CN111378655B - 抑制CTGF基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途 - Google Patents

抑制CTGF基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

一种抑制CTGF基因表达的siRNA，含有正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，核苷酸序列II至少部分地与CTGF mRNA第700‑1050位区域中长度为19个连续核苷酸的序列互补。按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。本公开还提供了包含该siRNA的药物组合物。该siRNA和含有该siRNA的药物组合物能够治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病。

Description

抑制CTGF基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其 用途
技术领域
本公开涉及一种能够抑制CTGF基因表达的核酸和含有该核酸的药物组合物，属于核酸制药领域。本公开还涉及这些核酸和药物组合物的用途。
背景技术
肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(ECM)的过度沉积，是继发于各种形式慢性肝损伤之后的组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化、肝癌等严重致死性疾病的必经病变过程，所以抗肝纤维化成为慢性肝病治疗的重中之重。
目前治疗肝纤维化的手段非常有限，主要包括两大方面：一是针对原发病去除致病因素，如抗病毒、戒酒等；二是针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞(HSC)的增殖活化，以及促进胶原降解等。临床药物中，使用干扰素抑制星状细胞的激活和增殖细胞外基质的表达，使用拉米夫定抑制HBV DNA的复制，使用秋水仙碱和水飞蓟素干扰细胞的胶原分泌。但这些药物对肝纤维化的治疗效果不确切，对肝纤维化患者生存率也无明显改善，而副作用发生率却明显增加。
***生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一种新发现的可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子，可由成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌。成年哺乳动物心、脑、肾、肺、肝、胎盘中均有表达，如广泛表达于人类多种组织器官中。在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等。
CTGF是TGF-β下游的靶基因。在胚胎发育、软骨形成以及创伤修复过程中，CTGF具有一定的生理作用，被认为是启动间充质转化(EMT)及肝损伤修复的“总开关”，决定慢性肝损伤是再生修复还是纤维化修复。CTGF参与肝纤维化的生物学作用主要表现在如下几个方面：(1)在其他细胞因子的协同下刺激细胞外基质(ECM)的合成，抑制其降解，导致ECM的积聚及结构改建；(2)介导细胞黏附；(3)促进细胞趋化效应，在体外能趋化成纤维细胞；(4)通过改变TGF-β/BMP-7的比例，促进EMT的发生。TGF-β可能在肝纤维化起始阶段起关键作用，而持续的CTGF高表达才是肝纤维化得以形成和发展的主要原因。
设计针对CTGF基因的siRNA，抑制纤维化肝脏组织的CTGF的表达，可以作为治疗和预防肝纤维化和肝硬化的有效手段。然而迄今为止，用于治疗与CTGF基因表达相关的疾病的siRNA药物临床应用进展缓慢，其中，siRNA本身的活性和在血液中的稳定性较差，是影响该类药物进展缓慢的原因之一。因此，迫切需要开发一种具有潜在临床应用价值的，具有良好稳定性和生物活性的，用于治疗与CTGF基因表达相关的疾病的siRNA和含siRNA的药物组合物。
发明内容
在一些实施方式中，本公开提供了一种能够抑制CTGF基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列选自CTGF mRNA第700-1050位区域中长度为19个连续核苷酸的序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的5'末端的第一个核苷酸是反义链5'末端的第一个核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的siRNA和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物中的应用。
在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的siRNA和/或药物组合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利以及专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
本公开提供的siRNA和含该siRNA的药物组合物具有良好的稳定性，较高的基因抑制活性，很低的脱靶效应，和/或能显著改善肝纤维化水平。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA或含该siRNA的药物组合物具有更高的稳定性和/或更高的活性。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA或药物组合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％或80％的靶基因表达抑制率。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA或含该siRNA的药物组合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。据认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA具有良好的稳定性，在体外溶酶体裂解液中、人血浆或猴血浆中都保持着一致的稳定性。
由此说明，本公开提供的siRNA或药物组合物能够抑制CTGF基因的表达，有效治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病，具有良好的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，CTGF基因以及靶基因都是指mRNA序列如Genbank注册号NM_001901.2所示的基因。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种病理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
siRNA
本公开提供了一种能够抑制CTGF基因表达的siRNA。
本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
本公开的siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列选自CTGF mRNA第700-1050位区域中长度为19个连续核苷酸的序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的5'末端的第一个核苷酸是反义链5'末端的第一个核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列选自CTGF mRNA第746-764位长度为19个连续核苷酸的序列，定义为SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列是与SEQ IDNO:2完全反向互补的序列。所述修饰的siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列Ⅰ和所述核苷酸序列Ⅱ至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列Ⅰ与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列Ⅱ与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAZa1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Zb1UUUUGCCCUUCUUAAUGU-3'(SEQ ID NO:2)，
其中，Za1为A，Zb1为U，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za1的核苷酸ZA1，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb1的核苷酸ZB1，所述ZB1是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在上文与下文中，“位置对应”是指从核苷酸序列相同端起算，处于核苷酸序列中相同的位置。例如，核苷酸序列I的3'端第1个核苷酸ZA1是位置对应于SEQ ID NO:1的3'端第1个核苷酸Za1的核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列选自CTGF mRNA第801-819位长度为19个连续核苷酸的序列，定义为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列是与SEQ IDNO:4完全反向互补的序列。所述修饰的siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列Ⅰ和所述核苷酸序列Ⅱ至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列Ⅰ与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列Ⅱ与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGZa2-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Zb2CAGCCAGAAAGCUCAAAC-3'(SEQ ID NO:4)，
其中，Za2为C，Zb2为G，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za2的核苷酸ZA2，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb2的核苷酸ZB2，所述ZB2是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列选自CTGF mRNA第1015-1033位长度为19个连续核苷酸的序列，定义为SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列是与SEQ IDNO:6完全反向互补的序列。所述修饰的siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列Ⅰ和所述核苷酸序列Ⅱ至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列Ⅰ与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列Ⅱ与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUGUACUACAGGAAGAUGZa3-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Zb3CAUCUUCCUGUAGUACAG-3'(SEQ ID NO:6)，
其中，Za3为U，Zb3为A，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za3的核苷酸ZA3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb3的核苷酸ZB3，所述ZB3是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，核苷酸序列II与第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2-19位的核苷酸与第一段核苷酸序列互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第1位核苷酸为A或U。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB1位置处的差异，且ZB1选自A、C或G。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为ZB1位置处的差异，ZB1选自A、C或G。在一些实施方式中，ZA1是与ZB1互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB2位置处的差异，且ZB2选自A、U或C。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为ZB2位置处的差异，ZB2选自A、U或C。在一些实施方式中，ZA2是与ZB2互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB3位置处的差异，且ZB3选自U、C或G。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为ZB3位置处的差异，ZB3选自U、C或G。在一些实施方式中，ZA3是与ZB3互补的核苷酸。
这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力，而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAZA1-3'(SEQ ID NO:7)；
5'-ZB1UUUUGCCCUUCUUAAUGU-3'(SEQ ID NO:8)，
其中，所述ZB1是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA1选自A、U、G或C，并且ZB1是与ZA1互补的核苷酸；在一些实施方式中，ZA1为A，ZB1为U。
在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列：
5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGZA2-3'(SEQ ID NO:9)；
5'-ZB2CAGCCAGAAAGCUCAAAC-3'(SEQ ID NO:10)，
其中，所述ZB2是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA2选自A、U、G或C，并且ZB2是与ZA2互补的核苷酸；在一些实施方式中，ZA2为C，ZB2为G。
在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列：
5'-CUGUACUACAGGAAGAUGZA3-3'(SEQ ID NO:11)；
5'-ZB3CAUCUUCCUGUAGUACAG-3'(SEQ ID NO:12)，
其中，所述ZB3是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA3选自A、U、G或C，并且ZB3是与ZA3互补的核苷酸；在一些实施方式中，ZA3为U，ZB3为A。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列Ⅰ，所述反义链仅包含核苷酸序列Ⅱ。在一些实施方式中，所述正义链是核苷酸序列Ⅰ，所述反义链是核苷酸序列Ⅱ。此时，正义链和反义链的长度比为19/19。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述siRNA为如下siRNA中的一种：
1)所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:7所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:8所示的序列，此时，所述siRNA还含有核苷酸序列III和核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为A；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为G和A；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A、G和A；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为G、A、G和A；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
2)所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:9所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:10所示的序列，此时，所述siRNA还含有核苷酸序列III和核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为A；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A和A；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C、A和A；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为U、C、A和A；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
3)所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:11所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ IDNO:12所示的序列，此时，所述siRNA还含有核苷酸序列III和核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C和G；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为U、C和G；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A、U、C和G；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度相同，并且完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基，核苷酸序列IV的碱基也就确定了。
在一些实施方式中，所述反义链还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种；核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端。由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列V中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)或连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，核苷酸序列V与第三段核苷酸序列完全反向互补；所述第三段序列是指靶mRNA中与第一段核苷酸序列或第二段核苷酸序列相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列：
5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAZA1-3'(SEQ ID NO:13)；
5'-ZB1UUUUGCCCUUCUUAAUGUUC-3'(SEQ ID NO:14)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列：
5'-GAACAUUAAGAAGGGCAAAAZA1-3'(SEQ ID NO:15)；
5'-ZB1UUUUGCCCUUCUUAAUGUUCUC-3'(SEQ ID NO:16)；
其中，所述ZB1是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA1选自A、U、G或C，并且ZB1是与ZA1互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列：
5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGZA2-3'(SEQ ID NO:17)；
5'-ZB2CAGCCAGAAAGCUCAAACUU-3'(SEQ ID NO:18)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列：
5'-AAGUUUGAGCUUUCUGGCUGZA2-3'(SEQ ID NO:19)；
5'-ZB2CAGCCAGAAAGCUCAAACUUGA-3'(SEQ ID NO:20)；
其中，所述ZB2是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA2选自A、U、G或C，并且ZB2是与ZA2互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列：
5'-CUGUACUACAGGAAGAUGZA3-3'(SEQ ID NO:21)；
5'-ZB3CAUCUUCCUGUAGUACAGCG-3'(SEQ ID NO:22)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列：
5'-CGCUGUACUACAGGAAGAUGZA3-3'(SEQ ID NO:23)；
5'-ZB3CAUCUUCCUGUAGUACAGCGAU-3'(SEQ ID NO:24)；
其中，所述ZB3是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA3选自A、U、G或C，并且ZB3是与ZA3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开所述siRNA为siCTGFa1、siCTGFa2、siCTGFb1、siCTGFb2、siCTGFc1或siCTGFc2：
siCTGFa1
正义链：5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAA-3'(SEQ ID NO:25)
反义链：5'-UUUUUGCCCUUCUUAAUGUUC-3'(SEQ ID NO:26)
siCTGFa2
正义链：5'-GAACAUUAAGAAGGGCAAAAA-3'(SEQ ID NO:27)
反义链：5'-UUUUUGCCCUUCUUAAUGUUCUC-3'(SEQ ID NO:28)
siCTGFb1
正义链：5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGC-3'(SEQ ID NO:29)
反义链：5'-GCAGCCAGAAAGCUCAAACUU-3'(SEQ ID NO:30)
siCTGFb2
正义链：5'-AAGUUUGAGCUUUCUGGCUGC-3'(SEQ ID NO:31)
反义链：5'-GCAGCCAGAAAGCUCAAACUUGA-3'(SEQ ID NO:32)
siCTGFc1
正义链：5'-CUGUACUACAGGAAGAUGU-3'(SEQ ID NO:33)
反义链：5'-ACAUCUUCCUGUAGUACAGCG-3'(SEQ ID NO:34)
siCTGFc2
正义链：5'-CGCUGUACUACAGGAAGAUGU-3'(SEQ ID NO:35)
反义链：5'-ACAUCUUCCUGUAGUACAGCGAU-3'(SEQ ID NO:36)
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，所述核苷酸序列I中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
在上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(10)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(11)所示：
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleicacid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：
上述式(15)和式(16)中，R表示选自于由H、OH和烷氧基(O-烷基)所组成的组的基团。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示：
上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示选自A、U、G、C或T的碱基；R表示选自于由H、OH、F和如上所述的非氟基团所组成的组的基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“2'-氟代核糖基”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“2'-甲氧基核糖基”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。
在一些实施方式中，本公开的siRNA可抵抗血液中的核糖核酸酶切割，由此增加siRNA的血液稳定性，使siRNA具有更强的抵抗核酸酶水解的性能，同时保持较高的靶基因调节活性。
在一些实施方式中，本公开的siRNA获得了稳定性和基因表达调节效率的高度平衡，并且有些还具有更加简单，成本更低的优点。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：
按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA还含有其他修饰的核苷酸基团，所述修饰的核苷酸基团不会导致所述siRNA调节靶基因表达的功能明显削弱或丧失。
目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，除了上文提及的核糖基团修饰外，还包括骨架修饰(如磷酸基团修饰)及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链或反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(1)所示结构的硫代磷酸酯基：
这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的。在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸具有式(2)所示的结构：
Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了式(3)至式(6)所示的5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、甲氧基和氟所组成的组的基团；Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一些实施方式中，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(3)所示的含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)的核苷酸，或式(5)所示的含有硫代磷酸酯的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA可以为表1A-1C中示出的siRNA。
表1A一些实施方式中的siRNA序列
表1B一些实施方式中的siRNA序列
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表1C一些实施方式中的siRNA序列
本公开的发明人意外发现，本公开提供的siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还保留很高的基因抑制活性。
本公开所述siRNA中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH4+，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一些实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K+和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述siRNA可以至少部分以盐的形式存在。在一种实施方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述siRNA以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本公开的siRNA可以采用常规的方法，例如本领域所熟知的固相亚磷酰胺合成法制备得到，也可以采用商业化定制合成得到。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbonnanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，在一些实施方式中，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方式中，所述药物组合物用于静脉注射给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机胺可为CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
X101和X102各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
Y101和Z101各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
R101、R102、R103、R104、R105、R106和R107各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R102是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R103和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。
在一些实施方式中，R103是多胺。在其它实施方式中，R103是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R101和R102中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R103可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：
其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R103与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。
其中，式(201)所示化合物可以根据CN103380113A中的描述制备。
在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)，例如可以为(50-70)：(20-40)：(3-20)。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的siRNA替代现有siRNA即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)，例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流***、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
本公开的siRNA、含该siRNA的药物组合物的应用
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物给予有需要的受试者。
通过将本公开的siRNA活性成分给予有需要的受试者，可以通过RNA干扰的机制达到治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的目的。因此，本公开的siRNA和/或药物组合物可用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病，或用于制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物。
所述与CTGF基因表达相关的疾病指细胞中CTGF基因过度表达引起的病症，如纤维化病症和/或原纤维生成的疾病。这类疾病具体的例子包括但不限于：肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、腹膜纤维化、声带纤维化、肠纤维化、骨髓纤维化、心脏纤维化、与脑梗死相关的纤维化、与全部可能类型的意外或医源性皮肤损伤相关的异常瘢痕化、硬皮病、青光眼滤过术失败、肠粘连、肝硬化或慢性肝损伤。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本公开的siRNA和/或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将本公开的siRNA和/或药物组合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多siRNA活性成分递送至特定位点；而全身给药导致将本公开的siRNA和/或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供治疗或改善肝纤维化的手段，在一些实施方式中为能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的siRNA和/或药物组合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J小鼠，以siRNA的量计：对于siRNA与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，在进一步的实施方式中为0.01-10mg/kg体重，在更进一步的实施方式中为0.05-5mg/kg体重，在又进一步的实施方式中为0.1-3mg/kg体重。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制细胞中CTGF基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物与所述细胞接触，将本公开的siRNA和/或药物组合物导入所述细胞，通过RNA干扰的机制达到抑制细胞中CTGF基因表达的目的。所述细胞可以选自肝星状细胞、肾星状细胞、或肺星状细胞。在一些实施方式中，所述细胞为肝星状细胞。
采用本公开提供的方法抑制CTGF基因在细胞中表达，所提供的修饰的siRNA和/或药物组合物中的siRNA用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本公开的修饰的siRNA和药物组合物的至少一种。
在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供修饰的siRNA。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述修饰的siRNA的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将修饰的siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述修饰的siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述修饰的siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))所记载的方法进行。
Hela细胞由北京大学分子医学研究所核酸技术实验室提供，用含有20％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)培养细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
制备例1合成siRNA序列
在siRNA合成中，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的siRNA中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰的核苷亚磷酰胺单体(modified RNA phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。除非特别说明，所用的核苷单体均可商购得到。
(1-a)固相亚磷酰胺法
通过固相亚磷酰胺法得到表2中所列的siRNA序列。
对于正义链，利用通用固相载体(UnyLinkerTMloadedHL SolidSupports，Kinovate Life Sciences公司)起始循环，按照核苷酸排布顺序自3'-5'方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。其中，两个核苷酸之间采用磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应。两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括保护、偶联、盖帽、硫化四步反应。
合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液，其中CapA为20体积％N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；CapB为20体积％乙酸酐的乙腈溶液。盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行。
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，真空浓缩至干。
纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测纯度，使用液质联用(LC-MS)分析分子量。实测值与理论值相符，表明所合成的是正义链S。
对于反义链，合成条件与正义链相同，不同的是按照反义链的核苷酸顺序使用相应的核苷单体。
(1-b)5'-VP修饰的引入
对于siRNA 2，其反义链5'-末端第一个核苷酸具有5'-VP修饰，该修饰通过在上述固相亚磷酰胺合成方法中使用乙烯基磷酸酯修饰的2'-甲氧基修饰尿嘧啶核苷单体(VP-Um)来引入，所述VP-Um核苷单体按照以下方法合成：
(1-b-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
将2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷(2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol)，叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)，咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶于450ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应20h。蒸除DMF，用600ml二氯甲烷溶解后加300ml饱和碳酸氢钠洗涤，水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml，合并有机相，用5％草酸洗涤至水相pH<5，蒸发溶剂至干后获得VP-U-1粗品直接用于随后VP-U-2的合成。
将VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解后，外加冰浴搅拌10分钟，再加入预先在4℃冰箱冷藏好的450ml 2％对甲苯磺酸溶液(溶剂为体积比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶剂)，反应10分钟。再加入200ml饱和碳酸氢钠淬灭反应，有机相加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至pH＝8。合并水相，用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，再用200ml饱和食盐水洗涤一次，蒸发溶剂至干。200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.79(d,J＝4.7Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.94(t,J＝7.0Hz,1H),4.12(td,J＝4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J＝4.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理论：497.21，实测：497.45。
(1-b-2)VP-U-4的合成：
将VP-U-2(19.84g，40.0mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，16.48g，80.0mmol)，吡啶(4.20g，53.2mmol)，三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶于200ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应20h，获得反应液备用。另取亚甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶于120mlTHF，冰浴降温，在冰浴温度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴温度下反应10min，再升至室温反应0.5h，然后加入至前述反应液中，约1h加完，冰浴温度下反应1h，再升至室温反应18h。加水淬灭反应，水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合并有机相，用200ml饱和食盐水水洗一次后蒸发溶剂至干。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:4梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-4共14.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.82–6.71(m,2H),5.90(ddd,J＝25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.36–4.21(m,3H),4.18(t,J＝4.9Hz,1H),4.05(ddq,J＝9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J＝4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J＝6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理论：629.24，实测：629.51。
(1-b-3)VP-U-5的合成：
将VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶于100ml四氢呋喃，加入三乙胺三氢氟酸(17.96g，111.45mmol)，室温搅拌20h反应完全。直接蒸发溶剂至干，再用二氯甲烷溶解随后蒸干2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-5共6.70g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),6.77(dd,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.99–5.82(m,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.1Hz,1H),5.10(dd,J＝5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J＝9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J＝6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12–3.98(m,3H),3.39(s,2H),1.32(td,J＝6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理论：391.13，实测：391.38。
(1-b-4)VP-U-6的合成：
在氩气保护条件下向10ml无水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)，双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室温搅拌反应5小时。蒸除溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:乙腈(含0.5重量％三乙胺)＝3:1-1:3梯度洗脱)，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理论：591.23，实测：591.55。表明VP-U-6是目标产物VP-Um，作为核苷单体参与RNA链合成。
(1-c)5'-P修饰的引入
对于siRNA 1、3、4、5、9，其反义链5'-末端第一个核苷酸处具有5'-P修饰，按照固相亚磷酰胺法制备反义链过程中，在连接反义链最后一个核苷单体后，再经脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应，将CPR-I单体(苏州吉玛，货号Cat#13-2601-XX)连接至反义链5'末端，形成5'-磷酸酯修饰(5'-P修饰)。
所述脱保护、偶联、盖帽、氧化反应的条件和所用试剂与前述固相亚磷酰胺法中的相应反应相同。
在引入上述5'-P修饰之后，再进行如前所述的切割-脱保护步骤，获得反义链AS。
采用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测纯度；采用液质联用(LC-MS)分析分子量。实测值与理论值相符，表明所合成的是具有目标序列的反义链AS。
(1-d)退火形成双链siRNA
使用DEPC水(购自Amresco，货号E174)分别溶解等摩尔的正义链和反义链，配置出所需要的浓度，加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。
对于获得的双链siRNA，通过LC-MS对其分子量进行检测，确认产物结构与目标siRNA一致，表明获得的是具有目标序列的双链siRNA。
表2 siRNA序列
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dT表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
实验例1siRNA在Hela细胞中对CTGF mRNA表达量的抑制效率检测。
使用LipofectamineTM2000将制备例1中得到的siRNA分别转染至Hela细胞中，siRNA终浓度为50nM。每个siRNA转染3个复孔。未经任何siRNA处理的细胞作为空白对照。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)检测转染了各siRNA的Hela细胞中CTGF mRNA的表达量。具体步骤为：培养转染的细胞24小时后，使用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒(Promega公司，货号A3500)按其说明书的操作方法反转录得到cDNA。使用2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0956)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行CTGF mRNA表达量的检测。其中，用于扩增CTGF和作为内参基因的GAPDH的PCR引物如表3所示。
表3引物信息
CTGF mRNA表达量按下式计算：CTGF mRNA表达量＝(测试组CTGF mRNA的表达量/测试组GAPDH mRNA的表达量)/(对照组CTGF mRNA的表达量/对照组GAPDH mRNA的表达量)×100％。
mRNA抑制率＝(1-CTGF mRNA表达量)×100％。其中，各测试组为分别经各siRNA处理的Hela细胞，对照组为未经siRNA处理的Hela细胞。结果如表4所示。
表4 siRNA体外活性检测
siRNA 编号 mRNA抑制率(％)
siRNA N1 siCTGF1 80
siRNA 1 siCTGFa1M1SP 77
siRNA 2 siCTGFa1M1SVP 80
siRNA 3 siCTGFa1M2SP 68
siRNA 4 siCTGFa1M3SP 57
siRNA N2 siCTGF2 81
siRNA 5 siCTGFb1M1SP 79
siRNA 6 siCTGFb1M1S 76
siRNA 7 siCTGFb1M2S 66
siRNA 8 siCTGFb1M3S 58
siRNA N3 siCTGF3 76
siRNA 9 siCTGFc1M1SP 72
siRNA 10 siCTGFc1M1 68
siRNA 11 siCTGFc1M2 57
siRNA 12 siCTGFc1M3 48
mRNA抑制率为3个复孔中siRNA对TIMP-1mRNA抑制率的平均值。
由表4可见，本公开提供的修饰的siRNA在Hela细胞系中有较高的抑制活性。
实验例2siRNA在溶酶体中的稳定性检测
经溶酶体裂解液处理的测试样品制备：将制备例1中各siRNA(20μM)6μl分别与27.2μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、4.08μL去离子水和2.72μL鼠源溶酶体裂解液(Rat LiverTritosomes，Xenotech公司，货号R0610.LT，批号1610069)混匀，酸性磷酸酶终浓度为0.2mU/μL。37℃恒温孵育。分别在0、2、6、24小时各取出5μl混合液，加入到15μL 9M的尿素溶液中变性，随后加入4μl 6×上样缓冲液(索莱宝公司，货号20160830)，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。0小时表示，将待测样品与溶酶体裂解液混匀后，立即取出的时刻。
未经溶酶体裂解液处理的参比样品制备：取等摩尔量的siRNA(20μM)各1.5μl分别与7.5μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、1μL去离子水混匀，加入30μL 9M的尿素溶液变性，随后加入8μL 6×上样缓冲液混匀，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。标记为M。
配制16重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，上述测试样品及参比样品各取20μl上样至凝胶，在20mA恒流条件下电泳10min后，继续在40mA恒流条件下电泳30min。电泳结束后，将凝胶置于摇床上，用Gelred染料(BioTium公司，货号13G1203)染色10min。凝胶成像观察并拍照，对电泳条带进行灰度分析。表5显示了表2中所列的测试siRNA在体外溶酶体裂解液中的稳定性半定量检测结果。该结果以测试siRNA与Tritosomes孵育后残留的最长片段与未经Tritosome处理的siRNA最长片段的比例(RL)表示。
表5 siRNA的Tritosome稳定性半定量结果
由表5可见，本公开提供的修饰的siRNA在鼠源溶酶体中至少能够稳定存在24小时。
以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术有限公司
<120> 抑制CTGF基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
<130> 12673RIBO
<160> 124
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
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<400> 105
guuugagcuu ucuggcugc 19
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gcagccagaa agcucaaacu u 21
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
cuguacuaca ggaagaugu 19
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
acaucuuccu guaguacagc g 21
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
cuguacuaca ggaagaugu 19
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
acaucuuccu guaguacagc g 21
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
cuguacuaca ggaagaugu 19
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
acaucuuccu guaguacagc g 21
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
cuguacuaca ggaagaugu 19
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
acaucuuccu guaguacagc g 21
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
cacccgggtt accaatgaca 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
tccgggacag ttgtaatggc 20
<210> 117
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ggtcggagtc aacggattt 19
<210> 118
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
ccagcatcgc cccacttga 19
<210> 119
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
acauuaagaa gggcaaaaat t 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
uuuuugcccu ucuuaaugut t 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
guuugagcuu ucuggcugct t 21
<210> 122
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gcagccagaa agcucaaact t 21
<210> 123
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
cuguacuaca ggaagaugut t 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
acaucuuccu guaguacagt t 21

Claims (20)

1.一种能够抑制CTGF基因表达的siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列II的至少第2-19位与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列选自CTGF mRNA第700-1050位区域中长度为19个连续核苷酸的序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的5'末端的第一个核苷酸是反义链5'末端的第一个核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸；其中，
所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于1个核苷酸差异，所述核苷酸序列Ⅱ与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于1个核苷酸差异：
5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAZa1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Zb1UUUUGCCCUUCUUAAUGU-3'(SEQ ID NO:2)，
其中，Za1为A，Zb1为U，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za1的核苷酸ZA1，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb1的核苷酸ZB1，所述ZB1是所述反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA1是与ZB1互补的核苷酸，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB1位置处的差异，且ZB1选自A、C或G；或者
所述核苷酸序列Ⅰ与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于1个核苷酸差异，所述核苷酸序列Ⅱ与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于1个核苷酸差异：
5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGZa2-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Zb2CAGCCAGAAAGCUCAAAC-3'(SEQ ID NO:4)，
其中，Za2为C，Zb2为G，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za2的核苷酸ZA2，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb2的核苷酸ZB2，所述ZB2是所述反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA2是与ZB2互补的核苷酸，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB2位置处的差异，且ZB2选自A、U或C；或者
所述核苷酸序列Ⅰ与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列长度相等，且不多于1个核苷酸差异，所述核苷酸序列Ⅱ与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列长度相等，且不多于1个核苷酸差异：
5'-CUGUACUACAGGAAGAUGZa3-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Zb3CAUCUUCCUGUAGUACAG-3'(SEQ ID NO:6)，
其中，Za3为U，Zb3为A，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za3的核苷酸ZA3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb3的核苷酸ZB3，所述ZB3是所述反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA3是与ZB3互补的核苷酸，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB3位置处的差异，且ZB3选自U、C或G；
所述位置对应是指从核苷酸序列相同端起算，处于核苷酸序列中相同的位置。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:7所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:8所示的序列；或者
所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:9所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:10所示的序列；或者
所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:11所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:12所示的序列；
5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAZA1-3'(SEQ ID NO:7)，
5'-ZB1UUUUGCCCUUCUUAAUGU-3'(SEQ ID NO:8)；
5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGZA2-3'(SEQ ID NO:9)，
5'-ZB2CAGCCAGAAAGCUCAAAC-3'(SEQ ID NO:10)；
5'-CUGUACUACAGGAAGAUGZA3-3'(SEQ ID NO:11)，
5'-ZB3CAUCUUCCUGUAGUACAG-3'(SEQ ID NO:12)；
其中，
ZB1是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA1选自A、U、G或C，并且ZB1是与ZA1互补的核苷酸；
ZB2是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA2选自A、U、G或C，并且ZB2是与ZA2互补的核苷酸；
ZB3是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA3选自A、U、G或C，并且ZB3是与ZA3互补的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其中，所述ZA1为A，ZB1为U；ZA2为C，ZB2为G；ZA3为U，ZB3为A。
4.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，并且所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列，所述实质上反向互补是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配，所述完全反向互补是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
5.根据权利要求4所述的siRNA，其中，所述siRNA为如下siRNA中的一种：
1)所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:7所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:8所示的序列，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为G和A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A、G和A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为G、A、G和A；
2)所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:9所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:10所示的序列，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A和A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C、A和A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为U、C、A和A；
3)所述核苷酸序列I为SEQ ID NO:11所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQ ID NO:12所示的序列，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C和G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为U、C和G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A、U、C和G。
6.根据权利要求5所述的siRNA，其中，所述反义链还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，所述核苷酸序列V连接在所述反义链的3'末端，构成所述反义链的3'突出端。
7.根据权利要求6所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补；所述第三段核苷酸序列是指靶mRNA中与第二段核苷酸序列相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述反义链还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，所述核苷酸序列V连接在所述反义链的3'末端，构成所述反义链的3'突出端。
9.根据权利要求8所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补；所述第三段序列是指靶mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述siRNA为如下siRNA中的一种：
所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQID NO:14所示的核苷酸序列：
5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAZA1-3'(SEQ ID NO:13)；
5'-ZB1UUUUGCCCUUCUUAAUGUUC-3'(SEQ ID NO:14)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列：
5'-GAACAUUAAGAAGGGCAAAAZA1-3'(SEQ ID NO:15)；
5'-ZB1UUUUGCCCUUCUUAAUGUUCUC-3'(SEQ ID NO:16)；
其中，所述ZB1是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA1选自A、U、G或C，并且ZB1是与ZA1互补的核苷酸；或者
所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列：
5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGZA2-3'(SEQ ID NO:17)；
5'-ZB2CAGCCAGAAAGCUCAAACUU-3'(SEQ ID NO:18)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列：
5'-AAGUUUGAGCUUUCUGGCUGZA2-3'(SEQ ID NO:19)；
5'-ZB2CAGCCAGAAAGCUCAAACUUGA-3'(SEQ ID NO:20)；
其中，所述ZB2是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA2选自A、U、G或C，并且ZB2是与ZA2互补的核苷酸；或者
所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列：
5'-CUGUACUACAGGAAGAUGZA3-3'(SEQ ID NO:21)；
5'-ZB3CAUCUUCCUGUAGUACAGCG-3'(SEQ ID NO:22)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列：
5'-CGCUGUACUACAGGAAGAUGZA3-3'(SEQ ID NO:23)；
5'-ZB3CAUCUUCCUGUAGUACAGCGAU-3'(SEQ ID NO:24)；
其中，所述ZB3是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA3选自A、U、G或C，并且ZB3是与ZA3互补的核苷酸。
11.根据权利要求10所述的siRNA，其中，所述siRNA为如下siRNA中的一种：
siCTGFa1
正义链：5'-ACAUUAAGAAGGGCAAAAA-3'(SEQ ID NO:25)
反义链：5'-UUUUUGCCCUUCUUAAUGUUC-3'(SEQ ID NO:26)
siCTGFa2
正义链：5'-GAACAUUAAGAAGGGCAAAAA-3'(SEQ ID NO:27)
反义链：5'-UUUUUGCCCUUCUUAAUGUUCUC-3'(SEQ ID NO:28)
siCTGFb1
正义链：5'-GUUUGAGCUUUCUGGCUGC-3'(SEQ ID NO:29)
反义链：5'-GCAGCCAGAAAGCUCAAACUU-3'(SEQ ID NO:30)
siCTGFb2
正义链：5'-AAGUUUGAGCUUUCUGGCUGC-3'(SEQ ID NO:31)
反义链：5'-GCAGCCAGAAAGCUCAAACUUGA-3'(SEQ ID NO:32)
siCTGFc1
正义链：5'-CUGUACUACAGGAAGAUGU-3'(SEQ ID NO:33)
反义链：5'-ACAUCUUCCUGUAGUACAGCG-3'(SEQ ID NO:34)
siCTGFc2
正义链：5'-CGCUGUACUACAGGAAGAUGU-3'(SEQ ID NO:35)
反义链：5'-ACAUCUUCCUGUAGUACAGCGAU-3'(SEQ ID NO:36)。
12.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基，和/或所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
13.根据权利要求12所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
14.根据权利要求12所述的siRNA，其中，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由式(2)-式(6)中的一个所示的核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
15.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述siRNA为siCTGFa1M1、siCTGFa2M1、siCTGFa1M1S、siCTGFa2M1 S、siCTGFa1M1P1、siCTGFa2M1P1、siCTGFa1M1SP1、siCTGFa2M1SP1、siCTGFb1M1、siCTGFb2M1、siCTGFb1M1S、siCTGFb2M1 S、siCTGFb1M1P1、siCTGFb2M1P1、siCTGFb1M1SP1、siCTGFb2M1SP1、siCTGFc1M1、siCTGFc2M1、siCTGFc1M1S、siCTGFc2M1S、siCTGFc1M1P1、siCTGFc2M1P1、siCTGFc1M1SP1和siCTGFc2M1SP1所示siRNA中的任意一种：
siCTGFa1M1
S：
AmCmAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:43)
AS：
UmUfUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmUmCm
(SEQ ID NO:44)
siCTGFa2M1
S：
GmAmAmCmAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:45)
AS：
UmUfUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmUmCmUmCm
(SEQ ID NO:46)
siCTGFa1M1S
S：
AmsCmsAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:47)
AS：
UmsUfsUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmsUmsCm
(SEQ ID NO:48)
siCTGFa2M1S
S：
GmsAmsAmCmAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:49)
AS：
UmsUfsUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmUmCmsUmsCm
(SEQ ID NO:50)
siCTGFa1M1P1
S：
AmCmAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:51)
AS：
P1-UmUfUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmUmCm
(SEQ ID NO:52)
siCTGFa2M1P1
S：
GmAmAmCmAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:53)
AS：
P1-UmUfUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmUmCmUmCm
(SEQ ID NO:54)
siCTGFa1M1SP1
S：
AmsCmsAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:55)
AS：
P1-UmsUfsUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmsUmsCm
(SEQ ID NO:56)
siCTGFa2M1SP1
S：
GmsAmsAmCmAmUmUmAmAfGfAfAmGmGmGmCmAmAmAmAmAm
(SEQ ID NO:57)
AS：
P1-UmsUfsUmUmUmGfCmCmCmUmUmCmUmUfAmAfUmGmUmUmCmsUmsCm
(SEQ ID NO:58)
siCTGFb1M1
S：
GmUmUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:59)
AS：
GmCfAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmUmUm
(SEQ ID NO:60)
siCTGFb2M1
S：
AmAmGmUmUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:61)
AS：
GmCfAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmUmUmGmAm
(SEQ ID NO:62)
siCTGFb1M1S
S：
GmsUmsUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:63)
AS：
GmsCfsAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmsUmsUm
(SEQ ID NO:64)
siCTGFb2M1S
S：
AmsAmsGmUmUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:65)
AS：
GmsCfsAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmUmUmsGmsAm
(SEQ ID NO:66)
siCTGFb1M1P1
S：
GmUmUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:67)
AS：
P1-GmCfAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmUmUm
(SEQ ID NO:68)
siCTGFb2M1P1
S：
AmAmGmUmUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:69)
AS：
P1-GmCfAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmUmUmGmAm
(SEQ ID NO:70)
siCTGFb1M1SP1
S：
GmsUmsUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:71)
AS：
P1-GmsCfsAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmsUmsUm
(SEQ ID NO:72)
siCTGFb2M1SP1
S：
AmsAmsGmUmUmUmGmAmGfCfUfUmUmCmUmGmGmCmUmGmCm
(SEQ ID NO:73)
AS：
P1-GmsCfsAmGmCmCfAmGmAmAmAmGmCmUfCmAfAmAmCmUmUmsGmsAm
(SEQ ID NO:74)
siCTGFc1M1
S：
CmUmGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:75)
AS：
AmCfAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmCmGm
(SEQ ID NO:76)
siCTGFc2M1
S：
CmGmCmUmGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:77)
AS：
AmCfAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmCmGmAmUm
(SEQ ID NO:78)
siCTGFc1M1S
S：
CmsUmsGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:79)
AS：
AmsCfsAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmsCmsGm
(SEQ ID NO:80)
siCTGFc2M1S
S：
CmsGmsCmUmGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:81)
AS：
AmsCfsAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmCmGmsAmsUm
(SEQ ID NO:82)
siCTGFc1M1P1
S：
CmUmGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:83)
AS：
P1-AmCfAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmCmGm
(SEQ ID NO:84)
siCTGFc2M1P1
S：
CmGmCmUmGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:85)
AS：
P1-AmCfAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmCmGmAmUm
(SEQ ID NO:86)
siCTGFc1M1SP1
S：
CmsUmsGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:87)
AS：
P1-AmsCfsAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmsCmsGm
(SEQ ID NO:88)
siCTGFc2M1SP1
S：
CmsGmsCmUmGmUmAmCmUfAfCfAmGmGmAmAmGmAmUmGmUm
(SEQ ID NO:89)
AS：
P1-AmsCfsAmUmCmUfUmCmCmUmGmUmAmGfUmAfCmAmGmCmGmsAmsUm
(SEQ ID NO:90)
其中，序列方向是5'-3'方向，S指正义链，AS指反义链；大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
16.一种药物组合物，其中，该药物组合物含有权利要求1-15中任意一项所述的siRNA和药学上可接受的载体。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中，所述siRNA与所述药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)。
18.根据权利要求16所述的药物组合物，其中，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-50)。
19.权利要求1-15中任意一项所述的siRNA和/或权利要求16-18中任意一项所述的药物组合物在制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物中的应用，其中，所述疾病为肝纤维化。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-15中任意一项所述的siRNA和/或权利要求16-18中任意一项所述的药物组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116940681A (zh) * 2021-04-22 2023-10-24 上海拓界生物医药科技有限公司 靶向第13型17β-羟基类固醇脱氢酶的siRNA和siRNA缀合物
CN118076738A (zh) * 2021-12-16 2024-05-24 上海拓界生物医药科技有限公司 靶向LPA的siRNA及缀合物
CN118302526A (zh) * 2021-12-16 2024-07-05 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用
CN118339294A (zh) * 2021-12-16 2024-07-12 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107075516A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 阿尔尼拉姆医药品有限公司 经修饰的双链rna试剂
CN108251420A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 苏州瑞博生物技术有限公司 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP7049262B2 (ja) * 2016-04-11 2022-04-06 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 結合組織成長因子を標的とするｒｎａ複合体を用いた特発性肺胞線維症の治療

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107075516A (zh) * 2014-08-20 2017-08-18 阿尔尼拉姆医药品有限公司 经修饰的双链rna试剂
CN108251420A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 苏州瑞博生物技术有限公司 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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