물(1.25 g, 5%)을 산출하였다. 후자 물질을 15 mL의 고온 에틸 아세테이트 중에 용해시킨 뒤 15 mL의 헥산을 천천히 첨가하였다. 혼합물이 실온까지 냉각하도록 두고, 하룻밤 교반하고, 침전을 여과하고, 에틸 아세테이트-헥산의 1:2의 혼합물로 세척하고 건조하여 순수한 (4a)를 산출하였다(0.81 g, 결정화 상 65%, 반응 상 3%). 3a: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.08 (s, 6H); 0.87 (s, 9H); 1.14 (d, J = 6.7 Hz, 3H); 3.33 (s, 3H); 3.68 (dd, J = 1.8, 4.4 Hz, 1H); 3.76-3.84 (m, 2H); 4.27 (t, J = 4.6 Hz, , H2'); 5.17 (d, J = 4.4 Hz, 1H, OH); 5.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 5.83 (d, J = 4.7 Hz, 1H, Hl'); 8.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 1 1.3 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ -4.95; -4.82; 17.78; 20.05; 25.61; 57.56; 64.73; 70.57; 82.61; 85.83; 87.96; 101.79; 140.19; 150.48; 163.08. HRMS m/z [C17H30N2O6Si + H]+ 산출치: 387.1951; 실측치: 387.1962. 4a: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.09 (s, 6H); 0.88 (s, 9H); 1.10 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 3.28 (s, 3H); 3.64 (dd, J = 2.2, 4.2 Hz, 1H, H4'); 3.77 (dt, J =4.6, 6.5 Hz, 1H, H5'); 3.86 (dd,J = 4.8, 6.8 Hz, 1H, H2'); 4.40 (dd, J = 2.2, 4.7 Hz, 1H, H3'); 5.16 (d, J = 4.9 Hz, 1H, OH); 5.67 (dd, J = 2.2, 8.1 Hz, 1H); 5.86 (d, J = 6.8 Hz, 1H, Hl'); 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H); 11.36 (d, J = 1.8 Hz, 1H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ 0.60; 0.69; 23.19; 25.19; 62.84; 71.50; 74.48; 87.10; 90.47; 94.80; 107.69; 145.93; 156.11; 168.37. HRMS m/z [C17H30N2O6Si + H]+ 산출치: 387.1951; 실측치: 387.1960.
아르곤 분위기 하에 0℃에서 AlMe3(헵탄 중 2 M, 8 mL, 16 mmol) 및 무수 THF(10 mL)의 혼합물에 무수 THF(10 mL) 중 약 55%의 표제 화합물(1.80 g, ≤ 5 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2b)의 용액을 첨가한 뒤 하룻밤 실온에서 교반하여 5'-( S )- C -메틸-2'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'-플루오로-우리딘(3b) 및 5'-( R )- C -메틸-2'-데옥시-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'-플루오로-우리딘(4b)을 유사하게 제조하였다. 조정제 잔여물(1.88 g)을 헥산 중 1% 트리에틸아민을 함유하는 50% 에틸 아세테이트로 80 g CombiFlash 실리카 겔 컬럼에 걸쳐 크로마토그래피하여 소형 중간체 혼합 분획과 함께 (3b)(0.88 g, 47%), 및 (4b)(0.17 g, 9%)를 산출하였다. 3b: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.088 (s, 3H); 0.094 (s, 3H); 0.86 (s, 9H); 1.19(d,J=6.5Hz, 3H); 3.72 (d, J = 6.8 Hz, 1H); 3.75-3.83 (m, 1H); 4.31 (ddd,J = 4.4, 6.8, 18.3 Hz, 1H, H3'); 5.06 (ddd, J = 2.4, 4.4, 53.1 Hz, 1H, H2'); 5.20 (d, J = 4.7 Hz, 1H, OH); 5.63 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 5.91 (dd, J = 2.3, 16.9 Hz, 1H, H1'); 7.99 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 11.4 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, 아세톤-d6): δ -4.84; -4.53; 18.75; 20.70; 26.14; 66.02; 71.29; 71.42; 87.98; 88.50; 88.77; 93.20; 94.71; 102.58; 141.37; 151.41; 163.74. 19F NMR (376 MHz, 아세톤-d6): δ -207.60 (dt, J = 16.6, 53.1 Hz, 1F). HRMS m/z [C16H27FN2O5Si + H]+ 산출치: 375.1752; 실측치: 375.1744. 4b: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.096 (s, 3H); 0.102 (s, 3H); 0.87 (s, 9H); 1.11 (d, J = 6.7 Hz, 3H); 3.74 - 3.78 (m, 1H); 3.84 - 3.94 (m, 1H); 4.43 (dt, J = 4.8, 12.2 Hz, 1H, H3'); 5.10 (dt, J = 4.2, 52.8 Hz,1H, H2'); 5.21 (d, J = 4.7Hz, 1H, OH); 5.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 5.94 (dd, J = 4.0, 15.8 Hz, 1H, H1'); 7.89(d, J = 8.1 Hz, 1H); 11.4 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, CD3OD): δ -4.56; -4.10; 19.11; 19.89; 26.45; 67.67; 70.62; 70.74; 88.28; 88.55; 89.99; 92.89; 94.40; 103.39; 142.71; 152.28; 165.67. 19F NMR (376 MHz, 아세톤-d6): δ -208.28 (dt, J = 14.3, 52.8 Hz, 1F). HRMS m/z [C16H27FN2O5Si + H]+ 산출치: 375.1752; 실측치: 375.1760.
아르곤 분위기 하에 0℃에서 AlMe3(헵탄 중 2 M, 6 mL, 12 mmol) 및 무수 THF(10 mL)의 혼합물에 무수 THF(10 mL) 중 약 60%의 표제 화합물(1.21 g, ≤ 3.4 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2c)의 용액을 첨가한 뒤 하룻밤 실온에서 교반하여 5'-( S )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-티미딘(3c) 및 5'-( R )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-티미딘(4c)을 유사하게 제조하였다. 조정제 잔여물(1.21 g)을 헥산 중 1% 트리에틸아민을 함유하는 에틸 에테르 구배(80% 내지 100%)로 2 연속 실리카 겔 플래시-컬럼(CombiFlash 80 g 및 24 g)에 걸쳐 크로마토그래피하였다. 분리된 에피머를 함유하는 분획을 별도로 꺼내고, 중간체 혼합 분획을 조합하여 두 번째 컬럼 크로마토그래피를 거쳤다. 소형 중간체 혼합 분획과 함께 (3c) 0.65 g(52%) 및 (4c) 0.11 g(9%)을 수득하였다. 3c: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.07 (s, 6H); 0.86 (s, 9H); 1.13 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 1.76 (d, J = 1.0 Hz, 3H); 2.01 (ddd, J = 3.0, 6.0, 13.2 Hz, 1H, H2'A); 2.13 (ddd, J = 5.9, 7.7, 13.4 Hz, 1H, H2'B); 3.58 (t, J = 2.7 Hz, 1H, H4'); 3.74-3.83 (m, , H5'); 4.40 (quintet, J = 2.8 Hz, 1H, H3'); 5.02 (d, J = 4.6 Hz, 1H, OH); 6.15 (dd, J = 6.0, 7.7 Hz, 1H, H1'); 7.84 (d, J = 1.2 Hz, 1H); 1 1.27 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, ACN-d3): δ -4.58; -4.39; 12.72; 18.63; 20.65; 26.20; 41.14; 67.55; 73.94; 85.97; 97.74; 11 1.06; 137.89; 151.76; 165.10. HRMS m/z [C17H30N2O5Si + Na]+ 산출치: 393.1822; 실측치: 393.1825. 4c: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.081 (s, 3H); 0.084 (s, 3H); 0.87 (s, 9H); 1.10 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 1.76 (d, J = 1.1 Hz, 3H); 1.95 (ddd, J = 1.7, 5.5, 13.1 Hz, 1H, H2'A); 2.14 (ddd, J = 5.4, 9.0, 13.2 Hz, 1H, H2'B; 3.55 (dd, J = 1.6, 4.7 Hz, 1H, H4'); 3.73 (dt, J = 4.9, 6.4 Hz, 1H, H5'); 4.49 (dt, J = 1.4, 5.3 Hz, 1H, H3'); 5.03 (d, J = 5.0 Hz, 1H, OH); 6.15 (dd, J = 5.5, 8.9 Hz, 1H, H1'); 7.66 (d, J = 1.2 Hz, 1H); 11.29 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, ACN-d3): δ -4.52; -4.25; 12.67; 18.55; 20.21 ; 26.19; 41.10; 68.26; 72.46; 86.07; 92.35; 1 1 1.27; 137.75; 151.83; 165.09. HRMS m/z [C17H30N2O5Si + H]+ 산출치: 371.2002; 실측치: 371.1992.
아르곤 분위기 하에 0℃에서 AlMe3(헵탄 중 2 M, 12 mL, 24 mmol) 및 무수 THF(20 mL)의 혼합물에 무수 THF(20 mL) 중 약 56%의 표제 화합물(2.80 g, ≤ 6.8 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2d)의 용액을 첨가한 뒤 하룻밤 실온에서 교반하여 N -아세틸-5'-( S )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-시티딘(3d)을 유사하게 제조하였다. 조정제 잔여물(3.03 g)을 헥산 중 에틸 아세테이트 구배(70% 내지 100%)로 2 연속 실리카 겔 플래시-컬럼(CombiFlash 80 g 및 40 g)에 걸쳐 크로마토그래피하여 추가 분리되지 않은 (3d) 및 (4d)의 혼합물을 함유하는 0.60 g의 극성이 더 큰 분획과 함께 1.09 g(37%)의 극성이 더 작은 (S)-에피머(3d)를 산출하였다. 3d: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.05 (s, 6H); 0.85 (s, 9H); 1.21 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 2.09 (s, 3H); 3.43 (s, 3H); 3.70 - 3.76 (m, 2H); 3.77 - 3.85 (m, 1H); 4.21 (dd, J = 4.8, 7.0 Hz, 1H); 5.19 (d, J = 4.4 Hz, 1H); 5.83 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 7.18 (d, J = 7.5 Hz, 1H); 8.58 (d, J = 7.5 Hz, 1H); 10.90 (s, 1H).
주: N-아세틸 시티딘은 트리에틸아민의 존재 하에 실리카 겔 컬럼 상에서 매우 안정하지 않고, 불균등화를 거쳐서 N-탈보호 및 N-디아세틸화 유도체를 형성하는 경향이 있다. 따라서, 이성질체 (3d) 및 (4d)를 분리하기 위해 트리에틸아민을 이용하지 않았다. 그러나, 트리에틸아민의 첨가는 TLC 상에서 이성질체의 더 우수한 분리를 위해 유용하다.
아르곤 분위기 하에 0℃에서 AlMe3(헵탄 중 2 M, 51 mL, 102 mmol) 및 무수 THF(100 mL)의 혼합물에 무수 THF(100 mL) 중 약 50%의 표제 화합물(16.9 g, ≤ 34 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2e)의 용액을 첨가한 뒤 하룻밤 실온에서 교반하여 N -벤조일-5'-( S )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-아데노신(3e) 및 N -벤조일-5'-( R )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-아데노신(4e)을 유사하게 제조하였다. 조정제 잔여물(15.9 g)을 헥산 중 에틸 아세테이트 구배(70% 내지 100%)로 실리카 겔 플래시-컬럼(CombiFlash 220 g)에 걸쳐 크로마토그래피하여 에피머의 정제된 혼합물(~1:1)을 8.52 g, 49%로 산출하였다. 이성질체를 Gilson PLC 2020 정제 시스템을 이용하여 분취용 C18 RP-HPLC로 추가 분리하였다: 1 g의 혼합물을 주입하고 25 mM 트리에틸암모늄 바이카보네이트 및 65% 아세토니트릴로 이소크라틱 방법을 이용하여 용출하였다. HPLC 순도 95% 초과의 적절한 분획을 풀링하고 증발 건조하여 0.15 g의 (3e)(dr > 97%), 및 0.25 g의 (4e)의 순수 입체이성질체를 산출하였다. 3e: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.124 (s, 3H); 0.126 (s, 3H); 0.91 (s, 9H); 1.17 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 3.32 (s, 3H); 3.81 - 3.90 (m, 2H); 4.40 (dd, J = 4.9, 5.7 Hz, 1H); 4.54 (dd, J = 3.2, 4.5 Hz, 1H); 5.19 (d, J = 5.7 Hz, 1H); 6.16 (d, J = 5.7 Hz, 1H); 7.55 (t split, J = 7.8 Hz, 2H); 7.64 (t split, J = 7.4 Hz, 1H); 8.03 (d, J = 1.4 Hz, 1H); 8.05 (s, 1H); 8.76 (s, 1H); 8.80 (s, 1H); 1 1.23 (s, 1H). 4e: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 0.146 (s, 3H); 0.147 (s, 3H); 0.93 (s, 9H); 1.10 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 3.25 (s, 3H); 3.75 (dd, J = 1.1, 5.6 Hz, 1H); 3.89 (sextet, J = 5.7 Hz, 1H);4.60 (dd, J = 4.5, 7.4 Hz, 1H); 4.63 (dd, J = 1.2, 4.6 Hz, 1H); 5.32 (d, J = 4.7 Hz, 1H); 6.11 (d, J = 7.4 Hz, 1H); 7.55 (t, J = 8.0 Hz, 2H); 7.64 (t split, J = 7.5 Hz, 1H); 8.03 (d, J = 1.4 Hz, 1H); 8.05 (d, J = 0.9 Hz, 1H); 8.76 (s, 1H); 8.77 (s, 1H); 11.23 (s, 1H).
아르곤 분위기 하에 -78℃에서 AlMe3(헵탄 중 2 M, 10 mL, 20 mmol) 및 무수 DCM(10 mL)의 혼합물에 무수 DCM(10 mL) 중 약 53%의 표제 화합물(1.63 g, ≤ 3.4 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2f)의 용액을 첨가한 뒤 하룻밤 실온까지 천천히(조 내에서) 가온하여 N -이소부티릴-5'-( S )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-구아노신(3f) 및 N -이소부티릴-5'-( R )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-구아노신(4f)을 유사하게 제조하였다. 조정제 잔여물(1.59 g)을 클로로포름 중 메탄올 구배(0% 내지 4%)로 실리카 겔 플래시-컬럼(CombiFlash 40 g)에 걸쳐 크로마토그래피하여 0.14 g의 극성이 더 작은 (R)-이성질체(4f), 0.36 g의 (3f) 및 (4f)의 중간체 혼합물 및 0.25 g의 극성이 더 큰 (S)-이성질체(3f)를 산출하였다. 중간체 분획을 클로로포름 중 3% 메탄올로 두 번째 이소크라틱 컬럼(CombiFlash 40 g) 상에서 분리하여 추가적인 0.20 g의 (4f) 및 0.16 g의 (3f)를 산출하였다. 총 수율 (3f): 0.34 g(23%) 및 (4f): 0.41 g(27%). 3f: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 50.10 (s, 3H); 0.11 (s, 3H); 0.89 (s, 9H); 1.11 (d, J = 6.8 Hz, 6H); 1.12 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 2.77 (septet, J = 6.8 Hz, 1H); 3.29 (s, 3H); 3.76 (t, J = 2.6 Hz, 1H); 3.79 - 3.87 (m, 1H); 4.20 (dd, J = 4.8, 6.3 Hz, 1H); 4.44 (dd, J = 2.6, 4.6 Hz, 1H); 5.12 (d, J = 4.6 Hz, lH); 5.88 (d, J = 6.3Hz, 1H); 8.36 (s, 1H); 11.61 (s, 1H); 12.10 (s, 1H). 4f: lH NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.12 (s, 3H); 0.13 (s, 3H); 0.90 (s, 9H); 1.08 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 1.11 (d, J = 6.8 Hz, 6H); 2.76 (septet, J = 6.8 Hz, 1H); 3.25 (s, 3H); 3.66 (d, J = 5.6 Hz, 1H);3.76 (sextet, J = 6.0 Hz, 1H); 4.36 (dd, J = 4.6, 7.8 Hz, 1H); 4.54 (d,J=4.5 Hz, 1H); 5.16 (d,J = 5.1 Hz, 1H); 5.83 (d,J=7.8Hz, 1H); 8.32 (s, 1H); 11.60 (s, 1H); 12.10 (s, 1H).
c. 퓨린 5'-옥소-뉴클레오사이드와 디메틸아연의 입체선택 반응 절차
N-벤조일-5'-(S)-C-메틸-3'-O-[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'-O-메틸-아데노신(3e). 무수 DCM(10 mL) 중 약 55%의 표제 화합물(1.69 g, ≤ 3.4 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2e)의 용액을 아르곤 분위기 하에 ZnMe2(톨루엔 중 2 M, 6 mL, 12 mmol) 및 무수 DCM(10 mL)의 교반 냉각(-78℃) 혼합물에 약 20분 동안 천천히 적가하였다. 용액을 하룻밤 실온까지 천천히(조 내에서) 가온하도록 두고, 0℃까지 냉각하고, 10% 인산의 주의깊은 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기상을 분리하고, 5% 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조하였다. 용매를 진공 중에 제거하고 조정제 잔여물(1.57 g)을 헥산 중 에틸 아세테이트 구배(70% 내지 100%)로 40 g CombiFlash 실리카 겔 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 약 90% 부분입체이성질체 순도로 (3e)(0.96 g, 55%)를 산출하였다. 화합물을 5 mL의 디에틸 에테르 중에 용해시키고, 헥산(4 mL)을 교반하며 천천히 첨가하여 결정화를 유발하였다. 혼합물을 하룻밤 실온에서 교반하고, 여과하고, 고체를 에테르-헥산의 1:2 혼합물로 2회 세척하여 약 97%의 부분입체이성질체 순도로 0.69 g(결정화 시 73%)의 (3e)를 산출하였다.
아르곤 분위기 하에 -78℃에서 ZnMe2(톨루엔 중 2 M, 8.5 mL, 17 mmol) 및 무수 DCM(10 mL)의 혼합물에 무수 DCM(10 mL) 중 약 53%의 표제 화합물(1.63 g, ≤ 3.4 mmol)을 함유하는 조정제 알데하이드(2f)의 용액을 첨가한 뒤 하룻밤 실온까지 천천히(조 내에서) 가온하여 N -이소부티릴-5'-(S)-C-메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-구아노신(3f)을 유사하게 제조하였다. 약 3:1비의 (3f) 대 (4f)를 함유하는 조정제 잔여물(1.56 g)을 클로로포름 중 2% 메탄올로 실리카 겔 플래시-컬럼(CombiFlash 40 g)에 걸쳐 크로마토그래피하여 0.13 g의 (4f) 및 (3f)의 혼합물에 이어 순수한 (3f) 0.48 g(32%)을 산출하였다.
d. 5'-알킬-에피머의 입체특이적 상호전환
5'-( S )- C -메틸-5'-O-메실-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-우리딘(5a). 메탄설포닐 클로라이드(5.5 mL, 72 mmol)를 아르곤 분위기 하에 무수 DCM(80 mL) 중 (S)-에피머(3a)(8.32 g, 21.6 mmol) 및 무수 피리딘(5.8 mL, 72 mmol)의 저온(0℃) 교반 용액에 약 5분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 48시간 동안 실온에서 교반하고, 0℃까지 냉각하고, 중탄산 나트륨(200 mL) 포화 용액의 주의깊은 첨가에 의해 켄칭하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 강력 교반하고, 유기상을 분리하고, 10% 인산, 5% 염수로 2회 연속 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조하였다. 용매를 진공 중에 제거하고, 잔여물을 고진공 하에 건조하여 본질적으로 순수한 (5a)(9.79 g, 98%)를 오렌지색 발포체로 산출하였다. 5a: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.09 (s, 3H); 0.10 (s, 3H); 0.87 (s, 9H); 1.42 (d, J = 6.5 Hz, 3H); 3.20 (s, 3H); 3.33 (s, 3H); 3.86 (t, J = 4.9 Hz, 1H); 3.89 (t, J = 4.9 Hz, 1H); 4.29 (t, J = 5.1 Hz, 1H); 4.91 (dt, J = 6.4, 1 1.3 Hz, 1H); 5.68 (dd, J = 2.2, 8.1 Hz, 1H); 5.86 (d, J = 4.7 Hz, 1H); 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 1H); 1 1.42 (s, 1H).
6,9-에폭시-2 H ,6 H -피리미도[2,1- b ][1,3]옥사조신-2-온-7,8,10-트리하이드로-9-( R )-메틸-8- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-7-메톡시-[6 R -(6α,7α,8α,9α)](6a). 무수 DMSO(10 mL) 중 메실레이트(5a)(2.33 g, 5 mmol) 및 DBU(1.5 mL, 10 mmol)의 용액을 27시간 동안 아르곤 분위기 하에 60℃에서 교반하고, 0℃까지 냉각하고, 에틸 아세테이트(40 mL)에 이어 5% 수성 NaCl(80 mL)을 첨가하였다. 유기상을 분리하고, 5% NaCl 및 10% 수성 인산의 1:1 혼합물에 이어, 5% NaCl, 포화 중탄산 나트륨, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 무수 황산 나트륨 상에서 건조 후, 용매를 진공 중에 제거하여 조정제 무수 산물(6a)(1.57 g)을 산출하고, 45분 동안 30 mL의 디에틸 에테르와 함께 환류시키고, 실온까지 냉각하고, 2시간 동안 교반하고, 흰색 침전을 여과하고, 디에틸 에테르로 2회 세척하고 건조하여 0.88 g(48%)의 순수한 (6a)를 산출하였다. 6a: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 0.06 (s, 3H); 0.7 (s, 3H); 0.84 (s, 9H); 1.36 (d, J = 6.7 Hz, 3H); 3.29 (s, 3H); 4.13 (dd, J = 0.8, 6.0 Hz, 1H); 4.27 (s, 1H); 4.32 (q, J = 6.8 Hz, 1H); 4.62 (d, J = 5.9 Hz, 1H); 5.78 (s, 1H); 5.89 (d, J = 7.4 Hz, 1H); 7.95 (d, J = 7.4 Hz, 1H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6): δ -5.22; -4.81 ; 16.79; 17.91 ; 25.59; 57.93; 71.42; 81.77; 86.33; 91.16; 96.24; 109.09; 142.58; 156.29; 170.67.
5'-( R )- C -메틸-3'- O -[(1,1-디메틸에틸)디메틸실릴]-2'- O -메틸-우리딘(4a)((5a)로부터). THF(50 mL) 중 메실레이트(5a)(3.72 g, 8 mmol), DBU(2.4 mL, 16 mmol), 및 물(10 mL)의 용액을 67시간 동안 아르곤 분위기 하에 환류시켰다. 용매를 진공 중에 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트(120 mL) 및 80 mL의 5% NaCl 및 30 mL의 10% 인산의 혼합물 간에 분획화하고, 유기상을 분리하고, 5% NaCl로 2회, 이어서 포화 NaCl로 세척하였다. 무수 황산 나트륨 상에서 건조 후, 조정제 잔여물(3.04 g)을 1시간 동안 30 mL의 디에틸 에테르 및 15 mL의 헥산의 혼합물과 함께 환류시키고, 실온까지 냉각하고, 하룻밤 교반하고, 흰색 침전을 여과하고, 에테르-헥산의 1:1 혼합물로 2회 세척하여 2.32 g(75%)의 (4a)를 산출하였다.
본 실시예에 기재된 방법은 올리고뉴클레오타이드 및 소분자를 포함하여 임의의 치료적 적용(예를 들어, 항바이러스, 및 항종양 적용)을 위한 다양한 5'-알킬 뉴클레오사이드의 합성을 위해 이용할 수 있다.
실시예 9: 포스포디에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 또는 포스포로디티오에이트(PS2) 결합의 3'-말단으로의 4' 및 5'-변형 뉴클레오타이드의 도입에 의한 PO, PS 및 PS2의 입체적 차단.
본 발명자들은 단일-가닥 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드의 임의 위치에서 디뉴클레오타이드의 포스포디에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 및/또는 포스포로디티오에이트(PS2) 결합의 3'-말단에 대한 4'-변형 및/또는 5'-변형 뉴클레오타이드의 도입이 뉴클레오타이드간 결합에 입체적 효과를 발휘함으로써, 이를 뉴클레아제에 대해 보호하거나 안정화할 수 있음을 확인하였다.
본 실시예에서, 선택된 위치에 4'-O-메틸화 또는 5'-메틸화 뉴클레오타이드를 함유하는 F7 siRNA의 시험관내 유전자 사일런싱 활성을 평가하였고, 결과를 표 11에 나타낸다.
[표 11]
선택된 위치에 4'-O-메틸화 또는 5'-메틸화 뉴클레오타이드를 함유하는 F7 siRNA의 시험관내 유전자 사일런싱 활성
실시예 10: siRNA 듀플렉스에서 글리콜 핵산(GNA)의 키랄성-의존적 활성
siRNA 듀플렉스의 화학적 변형은 이들 분자를 뉴클레아제 분해에 대해 안정화하고, 이들의 세포 내 섭취를 촉진하고, 활성 RISC의 형성뿐만 아니라 RNAi-매개 타겟 사일런싱에 영향을 미치기 위해 필요하다. siRNA 듀플렉스의 특정 위치에 혼입된 열적 탈안정화 변형은 RISC 로딩 동안 가닥 편향 및/또는 센스 가닥 해리의 개선에 의해 효능 증가로 이어질 수 있다.
본 실시예에서, 3-탄소, 비사이클릭 핵산 유사체인 글리콜 핵산(GNA)을 siRNA 듀플렉스의 맥락 내에서 평가하였다. GNA-함유 siRNA 듀플렉스를 합성하였다. (S)-GNA 올리고는 전형적인 RNA A-형태 듀플렉스와 구조적 유사성을 가지는 동종-듀플렉스를 형성하였고, A/T-풍부 서열 내에서, DNA가 아닌 RNA와 교차쌍을 이룬다. (S)- 또는 (R)-GNA를 함유하는 siRNA 듀플렉스의 열 안정성 및 뉴클레아제 저항성을 연구하였다. x-선 결정측정을 이용한 구조적 연구는 RNA 듀플렉스 내에서 이들 GNA 치환체의 효과에 대한 추가 식견을 제공하였다. GNA-함유 siRNA 듀플렉스의 키랄성-의존적 유전자 사일런싱 활성을 생물학적 연구에서 조사하였다.
결과를 표 27~30에 나타낸다.
도 27은 단일 (S)-GNA 뉴클레오타이드 로 변형된 siRNA를 이용한 TTR의 시험관내 녹다운을 나타내는 그래프이다. TTR mRNA 수준을 24시간 동안 일차 마우스 간세포에서 10 nM siRNA와의 인큐베이션 후 측정하였다. TTR mRNA를 RT-qPCR을 이용하여 평가하고, PBS 처리 세포에 대해 정상화하였다. 모든 데이터 포인트는 4회 측정의 평균이었다. 도 27은 시험관내 siRNA 활성에 대한 단일 (S)-GNA 뉴클레오타이드 혼입의 영향을 나타낸다.
도 28a는 단일 (S)-GNA 염기쌍으로 변형된 siRNA를 이용한 TTR의 시험관내 녹다운을 나타내는 그래프이다. TTR mRNA 수준을 24시간 동안 일차 마우스 간세포에서 10 nM siRNA와의 인큐베이션 후 측정하였다. TTR mRNA를 RT-qPCR을 이용하여 평가하고, PBS 처리 세포에 대해 정상화하였다. 모든 데이터 포인트는 4회 측정의 평균이었다. 도 28b는 단일 (S)-GNA 뉴클레오타이드를 함유하는 센스 및 안티센스 가닥이 GNA:RNA 헤테로-염기쌍으로서 쌍을 이룬 믹스 매치 듀플렉스를 나타낸다. 도 28은 시험관내 siRNA 활성에 대한 단일 (S)-GNA 염기쌍 혼입의 영향을 나타낸다.
도 29는 마우스 혈청 중 TTR의 생체내 수준을 나타내는 그래프이다. 동물은 2.5 mg/kg siRNA의 단회 용량을 수여받았다. 투여-전 또는 투여-후 나타낸 시점에, 동물을 방혈시키고 450 nm에서 판독을 위해 HRP-접합체 항체 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 이용하는 샌드위치 ELISA 분석법을 이용하여 혈청 샘플을 측정하였다. 모든 샘플은 2회씩 측정하였고, 각각의 데이터 포인트는 각 코호트(n=3)에서 마우스의 평균이다. 도 29는 혈청 TTR 수준에 대한 GNA-변형 siRNA 듀플렉스를 이용한 마우스에서의 생체내 유전자 사일런싱 효과를 나타낸다.
도 30은 TTR mRNA 수준의 생체내 정량을 나타내는 그래프이다. 동물은 2.5 mg/kg siRNA의 단회 용량을 수여받았다. 투여 후 나타낸 시점에, 전체-간 균질화물 상에서 RNA 추출을 수행하였다. TTR mRNA는 GAPDH를 대조군 전사체로서 ΔΔCt 방법을 이용하여 RT-qPCR에 의해 상기와 같이 평가하였고, PBS-처리 동물에 대해 정상화하였다. 도 30은 간 mRNA 수준에 대한 GNA-변형 siRNA 듀플렉스를 이용한 마우스에서의 생체내 유전자 사일런싱 효과를 나타낸다.
상기 도면에 나타낸 결과는 GNA 혼입이 생성 듀플렉스의 위치-의존적 열적 탈안정화를 일으켰음을 나타낸다. 탈안정화 정도는 뉴클레오타이드 의존적이었다; 반면에, A 또는 U 뉴클레오타이드에 대한 치환은 G 또는 C 뉴클레오타이드에 대한 GNA 치환에 비해 훨씬 더 작은 ΔTM을 생성하였다. siRNA 듀플렉스의 씨드 영역 내로의 단일 GNA 뉴클레오타이드의 혼입은 시험관내 TTR mRNA의 유사한 녹다운 수준을 생성하였다. 또한, 씨드 영역 내에 GNA 염기쌍을 함유하는 siRNA뿐만 아니라 믹스 매치 듀플렉스는 대응하는 모체 siRNA보다 더 높은 수준의 시험관내 녹다운을 나타내었다.
생체내 유전자 사일런싱은 단일 GNA 치환을 함유하는 듀플렉스에 대한 시험관내 결과와 잘 연관되었다. GNA의 이중 치환은 단일-치환 siRNA와 비교된 경우, 생체내 사일런싱 활성의 손실을 일으켰다.
본 명세서에서 참조되는 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공보는 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 구현예들의 양태들은, 다양한 특허, 출원, 및 공보의 개념들을 채용할 필요가 있는 경우 변형되어, 더욱 추가적인 구현예들을 제공할 수 있다.
전술한 설명의 견지에서 구현예들에 이들 및 다른 변화들이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음 청구범위에서, 이용되는 용어들은 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예들로 청구범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 그보다는 이런 청구범위에 대한 균등물의 전체 범위에 따라 모든 가능한 구현예들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 청구범위는 개시내용에 의해 한정되지 않는다.

Claims (38)

  1. 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제로서, 상기 타겟 유전자에 상응하는 mRNA의 적어도 하나의 부위에 상보적인 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서,
    상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 형성하고;
    상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이이고;
    각각의 센스 및 안티센스 가닥은 2개 이상의 상이한 뉴클레오타이드 변형을 함유하며, 여기서 각각의 뉴클레오타이드 변형은 독립적으로 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 및 2'-ara-F로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    상기 안티센스 가닥은 2'-F 변형을 함유하고, 여기서, 안티센스 가닥 상의 2'-F 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 (A) 내지 (C):
    (A) 2번, 6번, 14번, 및 16번 위치;
    (B) 2번, 6번, 9번, 14번, 및 16번 위치; 또는
    (C) 2번, 6번, 8번 내지 9번, 14번, 및 16번 위치
    중의 하나에 의해 나타내어지는 위치에서 발생되고 오직 발생되는, dsRNA 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서 각각의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥이 안티센스 가닥의 5'-말단에서 첫번째 5개의 뉴클레오타이드 내에서 포스포로티오에이트 변형을 함유하는, dsRNA 제제.
  4. 제2항에 있어서,
    각각의 뉴클레오타이드는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 및 2'-플루오로 변형으로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 함유하는, dsRNA 제제.
  5. 제2항에 있어서,
    각각의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 변형으로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 함유하는, dsRNA 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘다가 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개 이상의 블록을 포함하는, dsRNA 제제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 센스 가닥이 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개의 블록을 포함하는 dsRNA 제제.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥이 14개, 15개, 16개, 17개, 또는 18개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함하는, dsRNA 제제.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥이 16개 내지 18개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함하는, dsRNA 제제.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드를 갖고, 상기 안티센스 가닥이 19개 내지 25개 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드를 갖고, 상기 안티센스 가닥이 23개 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 3' 및/또는 5' 오버행을 갖는, dsRNA 제제.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 안티센스 가닥의 3' 말단에 3' 오버행, 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는, dsRNA 제제.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 센스 가닥의 5' 말단에 5' 오버행을 갖는, dsRNA 제제.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 듀플렉스에서 안티센스 가닥의 5' 말단의 1번 위치의 뉴클레오타이드의 뉴클레오베이스가 아데닌, 우라실, 및 티민으로 구성된 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1, 제2, 및 제3 염기쌍 중 하나 이상이 AU 염기쌍인, dsRNA 제제.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 하나 이상의 리간드에 접합되는, dsRNA 제제.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 하나 이상의 리간드가 dsRNA 제제의 뉴클레아제 내성을 향상시키는, dsRNA 제제.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 하나 이상의 리간드가 ASGPR 리간드인, dsRNA 제제.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 ASGPR 리간드가 센스 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 부착되는, dsRNA 제제.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 ASGPR 리간드가 센스 가닥의 3' 말단에 부착되는, dsRNA 제제.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 ASGPR 리간드가 2가 또는 3가 분지화 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인, dsRNA 제제.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 ASGPR 리간드가 다음과 같은, dsRNA 제제:
    .
  24. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는, dsRNA 제제.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥이 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 2번, 6번, 14번, 및 16번 위치에서 4개 및 오직 4개의 2'-F 변형을 함유하는, dsRNA 제제.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥이 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 2번, 6번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서 5개 및 오직 5개의 2'-F 변형을 함유하는, dsRNA 제제.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥이 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 2번, 6번, 8번 내지 9번, 14번, 및 16번 위치에서 6개 및 오직 6개의 2'-F 변형을 함유하는, dsRNA 제제.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 제1의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 염기쌍 중의 하나 이상이 A:U, G:U, I:C, 및 미스매치된 쌍으로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되는, dsRNA 제제.
  29. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 5'-말단 인-함유 기를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 5'-말단 인-함유 기가 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, dsRNA 제제.
  31. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 안티센스 가닥 또는 센스 가닥의 5'-말단에서 포스포로디티오에이트(PS2) 결합을 통해 연결된 2'-데옥시티미딘을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  32. 제1항에 있어서,
    상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서 제1 뉴클레오타이드가 2'-OMe로 변형된, dsRNA 제제.
  33. 제1항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제의 양 말단에 2개의 블런트 말단을 갖는, dsRNA 제제.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 제제를 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와의 조합으로 포함하는 약학적 조성물.
  35. 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 제제의 용도.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 피하 또는 정맥내 투여를 통해 투여되는, 용도.
  37. 피험자에서 특정 타겟에 대한 폴리뉴클레오타이드를 전달하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 제제의 용도.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 dsRNA 제제가 근육내, 기관내, 흉강내, 복강내, 동맥내, 림프, 정맥내, 피하, 뇌척수, 또는 이들의 조합을 포함하는 투여 수단에 의해 투여되는, 용도.
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Application Number Title Priority Date Filing Date
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US (9) US10233448B2 (ko)
EP (3) EP3812462A1 (ko)
JP (4) JP7289610B2 (ko)
KR (3) KR102494171B1 (ko)
CN (2) CN107075516A (ko)
CA (1) CA2958758A1 (ko)
EA (1) EA201790420A1 (ko)
IL (2) IL250448B (ko)
MX (1) MX2017002144A (ko)
NZ (2) NZ767118A (ko)
SG (3) SG11201701166UA (ko)
WO (1) WO2016028649A1 (ko)

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX345095B (es) 2011-06-21 2017-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.
IN2014CN03465A (ko) * 2011-11-18 2015-10-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc
CN104661664B (zh) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 手性控制
ES2676146T3 (es) 2013-05-22 2018-07-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composiciones de ARNi de Serpina1 y métodos de uso de las mismas
KR102494171B1 (ko) * 2014-08-20 2023-02-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형 이중-가닥 rna 제제
CN113846101A (zh) * 2014-11-17 2021-12-28 阿尔尼拉姆医药品有限公司 载脂蛋白C3（APOC3）iRNA组合物及其使用方法
WO2016168286A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
DK3329002T3 (da) 2015-07-31 2021-01-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transthyretin (ttr)-irna-sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling eller forebyggelse af ttr-forbundne sygdomme
EP3408391A4 (en) 2016-01-31 2019-08-28 University of Massachusetts BRANCHED OLIGONUCLEOTIDES
JP2019511562A (ja) * 2016-02-01 2019-04-25 アラーキス セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｒｎａ媒介疾患を処置する化合物および方法
MA45349A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques egfr et leurs utilisations
MA45469A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques de bêta-caténine et leurs utilisations
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
MA45470A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques kras et leurs utilisations
AU2017279512B2 (en) 2016-06-06 2021-08-19 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. 5'-cyclo-phosphonate modified nucleotides
US11753638B2 (en) 2016-08-12 2023-09-12 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
CA3037192A1 (en) * 2016-11-07 2018-05-11 nanoSUR LLC Post-transcriptionally chemically modified double strand rnas
US11447519B2 (en) 2016-11-10 2022-09-20 San Diego State University Research Foundation Compounds for fluorescence sensing of duplex formation
KR102645243B1 (ko) * 2016-11-23 2024-03-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 표적외 효과가 감소된 변형 rna 작용제
TW202313978A (zh) * 2016-11-23 2023-04-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
CA3046963A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd8a-binding fibronectin type iii domains
EP3554561B1 (en) 2016-12-14 2023-06-28 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
JP7058656B2 (ja) * 2016-12-16 2022-04-22 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物を用いてＴＴＲ関連疾患を治療または予防するための方法
WO2019193144A1 (en) * 2018-04-05 2019-10-10 Silence Therapeutics Gmbh siRNAs WITH VINYLPHOSPHONATE AT THE 5' END OF THE ANTISENSE STRAND
EP3550022A1 (en) * 2018-04-05 2019-10-09 Silence Therapeutics GmbH Products and compositions
PL3607069T3 (pl) * 2017-04-05 2023-03-06 Silence Therapeutics Gmbh Produkty i kompozycje
ES2936109T3 (es) * 2017-04-05 2023-03-14 Silence Therapeutics Gmbh Inhibición de TMPRSS6 mediada por interferencia de ARN
TN2020000038A1 (en) 2017-09-14 2021-10-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Rnai agents and compositions for inhibiting expression of angiopoietin-like 3 (angptl3), and methods of use
EP3684931A1 (en) 2017-09-19 2020-07-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
CN111655268B (zh) * 2017-10-04 2024-03-26 艾维迪提生物科学公司 核酸-多肽组合物及其用途
SG11202003082UA (en) * 2017-11-13 2020-05-28 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acids for inhibiting expression of a target gene comprising phosphorodithioate linkages
IL297543A (en) 2017-11-30 2022-12-01 Arrakis Therapeutics Inc Nucleic acid-binding photoprobes and their uses
AU2018377716A1 (en) * 2017-12-01 2020-04-09 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Nucleic acid, composition and conjugate containing same, and preparation method and use
EP3719127A4 (en) * 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH IT, MANUFACTURING METHOD AND USE
KR20200091414A (ko) 2017-12-01 2020-07-30 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체, 그의 제조 방법 및 그의 용도
CN110945130B (zh) * 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
US11414665B2 (en) * 2017-12-01 2022-08-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
MA51103A (fr) 2017-12-06 2020-10-14 Avidity Biosciences Inc Compositions et procédés de traitement de l'atrophie musculaire et de la dystrophie myotonique
CA3086485A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chirally-enriched double-stranded rna agents
EP3677588A4 (en) * 2017-12-26 2020-11-25 Guangzhou Ribobio Co., Ltd. MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES AND COMPOUND WHICH CAN BE USED FOR THE SYNTHESIS OF THEM
US11633482B2 (en) 2017-12-29 2023-04-25 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
MX2020009074A (es) * 2018-03-02 2020-10-08 Dicerna Pharmaceuticals Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de condiciones asociadas a la deficiencia del conducto biliar.
EP3775209A1 (en) * 2018-04-05 2021-02-17 Silence Therapeutics GmbH Sirnas with at least two ligands at different ends
US20210238594A1 (en) * 2018-05-07 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for improving strand biased
EP3802827A4 (en) * 2018-05-16 2022-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED RNA AGENTS WITH REDUCED OFF-TARGET EFFECT
US11918600B2 (en) 2018-08-21 2024-03-05 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof
US11279930B2 (en) * 2018-08-23 2022-03-22 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
JP7470107B2 (ja) 2018-09-28 2024-04-17 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及びＴＴＲ関連眼疾患を治療又は予防するためのその使用方法
EP3862024A4 (en) * 2018-09-30 2022-08-17 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SHORT INTERFERENT RNA CONJUGATE, METHOD FOR PREPARATION AND USE THEREOF
US20220049252A1 (en) * 2018-12-10 2022-02-17 Amgen Inc. CHEMICALLY-MODIFIED RNAi CONSTRUCTS AND USES THEREOF
CA3124090A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amyloid precursor protein (app) rnai agent compositions and methods of use thereof
JP2022515503A (ja) * 2018-12-28 2022-02-18 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
CN112423795A (zh) * 2018-12-28 2021-02-26 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN111378658B (zh) * 2018-12-28 2024-03-15 苏州瑞博生物技术股份有限公司 抑制TIMP-1基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
CN111378655B (zh) * 2018-12-28 2024-03-19 苏州瑞博生物技术股份有限公司 抑制CTGF基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
CN111378657B (zh) * 2018-12-28 2024-03-15 苏州瑞博生物技术股份有限公司 抑制COL1A1基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
CN111378659B (zh) * 2018-12-29 2024-01-30 苏州瑞博生物技术股份有限公司 抑制stat3基因表达的核酸、含有该核酸的药物组合物及其用途
EP3974532A4 (en) * 2019-05-22 2024-01-24 Suzhou Ribo Life Science Co Ltd NUCLEIC ACID, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, CONJUGATE, PROCESS OF PREPARATION AND USE
TW202111118A (zh) * 2019-05-22 2021-03-16 大陸商蘇州瑞博生物技術股份有限公司 核酸、藥物組合物與綴合物及製備方法和用途
CN111973619B (zh) * 2019-05-23 2024-01-30 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
US20220315929A1 (en) * 2019-05-24 2022-10-06 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate, preparation method therefor and use thereof
US20220186221A1 (en) * 2019-05-24 2022-06-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate, preparation method and use
CN112007040B (zh) * 2019-05-31 2024-01-30 苏州瑞博生物技术股份有限公司 用于治疗乙型病毒性肝炎的联合用药物
EP3986475A4 (en) * 2019-06-21 2023-07-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc. STRUCTURALLY DEFINED SIRNA-IMMUNOGLOBULIN CONJUGATES WITH DUAL VARIABLE DOMAIN
WO2021030778A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds and uses thereof
US11781138B2 (en) 2019-10-14 2023-10-10 Aro Biotherapeutics Company FN3 domain-siRNA conjugates and uses thereof
US11628222B2 (en) 2019-10-14 2023-04-18 Aro Biotherapeutics Company CD71 binding fibronectin type III domains
EP4055166A2 (en) * 2019-11-06 2022-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extrahepatic delivery
WO2021092145A1 (en) * 2019-11-06 2021-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna composition and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
CN112876534B (zh) * 2019-11-29 2024-02-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 肝靶向化合物及缀合物
CN115461460A (zh) * 2020-03-06 2022-12-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制转甲状腺素蛋白(ttr)的表达的组合物和方法
US11555190B2 (en) 2020-03-19 2023-01-17 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2022011214A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Circular sirnas
CN114685585A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
US20240116973A1 (en) * 2021-01-15 2024-04-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
KR20230134509A (ko) * 2021-01-22 2023-09-21 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드
IL304880A (en) 2021-02-12 2023-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Superoxide dismutase 1 (SOD1) IRNA compositions and methods of using them to treat or prevent superoxide dismutase 1- (SOD1-) associated neurodegenerative diseases
BR112023017737A2 (pt) 2021-03-04 2023-10-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de angiopoietina-semelhantes 3 (angptl3) e métodos de uso das mesmas
WO2022189861A1 (en) 2021-03-08 2022-09-15 Tollys Carbohydrate conjugates of tlr3 ligands and uses thereof
TW202315943A (zh) 2021-06-23 2023-04-16 麻薩諸塞大學 用於治療子癇前症及其它血管新生病症的最佳化抗flt1寡核苷酸化合物
KR20240024194A (ko) * 2021-06-24 2024-02-23 서나오믹스, 인크. 생성물 및 조성물
EP4367237A2 (en) 2021-07-09 2024-05-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bis-rnai compounds for cns delivery
EP4373937A1 (en) 2021-07-21 2024-05-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Metabolic disorder-associated target gene irna compositions and methods of use thereof
TW202328445A (zh) 2021-08-03 2023-07-16 美商艾拉倫製藥股份有限公司 甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
CA3231330A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023064530A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extra-hepatic delivery irna compositions and methods of use thereof
WO2023069495A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides with 2'-deoxy-2'-f-2'-c-methyl nucleotides
WO2023109932A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用
CN116003494A (zh) * 2022-01-05 2023-04-25 大睿生物医药科技(上海)有限公司 具有核苷酸类似物的双链rna
US11879125B2 (en) 2022-03-16 2024-01-23 Empirico Inc. GalNAc compositions for improving siRNA bioavailability
WO2024077148A1 (en) * 2022-10-07 2024-04-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Plasminogen (plg) irna compositions and methods of use thereof
CN117534717A (zh) * 2024-01-09 2024-02-09 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 5′-(e)-乙烯基磷酸酯的合成方法

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0833613A1 (en) 1995-05-26 1998-04-08 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
US8273866B2 (en) * 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
WO2005078097A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (Multifunctional siNA)
US7683036B2 (en) * 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
CH698304B1 (de) 2005-10-10 2009-07-15 Fatzer Ag Drahtseilanker, insbesondere für Steinschlag- oder Lawinenschutzverbauungen.
CA2628300C (en) * 2005-11-02 2018-04-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified sirna molecules and uses thereof
EP1989307B1 (en) 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
ES2564303T3 (es) 2006-04-07 2016-03-21 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compuestos de ARN inmunomodulador estabilizado (SIMRA) para TLR7 y TLR8
US8324179B2 (en) 2007-02-09 2012-12-04 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside analogs for antiviral treatment
JP5737937B2 (ja) 2007-07-09 2015-06-17 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
CN102016036B (zh) * 2008-02-11 2015-04-08 阿克赛医药公司 经修饰的RNAi多核苷酸及其用途
US20110223665A1 (en) 2008-07-25 2011-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ENHANCEMENT OF siRNA SILENCING ACTIVITY USING UNIVERSAL BASES OR MISMATCHES IN THE SENSE STRAND
US20100183704A1 (en) * 2008-09-25 2010-07-22 Novartis Ag dsRNA FOR TREATING VIRAL INFECTION
JP5875976B2 (ja) 2009-06-01 2016-03-02 ヘイロー−バイオ アールエヌエーアイ セラピューティクス， インコーポレイテッド 多価ｒｎａ干渉のためのポリヌクレオチド、組成物およびそれらの使用方法
US20110082186A1 (en) 2009-08-27 2011-04-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2011109427A2 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improving the biological activity of sirna through modulation of its thermodynamic profile
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133871A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
KR101869570B1 (ko) * 2010-04-28 2018-06-20 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드 및 그로부터 제조된 올리고머 화합물
BR112013025006B1 (pt) 2011-03-29 2021-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene de tmprss6, método para inibição da expressão de tmprss6 em uma célula, e uso de ácidos ribonu-cleicos fita dupla
EP3388068A1 (en) 2011-06-21 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes
CA2839711C (en) 2011-06-21 2023-04-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of apolipoprotein c-iii (apoc3) genes
EP2723861A4 (en) 2011-06-21 2014-12-10 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING HEPCIDINE ANTIMICROBIAL PEPTIDE (HAMP) OR THE ASSOCIATED GENE EXPRESSION
MX345095B (es) 2011-06-21 2017-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.
US20140235693A1 (en) 2011-06-23 2014-08-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment
IN2014CN03465A (ko) * 2011-11-18 2015-10-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc
AU2012340159B2 (en) 2011-11-18 2017-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (TTR) associated diseases
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
CN104717982B (zh) * 2012-08-06 2018-08-28 阿尔尼拉姆医药品有限公司 碳水化合物共轭物及其制备改进工艺
CA2880290C (en) 2012-09-12 2020-10-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules targeting p53 and methods of use thereof
AU2013315524B2 (en) * 2012-09-12 2019-01-31 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
KR20200035490A (ko) * 2012-12-05 2020-04-03 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 PCSK9 iRNA 조성물 및 그 사용 방법
MX366660B (es) 2013-03-14 2019-07-18 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni contra el componente c5 del complemento y métodos para su uso.
IL285780B (en) 2013-05-22 2022-07-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Preparations of tmprss6 irna and methods of using them
ES2676146T3 (es) 2013-05-22 2018-07-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composiciones de ARNi de Serpina1 y métodos de uso de las mismas
AR097738A1 (es) 2013-09-23 2016-04-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos para tratar o prevenir enfermedades asociadas con la transtiretina (ttr)
MX2016004230A (es) 2013-10-02 2016-10-21 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen lect2.
KR102307389B1 (ko) 2013-10-04 2021-09-30 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ａｌａｓ1 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
US10010562B2 (en) * 2013-11-06 2018-07-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Dual molecular delivery of oligonucleotides and peptide containing conjugates
JP6710638B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-17 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 補体成分ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
EP3960860A3 (en) 2014-02-11 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
WO2015179724A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
KR102494171B1 (ko) * 2014-08-20 2023-02-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형 이중-가닥 rna 제제
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

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