CN112876534B - 肝靶向化合物及缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于与活性剂例如寡核苷酸形成缀合物的化合物，该化合物具有如式(I)所示的结构。本公开还提供了相应的缀合物，以及寡核苷酸缀合物用于调控肝细胞中的基因表达，以及所述缀合物在制备用于预防和/或治疗相关疾病的药物中的用途。本公开的缀合物能够特异性地靶向肝细胞，从而有效解决寡核苷酸药物的体内递送的相关问题，毒性低，并在保持所递送的寡核苷酸高度稳定的同时，还具有优异的递送效率。
Description
技术领域
本发明涉及使用靶向配体递送活性剂的领域。具体而言，本发明涉及一种新的肝靶向化合物及包含该化合物的缀合物，特别是寡核苷酸缀合物、以及它们的制备方法和用途。
背景技术
寡核苷酸化合物在医学上具有重要的治疗应用。寡核苷酸可用于对特定基因进行调控。这类寡核苷酸化合物包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ASO)，小激活RNA(saRNA)和微小RNA(microRNA)等寡核苷酸化合物。在具体治疗应用中，可选择仅在特定组织或位置表达的寡核苷酸及其类似物，从而针对特定靶点处的相关疾病或症状进行治疗。
尽管以特定寡核苷酸和寡核苷酸类似物为代表的组织特异性活性剂在作为治疗剂的应用方面已取得部分进展，但是仍然存在对其药理特性的改进的需求，例如使其靶向性地递送至病灶以提高治疗剂的选择性，提高其生物活性及功效。最近靶向缀合递送技术成为一类研究最广泛的递送***，主要集中于肝靶向递送。
发明内容
第一方面，本发明提供一种新的肝靶向化合物(以下有时也称为“缀合分子”)，该化合物具有式(I)所示的结构：
其中，
m代表1-6的整数；
每个R2独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
L1代表羰基、羰基(C1-C10亚烷基)或者羰基-(氧乙基)k，其中k代表1-10的整数；
G代表第一羟基保护基团；
L2代表氨基或羟基，或者能够与氨基或羟基形成共价键的任意基团；或者
L2包含通过所述共价键连接的固相载体；
E代表对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体M1，或者
代表所述配体M1中的活性羟基，如果有的话，全部被第二羟基保护基团取代而形成的基团；
每个L3是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且，
每个L3任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。
第二方面，本发明提供一种新的寡核苷酸缀合物，该缀合物具有式(II)所示的结构：
其中，
E1为OH、SH或BH2，Nu代表功能性寡核苷酸；
m代表1-6的整数；
每个R2独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
L1代表羰基、羰基(C1-C10亚烷基)或者羰基-(氧乙基)k，其中k代表1-10的整数；
E2代表氨基、羟基、-氨基(C1-C10亚烃基)氨基、-氨基(C1-C10亚烃基)羟基、-羟基(C1-C10亚烃基)氨基或羟基(C1-C10亚烃基)羟基，所述亚烃基任选地具有一个或多个取代基，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
M1代表对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体；
每个L3是长度为1-70个碳原子的直链烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且
每个L3可任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。
第三方面，本发明提供式(I)的肝靶向化合物以及式(II)的寡核苷酸缀合物的制备方法。
第四方面，本发明提供调控肝细胞中基因表达的方法，所述调控包括抑制或增强所述基因的表达，该方法包括将本发明的寡核苷酸缀合物与所述肝细胞进行接触。
本发明的寡核苷酸缀合物在肝细胞中显示出较高的基因表达抑制活性，并且预期能够有效提高siRNA在体内递送效率、具有低的毒性和脱靶效应和/或优异的稳定性，从而，与现有的寡核苷酸制剂相比，本发明的寡核苷酸缀合物有望达到更好的治疗效果，从而具有广泛的工业应用前景。
本发明的其他特征和有益效果将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
以引用的方式并入本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
定义
在上文及下文中，特别是在描述本公开的递送化合物(以下，有时也称为“本公开的缀合分子”或简称为“缀合分子”)的制备方法或寡核苷酸缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的RNA序列，所述“未修饰或修饰RNA亚磷酰胺(unmodified or modified RNA phosphoramidite)”，分别用于所谓的固相亚磷酰胺合成，固相亚磷酰胺合成是本领域合成RNA众所周知的方法。在本文中RNA亚磷酰胺同时也指核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidites)。除非另有说明，本公开所使用的核苷酸单体均可商购得到。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)是用于指示取代基连接点的位置。例如：-C1-C10烷基-NH2通过C1-C10烷基而连接。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或状况发生的情况和其中不发生的情况。例如，“任选的取代的烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或内在不稳定的任何取代或取代型式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1到20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中各自失去一个氢原子而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中各自失去两个氢原子而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指衍生自芳香族单环或多环烃环***、通过从环碳原子中除去氢原子而形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环***仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，其根据Hückel理论包含环状、离域的(4n+2)π-电子***。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的一个子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香碳环，通常具有3至7个环状碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指具有指定数量的碳原子的烷基被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3至18元非芳香族环基，其包含2-12个碳原子和选自氮、氧和硫的1-6个杂原子。除非说明书中另有说明，否则杂环基是单环、双环、三环或四环***，可包括稠环或桥环***。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1oxo thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1dioxo thiomorpholinyl)。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，其包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环***，其中环***中的至少一个环是完全不饱和的，即，根据Hückel理论，包含环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环***。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过环中的任何原子连接。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上附加以及去除，而在实质上并不损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter2,2d ed，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)和叔丁基二甲基硅烷基(TBS或TBDMS)。本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括烃基酰基。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”、“减轻”、或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物或组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种病理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
肝靶向化合物
在一个方面，本发明公开了一种用于递送活性剂或者活性药物的缀合分子。在一些实施方式中，本公开的缀合分子有利于组织特异性靶向。在一些实施方式中，本公开的缀合分子与细胞表面受体结合。为此目的，任何细胞表面受体或者生物标志物或其一部分都被认为是合适的。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地结合到特定组织的特有受体，从而实现组织特异性靶向。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地靶向至肝细胞表面受体，从而特异性地靶向至肝组织。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地靶向至肝细胞特有的细胞表面受体。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地靶向至肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptors，ASGPR)。
如本文所使用的，“活性剂”和“活性药物”可互换使用，都是指能够通过本公开的缀合分子递送的分子。在一些实施方式中，活性剂为能够地送到肝细胞的试剂。这些试剂为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于功能性寡核苷酸，特别是本文公开的那些。
在一些实施方式中，本发明提供一种新的肝靶向化合物，该化合物具有式(I)所示的结构：
其中，
m代表1-6的整数；
每个R2独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
L1代表羰基、羰基(C1-C10亚烷基)或者羰基-(氧乙基)k，其中k代表1-10的整数；
G代表第一羟基保护基团；
L2代表氨基或羟基，或者能够与氨基或羟基形成共价键的任意基团；或者
L2包含通过所述共价键连接的固相载体；
E代表对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体M1，或者
代表所述配体M1中的活性羟基，如果有的话，全部被第二羟基保护基团取代而形成的基团；
每个L3是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且，
每个L3任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。
在一些实施方式中，m可选自2-5的整数，从而保证所述肝靶向化合物(I)(也称为“缀合分子”)中E基团的个数至少为2；在一些实施方式中，m≥3，这样可以使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物(II)中，M1配体的个数可能至少为3，从而使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进寡核苷酸缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中m为2-4的整数。
在一些实施方式中，每个R2彼此独立地为H、甲基或乙基；在一些实施方式中，每个R2均为H；
L1的作用是为肝靶向化合物与寡核苷酸的连接提供合适的空间位置和化学环境。为此，在一些实施方式中，L1代表羰基、羰基(C1-C10亚烷基)或者羰基-(氧乙基)k，其中k代表1-10的整数。在一些实施方式中，L1为羰基(C2-C6亚烷基)或者羰基(氧乙基)k，其中，k为2-7的整数、优选2-4的整数。在一些实施方式中，L1为羰基亚丁基。
G代表第一羟基保护基团。在一些实施方式中，所述第一羟基保护基团在合适的条件下水解释放出活性羟基，用于形成与寡核苷酸之间的共价连接。根据期望的后续合成工艺对羟基保护基团G进行选择。例如，G可以选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4’,4”-三甲氧基苯甲基和叔丁基二甲基硅烷基(TBS或TBDMS)中的任意一种；在一些实施方式中，G为4,4’-双甲氧基三苯甲基(DMTr)。
在一些实施方式中，L2包含能够通过共价键连接至固相载体的基团。在一些实施方式中，L2包含能够通过烃基二酸桥接，从而通过与固相载体上的羟基或氨基形成酰胺键或酯键而连接的基团。在一些实施方式中，L2代表-氨基(C1-C10烷基醇)或者-氨基(乙氧基)q2乙醇，其中q2代表1-10的整数、优选2-7的整数。在另外的实施方式中，L2具有能够与固相载体上的羟基或氨基形成酯键或酰胺键而连接的基团；在一些实施方式中，L2包含羧基或阳离子羧酸盐，所述阳离子可以是例如金属离子、铵离子、有机胺形成的阳离子或季铵阳离子。在一些实施方式中，L2包含氧酰亚烷基羧基(或羧酸盐)或氨酰亚烷基羧基(或羧酸盐)。在一些实施方式中，L2包含通过与羟基或氨基形成酯键或酰胺键而连接的固相载体。在一些实施方式中，L2包含氨基或羟基，或L2包含由式(C1)、(C2)、(C3)、(C4)、(C1')、(C3')或(C4')表示的结构：
式中，每个q1独立地为1-5的整数，每个X独立地为O或NH，M+为阳离子；在一些实施方式中，M+选自氢离子、铵离子、碱金属离子或碱土金属离子中的任一种，SPS表示固相载体，表示基团共价连接的位点。
E代表对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体M1，或者
代表所述配体M1中的活性羟基(如果有的话)全部被第二羟基保护基团保护而形成的基团。在本公开的一些实施方式中，被所述第二羟基保护基团保护的羟基具有YCOO-的形式，其中每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基和C6-C10芳基，所述C1-C10烷基或C6-C10芳基任选地具有一个或多个取代基，所述取代基选自于由卤素取代基和C1-C6烷基所组成的组。在一些实施方式中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及C1-C6烷基苯基中的一种；
所述对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体M1可能是任何与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲合力的配体，这些配体的种类为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，至少一个配体M1为糖类。在一些实施方式中，每个配体为糖。在一些实施方式中，至少一个配体M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，每个配体M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，至少一个配体M1是修饰的糖。在一些实施方式中，每个配体M1为修饰的糖。在一些实施方式中，每个配体M1独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖或单糖衍生物。在一些实施方式中，每个或至少一个配体M1可能独立地选自由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖和麦芽糖及其衍生物、***糖及其衍生物、果糖及其衍生物以及唾液酸。
在一些实施方式中，所述配体M1可能独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在一些实施方式中，至少一个M1为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)；在一些实施方式中，每个M1均为N-乙酰基半乳糖胺。在一些实施方式中，配体M1的选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。CN105378082A公开了一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团及1个或多个配体，每个配体选自多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。据称，该化合物可以降低细胞中核酸转录物的量或活性。
WO2016077321A1公开了众多特异性靶向HBV基因的siRNA以及对其进行递送的方法，并通过对siRNA的核苷酸进行修饰，从而增强了其血清稳定性。该文献还公开了siRNA缀合物，并且进一步具体公开了数种具有特定结构的siRNA缀合物。
WO2016168286A1公开了众多特异性靶向ANGPTL3基因的siRNA以及对其进行递送的方法，并通过对siRNA的核苷酸进行修饰，从而增强了其血清稳定性。该文献还公开了siRNA缀合物。
N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)，是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的配体。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了较好的效果。例如，阿尔尼拉姆公司(Alnylam pharmaceuticals,Inc.)首次报道了基于GalNAc缀合技术的siRNA在小鼠体内发挥干扰活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)。文章报道了三簇GalNAc缀合的siRNA，在体内外实验中均展现了良好的递送活性。通过皮下给药的小鼠体内实验，单一剂量的ED50为1mg/kg，单次注射剂量小于1ml。在长期给药实验中，每周皮下注射一次，可获得长达9个月的稳定干扰活性。
在一些实施方式中，每个或至少一个所述配体选自下述中的任意一种：α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖。
在一些优选实施方案中，每个E独立地选自式A46-A54基团中的一种：
在一些实施方式中，E为式A49或A50。在一些实施方式中，每个Y均为甲基。
L3的作用是为上述配体与本公开式(I)中的吡咯烷环上的N原子提供连接，从而为本公开的寡核苷酸缀合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L3独立地选自于由式A1-A26基团及其任意组合所组成的组：
其中，每个j1独立地为1-20的整数；
每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10-烷基；
每个Ra独立地选自于由式A27-A45基团及其任意组合所组成的组：
/>
每个Rb独立地为C1-C10-烷基；
表示基团共价连接的位点。
在一些实施方式中，L3选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L3选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，L3选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中，L3的长度可能为3-25、3-20、4-15或5-12个原子。在一些实施方式中，L3的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55或60个原子。所述L3的长度是指与式(I)化合物中吡咯烷环上的N原子连接的原子到与E连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数。
根据本公开的一些实施方式，每个j1独立地为2-10的整数，在一些实施方式中，每个j1独立地为3-5的整数。在一些实施方式中，每个j2独立地为2-10的整数；在一些实施方式中，每个j2独立地为3-5的整数。每个R’独立地为C1-C4的烷基，在一些实施方式中，每个R’独立地为甲基、乙基和异丙基中的一种。在一些实施方式中，每个Ra独立地为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，每个Ra独立地为A27或A28。在一些实施方式中，每个Rb独立地为C1-C5的烷基，在一些实施方式中，每个Rb独立地为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现所述配体与吡咯烷环上的N的稳定连接，并使所述配体之间的空间位置更适合所述配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
在一个具体实施方案中，本发明的肝靶向化合物具有式(I-1)、(I-2)、(I-3)、(I-4)、(I-5)或(I-6)所示的结构：
/>
/>
其中，SPS表示固相载体；
固相载体可以是本领域中公知的可用于核酸固相合成的固相载体，例如，市售的通用固相载体(HL UnyLinkerTM300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，结构如式B80所示)：
其中，Resin表示树脂。
在一些实施方式中，SPS表示树脂。在一些实施方式中，SPS可以是羟基或氨基树脂、或者SPS进一步包含连接基团，此时L1可直接地、或通过该连接基团与树脂上的羟基或氨基形成共价键连接。
式(I)化合物的制备
可以采用任意合理的合成路线制备式(I)化合物。
例如，在一些实施方式中，式(I)中的L2基团具有羟基，此时，式(I)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，使式(X-11)化合物与脱保护剂接触以脱除式(X-11)化合物中的羟基保护基团X11，分离。
其中，L1、L3、G、E、R2、m的定义如前所述；
L11为连接基团，其通过连接羟基而获得上述的L2基团；X11为羟基保护基团。
所述有机溶剂可以是卤代烷类、醚类或腈类溶剂；在一些实施方式中，所述有机溶剂为四氢呋喃(THF)。所述有机溶剂的用量相对于式(X-11)化合物而言可以是5-50L/mol，例如为8-20L/mol。依据所使用的羟基保护基团X11，对所述脱保护剂进行选择。例如，在一些实施方式中，羟基保护基团X11为四甲基硅烷基(TMS)或叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)，此时，所述脱保护剂可以是例如四丁基氟化铵(TBAF)。所述脱保护剂的用量相对于式(X-11)化合物而言的摩尔比可以是2:1-10:1，例如为4:1-6:1。反应可以在适当的温度、如0-25℃下进行2-8小时。在一些实施方式中，所述反应在室温下进行4h。在一些实施方式中，所述反应在冰浴中进行8h。在一些实施方式中，可以使用例如柱色谱对反应产生的式(I)化合物进行分离，分离条件可以是例如使用乙酸乙酯:甲醇＝100:1-8:1(V:V)的梯度洗脱进行。在本发明的一个具体实施例中，式(X-11)的化合物为例如下文PNB-11所示的化合物。
本领域技术人员可通过任意的方法获得或制备式(X-11)化合物。在一些实施方式中，所述式(X-11)化合物可通过以下制备方法得到：在有机溶剂中，在缩合催化剂和有机碱存在下，使式(X-10)化合物与式(X-22)化合物接触以进行缩合反应，分离。
其中，L1、L3、G、E、m、R2、L11、X11的定义如前所述；
所述有机溶剂可以是卤代烷类、醚类或腈类溶剂；在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。所述有机溶剂的用量相对于式(X-10)化合物而言可以是5-30L/mol，例如是8-20L/mol。缩合剂可选择本领域中适当的成酰胺缩合剂。在一些实施方式中可以是例如2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。所述缩合剂的用量相对于式(X-10)化合物而言的摩尔比可以是2:1-10:1，例如为3:1-6:1。所述有机碱可以是例如胺类有机碱，在一些实施方式中可以使用三乙胺或N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。所述有机碱的用量相对于式(X-10)化合物而言的摩尔比可以是1.5:1-8:1，例如为2:1-5:1。反应可以在适当的温度、如0-25℃下进行2-8小时。在一些实施方式中，所述反应在冰浴中进行4h。在一些实施方式中，可通过例如LC-MS监测反应终点。在一些实施方式中，可以使用例如柱色谱对反应产生的式(X-11)化合物进行分离，分离条件可以是例如使用乙酸乙酯:甲醇＝100:1-12:1的梯度洗脱进行。
式(X-22)化合物可由本领域技术人员通过任意的方法制备获得，或商购获得。例如，当L1为羰基亚丁基时，式(X-22)化合物可通过市售的羟基戊酸经本领域技术人员公知的方法对羟基进行保护而获得。
本领域技术人员可通过任意的方法获得或制备式(X-10)化合物。在一些实施方式中，所述式(X-10)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，使式(X-9)化合物与有机碱接触以经脱保护反应脱除式(X-9)化合物中的氨基保护基团GN，分离，或者将粗品直接用于后续反应。
其中，L3、E、m、R2、L11、X11的定义如前所述；
GN为上述的氨基保护基团；在一些实施方式中，GN可以是例如Fmoc保护基。
所述有机溶剂可以是卤代烷类、醚类或腈类溶剂；在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。所述有机溶剂的用量相对于式(X-9)化合物而言可以是2-15L/mol，例如是3-8L/mol。所述有机碱可以是例如各种有机胺类碱，如二乙胺、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺；所述有机碱的用量相对于式(X-9)化合物而言的摩尔比可以是5:1-30:1L/mol，例如是6:1-20:1。所述脱保护反应可以在0-40℃下进行1-4h，例如在室温下进行2h，和/或通过薄层色谱(TLC)监控反应进行程度来确定反应终点。在一些实施方式中，反应产物可在例如蒸除溶剂后作为粗品直接用于后续反应。在一些实施方式中，可以使用例如柱色谱对反应产生的式(X-10)化合物进行分离，分离条件可以是例如使用乙酸乙酯:甲醇＝100:1-10:1的梯度洗脱进行。
本领域技术人员可通过任意的方法获得或制备式(X-9)化合物。在一些实施方式中，所述式(X-9)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在缩合剂和有机碱存在下，使式(X-8)化合物与式(X-21)化合物接触以发生缩合反应，分离。
其中，L3、E、m、R2、L11、GN、X11的定义如前所述。
在一些实施方式中，式(X-21)化合物为羧酸，即，L3中具有与式(X-21)中示出的羟基相连接的羰基。此时，式(X-21)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公开的化合物，或者，式(X-21)化合物可由本领域技术人员通过各种方法制备，例如，可参照US 8,106,022B2实施例1中所公开的方法制备某些式(X-21)化合物，以引用的方式将以上文献的全部内容整体并入本文。
所述有机溶剂可以是乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种，所述环氧类溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂在一些实施方式中为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。所述有机溶剂的用量相对于式(X-8)化合物而言可以是3-15L/mol，例如是5-10L/mol。在一些实施方式中，式(X-21)化合物为羧酸，此时，所述缩合剂为成酰胺反应缩合剂。在一些实施方式中，所述成酰胺反应缩合剂为六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在进一步的实施方式中为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(HATU)。所述成酰胺反应缩合剂与式(X-8)所示化合物的摩尔比为1:1-5:1，在一些实施方式中为1.2:1-3:1。所述有机碱可以是三级胺类有机碱。在一些实施方式中，所述三级胺类有机碱为N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；所述三级胺类有机碱与式(X-8)所示化合物的摩尔比为2:1-20:1，在一些实施方式中为3:1-10:1。所述反应可以是在例如冰浴条件下进行2-6小时。可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(X-9)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取、合并有机相后使用盐类溶剂洗涤、在硫酸盐干燥后、随后通过色谱方法分离式(X-9)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用乙酸乙酯:甲醇＝100:1-20:1梯度洗脱；或者(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可直接除去溶剂得到式(X-9)化合物粗产品，该粗产品可直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(X-8)化合物与足量的一种式(X-21)化合物一次反应即生成期望的式(X-9)化合物，此时，各个E-L3部分彼此相同。在一些实施方式中，可根据需要，通过使式(X-8)化合物分批与不同的式(X-21)化合物，即L3和/或E不同的式(X-21)化合物发生反应，使得生成的式(X-9)化合物中含有两种以上的E和/或L3。例如，对于1eq的式(X-8)化合物，可先使其与2eq的第一式(X-21)化合物接触，在式(X-8)化合物中的两个氨基基团上连接第一E-L3部分，随后，使其继续与(m-2)eq的第二式(X-21)化合物接触(m的定义和取值范围如前所述)，从而在式(7)化合物中的(m-2)个氨基基团上连接第二E-L3部分。
本领域技术人员可通过任意的方法获得或制备式(X-8)化合物。在一些实施方式中，所述式(X-8)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在有机碱存在下，使式(X-7)化合物与羟基保护剂接触以将式(X-7)中的羟基转化为经保护的羟基-OX11，分离。
其中，m、L11、R2、GN的定义如前所述。
所述有机溶剂可以是乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种，所述环氧类溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂在一些实施方式中为***和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。所述有机溶剂的用量相对于式(X-7)化合物而言可以是2-15L/mol，例如是3-8L/mol。在一些实施方式中，所述羟基保护剂提供羟基保护基团X11，在一些实施方式中可以是例如叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)，此时X11为叔丁基二甲基硅烷基(-TBS)。所述羟基保护剂与式(X-7)所示化合物的摩尔比为2:1-20:1，在一些实施方式中为3:1-10:1。所述有机碱可以是三级胺类有机碱。在一些实施方式中，所述三级胺类有机碱为N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N,N-二异丙基乙胺；所述三级胺类有机碱与式(X-7)所示化合物的摩尔比为2:1-20:1，在一些实施方式中为5:1-15:1。可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(X-8)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取、合并有机相，使用盐类溶剂洗涤、硫酸盐干燥，随后通过色谱方法分离式(X-8)化合物。在一些实施方式中，可直接除去溶剂得到式(X-8)化合物粗产品，该粗产品可直接用于后续反应。
本领域技术人员可通过任意的方法获得或制备式(X-7)化合物。在一些实施方式中，所述式(X-7)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在溶剂中，使式(X-6)化合物与酸接触以脱除式(X-6)中的氨基保护基团G’N和羟基保护基团X11，分离。
/>
其中，m、L11、R2、GN、X11的定义如前所述。
G’N是与GN相比更易与酸发生反应而脱除的第二氨基保护基团，如，当GN是Fmoc保护基时，G’N可以是例如叔丁氧羰基(Boc)。所述溶剂可以是醇类溶剂、醚类溶剂、酯类溶剂中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为醇类溶剂，如乙醇。所述有机溶剂的用量相比于式(X-6)所示化合物而言为1-10L/mol，在一些实施方式中为1.5-5L/mol。在一些实施方式中，所述酸可以是有机酸或无机酸，例如盐酸(HCl)。为了保证反应完全，所述酸应当是显著过量的，并且与m的取值有关。在m为2-5的情况下，所述酸与式(X-6)所示化合物的摩尔比可以为例如50:1-400:1，在一些实施方式中为100:1-250:1。所述反应可以例如在室温下进行3-6小时，只要能够充分反应即可，和/或使用TLC监测反应终点。可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(X-7)化合物。在一些实施方式中，可直接除去溶剂得到式(X-7)化合物粗产品，该粗产品可直接用于后续反应。
依据m的取值，可以从式(X-1)化合物出发，选择任意合理路线制备式(X-6)化合物。
例如，当m为1时，式(X-6)化合物(m＝1)(以下，也称为式(X-6-1)化合物)可由式(X-1)与式(X-20)所示的化合物在有机溶剂中，在缩合剂存在下接触以发生缩合反应而获得：
X1-L20-OX11
式(X-20)
其中，m、L11、GN、G’N、X11的定义如前所述。
L20为对应于L11基团的部分；X1为氨基或羟基，其与式(X-1)化合物中的羧基发生缩合，连同L20部分共同获得连接基团L11。所述有机溶剂和所述缩合剂可根据本领域公知的成酰胺或成酯方法进行选择。例如，在一些实施方式中，所述有机溶剂可以是二氯甲烷，所述有机溶剂的用量相对于式(X-1)化合物而言可以是5-20Lmol，例如8-15L/mol，所述缩合剂可以是有机碱如二异丙基乙胺(DIPEA)，所述有机碱与式(X-1)化合物的摩尔比为1:1-10:1，例如1.5:1-5:1。所述缩合反应可以在例如室温下进行3h，和/或以TLC监测反应终点。在一些实施方式中，可通过柱色谱分离式(X-6)化合物，例如在正相柱层析条件下，使用200-300目正相硅胶，使用石油醚:乙酸乙酯＝20:1-1:1梯度洗脱，收集洗脱产物并除去溶剂，获得式(X-6)化合物(m＝1)。
式(X-1)化合物可由本领域技术人员按照公知的制备方法容易地制备获得，或由市场购得。例如，当每个R2均为氢、GN为Fmoc保护基、G’N为Boc保护基时，式(X-1)化合物可自安耐吉公司市售购得。
在一些实施方式中，m为≥2的整数。此时，在上述反应的基础上，需要特异性地脱除前一中间体(例如，在制备X-6化合物(m＝2)(类似地，也称为式(X-6-2)化合物)时，以前述X-6-1化合物作为该“前一中间体”；在制备X-6化合物(m＝3)(以下也称为式(X-6-3)化合物)时，以该X-6-2化合物作为该“前一中间体”，以此类推)中的氨基保护基团GN，并将所得的化合物与式(X-1)化合物进行前述缩合反应而获得。缩合反应的溶剂、反应试剂、条件和分离方法与前述相同或不同，可根据期望产物的结构选择适当的试剂、反应条件和方法。
在一些实施方式中，m为3，此时，式(X-6)化合物(式(X-6-3)化合物)可通过以下方法制备：
(i)如前所述，制备式(X-6-1)化合物；
(ii)在有机溶剂中，使式(X-6-1)化合物与碱接触，脱除氨基保护基团GN，分离；其中，所述有机溶剂可以是例如乙腈，所述碱可以是有机碱，进一步可以是胺类有机碱如二乙胺或三乙胺；反应可以在例如室温下进行2h，随后通过例如乙酸乙酯:甲醇＝100:1-10:1(V:V)梯度洗脱柱色谱分离，最终获得式(X-6-1a)化合物；
(iii)在有机溶剂中，在缩合剂存在下，使式(X-1)化合物与式(X-6-1a)化合物接触以发生缩合反应，分离获得式(X-6-2)化合物；其中，所述溶剂、缩合剂和反应条件的选择与步骤(i)相同，并使用例如乙酸乙酯:甲醇＝100:1-15:1梯度洗脱柱色谱分离：
(iv)在有机溶剂中，使式(X-6-2)化合物与碱接触，脱除氨基保护基团GN，分离获得式(X-6-2a)化合物；所述溶剂、试剂与反应条件与步骤(ii)相同，并使用例如乙酸乙酯:甲醇＝100:1-10:1梯度洗脱液柱色谱分离；
(v)在有机溶剂中，在缩合剂存在下，使式(X-1)化合物与式(X-6-2a)化合物接触以发生缩合反应，分离获得式(X-6-3)化合物；其中，所述溶剂、缩合剂和反应条件的选择与步骤(i)相同，并使用例如乙酸乙酯:甲醇＝100:1-8:1梯度洗脱柱色谱分离：
寡核苷酸缀合物
在一方面，本公开提供了一种寡核苷酸缀合物，该缀合物具有式(II)所示的结构：
其中，
E1为OH、SH或BH2；
Nu代表功能性寡核苷酸；
m、L1、L3、R2的定义和可选择的范围与上述相同；
M1代表对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体，所述配体的定义和可选择的范围与上述E中的相同；
E2代表氨基、羟基、-氨基(C1-C10亚烃基)氨基、-氨基(C1-C10亚烃基)羟基、-羟基(C1-C10亚烃基)氨基或羟基(C1-C10亚烃基)羟基，所述亚烃基任选地具有一个或多个取代基，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；在一些实施方式中，E2代表-氨基(C1-C10亚烷基)羟基；在一些实施方式中，E2为羟乙基氨基(-NHCH2CH2OH)。
通过形成式(II)的寡核苷酸缀合物，所述功能性寡核苷酸共价连接至一个或多个对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的M1配体，从而易于富集至肝细胞表面，并进一步进入肝细胞，以实现功能性寡核苷酸的特异性靶向递送。
在本公开中，优选地式(II)的寡核苷酸缀合物中，其中
E1为OH，m为2-4的整数；
每个R2独立地为H、甲基或乙基；或每个R2均为H；
L1为羰基(C2-C6亚烷基)或者羰基(氧乙基)k，其中，k为2-7的整数；
E2表示氨基或-氨基(C2-C6亚烷基)羟基；和/或
Nu、M1、L3的定义和可选择的范围与上述相同。
在一个具体实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物具有式(II-1)、(II-2)或(II-3)所示的结构：
/>
其中，Nu代表功能性寡核苷酸。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物。在下文中，有时也将本公开的寡核苷酸缀合物简称为“缀合物”。更具体地，在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至寡核苷酸、最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。在一些实施方式中，寡核苷酸是siRNA，此时，本公开的缀合物是siRNA缀合物。更具体地，对于本公开而言，“缀合分子”可以是指由式(I)表示的化合物，相应地，“寡核苷酸缀合物”可以是指由式(II)表示的化合物。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指这样的寡核苷酸：所述寡核苷酸能够通过与靶序列之间产生稳定且特异性的杂交，利用RNA激活(RNA activation，RNAa)、RNA干扰(RNA interference，RNAi)、反义核酸技术、外显子跳跃(exon skipping)技术等原理，上调或下调靶基因的表达，或导致mRNA可变剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸还可以是与靶蛋白之间产生稳定且特异性地结合的核酸结构。此外，本领域技术人员容易理解的是，多核苷酸(例如mRNA本身或其片段)也同样适用于与本公开提供的缀合分子缀合形成缀合物以实现靶向递送，比如肝靶向递送，从而调节mRNA转录出的蛋白质的表达。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵盖mRNA或其片段。
在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸能够与靶序列发生相互作用，从而影响靶序列分子的正常功能，如导致发生mRNA断裂或翻译阻遏或外显子跳跃引发mRNA可变剪接等。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以大体上与靶序列的碱基互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以与靶序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的碱基互补，或者与靶序列完全互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1个、2个或3个不与靶序列互补的碱基。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以是单链的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合体(chimera)，或者是双链的DNA、RNA或DNA-RNA杂交体(hybrids)。
由此，在一些实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、核酸适配体(Nucleic Acid Aptamer)、小激活RNA(small activating RNA，saRNA)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。WO2015/006740A2公开了一种不同配体缀合到寡核苷酸的缀合物，其中配体通过接头(linker)与寡核苷酸进行连接，所述寡核苷酸选自小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、适配体(aptamer)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。这些缀合物在寡核苷酸的体内递送上表现出好的稳定性。在进一步的实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公开的寡核苷酸，以引用的方式将其整体内容并入本文。
本公开的寡核苷酸缀合物可通过提高活性剂例如功能性寡核苷酸的肝靶向递送效率，来调节特定细胞如肝细胞中特定基因的异常表达，从而增强功能性寡核苷酸和细胞中靶向序列之间的相互作用。在一些实施方式中，所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在肝细胞中异常表达的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述在肝细胞异常表达的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本公开的上下文中，HBV基因是指序列如Genbank注册号NC_003977.1所示的基因；ANGPTL3基因是指mRNA序列如Genbank注册号NM_014495.3所示的基因；APOC3基因是指mRNA序列如Genbank注册号NM_000040.1所示的基因。
在一些实施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本公开的上下文中，“靶mRNA”是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA，它既可以是过量表达的基因对应的mRNA，或者是表达不足的基因对应的mRNA。由于大部分疾病源于mRNA的过量表达，因此，在本公开中，靶mRNA尤其指过量表达的基因对应的mRNA。在本公开的一些实施方式中，相应于上述异常表达的基因，所述靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因对应的mRNA。在一些实施方式中，所述靶mRNA可以是由对应HBV基因转录而得的mRNA、或者ANGPTL3基因所对应的mRNA、或者APOC3基因所对应的mRNA。
式(II)中的P(磷原子)可以连接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以连接到寡核苷酸的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，所述连接包括但不仅限于所述P通过形成磷酸二酯键(有时也简称为磷酸酯键)而连接至所述核苷酸。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是单链寡核苷酸(例如，单链RNA或者适配体)，此时，式(II)中的P可以连接到所述单链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式(II)中的P连接到所述单链寡核苷酸的末端。
式(II)中的P可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式(II)中的P可通过形成磷酸二酯键而连接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些具体实施方式中，式(II)中的P连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，可将该P及相应的磷酸酯基团视为归属于双链寡核苷酸中的P和磷酸酯基团)，或者式(II)中的P通过取代双链寡核苷酸序列中正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式(II)中的P通过取代双链寡核苷酸序列中正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
在不愿受到限制的情况下，在下面的实施方式和实施例中，详细描述了本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸为小干扰RNA(siRNA)的情况。此时，本公开的寡核苷酸缀合物为siRNA缀合物。在本文的上下文中，为了描述方便，也将这些实施方式中的siRNA缀合物称为本公开的siRNA缀合物。这并不代表本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸仅可以是siRNA，相反，所述寡核苷酸可能是本公开的或者本领域技术人员所熟知的其它替代药物。根据siRNA缀合物的详细说明，可以设想其它功能性寡核苷酸与本公开提供的缀合分子缀合时也会有类似的作用。
本领域技术人员公知，siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常具有活性的，即功能性的siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方式中约为15-30个核苷酸，所述siRNA中的每个核苷酸可以独立地是修饰或未修饰的核苷酸，为了增加稳定性，所述siRNA中至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
本公开的发明人发现，下面的实施方式中所述的siRNA具有较高的活性和/或稳定性，因而可以作为本公开中siRNA的发明目的。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的siRNA(以下，也称为本公开的siRNA)中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成互补双链区，所述核苷酸序列2的至少一部分与第一段核苷酸序列互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是指在3mg/kg的浓度下，能够抑制至少50％乙型肝炎病毒基因表达、至少50％血管生成素样蛋白3基因表达或者至少50％载脂蛋白C3基因表达的siRNA。在一些实施方式中，本公开的siRNA指在浓度为3mg/kg时，能够抑制至少55％、60％、65％、70％、75％或80％HBV基因表达的siRNA。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列。在不愿受到限制的情况下，这些特定的核苷酸差异并不会显著降低siRNA缀合物的靶基因抑制能力，而这些包含特定核苷酸差异的siRNA缀合物也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，该第二段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。因此，所述正义链和反义链的长度可以是19-23个核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；在一些实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为1或2个核苷酸。这样，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、或者和所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一个实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的肝细胞mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA不含修饰的核苷酸基团；在一些实施方式中，本公开的siRNA含有修饰的核苷酸基团。
目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括骨架修饰(也称为核苷酸间连接修饰，如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基被修饰，比如2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。
在本公开的一些实施方式中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基(或修饰的磷酸酯基和/或修饰的核糖基)。本公开的一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的结构。
非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(208)所示。2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(209)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(210)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(211)所示。
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶的基团。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物可以为如异核苷酸、桥联核酸(bridged nucleic acid，简称BNA)核苷酸或无环核苷酸。
BNA核苷酸是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖环的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(212)所示，ENA如式(213)所示，cET BNA如式(214)所示。
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)核苷酸或甘油核酸(GNA)核苷酸，其中，UNA如式(215)所示，GNA如式(216)所示。
其中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(217)或(218)所示。
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“2'-氟代核糖基”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代而形成的具有如式(207)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“2'-甲氧基核糖基”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成如式(208)所示的结构。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸位于前述的核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为-氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：或者按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在本公开所述siRNA的一些具体实施方式中，所述核苷酸含有磷酸基团修饰。在本公开的上下文中，磷酸基团修饰在一个实施方式中为如下式(201)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)修饰，即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。在一些实施方式中，该修饰能稳定siRNA的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
根据本公开的一些实施方式，所述siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置的组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。
按照本公开的一些实施方式，所述siRNA分子的反义链序列5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸可具有式(202)所示结构：
同时，常用的所述5'-磷酸类似物修饰的核苷酸的种类是本领域技术人员公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开的如下如式(203)-(206)所示的4种核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；
Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(203)所示的含有乙烯基磷酸酯(E-vinylphosphonate，E-VP)的核苷酸、式(202)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸或式(205)所示的含有5'-硫代磷酸修饰的核苷酸。
本公开的发明人意外发现，本公开所述siRNA缀合物在具有显著提高的血清稳定性的同时，还表现出并未明显降低的靶mRNA沉默活性以及优异的基因表达抑制效果；从而显示出，本公开的siRNA缀合物具有较高的体内递送效率。按照本公开的一些实施方式，本公开的寡核苷酸缀合物为包含以下siRNA的siRNA缀合物，所述siRNA例如为表1A-1F中示出的siRNA：
表1一些实施方式中的siRNA序列
表1A
/>
表1B
/>
表1C
表1D
/>
表1E
/>
表1F
*S：正义链；AS：反义链
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸修饰的核苷酸(以下实施例中以P表示)或硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
寡核苷酸缀合物的制备
可以采用任意合理的合成路线制备本公开的寡核苷酸缀合物。
例如，本公开的寡核苷酸缀合物的制备方法可以包括：
(a)将式(I)化合物与琥珀酸或琥珀酸酐反应，得到式(II-M1)中间体；
(b)脱除带有经保护的氨基的固相载体上的保护基团，在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将步骤(a)得到的式(II-M1)中间体连接到该固相载体上；
(c)在核酸固相亚磷酰胺固相合成方法的条件下，分别按照所述功能性寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。
所使用的固相载体可使用表面为羟基或氨基的高分子聚合物载体，例如市售的王氏树脂、胺甲基(AM)树脂、苄醇树脂等。
所述脱保护、偶联、盖帽、氧化、硫化或硼氢化反应可使用核酸固相亚磷酰胺固相合成方法中相同的条件与试剂，具体的反应条件和试剂将在后文详细描述。
在一些实施方式中，该方法还包含脱除保护基并且与固相载体切割的步骤、分离纯化步骤。
在本发明上下文中，术语“羰基-(氧乙基)k”表示k个-O-CH2-CH2-单元与羰基相连，k为2-7的整数，优选2-5，更优选2-4，最优选2-3；实例包括但不限于羰基二(氧乙基)、羰基三(氧乙基)等。
在本发明中，氨基(乙氧基)q2表示q2个-CH2-CH2-O-单元与氨基相连,q2为1-10的整数、在一些实施方式中为2-7的整数，优选2-5，更优选2-4，最优选2或3；实例包括但不限于氨基二(乙氧基)、氨基三(乙氧基)等。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将上述连接到固相载体上的式(II-M1)中间体与正义链或反义链的3'端的第一个核苷单体接触，使上述连接到固相载体上的式(II-M1)中间体连接上序列中第一个核苷酸，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成双链寡核苷酸的正义链或反义链；其中，与第一个核苷单体连接前，上述连接到固相载体上的式(II-M1)中间体经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；得到连接有缀合分子的核酸的正义链或反义链；按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接来合成双链寡核苷酸另一条链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得核酸的正义链和反义链，退火。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成正义链和反义链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(II-M1)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，从而将式(II-M1)化合物连接至正义链或反义链；脱除保护基并与固相载体切割，分别分离纯化，获得寡核苷酸的正义链或反义链，退火，其中，所述寡核苷酸的正义链或反义链上连接有缀合分子。
在一些具体实施方式中，式(II)所示的化合物连接至siRNA中的正义链的3'末端，本公开的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)脱除连接有固相载体的式(II-M1)化合物(以下，也称为连接固相载体的L缀合分子)中的羟基保护基团G；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将该连接固相载体的L缀合分子与核苷单体接触，得到通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以该通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得本公开的siRNA缀合物。
其中，在步骤(1)中，脱除该连接固相载体的L缀合分子中的保护基团G的方法包括在脱保护条件下，将连接有固相载体的式(II-M1)化合物与脱保护试剂接触。脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。以式(II-M1)化合物的物质的量计算，脱保护试剂与式(II-M1)化合物的摩尔比为2:1-100:1，在一个实施方式中为3:1-50:1。
所述偶联反应条件和偶联试剂可使用任何适于上述偶联反应的条件和试剂。在一些实施方式中，使用与所采用的固相合成方法中的偶联反应相同的条件与试剂。
在一些实施方式中，所述偶联反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃。以式(II-M1)化合物的物质的量计算，式(II-M1)化合物与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:2-1:5；以式(II-M1)化合物的物质的量计算，式(II-M1)化合物和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:3-1:10，反应时间为200-3000秒，在一些实施方式中为500-1500秒。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，在一些实施方式中为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，在一些实施方式中为无水乙腈。相对于式(II-M1)化合物的物质的量，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在步骤(2)中，通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用上述步骤制备的通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向合成siRNA缀合物的正义链S。此时，L缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端。
步骤(2)和(3)中所述固相合成的其它条件，包括核苷单体脱保护条件，脱保护试剂种类和用量，偶联反应条件，偶联试剂的种类和用量，盖帽反应的条件，盖帽试剂的种类和用量，氧化反应条件，氧化试剂种类和用量，硫化反应条件，硫化试剂和用量采用本领域中常规使用的各种试剂、用量和条件。
例如，在一些实施方式中，步骤(2)和(3)中所述固相合成可使用如下条件：
核苷单体脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的的摩尔比为2:1-100:1，在一些实施方式中为3:1-50:1。
偶联反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:5-1:15；固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，在一些实施方式中为1:50-1:80，反应时间和偶联试剂的选择与前述相同。
盖帽反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为5-500秒，在一些实施方式中为10-100秒，盖帽试剂的选择与前述相同。盖帽试剂的总量与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:100-100:1，在一些实施方式中为1:10-10:1。在盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑的情况下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:10-10:10:1，在一些实施方式中为1:1:2-2:2:1。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为1-100秒，在一些实施方式中为5-50秒，氧化试剂在一些实施方式中为碘(在进一步实施方式中，以碘水的形式提供)。氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1-100:1，在一些实施方式中为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。硫化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为50-2000秒，在一些实施方式中为100-1000秒，硫化试剂在一些实施方式中为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为10:1–1000:1，在一些实施方式中为10:1-500:1。在一些实施方式中，所述硫化反应在乙腈:吡啶＝1:3-3:1的混合溶剂中进行。
按照本公开提供的方法，在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，并脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团可按照siRNA合成中常规的切割和脱保护方法进行。例如，将得到的连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触；在脱保护的过程中，羟基保护基团被脱除，获得M1基团，从而生成式(II)所示的缀合物。其中，所述浓氨水是指25-30重量％的氨水，浓氨水的用量与目标siRNA序列相比为0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2'-TBDMS保护时，所述方法还包括将脱除了固相载体的核苷酸序列与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除该2'-TBDMS保护。此时，所得到的目标siRNA序列中具有游离的2'-羟基的相应核苷。三乙胺三氢氟酸盐纯品的用量与目标siRNA序列相比为0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。
在合成过程中，可随时对核酸序列的纯度和分子量进行检测，从而更好地把控合成质量，检测的方法为本领域技术人员所公知。例如，可通过离子交换色谱检测核酸纯度，并通过液质联用色谱测定分子量。
退火的方法也是本领域技术人员熟知的。例如，可简单地将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
在获得本公开的缀合物后，在一些实施方式中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的siRNA缀合物进行表征，确定所合成的siRNA缀合物为目标设计的siRNA缀合物，且所合成的siRNA的序列与欲合成的siRNA的序列相符，例如与上述表1中所列的序列相符。
在另外的实施方式中，本公开的缀合物可以通过以下方法制备：
按照如上所述的亚磷酰胺固相合成方法，合成寡核苷酸，其中，寡核苷酸序列中至少一个核苷酸连接有氨基基团；
在常温下，加入碳酸氢钠、乙腈、二甲基亚砜混合物，将所合成的寡核苷酸与本公开的缀合分子反应，其中，本公开的缀合分子中，L2基团具有依次连接的亚胺酯基团、酰基基团和亚烷基，使寡核苷酸与本公开的缀合分子通过酰胺键连接；分离获得本公开的缀合物。
本公开的缀合物的应用
如本公开所示，所述缀合物可向细胞递送某种活性剂，用于治疗或预防可能需要这种递送的疾病或状况。在不愿受任何理论束缚的情况下，我们认为缀合分子的空间排列在靶向细胞表面受体方面特别有效，从而使负载的活性剂与细胞接触。在一些实施方式中，这种缀合物是针对肝细胞的寡核苷酸缀合物。
本发明的寡核苷酸缀合物具有优异的肝靶向特异性，因此能够高效地将所缀合的功能性寡核苷酸和小分子药物同时递送至肝部，具有尽量低的毒性、较好的稳定性和肝细胞中较高的基因表达抑制活性，以达到更好的治疗效果。
本发明的寡核苷酸缀合物适用于制备预防和/或治疗由肝细胞中基因的表达引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
本发明的寡核苷酸缀合物适用于预防和/或治疗由肝细胞中基因的表达引起的病理状况或疾病的用途。
所述基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在一些实施方式中，所述基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。相应地，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
以下实施例仅示例性地说明本发明，并非限制性。
实施例
Boc：叔丁氧基
Fmoc：9-芴甲氧羰基
TBS、TBDMS：叔丁基二甲基硅烷基
DMTr：4,4’-双甲氧基三苯甲基
制备实施例
制备例1：本发明的肝靶向化合物的制备
1.1合成PNB-2
将起始原料PNB-1(购至安耐吉公司，14.0g，31.0mmol)与P4-1(7.0g,40mmol)溶于300毫升二氯甲烷中，加入HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，购置麦克林公司，17.7g,46.2mmol)；然后在冰浴下加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，购阿拉丁公司,10.2g,77.0mmol)；随后在25℃下搅拌反应3小时，加水淬灭反应。将反应混合物用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏溶剂。所得的残余物通过柱层析进行纯化，在200～300目正相硅胶上，采用石油醚:乙酸乙酯＝20:1-1:1梯度洗脱，得到产物PNB-2为18.8g，产率99.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80–7.73(m,2H),7.56(t,J＝8.9Hz,2H),7.45–7.37(m,2H),7.36–7.30(m,2H),7.15–6.89(m,1H),5.32-5.28(m,2H),4.76-4.73(m,1H),4.47-4.42(m,2H),4.16(d,J＝34.3Hz,3H),3.69-3.64(m,3H),3.39-3.35(m,3H),1.45(s,9H),0.90(s,9H),0.06(s,6H).MS m/z：C33H47N3O6Si，[M+H]+，理论：610.84，实测：611.03
1.2合成PNB-3
将PNB-2(18.8g，30.8mmol)溶于无水乙腈(100ml)，然后用注射器将二乙胺(20毫升)加入到反应液中，在25℃下搅拌反应2h。随后，减压蒸干反应混合物，将所得的残余物用甲醇稀释，再次减压蒸干，得到粗品。柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-10:1梯度洗脱)纯化，因目标产物极性较大，在洗脱低极性化合物后，采用10:1乙酸乙酯-甲醇洗脱，经浓缩、干燥得到PNB-3为12.3g，定量产率(约99％)。MS m/z：C18H37N3O4Si，[M+H]+，理论：388.590，实测：388.830
1.3合成PNB-4
将PNB-1(15.8g,34.9mmol)与1.2所得的PNB-3(12.3g)溶于二氯甲烷(310ml)中，加入HATU(18.1g,47.6mmol)；然后在冰浴下加入DIPEA(10.3g,79.3mmol)，室温下搅拌3小时，加水淬灭反应。二氯甲烷萃取3次，合并有机相，有机相旋转蒸发浓缩后，经柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-15:1梯度洗脱)纯化收集目标产物浓缩，得到PNB-4为26.0g，定量产率(约99％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.20–8.04(m,3H),7.86(t,J＝6.5Hz,2H),7.69–7.61(m,2H),7.38(t,J＝7.3Hz,2H),7.30(t,J＝7.3Hz,2H),4.34–4.16(m,4H),3.64–3.49(m,8H),3.15–3.04(m,7H),1.21(d,J＝6.0Hz,18H),0.82(s,10H),-0.01(s,6H)。
1.4合成PNB-5
将上步反应1.3所得到的PNB-4(26g)溶于乙腈(100毫升)，然后用注射器将二乙胺(20毫升)加入到反应液中，常温搅拌3h。随后，减压蒸干反应混合物，将所得的残余物用甲醇稀释，再次减压蒸干，得到粗品。经柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-10:1梯度洗脱)纯化，因目标产物极性较大，在洗脱低极性化合物后，采用10:1乙酸乙酯-甲醇洗脱，浓缩抽干，得到PNB-5为22g，定量产率(约99％)。MS m/z：C28H53N5O7Si，[M+H]+，理论：600.8450，实测：601.14
1.5PNB-6合成
将PNB-5(17g,28.3mmol)与PNB-1(14.1g,31.2mmol)溶于二氯甲烷(283ml)中，加入HATU(16.1g,42.5mmol)；然后在冰浴下加入DIPEA(9.1g,70.8mmol)，在室温下搅拌3小时，加水淬灭反应。用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，减压蒸馏浓缩至干后，经柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-8:1梯度洗脱)纯化，得到PNB-6为17.0g，产率58％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝7.1Hz,2H),7.60(d,J＝7.3Hz,2H),7.45–7.40(m,2H),7.36–7.32(m,2H),6.24(s,3H),4.57–4.22(m,10H),3.83–3.63(m,9H),3.36–3.16(m,7H),1.47(s,27H),0.94(s,9H),0.12(s,6H)。
1.6合成PNB-7和PNB-8
将PNB-6(17g,16.3mmol)加入30ml的HCl/EtOH(30％)中,室温下搅拌4小时，减压蒸馏除去溶剂，油泵抽干16小时后得到PNB-7，此产物无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。
将PNB-7溶于80ml DMF中，加入DIPEA(25.2g,195mmol)，搅拌3分钟，再缓慢加入TBSCl(叔丁基二甲基氯硅烷，购置麦克林公司，12.28g,81.5mmol)，室温反应搅拌4小时，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次。将有机相合并，经无水硫酸钠干燥、过滤，减压蒸馏并抽干溶剂得到粗产品PNB-8,此产物无需进一步纯化即可直接用于下一步反应，得到粗品PNB-8为11.9g。产物经LC-MS鉴定：MS m/z：C38H55N7O6Si，[M+H]+，理论：734.986，实测：734.39。
1.7合成PNB-9
将PNB-8(11.9g,16.3mmol)溶于160毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入Gal-5(合同定制自天津钧尧公司，25.5g,57.1mmol)，再加入HATU(9.3g,24.5mmol)；然后在冰水浴条件下加入DIPEA(6.3g,48.9mmol)，反应搅拌4小时，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次；将有机相合并，经减压蒸馏浓缩后，通过柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-20:1梯度洗脱)纯化，得到PNB-9为16.1g，产率97.5％。产物经LC-MS鉴定：MS m/z：C95H136N10O36Si，[M/2+H]+，理论：1012.1260，实测：1012.10。
1.8合成PNB-10和PNB-11
将PNB-9(16.1g，7.96mmol)溶于无水乙腈(购自sigma-aldrich，40毫升)，用注射器将二乙胺(8毫升，77.6mmol)加入到反应液中，常温搅拌2h。减压蒸干反应混合物，将所得的残余物用甲醇稀释，再次减压蒸干，得到粗品PNB-10(12.1g)，该粗品作为原料直接进行下一步反应。
将上步所得PNB-10(12.1g)溶于二氯甲烷(70毫升)，加入5-O-DMTr-5-羟基戊酸(9.9g,23.5mmol)，再加入HATU(3.8g,10.1mmol)；然后在冰水浴条件下加入DIPEA(2.6g,20.2mmol)，反应搅拌4小时后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取；将有机相减压蒸干，残余物经柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-12:1梯度洗脱)纯化，得到PNB-11产物为6.2g，两步反应合计产率41.0％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.38(d,J＝5.5Hz,6H),8.16(d,J＝9.6Hz,8H),7.94(s,2H),7.35(t,J＝9.2Hz,5H),7.23(d,J＝8.8Hz,5H),7.21–7.15(m,7H),6.89(d,J＝8.7Hz,4H),5.23(d,J＝2.8Hz,2H),4.99(d,J＝11.1Hz,2H),4.51(d,J＝7.6Hz,2H),4.31(d,J＝28.7Hz,5H),4.04(t,J＝7.0Hz,10H),3.95–3.81(m,4H),3.74(s,6H),2.91(d,J＝18.4Hz,18H),2.69(s,2H),2.11(s,9H),2.00(s,12H),1.89(s,9H),1.79(s,9H),1.52–1.45(m,10H),0.85(s,9H),0.03(s,6H)。
MS m/z：C106H152N10O38Si，[M-303(DMTr)]+，理论：1899.4985，实测：1899.94。
1.9合成PNB-12
将PNB-11(6.2g,2.8mmol)溶于THF(四氢呋喃，28ml)，加入1M TBAF(12ml,12.6mmol)，搅拌反应4小时后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次；将有机相合并后，减压蒸馏浓缩，经柱层析(200～300目正相硅胶，乙酸乙酯:甲醇＝100:1-8:1梯度洗脱)纯化，得到PNB-12为3.1g，产率64％。产物经LC-MS鉴定：MS m/z：C100H138N10O38，[M-303]+，理论：1785.2360，实测：1785.81。
1.10合成PNB-13
将PNB-12(3.1g,1.5mmol)，琥珀酸酐(360mg,3.6mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶，购自阿拉丁公司，366mg,3.0mmol)加入二氯甲烷溶液，滴加入溶于二氯甲烷的DIPEA(968mg,7.5mmol)溶液，反应搅拌4小时；采用LC-MS监测完全反应后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次；将有机相合并，并用饱和氯化铵溶液洗涤三次，减压蒸干，得到PNB-13为3.3g，定量产率(约99％)。产物经LC-MS鉴定后，直接用于下一步连接固相载体。MS m/z：C104H142N10O41，[M-303]+，理论：1885.3090，实测：1885.95。
制备例2：连接至固相载体的缀合分子的制备
将PNB-13(533mg,0.243mmol)和HBTU(138mg,0.365mmol)，及DIPEA(125mg,0.974mmol)加入5ml乙腈中，超声波辅助溶解后，再加入胺甲基(AM)树脂固相载体(购自南开合成公司，氨基含量400μmol/g，607mg)，震荡反应16小时，反应完成后，抽滤；用乙腈冲洗滤饼，并抽干。然后将滤饼再与乙酸酐/吡啶(25％)溶液反应半小时，使未连接上的氨基被乙酰基盖帽。再次过滤，并重复上述冲洗过程，充分抽干。得到目标产品PNB-14，即连接至固相载体的缀合分子。产量1.03g，载量135μmol/g。
制备例3：PNB-siRNA化合物(SR16-X2U3460-PNB)的制备
在本实施例中，siRNA缀合物的siRNA为编号为SR16-X23460的序列：
正义链：
5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3'
(SEQ ID NO:140)
反义链：
5'-VPUmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm-3'；
(SEQ ID NO:141)
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；VP表示该VP右侧的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
制备方法
3.1合成正义链(S)
正义链利用实施例2所制备的PNB-14作为起始物料，分别按照上述序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应。合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液，CapA为20体积％N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；CapB为20体积％乙酸酐的乙腈溶液；盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
其中，乙烯基磷酸酯修饰的2'-甲氧基修饰尿嘧啶核苷单体(VP-Um)按照以下方法合成：
(3a-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
将2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷(2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol)，叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)，咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶于450ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应20h。蒸除DMF，用600ml二氯甲烷溶解后，加入300ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml，合并有机相。将所述合并的有机相用5％草酸洗涤至所分离的水相pH<5，蒸发有机相中的溶剂至干后获得VP-U-1粗品直接用于随后VP-U-2的合成。
将VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解后，冰浴下搅拌10分钟，再加入预先在4℃冰箱冷藏的450ml 2％对甲苯磺酸溶液(溶剂为体积比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶剂)，反应10分钟。再加入200ml饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，分离有机相和水相。向有机相加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至pH＝8，合并水相。将合并的水相用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相。再将合并的有机相用200ml饱和食盐水洗涤一次，蒸发溶剂至干。残留物通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶柱，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱)，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.79(d,J＝4.7Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.94(t,J＝7.0Hz,1H),4.12(td,J＝4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J＝4.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理论：497.21，实测：497.45。
(3a-2)VP-U-4的合成：
将VP-U-2(19.84g，40.0mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，16.48g，80.0mmol)，吡啶(4.20g，53.2mmol)，三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶于200ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应20h。另外，将亚甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶于120ml THF，冰浴降温，在冰浴温度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴温度下反应10min，再升至室温反应0.5h，然后加入至前述反应液中，约1h加完，冰浴温度下再反应1h，然后升至室温反应18h。加水淬灭反应，水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合并有机相，用200ml饱和食盐水洗涤一次后蒸发溶剂至干。残留物通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶柱，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:4梯度洗脱)，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-4共14.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.82–6.71(m,2H),5.90(ddd,J＝25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.36–4.21(m,3H),4.18(t,J＝4.9Hz,1H),4.05(ddq,J＝9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J＝4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J＝6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理论：629.24，实测：629.51。
(3a-3)VP-U-5的合成：
将VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶于100ml四氢呋喃，加入三乙胺三氢氟酸(17.96g，111.45mmol)，并且在室温下搅拌20h反应完全。直接蒸发溶剂至干，随后用二氯甲烷溶解随后蒸干2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。粗品通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶柱，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱)，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-5共6.70g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),6.77(dd,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.99–5.82(m,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.1Hz,1H),5.10(dd,J＝5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J＝9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J＝6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12–3.98(m,3H),3.39(s,2H),1.32(td,J＝6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理论：391.13，实测：391.38。
(3a-4)VP-U-6的合成：
在氩气保护条件下向10ml无水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)，双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室温搅拌反应5小时。蒸除溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:乙腈(含0.5wt％三乙胺)＝3:1-1:3梯度洗脱)，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理论：591.23，实测：591.55。VP-U-6是目标产物VP-Um，作为核苷单体参与RNA链合成。
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，真空浓缩至干。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测，纯度为78％；采用液质联用(LC-MS)分析分子量，理论值7662.5，实测值7661.4。
3.2合成反义链(AS)
通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，其反义链使用商品化的通用固相载体(HL UnyLinkerTM300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate LifeSciences公司，载量300μmol/g)作为起始物料。固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化反应条件，脱保护和切割，分离条件与合成正义链相同，得到反义链AS。
检测：纯度采用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测，其结果，纯度93.2％；分子量采用液质联用(LC-MS)进行分析。反义链：7037.1，实测值：7036.2。
3.3合成本发明寡核苷酸缀合物(SR16-X2U3460-PNB)
将上述得到的正义链与反义链以等摩尔比混合，溶于注射用水中并加热至50℃，室温冷却后，使它们通过氢键形成双链结构。即得到缀合PNB的siRNA双链SR16-X2U3460-PNB。该缀合物具有式(II-1)所示的结构。
应用实施例：本发明的寡核苷酸缀合物(SR16-X2U3460-PNB)的活性测试
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均按本领域技术人员熟知的方案进行。例如，可按MolecularCloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
实验例:寡核苷酸缀合物在体内(in vivo)对于由HBV X mRNA表达量的抑制效率
在本实施例中，对本发明的寡核苷酸缀合物(SR16-X2U3460-PNB)及阴性对照1×PBS(NS)在HBV转基因小鼠44BriHBV中对HBV X mRNA表达量的抑制效率进行了考察。
本实施例中所使用的HBV转基因小鼠44BriHBV购自北京大学医学部实验动物科学部，约8-12周，雄性。
首先，将C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量随机分组(均为雌性)，每组4只小鼠，阴性对照组给予PBS溶液。所有动物根据体重计算药量，单次给药(采用皮下给药)，以PBS缓冲液将siRNA缀合物SR16-X2U3460-PNB配制为终浓度为0.2mg/ml和0.02mg/ml(以siRNA计)的溶液，进行皮下给药，给药剂量分别为1mg/kg体重和0.1mg/kg体重，给药体积为5ml/kg。给药后第7天将动物处死，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV X mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV XmRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见下表2。
表2检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组HBV基因的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算mRNA抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于以下表3中。
表3siRNA缀合物在小鼠肝脏中HBV X mRNA表达的抑制
NA表示数据不可得。
由表3的结果可以看出，应用实施例中本发明的寡核苷酸缀合物对于HBV X mRNA表达的抑制具有很高的抑制率；尤其是在较高浓度1mg/kg时，抑制活性更为显著。
本文已公开了示例实施方式，并且虽然采用特定术语，但是它们仅以一般和描述性含义使用和说明，并非出于限制的目的。在一些情况下，如本领域技术人员自提交本申请起显而易见的是，结合特定实施方式描述的特性、特征和/或元件可以单独地使用或与结合其他实施方式描述的特性、特征和/或元件的组合使用，除非另有明确指示。因此，本领域技术人员应理解，可在不偏离权利要求书中阐述的本发明的精神和范围下作出形式和细节的各种变化。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术有限公司
<120> 肝靶向化合物及缀合物
<160> 141
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> artifical sequence
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Claims (20)
1.一种化合物，该化合物具有式(I-1)所示的结构：
其中，DMTr代表4,4’-二甲氧基三苯甲基。
2.一种寡核苷酸缀合物，该缀合物具有式(II-1)所示的结构：
其中，Nu代表siRNA。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸缀合物，所述siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列1与第一段核苷酸序列长度相等，且不超过1个核苷酸差异，所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过1个核苷酸差异；
所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列，所述靶mRNA是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸长度相等且序列完全反向互补的核苷酸序列；
所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异是按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸；所述式(II-1)中的P连接到所述正义链或所述反义链的末端。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸缀合物，其中式(II-1)中的P连接到所述正义链的3'末端。
5.根据权利要求3所述的寡核苷酸缀合物，其中式(II-1)中的P通过形成磷酸二酯键连接至所述寡核苷酸缀合物中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。
6.根据权利要求3所述的寡核苷酸缀合物，其中所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，所述第二段核苷酸序列是指靶mRNA中和所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4完全反向互补。
7.根据权利要求3所述的寡核苷酸缀合物，其中所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的寡核苷酸缀合物，其中所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。
9.根据权利要求3所述的寡核苷酸缀合物，其中所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。
10.根据权利要求9所述的寡核苷酸缀合物，其中所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸；
其中按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；
其中每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸是指所述核苷酸中核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
11.根据权利要求9所述的寡核苷酸缀合物，其中所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
12.根据权利要求11所述的寡核苷酸缀合物，其中所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(201)所示结构的硫代磷酸酯基：
13.根据权利要求11所述的寡核苷酸缀合物，其中所述硫代磷酸酯基存在于以下至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
14.根据权利要求9所述的寡核苷酸缀合物，其中所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
15.根据权利要求14所述的寡核苷酸缀合物，其中所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由以下式(202)-式(206)中的一个表示的核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团，Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
16.根据权利要求15所述的寡核苷酸缀合物，其中所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由式(202)、式(203)或式(205)表示的核苷酸。
17.根据权利要求3所述的寡核苷酸缀合物，其中所述siRNA选自siHBa1、siHBa2、siHBa1M1、siHBa1M2、siHBa2M1、siHBa2M2、siHBa1M1S、siHBa1M2S、siHBa2M1S、siHBa2M2S、siHBa1M1P1、siHBa1M2P1、siHBa2M1P1、siHBa2M2P1、siHBa1M1SP1、siHBa1M2SP1、siHBa2M1SP1、siHBa2M2SP1或SR16-X23460中的任意一种：
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(SEQ ID NO:141)；
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸；VP表示该VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
18.权利要求17所述的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗乙型肝炎病毒基因的表达而引起的肝炎的药物中的用途。
19.一种在体外抑制肝细胞中乙型肝炎病毒基因表达的方法，其中，所述方法包括将有效量的权利要求2-17中任意一个所述的寡核苷酸缀合物与所述肝细胞进行接触。
20.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求2-17中任意一个所述的缀合物。
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