MXPA01012717A - Expresion genica modulada en inflamacion gastrointestinal. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan polinucleotidos, polipeptidos, equipos y metodos relacionados a los genes regulados caracteristicos de la inflamacion gastrointestinal.

Description

EXPRESIÓN GÉNICA MODULADA EN INFLAMACIÓN GASTROINTESTINAL ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), crónicas, son un problema persistente en medicina.

Los dos tipos principales de IBD son la enfermedad de Crohn (CD) que puede afectar el tracto digestivo completo desde la boca al ano y la colitis ulcerativa (UC) que afecta sólo el intestino grueso. Aunque la CD y UC se caracterizan ambas por daño masivo en el intestino que surge de la inflamación intestinal, estas enfermedades son completamente distintas. De forma macroscópica, las mejores características distintivas de estas enfermedades son que la UC es 1) un trastorno inflamatorio continuo, 2) se restringe principalmente a la mucosa del colon y el recto, 3) usualmente es principalmente vascular y 4) usualmente, se asocia con un acortamiento dramático del colon. En contraste, la inflamación en CD es casi siempre discontinua y puede presentarse donde quiera en el intestino grueso o delgado. Con la CD, la mucosa aparece usualmente ""adoquinada" y existen fisuras y un engrosamiento de la pared del intestino con estenosis asociada de lumen y constricciones . De forma microscópica, la UC es esencialmente una REF: 134937 inflamación superficial de la membrana mucosa y aún en la enfermedad crónica, la muscularis propria y serosa están libres de infiltración inflamatoria. En contraste, la CD se presenta de forma microscópica como una inflamación transmural, que se extiende a través de la mucosa y submucosa en las capas musculares. En la UC, son comunes abscesos de cripta y destrucción del epitelio, en tanto que en la CD, una característica valiosa de diagnóstico es la presencia de granulomas tipo sarcoide. Las características histológicas de ambas enfermedades sugieren que existe una desregulación del tejido linfoide en IBD. Si la desregulación inmunológica es una causa primaria de la IBD o si la respuesta inflamatoria es secundaria a otro agravamiento mucósico, tal como una fisura en la barrera epitelial, esto permanece no claro. A pesar de los avances en los años recientes, la etiologia precisa y la patogénesis de la CD y UC permanecen sin definir. A fin de examinar y entender mejor la base mecanistica de las IBD, se ha dirigido mucho esfuerzo hacia el descubrimiento y desarrollo de los diferentes modelos en animales de la enfermedad inflamatoria del intestino. Uno de los sistemas mejor caracterizados para estudiar la inflamación intestinal es el modelo en el ratón de la colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS) (I.

O ayasu et al, Gastroenterology 98:694702, 1990; H.S. Cooper et al, Laboratory Investigation 69:238-249, 1993; L.A. Dielman et al, Gastroenterology 107:1643-1652, 1994; C.O. Elson et al, Gastroenterology 109:1344-1367, 1995). Se piensa que el DSS provoca ramificaciones en las uniones epiteliales, estrechas (J. Ni et al, Gut 39:234-241, 1996), permitiendo de este modo que la enorme carga antigénica en el lumen del intestino entre en contacto directo con los tejidos subyacentes. Como resultado, se inicia una vigorosa respuesta inmunitaria dirigida contra los antigenos localizados en el lumen del intestino, en los ratones tratados con DSS. La inflamación intestinal se restringe principalmente al intestino grueso. El sistema de modelo de colitis inducida por DSS se usa para examinar (i) la naturaleza de la respuesta más temprana al daño epitelial, (ii) los mecanismos responsables de reclutar células a los sitios de inflamación, (iii) la naturaleza de la respuesta inmunitaria protectora a la altura de la inflamación intestinal y (iv) los mecanismos que dirigen la recuperación y accionan la reparación de los tejidos dañados. Este sistema de modelo se puede usar para examinar los mecanismos de inducción y recuperación de las IBD y deben ayudar en la identificación de los genes/proteinas que son capaces de modular o impedir el daño intestinal o estimular la recuperación de la mucosa. Dada la diversidad de factores que pueden contribuir a estos procesos, es evidente una clara necesidad de descubrimiento, identificación y esclarecimiento de los papeles de las nuevas proteinas comprendidas en las diferentes etapas de las IBD.

Características de la colitis inducida por DSS En el sistema de modelo de colitis inducida por DSS, la pérdida de peso es evidente en ratones que empiezan en el dia 4. El análisis histológico del intestino revela la presencia de lesiones desiguales, tempranas, identificadas por la pérdida de células epiteliales y células caliciformes. Por el dia 8, la pérdida de peso es bastante severa (aproximadamente 20% de reducción) y los ratones parecen moribundos. Histológicamente, el epitelio del intestino está casi destruido en esta etapa. Hay evidencia de una gran infiltración de células inflamatorias, mezcladas en la lámina propia y submucosa. El infiltrado de células inflamatorias parece estar compuesto principalmente de células T, células B y granulocitos. Por el dia 12, la ganancia de peso es evidente conforme se recuperan los ratones. En esta última etapa, la recuperación de las criptas y la regeneración epitelial proporciona evidencia histológica del comienzo de los procesos de reparación.

Colitis inducida por DSS e IBP humana El evento principal en la colitis inducida por DSS es el daño a las células epiteliales, con inflamación asociada con activación inmunitaria como un evento secundario. Si el daño a las células epiteliales o la desregulación inmunitaria es el evento causante en la IBD humana, esto no está puesto en claro. El modelo de la colitis con DSS por lo tanto es útil en proporcionar una oportunidad para estudiar el desarrollo y consecuencias de ambos procesos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se han identificado moléculas que corresponden a los genes que se regulan por el tratamiento con DSS. Estas moléculas son útiles en aplicaciones terapéuticas, de pronóstico y de diagnóstico en el tratamiento de las IBD y otras patologías del intestino. La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos y los polipéptidos codificados. Además, la presente invención se refiere a vectores, células hospedadoras, anticuerpos y métodos recombinantes para producir los polinucleótidos y los polipéptidos. También se proporcionan métodos de diagnóstico para detectar trastornos relacionados a los JA * * * • polipéptidos y polinucleótidos que los codifican, y métodos terapéuticos para tratar estos trastornos. La invención se refiere adicionalmente a métodos de detección para identificar compañeros de unión de los polipéptidos. La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos y los polipéptidos codificados. Además, la presente invención se refiere a vectores, células hospedadoras, anticuerpos y métodos recombinantes para producir los polinucleótidos y los polipéptidos. También se proporcionan métodos de diagnóstico para detectar trastornos relacionados a los polipéptidos y a los polinucleótidos que los codifican y métodos terapéuticos para tratar estos trastornos. La invención se refiere adicionalmente a métodos de detección para identificar compañeros de unión de los polipéptidos. En una modalidad, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido elegido del grupo que consiste de SEQ ID N0.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID -^.. ^.^^ ? - -f ^^ .,...^.-^.^4^1, NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.41, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.43, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO.46, SEQ ID NO.47, SEQ ID NO.48, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO.50, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54, SEQ ID NO.55, SEQ ID NO.56, SEQ ID NO.57, SEQ ID NO.58, SEQ ID NO.59, SEQ ID NO.60, SEQ ID NO.61 y SEQ ID NO.62. Otra modalidad comprende una molécula aislada de ácido nucleico al menos 95% idéntica a la molécula aislada de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1-62. Una modalidad adicional comprende una molécula aislada de ácido nucleico de al menos diez bases de longitud que se puede hibridar a la molécula aislada de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-62 bajo condiciones severas. En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido aislado y codificado por un polinucleótido elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.30, SEQ ID - - J, ±. jt.- .-e. á.y NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.41, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.43, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.45, SEQ ID NO.46, SEQ ID 5 NO.47, SEQ ID NO.48, SEQ ID NO.49, SEQ ID NO.50, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54, SEQ ID NO.55, SEQ ID NO.56, SEQ ID NO.57, SEQ ID NO.58, SEQ ID NO.59, SEQ ID NO.60, SEQ ID NO.61 y SEQ ID NO.62. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula aislada de 10 ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención. En una modalidad adicional, la invención proporciona una molécula de .ADN aislada, substancialmente pura adecuada para el uso como una sonda para genes 15 regulados en la inflamación gastrointestinal, elegida del grupo que consiste de moléculas de ADN identificadas en la Tabla 1, que tiene una secuencia de nucleótidos parcial de 5' y la longitud como se describe por sus direcciones digitales, y que tiene un patrón de regulación 20 característico en la inflamación gastrointestinal. La presente invención también proporciona un sistema y método para detectar la presencia de un gen regulado en la inflamación gastrointestinal. En una modalidad, la presente invención proporciona un equipo para 25 la detección adecuada de la presencia de un gen regulado en la inflamación gastrointestinal, que comprende al menos un polinucleótido de la presente invención, o un fragmento del mismo que tiene al menos diez bases contiguas, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo; un medio de marca; instrucciones para el uso; y material de empaque adecuado. En una modalidad, el polinucleótido se elige del grupo que consiste de: SEQ ID N0.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.41, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.43, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.45, SEQ ID NO.46, SEQ ID NO.47, SEQ ID NO.48, SEQ ID NO.49, SEQ ID NO.50, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54, SEQ ID NO.55, SEQ ID NO.56, SEQ ID NO.57, SEQ ID NO.58, SEQ ID NO.59, SEQ ID NO.60, SEQ ID NO.61 y SEQ ID NO.62. Otra modalidad comprende un polinucleótido al menos 95% idéntico a la molécula aislada de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-62. Una molécula adicional comprende un polinucleótido de al menos diez bases de longitud que se puede hibridar a la molécula aislada de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-62 bajo condiciones severas. En aún otra modalidad, el polinucleótido se elige del grupo que consiste de moléculas de ADN identificadas en la Tabla 1, que tienen una secuencia de nucleótidos parciales 5' y la longitud como se describe por sus direcciones digitales, y que tiene un patrón de regulación característico en la inflamación gastrointestinal .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención llegarán a entenderse mejor con referencia a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y los dibujos anexos donde: La Figura 1 es una representación gráfica de los resultados del análisis TOGA (Análisis de Expresión Génica Total) , usando un cebador de PCR de 5' con las bases CGCG de análisis, que muestra los productos de PCR producidos del ARNm extraido de los colon aislados de ratones sin tratar (Figura ÍA, '0 dias"), el ARNm extraido de los colon aislados de ratones que reciben DSS durante cuatro dias (Figura IB, * 4 dias"), el ARNm extraido de los colon aislados y de ratones que reciben DSS durante ocho dias (Figura 1C, * 8 dias"), y el ARNm extraido de los colon aislados de ratones que reciben DSS durante 12 dias (Figura ID, *12 dias"), donde la linea de Índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 458 p.b. que se regula ascendentemente por el tratamiento de DSS, alcanzando un máximo en ocho dias, donde la ordenada está en unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia y la abscisa es la longitud del producto de PCR en nucleótidos; La Figura 2 es una representación gráfica de un análisis más detallado del producto de PCR de 458 p.b. indicado en la Figura 1; la Figura 2A muestra el producto de PCR obtenido usando un cebador de 5' extendido como se describe en el texto; la Figura 2B muestra los productos de PCR obtenidos usando los cebadores originales de PCR, y la Figura 2C, las trazas de las Figuras 2A y 2B se traslapan, demostrando que el producto de PCR del clon aislado y secuenciado es la misma longitud como el producto original de PCR, donde la ordenada está en unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia y la abscisa es la longitud del producto de PCR y nucleótidos; La Figura 3 es una representación gráfica de los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX 2_46, SEQ ID NO: 10, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las cuatro muestras experimentales (tratamiento con DSS de 0 , 4, 8 o 12 días), así como las normas de tamaño se transfirieron después de la electroforesis y se sondearon con IMX 2_46, radiomarcado, SEQ ID NO: 10; se convirtió en imagen usando un equipo de fosfoformación de imágenes y se cuantificó. Los resultados cuantitativos que muestran los niveles de expresión relativa del trascripto de 1.6 kb fueron 0 días, 64; 4 días, 53; 8 días, 223; y 12 días, 269. La cantidad de ARN cargado en el gel se determinó al sondear para ciclofilina ("cyc"). La Figura 4 es una representación gráfica de los resultados de RT-PCR del clon IMX2_48. La Figura 5 es una representación gráfica de los resultados de RT-PCR de del clon IMX2_74. La Figura 6 es una representación gráfica de los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_17, SEQ ID NO: 3, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y las normas de tamaño se transfirió después de la electroforesis, se sondeó, se formó en imagen usando un equipo de fosfoformación de imagen y se cuantificó. La Figura 6A muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis de DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis por aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras de intestinos gruesos de FVB, ratones de eliminación de mdr sin colitis y ratones de eliminación de mdr con colitis. La Figura 6B muestra los resultados de ratones Balb/c con colitis de DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c tratados con DSS al 0%, 5% y 8%, ratones Balb/c con ileítis aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento. El análisis previsto del trascripto para IMX2_17 CRP-ductina es de 6.6 Kb; el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de aproximadamente 6.5 Kb. La Figura 7 es una representación gráfica de los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_22, SEQ ID NO: 4, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y normas de tamaño se transfirió después de la electrofores s, se sondeó, se formó en imagen usando un equipo de fosfoformación de imágenes y se cuantificó. La Figura 7A muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis de DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras de intestinos gruesos de FVB, ratones de eliminación de mdr sin colitis, £.1-; ratones de eliminación de mdr con colitis y el vaso C57BL/C. La Figura 7B muestra los resultados de ratones Balb/c con colitis de DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c con ileítis aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, y muestras de tejido linfoide normales, de C57BL/6 (MLM, PP, vaso y timo) . El tamaño previsto del trascripto para IMX2_22 HPK1 es de 2.7 Kb, el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de aproximadamente 2.8 Kb. La Figura 8 es una representación gráfica de los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_28, SEQ ID NO : 5, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y normas de tamaño se gráfico después de la electroforesis, se sondeó, se formó en imagen usando un equipo de fosfoformación de imágenes y se cuantificó. La Figura 8A muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis DSS 0, 4, 8, o 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras de intestinos gruesos de FVB, ratones de eliminación de mdr sin colitis y ratones de eliminación de mdr con colitis. La Figura 8B muestra los resultados de ratones de Balb/c con colitis de DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c tratados con CSS al 0%, 5% y 8%, y ratones Balb/c con ileítis aCD3 O, 6, 30 ó 73 horas después del tratamiento, el tamaño previsto del trascripto para IMX2_28 DRA es de 2.6 Kb; el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de aproximadamente 3 Kb. La Figura 9 es una representación gráfica de los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_33, SEQ ID NO: 21, donde un gel de agarosa contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y las normas de tamaño se transfirió después de la electroforesis, se sondeó, se formó en imágenes usando un equipo de fosfoformación de imágenes y se cuantificó. La Figura 9A muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis CD3, 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras de intestinos gruesos con FVB, ratones de eliminación de mdr sin colitis y ratones de eliminación de mdr con colitis. La Figura 9B muestra los resultados de ratones Balb/c con colitis de DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c tratados con DSS al 0%, 5% y 8% y ratones Balb/c con ileítis aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento. El tamaño previsto del trascripto para IMX2_33 SLPI es de 1.1 Kb; el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de 1.1 Kb.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Definiciones Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar el entendimiento de ciertos términos usados a todo lo largo de esta especificación. En la presente invención, "aislado" se refiere a material removido de su ambiente natural (por ejemplo, el ambiente natural, si es que se presenta de forma natural), y de esta manera se altera "por la mano del hombre" de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede ser parte de un vector o una composición de materia, o puede estar contenido dentro de una célula, y aún estar "aislado" debido a que ese vector, composición de material, o célula particular no es el ambiente original del polinucleótido . En la presente invención, una proteína "segregada" se refiere a aquellas proteínas capaces de ser dirigidas al ER vesículas secretorias, o el espacio extracelular como resultado de una secuencia de señal, así como aquellas proteínas liberadas en el espacio extracelular sin que contengan necesariamente una secuencia de señal. Si la proteína segregada se libera en el espacio extracelular, la proteína segregada puede sufrir procesamiento extracelular para producir una proteína "madura" . La liberación en el espacio extracelular puede presentarse por muchos mecanismos, incluyendo exocitosis y escisión proteolítica. Como se usa en la presente, un "polinucleótido" se refiere a una molécula que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en SEQ ID NO: 1-62. Por ejemplo, el polinucleótido puede contener toda o parte de la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, incluyendo las secuencias introducir en 5' y 3', la región de codificación, con o sin la secuencia de señal, la región de codificación de la proteína segregada, así como fragmentos, epítopes, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico. Además, como se usa en la presente, un "polipéptido" se refiere a una molécula que tiene la secuencia traducida de aminoácidos generada del polinucleótido como se define ampliamente. Un "polinucleótido" de la presente invención también incluye aquellos polinucleótidos capaces de hibridar, bajo condiciones severas de hibridación, a secuencias contenidas en SEQ ID NO: 1-62, o el complemento de las mismas, o el ADNc. "Condiciones severas de hibridación" se refiere a una incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende 50% de formamida, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato de sodio a 75 mM) , fosfato de sodio a 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y 20 µg/ml de -ADN de esperma de salmón, cizallado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en SSC 0. lx a aproximadamente 65°C. También contempladas están las moléculas de ácido nucleico que hibridan a los polinucleótidos de la presente invención a condiciones de hibridación de baja severidad. Los cambios en la severidad de hibridación y la detección de señales se logran principalmente a través de la manipulación de la concentración de formamida (menores porcentajes de formamida dan por resultado una severidad disminuida); condiciones salinas, o temperatura. Por ejemplo, las condiciones de baja severidad incluyen una incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende SSPE 6X (SSPE 20X = NaCl 3M; NaH2P04 al 0.02M; EDTA 0.02M, pH 7.4), SDS al 0.5%, formamida al 30%, ADN de bloqueo de esperma de salmón 100 µg/ml; seguido por lavados a 50°C con SSPE IX, SDS al 0.1%. Además, para lograr aún menor severidad, los lavados seguidos después de la hibridación severa se pueden hacer a mayores concentraciones de sal (por ejemplo, SSC 5X) . Se señala que las variaciones en las condiciones anteriores se pueden lograr a través de la inclusión y/o substitución de reactivos de bloqueo alternativos usados para suprimir el fondo en los experimentos de hibridación. Los reactivos típicos de bloqueo incluyen el reactivo de í .

Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y formulaciones patentadas comercialmente disponibles. La inclusión de reactivos de bloqueo específicos puede requerir la modificación de las condiciones de hibridación descritas anteriormente, debido a problemas con la compatibilidad. Por supuesto, un polinucleótido que hibrida solo a las secuencias de polyA+ (tal como cualquier tracto polyA+ 3 '-terminal de un ADNc mostrado en el listado de secuencias) , o a un tramo complementario de residuos de T (o U) , no se incluiría a la definición de "polinucleótido", puesto que este polinucleótido hibridará a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poly (A) o el complemento de la misma (por ejemplo prácticamente cualquier clon de ADNc de doble hebra) . El polinucleótido de la presente invención se puede componer de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o AKN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos se pueden componer de ADN de cadena individual y doble, ADN que es una mezcla de las regiones de cadena individual y doble, ARN de cadena individual y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de doble hebra y hebra individual, moléculas híbridas que comprenden AD? y ARN que pueden ser de hebra individual o más típicamente de doble hebra o una mezcla de regiones de hebra individual y doble. Además, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de triple hebra que comprenden ARN o AD? o tanto ARN como AD?. Un polinucleótido también puede contener una o más bases modificadas o estructuras de AD? o AR? modificadas para la estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no usuales tal como inosina. Se puede hacer una variedad de modificaciones al AD? y AR?; de esta manera, "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas. El polipéptido de la presente invención se puede componer de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y puede contener aminoácidos diferente de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos se pueden modificar por procesos ya sea naturales tal como el procesamiento pos-transduccional , o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Estas modificaciones se describen bien en textos básicos y en artículos más detallados, así como en literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden presentarse donde quiera en un polipéptido, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los términos amino o carboxi. Se apreciará : i -I que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o variar de grado en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden resultar de los procesos naturales de pos-traducción o se pueden hacer por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidil-inositol , reticulación, ciclización, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, iodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación. (Ver por ejemplo, PROTEINS- STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a. Ed . , T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) . "Un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a polipéptidos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de un polipéptido de la presente invención, incluyendo formas maduras, como se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso donde exista la dependencia en la dosis, no es necesariamente idéntico a aquel del polipéptido, pero más bien es substancialmente similar a la dependencia en la dosis de una actividad dada en comparación al polipéptido de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y de manera preferente, no más de aproximadamente 10 veces menos actividad, y de manera más preferente no más de aproximadamente tres veces menos actividad con relación al polipéptido de la presente invención. La secuencia traducida de aminoácidos, empezando con la metionina, se identifica aunque también se pueden traducir fácilmente otros cuadros de lectura usando técnicas conocidas de biología molecular. Los polipéptidos producidos por la traducción de estos cuadros alternativos de lectura abiertos se contempla específicamente por la presente invención.

Las SEQ ID NOS: 1-62 y las traducciones de las SEQ ID NO: 1-62 son suficientemente exactamente y de otro modo adecuadas para una variedad de usos bien conocidas en la técnica y descritas posteriormente. Estas sondas también hibridarán las moléculas de ácido nucleico en muestras biológicas, permitiendo de este modo una variedad de métodos forenses y de diagnósticos de la invención. De manera similar, los polipéptidos identificados de las traducciones de SEQ ID NO: 1-62 se pueden usar para generar anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas segregadas codificadas por los clones de ADNc identificados . Sin embargo, las secuencias de ADN generadas por reacciones de secuenciación pueden contener errores de secuenciación. Los errores existen como nucleótidos mal identificados, o como inserciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de ADN generada. Los nucleótidos erróneamente insertados o suprimidos pueden provocar cambios en los cuadros de lectura de la secuencia prevista de aminoácidos. En estos casos, la secuencia prevista de aminoácidos diverge de la secuencia real de aminoácidos, aunque la secuencia de ADN generada puede ser mayor de 99.9% idéntica a la secuencia real de ADN (por ejemplo, una inserción de bases o supresión en un cuadro de lectura abierto para 1000 bases) . k.as.í £ a. - ..*- La presente invención también se refiere a genes que corresponden a SEQ ID NO: 1-62, y traducciones de SEQ ID NO: 1-62. El gen correspondiente se puede aislar de acuerdo con métodos conocidos usando la información de 5 secuencia descrita en la presente. Estos métodos incluyen la preparación de sondas o cebadores de la secuencia descrita y la identificación o amplificación del gen correspondiente de las fuentes apropiadas del material genómico . 10 También se proporcionan en la presente invención especies homologas. Las especies homologas se pueden aislar e identificar al hacer sondas o cebadores adecuados a partir de las secuencias provistas en la presente y al detectar una fuente adecuada de ácido nucleico para el 15 homólogo deseado. Los polipéptidos de la invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Estos polipéptidos incluyen polipéptidos que se presentan de forma natural, aislados, polipéptidos reproducidos de forma recombinante, 20 polipéptidos sintéticamente producidos, o polipéptidos producidos por una combinación de estos métodos. Son bien entendidos en la técnica los medios para preparar estos polípéptidos . Los polipéptidos pueden estar en la forma de una 25 proteína segregada, incluyendo la forma madura, o pueden ser una parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión (ver posteriormente) . Frecuentemente, es ventajoso incluir una secuencia adicional de aminoácidos que contiene secuencias secretorias o guía, pro-secuencias, secuencias con ayuda en la purificación, tal como múltiples residuos de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan de manera preferente en una forma aislada, y de manera preferente están substancialmente purificados. Una versión recombinantemente producida de un polipéptido, incluyendo el polipéptido segregado, se pueden purificar substancialmente por el método de un paso descrito en Smith y Jonson, Gene 67:31-40 (1988). Los polipéptidos de la invención también se pueden purificar a partir de fuentes naturales o recombinantes usando anticuerpos de la invención formulados contra la proteína segregada en métodos que son bien conocidos en la técnica.

Secuencias de señal Los métodos para predecir si una proteína tiene una secuencia de señal, así como el punto de escisión de esa secuencia, están disponibles. Por ejemplo, el método de McGeoch, Virus Res. 3:271-286 (1985), usa la información de una región cargada, corta, N-terminal y una región sin í.í.i,lá carga, subsiguiente de la proteína completa (sin escindir) . El método de von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986) usa la información de los residuos que circundan el sitio de escisión, típicamente los residuos -13 a +2, donde +1 indica el término amino de la proteína segregada. Por lo tanto, a partir de una secuencia deducida de aminoácidos, se puede identificar una secuencia de señal y la secuencia madura.

Variantes de polinucleótido y polipéptido "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido de la presente invención, pero que retiene propiedades esenciales del mismo. En general, las variantes son completamente similares de forma cercana, y en muchas regiones, idénticas al polipéptido o polinucleótido de la presente invención. "Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular usando técnicas publicadas (ver, por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, (1988); BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. ., ed., Academic Press, New York, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A.M. , and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, (1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, (1987); and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, (1991).) En tanto que existen varios 5 métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la técnica (Carillo, H., y Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988).) Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o 10 similitud entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos descritos en "Guide to Huge Computers," Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego, (1994), and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988). Los métodos para alinear 15 polinucleótidos o polipéptidos se codifican en programas de computadora, incluyendo el paquete de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Bíol . 215:403 (1990), el programa Bestfit 20 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711 (que usa el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathe atics 2:482-489 (1981).) 25 ^. Cuando se usa cualquiera de los programas de f-^'-^'i ^fa^^i^a^t^.ifc .1 £•**»-'» í ______A____- -....Jj»~..fe, .. ^ — >'-- ... ..... ..SM^.m^ .*.,máMM^ M*£*lM*A~ .-M:^tmmm^í¡i,~At.m alineación de secuencia para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se ajustan de modo que el porcentaje de identidad se calcula con respecto a la 5 longitud completa del polinucleótido de referencia y qué separaciones en la identidad de hasta 5% del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia se permitirán. Un método preferido para determinar la mejor 10 correspondencia completa entre una secuencia de referencia (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sometida, también referido como una alineación de secuencia global, se puede determinar usando el programa de computadora FASTDB en base al algoritmo de Brutlag et al., 15 (comp.. App. Biosci . 6:237-245 (1990)). El término "secuencia" incluye secuencias de nucleótidos y aminoácidos. En una alineación de secuencias, las secuencias de referendo y sometida son ya sea ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de 20 aminoácidos. El resultado de la alineación de secuencias, global es un por ciento de identidad. Los parámetros preferidos usados en la búsqueda FASTDB de una secuencia de ADN para calcular el por ciento de identidad son: Matrix=unitaria, k-tuple=4, penalidad de mal 25 correspondencia=l , penalidad de unión=30, longitud de grupo de aleatorización=0, y corte puntuación=l , penalidad de separación=5 , penalidad de tamaño de separación=0.05 , y tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de referencia en bases de nucleótidos, cualquiera que sea más corta. Como una ilustración, un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de al menos 95% de "identidad" a una secuencia contenida en el SEQ ID NO: 1-62 significa que el polinucleótido es idéntico a una secuencia contenida de SEQ ID NO: 1-62 ó del ADN excepto que la secuencia de polinucleótido puede contener hasta cinco mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos de longitud total (no solo dentro de un tramo dado de 100 nucleótidos. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idénticas SEQ ID NO: 1-62, hasta 5% de los nucleótido en la secuencia contenida en SEQ ID NO: 1-62 ó el ADN se pueden suprimir, insertar o sustituir con otros nucleótidos. Estos cambios pueden presentarse dondequiera a todos lo largo del polinucleótido. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen polinucleótidos que tienen al menos 80% de identidad, en forma más preferente al menos 90% de identidad, y en la forma más preferente al menos 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad a una secuencia contenida en .* JMfciii l , SEQ ID NO: 1-62. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá rápidamente que un gran número de polinucleótidos que tiene al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de identidad codificará para un polipéptido idéntico a una secuencia de aminoácidos contenidas en las traducciones de SEQ ID NO: 1- 62. De manera similar, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos por ejemplo, el 95% de "identidad" a un polinucleótido de referencia, se propone que la secuencia de aminoácidos de polinucleótido es idéntica al polinucleótido de referencia excepto que la referencia de polinucleótido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la longitud total del polipéptido de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia se pueden suprimir o substituir con otro aminoácido, o varios aminoácidos hasta 5% de los residuos totales de aminoácidos en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden presentarse en las posiciones amino-o carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o donde quiera entre estas posiciones terminales, entremezcladas ya sea de manera individual entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Las modalidades adicionales de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen al menos 80% de identidad, en forma más preferente al menos 85% de identidad, en forma más preferente al menos 90% de identidad, y en forma más preferente al menos 95% de identidad, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad a una secuencia de aminoácidos contenida en las traducciones de SEQ ID NO: 1-62. De manera preferente, los polipéptidos anteriores deben exhibir al menos una actividad biológica de la proteína. En una modalidad preferida, los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen al menos 90% de similitud, en forma más preferente al menos 95% de similitud, en forma aún más preferente al menos 96%, 97%, 98% ó 99% de similitud a una secuencia de aminoácidos contenida en las traducciones de SEQ ID NO: 1-62. Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones sin codificación, o ambas. Especialmente preferidas son las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen J. riAt -, - AJ.... ,..*.fe,s..<,. , ..a-..,.*.->„.. -M.-. substituciones, adiciones o supresiones imperceptibles, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Las variantes de nucleótidos producidas por substituciones imperceptibles debido a la degeneración del código genético se prefieren. Además, las variantes en las cuales 5-10, 1-5 ó 1-2 aminoácidos están substituidos, suprimidos o adicionados en cualquier combinación, también se prefieren. Se pueden producir variantes de polinucleótidos por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (cambiar codones en el ARNm humano a aquellos preferidos por un hospedador bacteriano tal como E. Coli) . Las variantes que se presentan de forma natural se llaman "variantes alélicas", y se refieren a una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. (Genes, II, Lewin, B., ed., John Wuley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar a nivel de polinucleótido y/o polipéptido. Alternativamente, las variantes que no se presentan de forma natural se pueden producir por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa. Usando métodos conocidos de manejo de proteínas y tecnología de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los í %M. ?ÍM>-Í . •?t ,..,.!*,. - - .„« - ,»- .. , .,,, . . . »*,. ,- M... M. ....... ti..^. -»JÍ- -=-.--— -«, *"A polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden suprimir uno o más aminoácidos a partir del N- término al C-término de la proteína segregada sin pérdida substancial de la función biológica. Los autores de Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993) reportan proteínas variantes de KGF que tienen actividad de unión a heparina aún después de suprimir 3, 8 ó 27 residuos de aminoácido amino-terminales . De manera similar, el interferón-gamma exhibió hasta diez veces mayor actividad después de suprimir 8-10 residuos de aminoácido del término carboxi de esta proteína. (Dobeli et al . , J. Biotechnology 7:_199-216 (1988) . Además, amplia evidencia demuestra que las variantes retienen frecuentemente una actividad biológica similar a aquella de la proteína que se presenta de forma natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993)) llevaron a cabo un análisis mutacional extenso de la citosina IL-l-a humana. Usaron mutagénesis aleatoria para generar más de 3,500 mutantes individuales de IL-la que promediaron 2.5 cambios de aminoácidos por variante con respecto a la longitud completa de la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posible posición de aminoácidos. Los investigadores encontraron que "la mayoría de la molécula se puede alterar r- 'zoco efecto en ya~ sea [la actividad de unión o «^ft^aj biológica"]. (Ver, Gayel et al., (1993), Abstract.). En realidad, solo 23 secuencias únicas de aminoácidos, de entre 3,500 secuencia de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que fue significativamente diferente en 5 actividad del tipo silvestre. Adicionalmente, aun si se suprimen uno o más aminoácidos del N-término o C-término, de un polipéptido, se da por resultado modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, aún pueden permanecer otras 10 actividades biológicas. Por ejemplo, la capacidad de una variante de supresión para inducir y/o unir anticuerpos que reconocen la forma segregada, probablemente se retendrá cuando menos de la mayoría de los residuos de la forma segregada se remuevan del N-término o C-término. Si un 15 polipéptido particular que carece de los residuos N- o C- terminales de una proteína retiene estas actividades inmunogénicas, se puede determinar fácilmente por métodos de rutina descritos en la presente y otros conocidos en la técnica . 20 De esta manera, la invención incluye adicionalmente variantes polipeptídicas que muestran actividad biológica substancial. Estas variantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, repeticiones y substituciones seleccionadas de acuerdo a las reglas 25 generales conocidas en la técnica como que tienen poco efecto en la actividad. Por ejemplo, la guía con respecto a como hacer fenotípicamente imperceptibles las substituciones de aminoácidos se proporciona en Bowie, J. U. Et "al., Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio . La primera estrategia explora la tolerancia de las substituciones de aminoácidos por selección natural durante el proceso de evolución. Al comparar las secuencia de aminoácidos en diferentes especies, se pueden identificar los aminoácidos conservados. Estos aminoácidos conservados probablemente son importantes para la función de las proteínas. En contraste, las posiciones de aminoácidos donde se han tolerado substituciones por selección natural indican que estas posiciones no son críticas para la función de la proteína. De esta manera, las posiciones que toleran la substitución de aminoácidos se pueden modificar en tanto que aún mantienen actividad biológica de la proteína. La segunda estrategia usa manejo genético para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar regiones críticas para la función de la proteína. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida a la secuencia o la mutagénesis de exploración de alanina (introducción de mutaciones de alanina individual en cada residuo en la molécula) se puede usar. (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Las moléculas mutantes resultantes entonces se pueden probar para la actividad biológica. Como señalan los autores, estas dos estrategias han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las substituciones de aminoácidos. Los autores indican adicionalmente que los cambios de aminoácidos probablemente van a ser permisibles en ciertas posiciones de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de aminoácidos ocultos (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, en tanto que se conservan en general pocas características de las cadenas laterales superficiales. Además, las substituciones de aminoácido, conservadoras, toleradas, comprenden el reemplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos, Ala, Val, Leu y lie; el reemplazo de los residuos de hidroxilo Ser y Thr; el reemplazo de los residuos ácidos Asp, y Glu; el reemplazo de los residuos de amida Asn y Gln, el reemplazo de los residuos básicos Lys, Arg y His; el reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y el reemplazo de los aminoácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met y Gly. Además de la substitución conservadora de aminoácidos, las variantes de la presente invención incluyen (i) substituciones con uno o más de los residuos de aminoácido no conservados, donde los residuos substituidos de aminoácidos pueden ser codificados o no, por el código genético, o (ii) substitución con uno o más de los residuos de aminoácidos que tienen un grupo sustituyente, o (iii) fusión del polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) o (iv) fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales, tal como la región de fusión de IgG Fc, o la secuencia guía o secretoria, o una secuencia que facilita la purificación. Estos polipéptidos variantes parecen estar dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente. Por ejemplo, las variantes de polipéptido que contienen substituciones de aminoácido de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutrales pueden producir proteínas con características mejoradas, tal como menos agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas reduce tanto la actividad como incrementa la depuración debido a la actividad inmunogénica del agregado.

(Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol . 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993) ) .

Fragmentos de polinucleótido y polipéptido En la presente invención, un "fragmento de polinucleótído" se refiere a un polinucleótido corto que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en aquella mostrada en SEQ ID NO: 1-62. Los fragmentos cortos de nucleótidos son de manera preferente de al menos aproximadamente 15 nt, en forma más preferente al menos 20 n , en forma aún más preferente al menos aproximadamente 30 nt, y en forma aún más preferente al menos aproximadamente 40 nt de longitud. Un fragmento "al menos de 20 nt de longitud", por ejemplo, se propone que incluya 20 ó más bases contiguas de la secuencia de ADNc contenida en aquella mostrada en SEQ ID NO: 1-62. Estos fragmentos de nucleótido son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se analiza en la presente. Por supuesto, se prefieren fragmentos más grandes (por ejemplo, 50, 150 y más nucleótidos). Además, los ejemplos representativos de fragmentos de polinucleótido de la invención, incluyen, por ejemplo, fragmentos que tienen una secuencia de aproximadamente un número 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450 de nucleótidos, al extremo de SEQ ID NO: 1-62. En el contexto *AHÍ tJí? I "aproximadamente" se incluye los intervalos particularmente aceptados, más grandes o más pequeños por varios nucleótidos (5, 4, 3, 2 ó 1), en cualquier término o ambos términos. De manera preferente, estos fragmentos codifican 5 para un polipéptido que tiene actividad biológica. En la presente invención, un "fragmento de polipéptido" se refiere a una secuencia corta de aminoácidos contenida en las traducciones de SEQ ID NO: 1- 62. Los fragmentos de proteína pueden ser "autoestables" , 10 o estar domprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual el fragmento forma una parte o región, de manera más preferente como una región continua e individual . Los ejemplos representativos de los fragmentos de polipéptidos de la invención, incluyen, por ejemplo, fragmentos de 15 aproximadamente un número de 1-20, 21-40, 41-60 ó 61 aminoácidos al extremo de la región de codificación. Además, los fragmentos polipeptídicos pueden ser de aproximadamente 20, 30, 40, 50 ó 60 aminoácidos de longitud. En este contexto "aproximadamente", incluye los 20 intervalos particularmente insertados, mas grandes o más pequeños por varios aminoácidos (5, 4, 3, 2 ó 1), en cualquier extremo o en ambos extremos . Los fragmentos preferidos de polipéptido incluyen la proteína segregada así como la forma madura. Los 25 fragmentos preferidos, adicionales del polipéptido incluyen la proteína segregada o la forma madura que tiene la serie continua de residuos suprimidos del término amino o carboxí, o ambos. Por ejemplo, cualquier número de aminoácidos, que varían de 1-60, se pueden suprimir del 5 término amino de ya sea el polipéptido segregado o la forma madura. De manera similar, cualquier número de aminoácidos, que varía de 1-30, se puede suprimir del término carboxi de la proteína segregada a la forma madura. Adicionalmente, se prefiere cualquier combinación de las supresiones del 10 término amino y carboxi, anteriores. De manera similar, los fragmentos de polinucleótido que codifican para estos fragmentos de polipéptido también se prefieren. Se prefieren los fragmentos de polipéptido y polinucleótido caracterizados por dominios estructurales o 15 funcionales, tal como fragmentos que comprenden la alfa- hélice y regiones de formación de alfa-hélice, beta-hoja y regiones de formación de beta-hoja, vuelta y regiones de formación de vuelta, espiral y regiones de formación espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones 20 alfa-anfipáticas, regiones beta-anfipáticas , regiones flexibles, regiones de formación de superficie, región de unión a substrato, y regiones de alto índice antigénico. Los fragmentos polipeptídicos de las traducciones de SEQ ID NO: 1-62 que caen dentro de los dominios se contemplan 25 específicamente por la presente invención. Además, los J,JÉTaK«a-tt¡... -*&«. . . „ ¿^ ,_ ^Jj , „ M. -* .«~« JC* .-. -^ y. ,.-..,.,»>*.. JJ» „ M* . - » — -t, •«* « » A fragmentos polinucleótidos que codifican para estos dominios también se contemplan. Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada, mejorada, una actividad indeseada, disminuida.

Epítopes y anticuerpos En la presente invención, "epítopes" se refiere a fragmentos polipeptídicos que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, especialmente en un humano. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un fragmento polipeptídico que comprende un epítope, así como el polinucleótido que codifica para este fragmento. Una región de una molécula de proteína a la cual puede unirse un anticuerpo se define como un "epítope antigénico" . En contraste, un "epítope inmunogénico" se define como parte de una proteína que produce una respuesta de anticuerpos. (ver, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)). Los fragmentos que funcionan como epítopes se pueden producir por cualquier medio convencional, (ver, por ejemplo, Houghten, R. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985), descrito adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos No. 4,631,211). En la presente invención, los epítopes antigénicos contienen de manera preferente una secuencia de al menos siete, de manera preferente al menos nueve, y de manera más preferente entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. Los epítopes antigénicos son útiles para formular anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente al epítope. (Ver, por ejemplo, Wilson et al, Cell. 37:767-778 (1984); Sutcliffe, J. G. et al., Science 219:660-666 (1983) ) . De manera similar, se pueden usar epítopes inmunogénicos para inducir anticuerpos de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al, supra: Chow, M. Et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F. J. Et al., J. Gen. Virol . 66:2347-2354 (1985)). Un epítope inmunogénico preferido incluye la proteína segregada. Los epítopes inmunogénicos se pueden presentar junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, a un sistema de animal (tal como conejo o ratón) o, si es suficientemente largo (al menos aproximadamente 25 aminoácidos), sin un portador. Sin embargo, los epítopes inmunogénicos que comprenden tan pocos como 8 a 10 aminoácido se han mostrado que son suficientes para formular anticuerpos capaces de unirse a, en, como mínimo, epítopes lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en la transferencia 5 Western) . Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" (Ab) o anticuerpo monoclonal" (Mab) se propone para incluir moléculas intactas así como a fragmentos de anticuerpo (tal como, por ejemplo, fragmentos Fab y 10 F(ab')2) que son capaces de la unión especifica a la proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se depuran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión a tejido no específico que un anticuerpo intacto. (Wahl et 15 al., J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983)). De esta manera, estos fragmentos se prefieren, así como los productos de FAB u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena individual y humanizados. 20 Las modalidades adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales, murinos. Estos anticuerpos humanizados se pueden preparar por técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los 25 anticuerpos se administran a humanos. En una modalidad, un anticuerpos monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o solo el sitio de unión antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de 5 anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos 10 monoclonales quiméricos y adicionalmente manejados incluyen aquellos descritos en Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989), y Winter y Harris (TIPS 14:139, mayo, 1993) . 15 Un método para producir un anticuerpo comprende inmunizar un animal no humano, tal como un ratón transgénico, con un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62, por lo que los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido traducido de 20 una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62 se generan en el animal. Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos en animales no humanos. Los anticuerpos pueden ser parcialmente humanos, o de manera preferente completamente humanos. Los animales no 25 humanos (tal como ratones transgénicos) en los cuales se ha s -s* í i í introducido material genético que codifica para una o más cadenas de inmunoglobulina humana, se pueden emplear. Estos ratones transgénicos se pueden alterar genéticamente en una variedad de maneras. La manipulación genética puede dar por resultado cadenas de polipéptidos de inmunoglobulina humana que reemplazan cadenas de inmunoglobulina endógenas en al menos algunos anticuerpos (de manera preferente virtualmente todo) producidos por el animal en la inmunización. Los anticuerpos producidos al inmunizar animales transgénicos con un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62 se proporcionan en la presente. Se han preparado ratones en los cuales se inactivan uno o más genes de inmunoglobulina endógenos, por varios medios. Se han introducido genes de inmunoglobulina humana en los ratones para reemplazar los genes inactivados de ratón. Los anticuerpos producidos en los animales incorporan cadenas de polipéptido de inmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. Los ejemplos de técnicas para la producción y uso de estos animales transgénicos se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,814,318, 5,569,825 y 5,545,806 que se incorporan en la presente como referencia. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por procedimientos convencionales, por ejemplo, al i,y- ü.&ly inmortalizar células de vaso recolectadas del animal transgénico después del término del programa de inmunización. Las células de vaso se pueden fusionar con células de mieloma para producir hibridomas, por procedimientos convencionales. Un método para producir una línea de células de hibridoma comprende inmunizar un animal transgénico con un inmunógeno que comprende al menos siete residuos contiguos de aminoácido de un polipéptido traducido a partir de una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62; recolectar las células de vaso del animal inmunizado; fusionar las células de vaso recolectadas a una línea de células de mieloma; generando de esta manera células de hibridoma; e identificar una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpos monoclonal que se une a un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62. Estas líneas de célula de hibridoma, y anticuerpos monoclonales producidos de las mismas, se abarcan por la presente invención. Los anticuerpos monoclonales segregados por la línea de células de hibridoma se purifican por técnicas convencionales. Se pueden ampliar anticuerpos en un procedimiento in vi tro o se administran, in vivo para inhibir la actividad biológica inducida por un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62.

De esta manera, se pueden tratar trastornos provocados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de estos polipéptidos de la presente invención con los receptores de la superficie celular. Un método terapéutico comprende la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad efectiva para reducir una actividad biológica inducida por un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos elegido de SEQ ID NO: 1-62. También se proporcionan en la presente conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo de diagnóstico) o terapéutico, unido a un anticuerpo dirigido contra un polipéptido traducido de una secuencia de nucleótidos elegida de SEQ ID NO: 1-62. Los ejemplos de estos agentes son bien conocidos, e incluyen de manera enunciativa y sin limitación radionúclidos de diagnóstico, radionúclidos terapéuticos y fármacos citotóxicos. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vi tro o in vivo .

Proteínas de fusión Cualquier polipéptido de la presente invención se puede usar para generar proteínas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención, cuando se fusiona a una segunda proteína, se puede usar como una marca antigénica. Los anticuerpos formulados contra el polipéptido de la presente invención se pueden usar para detectar indirectamente la segunda proteína al unirse al polipéptido. Además, debido a las ubicaciones celulares objetivo de las proteínas segregadas en base a las señales de tráfico, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar como moléculas de dirección al objetivo una vez fusionadas a otras proteínas. Los ejemplos de dominios que se pueden fusionar a polipéptidos de la presente invención incluyen no solo secuencias de señal heterólogas, sino también otras regiones funcionales heterólogas. La fusión no necesariamente necesita ser directa, sino que puede presentarse a través de secuencias ligadoras. Además, las proteínas de fusión también se pueden manejar para mejorar las características del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, se puede adicionar al N-término del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación de la célula hospedadora o manejo subsecuente y almacenamiento. También, las porciones peptídicas se pueden adicionar al polipéptido para facilitar la purificación. Estas regiones se pueden remover antes de la preparación final del polipéptido. La adición de las porciones peptídicas para facilitar el manejo de polipéptido son técnicas familiares y de rutina en la técnica . Además, los polipéptidos de la presente invención, incluyendo fragmentos, y específicamente epítopes, se pueden combinar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando por resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media incrementada in vivo . Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del CD4-polipéptido humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de mamífero. (EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen estructuras diméricas enlazadas a disulfuro (debido a IgG) también pueden ser más eficientes en la unión y neutralización de otras moléculas, que la proteína segregada monomérica o fragmento de proteína sólo. (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995). De manera similar, la EP-A-0, 464 , 533 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden varias porciones de región constate de moléculas de mmunoglobulma junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es benéfica en terapia y diagnosis, y de esta manera puede dar por resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas. (EP-A-0 , 232 , 262 ) . Alternativamente, la supresión de la parte Fc después de 5 que se ha expresado, detectado y purificado la proteína de fusión, sería deseable. Por ejemplo, la porción Fc puede impedir la terapia y diagnosis y la proteína de fusión se usa como un antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, las proteínas 10 humanas, tal como hIL-5, se han fusionado con porciones Fc para el propósito de los ensayos de detección de alto rendimiento, para identificar antagonistas hIL-5 (Ver, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol.. Chem. 270:9459-9471 (1995)). 15 Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tal como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos del marcador es un péptido de exa-histidina, 20 tal como la marca provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA. , 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1989), por ejemplo, hexa-histidina proporciona 25 purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra Am ^¿í?& ^ F- ^'^ * - marca peptídica útil para la purificación, la marca "HA", corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984) . De esta manera, se pueden manejar cualquiera de estas fusiones anteriores usando los polinucleótidos o los polipéptidos de la presente invención.

Vectores, células hospedadoras y producción de proteína La presente invención también se refiere a vectores que contienen el polinucleótido de la presente invención, células hospedadoras y la producción de polipéptidos por técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en replicación o defectuosos en la replicación. En este último caso, la propagación viral se presentará en general solo en células hospedadoras de complemento. Los polinucleótidos se pueden unir a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un hospedador. En general, un vector de plásmido se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empacar in vi tro usando una ] ínea celular de empaque apropiada y luego se traduce en células hospedadoras . El inserto de polinucleótido se debe enlazar operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor fago lambda PL, el promotor lac de E. Coli, el promotor trp, los promotores phoA y tac, los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de LTR retrovirales, por nombrar unos pocos. Se conocerán por aquellos expertos en la técnica otros promotores adecuados. Las construcciones de expresión contendrán adicionalmente sitios para el inicio de trascripción, término y en una región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción de codificación de los transcritos expresados por las construcciones incluirá de manera preferente un codón de inicio de traducción en el comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente en el extremo del polipéptido que se va a traducir . Como se indica, los vectores de expresión incluirán de manera preferente al menos un marcador seleccionable. Estos marcadores incluyen dihidrofolato- reductasa, G418 o resistencia a neomicina para el cultivo de células eucarióticas los genes de resistencia a tetraciclina, canamicina o ampicilina para cultivo en E. Coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, células bacterianas, tal como E. Coli, células de Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngales, tal como células de levadura; células de insecto tal como las células S2 de Drosophila y las células Sf9 de Spodoptera ; células de animales tal como CHO, COS, 293; células de melanoma de Bowes, y células de planta. Los medios de cultivo apropiados y las condiciones para las células hospedadoras descritas con anterioridad, se conocen en la técnica. Entre los vectores preferidos para el uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de QIAGEN, Incl . ; vectores pBluescript, vectores de Phagescript, pNHdA, PNHlßa, pNHldA, pNH46A, disponibles de Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223 3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponible de Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3 , pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes por aquellos expertos en la técnica. La introducción de la construcción en la célula hospedadora se puede efectuar por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, transfección mediada con lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos.

Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio normales, tal como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) . Se contempla de forma específica que los polipéptidos de la presente invención se pueden expresar en realidad por una célula hospedadora que carezca de un vector recombinante. Un polipéptido de esta invención se puede recuperar y purificar en los cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía con lectina. De manera más preferente, se emplea cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención, y de manera preferente la forma segregada, también se puede recuperar de: productos purificados de fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células, ya sea directamente aislados o cultivados; productos de procedimientos de síntesis química; y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de ,t ? ? A2 .A.ÍSCAH .Í ^-- . * AL?+ C?. ¿-*? • OT--tír*--' *'--»'^^fil^rfr?'Í^f»" insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención se pueden glicosilar o pueden estar no glicosilados Además, los polipéptidos de 5 la invención también pueden incluir un residuo inicial de metíonina, modificado, en algunos casos como resultado de los procesos mediados por el hospedador. De esta manera, es bien conocido en la técnica que la metionina N-terminal codificada por el codon de inicio de traducción se remueve 10 en general con una alta eficiencia de cualquier proteína después de la traducción en todas las células eucarióticas. En tanto que la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas también se remueve de forma eficiente en la mayoría de las procariotas, para algunas proteínas, este 15 proceso de remoción procariótico es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al cual se enlace covalentemente la metionina N-terminal.

Usos de los polinucleótidos 20 Cada uno de los polinucleótidos identificados en la presente se puede usar de varias maneras como reactivos. La siguiente descripción se debe considerar ejemplo y utiliza técnicas conocidas. Los polinucleótidos de la presente invención son 25 útiles para la identificación de cromosomas. Existe una j¿a?~M*Aibi necesidad actual de identificar nuevos marcadores de cromosoma, puesto que pocos reactivos de marcación de cromosomas, en base a los datos de secuencia actuales (polimorfismos de repetición) , están actualmente disponibles. Cada polinucleótido de la presente invención se puede usar como un marcador de cromosoma. De manera breve, se pueden correlacionar secuencias a cromosomas al preparar cebadores de PCR (de manera preferente 15-25 pb) de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1-62. Se pueden seleccionar cebadores usando análisis de computadora, de modo que los cebadores no abarquen más de un exón previsto en el ADN genómico. Estos cebadores entonces se usan para la detección por PCR de los híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Solo aquellos híbridos que contienen el gen humano que corresponde a la SEQ ID NO: 1-62 producirá un fragmento amplificado. De manera similar, los híbridos somáticos proporcionan un método rápido de PCR que correlaciona los polinucleótidos a cromosomas particulares. Tres o más clones se pueden asignar por día usando un ciclador térmico individual. Además, la sububicación de los polinucleótidos se puede lograr con paneles de fragmentos cromosómicos específicos. Otras estrategias de correlación de genes que se pueden usar incluye hibridación in situ, predetección u¿msá?iM?.Mi. ;ií¡?,yf. ^uM con cromosomas clasificados con flujo, marcados, y pre- selección por hibridación para construir bibliotecas de ADNc específicas del cromosomas. La ubicación cromosómica precisa de los polinucleótidos también se puede lograr usando hibridación in situ por fluorescencia (FISH) de una extensión cromosómica de metafase. Esta técnica usa polinucleótidos tan cortos como de 500 a 600 bases; sin embargo, se prefieren los polinucleótidos de 2,000 a 4,000 pb. Para una revisión de esta técnica, ver Verma et al, "Human Chromosomes; a Manual of Basic Techniques", Pergamon Press, New York (1988) . Para la correlación de cromosomas, los polinucleótidos se pueden usar de forma individual (para marcar un cromosoma individual o un sitio individual en ese cromosoma) o en paneles (para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas) . Los polinucleótidos preferidos corresponden a las regiones de no codificación de los ADNc debido a que las secuencias de codificación están más probablemente conservadas dentro de las familias génicas, incrementando de esta manera la oportunidad de hibridación cruzada durante la correlación cromosómica. Una vez que se ha correlacionado un polinucleótido a una ubicación cromosómica precisa, la posición física del polinucleótido se puede usar en el j 2c..l M..Í ,j. ?ZÍ Zm,*.:ií . ...ZÍ;.i¡,mZ..* -----—--s- . "•*___r?&~ .-MS..-»*».----»*--* »-*.»««*->' análisis de los enlaces. El análisis de enlaces establece la co-herencia entre una ubicación cromosómica y la presentación de una enfermedad particular. (Se encuentran los datos de correlación de enfermedad, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library) ) . Asumiendo una resolución de correlación de una megabase y un gen por 20 kb, un ADNc localizado de forma precisa a una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de los 50-500 genes potenciales causantes. De esta manera, una vez que se establece la coherencia, se pueden examinar las diferencias en el polinucleótido y el gen correspondiente entre individuos afectados y sin afectar. Los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1-62 se pueden usar para este análisis de humanos individuales . Primero, se examinan alteraciones estructurales visibles en los cromosomas, tal como supresiones o transcolocaciones en las extensiones cromosómicas o por PCR. Si no existen alteraciones estructurales, la presencia de mutaciones de punto se averigua. Las mutaciones observadas en algunos o todos los individuos afectados, pero no en individuos normales, indica que la mutación puede provocar la enfermedad. Sin embargo, la secuenciación completa del polipéptído y el gen correspondiente de varios individuos normales se requiere para distinguir la mutación de un polimorfismo. Si se identifica un nuevo poliformismo, este polipéptido polimórfico se puede usar para el análisis de enlace adicional. Además, la expresión incrementada o disminuida del gen en individuos afectados en comparación a individuos sin afectar se puede valorar usando los polinucleótidos de la presente invención. Se pueden usar cualquiera de estas alteraciones (expresión alterada como un marcador de diagnóstico o pronóstico. Además de lo anterior, un polinucleótido se puede usar para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ADN o ARN anti-sentido. Ambos métodos dependen de la unión del polinucleótido ADN o ARN. Para estas técnicas, los polinucleótidos preferidos usualmente son de 20 a 40 bases de longitud y complementarios a ya sea la región del gen comprendido en la trascripción (triple hélice - ver Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)) y al ARNm mismo (antisentido.- Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). La formación de triple hélice da por resultado óptimamente un corte de la trascripción de ARN del ADN, en tanto que la hibridación de ARN anti-sentido bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido. Ambas técnicas son efectivas en sistemas de modelo, y la información descrita en la presente se puede usar para diseñar polinucleótidos antisentido o de triple hélice en un esfuerzo para tratar la enfermedad. Los polinucleótidos de la presente invención también son útiles en la terapia génica. Un objetivo de la terapia génica es insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectuoso, en un esfuerzo para corregir el defecto genético. Los polinucleótidos descritos en la presente invención ofrecen un medio para dirigir los defectos genéticos de una manera altamente exacta. Otro objetivo es insertar un nuevo gen que no estuvo presente en el genoma del hospedador, produciendo de esta manera un nuevo rasgo en la célula hospedadora. Los polinucleótidos también son útiles para identificar individuos de muestras biológicas diminutas. El ejército de los Estados Unidos, por ejemplo, está considerando el uso del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) para la identificación de su personal. En esta técnica, se digiere del AD? genómico de un individuo con una o más enzimas de restricción, y se sondea en una transferencia Southern para producir bandas únicas para identificar al personal. Este método no sufre de las limitaciones actuales de las "marcas de perro" que pueden perder, cambiar u olvidarse, haciendo difícil la identificación positiva. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar como marcadores adicionales de ADN para RFLP. Los polmucleótidos de la presente invención también se pueden usar como una alternativa a RFLP, al determinar la secuencia de ADN base por base, real de las porciones seleccionadas del genoma de un individuo. Estas secuencias se pueden usar para preparar cebadores de PCR para amplificar y aislar este ADN seleccionado, que luego se puede secuenciar. Usando esta técnica, se pueden identificar individuos debido a que cada individuo tendrá un conjunto único de secuencias de ADN. Una vez que se establece una base de datos de ID única para la identificación positiva, individual de ese individuo, vivo o muerto, se puede hacer a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas . La biología forense también se beneficia del uso de técnicas de identificación basadas en ADN como se describe en la presente. Las secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas tal como tejidos, por ejemplo cabello o piel, o fluidos corporales, por ejemplo sangre, saliva, semen, etc., se pueden amplificar usando PCR. En una técnica anterior, las secuencias génicas amplificadas del locus polimórfico, tal como el gen HLA clase II de DQa, se usan en biología forense para identificar individuos. (Erlich, H. , PCR Technology, Freeman and Co . (1992)). Una vez que se amplifican estos locus polimórficos específicos, se digieren con una o más 5 enzimas de restricción, produciendo un conjunto de identificación de bandas en una transferencias Southern sondeada con ADN que corresponde al gen HLA clase H de DQa. De manera similar, los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar como marcadores polimórficos para 10 propósitos forenses. También existe la necesidad de reactivos capaces de identificar la fuente de un tejido particular. Surge esta necesidad, por ejemplo, en los médicos forenses cuando se presentan con tejido de origen desconocido. Los 15 reactivos apropiados pueden comprender, por ejemplo, sondas o cebadores de ADN específicos para un tejido particular preparados de las secuencias de la presente invención. Paneles de estos reactivos pueden identificar tejido por especie y/o por tipo de órgano. De una manera similar, 20 estos reactivos se pueden usar para detectar cultivos de tejidos para la contaminación. Como mínimo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar como marcadores de peso molecular en los geles Southern, como sondas de diagnostico para la 25 presencia de un ARNm específico en un tipo celular fe&,.., j*-j^a- ititli i c?LÁai .^-i^t±- ". particular, como una sonda para "substraer" secuencias conocidas en el proceso de descubrir nuevos polinucleótidos, para seleccionar y marcar oligómeros para la unión aun "pedazo de gen" u otro soporte, para formular anticuerpos anti-ADN usando técnicas de inmunización de ADN, y como un antígeno para producir una respuesta inmunitaria .

Usos de los polipéptidos Cada uno de los polipéptidos identificados en la presente se puede usar de varias maneras. La siguiente descripción se debe considerar de ejemplo y utiliza técnicas conocidas. Un polipéptido de la presente invención se puede usar para analizar o ensayar los niveles de proteína en una muestra biológica usando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de proteína en tejido se puede estudiar con métodos inmunohistológicos clásicos. Jalkanen, M. , et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M. , et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, tal como el ensayo inmunoabsorben enlazado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RÍA) . Se conocen marcas de ensayo de anticuerpo, adecuadas en la técnica e incluyen marcas de enzima, tal como glucosa-oxidasa, radioisótopos, tal como yodo (125I, 121I), carbono (14C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (112In) y tecnedio (99mTc), y marcas fluorescentes, tal como fluoresceína y rodamina, y biotina. Además de ensayar los niveles de proteína segregada en una muestra biológica, las proteínas también se pueden detectar in vivo por formación de imágenes. Las marcas o marcadores de anticuerpo para la formación de imágenes in vi vo de proteína que incluyen aquellos detectables por radiografía con rayos X, es RMN y ESR. Para la radiografía con rayos X, las marcas adecuados incluyen radioisótopos tal como bario o cesio, que emiten radiación de detectable, pero no son claramente peligrosos al sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y ESR incluyen aquellos con un giro detectable, tal como de deuterio, que se incorporar en el anticuerpo por marcado de nutrientes para hibridoma impertinente. Un anticuerpo específico a la proteína o fragmento de anticuerpo que se haya marcado con una porción de imágenes, detectable, apropiada, tal como un radioisótopo (por ejemplo, 131I, 112In, 99Tc) , una substancia radioopaca, o un material detectable por resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, de forma parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el * j ¿j^„bÁM^^, j-ttájooiz.. » -ijítiat-i .-A- - A * i. ^t-. -.A-*»»... . M*A* ~M** I. •** «y- fjí " tf* ~f? sistema de formación de imagen usado determinará la cantidad de porción de formación de imagen necesaria para producir imágenes y diagnostico en el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada variará normalmente desde aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99p?Tc . El anticuerpo marcado o fragmento de anticuerpos entonces se acumulará de forma preferencial en la ubicación de células que contienen la proteína específica. Se describe la formación de imágenes del tumor in vivo en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokmetics of Radiolabeled .Antibodies and Their Fragments Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).) De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico de un trastorno, que comprende (a) ensañar la expresión de un polipéptido de la presente invención en células o fluido corporal de un individuo; (b) cooperar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica anormal, por lo que un incremento o disminución en el nivel de expresión del gen de polipéptido, ensayado, en comparación al nivel de expresión normal es indicativo de un trastorno. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para tratar una enfermedad. Por ejemplo, a I . A . los pacientes se les puede administrar un polipéptido de la presente invención en un esfuerzo para reemplazar los niveles ausentes o disminuidos del polipéptido (por ejemplo, insulina), para complementar los niveles ausentes o disminuidos de un diferente polipéptido (por ejemplo, hemoglobina S para hemoglobina B) para inhibir la actividad de un polipéptido (por ejemplo, un oncogen), para activar la actividad de un polipéptido (por ejemplo, por unión a un receptor) , para reducir la actividad de un receptor unido a membrana al competir con ésta por el ligando libre (por ejemplo, receptores de TNF solubles usados en la reducción de la inflamación) , o para provocar una respuesta indeseada (por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos). De manera similar, los anticuerpos dirigidos a un polipéptido de la presente invención también se pueden usar para tratar la enfermedad. Por ejemplo, la administración en un anticuerpos dirigido a un polipéptido de la presente invención puede unirse y reducir la sobreproducción del polipéptido. De manera similar, la administración del anticuerpo puede activar el polipéptido, tal como por la unión a un polipéptido unido a una membrana (receptor) . Como mínimo, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar como marcadores de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración de gel y tamices moleculares usando métodos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos se pueden usar también para formular anticuerpos, que a su vez se usan para medir la expresión de la proteína de una célula recombinante, como una manera para valorar la transformación de la célula hospedadora. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para probar las siguientes actividades biológicas.

Actividades biológicas Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se pueden usar en ensayos para probar una o más actividades biológicas. Si estos polinucleótidos y polipéptidos exhiben actividad en un ensayo particular, probablemente es que estas moléculas puedan estar comprendidas en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. De esta manera, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden usar para tratar el tejido asociado.

Actividad inmunitaria Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de deficiencias y trastornos del sistema inmunitario, la activar o al inhibir la proliferación, diferenciación, o movilización (quimiotaxis) de células inmunitarias . Las células inmunitarias se desarrollan a través de un proceso llamado hematopoyesis, que producen células mieloides (plaquetas, células sanguíneas rojas, neutrófilos, y macrófagos) y linfoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotentes. La etiología de estas deficiencias 5 inmunitarias o trastornos puede ser genética, somática, tal como cáncer o algunos trastornos inmunitarios , adquirida (por ejemplo por quimioterapia o toxina) o infecciosa. Además, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención se puede usar como un marcador o detector de un 10 trastorno o enfermedad particular del sistema inmunitario. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede ser útil en el tratamiento o detección de deficiencias a trastornos de células hematopoyéticas. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se 15 puede usar para incrementar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células madre pluripotentes, en un esfuerzo para tratar aquellos trastornos asociados con una disminución en ciertos tipos (o en muchos) de células hematopoyéticas. 20 Los ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológicos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación: trastornos de proteínas sanguíneas (por ejemplo, agammaglobulinemia, disgammaglobulinemia) , telangiectasia atáxica, inmunodeficiencia variable común, síndrome de 25 Digeorge, infección por HIV, infección por HTLV-BLV, síndrome de deficiencia de adhesión de leucocitos, limfopenia, disfunción bacteriocida de fagocitos, inmunodeficiencia combinada severa (SCID) , trastorno de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia o hemoglobinuria . Además, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se podría usar para modular la actividad hemostática (la detención del sangrado) o trombolítica (formación de coágulos) . Por ejemplo, al incrementar la actividad hemostática o trombolítica, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención se podría usar para tratar los trastornos de coagulación sanguínea (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencia de factores), trastornos de plaquetas sanguíneas (por ejemplo, trombocitopenia) , o heridas que resultan de trauma, cirugía u otras causas. De manera alternativa, un polmucleótido o polipéptido de la presente invención que puede disminuir la actividad hemostática o trombolítica se podría usar para inhibir o disolver la coagulación. Estas moléculas pueden ser importantes en el tratamiento de ataques cardiacos (infarto), apoplejías, o cicatrización. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención también podría ser útil en el tratamiento o detección de trastornos autoinmunitarios . Muchos trastornos autoinmunitarios resultan del reconocimiento inapropiado del material autónomo como material extraño por células inmunitarias. Este reconocimiento inapropiado da por resultado una respuesta inmunitaria que conduce a la detección del tejido del hospedador. Por lo tanto, la administración de un polipéptido o polinucleótido de la presente invención que inhibe una respuesta inmunitaria, particularmente la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia efectiva en la prevención de trastornos autoinmunitarios. Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar o detectar por la presente invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación: enfermedad de Addison, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípido, antireumatoide, dermatitis, encefalomielitis alérgica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasteure, enfermedades graves, esclerosis múltiple, miastenia gravis, neuritis, oftalmía, pénfigo dio buloso, pénfigo, poliendocrinopatías, púrpura, enfermedad de Reiter, síndrome de hombre rígido, tiroiditis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina, y enfermedad ocular inflamatoria autoinmunitaria. De manera similar, las reacciones y condiciones alérgicas, tal como asma (particularmente asma alérgica) y otros problemas respiratorios, también se pueden tratar por sdba un polipéptido o polinucleótido de la presente invención. Además, estas moléculas se pueden usar para tratar la anafilaxis, hipersensibilidad a una molécula antigénica, o incompatibilidad de grupo sanguíneo. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención también se puede usar para tratar y/o prevenir el rechazo de órganos o la enfermedad del huésped contra el injerto (GVHD) el rechazo de órganos se presenta por la descripción de células inmunitarias del hospedador del tejido trasplantado a través de una respuesta inmunitaria. De manera similar, también está comprendida una respuesta inmunitaria en GVHD, pero en este caso, las células inmunitarias trasplantadas, extrañas destruyen los tejidos del hospedador. La administración de un polipéptido o polinucleótido de la presente invención que inhibe una respuesta inmunitaria, particularmente la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia efectiva en la prevención del rechazo de órganos o GVHD. De manera similar, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede usar para modular la inflamación. Por ejemplo, el polipéptido o polinucleótido puede inhibir la proliferación y diferenciación de células comprendidas en una respuesta inflamatoria. Estas moléculas se pueden usar para tratar condiciones inflamatorias, tanto condiciones crónicas como agudas, incluyendo inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque séptico, sepsis, o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) ) , lesión por isquemia- reperfusión, letalidad por endotoxinas, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, lesión de pulmón inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, o que resulten de la sobreproducción de citocinas (por ejemplo TNF o IL-1) .

Trastornos hiperproliferativos Se puede usar un polipéptido o polinucleótido para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, incluyendo neoplasmas. Un polipéptido o polinucleótido del proporciona puede inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Alternativamente, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede hacer proliferar otras células que puedan inhibir el trastorno hiperproliferativo. Por ejemplo, al incrementar una respuesta inmunitaria, particularmente al incrementar las cantidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o al proliferar, diferenciar o movilizar células T, se pueden tratar trastornos hiperproliferativos . Esta respuesta inmunitaria se puede incrementar ya sea al mejorar una respuesta inmunitaria existente, o al iniciar una nueva respuesta inmunitaria. De manera alternativa, la disminución de una respuesta inmunitaria también puede ser un método para tratar trastornos hiperproliferativos , tal como un agente quimioterapéutico. Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, neoplasmas localizados en el: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (supra renal, paratiroide, pituitaria, testículos, ovarios, timo, tiroides, ojo, cabeza y cuello, sistema de nervios (central y periférico) , sistema linfático, pélvico, piel, tejido suave, vaso, toráxico y urogenital. De manera similar, también se pueden tratar otros trastornos hiperproliferativos o detectar por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención. Los efectos de estos trastornos hiperproliferativos influyen de manera enunciativa y sin limitación: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemías, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gauchers, histiocitosis, y otra enfermedad hiperproliferativo, además neoplasia, localizada en el sistema de órganos listados anteriormente .

Enfermedad infecciosa 5 Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, al incrementar la respuesta inmunitaria, particularmente al incrementar la proliferación y diferenciación de células B y/o T, se 10 pueden tratar enfermedades infecciosas. La respuesta inmunitaria se puede incrementar al mejorar ya sea una respuesta inmunitaria existente, o al iniciar una nueva respuesta inmunitaria. De manera alternativa, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención 15 también puede inhibir directamente al agente infeccioso, sin producir necesariamente una respuesta inmunitaria. Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede provocar enfermedad o síntomas que se puedan tratar o detectar por un polinucleótido o polipéptido de la 20 presente invención. Los ejemplos de virus incluyen de manera enunciativa y sin limitación, las siguientes familias virales de ADN o ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Axterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circovirídae, Coronaviridae, Flaviviridae, 25 Hepadnavirídae (Hepatitis), Herpesviridae (tal como íff l?r? *l?Ü1Íítlft??ílfflfrrtP*"£ '- ' i .* - A.fc-ir.-t .-,» - .*— --» Citomegalovirus, Herpes Simplex, Herpes Zoster) , Mononegavirus (por ejemplo Paramixoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae) , Orthomixoviridae (por ejemplo, Influenza) , Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tal como Viruela o Vaccinia) , Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus) , Retroviridae (HTLV-1, HTLV-II, Lentivirus) , y Togaviridae (por ejemplo Rubivirus) . Los virus que caen dentro de estas familias pueden provocar una variedad de enfermedades o síntomas incluyendo de manera enunciativa y sin limitaciones. Artritis, bronqueolitis, encefalitis, infecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis, queratitis) , síndrome de fatiga crónico, hepatitis (A, B, C, E, activa crónica, delta) , meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo SIDA) , neumonía, linfoma de Burkitts, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabias, el resfriado común, polio, leucemia, rubéola, enfermedades sexualmente transmitidas, enfermedades de la piel (por ejemplo, Kaposi, verrugas) y viremia. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. De manera similar, los agentes bacterianos o fúngales que pueden provocar enfermedad o síntomas y que se pueden tratar o detectar por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen de manera enunciativa y sin limitación las siguientes familias de bacterias gram-negativas y gram-positivas y hongos: Actinomycetales (por ejemplo, Corynebacterium, Mycobacterium, Norcardia), Aspergillosis, Bacillaceae (por ejemplo, Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, Blastomycosis, Bordetella, Borrelia, Brucellosis, Candidiasis, Campylobacter, Coccidioidomycosis, Cryptococcosis , Dermatocycoses , Enterobacteriaceae (Klebsielia, Salmonella, Serratia, Yersinia) , Erysipelothrix, Helicobacter, Legionellosis , Leptospirosis, Listeria, Mycoplasmatales, Neisseriaceae (por ejemplo, Acinetobacter , Gonorrhea, Menigococcal) , infecciones por Pasteurellacea (por ejemplo, Actinobacillus, Heamophilus, Pasteurella), Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae, Syphilis, y Staphylococcal . Estas familias de bacterias y hongos pueden provocar las siguientes enfermedades o síntomas, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación: bacteremia, endocarditis, infecciones oculares (conjuntivitis, tuberculosis, uveítis) , gingivitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, infecciones relacionadas al SIDA, paroniquia, infecciones relacionadas a prótesis, enfermedad de Reiter, infecciones del tractorespiratorio, tal como tos ferina o empireuma, sepsis, enfermedad de Lyme, enfermedad de arañazo de gato, disentería, fiebre para tifoidea, enmendamiento de alimentos, fiebre tifoidea, p-neumonía, gonorrea, meningitis, clamidia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impetigio, fiebre reumática, fiebre escarlatina, enfermedades sexualmente transmitidas, enfermedades de la piel (por ejemplo celulitis, dermatocicosis) , toxemia, infecciones del tractourinario, infecciones de heridas. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. Además, los agentes parásitos que provocan enfermedad o síntomas que se pueden tratar o detectar por un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen de manera enunciativa y sin limitación las siguientes familias: Amebiasis, Babesiosis, Coccidiosis, Cryptosporidiosis , Dientamoebiasis , Dourine, Ectoparasitic , Giardiasis, Helminthiasis, Leishmaniasis , Theileriasis , Toxoplasmosis, Trypanosomiasis , y Trichomonas . Estos parásitos pueden provocar una variedad de enfermedades o síntomas, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación: sarna, trombiculiasis, enfermedades oculares, enfermedades intestinales (por ejemplo disentería, guiardiasis) , enfermedades hepáticas, enfermedades pulmonares, infecciones oportunistas (por ejemplo relacionadas al SIDA) , malaria, complicaciones de la preñez, y toxoplasmosis. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. De manera preferente, el tratamiento usando un polipéptido o polinucleótído de la presente invención puede ser ya sea al administrar una cantidad efectiva de un polípéptido al paciente, o al remover células del paciente, suministrando las células con un polinucleótido de la presente invención, y regresando las células manejadas al paciente (terapia es vivo) . Además, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar como un antígeno en una vacuna para formular una respuesta inmunitaria contra la enfermedad infecciosa.

Regeneración Un polipéptido o polipéptido de la presente invención se puede usar para diferenciar, proliferar y atraer células, conduciendo la regeneración de tejidos. (Ver, Science 276:59-87 (1997). La regeneración de tejidos se podría usar para reparar, reemplazar o proteger el tejido dañado por defectos congénitos, trauma (heridas, quemaduras, incisiones, o úlceras) , edad, enfermedad (por ejemplo, osteoporosis, osteoartritis, enfermedades periodontales, falla hepática, cirugía, incluyendo cirugía plástica o cosmética, fibrosis, lesión por reperfusión, o A^'^-« daño por citocinas sistémicas. Los tejidos que se podrían regenerar usando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardiaco), vascular (incluyendo endotelio vascular, tejido nervioso, hematopoyético y esquelético (hueso, cartílago, tendón y ligamento) . De manera preferente, la regeneración se presentan sin cicatrización o con cicatrización disminuida. También, la regeneración puede incluir angiogénesis. Además, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede incrementar la regeneración de tejidos difíciles de curar. Por ejemplo, la regeneración incrementada del tendón/ligamento acelerará el tiempo de recuperación después del baño. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención también se podría usar de manera profiláctica en un esfuerzo para evitar el daño. Las enfermedades específicas que se podrían tratar incluyen tendinitis, síndrome de túnel carpario, y otros defectos de tendones y ligamentos. Un ejemplo adicional de la regeneración de tejido de heridas sin curación incluye úlceras de presión, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas. De manera similar, el tejido de nervio y cerebro también se puede regenerar al usar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención para proliferar y diferenciar células de nervio. Las enfermedades que se podrían tratar usando este método incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatías, o 5 trastornos mecánicos y traumáticos (por ejemplo, trastornos de la médula espinal, trauma de cabeza, enfermedad cerebrovascular, y apoplejía). Específicamente, las enfermedades asociadas con lesiones de nervios periféricos, neuropatía periférica (por ejemplo que resulta de la 10 quimioterapia u otras terapias médicas), neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y síndrome de Shy-Drager) , todas se podrían 15 tratar usando el polinucleótido o polipéptido de la presente invención.

Quimiotaxis Un polinucleótido o polipéptido de la presente 20 invención puede tener actividad quimiotáxica . Una molécula quimiotáxica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células cebadas, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio particular en el cuerpo, tal como inflamación, 25 infección, o sitio de híperproliferación . Las células movilizadas entonces pueden repeler y/o curar el trauma particular o anormalidad. Un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede incrementar la actividad quimiotáxica de células particulares. Estas moléculas quimotácticas entonces se pueden usar para tratar inflamación, infección, trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema inmunitario al incrementar el número de células dirigidas a una ubicación particular en el cuerpo. Por ejemplo, se pueden usar moléculas quimiotáxicas para tratar heridas y otro trauma a tejidos al atraer células inmunitarias a la ubicación dañada. Las moléculas quimiotácticas de la presente invención también pueden atraer fibroblastos, que se pueden usar para tratar heridas. También se contempla que un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas también se pueden usar para tratar trastornos. De esta manera, un polinucleótido o polipéptido de la presente invención se podría usar como un inhibidor de la quimiotaxis.

Actividad de unión Un polipéptido de la presente invención se puede usar para detectar moléculas que se unen al polipéptido o a .J..y. J.j¿tt?t...._ M, .___.Í.„ y y ,y_.-.y mM., ^ ,..-.'.A,.-J.., t^.^^^J^..t ...-^ ^ •---. .. -..1^, t moléculas a las cuales se une el polipéptido. La unión del polipéptido y la molécula puede activar (agonistas) , incrementar, inhibir (antagonistas), o disminuir la actividad del polipéptido o la molécula unida. Los ejemplos de estas moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo receptores), o moléculas pequeñas. De manera preferente, la molécula está cercanamente relacionada al ligando natural del polipéptido, por ejemplo, un fragmento de ligando, o un substrato natural, un ligando, un imitador estructural o funcional. (Ver, Coligan et al., Current^ Protocols in Immunology 1(2), Capítulo 5 (1991). De manera similar, la molécula puede estar cercanamente relacionada al receptor natural al cual se une el polipéptido, o al menos, un fragmento del receptor capaz de ser unido por el polipéptido (por ejemplo, sitio activo) . En cualquier caso, la molécula se puede diseñar en forma rotacional usando técnicas conocidas. De manera preferente, la detección de estas moléculas comprende producir células apropiadas que expresen el polipéptido, ya sea como una proteína segregada o en la membrana celular. Las células preferidas incluyen células de mamíferos, levadura, Drosophila, o E. coli . Las células que expresan el polipéptido (o membrana celular que contiene el polipéptido expresado) entonces se ponen en contacto, de manera preferente, con un compuesto de prueba contiene potencialmente la molécula para observar la unión, estimulación o inhibición de la actividad de ya sea el polipéptido o la molécula. El ensayo puede probar simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido, en donde la unión se detecta por una marca, o en un ensayo que comprende la competición con un competidor marcado. Adicionalmente, el ensayo puede probar si el compuesto candidato da por resultado una señal generada por la unión al polipéptido. De manera alternativa, el ensayo se puede llevar a cabo usando preparaciones libres de célula, el polipéptido/molécula fijada a un soporte sólido, bibliotecas químicas, o mezclas de productos naturales. El ensayo también puede comprender simplemente los pasos de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido, medir la actividad del polipéptido/molécula o la unión, y comparar la actividad del polipéptido/molécula por la unión a una norma. De manera preferente, un ensayo de ELISA puede medir el nivel o actividad polipeptídica en una muestra (por ejemplo, muestra biológica usando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir el nivel o actividad polipeptídica ya sea por unión, directa o indirectamente, el polipéptido al competir con el y -¿jfal « t? * polipéptido por un substrato. Todos estos ensayos anteriores se pueden usar como marcadores de diagnóstico o pronóstico. Las moléculas descritas que usan estos ensayos se pueden usar para tratar enfermedad o para ocasionar un resultado particular en un paciente (por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos) al activar o inhibir el polipéptido/molécula. Además, los ensayos pueden descubrir agentes que pueden inhibir o mejorar la producción del polipéptido a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. Por lo tanto, la invención incluye un método para identificar compuestos que se unen a un polipéptido de la invención, que comprende los pasos de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con un polipéptido de la invención; y (b) determinar si la unión se ha presentado. Además, la invención incluye un método para identificar los agonistas/antagonistas que comprenden los pasos de: (a) incubar un compuesto candidato con un polipéptido de la invención, (b) ensayar una actividad biológica; y (c) determinar si se ha alterado la actividad biológica del polipéptido .

Otras actividades Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también puede incrementar o disminuir la i I-d í*km .J,é »Í M. diferenciación o proliferación de células cebadas embriónicas, además de que, como se analiza anteriormente, el linaje hematopoyético. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede usar para modular las características del mamífero, tal como altura corporal, peso, color de cabello, color de ojos, piel, porcentaje de tejido adiposo, pigmentación, tamaño y forma (por ejemplo, cirugía cosmética. De manera similar, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar para modular el metabolismo de mamíferos que afecta el catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización y almacenamiento de energía. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar para cambiar el estado físico o estado mental del mamífero al influenciar los biorritmos, ritmos circadianos, depresión (incluyendo trastornos depresivos), tendencia a la violencia, tolerancia de dolor, capacidades reproductoras (de manera preferente por actividad tipo activina o inhibina) , niveles hormonales o endocrinos, apetito, libido, memoria, tensión, u otras calidades cognitivas. Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención también se puede usar como un aditivo o conservador de alimento, tal como para incrementar o disminuir las capacidades de almacenamiento, contenido de grasa, lípido, proteína, carbohidrato, vitaminas, minerales, cofactores u otros componentes nutricionales.

Otras modalidades preferidas Otras modalidades preferidas de la invención reivindicada incluyen una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80%, de manera preferente al menos 85%, en forma más preferente al menos 90%, en forma más preferente al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1-62. También preferida es una modalidad de ácido nucleico en donde la secuencia de nucleótidos contiguos incluye en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62 en el intervalo de posiciones que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido 5 ' de la secuencia del clon y que termina con el nucleótido en aproximadamente la posición de nucleótido 3' de la secuencia de clon. También se prefiere una molécula de ácido nucleico en donde la secuencia de nucleótidos contiguos incluye en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62 en el intervalo de posiciones que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido de 5 ' del codon de inicio y que termina con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido de 3' de la secuencia de clon como se define para SEQ ID NO: 1-62. 5 De manera similar, se prefiere a una molécula de ácido nucleico en donde la secuencia de nucleótidos contiguos se incluye en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62 en el intervalo de posiciones que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición de nucleótidos 10 de 5 ' del primer aminoácido del péptido de señal y que termina con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido de 3 ' de la secuencia de clon como se define para SEQ ID NO: 1-62. También preferida es una molécula aislada de 15 ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 150 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62. Adicionalmente preferida es una molécula aislada 20 de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62. Una modalidad preferida, adicional es una 25 molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62 que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición de 5 ' del primer aminoácido del péptido de señal y que termina con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido de 3' de la secuencia de clon como se define para SEQ ID NO: 1-62. Una modalidad preferida, adicional es una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia completa de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de hibridación severas a una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico que hibrida, no hibrida bajo condiciones severas de hibridación a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solo residuos A o de solo residuos T. Una modalidad preferida, adicional es un método para detectar en una muestra biológica, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62, método que comprende un paso de comparar una secuencia de nucleótidos de al menos una molécula de ácido nucleico en la muestra con una secuencia seleccionada del grupo y determinar si la secuencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra es al menos 95% idéntica a la secuencia seleccionada. También preferido es el método anterior en donde el paso de comparar las secuencias comprende determinar el grado de hibridación de ácido nucleico entre las moléculas de ácido nucleico en la muestra y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia seleccionada de este grupo. De manera similar, también se prefiere el método anterior en donde el paso de comparar la secuencia se realiza al comparar la secuencia de nucleótidos determinada de una molécula de ácido nucleico en la muestra con la secuencia seleccionada del grupo. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o moléculas de ARN. Una modalidad preferida, adicional es un método para identificar las especies, tejido o tipo celular de una muestra biológica, método que comprende un paso de detectar las moléculas de ácido nucleico en la muestra, si las hay, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1- __._.__ ^ i-.t .? 62. También preferido es un método para diagnosticar en un sujeto una condición patológica asociada con estructura o expresión anormal de un gen, método que 5 comprende un paso para detectar en una muestra biológica obtenida de las moléculas sometidas de ácido nucleico, si las hay, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del 10 grupo que consiste de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62. El método para diagnosticar una condición patológica que comprende un paso de detectar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos 15 en un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, en donde al menos una secuencia en el panel es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo. También preferida es una composición de materia 20 que comprende moléculas aisladas de ácido nucleico en donde las secuencias de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico comprenden un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, en donde al menos una secuencia en el panel es al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 25 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del -_a_^_a_?_-_8_a_i_¡¡I ifei»?-¿»=É«»* t.A.zí..,?.. : zj.? . i . 1*^.*,**. grupo que consiste de: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-62. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o molécula de ARN . También preferido es un polipéptido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 90% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos en una secuencia de aminoácidos traducida de SEQ ID ?O : 1-62. También preferido es un polipéptido, donde la secuencia de aminoácidos contiguos se incluye en ácidos en una secuencia de aminoácidos traducida de SEQ ID ?O : 1-62, en el intervalo de posiciones que empiezan con el residuo en aproximadamente la posición del primer aminoácido de la porción segregada y que terminan con el residuo en aproximadamente el último aminoácido del cuadro de lectura abierto . También preferido es un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos en una secuencia de aminoácido traducida de SEQ ID ?O : 1-62. Se prefiere adicionalmente un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos en una secuencia de aminoácido _ .l. jt¡?,át? *-<* **<--' i-l-8m.AiA, * -y_aaj*j- -i. -*. traducida de SEQ ID NO: 1-62. Adicionalmente preferido es un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a ácidos en una secuencia de aminoácidos traducida de SEQ ID NO: 1-62. Adicionalmente preferido es un método para detectar en una muestra biológica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62, método que comprende un paso de comparar una secuencia de aminoácidos de al menos una molécula de polipéptido en la muestra con una secuencia seleccionada del grupo y determinar si la secuencia de la molécula de polipéptido en la muestra es al menos 90% idéntica a la secuencia de al menos 10 aminoácido contiguos. También preferido es el método anterior en donde el paso de comparar una secuencia de aminoácidos de al menos una molécula de polipéptido en la muestra con una secuencia seleccionada del grupo comprende determinar el grado de unión específica de polipéptidos en la muestra a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una escénica de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62. También preferido es el método anterior en donde el paso de comparar las secuencias se realiza al comparar la secuencia de aminoácidos determinada de una molécula de polipéptido en la muestra con la secuencia seleccionada del grupo . También se prefiere un método para identificar las especies, tipo de tejido o de célula de una muestra biológica, método que comprende un paso de detectar las moléculas de polipéptido en la muestra, si las hay, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62. También se prefiere el método anterior para identificar las especies, tipo de tejido o célula de una muestra biológica, el método que comprende un paso de detectar moléculas de polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en un panel al menos dos secuencias de aminoácidos, en donde al menos una secuencia en el panel es al menos 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 -^aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo anterior. También se prefiere un método para diagnosticar en un sujeto una condición patológica asociada con estructura o supresión o expresión anormal de un gen, método que comprende un paso de detectar una muestra biológica obtenida de las moléculas polipeptídicas sometidas que comprenden una secuencia de aminoácidos en un panel de al menos dos secuencias de aminoácidos, en donde al menos una secuencia del panel es al menos 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62. En cualquiera de estos métodos, el paso de detectar las moléculas polipeptídicas incluye usar un anticuerpo. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico, en done la secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido se ha optimizado para la expresión del polipéptido en un hospedador procariótico. También se prefiere una molécula aislada de ácido nucleico, en done la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62. Adicionalmente preferido es un método para elaborar un vector recombinante que comprende insertar cualquiera de las moléculas asiladas de ácido nucleico, anteriores, en un vector. También se prefiere el vector recombinante producido por este método. También se prefiere un método para elaborar o fabricar una célula hospedadora recombinante que comprende introducir el vector en una célula hospedadora, así como la célula hospedadora recombmante producida por este método. También preferido es un método para fabricar un polipéptido aislado que comprende cultivar esta célula hospedadora recombinante bajo condiciones tal que el polipéptido se exprese y recuperar el polipéptido. También preferido es el método para fabricar un polipéptido aislado, en donde la célula hospedadora recombinante es una célula eucariótica y el polipéptido es una porción segregada de una proteína segregada, humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos traducidas de SEQ ID NO: 1-62. El polipéptido aislado producido por este método también se prefiere. También se prefiere un método de tratamiento de un individuo en necesidad de un nivel incrementado de actividad de proteína segregada, método que comprende administrar a este individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un polipéptido aislado, por el nucleótido, o anticuerpo de la invención reivindicada efectivo para incrementar el nivel de actividad de proteína en el individuo. Habiendo descrito en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a manera de ilustración y no se proponen como limitantes.

EJEMPLO 1 Identificación y caracterización de polinucleótidos regulados por el tratamiento con DSS in vivo Para la inducción de colitis, se disolvió DSS (PM 40,000) en el agua para beber y se dio a ratones ad libitum durante un periodo de 7 días. El agua con DSS entonces se reemplazó con agua regular para beber. Distintas razas de ratones demuestran susceptibilidad diferencial a la colitis de DSS. Tres por ciento de DSS es suficiente para la inducción de la colitis aguda en ratones C57BL/6, en tanto que 5% de DSS se requiere para la inducción de colitis aguda en ratones BALB/c, 5 Para el propósito de este estudio, se recolectaron muestras de colon de cohortes de ratones C57BL/6 tratados con DSS al 3%. Se recolectaron tejidos en el día 0, día 4, día 8, día 12, un programa designado para abarcar el intervalo completo de inducción de daño 10 intestinal hasta la recuperación. El daño al tejido colónico es una marca de IBD. El modelo de ratón de la colitis inducida por DSS ocasiona un tejido colónico dañado y como tal es uno de los modelos más útiles para estudiar la IBD. 15 Se trataron ratones con DSS en su agua de beber como se describe anteriormente. A varios intervalos durante el tratamiento con DSS, los cohortes de ratones se sacrificaron y los colon se removieron por disección. El tejido colónico recientemente diseccionado se colocó 20 inmediatamente en amortiguado GT (isotiocionato de guanidmio 4.5M, citrato de sodio 50 mM, sarcosilo sódico al 0.5% p/v, 2-beta-mercaptoetanol al 2%) y se homogeneizó. Los lisados homogeneizados se agitaron brevemente para remover los desechos grandes antes de que se estratificaran 25 en un gradiente de CsCl. Se extrajo el ARN usando métodos Í_t__^fc»aaiJfcMBjÉhl'-»»-* - c ^ J .....i A?-i:*?* í . ..-y-^j--.- *• . .. . . . .*., .. ..... - * ?=a- - -< convencionales y se usó subsecuentemente para el análisis TOGA.

Características de colitis inducida por DSS La pérdida de peso es evidente en ratones que comienzan en el día 4. El análisis histológico del intestino revela la presencia de lesiones desiguales, tempranas identificables por la pérdida de células epiteliales y células caliciformes. Por el día 8, la pérdida de peso es bastante severa (aproximadamente 20% de reducción) y el ratón parece moribundo. Histológicamente, el epitelio del intestino está casi totalmente destruido en esta etapa. Existe evidencia de una gran infiltración de células inflamatorias, mezclada en la lámina propia y submucosa. El infiltrado de células inflamatorias parece estar compuesto principalmente de células T células B y granulocitos . Por el día 12, la ganancia de peso es evidente conforme los ratones se recuperan. En esta última etapa, la recuperación de las criptas y la regeneración epitelial proporciona evidencia histológica del comienzo del proceso de reparación. Se analizó el ARN aislado usando un método de identificación específica de la secuencia, simultánea de los ARNm conocidos como TOGA (Análisis de Expresión Génica Total) descrito en Sutcliffe, J.G., et al., Proc . Nati .

Acad. Sci U. S.A . Febrero 29 del 2000; 97 (5 ): 1976-1981 , solicitud internacional publicada PCT/US99/23655 , Patente de los Estados Unidos No. 5,459,037, Patente de los Estados Unidos No. 5,807,680 y Patente de los Estados Unidos No. 6,030,784, incorporada de este modo en la presente como referencia. De manera preferente, antes de la aplicación del método TOGA u otros métodos, el ARN aislado se enriqueció para formar una población de ARNm que contiene poli A de inicio por métodos conocidos en la técnica. En esta modalidad preferida, el método TOGA comprende adicionalmente un paso adicional de reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") realizado usando uno de los cuatro cebadores de PCR de 5 ' y las plantillas de .AD?c preparadas de una población de AR? complementario antisentido ( "ARNc " ) . Un paso final de PCR que usa uno de los 256 posibles cebadores de PCR de 5' y n cebador universal de PCR de 5' producidos como productos de PCR, fragmentos de AD?c que corresponden a una región 3 ' de la población de ARNm de inicio. Los productos de PCR producidos entonces se identificaron por a) la secuencia de al menos siete pares de base de 5 ' , de manera preferente la secuencia del fragmentos completo, y b) la longitud del fragmento. Estos dos parámetros, la longitud del fragmento y secuencia, se usaron para comparar los productos de PCR obtenidos a una base de datos de secuencias conocidas de polinucleótidos. *.,? ~t.c.*..,. **?,mM*t. *- .-- — s*.t ~~at * ****- - «- L¡ t*Aa^*t . i¡»¿S<-a..- El método produce Marcas de Secuencia Digitales (DST) , es decir, polinucleótidos que son marcas de secuencia expresadas (EST) del extremo 3' de los ARNm. Las DST que mostraron cambios en niveles relativos después del tratamiento con DSS se seleccionaron para estudio adicional. Las intensidades de la fluorescencia inducida con láser de los productos de PCR marcados se compararon a través de la muestra aislada a diferentes intervalos de tiempo después del tratamiento. En general, se generó el ADNc de doble hebra del ARN citoplasmático enriquecido con poly (A) extraído de las muestras de tejido de interés usando una muestra equimolar de los 48 cebadores de fijación 5 ' -biotinilados de un conjunto para iniciar al trascripción invertida. Este conjunto adecuado es G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-C-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N (SEQ ID NO: 63), donde V es A, C o G y N es A, C, G o T. Un miembro de esta mezcla de 48 cebadores de fijación inicia la síntesis en una posición fija en el extremo 3' de todas las copias de cada especie de ARNm en la muestra, definiendo de este modo un punto final 3' para cada especie, dando por resultado un ADNc de doble hebra, biotinilado . Cada muestra de ADNc de doble hebra, biotinilado se escindió con la endonucleasa de restricción Mspl, que reconoce la secuencia CCGG. Los fragmentos en 3 ' de ADNc entonces se aislaron por captura de los fragmentos de .ADNc biotinilados en un substrato revestido con estreptavidina. Los substratos adecuados revestidos con estreptavidina incluyen placas de microtítulo, tubos de PCR, cuentas de poliestireno, cuentas poliméricas paramagnéticas y partículas de vidrio, porosas, paramagnéticas. Un substrato preferido cargado con estreptavidina es una suspensión de cuentas poliméricas paramagnéticas (Dynal, Inc., Lake Success, NY) . Después del lavado, el substrato revestido con estreptavidina y los fragmentos de ADNc biotinilados, capturados, el producto del fragmento de ADNc se liberó por digestión con Notl, que escinde en la secuencia de 8-nucleótidos dentro de los cebadores de fijación pero raramente dentro de la porción derivada de ARNm de los ADNc. Los fragmentos 3'MspI-NotI, que son de longitud uniforme de cada especie de ARNm, se ligaron de forma direccional en el plásmido pBC SK+ escindido con Clal-, ?otl- (stratagene, La Jolla, CA) en una orientación antisentido con respecto al promotor T3 del vector, y el producto usado para transformar células SURE de Escherichia coli (Stratagene) . La ligación genera el sitio ?otl pero no el sitio MspI . Cada biblioteca contuvo en exceso de 5 x 105 a las 5 recombinantes para asegurar una alta probabilidad de que los extremos 3' de todos los ARNm con concentraciones de 0.001% ó mayor estuvieron múltiplemente representados. Las preparaciones de plásmido (Qiagen), se elaboraron de la biblioteca de ADNc de cada muestra ba o estudio. Una alícuota de cada biblioteca se digirió con MspI, que efectúa la linealización por escisión en varios sitios dentro del vector de origen en tanto que de a los insertos de ADNc de 3 ' y sus secuencias de flanqueo, incluyendo el promotor T3 , intacto. El producto se incubó con T3-ARN-polimerasa (MEGAscript kit, Ambion) para generar los trascriptos de ARNc antisentido de los insertos clonados que contienen secuencias de vector conocidas que unen a tope los sitios MspI y Notl de los ADNc originales. En esta etapa, cada una de las preparaciones de ARNc se procesó de una forma de tres pasos. En un paso, se convirtieron 250 ng de ARNc al ADNc de primera hebra usando el cebador 5 ' RT (A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G, (SEQ ID NO: 64) . En el paso dos, se usaron 400 pg del producto de ADNc como la plantilla de PCR en cuatro reacciones separadas con cada uno de los cuatro cebadores de PCR de 5 ' de la forma G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 65), cada uno en par con un cebador de PCR de 5' "universal" G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO: 66) . En el paso tres, el producto de cada sub-mezcla .4.» i._*-Í„fcA.. se dividió adicionalmente en 64 sub-mezclas (2 ng en 20 µl) para la segunda reacción de PCR, con 100 ng cada uno del cebador de PCR de 3' "universal" tratado con fluoresceína, el oligonucleótido (SEQ ID NO: 66) conjugado a 6-FAM y el cebador de PCR de 5' apropiado de la forma C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N- (SEQ ID NO : 67) , usando un programa que incluyó un paso de fijación a una temperatura X ligeramente por arriba de la Tm de cada cebador de PCR de 5 ' para reducir al mínimo la mala cebadura artifactual y promover la copia de alta fidelidad. Cada paso de reacción en cadena de la polimerasa se realizó en la presencia del anticuerpo TaqStart (Clonetech) . Los productos del paso final de reacción en cadena de la polimerasa para cada una de las muestras de tejido se resolvieron en una serie de geles de secuenciación de ADN de desnaturalización usando el secuenciador ABI Prizm 377 automatizado. Se recolectaron datos usando el paquete de cómputo GeneScan (ABI) y se normalizó para amplitud y migración. La ejecución completa de esta serie de reacciones generó 64 sub-mezclas de producto para cada una de las cuatro mezclas establecidas por los cebadores de PCR de 5 ' de la primera reacción de PCR. Para un total de 256 sub-mezclas de producto para el conjunto completo de cebador de PCR de 5' de la segunda reacción de PCR.

Las muestras de ARNm de cada punto de tiempo después del tratamiento de DSS como se describe anteriormente se analizaron. La Tabla 1 es un resumen de los niveles de expresión de los 414 ARNm determinados del AD?c. Estas moléculas de AD?c se identifican por sus direcciones digitales, es decir, una secuencia de nucleótídos del 5 '-término, parcial acoplada con el tramo de la molécula, así como la cantidad relativa de la molécula producida a diferentes intervalos de tiempo después del tratamiento. La secuencia de nucleótidos, parcial, del 5 '-término se determina por el sitio de reconocimiento para MspI y la secuencia de nucleótidos de las bases de análisis del cebador de PCR de 5' usado en el paso final de PCR. La longitud de dirección digital del fragmentos se determinó por interpolación en una curva normal y como tal, puede variar ± 1-2 p.b. de la longitud real como se determina al secuenciar. Por ejemplo, la entrada en la Tabla 1 que describe una molécula de AD? identificada por la dirección digital MspI AGTG 244, se caracteriza adicionalmente como que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del 5'-término de CGGAGTG y una longitud de dirección digital de 244 p.b. La molécula de AD? identificada como MspI AGTG 244 se describe adicionalmente como que se expresa a niveles crecientes en los días 0, 4 y 8 con una declinación moderada en el día 12. Sin embargo, los resultados de tratamiento en un patrón diferente de expresión de MspI AGTA 187, que declinan los días 4 y 8 del nivel relativamente alto vista en el día 0, pero que incrementa en el día 12. De manera similar, las otras 412 moléculas de ADN identificadas en la Tabla 1 por sus direcciones digitales de MspI se caracterizan adicionalmente por el patrón del nivel de expresión génica en los días 0, 4, 8 y 12 después del término del tratamiento con DSS. Muchos de los clones aislados se caracterizaron adicionalmente las Tablas 2 y 3. Sus secuencias de nucleótidos se proporcionan como SEQ ID NO: 1-62 en el listado de secuencias posterior. Los datos mostrados en la Figura 1 se generaron con un cebador de 5' -PCR (C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-C-G-C-G, SEQ ID NO: 68) apareado con el cebador de 3' "universal" (SEQ ID NO: 66) marcado con 6-carboxifluoresceína (6FAM, ABI) en el 5 '-término. Los productos de reacción de PCR se resolvieron por electroforesis en gel en geles de acrilamida al 4.5% y los datos de fluorescencia se adquirieron en secuenciadores automatizados ABI377. Se analizaron los datos usando el programa GeneScan (Perkin-Elmer) . Los resultados del análisis TOGA que usa un cebador de PCR de 5' con las bases de análisis CGCG (SEQ ID NO: 68) se muestran en la Figura 1, que presenta los resultados del análisis TOGA que usa un cebador de PCR de 5' con las bases de análisis CGCG, que muestra los productos de PCR producidos del ARNm extraído de (paneles superior o al fondo) colons aislados de ratones 0 (Figura ÍA) , 4 (Figura IB), 8 (Figura 1C) ó 12 días (Figura ID) después de un transcurso de siete días de tratamiento con DSS. La línea de índice vertical indica un producto de PCR de aproximadamente 458 p.b. que está presente en el día 0, se redujo en el día 4, se incrementó mucho en el día 8 y cuya expresión disminuye relativamente pero es aún elevada en el día 12. Algunos productos, que también se representan de forma diferencial, parecen migrar en las posiciones que sugieren que los productos son nuevos en base a la comparación a datos extraídos del GenBank. En estos casos, se aisló el producto de PCR, se clonó en un vector TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron en ambas hebras. Los ejemplos se encuentran en la Tabla 4, posterior. A fin de verificar que los clones aislados son del mismo pico, se diseñaron cebadores de PCR en base a la secuencia determinada y se realizó la PCR usando el AD?c producido en la primera reacción de PCR como substrato. Por ejemplo, para el producto de 458 p.b. descrito anteriormente, se sintetizaron oligonucleótidos usando el cebador de PCR de S&A.ÁMÍ. .. 1 i* 3 ' universal y un cebador de PCR de 5 ' que corresponde al cebador de PCR de 5 ' en el segundo paso de PCR extendido en el extremo 3 ' con nucleótidos adicionales de la secuencia 3' de clon a las bases de análisis (en este caso, CGCG) . 5 Este cebador de PCR de 5' extendido tiene la secuencia: GATCGAATCC GGCGCGCACG GGGACCAGAC (SEQ ID NO : 78) . Los productos se separaron por electroforesis y la longitud del clon se comparó a la longitud del producto de PCR original como se muestra en la Figura 2. La Figura 10 2A muestra la longitud (como posiciones pico) del producto de PCR derivado como se describe anteriormente. La Figura 2B muestra los productos de PCR producidos usando los cebadores de PCR originales, SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 66 (comparar a Figura ÍA) . En la Figura 2C, las trazas de los 15 paneles superior e intermedio se traslapan, demostrando que el producto de PCR que usa la secuencia del clon aislado es la misma longitud como el producto de PCR original. Se usó el mismo procedimiento para verificar las correspondencias candidatas a las entradas de la base de 20 datos. Los resultados se muestran en la Tabla 4, posterior. En cada caso, se sintetizaron oligonucleótidos usando el cebador de PCR de 3 ' universal y un cebador de PCR de 5 ' que corresponde al cebador de PCR de 5 ' en el segundo paso de PCR extendido al extremo 3 ' con nucleótidos adicionales 25 de las secuencias adyacentes a los sitios MspI terminales &amßc *¡ia¡ S&k&?á 2i, . ,- ^ j.t,t, u? .. . «¡¡^J**. - > . -*». -.—.» ..-..~.. . .- - - .-» . *****„*- ,. * _«-»> . y»^. ->^>.» — .»-».%. - »Á¿ -»M en las secuencias de GenBank correspondientes, identificadas. En tres casos (IMX2_33, SEQ ID NO: 21, IMX2_34 SEQ ID NO : 61 y IMX2_70, SEQ ID NO: 62) la secuencia de DST listada se obtuvo de la secuencia de correspondencia de la base de datos verificada en el GenBank . La Figura 3 es una representación gráfica de los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_46, SEQ ID NO: 10, donde un gen de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las cuatro muestras experimentales (0, 4, 8 ó 12 días pos-tratamiento) así como las normas de tamaño se transfirieron después de la electroforesis y se sondearon con IMX2_46 radiomarcado, SEQ ID ?O : 10, se formaron en imagen usando un equipo de fosformación de imagen y se cuantificaron. Los resultados cuantitativos muestran los niveles de expresión relativos del trascripto de 1.6 kb que fueron: 0 días, 64; 4 días, 53; 8 días 223; y 12 días 269. La cantidad de ARN cargado en el gel se determinó al sondear para ciclofilina ("cyc"). «y*-, £.«-..,-* l___-__,.a..¡-.JAAÁ--t . ...-anisa*. «¡» _A.nAy A*l *^^^^^^*S^^^^^¡''a *&» fc .rt- &*& • ES.». A «jtafof'* •* ****** - "áa¿ ¿f. afe^¿ fe .^ Jlfci 2 jn?- .

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EST = Marca de Secuencia Expresada, NA = No Aplicable, R = Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Invertida, N = Análisis de Transferencia Northern, * Cantidad Relativa de DST = Cantidad Relativa de DST para transferencias Northern se han corregido para el fondo y normalizado a la señal de hibridación de ciclofilina. Los valores se obtuvieron al esconder la transferencia Northern a una detección con fosfoformación de imagen y se cuanti ficaron usando un equipo de fosíoformación de imagen SI .

EST = Marca de Secuencia Expresada, N/A = No Aplicable EST = Marca de Secuencia Expresada EST = Marca de Secuencia Expresada EJEMPLO 2 Validación por RT-PCR Se realizó la validación por RT-PCR de los DST clonados, y los resultados se presentan en la Tabla 2. La cantidad de inicio de la plantilla se eligió en base a una curva de control que se generó para definir de forma exacta el intervalo lineal de aplicación para el DST clonado, dado. En base a la intensidad del pico clonado del panel TOGAMR, se eligieron las siguientes cantidades de la plantilla : Intensidad pico de Ba a [ADNc] Alta [ADNc] TOGA 0-400 2000 pg 5000 pg 300-1000 400 pg 2000 pg > 1000 50 pg 250 pg Los cebadores de PCR usados para la validación de los DST clonados se enlistan en la Tabla 5. Las mezclas de reacción duplicadas se configuraron usando la concentración baja y alta apropiada de la plantilla de ADNc elegida de la muestra de punto de tiempo que muestra la señal TOGAMR más fuerte. Las mezclas de reacción se ciclaron durante 23, 26, 29, 32, 35 y 38 ciclos. Los productos de amplificación i A . A A A í -jt__a__ - y-—^-.»^ . -^m, ~»t> -* . -- *- *- -.. **»-&. **-. —. «. -*»«= • s__¡_—« - »*»*. . *-*• resultantes de las reacciones duplicadas se cuantificaron y graficaron contra el número de ciclo para generar una curva normal. De estos datos, el número de ciclo y la combinación de concentración de ADNc que produjo niveles aceptables del producto de PCR dentro del intervalo lineal de amplificación se eligieron para la validación por RT-PCR a través de los varios puntos de tiempo. La validación por RT-PCR consistió de la configuración de reacciones triplicadas que usan la concentración elegida de ADNc ciclado al número de ciclo definido. Por ejemplo, los datos en la Tabla 2 para IMX2_55 (SEQ ID NO: 13) se generaron usando 50 pg de plantilla de ADNc y 29 ciclos. Un par de cebadores, de control, interno se amplificaron bajo las mismas condiciones también se realizó para proporcionar la base para la normalización de cualquier diferencia entre las plantillas de ADNc.

EJEMPLO 3 Análisis por RT-PCR Usando Fluorimetría Se validaron dos DST usando un protocolo alternativo. Los cebadores usados para RT-PCR se listan en la Tabla 5. Para cada DST examinado, se determinaron la temperatura de fijación óptima y las condiciones del reactivo para el conjunto correspondiente de cebadores (ver Tabla 5) en base a los resultados de un experimento preliminar. En ocho reacciones separadas, cada conjunto de cebadores se ensayó para encontrar las condiciones óptimas al ajustar los siguientes cuatro parámetros: concentración del cebador, concentración de dNTP, concentración de MgCl2 y Taq-polimerasa . Una vez que se determinaron las condiciones óptimas, cada DST se corrió en múltiples reacciones simultáneas en duplicado que usualmente incluyeron al menos cuatro diluciones de la plantilla, más reacciones de control que carecen de la plantilla, y seis puntos de datos secuénciales para los números de ciclos. Se realizaron reacciones usando PCR "Hot Start" con el sistema de anticuerpos Clontech TaqStart (Cat. #5400-1) . Cada reacción contuvo 1 µl de la dilución de la biblioteca de .ADNc como plantilla, cantidades determinadas de AmpliTaq ADN-polimerasa (cat #N808-0156) , MgCl2, dNTP (GibcoBRL cat #10297-018), cebador y el anticuerpo Clontech TaqStart en un volumen de reacción de 20 µl usando amortiguador II 10X Taq (sin MgCl2) . Típicamente, una mezcla principal que contiene todos los componentes excepto la plantilla se preparó y se 'tomó en alícuotas. Luego se adicionaron varias plantillas a estas muestras de mezcla principal y se distribuyeron subsecuentemente volúmenes de 20 µl en tubos de reacción individuales. Durante la corrida de PCR, los tubos se removieron secuencialmente en un programa predeterminado a fin de cuantificar la expresión del DST objetivo sobre una "ventana" de ciclos. Después de la amplificación, las muestras se cuantificaron vía fluorimetría. Se realizó la PCR a temperaturas de fijación aproximadamente 5 grados por arriba de la temperatura de fusión más baja de cada par de cebadores usando el siguiente programa: 1) 95 grados Celsius, 3 minutos; 2) 95 grados Celsius, 30 segundos; 3) TM+5 grados Celsius, 30 segundo, 4) 72 grados Celsius, durante un tiempo dependiente de la longitud objetivo en 16 pb/segundo; 5) repetir paso 2-4, 33 ciclos más; 6) 72 grados Celsius, 3 minutos; 7) 14 grados Celsius, por siempre. Después del ciclado de temperatura, se adicionaron 2 µl de la reacción de PCR a 140 µl de una dilución 1:280 de PicoGreen (Molecular Probes cat. #P-11495 (10x100 µl)) en TE, pH 7.5 en una placa de microtítulo Costar UV de 96 cavidades (Fisher cat. 07-200623). Las muestras se mezclaron suavemente durante 1.5 minutos y se dejaron llegar al equilibrio a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos. La concentración de los productos de PCR se cuantificó por fluorimetría usando un lector de placa de varias cavidades, PerSeptive Biosystems CytoFluor series 4000. La fluorescencia de fondo se determinó al usar muestras de control en duplicado que se sometieron a ciclos con todos los componentes de reacción excepto la plantilla. El valor promedio de estas muestras de control de fondo, en duplicado, sustrajo de los valores experimentales correspondientes antes de analizar los resultados. La sensibilidad del ensayo de ADNds PicoGreen se reporta que es de 250 pg/ml (50 pg de ADNds en un volumen de ensayo de 200 µl) usando un lector de microplaca de fluorescencia tal como se usó en estas mediciones . Los resultados de la RT-PCR cuantificada de IMX2_48 para una dilución 1:2000 de la biblioteca se muestran en la Figura 4 (en unidades de fluorescencia arbitraria) y en la Tabla 6 (normalizados al valor de control en cada punto de tiempo) . Los resultados de la RT-PCR cuantificada de IMX2_74 para una dilución 1:500 de la biblioteca se muestran en la Figura 5 (en unidades de fluorescencia arbitraria) y en la Tabla 6 (normalizada al valor de control en cada punto de tiempo) .

L A ,Í»fc-i.. Á ^i^a. fc EJEMPLO 74 Clon de secuencia extendido para IMX2__4 El clon se aisló de una biblioteca de colon con DSS de D4/D8 usando el procedimiento de Clonecapture de Edge Biosystems. La biblioteca se construyó por Edge Biosystems por Immunex del ARN aislado de los colons inflamados D4 y D8 de ratones C57BL/6 tratados con DSS. El clon es un vector de borde pEAK12. IMX2_04 DST (SEQ ID NO: 1) corresponde la secuencia extendida para IMX2_04 desde la base 688 a 957 (SEQ ID NO: 2) (Ver Tabla 7, anterior). Hay un cuadro de lectura abierto iniciando la base 1 que puede modificar para un producto génico parcial. La secuencia de aminoácidos de la proteína parcial codificada se da en SEQ ID NO: 129. Cuando la secuencia extendida se comparó a la base de datos de NCBI nr, w/BLAST, los segmentos lineales de la secuencia de nucleótidos para las bases 1-936 muestran aproximadamente 70% de identidad con segmentos de la secuencia de nucleótidos de un clon de cósmido de cromosoma 19, AC007565.1 (ver Tabla 7, anterior). Esto indica que el homólogo humano de IMX2_4 se encuentra, al menos en parte, en el cósmido. Sin embargo, varios exones previstos en el cósmido (por el programa GRAIL o por alguna homología a los EST de ratón) se saltan por la secuencia lineal de IMX2-4 ElO. seq. Parece que un exon previsto, aún brincado, es real ya que se encuentra una correspondencia perfecta en la base de datos DERWENT. La entrada Derwent es para una molécula "secreta" con el fragmento de proteína en la entrada de proteína Derwent que es un péptido de señal que contiene la secuencia de aminoácidos no encontrada en el cósmido (o la entrada Derwent de nucleótidos) . Sin embargo, la entrada de nucleótido Derwent también tiene una correspondiente a otro segmento 5' más del cósmido que no muestra una correspondencia con el extremo 5' de IMX2-4-E10. seq a un nivel de identidad 75%. Estas formas pueden representar diferentes variantes de empalme de una proteína segregada.

EJEMPLO 5 Clon de secuencia extendida para IMX2_36 La información de secuencia de IMX2_36.EXT se derivó del clon IMX2_36pT7T3-2. seq que es un clon de EST derivado del clon proximal de ratón FVB/N obtenido del consorcio IMAGE. El número de acceso para el EST es AA529850, y el id del clon es IMAGE : 921608. El EST está en el vector pT7T3. En IMX2_36 DST (SEQ ID NO : 6) corresponde con la secuencia extendida para IMX2_36.EXT (SEQ ID NO : 7) desde la base 293 a 427 (ver Tabla 7, anterior) . La carga ,. .. . del EST al GenBank da aciertos al KAR (receptor de activación de aniquilación) de ratón" y "proteína DAP12" (ver Tabla 7, anterior).

EJEMPLO 6 Clon de secuencia extendida para IMX2_43 El clon se aisló a partir de una biblioteca de colon con DSS de D4/D8 usando el procedimiento de Clonecapture de Edge Biosystems. La biblioteca se construyó por Edge Biosystems para Immunex del ARN aislado de colons inflamados D4 y D8 mezclados de ratones C57BL/6 tratados con DSS. El clon está en el vector de borde pEAK12. El IMX2_43 DST (SEQ ID NO: 8) corresponde a la secuencia extendida de IMX2_43 (SEQ ID NO : 9) desde la base 1079 a 1298 (ver Tabla 7, anterior).

EJEMPLO 7 Clon de secuencia extendida para IMX2_46 La información de la secuencia IMX2_46.EXT se derivó de los dos clones IMX2_46pT7T3-6. seq y IMX2_46pT7T3- 7. seq, que son clones EST en el vector pT7T3 que se obtuvieron del consorcio IMAGE. El IMX2_46pT7T3-6. seq (número de acceso AA290194, id de clon IMAGE : 750847 ) se derivó del nodulo linfático de ratones C57BL/6. El IMX2_46pT7T3-7.seq (número de acceso AA174968, id de clon IMAGE: 617717) se derivó del vaso de ratones C57BL/6. El IMX2_46 DST (SEQ ID NO: 10) se alinea con la secuencia extendida IMX2_46.EXT (SEQ ID NO: 11) desde la base 157 a 561 (ver Tabla 7, anterior). La carta de los EST contra el GenBank da aciertos a TOSO: regulador humano de apóptosis inducida por fas (ver Tabla 7, anterior.

EJEMPLO 8 Clon de secuencia extendida para IMX2_55 La información de secuencia extendida IMX2_55.EXT se derivó de los dos clones IMX2_55pT7T3-8. seq y IMX2_55pT7T3-24. seq, que son clones EST que se obtuvieron del consorcio IMAGE. El IMX2_55pT7T3-8. seq (número de acceso AA823573, id de clon IMGE: 1079189 ) se derivó del colon de ratones irradiados con FVB. El IMX2_55pT7T3-24. seq (número de acceso AAA690372, id de clon IMAGE : 1164692 ) se derivó del colon próximo de ratón de FVB. El número de acceso para el EST para IMX2_55pT7T3-8.seq es AA823573, y el id de clon es IMAGE: 1079189. El número de acceso para el EST para IMX2_55pT7T3-24.seq es AA690372, y el id de clon es IMAGE: 1164692. Ambos EST están en el vector pT7T3 y se obtienen del consorcio IMAGE. El clon IMX2_55pT7T3-8. seq se derivó del clon de ratón irradiado con FVB y el clon de IMX2_55pT7T3-24. seq se derivó del colon próximo de ratón de FVB. El IMX2_55 DST (SEQ ID NO: 13) alinea las bases 322 a 744 con la secuencia extendida IMX2_55.EST (SEQ ID NO: 14) (ver Tabla 7, anterior). La' carga de la secuencia IMX2_55 extendida al GenBank describe los EST con homología a la proteína reactiva C (ver Tabla 7, anterior).

EJEMPLO 9 Clon de secuencia extendida para IMX2_57 Se diseñaron cebadores de PCR para IMX2_57 en base a la información de secuencia obtenida de las secuencias de dos clones de EST que no están comercialmente disponibles. Los clones de EST usados para derivar la información de secuencia fueron (1) un EST con número de acceso AAA240177 e id de clon IMAGE: 679264 derivado del hígado de ratón y (2) un EST con número de acceso AV005227 e id de clon 0910001G08 derivado del vaso de C57BL/6. Los cebadores usados son el cebador directo IMX2_57-FP y el cebador invertido IMX2_57-RP que cebó la secuencia obtenida del montaje electrónico del DST y el EST AV005227. La reacción de PCR se realizó en un ADNc derivado de ARN preparado del colon de ratón C57BL/6. El producto de PCR se clonó en el vector pGEM dando por resultado el clon IMX2_57PCR1. El IMX2_57DST. (SEQ ID NO: 15) se alinea . ÍJ con las bases 283 a 408 de la secuencia extendida IMX2_57.EXT (SEQ ID NO: 16) (ver Tabla 7, anterior). La carga de los E?T ensamblados al GenBank da aciertos a "ARNm tipo quimiotripsina human (CTRL)", y "subunidad tipo proteosoma humana (MECL-1), proteasa tipo quimiotripsina (CTRL.-l) y último exon de proteína-serina- cinasa (PSK-H1) (ver Tabla 7, anterior).

EJEMPLO 10 Clon de secuencia extendida para IMX2_61 La información de secuencia extendida de IMX2_61 se derivó del clon de EST IMX2_61pBS-47. seq, un clon de EST que se obtuvo del consorcio IMAGE. El número de acceso para el EST para IMX2_61pBS-47. seq es AA981092, y el ID de clon es IMAGE : 1279287. El clon IMX2_61pBS-47. seq se derivó de células de macrófago de ratón WEH13. EL IMX2_61 DST (SEQ ID NO: 17) se alinea con las bases 204 a 425 de la secuencia extendida IMX2_61 (SEQ ID NO: 18) (ver Tabla 7, anterior) .

EJEMPLO 11 Clon de secuencia extendida para IMX2_17 : Receptor de alfa-eliminador de cripta-ductina (CRP-ductina) El análisis TOGA indicó que IMX2_17 (SEQ ID NO: 3) corresponde al ARNm de CRP-ductina-alfa de Mus musculus , • ¿tká Má ¿a* „*. • número de acceso U37438 (Tabla 3) . La CRP-ductina localiza a la porción apical de las células de cripta en el intestino delgado. En el colon, se ve predominantemente en las células epiteliales de superficie (EC) . También se ve en la porción apical de los conductos hepáticos más grandes y pancreáticos de forro EC . La secuencia de CRP-ductina- alfa predice una proteína de mosaico con una corta región citoplasmática, un dominio trasmembrana y una gran región extracelular compuesta de muchas repeticiones. La región extracelular contiene 21 sitios potenciales de N- glicosilación en la mitad C-terminal de la proteína. Hay también dos sitios de fosforilación potenciales en el dominio citoplasmático . El cebador directo mCRP.5179-FP y el cebador invertido mCRP.6106-RP se usaron para someter a PCR un producto de 936 pb de una plantilla de ADNc derivada de ARN aislado del colon de C57BL/6. El producto de PCR se subclonó en el vector pGEM y la secuencia se verificó antes de que se use como una sonda para el análisis de transferencia Northern. La Figura 6 representa los resultados del análisis de transferencia Northern del cloa IMX2_17, SEQ ID NO: 3, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y normas de tamaño transfirió después de la electroforesis, t, JL* A •». ?. ??i. í .', ..AaM-j.- JfcJS. t .fe i se sondeó con una zona marcada que corresponde a las bases 5179-6106 de U37438, se formó en imagen usando un equipo de fosformación de imagen y se cuantificó. La Figura 6A muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis con DSS 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis con aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras del intestino grueso de ratones con eliminación de mdr de FVB sin colitis y ratones con eliminación de mdr con colitis. La Figura 6B muestra los resultados de ratones Balb/c con colitis de DSS 0, 4 8, ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c tratados con DSS al 0%, 5% y 8%, y ratones Balb/c con ileítis de aCD3 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento. El tamaño previsto del trascripto para IMX2_17 CRP-ductina es de 6.6 Kb; el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de aproximadamente 6.5 Kb. Se realizaron las transferencias Northern en las transferencias de ARNm de varios modelos de IBD. El análisis de las muestras de ratones C57BL/6 con colitis de DSS mostró altos niveles de expresión constitutiva en el intestino grueso, con un máximo del día 8 de la colitis de DSS (Figura 6A) , consistente con los resultados del análisis inicial de TOGA (Tabla 1) . El análisis de muestras de ratones Balb/c con colitis de DSS mostró resultados similares (Figura 6B) .

El análisis de muestras de ratones C57BL/6 con ileítis de aCD3 mostró bajos niveles de expresión constitutiva en el intestino delgado lo que se incrementa tempranamente en la inflamación (Figura 6A) que alcanza un 5 máximo a las seis horas y declina posteriormente. El análisis de las muestras de ratones Balb/c con ileítis de aCD3 mostró resultados similares, aunque menos intensos (Figura 6B) . La expresión constitutiva se vio en muestras de 10 intestino grueso de FVB (Figura 6A) . La expresión incrementada en ratones con eliminación de mdr, saludables sin signos de colitis, con poco incremento adicional en la expresión de los ratones con eliminación de mdr con colitis ulcerativa (Figura 6B) . 15 La expresión mostrada en la transferencia Northern de la Figura 6 se cuantificó y normalizó a la cantidad de G3PDH en cada celda. Los resultados normalizados se muestran en la Tabla 8, posterior.

TABLA 8 A t« EJEMPLO 12 Clon de secuencia extendida para IMX2_22 Progenitor hematopoyético-cinasa HPKl de IMX2_22 El análisis TOGA indicó que IMX2_22 corresponde 5 al ARNm de Mus musculus para serina/treonina-cinasa, número de acceso Y09010 (Tabla 3). HPKl es una proteína-cinasa hematopoyética que activa la ruta SAPK/JNK. El cebador directo mHPKl .1640-FP y el cebador invertido nríHPKl .2420-RP se usaron para someter a PCR un 10 producto de 780 pb de una muestra de ADNc se derivó de ARN aislado del colon de C57BL/6. El producto de PCR se subclonó en el vector pGEM y la secuencia se verificó antes de que se usara como una sonda para análisis de transferencia Northern. El tamaño previsto del trascripto 15 para IMX2_22 HPKl fue de 2.7 Kb y los tamaños publicados de trascripto son de 2.8 Kb y 3.6 Kb. El tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de 2.8 Kb. La Figura 7 presenta los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_22, SEQ ID NO : 4, 20 donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y las normas de tamaño se gráfico después de la electroforesis, se sondeó con una sonda marcada que corresponde a las bases 1640-2420 de Y09010, se formó una imagen usando un equipo de 25 fosformación de imagen y se cuantificó. La Figura 7A £¿smíSmÍÍ?'Wir'"' ,.ÍJ*~¿.*...*.*-.* *<¡Aag?.--....A^J** muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis por DSS a los 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, los ratones C57BL/6 con ileítis de CD3 a las 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras del intestino grueso de ratones de eliminación de mdr de FVB, ratones de eliminación de mdr con colitis y vaso de C57BL/6. La Figura 7B muestra los resultados de los ratones Babl/c con colitis por DSS a los 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c con ileítis por aCD3 a las 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento y muestras de tejido linfoide anormal de C57BL/6 (MLM, PP, vaso y timo) . Se realizaron las transferencias Northern en muestras de ARNm de varios modelos de IBD. El análisis de muestras de los ratones C57BL/6 con colitis por DSS mostró bajos niveles de expresión constitutiva en el intestino grueso, máximo en el día 12 de la colitis por DSS (Figura 7A) , no muy consistente con los resultados del análisis TOGA inicial (Tabla 1) . El análisis de las muestras de los ratones Balb/c con colitis por DSS mostró resultados similares con un máximo en el día 8 (Figura 7B) . El análisis de las muestras de los ratones C57BL/6 con ileítis por CD3 mostró expresión constitutiva en el intestino delgado que se incrementa a las seis horas (Figura 7A) . El análisis de las muestras de los ratones Balb/c con ileítis por aCD3 mostró resultados similares (Figura 7B) . La expresión incrementada en ratones de eliminación de mdr con colitis activa (Figura 7A) , en contraste con poco cambio en el análisis TOGA correspondiente (datos no mostrados) . Se encontró una fuerte expresión en tejidos linfoides en MLN, PP, timo, especialmente el vaso (Figuras 7A y B) . La expresión mostrada de la transferencia Northern de la Figura 7 se cuantificó y normalizó a la cantidad de G3PDH. Los resultados normalizados se muestran en la Tabla 9, posterior TABLA 9 EJEMPLO 13 Clon de secuencia extendida para IMX2 28 Regulado descendentemente en la proteína de adenoma (DRA) El análisis TOGA indicó que IMX2_28 corresponde a DRA de Mus musculus regulada descendentemente en la proteína de genoma, número de acceso AF136751 (Tabla 3) . El cebador directo Dra. 1551-FP y el cebador invertido Dra. 2390-RP se usaron para someter a PCR un producto de 840 pb de una plantilla de ADNc derivada del ARN aislado del colon C57BL/6. El producto de PCR se subclonó en el vector pGEM y se verificó en secuencia antes de que se usara como una sonda para el análisis de transferencia Northern. El tamaño de trascripto prescrito para IMX2_28 DRA es de 2.6 Kb, el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de aproximadamente 3 Kb. La Figura 8 presenta los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_28, SEQ ID NO : 5, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y normas de tamaño se transfiere después de la electroforesis, se sondea con una sonda marcada que corresponde a las bases 1551-2390 de AF136751, se forma en imágenes usando un equipo de fosformación de imágenes y se cuantifica. La Figura 8A muestra los resultados de los ratones C57BL/6 con colitis l A. MC l. l.Ít 4¡?m >t MZ fc ,¿- . V *~ » - * * ~- - -> -»>-J % — *)¡B . t J f-M por DSS a los 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis por aCD3 a 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras del intestino grueso de ratones de eliminación de mdr, FVB sin colitis y 5 ratones de eliminación de mdr con colitis. La Figura 8B muestra los resultados de los ratones Balb/c con colitis por DSS a los 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, los ratones Balb/c tratados con DSS al 0%, 5% y 8%, y ratones Balb/c con ileítis por CD3 a 0, 6, 30 ó 72 horas 10 después del tratamiento. Las transferencias Northern se realizaron en muestras de ARNm para varios modelos de IBD. El análisis de las muestras de los ratones C57BL/6 con colitis por DSS mostró altos niveles de expresión constitutiva en el 15 intestino grueso que disminuyen con la inflamación, mínimo en el día 8 de la colitis por DSS (Figura 8A) , consistente con los resultados del análisis TOGA inicial (Tabla 1) . El análisis de las muestras de los ratones Balb/c con colitis por DSS mostró el mismo patrón (Figura 8B) . 20 El análisis de las muestras de ratones C57BL/6 con la íleítis por aCD3 mostró niveles de expresión constitutiva en el intestino delgado menores que los vistos en el intestino grueso con colitis por DSS. La expresión disminuye con la inflamación rápidamente por 6 horas y 25 permanece baja (Figura 8A) . El análisis de las muestras de ratones Balb/c con ileítis por aCD3 mostró el mismo patrón (Figura 8B) . El análisis TOGA en este modelo (datos no mostrados) no muestra un pico correspondiente. Se ve la expresión constitutiva en muestras de intestino grueso de FVB (Figura 8A) . La expresión constitutiva se vio en ratones de eliminación de mdr saludables sin signos de colitis, con una disminución dramática en la expresión vista en ratones con eliminación de mdr con colitis activa (Figura 8A) . El análisis TOGA en este modelo (datos no mostrados) no muestra un pico correspondiente . La expresión mostrada en la transferencia Northern de la Figura 8 se cuantificó y normalizó a la cantidad de G3PDH en cada senda. Los resultados normalizados se muestran en la Tabla 10, posterior.

TABLA 10 EJEMPLO 14 Clon de subsecuencia extendida para IMX2_33 ?'?. íf ,?- si .¿.2% . ¡r,¡At.í . * ... ;*i- -.

Inhibidor de leucocito-proteasa secretorio (SLPI) El análisis TOGA indicó que IMX2_33 corresponde al inhibidor de leucocito-proteasa secretorio de Mus musculus, número de acceso U73004 (Tabla 3). El inhibidor del leucocito-proteasa secretorio es una célula epitelial y inhibidor derivado de macrófagos de las leucocito-serina- proteasas . La expresión de SLPI se suprime por gamma-IFN. SLPI es un producto de fagocitos suprecible de gamma-IFN inducido por LPS que sirve para inhibir las respuestas de LPS. El cebador directo mSLPI.447-FP y el cebador invertido SLPI .800-RP se usaron para someter a PCR un producto de 350 pb de una plantilla de ADNc se derivó a partir del ARN aislado del colon de C57BL/6. El producto de PCR se subclonó en el vector pGEM y la secuencia se verificó antes de que se use como una sonda para el análisis de transferencia Northern. La sonda usada corresponde a las bases 447-800 de U73004. El tamaño previsto del trascripto para IMX2_33 SLPI es de 1.1 Kb; el tamaño real del trascripto encontrado en este estudio fue de 1.1 Kb. La Figura 9 presenta los resultados del análisis de transferencia Northern del clon IMX2_33, SEQ ID NO: 21, donde un gel de agarosa que contiene ARNm enriquecido con poli A de las muestras experimentales y las normas de tamaño se transfirió después de la electroforesis, se sondeó, se convirtió en imagen usando un equipo de fosformación de imágenes y se cuantificó. La Figura 9A muestra los resultados de ratones C57BL/6 con colitis por 5 DSS a los 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones C57BL/6 con ileítis por aCD3 a 0, 6, 30 ó 72 horas después del tratamiento, así como muestras de los intestino grueso de ratones de eliminación de mdr de FVB sin colitis y ratones de eliminación de mdr con colitis. La Figura 9B 10 muestra los resultados de los ratones Balb/c con colitis pos DSS a los 0, 4, 8 ó 12 días después del tratamiento, ratones Balb/c tratados con DSS al 0%, 5% y 8%, y ratones Balb/c con ileítis por aCD3 (0, 6, 30, 72 horas) . Se realizaron transferencia Northern en muestras 15 de ARNm en varios modelos de IBD. El análisis de las muestras de los ratones C57BL/6 con colitis por DSS mostró una expresión constitutiva mínima en el intestino grueso que se incrementa significativamente con la inflamación, es máxima en el día 8 de la colitis por DSS y aún permanece 20 alta en el día 12 (Figura 9A) , consistente con los resultados del análisis TOGA inicial (Tabla 1). El análisis de las muestras de los ratones Balb/c con colitis por DSS mostró el mismo patrón (Figura 9B) . El análisis de las muestras de los ratones 25 C57BL/6 con ileítis por sCD3 mostró niveles bajos a -- <kg* moderados de expresión constitutiva en el intestino delgado con menor regulación que la vista en el intestino grueso con colitis por DSS. Hubo un incremento significativo con la inflamación, que es máximo a las 30 horas, entonces disminuye (Figura 9A) . El análisis de las muestras de los ratones Balb/c con ileítis por aCD3 mostró el mismo patrón (Figura 9B) . El patrón fue consistente con aquel visto en el análisis TOGA en este modelo (datos no mostrados) . La expresión constitutiva mínima se vio en ratones con eliminación de mdr saludables sin signos' de colitis, con un incremento en la expresión vista de ratones de eliminación de mdr con colitis ulcerativa (Figura 9A) . El patrón fue consistente con aquel visto en el análisis TOGA en este modelo (datos no mostrados) . La expresión mostrada en la transferencia Northern de la Figura 9 se cuantificó y normalizó a la cantidad de G3PDH en cada senda. Los resultados normalizados se muestran en la Tabla 11, posterior.

TABLA 11 Cuantificación de la Tabla 9 ití,- EJEMPLO 15 Clon de secuencia extendida para IMX2_48 Proteína inflamatoria 2 de macrófago de IMX2_48 (MIP2) El análisis TOGA indicó que IMX2_48 corresponde a la proteína inflamatoria 2 de macrófago, MIP-2, de Mus musculus , número de acceso X53798 (Tabla 3) . El cebador directo MIP2.61-FP y el cebador invertido MIP2.345-RP se usaron para someter a PCR un producto de 284 pb de una plantilla de ADNc derivada de ARN aislado del colon C57BL/6. El producto de PCR se subclonó en el vector pGEM y la secuencia se verificó. El tamaño prescrito del trascripto para IMX2_48 MIP2 es de 1.1 Kb. jj*, Al ?¿tÍI? tAM?M Z?¿*.t .»>-., «.— - • , ~ J» - -»- *- ' - .*- :*. «» - - - -i J»¿ 4.? LISTADO DE SECUENCIAS < 110 > DIGITAL GENE TECHNOLOGIES , INC . < 12 o > Expresión Génica Modulada en Inflamación Gastrointestinal <130> 99, 104-A <140> PCT/USOO/15973 <141> 2000-06-09 <150> US 60/138,487 <151> 1999-06-10 <160 129 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 270 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 1 cggacaccca gtcaggcaca agaggcccac accccctaac tcctttccag cgcctcccca 60 acggccactt acttccagac tgcgtgtttt atttttagga gagatgtgta CaCCttttgt 120 egctgetgtc gtttctagaC agggtcCcac tgcgtagccc cggcttttct ggaactcact 180 gtgtagagca agccagcctc aaactcatag atccacctgc ctctgcctcc agatcgccag 240 aatcaaagtt actgccacaa cacccaaaaa 270 <210> 2 <211> 964 <212 > ADN <213> Mua musculus <400> 2 ggctggcagg gagccccaga tccccgtggc ctcggccagc tttcccagcc ctacatggga 60 ggagagatgc cctggaccat cctgctgttt gcacctgtcc ccacctggat cttggcactc 120 Cccctgagcc Cggctggagc cgtgctgctc ccagggctgg tggccatcac agtgccggcg 180 agaaaagcca aagccaaaaa c cacagaag cagagagagc gtgaatcctg ctgggctcag 240 atcaacttca ccaatacaga catgtccttt gataactctc tgtttgctat ctccacgaaa 300 atgactcagg aagactcagc ggcaacccta gactcagggc cccggaagag gcccacctcc 360 gcaccacccc ctccggagcc ccctgagttc agcactttcc gggcctgcca gtgaggctga 420 cgaacgagga ccactttatc cagttccttc cctcccactg ccagaggctg cacatctgtc 480 cagagacttg gcagtggagg tagggtgggg gtgggaacca agccacagct ttcttaggga 540 agcactggcc aaaggaaggg gactcctaga gttgtaacct tcctcacaga agacaagaaa 600 acgagccggg gtatcagcct caggccagac agagagccag aacctcttca cagactccca 660 gaccaccgga gaagtcacca etgaatccgg acacccagcc aggcacaaga ggtctacacc 720 ctctaacecc eetccagtgc ttccccaacg gtcacttact Cccagaccgc gtgtctta C 780 cttaggagag atgcgcatac cttttgctgc tgttgttgtt tctagacagg gtctcactgt 840 gcagccctgg cttttctgga actcactgtg Cagagcaagc cagcctcaaa ctcacagatc 900 cacctgcccc cgcctccaga ccgcCagaac aaagttact gccacaacac cCaaaaaaaa 960 aaaa 964 <210> 3 <212> ADN <213J> MU3 musculus <400> 3 cgggccctgg gtctatcgtt ccggatgacg tggcctgtac -aggacacgag gactatccgC 60 sgagctgctc ccaccgaggc tggccctctc acaactgcgg acaccacggg gatgctggag 120 ccacctgtcc agacgcccaa acccagagca caaccaggcc agacccgtgg cctactacta 180 ctaccccaaa aa 192 <210> 4 <211> 183 <212> ADN < 13> Mus musculus <400> 4 cggcagcggt ggagacaagg cccacggatg accctacggc ccccagcaac ctctacatcc 60 aggaa gagc catcgagagg gcatgggaaa cggatgcctg cagactccta acagacgcac 120 tagcggtcat gacatgacct tatctcccaa taaacttgac Cttagtcttg tcatcctgaa 180 aaa 183 <210> 5 <211> 115 <212> ADN <213> Mua muaculua <400> S cggtgtactc cacaaagact tctggagagg agtctaagaa gacgcacaga catcacaagg 60 -?mZ ¡1...5 &.? A,.¿ cattcccgga ccatctcaaa gggtgttgta gctgctcctc acagaaggcc aaaaa US <210> 6 <211> 135 <212» ADN <213> Mus musculus <400> 6 cggccattcc agatgcctac ccaacaagcc ccccctggga Ccaggacccc cgCCggaaCa 60 cagacccaca gggcaccccc ccgagacacc cgacactgta ccatttccgc ccccaaataa 120 aagacagagc aaaaa 135 <210> 7 <211> 474 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 7 cccccccaag acgcgaccgc ccccccgcga gccccggcgc accggccggg a cgccccgg 60 gcgacttggc gccgactccg ctgaccgccc cggccgcgca ccctctgggc cgcctggtct 120 cccgaggtca agggacagcg gaagggaccc ggaaacaaca cactgctgag actgagtcgc 180 ctcatcagga gccccagggt cagagaccag aagtacacag cgacctcaac acacagaggc 240 aatactacag acgagcccac CcCatgccca ccagcggcct gatgcccgga tccggtcatt 300 ccagacgccc actcaacaag ccctccccgg gatcaggact cccgttggaa tacagatcca 360 cagggtacct ccctgagata tctgacattg taccatttct gtccccaaat aaaagacaga 420 gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagggcggc cgca 474 <210> 8 <211> 221 <213> Mus musculus <400> ß cggccaaacc tactcaggtt gcaaaggact tatgtgaccc aCgcgactgt aggaaaaaga 60 gaaacgagtg atcatcccgc ggctactagc agatttccac Cgtgcccaga ccagtcggca 120 ggctttgaag gaagtatatg aaaactgtgc ctcagaagcc aatgacagga cacatgactt 180 ccccccccca agtcaaataa acaa acatt gaacagaaaa a 221 <210> 9 <211> 1377 <212> ADN j**. ki <213-> Mus musculus <400> 9 ccgccccctg ctcccacacc tgggac gcc cccgtgcccg gctctgcacc cacccccctc 60 cccccccgcc agcgacaacg ggccccgcgC ggtccttgac aacacctaca ccCccgacac 120 ctcggaaacc agcaccatgg ccaacgcccc cggtggggat gtaacctata cagcgacggc 180 ccccgCgaac gactcagtca gtgccgtgac cctgaaagca gtgaaggagg acgacagccc 240 agtgggcacc tggagtggaa catatgagaa gtgcaacgac agcagtgtcc acCacaactt 300 gacatcccaa agccagccgg ccctccagac aaactggaca gcccccaccc ccgaggacgt 360 gactaaagtc aacccgcagg ccctcatcgc cgtcaatcgc acagccccaa agccatccgt 420 gaaaacggaa caagCacaac ccccagcctc aacccctatc cccgagagtt ctgagaccag 480 ccagaccaca aacacgacCc caactgcgaa cacagccaag accacagcca aggacacagc 540 caacaccaca gccgcgacca cagccaacac cacagccaac accacagccg Cgaccacagc 600 caagaccaca gccaaaagcc cggccacccg cacccceggc agccccctgg caggtgccct 660 ccataccctg ctcgtctttc tcattagtaa acccctcttc taaagaaaac tggggaagca 720 gacccccaac ctccaggCca cccCcccgag cccaccccag gccagcgccc aaacacaccc 780 gaacgaaggc cctacgcccc cagcccgcag ccccaccacc ctggaccaca gacctgcaac 840 accagtgcac tcgagggata caaatgctcg cctggatctt tcagggcaca aattccgctt 900 cccgcaaaca cccagtccat ccatcctgcg CgCaaccCga agccccgact ctcagcccaa 960 cctgttgaca gccaatctga acttgcgttt cttgccaaag gtattccca gagccccccg 1020 ggtgtggggg tggggaggga atgaCccCCc cctactttca aactgatttc agatttctgg 1080 ccaaacctac tcaggttgca aaggactcac gtgacttatg tgactgtagg aaaaagagaa 1140 atgagtgatc atcctgtggc cactagcaga tttccactgt gcccagacca gtcggtaggt 1200 cttgaaggaa gtatatgaaa actgtgcctc agaagccaat gacaggacac atgacttttt 1260 ttttccaagt eaaataaaca atacactgaa caagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1377 <210> 10 <211> 407 <212> ADN <213> Mus mußculuß <400> 10 cggcgcgcac ggggaccaga cagcccgggt ccagcggagg ctccgctcct caacgcccca 60 iá ? ? * tlfa-J-J -i ,« ^-^»» - * JSK*. * i . ? , ,--. 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(440) < 223 > Todas las n se desconocen <400> 16 cnccpggggc CcaeeCgtgC caccaccggc Cggggccgaa tcagtggngt gggcaacgtg 60 acaccagctc gcctgcagca agtngttcta cccctggtca ctgtgaatca gtgtcggcag 120 tactggggtg cacgcattac cgatgccatg atatgtgcag gtggctcagg cgcctcctca 180 tgccngggtg actcaggagg cccccttgtc tgccagaagg gaaacacctg gg gcttatt 240 gggattgcct cccggggcac taagaaccgc aacatacaag caccggccaC gtacactcgg 300 gtcagcaagt tcagtacctg gatcaaccaa gtcatggcct acaactaaac tgtccacaga 360 tccgctcccc atctcaatct aataaacaca cccgtctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 440 <210> 17 <213> Mus musculus <400> 17 cgggtatggc agggatctgg agctcctggg atggcgcgct ctctctcctt tcatttgtga 60 ccagcatgtc agtctgtaaa gctccaaccc catgctcaga aggcaggagg gccacatagt 120 gaagacacca gcccaaaacc actggccgcc ccccacgtgt ggctaggggt ggggtccagt 180 ¿&£ JU-AitAi *A~t*,*.* A&MÍ*. gagcctccca tcaaatctct gtacaacacc atcccctcaa aaa 223 «210> 18 <::??> 1225 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 18 aggaacccgg cacgaggcac cccacccccg cgtcggcaac ggaagcagca caaagctgac 60 ccccacacga ccacgccacc caccgccgct ggcacccgca cacaccaggg ccccgcgccc 120 cccggctcac cccccacccc cacactacac Cgggactcca cgccaggcga cgagccagcc 180 acgctcgccc tccttgtgct cctgagtatg gcagggatcc ggagctcctg ggatggcgcg 240 ctctctctcc tctcatttgt gaccagcatg tcagtctgta aagctccaac cccatgccca 300 gaaggcagga gggccacata gtgaagacac cagcccaaaa ccactggctg cctcttacgc 360 gtggccaggg gtggggtcca gtgagccccc catcaaacct ccgcacaaca ccatcccccc 420 aaaaaaaagc cacccccacc gcaagggacc cagaccccac acccaggaac aggtcacagg 480 cggctaCgaa caaaaccaca cgccgccccc cgctctgtcg gccccccctt ttacatccag 540 aacaaactat ttaaattacc Ccacagcaag ggagagggac aCCCgCcatc ttCCttCCCc 600 CCttgaagat tttgtcatat tcccttaaga ttatgttttt atgttcttgg gctaatggag 660 caacactgcc cccCgacaca gtgaccaccc aagcagcaaa gccgccctcg gctccttcct 720 Ccttgccttg ggagctttct ttctgatgac tcaggaactt tgtgtgaatg agggagaacg 7ß0 cttggagatg agctcgcacc cacctcagct ctacaaCaat Cctgcttcct agaacaaaac 840 Ctgaggttgt atcccagagg gaaacgggaa tcaagatacg gacctatgct tttcatatga 900 aaccgtgcct gaagccgttt gagtgattgt ttgaatgtct cttaaattcc ttgtaccttt 960 gtaaaaaagt aaataaaaaa taattaagaa ataaaagtta aaatagacac agaatcgtgc 1020 aatgtaagaa tatgacaatc tactgtgggt ggtaactcct gcctgtaatc ccagttcatg 1080 gaaggccgag gcaggaagat tgaaaactcc agaccagctt gggcaaagga gtctaagact 1140 ctgcctcaac caaaataata ataaataata acaccagact cgaaaaaaáa aaaaaaaaaa 1200 aaactcgagg gggggccggc accca 1225 <210> 19 <211> 427 <212> ADN <213> Mus musculus Áiááh?t- M¿Zá?ÍÍ .ii-.Au .'M.IÍ*- M*-- Z. - <400> 19 cggcgataag agcaaccccg cacgccggcg gtaccaggtg actgtcaccc tgtctggaca 60 gaaggtcacc gggcacattc cagtttettt gcccggaaac ggaggaaacc ccaaacagta 120 cgaagccccc aagggccccc cgcagccagg cacctctcac gccaatgaat ccgaccccga 180 cgcggacgcc ggagacccgc agaaggttaa atttatttgg tacaacaa g cgaccaaccc 240 aaccccaccc aaagcgggag caccaaggac cacagcggaa agaaatgacg gcagagcg c 300 caacccccgc agccaagaga cagcgaggga agacgCccCg ctcacactgt ctccatgtta 360 ggaggccgcc gcCgcgcgac caccaagccc cactgttgta acaaaagtct agcaccaaag 420 ccaaaaa 427 <210> 20 <211> 180 c212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 cggcctcaga gattagcacg gcgggacaag ggcttctggt ccccgcgccc accccacaat 60 cctccccggc accccccccc cccctcaccg cctaaacag caatgcttaa caagctagaa 120 acgcgctttc ttgactactg cgtctctgtc aaaccagtaa agttttggag ccaacaaaaa 180 <210> 21 <211> 147 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 21 cggctccctg tatcccaggc ttggatcctg tggaccaggg ttactgtttt accactaaca 60 tctccttttg gctcagcatt caccgatctt tagggaaatg ctgttggaga gcaaataaat 120 aaacgcattc atttctctat gcaaaaa 147 <210> 22 <211> 124 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 22 cggcggccca acgaaagagg gagccgccca aggtaggaca gatgactggg gttaagtcgt 60 aacaaggtat ccctacgaga acgtggggat ggatcacctc ctttctaagg agaaaaacga 120 aaaa 124 k JA »A..«¿l««>ltJ-atatlll?« , A,, . . , _. ... , ^«? 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() < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético <400> 69 gaccgaaccc ggacacagca gcagccgggc 30 <210> 70 <211> 30 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <221> mi sc_ característica 222> () .. () < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético <400> 70 gaccgaaccc gggctctggg cccaccgccc 30 <210> 71 <211> 30 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <221> mÍ3c_característica <222> () .. () < 223 > Descripción de la Secuencia .Artificial: Cebador Sintético <400> 71 gaccgaaccc gggggtgcca ggtgtgaggc 30 <210> 72 <211> 30 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <2 1> misc_característica <222> () .. ()' < 223 > Descripción de la Secuencia .Artificial: Cebador Sintético <400> 72 gaccgaaccc ggtcatggga actcagtatt 30 -"-- * t A*>**" i.i -*-' <210:> 73 •c211> 30 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <221> m?sc_característica <222> () .. 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() «223> Descripción of Arcificial Sequence: synthetic primer <400> 77 gaccgaaccc ggccaaactc tcaattacca 30 <210> 78 <211» 30 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <221> m?sc_característica <222> () .. () <223> Descripción of ArCificial Sequence: syntheCic primer <400> 78 gaccgaatcc ggcgcgcacg gggaccagac 30 <210> 79 <211> 30 <212> ADN < 1 > Secuencia Artificial <220> <221> misc_ característica <222> () .. () <223> Deacription of Artificial Sequence: ßynthetic primer <400> 79 gatcgaatcc ggtgtcctgc ccgctctgag 30 «2io> 80 <211> 30 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> «221> mi sc_ característica <222> () .. () Í-?sÁfÍsátihjL MiAiik?i.»M.Aí,?ímJM.M~ - , yfe.y »-> J, m *. 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() < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético «400» 110 gaacaaagga tccacacccc aaacc 25 A. j .izl,.imj?Ai* .M.. *.-:í*-m <210» 111 «211> 25 «212» ADN «213» Secuencia Artificial «220» «221» misc_característíca «222> () .. () «223» Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético «400» 111 gcacatgtgg aggacacgtt cttca 25 «210» 112 «211» 25 «212» ADN «213» Secuencia Artificial «220» «221» m?sc_característica «222» () .. () < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético «400» 112 acgaaaaaca Cggaaaacga taaaa 25 «210» 113 «211» 24 «212» ADN «213» Secuencia Artificial «220» «221> mise característica «222» O ..7) «223» Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético «400» 113 ctaaaacgtt ctacagtgtg gttt 24 «210» 114 «211» 25 <212» ADN « 13» Secuencia Artificial «220» «2 1> misc_característica «222> - () .. 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() «223» Descripción de la Secuencia .Artificial: Cebador Sintético «400» 126 gatcgaaccc ggagtggcaa agaccccaac 30 «210» 127 «211> 25 «212» ADN « 13» Secuencia Artificial «220» «221» misc_característica «222» () .. () « 23» Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético «400» 127 cagtgcggag gaagcccggg aggcg 25 «210» 128 «211» 24 «212» ADN « 13» Secuencia Artificial «220» «221» mise característica «222» 0..7) «223» Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Sintético <400> 128 cacaccgggg gcaggcagac tttc 24 «210» 129 «211» 137 «212» PRT «213» Mus musculus «400» 129 Gly Trp Gln Gly Ala Pro Asp Pro Axg Gly Leu Gly Gln Leu Ser Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Met Gly Gly Glu Met Pro Trp Thr He Leu Leu Phe Ala Ser 20 25 30 Val Pro Thr Trp He Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Ala Gly Ala Val ÚtAiád .* ¿£k l~*.. *, rf ¡s»ri ¡-# . iL kj 35 40 45 Leu Phe Ser Gly Leu Val Ala lie Thr Val Leu Val Arg Lys Ala Lys 50 55 60 Ala Lys Asn Leu Gln Lys Gln Arg Glu Arg Glu Ser Cys Trp Ala Gln 65 70 75 80 He Asn Phe Thr Asn Thr A3p Mee Ser Phe Asp Asn Ser Leu Phe Ala 85 90 95 He Ser Thr Lys Met Thr Gln Glu Aap Ser Val Ala Thr Leu Asp Ser 100 IOS 110 Gly Pro Arg Lys Arg Pro Thr Ser Ala Ser Ser Ser Pro Glu Pro Pro 115 120 125 Glu Phe Ser Thr Phe Arg Ala Cys Gln 130 135 Se hace constar que con relación a esta fecha , el mej or método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención , es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención . j 1Í ¿i A: Am?MÁ. í*.* i,Í *

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende un polinucleótido elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62.
2. 2. Un polipéptido aislado caracterizado porque se codifica por un polinucleótido elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID É«Í A A. lt '1 ÍlÍ»¿.SfalJ*<>:fc «_jm._yrt-». -. *«. - > * - - -.-- - JJ- •* • - *% -- - - - > -' <» i- -y-t «O.» NO: 4, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62.
3. 3. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque comprende un polinucleótido al menos 95% idéntico a la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1.
4. 4. Una molécula aislada de ácido nucleico de al menos 10 bases de longitud caracterizada porque se puede hibridar a la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, bajo condiciones severas.
5. 5. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica para el polipéptido de la JÉJÉl i \ I i», ... i- - .- jfeJMaa - . .Í.Á. J l.- l i reivindicación 2.
6. 6. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica para un fragmento del polipéptido de la reivindicación 2.
7. 7. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica para un epítope polipeptídico del polipéptido de la reivindicación 2.
8. 8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad biológica.
9. 9. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica para un homólogo de especie de polipéptido de la reivindicación 2.
10. 10. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos comprende supresiones secuenciales de nucleótidos de ya sea el C-término o el N-término .
11. 11. Un vector recombinante caracterizado porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1.
12. 12. Una célula hospedadora recombinante caracterizada porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1.
13. 13. Un método caracterizado porque es para elaborar la célula hospedadora recombinante de la reivindicación 12.
14. 14. La célula hospedadora recombinante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende secuencias de vector.
15. 15. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende supresiones secuenciales de aminoácidos de ya sea el C-término o el N-término.
16. 16. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se une específicamente al polipéptido aislado de la reivindicación 2.
17. 17. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
18. 18. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
19. 19. Una célula hospedadora recombinante caracterizada porque expresa el polipéptido aislado de la reivindicación 2.
20. 20. Un polipéptido aislado caracterizado porque se produce por los pasos de: (a) cultivar la célula hospedadora recombinante de la reivindicación 14 bajo condiciones tal que se exprese taiaJ?Ajfaü t,.jrU.. J, . .J . ,1 : A i i i el polipéptido; y (b) aislar el polipéptido
21. 21. Un método para prevenir, tratar o mejorar una condición médica, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto o mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 2 o el polinucleótido de la reivindicación 1.
22. 22. Un método para diagnosticar una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de la reivindicación 1; y (b) diagnosticar una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica en base a la presencia o ausencia de la mutación.
23. 23. Un método para diagnosticar una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de la reivindicación 2 en una muestra biológica; y (b) diagnosticar una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica en base a la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.
24. 24. Un método para identificar un compañero de unión al polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el polipéptido de la reivindicación 2 con un compañero de unión; y (b) determinar si el compañero de unión efectúa una actividad del polipéptido.
25. 25. El gen caracterizado porque corresponde a la secuencia de ADNc del ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.
26. 26. Un método para identificar una actividad de un polipéptido expresado en un ensayo biológico, caracterizado porque el método comprende: (a) expresar el polipéptido de la reivindicación 2 en una célula; (b) aislar el polipéptido expresado; (c) probar el polipéptido expresado para una actividad en un ensayo biológico; y (d) identificar la actividad del polipéptido expresado en base a los resultados de la prueba.
27. 27. Una molécula de ADN aislada, sustancialmente pura adecuada para el uso como una sonda para genes regulados en la inflamación gastrointestinal, caracterizada porque se elige del grupo que consiste de moléculas de ADN identificadas en la Tabla 1, que tiene una secuencia de >^A l, +?*!i?jJ&ÍSr- i- *. t~*t' Ate! * * 3f nucleótidos parcial en 5 ' y longitud como se describe por su dirección digital, y que tiene un patrón de regulación característico en la inflamación gastrointestinal.
28. 28. Un equipo adecuado para detectar la presencia de un polipéptido de la reivindicación 2 en una muestra de tejido de mamífero, caracterizado porque comprende un primer anticuerpo que inmunoreacciona con una proteína de mamífero codificada por un gen que corresponde al polinucleótido de la reivindicación 1 o con un polipéptido de la reivindicación 2 en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, instrucciones para el uso y material de empaque adecuado .
29. 29. Un equipo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque además comprende un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo.
30. 30. El equipo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el segundo anticuerpo está marcado.
31. 31. El equipo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la marca comprende enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, compuestos fosforescentes, compuestos bioluminiscentes.
32. 32. Un equipo adecuado para detectar la presencia de un gen regulado en la inflamación gastrointestinal, .fe- 215 caracterizado porque comprende: al menos un polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 4, o un fragmento del mismo que tiene al menos 10 bases contiguas, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo; medios de marca; instrucciones para el uso; y material de empaque adecuado.
33. 33. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 129. l li .1 .? *LAí+- te,Mt* i .„ ¡-A.-..-. , . - .»