KR20230128365A - 아미노산 탈수소효소 돌연변이체 및 그 응용 - Google Patents
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Abstract
아미노산 탈수소효소 돌연변이체 및 그 응용을 제공하고, 상기 아미노산 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지고, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 K144G 부위를 포함한다. 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 단백질 구조 및 기능의 변화를 실현하여 효소 활성을 향상시키고 아미노산 탈수소효소의 사용량을 저감하며, 효소의 특이성도 상응하게 향상시키고 아미노산의 산업적 생산에서의 비용을 절감한다.
Description
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것이고, 구체적으로는 아미노산 탈수소효소 돌연변이체 및 그 응용에 관한 것이다.
아미노산 탈수소효소(Amino acid dehydrogenase, 약칭 AADH)는 효소 분류 번호가 EC(1.4.1.X)이고, 가역적으로 아미노산의 산화적 탈아미노화 및 케토산의 환원적 아미노화 반응을 촉매화할 수 있으며, 아미노산 합성 및 대사 경로에서 중요한 효소이다. 여기서, 아미노산 탈수소효소는 키랄 화합물의 합성에 있어서 잠재적인 키랄 케토산 또는 케톤을 대칭적으로 환원시켜 키랄 아민을 제조함으로써, 높은 입체 선택성, 고효율, 온화한 반응, 및 환경 친화성의 장점을 가지고 있다. 아미노산 탈수소효소에 의해 촉매화되는 반응은 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) 및 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)를 포함하는 보조 인자의 참여를 필요로 한다.
케톤의 환원 반응 과정에서 일반적으로 환원형 보조인자인 NADH의 참여가 필요하지만, 실제 반응에서는 산화형 보조인자인 NAD+를 첨가한 후 적절한 보조인자 재생 시스템을 통해 환원형인 NADH로 재생시킨다. 일반적으로 사용되는 보조인자 재생 시스템에는 포도당 및 포도당 탈수소효소, 포름산염 및 포름산염 탈수소효소, 2차 알코올 및 2차 알코올 탈수소효소, 아인산염 및 아인산염 탈수소효소, 및 기타 유사한 시스템이 포함된다. 일반적으로 보조 효소 재생 시스템의 교체는 아미노산 탈수소효소의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
아미노산 탈수소효소는 상업적 가치가 광범위하지만 그 유래가 상대적으로 제한적이고 효소를 생산하는 균주의 수율이 낮은 문제가 있기 때문에 유도 진화 방법을 통해 특성이 우수한 아미노산 탈수소효소 균주를 얻는 것은 아미노산 탈수소효소의 생산과 응용에 중요한 의의가 있다.
본 발명의 목적은 야생형 아미노산 탈수소효소가 산업적 생산에 적합하지 않다는 선행기술의 기술적 과제를 해결하기 위해 아미노산 탈수소효소 돌연변이체 및 그 응용을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면 아미노산 탈수소효소 돌연변이체가 제공된다. 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생한 서열을 가지며, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 K144G 부위를 포함한다.
또한, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 L41I/L/T, G42V, G43N, T115I/L/V, M117L/Y, G118N, T119C/E/L/S, P121M/S/T/W, L135I/V, K184M/N/S, G293A, 및 G294I/V 중 하나 이상을 더 포함하고, 여기서 "/"는 "또는"을 의미한다.
또한, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 K144G+L294I, K144G+L294I+L135V, K144G+L294I+T115I 중 어느 하나의 돌연변이 부위의 조합을 포함한다.
또한, 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 K144G+L294I+L135V 아미노산 돌연변이를 가지며, 포름산 탈수소효소 FDH와 공동 발현(Coexpression)된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 DNA 분자가 제공된다. 상기 DNA 분자는 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체를 암호화한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 재조합 플라스미드가 제공된다. 상기 재조합 플라스미드에는 상기 DNA 분자가 연결된다.
또한, 재조합 플라스미드는, pET-22a(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b, pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-8, pUC-18, pRSFDuet1, 또는 pUC-19이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 숙주 세포가 제공된다. 상기 숙주 세포는 상기 재조합 플라스미드 중 어느 하나를 함유한다.
또한, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하며; 바람직하게는 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이고, 진핵 세포는 효모이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 아미노산 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은 아미노산 탈수소효소를 사용하여 케톤계 화합물에 대해 촉매 환원적 아미노화 반응을 진행하는 단계를 포함하고, 아미노산 탈수소효소는 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체 중 어느 하나이다.
또한, 케톤계 화합물은 이고, 환원적 아미노화 반응의 생성물은 이며, 상기 식에서 R1은 -OH, -F, -Cl, -Br, 또는 -CH3이고, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, 또는 -CH3이며; 바람직하게는, 케톤계 화합물은 , , , 또는 이다.
또한, 촉매 환원적 아미노화 반응에서의 아미노 공여체는 포름산암모늄, 염화암모늄, 카르밤산암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소암모늄, 암모니아수, 옥살산암모늄, 옥살산수소암모늄, 젖산암모늄 또는 인산암모늄이고; 바람직하게는, 아미노산 탈수소효소에 의한 촉매 환원적 아미노화 반응의 조건은 30 ~ 50℃, 교반 회전 속도 50 ~ 250rpm이고, 촉매 환원적 아미노화 반응은 포름산 탈수소효소 0.1 mg/mL ~ 1 mg/mL를 사용하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 탈수소효소의 기초 상에서 부위 특이적 돌연변이 유도 방법에 의해 돌연변이를 일으켜 그 아미노산 서열을 변화시킴으로써 단백질 구조 및 기능의 변화를 실현하고, 방향성 스크리닝 방법에 의해 상기 돌연변이 부위를 갖는 아미노산 탈수소효소를 얻는다. 본 발명의 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 효소 활성이 크게 향상되는 장점이 있고, 이에 따라 아미노산 탈수소효소의 사용량을 저감할 수 있으며, 효소의 특이성도 상응하게 향상시킬 수 있고, 아미노산의 산업적 생산에서의 비용을 크게 절감할 수 있다.
모순되지 않는 경우, 본 출원의 실시형태와 실시형태의 특징은 서로 조합될 수 있음에 유의해야 한다. 이하, 실시형태를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
특허(CN108795893A)에서 Thermoactinomyces intermedius ATCC33205 유래 아미노산 탈수소효소 돌연변이체 A135L(Template)은 표적 기질을 촉매화하여 생성물을 얻을 수는 있지만, 촉매화 활성이 약하였다. 본 발명은 유도 진화 방법을 통해 그 촉매화 활성을 향상시키고, 아미노산 탈수소효소의 사용량을 저감하였다. 본 발명의 주형 아미노산의 서열은 서열번호 1 (MRDVFEMMDRYGHEQVIFCRHPQTGLKAIIALHNTTAGPALGGCRMIPYASTDEALEDVLRLSKGMTYKCSLADVDFGGGKMVIIGDPKKDKSPELFRVIGRFVGGLNGRFYTGTDMGTNPEDFVHAARESKSFLGLPKSYGGKGDTSIPTALGVFHGMRATARFLWGTDQLKGRVVAIQGVGKVGERLLQLLVEVGAYCKIADIDSVRCEQLKEKYGDKVQLVDVNRIHKESCDIFSPCAKGGVVNDDTIDEFRCLAIVGSANNQLVEDRHGALLQKRSICYAPDYLVNAGGLIQVADELEGFHEERVLAKTEAIYDMVLDIFHRAKNENITTCEAADRIVMERLKKLTDIRRILLEDPRNSARRLE*이고, *는 아미노산 종결 코돈임)이고, 대응되는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2 (ATGCGTGACGTATTCGAAATGATGGATCGCTACGGCCACGAGCAGGTGATTTTCTGTCGTCATCCGCAGACTGGCCTGAAAGCGATCATCGCTCTGCATAACACCACTGCCGGTCCGGCACTGGGCGGTTGTCGCATGATTCCATACGCAAGCACCGATGAAGCTCTGGAAGACGTTCTGCGTCTGAGCAAAGGTATGACCTATAAATGCTCTCTGGCGGATGTTGATTTCGGTGGCGGTAAAATGGTGATTATCGGCGATCCGAAAAAGGATAAAAGCCCAGAACTGTTCCGTGTTATCGGTCGCTTCGTTGGCGGCCTGAACGGTCGTTTCTATACCGGTACTGATATGGGCACCAATCCGGAAGATTTCGTGCACGCCGCTCGCGAAAGCAAATCTTTTCTAGGTCTGCCTAAATCTTACGGTGGTAAAGGTGACACTTCTATCCCGACCGCACTGGGTGTATTTCACGGCATGCGCGCGACCGCCCGCTTTCTGTGGGGCACCGATCAACTGAAAGGTCGTGTTGTTGCTATCCAGGGTGTTGGCAAAGTGGGTGAACGTCTGCTGCAGCTGCTGGTGGAAGTGGGTGCATACTGCAAAATTGCTGATATTGACTCTGTACGTTGTGAGCAGCTGAAAGAAAAGTACGGCGACAAAGTCCAGCTGGTAGACGTGAACCGTATCCACAAAGAGTCTTGTGACATCTTCTCCCCGTGCGCAAAAGGCGGCGTAGTCAACGACGACACTATTGACGAATTCCGCTGCCTGGCGATTGTTGGTTCCGCGAACAATCAGCTGGTTGAAGATCGTCATGGCGCGCTGCTGCAAAAACGCTCCATTTGCTATGCCCCGGATTATCTGGTTAACGCTGGCGGTCTGATCCAGGTCGCAGACGAACTGGAGGGTTTTCACGAGGAGCGTGTGCTGGCGAAAACGGAAGCCATCTACGACATGGTTCTGGACATCTTCCACCGCGCTAAGAACGAAAACATCACTACCTGCGAAGCAGCGGACCGTATCGTAATGGAACGTCTGAAGAAGCTGACGGACATCCGTCGTATCCTGCTGGAAGATCCGCGTAACTCCGCGCGTCGTCTCGAGTGA)이다.
먼저, 부위 특이적 돌연변이 유도 방식을 통해 아미노산 탈수소효소에 돌연변이 부위를 도입하고, 돌연변이체의 활성을 측정하여 활성이 향상된 돌연변이체를 선별하였다. 여기서 돌연변이체 K144G의 활성은 출발 주형에 비해 약 5배 증가하였다. 그 후, K144G를 주형으로 하여 돌연변이를 계속 진행하여 촉매화 활성이 보다 현저하게 향상된 돌연변이체를 얻었다.
여기서, 부위 특이적 돌연변이 유도 방식은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 등의 방법을 통해 표적 DNA 세그먼트(유전체 또는 플라스미드일 수 있음)에 필요한 변화(일반적으로 유리한 방향으로 특성화하는 변화)를 도입하는 것을 의미하며, 염기 추가, 삭제, 및 점 돌연변이 등을 포함한다. 부위 특이적 돌연변이 유도 방식은 DNA에 의해 발현되는 표적 단백질의 성질 및 특성을 신속하고 효율적으로 개선할 수 있으며 유전자 연구에 매우 유용한 방법이다.
Whole-plasmid PCR을 이용하여 특정 부위에 돌연변이를 도입하는 방법은 간단하고 효과적이며, 현재 상대적으로 많이 이용되고 있는 방법이다. 그 원리는 돌연변이 부위를 포함하는 한 쌍의 프라이머(정방향 및 역방향)가 주형 플라스미드에 어닐링된 다음 중합 효소로 순환 연장하는 것이다. 여기서 순환 연장이란 중합 효소가 주형에 따라 프라이머를 한번 연장한 후 프라이머 5' 말단으로 돌아가 종료한 다음, 가열, 어닐링, 연장의 순환을 반복하는 것을 의미하며, 이 반응은 회전환 증폭(rolling circle amplification)과 달리 탠덤 복제(Tandem Duplications)가 형성되지 않는다. 정방향 및 역방향 프라이머의 연장 생성물은 어닐링된 후 쌍을 이루어 틈(nick)이 있는 개방 원형 플라스미드를 형성한다. Dpn I 효소 절단(Enzyme digestion) 생성물은 원래의 주형 플라스미드가 통상적인 대장균에서 유래되었기 때문에 dam 메틸화에 의해 변형되어 Dpn I에 민감하여 절단되는 반면, 체외(in vitro)에서 합성된 돌연변이 서열을 가진 플라스미드는 메틸화를 거치지 않았기에 절단되지 않는다. 따라서 후속 형질전환에서 성공적으로 형질전환될 수 있고, 돌연변이 플라스미드의 클론을 얻을 수 있다. 돌연변이 플라스미드를 대장균 세포에 형질전환시킨 후 세포를 초음파로 파쇄하여 조효소(Crude Enzyme)를 얻었다.
상기 돌연변이 플라스미드는 대장균 세포에 형질전환된 후 대장균에서 과발현된다. 그 후, 세포를 초음파로 파쇄하는 방법으로 조효소(Crude Enzyme)를 얻었다. 아미노산 탈수소효소의 발현을 유도하는 최적 조건은 25℃, 0.1mM IPTG에서 16h 동안 유도하는 것이다.
소프트웨어를 이용한 아미노산 탈수소효소의 3차원 구조에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 분석을 통해, 대부분의 돌연변이 부위가 활성 중심 근처에 위치하며 돌연변이 후 기질과 효소의 결합이 강화될 수 있어 촉매화 효율이 향상됨을 발견하였다. 본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면, 아미노산 탈수소효소 돌연변이체가 제공된다. 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생한 서열을 가지며, 상기 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 K144G 부위를 포함한다.
바람직하게는, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 L41I/L/T, G42V, G43N, T115I/L/V, M117L/Y, G118N, T119C/E/L/S, P121M/S/T/W, L135I/V, K184M/N/S, G293A, 및 G294I/V 중 하나 이상을 더 포함하고, 여기서 "/"는 "또는"을 의미하며; 보다 바람직하게는, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 K144G+L294I, K144G+L294I+L135V, K144G+L294I+T115I 중 어느 하나의 돌연변이 부위 조합을 포함한다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면, 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 K144G+L294I+L135V 아미노산 돌연변이를 가지며, 포름산 탈수소효소 FDH와 공동 발현(Coexpression)된다.
본 발명의 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 탈수소효소의 기초 상에서 부위 특이적 돌연변이 유도 방법에 의해 돌연변이를 일으켜 그 아미노산 서열을 변화시킴으로써 단백질 구조 및 기능의 변화를 실현하고, 방향성 스크리닝 방법에 의해 상기 돌연변이 부위를 갖는 아미노산 탈수소효소를 얻는다. 본 발명의 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 효소 활성이 크게 향상되는 장점이 있고, 효소의 특이성도 상응하게 향상되고 산업적 생산에서의 비용을 크게 절감할 수 있다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면 DNA 분자가 제공된다. 상기 DNA에 의해 암호화되어 얻어진 아미노산 탈수소효소는 효소 활성 및 효소의 안정성이 향상되고, 아미노산의 산업적 생산에서 첨가되는 효소의 양을 저감할 수 있으며, 후처리의 어려움을 경감할 수 있다.
본 발명의 상기 DNA 분자는 또한 "발현 카세트"의 형태로 존재할 수 있다. "발현 카세트"는 선형 또는 원형 핵산 분자를 가리키며, 적절한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 및 RNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 표적 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 이는 선택적으로 종결 신호 및/또는 다른 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 발현 카세트는 뉴클레오티드 서열의 정확한 번역에 필요한 서열을 더 포함할 수 있다. 암호화 영역은 일반적으로 표적 단백질을 암호화하지만, 센스 또는 안티센스 방향에서 예를 들어 안티센스 RNA 또는 번역되지 않은 RNA와 같은 표적 기능 RNA를 암호화한다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라(chimera)일 수 있는데, 이는 그의 조성 중 적어도 하나가 그의 다른 조성 중 적어도 하나와 이종임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 자연 발생적일 수 있지만, 이종 발현을 위한 효과적인 재조합 형성에서 얻어질 수 있다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면 재조합 플라스미드가 제공된다. 상기 재조합 플라스미드에는 상기 DNA 분자 중 어느 하나가 함유된다. 상기 재조합 플라스미드의 DNA 분자는 재조합 플라스미드의 적절한 위치에 배치되어 상기 DNA 분자가 정확하고 원활하게 복제, 전사, 또는 발현될 수 있다.
본 발명에서 상기 DNA 분자를 한정할 때 "함유한다"라는 표현을 사용하였지만, 그 기능과 무관한 다른 서열이 DNA 서열의 양 말단에 임의로 부가될 수 있음을 의미하는 것은 아니다. 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 재조합 작업의 요건을 충족시키기 위해 DNA 서열의 양 말단에 적절한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 추가하거나, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 별도로 추가할 필요가 있음을 알고 있을 것이다. 따라서 폐쇄형 표현을 사용하는 경우라면 이러한 상황을 진실되게 포함할 수 없다.
본 발명에서 사용되는 용어 "플라스미드"는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 선형 또는 원형 형태의 임의의 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 아그로박테리움 이원 핵산 분자를 포함하고, 바람직하게는 재조합 발현 플라스미드를 포함하며, 이는 원핵 발현 플라스미드 또는 진핵 발현 플라스미드일 수 있지만, 바람직하게는 원핵 발현 플라스미드이고, 특정 실시형태에서, 재조합 플라스미드는 pET-22a(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b, pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-2la(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-l, pGEX-6p-l, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-8, pUC-18, pRSFDuet1, 또는 pUC-19로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 플라스미드는 pET-22b(+)이다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면 숙주 세포가 제공되고, 숙주 세포는 상기 재조합 플라스미드 중 어느 하나를 함유한다. 본 발명에 적용되는 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이고, 진핵 세포는 효모이다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면 아미노산 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은 아미노산 탈수소효소를 사용하여 케톤계 화합물 및 아미노 공여체에 대해 촉매 아미노 전이 반응을 진행하는 단계를 포함하고, 아미노산 탈수소효소는 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체 중 어느 하나이다. 본 발명의 상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 효소 촉매화 활성이 더 높기에, 본 발명의 아미노산 탈수소효소 돌연변이체를 사용하여 제조된 아미노산은 생산 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 얻어진 아미노산의 e.e.값(거울상 이성질체 과잉)이 더 높다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면, 케톤계 화합물은 이고, 환원적 아미노화 반응 생성물은 이며, 여기서, R1은 -OH, -F, -Cl, -Br, 또는 -CH3이고, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, 또는 -CH3이고;
바람직하게는, 케톤계 화합물은 , , , 또는 이다.
바람직하게는, 촉매 환원적 아미노화 반응에서의 아미노 공여체는 포름산암모늄, 염화암모늄, 카르밤산암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소암모늄, 암모니아수, 옥살산암모늄, 옥살산수소암모늄, 젖산암모늄 또는 인산암모늄이고; 아미노산 탈수소효소에 의한 촉매 환원적 아미노화 반응의 조건은 30 ~ 50℃, 교반 회전 속도 50 ~ 250rpm이고, 촉매 환원적 아미노화 반응은 포름산 탈수소효소 0.1 mg/mL ~ 1 mg/mL을 사용하는 것을 더 포함한다.
이하, 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 유익한 효과를 더욱 상세하게 설명한다.
기질 1, 2, 3, 4의 반응 검증:
기질 1:
2-(1-아다만틸)-2-옥소아세트산
기질 2:
2-(2-히드록시-1-아다만틸)-2-옥소아세트산
기질 3:
2-(3-플루오로-1-아다만틸)-2-옥소아세트산
기질 4:
2-(3-메틸-1-아다만틸)-2-옥소아세트산
실시예 1
A135L(주형(Template)임, 여기서, A135L은 135번째 아미노산 A가 L로 교체됨을 나타냄)에 대해 부위 특이적 돌연변이를 수행하고, T115, L135, K144, T147, L294, 및 V297의 총 6개 돌연변이 부위의 40개 돌연변이체에서, 기질 1 및 기질 2를 반응에 투입하여 검증을 수행하였다. 반응 시스템은 0.1g의 기질, 0.001g의 아미노산 탈수소효소, 0.001g의 포름산 탈수소효소, 0.0256mg의 NAD+, 0.056g의 포름산암모늄, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1.1mL, 40℃, 16h이며, 여기서 K144G 돌연변이체의 형질전환율이 가장 높았다. 구체적인 결과는 표 1에 나타내었다.
| 돌연변이체 | 기질 1 활성 | 기질 1 e.e.% | 기질 2 활성 | 기질 2 e.e.% |
| 주형(Template) | - | ＞99 | - | ＞99 |
| M66G | - | ＞99 | - | ＞99 |
| T115C | + | ＞99 | + | ＞99 |
| T115G | - | ＞99 | + | ＞99 |
| T115I | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 |
| T115L | + | ＞99 | + | ＞99 |
| T115M | + | ＞99 | ++ | ＞99 |
| T115Q | +++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| T115V | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| L135D | - | ＞99 | - | ＞99 |
| L135K | ++ | ＞99 | + | ＞99 |
| L135Q | - | ＞99 | - | ＞99 |
| L135S | ++ | ＞99 | + | ＞99 |
| L135T | ++ | ＞99 | +++ | ＞99 |
| L135V | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| K144C | +++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| K144E | ++ | ＞99 | + | ＞99 |
| K144G | ++++ | ＞99 | ++++ | ＞99 |
| K144H | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| K144L | +++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| K144P | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 |
| K144S | +++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| K144Y | ++ | ＞99 | + | ＞99 |
| T147K | - | ＞99 | - | ＞99 |
| T147M | - | ＞99 | - | ＞99 |
| T147S | + | ＞99 | + | ＞99 |
| T147V | - | ＞99 | - | ＞99 |
| T147Y | - | ＞99 | - | ＞99 |
| L294A | - | ＞99 | - | ＞99 |
| L294C | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| L294I | ++ | ＞99 | +++ | ＞99 |
| L294L | + | ＞99 | + | ＞99 |
| L294M | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| L294S | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| L294V | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
| V297A | + | ＞99 | - | ＞99 |
| V297D | - | ＞99 | - | ＞99 |
| V297G | - | ＞99 | - | ＞99 |
| V297K | - | ＞99 | - | ＞99 |
| V297M | - | ＞99 | - | ＞99 |
| V297V | ++ | ＞99 | ++ | ＞99 |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 2
K144G를 주형으로 하여, L41, G42, G43, G114, T115, M117, G118, T119, P121, L135, K184, G293, 및 L294의 13개 부위에 대해 계속하여 돌연변이를 수행하여, 총 43개의 돌연변이체를 얻었으며, 기질 1 및 기질 2를 반응에 투입하여 검증을 수행하였다. 반응 조건은 0.1g의 기질, 0.0005g의 아미노산 탈수소효소, 0.001g의 포름산 탈수소효소, 0.0256mg의 NAD+, 0.056g의 포름산암모늄, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1mL, 40℃, 16h이며, 여기서, L135V, T115I, 및 L294I 부위를 추가한 후 형질전환율이 증가되었다. 구체적인 결과는 표 2에 나타내었다.
| 돌연변이체 | 기질 1 활성 | 기질 1 e.e.% | 기질 2 활성 | 기질 2 e.e.% | |||
| K144G | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+L41I | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+L41K | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+L41L | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+L41S | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+L41T | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G42V | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G43N | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G114S | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+T115I | ++++ | ＞99 | ++++ | ＞99 | |||
| K144G+T115L | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+T115V | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+M117A | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+M117L | +++ | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+M117T | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+M117V | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+M117Y | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G118A | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G118H | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+G118N | + | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+G118Q | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+G118S | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+G118Y | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+T119A | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+T119C | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+T119E | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+T119L | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+T119N | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+T119S | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+P121M | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+P121S | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+P121T | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+P121W | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+L135I | ++++ | ＞99 | ++++ | ＞99 | |||
| K144G+L135V | ++++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+K184H | +++ | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+K184M | +++ | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+K184N | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+K184S | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G293A | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
| K144G+G293P | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+G293S | - | ＞99 | - | ＞99 | |||
| K144G+L294I | ++++ | ＞99 | ++++ | ＞99 | |||
| K144G+L294V | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 | |||
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 3
포화 돌연변이를 조합하여 복수의 돌연변이 부위 사이에 시너지 효과가 있는 돌연변이체를 얻을 수 있고, 그 아미노산 조성의 조합을 최적화할 수 있다. K144G+L294I를 주형으로 하여 반응이 비교적 좋은 돌연변이 부위 L135V 및 T115I를 각각 중첩시켰다. 반응 조건은 0.1g의 기질, 0.0005g의 아미노산 탈수소효소, 0.001g의 포름산 탈수소효소, 0.0256mg의 NAD+, 0.056g의 포름산암모늄, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1mL, 40℃, 100rpm, 16h이며, 그 중 활성이 가장 높은 것은 K144G+L294I+L135V였다. 결과는 표 3에 나타내었다.
| 돌연변이 부위 | 기질 1 활성 | 기질 1 e.e.% | 기질 2 활성 | 기질 2 e.e.% |
| K144G | +++ | ＞99 | +++ | ＞99 |
| K144G+L294I | ++++ | ＞99 | ++++ | ＞99 |
| K144G+L294I+L135V | +++++ | ＞99 | +++++ | ＞99 |
| K144G+L294I+T115I | ++++ | ＞99 | ++++ | ＞99 |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 4
기질 1, 2, 3, 및 4의 반응 증폭: K144G+L294I+L135V를 반응에 투입하고 e.e.를 측정하였다. 반응 조건은 1g의 기질, 0.005g의 아미노산 탈수소효소, 0.01g의 포름산 탈수소효소, NAD+ 0.256mg, 0.056g의 포름산암모늄, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1 mL, 40℃, 100rpm이다.
활성 측정을 위한 샘플링 방법: 반응 시스템 0.5mL를 취하여, 12000rpm에서 5min 동안 원심분리하고, 상층액 0.050mL를 취하여 정제수 1mL를 첨가하고 잘 섞은 후 HPLC에 의해 형질전환율을 측정하였다.
e.e. 측정을 위한 샘플링 방법: 반응하여 형질전환이 완료된 시스템 1mL를 취하고 1M NaOH로 pH를 10 ~ 11로 조정하고; 0.1mL의 (BOC)2O를 30℃, 200rpm에서 0.5h 동안 추가하고, 1M NaOH로 pH를 10 ~ 11로 조정하되 30℃, 200rpm에서 0.5h 동안 조정하며; 동일한 부피의 이소프로필 아세테이트를 첨가하고 6M HCl로 pH를 2.0으로 조정하고; 시스템 0.5mL를 취하여 에틸 아세테이트 1mL를 첨가하고 흔들어 잘 섞은 후 12000rpm에서 5min 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 블로잉 건조시키고 무수 에탄올을 첨가하여 용해시키고 e.e.를 측정하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
| 돌연변이체 | 기질 1 | 기질 2 | 기질 3 | 기질 4 | ||||
| 활성 | e.e.% | 활성 | e.e.% | 활성 | e.e.% | 활성 | e.e.% | |
| 주형(Template) | - | > 99 | - | > 99 | - | > 99 | - | > 99 |
| K144G | +++ | > 99 | +++ | > 99 | +++ | > 99 | +++ | > 99 |
| K144G+L294I+L135V | +++++ | > 99 | +++++ | > 99 | +++++ | > 99 | +++++ | > 99 |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 5
K144G+L294I+L135V 돌연변이체를 선택하여, 포름산 탈수소효소를 최적화하였다. 반응 조건은 0.1g의 기질, 아미노산 탈수소효소 0.0005g, NAD+ 0.0256mg, 0.056g의 포름산암모늄, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1mL, 40℃, 100rpm이며, 여기서 포름산 탈수소효소는 0.3mg 이하에서만 활성이 현저히 감소되었고, 이는 반응 과정에서 포름산 탈수소효소가 비제한적 요소임을 설명한다. 결과는 표 5에 나타내었다.
| 포름산 탈수소효소 mg | 기질 1 활성 |
| 0.05 | ++ |
| 0.1 | +++ |
| 0.2 | ++++ |
| 0.3 | +++++ |
| 0.4 | +++++ |
| 0.5 | +++++ |
| 0.6 | +++++ |
| 0.7 | +++++ |
| 0.8 | +++++ |
| 0.9 | +++++ |
| 1 | +++++ |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 6
포름산 탈수소효소 0.3mg의 조건에서, K144G+L294I+L135V 효소의 양을 최적화하였다. 반응 조건은 0.1g의 기질, NAD+ 0.0256mg, 0.056g의 포름산암모늄, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1.1mL, 40℃, 100rpm이며, 효소의 양이 감소할수록 형질전환율이 현저하게 감소하였고, 이는 반응 과정에서 아미노산 탈수소효소가 제한적 요소임을 설명한다. 결과는 표 6에 나타내었다.
| 아미노산 탈수소효소 mg | 기질 1 활성 |
| 1 | + |
| 2 | ++ |
| 3 | +++ |
| 4 | ++++ |
| 5 | +++++ |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 7
공동 발현 균주의 반응 조건을 최적화하되, K144G+L294I+L135V 및 포름산 탈수소효소 FDH를 공동 발현 플라스미드 pRSFDuet1에 구축하고, E.coli BL21(DE3)로 형질전환시켰다. 기질 1을 반응에 투입하여 검증을 수행하고, 반응 조건의 온도, 회전 속도를 최적화하였다. 반응 조건은 0.1g의 기질, 아미노산 탈수소효소 0.005g, NAD+ 0.0256mg, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1.1mL이다. 결과는 최적의 반응 조건이 40℃, 100 rpm인 것으로 나타났다. 결과는 표 7에 나타내었다.
| 돌연변이체 |
온도
(℃) |
회전 속도
(rpm) |
NAD
+
(mg) |
기질 1 활성 |
| K144G+L294I+ L135V+FDH |
30 | 100 | 0.025 | +++ |
| 40 | +++++ | |||
| 50 | + | |||
| 30 | 200 | +++ | ||
| 40 | ++++ | |||
| 50 | ++ |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
실시예 8
기질 1, 2, 3, 및 4의 반응 증폭: 공동 발현균주 K144G+L294I+L135V+FDH를 반응에 투입하고 e.e.를 측정하였다. 반응 조건은 1g의 기질, 0.05g의 아미노산 탈수소효소, NAD+ 0.256mg, 0.1M, pH 8.0의 인산칼륨 용액 1mL, 40℃, 100rpm이다.
활성 측정을 위한 샘플링 방법: 반응 시스템 0.5mL를 취하여, 12000rpm에서 5min 동안 원심분리하고, 상층액 0.050mL를 취하여 정제수 1mL를 첨가하고 잘 섞은 후 HPLC에 의해 형질전환율을 측정하였다.
e.e. 측정을 위한 샘플링 방법: 반응하여 형질전환이 완료된 시스템 1mL를 취하고 1M NaOH로 pH를 10 ~ 11로 조정하고; 0.1mL의 (BOC)2O를 30℃, 200rpm에서 0.5h 동안 추가하고, 1M NaOH로 pH를 10 ~ 11로 조정하되 30℃, 200rpm에서 0.5h 동안 조정하고; 동일한 부피의 이소프로필 아세테이트를 첨가하고 6M HCl로 pH를 2.0으로 조정하고; 시스템 0.5mL를 취하여 에틸 아세테이트 1mL를 첨가하고 흔들어 잘 섞은 후 12000rpm에서 5min 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 블로잉 건조시키고 무수 에탄올을 첨가하여 용해시키고 e.e.를 측정하였다. 결과는 표 8에 나타내었다.
| 돌연변이체 | 기질 1 | 기질 2 | 기질 3 | 기질 4 | ||||
| 활성 | e.e.% | 활성 | e.e.% | 활성 | e.e.% | 활성 | e.e.% | |
| K144G+L294I+L135V+FDH | +++++ | > 99 | +++++ | > 99 | +++++ | > 99 | +++++ | > 99 |
참고: -는 0.5 ~ 20%, +는 20 ~ 40%, ++는 40 ~ 60%, +++는 60 ~ 80%, ++++는 80 ~ 90%, +++++는 90%보다 큼을 나타낸다.
반응이 완료된 후 시스템의 온도를 10 ~ 30℃로 낮추고 10N 수산화나트륨으로 pH = 9.8 ~ 10.2로 조절한 후, boc 무수물을 첨가하고 10 ~ 30℃로 온도를 유지하면서 반응시켰다(pH = 9.8 ~ 10.2). 반응이 종료된 후 35% 황산으로 pH = 7.5 ~ 8.5로 조절하고, 10 부피의 이소프로필 아세테이트를 첨가하고 다시 35% 황산으로 pH = 1.8 ~ 2.2로 조절하고 5 ~ 10min 동안 교반하였다. 그 다음 규조토를 첨가하고, 시스템을 규조토로 덮인 압력여과조에 통과시키고, 필터 케이크를 5 부피의 이소프로필 아세테이트로 세척하고 합한 여과액을 10N 수산화나트륨으로 pH = 8.2 ~ 8.5로 조정하고, 1h 동안 교반한 후 액 분리가 일어나도록 방치하였다. 하부 수상에 15 부피의 이소프로필 아세테이트를 첨가하고 35% 황산으로 pH = 1.8 ~ 2.2로 조절하고 시스템의 온도를 약 40℃로 올린 후 온도를 유지하면서 3h 동안 교반한 후 액 분리가 일어나도록 1h 동안 방치하였다. 수상에 15V의 이소프로필 아세테이트를 첨가하고 온도를 약 40℃로 조절하고 온도를 3h 동안 유지한 후 액 분리가 일어나도록 1h 동안 방치하였다. 유기상을 합하고 온도를 T ≤ 50℃로 제어하고 약 9 부피로 농축한 후, 10 ~ 15min 이내에 온도를 82 ~ 89℃로 제어하고 20 부피의 n-헵탄을 추가하고, 시스템을 점차 냉각시키고 재킷 온도를 70℃로 제어하고 온도를 1시간 동안 유지하였다. 시스템을 40℃까지 계속 냉각시키고 온도를 0.5h 동안 유지한 후, 0 ~ 5℃까지 계속 냉각시키고 온도를 1h 동안 유지하였다. 시스템을 흡입 여과하고 필터 케이크를 10v의 n-헵탄으로 헹구고 생성물을 55℃에서 건조시켰다. 생성물 0.8g을 칭량하여 얻었고, 수율은 80%였다.
본 발명에서, 돌연변이 부위의 임의의 다른 조합도 더 좋은 효과를 가져올 수 있으며, 더 높은 상동성을 갖는 다른 아미노산 탈수소효소에서 돌연변이 부위를 반복하는 것도 더 좋은 효과를 가져올 수 있을 것이다.
이상의 설명은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과하며, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명에 다양한 수정 및 변경을 가할수 있을 것이다. 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 동등한 대체, 개선 등은 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다.
<110> ASYMCHEM LIFE SCIENCE (TIANJIN) CO., LTD.
<120> Amino Acid Dehydrogenase Mutant and Application thereof
<130> PN206605KLY
<150> 202110078514.9
<151> 2021-01-21
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 368
<212> PRT
<213> Thermoactinomyces intermedius ATCC33205
<400> 1
Met Arg Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val
1 5 10 15
Ile Phe Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu
20 25 30
His Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro
35 40 45
Tyr Ala Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys
50 55 60
Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly
65 70 75 80
Lys Met Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu
85 90 95
Phe Arg Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr
100 105 110
Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala
115 120 125
Arg Glu Ser Lys Ser Phe Leu Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys
130 135 140
Gly Asp Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg
145 150 155 160
Ala Thr Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val
165 170 175
Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Val Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val
195 200 205
Arg Cys Glu Gln Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Lys Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Val Asn Arg Ile His Lys Glu Ser Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Asp Asp Thr Ile Asp Glu Phe Arg Cys
245 250 255
Leu Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Asp Arg His
260 265 270
Gly Ala Leu Leu Gln Lys Arg Ser Ile Cys Tyr Ala Pro Asp Tyr Leu
275 280 285
Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Phe
290 295 300
His Glu Glu Arg Val Leu Ala Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Asp Met Val
305 310 315 320
Leu Asp Ile Phe His Arg Ala Lys Asn Glu Asn Ile Thr Thr Cys Glu
325 330 335
Ala Ala Asp Arg Ile Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Leu Thr Asp Ile
340 345 350
Arg Arg Ile Leu Leu Glu Asp Pro Arg Asn Ser Ala Arg Arg Leu Glu
355 360 365
<210> 2
<211> 1107
<212> DNA
<213> Thermoactinomyces intermedius ATCC33205
<400> 2
atgcgtgacg tattcgaaat gatggatcgc tacggccacg agcaggtgat tttctgtcgt 60
catccgcaga ctggcctgaa agcgatcatc gctctgcata acaccactgc cggtccggca 120
ctgggcggtt gtcgcatgat tccatacgca agcaccgatg aagctctgga agacgttctg 180
cgtctgagca aaggtatgac ctataaatgc tctctggcgg atgttgattt cggtggcggt 240
aaaatggtga ttatcggcga tccgaaaaag gataaaagcc cagaactgtt ccgtgttatc 300
ggtcgcttcg ttggcggcct gaacggtcgt ttctataccg gtactgatat gggcaccaat 360
ccggaagatt tcgtgcacgc cgctcgcgaa agcaaatctt ttctaggtct gcctaaatct 420
tacggtggta aaggtgacac ttctatcccg accgcactgg gtgtatttca cggcatgcgc 480
gcgaccgccc gctttctgtg gggcaccgat caactgaaag gtcgtgttgt tgctatccag 540
ggtgttggca aagtgggtga acgtctgctg cagctgctgg tggaagtggg tgcatactgc 600
aaaattgctg atattgactc tgtacgttgt gagcagctga aagaaaagta cggcgacaaa 660
gtccagctgg tagacgtgaa ccgtatccac aaagagtctt gtgacatctt ctccccgtgc 720
gcaaaaggcg gcgtagtcaa cgacgacact attgacgaat tccgctgcct ggcgattgtt 780
ggttccgcga acaatcagct ggttgaagat cgtcatggcg cgctgctgca aaaacgctcc 840
atttgctatg ccccggatta tctggttaac gctggcggtc tgatccaggt cgcagacgaa 900
ctggagggtt ttcacgagga gcgtgtgctg gcgaaaacgg aagccatcta cgacatggtt 960
ctggacatct tccaccgcgc taagaacgaa aacatcacta cctgcgaagc agcggaccgt 1020
atcgtaatgg aacgtctgaa gaagctgacg gacatccgtc gtatcctgct ggaagatccg 1080
cgtaactccg cgcgtcgtct cgagtga 1107
Claims (14)
- 아미노산 탈수소효소 돌연변이체로서,
상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생한 서열을 가지며, 상기 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 K144G 부위인 것을 특징으로 하는 아미노산 탈수소효소 돌연변이체. - 청구항 1에 있어서,
상기 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는, K144G+L294I, K144G+L294I+L135V, K144G+L294I+T115I, K144G+L41I, K144G+L41K, K144G+L41L, K144G+L41S, K144G+L41T, K144G+G42V, K144G+G43N, K144G+G114S, K144G+T115I, K144G+T115L, K144G+T115V, K144G+M117A, K144G+M117L, K144G+M117T, K144G+M117V, K144G+M117Y, K144G+G118A, K144G+G118H, K144G+G118N, K144G+G118Q, K144G+G118S, K144G+G118Y, K144G+T119A, K144G+T119C, K144G+T119E, K144G+T119L, K144G+T119N, K144G+T119S, K144G+P121M, K144G+P121S, K144G+P121T, K144G+P121W, K144G+L135I, K144G+L135V, K144G+K184H, K144G+K184M, K144G+K184N, K144G+K184S, K144G+G293A, K144G+G293P, K144G+G293S, 또는 K144G+L294V 중 어느 하나의 돌연변이 부위의 조합인 것을 특징으로 하는 아미노산 탈수소효소 돌연변이체. - 청구항 1에 있어서,
상기 아미노산 탈수소효소 돌연변이체는 K144G+L294I+L135V 아미노산 돌연변이를 가지며, 포름산 탈수소효소 FDH와 공동 발현(Coexpression)되는 것을 특징으로 하는 아미노산 탈수소효소 돌연변이체. - DNA 분자로서,
상기 DNA 분자는 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 아미노산 탈수소효소 돌연변이체를 암호화하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자. - 재조합 플라스미드로서,
상기 재조합 플라스미드에는 청구항 4에 따른 DNA 분자가 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드. - 청구항 5에 있어서,
상기 재조합 플라스미드는, pET-22a(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b, pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-8, pUC-18, pRSFDuet1, 또는 pUC-19인 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드. - 숙주 세포로서,
상기 숙주 세포는 청구항 5 또는 청구항 6에 따른 재조합 플라스미드를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 청구항 7에 있어서,
상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 청구항 8에 있어서,
상기 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이고, 상기 진핵 세포는 효모인 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 아미노산 탈수소효소를 사용하여 케톤계 화합물에 대해 촉매 환원적 아미노화 반응을 진행하는 단계를 포함하는 아미노산 생산 방법으로서,
상기 아미노산 탈수소효소는 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 아미노산 탈수소효소 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 아미노산 생산 방법. - 청구항 10에 있어서,
상기 케톤계 화합물은 이고, 환원적 아미노화 반응의 생성물은 이며,
상기 식에서 R1은 -OH, -F, -Cl, -Br, 또는 -CH3이고, R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 -H, -OH, -F, -Cl, -Br, 또는 -CH3인 것을 특징으로 하는 아미노산 생산 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 케톤계 화합물은 , , , 또는 인 것을 특징으로 하는 아미노산 생산 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 촉매 환원적 아미노화 반응에서의 아미노 공여체는 포름산암모늄, 염화암모늄, 카르밤산암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소암모늄, 암모니아수, 옥살산암모늄, 옥살산수소암모늄, 젖산암모늄 또는 인산암모늄인 것을 특징으로 하는 아미노산 생산 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 아미노산 탈수소효소에 의한 촉매 환원적 아미노화 반응의 조건은 30 ~ 50℃, 교반 회전 속도 50 ~ 250rpm이고,
상기 촉매 환원적 아미노화 반응은 포름산 탈수소효소 0.1 mg/mL ~ 1 mg/mL를 사용하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 생산 방법.
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