JP7498244B2 - モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、生物技術分野に関し、具体的には、モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその使用に関する。
従来の化学酸化剤はほとんど毒性及び／又は爆発的なものであり、且つ立体特異性がとても低く、環境配慮性及び高い光学純度の医薬品や農業用化学品の合成のニーズに応えて、新規な酸化剤の開発が行われている。シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）は還元型補酵素Ｉ（ＮＡＤＰＨ）依存型酸化酵素であり、ケトン、アルデヒドや一部の硫化物、セレン化物の酸化反応を触媒することができる。モノオキシゲナーゼは有機合成に広く使用されており、優れた選択性、可制御性及び経済性を有する。
キラル医薬品の合成では、通常、製品の立体配置が異なると、その機能や毒性が大きく異なり、このため、高い光学純度のキラル化合物を得ることは製薬の研究開発において非常に重要なことである。最近数十年間、モノオキシゲナーゼは生物触媒剤として立体特異的な反応の触媒に用いられ、それにより一連の価値のあるキラル化合物を合成する[Protein Engineering of Stereoselective BaeyerーVilliger Monooxygenases] .[J]. Chemistry - A European Journal, 2012, 18(33)。
ペネム系抗生物質の１種であるスロペネムは、米国のＰｆｉｚｅｒ社により研究・開発されたものであり、注射用ペネム系抗生物質であり、抗菌スペクトルが広く、抗菌活性が高く、β－ラクタマーゼにより加水分解されにくいなどの特性を有する[Antibacterial activity of sulopenem, a new parenteral penem antibiotic].[J]. Japanese Journal of Antibiotics, 1996, 49(4):338。世界の抗生物質の市場では、ますます重要な地位を占めている。
生物酵素法を用いて不斉合成を行う手段は、自体の高選択性及び環境配慮性などの優位性のため、ますます注目されている。（Ｒ）－３－ヒドロキシ－テトラヒドロチオフェンは、抗生物質であるスロペネムなどの複数の医薬品を生産するための重要な中間体であり、スロペネム側鎖を酵素で触媒合成する方法（以下の図を参照）では、我々がタンパク質改変によって、既に選択性と活性の両方が大幅に向上したケトレダクターゼ突然変異体を獲得し、第１のステップである３－ケトテトラヒドロチオフェンの（Ｒ）－３－ヒドロキシ－テトラヒドロチオフェンへの転化を触媒することができる［特許：ケトレダクターゼ突然変異体及びその使用（公開番号ＣＮ１０８０４８４１７Ａ）］。第２のステップである酵素触媒反応において、モノオキシゲナーゼ置換化学法を用いて（Ｒ）－３－ヒドロキシ－テトラヒドロチオフェンの酸化反応を行うことができ、このように、化学発熱反応が回避されながら、高い光学純度の製品として（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンが生成される。
しかしながら、現在、野生型のモノオキシゲナーゼには、選択性が極めて低く、活性が悪いなどの欠陥が存在し、工業化を実現するには、かなりの努力がまだ必要とされる。一般には、タンパク質工程の手段を通じて野生酵素を改変することにより、酵素の立体特異性及び活性を向上させ、工業的生産に利用可能とすることが可能である。
本発明は、モノオキシゲナーゼの選択性が悪く、酵素活性が低いという従来技術の技術的問題を解決するために、モノオキシゲナーゼ突然変異体及びその使用を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明の一態様によれば、モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供する。
該モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得たアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも、４９位、６０位、６１位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１６７位、１６９位、１８９位、２４６位、２４７位、２８０位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、３２８位、３３０位、３３２位、３８２位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３８位、４４１位、４９３位、４９４位、５０８位、５０９位、５１０位、５１１位、５１２位、及び５１３位の突然変異部位のうちの１つを含み、且つ突然変異は、４９位のトリプトファンのアラニンへの突然変異、６０位のアスパラギン酸のロイシンへの突然変異、６１位のスレオニンのグルタミンへの突然変異、１４４位のバリンのグルタミン酸への突然変異、１４５位のグリシンのフェニルアラニンへの突然変異、１４６位のロイシンのフェニルアラニン又はチロシンへの突然変異、１４７位のロイシンのメチオニン、スレオニン又はチロシンへの突然変異、１６７位のヒスチジンのトリプトファンへの突然変異、１６９位のアラニンのリジンへの突然変異、１８９位のセリンのメチオニンへの突然変異、２４６位のアラニンのバリンへの突然変異、２４７位のバリンのスレオニンへの突然変異、２８０位のフェニルアラニンのチロシン、トリプトファン又はバリンへの突然変異、２８４位のフェニルアラニンのセリンへの突然変異、２８５位のグリシンのアラニンへの突然変異、２８６位のスレオニンのアラニンへの突然変異、２８７位のフェニルアラニンのアスパラギン酸への突然変異、３２８位のアラニンのアスパラギンへの突然変異、３３０位のアルギニンのアラニンへの突然変異、３３２位のロイシンのアルギニンへの突然変異、３８２位のグリシンのアラニンへの突然変異、４２７位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異、４２８位のバリンのアラニンへの突然変異、４２９位のロイシンのチロシンへの突然変異、４３０位のグリシンのアラニンへの突然変異、４３１位のプロリンのアラニンへの突然変異、４３２位のアスパラギンのチロシンへの突然変異、４３３位のグリシンのチロシンへの突然変異、４３４位のプロリンのアラニンへの突然変異、４３５位のフェニルアラニンのセリン、アラニン、アスパラギン又はチロシンへの突然変異、４３６位のスレオニンのアラニン、セリン、グリシン、グルタミン酸又はシステインへの突然変異、４３８位のロイシンのグリシン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン又はセリンへの突然変異、４４１位のセリンのロイシンとバリンへの突然変異、４９３位のトリプトファンのアラニンへの突然変異、４９４位のイソロイシンのアラニン、メチオニン又はセリンへの突然変異、５０８位のフェニルアラニンのチロシン、メチオニン又はアスパラギンへの突然変異、５０９位のチロシンのメチオニンへの突然変異、５１０位のロイシンのバリンへの突然変異、５１１位のグリシンのロイシンへの突然変異、５１２位のグリシンのイソロイシンへの突然変異、５１３位のロイシンのバリンへの突然変異であり、又はモノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、突然変異は、少なくとも、Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｆ４３５Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｌ４３８Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ４３５Ｎ＋Ｔ４３６Ａ、Ｌ１４６Ｙ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｌ１４６Ｆ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｌ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｓ４４１Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｉ４９４Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｔ６１Ｑ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ１４５Ｆ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ａ１６９Ｋ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｓ１８９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ３３２Ｒ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ａ３２８Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｉ４９４Ａ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ５１２Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｗ４９Ａ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｖ１４４Ｅ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｇ１４５Ｆ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｈ１６７Ｗ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ１６９Ｋ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ１７９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ２４６Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｇ２８５Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｔ２８６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ３３２Ｒ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ３２８Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ３８２Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｍ４２７Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｖ４２８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｐ４３１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ４３３Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｐ４３４Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ５１１Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ５１２Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｌ５１３Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｐ４３１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ａ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｆ２８５Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｐ４３４Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｔ２８６Ａ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｆ２８７Ｄ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｖ１４４Ｅ＋Ｇ１４５Ｆ＋Ｍ４２７Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｌ３２２Ｒ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｐ３２１Ａ＋Ｇ５１２Ｉ、及びＦ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｇ４３０Ａの突然変異部位の組み合わせのうちの１つを含む。
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記のいずれか１つのモノオキシゲナーゼ突然変異体をコードする。
本発明のさらなる態様によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記のいずれか１つのＤＮＡ分子を含有する。
さらに、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である。
本発明の別の態様によれば、宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、上記のいずれか１つの組換えプラスミドを含有する。
さらに、宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。
本発明の別の態様によれば、上記のいずれか１つのモノオキシゲナーゼ突然変異体の、チオエーテル系化合物又はケトン系化合物の一原子酸素添加反応の触媒における使用を提供する。
さらに、チオエーテル系化合物は
であり、ここで、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示し、Ｒ1及びＲ2は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができ、
好ましくは、Ｒ1及びＲ2は、炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、より好ましくは炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、
好ましくは、アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フラニルオキシ基、及びピロリルオキシ基を含み、
好ましくは、アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、及びシクロヘプチル基を含み、
好ましくは、アラルキル基はベンジル基であり、
好ましくは、置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基で置換されたことを意味する。
であり、ここで、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示し、Ｒ1及びＲ2は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができ、
好ましくは、Ｒ1及びＲ2は、炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、より好ましくは炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、
好ましくは、アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フラニルオキシ基、及びピロリルオキシ基を含み、
好ましくは、アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、及びシクロヘプチル基を含み、
好ましくは、アラルキル基はベンジル基であり、
好ましくは、置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基で置換されたことを意味する。
さらに、ケトン系化合物は
であり、ここで、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示し、Ｒ3及びＲ4は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができ、
好ましくは、Ｒ3及びＲ4は、炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、より好ましくは炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、
好ましくは、アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フラニルオキシ基、及びピロリルオキシ基を含み、
好ましくは、アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、及びシクロヘプチル基を含み、
好ましくは、アラルキル基はベンジル基であり、
好ましくは、置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基で置換されたことを意味する。
であり、ここで、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示し、Ｒ3及びＲ4は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができ、
好ましくは、Ｒ3及びＲ4は、炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、より好ましくは炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、
好ましくは、アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フラニルオキシ基、及びピロリルオキシ基を含み、
好ましくは、アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、及びシクロヘプチル基を含み、
好ましくは、アラルキル基はベンジル基であり、
好ましくは、置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基で置換されたことを意味する。
さらに、使用はスロペネム側鎖合成である。
さらに、モノオキシゲナーゼは、上記のいずれか１つのモノオキシゲナーゼ突然変異体の溶液、凍結乾燥粉末、固定化酵素又は固定化細胞である。
さらに、一原子酸素添加反応の反応系には補因子がさらに含まれ、補因子はＮＡＤ+/ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰ+/ＮＡＤＰＨであり、補因子循環系はグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、グルコース６－リン酸とグルコース－６－リン酸脱水素酵素、又は第二級アルコールと第二級アルコール脱水素酵素を含む。
さらに、一原子酸素添加反応の温度は１０～３７℃で、好ましくは１５～３５℃である。
さらに、一原子酸素添加反応の時間は３～４８時間で、より好ましくは６～１６時間である。
さらに、一原子酸素添加反応は、ｐＨ５.０～１０.０の条件で、好ましくはｐＨ６.０～９.０の条件で行われる。
本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるモノオキシゲナーゼを基に、部位特異的突然変異の方法により突然変異させることにより、そのアミノ酸配列を変えることで、タンパク質の構造及び機能を変え、次に標的スクリーニングの方法により、上記突然変異部位を有するモノオキシゲナーゼを得るものであり、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、立体特異性が大幅に向上するという優位性を有し、しかも酵素活性もその分向上する。
なお、矛盾しない限り、本出願の実施例及び実施例の特徴は互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照しながら本発明を詳しく説明する。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のモノオキシゲナーゼは、チオエーテル系化合物及びケトン系化合物の反応を触媒できるものの、その活性が低く、立体特異性が悪く、特に（Ｒ）－３－ヒドロキシ－テトラヒドロチオフェンの酸化を触媒反応する場合に、得られる製品は立体配置が目標産物と反対のＳ型である。本発明は、タンパク質工学の方法によってモノオキシゲナーゼの立体特異性を向上させ、モノオキシゲナーゼの活性を向上させ、酵素触媒特性が改善された突然変異体を得て、キラル化合物の製造過程において酵素の使用量を減らし、高い光学純度の製品を得ることを図る。
本発明の発明者は、指向性進化の方法によってモノオキシゲナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の活性及び立体特異性を向上させ、酵素の使用量を低下させる。まず、全プラスミドＰＣＲの方式でモノオキシゲナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１上に突然変異部位を導入し、突然変異体について活性及び立体特異性を検出し、活性又は立体特異性が向上した突然変異体を選別する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は以下に示される。ＭＴＡＱＩＳＰＴＶＶＤＡＶＶＩＧＡＧＦＧＧＩＹＡＶＨＫＬＨＮＥＱＧＬＴＶＶＧＦＤＫ ＡＤＧＰＧＧＴＷＹＷＮＲＹＰＧＡＬＳＤＴＥＳＨＬＹＲＦＳＦＤＲＤＬＬＱＤＧＴＷＫＴＴＹＩＴＱＰＥＩＬＥＹＬＥＳＶＶＤＲＦＤＬＲＲＨＦＲＦＧＴＥＶＴＳＡＩＹＬＥＤＥＮＬＷＥＶＳＴＤＫＧＥＶＹＲＡＫＹＶＶＮＡＶＧＬＬＳＡＩＮＦＰＤＬＰＧＬＤＴＦＥＧＥＴＩＨＴＡＡＷＰＥＧＫＮＬＡＧＫＲＶＧＶＩＧＴＧＳＴＧＱＱＶＩＴＡＬＡＰＥＶＥＨＬＴＶＦＶＲＴＰＱＹＳＶＰＶＧＮＲＰＶＴＫＥＱＩＤＡＩＫＡＤＹＤＧＩＷＤＳＶＫＫＳＡＶＡＦＧＦＥＥＳＴＬＰＡＭＳＶＳＥＥＥＲＮＲＩＦＱＥＡＷＤＨＧＧＧＦＲＦＭＦＧＴＦＧＤＩＡＴＤＥＡＡＮＥＡＡＡＳＦＩＲＳＫＩＡＥＩＩＥＤＰＥＴＡＲＫＬＭＰＴＧＬＹＡＫＲＰＬＣＤＮＧＹＹＥＶＹＮＲＰＮＶＥＡＶＡＩＫＥＮＰＩＲＥＶＴＡＫＧＶＶＴＥＤＧＶＬＨＥＬＤＶＬＶＦＡＴＧＦＤＡＶＤＧＮＹＲＲＩＥＩＲＧＲＮＧＬＨＩＮＤＨＷＤＧＱＰＴＳＹＬＧＶＴＴＡＮＦＰＮＷＦＭＶＬＧＰＮＧＰＦＴＮＬＰＰＳＩＥＴＱＶＥＷＩＳＤＴＶＡＹＡＥＲＮＥＩＲＡＩＥＰＴＰＥＡＥＥＥＷＴＱＴＣＴＤＩＡＮＡＴＬＦＴＲＧＤＳＷＩＦＧＡＮＶＰＧＫＫＰＳＶＬＦＹＬＧＧＬＧＮＹＲＮＶＬＡＧＶＶＡＤＳＹＲＧＦＥＬＫＳＡＶＰＶＴＡ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をテンプレートとして、６０対の部位特異的突然変異プライマー（突然変異部位は４９位、６０位、６１位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１６７位、１６９位、１８９位、２４６位、２４７位、２８０位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、３２８位、３３０位、３３２位、３８２位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３８位、４４１位、４９３位、４９４位、５０８位、５０９位、５１０位、５１１位、５１２位、５１３位などである）が設計されて、部位特異的突然変異手段によって、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）を発現ベクターとして、目的遺伝子を有する突然変異プラスミドを獲得する。
ここで、部位特異的突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法により目的ＤＮＡ断片（ゲノムであってもよいし、プラスミドであってもよい）に、塩基の添加、削除、部位突然変異など、所望の変化（通常、有利な方向を特徴付ける変化）を導入することである。部位特異的突然変異は、ＤＮＡが発現する目的タンパク質の性状及び特徴を迅速且つ効率よく向上させることができ、遺伝子研究において極めて有用な手段である。
全プラスミドＰＣＲによる部位特異的突然変異の導入方法は、簡単で効果的であり、現在よく使用されている手段である。その原理は、突然変異部位を含む１対のプライマー（順方向、逆方向）とテンプレートプラスミドとを、アニーリングした後に、ポリメラーゼで「サイクル伸長」することである。いわゆるサイクル伸長とは、ポリメラーゼがテンプレートに従ってプライマーを伸長し、一周後、プライマー５’末端に戻って終了し、次に、加熱・アニーリング・伸長のサイクルを繰り返すことを意味し、この反応は、ローリングサークル増幅とは異なり、複数のタンデムコピーを形成することがない。
順方向・逆方向プライマーの伸長産物は、アニーリング後ペアリングして、ニック付きの開環プラスミドとなる。ｄａｍ＋菌株由来のテンプレートＤＮＡは、メチル化部位を有するため、Ｄｐｎ Ｉ酵素により識別・切断可能であり、一方、インビトロで合成された突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されていないので消化されず、大腸菌に形質転換した後に、ニックが自然に修復され、このように、突然変異プラスミドを有するクローンが得られる。突然変異プラスミドを大腸菌コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ固体培地（１００μg/mLアンピシリン）を含む培養皿に塗布し、３７℃で一晩培養する。固体培地で成長した単一クローンに対して活性化を行う。シーケンシングにより正確に同定した後に、２５℃、０.２mM IPTGの条件下で、一晩放置してモノオキシゲナーゼの発現を誘導する。その後、細胞を遠心、超音波破砕する方法によって粗酵素液を得て、反応特性検出に用いる。
触媒特性が向上した突然変異体を単一部位突然変異により得た上、有益な部位を組み合わせて、性状がより良好な突然変異体を得ることができる。組み合わせ突然変異のうち二重部位突然変異の構築方法は、単一部位突然変異の構築方法と同様に、全プラスミドＰＣＲ法を用いたものである。また、２以上の部位が突然変異した複数部位の突然変異は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ増幅を用いて行われ、複数部位の突然変異を含む突然変異遺伝子が得られ、両端が制限エンドヌクレアーゼで二重消化された後に、発現ベクターに接続され、大腸菌細胞に形質転換され、１００μg/mLアンピシリンを含有するＬＢ培養皿に塗布され、３７℃で一晩培養すると、組み合わせ突然変異体が得られ、シーケンシングにより同定される。
オーバーラップ伸長ＰＣＲ技術（ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ、略語ＳＯＥＰＣＲ）は、相補末端を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ産物にオーバーラップ鎖を形成させ、それにより、後続の増幅反応においてオーバーラップ鎖の伸長を通じて、由来の異なる増幅断片をオーバーラップさせて接合することである。この技術は、ＰＣＲ技術を用いてインビトロで遺伝子組換えを効果的に行うことができ、複数部位の突然変異の構築によく使用されている。
コンピュータを用いてモノオキシゲナーゼと基質の三次元構造についてドッキングシミュレーション解析を行ったところ、酵素触媒中心付近に基質から５Å離れたアミノ酸が見つけられ、これは、基質に対する酵素の立体特異性及び活性に緊密に繋がる可能性がある。複数部位組み合わせ突然変異を基に、影響を与える可能性のあるアミノ酸部位について反復飽和突然変異を行い、活性及び立体特異性の両方が大幅に向上した突然変異体を得ることが可能である。
飽和突然変異とは、目的タンパク質のコード遺伝子を改変し、ターゲット部位であるアミノ酸がそれぞれ他の１９種類のアミノ酸で置き換えられた突然変異体を短時間で取得する方法である。この方法は、タンパク質を標的に改変するために有用なツールであるだけでなく、タンパク質構造－機能の関係を研究するための重要な手段である。飽和突然変異によれば、単一部位突然変異よりも好適な進化体を得る場合が多い。部位特異的突然変異方法により解決できないこれらの問題は、飽和突然変異方法の得意なところである。
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、モノオキシゲナーゼ突然変異体を提供する。
該モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得たアミノ酸配列であり、前記突然変異は、少なくとも、４９位、６０位、６１位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１６７位、１６９位、１８９位、２４６位、２４７位、２８０位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、３２８位、３３０位、３３２位、３８２位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３８位、４４１位、４９３位、４９４位、５０８位、５０９位、５１０位、５１１位、５１２位、及び５１３位の突然変異部位のうちの１つを含み、且つ前記突然変異は、４９位のトリプトファンのアラニンへの突然変異、６０位のアスパラギン酸のロイシンへの突然変異、６１位のスレオニンのグルタミンへの突然変異、１４４位のバリンのグルタミン酸への突然変異、１４５位のグリシンのフェニルアラニンへの突然変異、１４６位のロイシンのフェニルアラニン又はチロシンへの突然変異、１４７位のロイシンのメチオニン、スレオニン又はチロシンへの突然変異、１６７位のヒスチジンのトリプトファンへの突然変異、１６９位のアラニンのリジンへの突然変異、１８９位のセリンのメチオニンへの突然変異、２４６位のアラニンのバリンへの突然変異、２４７位のバリンのスレオニンへの突然変異、２８０位のフェニルアラニンのチロシン、トリプトファン又はバリンへの突然変異、２８４位のフェニルアラニンのセリンへの突然変異、２８５位のグリシンのアラニンへの突然変異、２８６位のスレオニンのアラニンへの突然変異、２８７位のフェニルアラニンのアスパラギン酸への突然変異、３２８位のアラニンのアスパラギンへの突然変異、３３０位のアルギニンのアラニンへの突然変異、３３２位のロイシンのアルギニンへの突然変異、３８２位のグリシンのアラニンへの突然変異、４２７位のメチオニンのイソロイシンへの突然変異、４２８位のバリンのアラニンへの突然変異、４２９位のロイシンのチロシンへの突然変異、４３０位のグリシンのアラニンへの突然変異、４３１位のプロリンのアラニンへの突然変異、４３２位のアスパラギンのチロシンへの突然変異、４３３位のグリシンのチロシンへの突然変異、４３４位のプロリンのアラニンへの突然変異、４３５位のフェニルアラニンのセリン、アラニン、アスパラギン又はチロシンへの突然変異、４３６位のスレオニンのアラニン、セリン、グリシン、グルタミン酸又はシステインへの突然変異、４３８位のロイシンのグリシン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン又はセリンへの突然変異、４４１位のセリンのロイシンとバリンへの突然変異、４９３位のトリプトファンのアラニンへの突然変異、４９４位のイソロイシンのアラニン、メチオニン又はセリンへの突然変異、５０８位のフェニルアラニンのチロシン、メチオニン又はアスパラギンへの突然変異、５０９位のチロシンのメチオニンへの突然変異、５１０位のロイシンのバリンへの突然変異、５１１位のグリシンのロイシンへの突然変異、５１２位のグリシンのイソロイシンへの突然変異、５１３位のロイシンのバリンへの突然変異であり、又は、前記モノオキシゲナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、前記突然変異が発生したアミノ酸配列における前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異が発生したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
反応したところ、ｅｅ値及び活性が向上した突然変異体を得ることが検証された。具体的には、好ましくは、以下の組み合わせを含む。
突然変異は、少なくとも、Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｆ４３５Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｌ４３８Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ４３５Ｎ＋Ｔ４３６Ａ、Ｌ１４６Ｙ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｌ１４６Ｆ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ２８０Ｙ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ４３５Ｓ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｍ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｎ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｆ５０８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｌ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｓ４４１Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｉ４９４Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｔ６１Ｑ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ１４５Ｆ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ａ１６９Ｋ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｓ１８９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ３３２Ｒ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ａ３２８Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｉ４９４Ａ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ５１２Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｗ４９Ａ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｖ１４４Ｅ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｇ１４５Ｆ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｈ１６７Ｗ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ１６９Ｋ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ１７９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ２４６Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｇ２８５Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｔ２８６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ３３２Ｒ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ３２８Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ３８２Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｍ４２７Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｖ４２８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｐ４３１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ４３３Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｐ４３４Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ５１１Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ５１２Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｌ５１３Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｐ４３１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ａ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｆ２８５Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｐ４３４Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｔ２８６Ａ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｆ２８７Ｄ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｖ１４４Ｅ＋Ｇ１４５Ｆ＋Ｍ４２７Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｌ３２２Ｒ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｐ３２１Ａ＋Ｇ５１２Ｉ、及びＦ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｇ４３０Ａ、及びＦ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｇ４３０Ａの突然変異部位の組み合わせのうちの１つを含む。
説明しやすくするために、４３５位のフェニルアラニンのアラニンへの突然変異と、５０８位のフェニルアラニンのチロシンへの突然変異は、Ｆ４３５Ａ＋Ｆ５０８Ｙとして記載され、他の表現も同様である。
本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるモノオキシゲナーゼを基に、部位特異的突然変異の方法により突然変異させることにより、そのアミノ酸配列を変えることで、タンパク質の構造及び機能を変え、次に標的スクリーニングの方法により、上記突然変異部位を有するモノオキシゲナーゼを得るものであり、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体は、立体特異性が大幅に向上するという優位性を有し、しかも酵素活性もその分向上する。
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記モノオキシゲナーゼ突然変異体をコードする。上記ＤＮＡでコードして得たモノオキシゲナーゼは、酵素活性及び酵素の立体特異性が向上し、チオエーテル系化合物又はケトン系化合物の一原子酸素添加反応の触媒において酵素添加量を減らし、後続の難度を低減させることができる。
本発明の上記ＤＮＡ分子は「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは、線状又は環状の核酸分子のことであり、特定のヌクレオチド配列が適切な宿主細胞にて発現することをガイドし得るＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む。一般には、目標ヌクレオチドに効果的に連結されたプロモータを含み、このプロモータは、任意選択に、終了信号及び／又は他の調節エレメントに効果的に連結される。発現カセットは、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列をさらに含んでもよい。
コード領域は通常、目標タンパク質をコードするが、センス方向又はアンチセンス方向においては目的機能ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳のＲＮＡもコードする。目標ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラのものであってもよく、それは、その少なくとも１つの成分がその少なくとも１つの別の成分とは異種であることを意味する。発現カセットは、天然に存在するものであってもよいが、異種発現用の効果的な組換えにより得られる。
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記のいずれか１つのＤＮＡ分子を含有する。上記組換えプラスミドにおけるＤＮＡ分子は、組換えプラスミドの適切な位置に配置され、上記ＤＮＡ分子が正確且つ順調に複製、転写又は発現することを可能とする。
本発明では、上記ＤＮＡ分子を限定する時に「含有」という限定用の用語が使用されているが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と無関係な他の配列を勝手に追加するわけではない。当業者が分かるように、組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼの消化部位を追加したり、又は開始コドン、停止コドンなどを付加的に増加したりする必要があり、このため、クローズ表現を用いて限定すると、このような状況を確実にカバーすることができない。
本発明で使用される用語「プラスミド」は、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状の形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はアグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは組換え発現プラスミドであり、原核発現プラスミドであっても、真核発現プラスミドであってもよいが、原核発現プラスミドが好ましい。
いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９から選ばれる。
より好ましくは、上記組換えプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ（＋）である。
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、上記のいずれか１つの組換えプラスミドを含有する。本発明に適用できる宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含むが、これらに制限されない。好ましくは、原核細胞は真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。より好ましくは、原核細胞は大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。モノオキシゲナーゼの誘導発現の最適な条件：２５℃、０.２mM IPTG１６ｈ誘導である。突然変異プラスミドを大腸菌細胞に形質転換し、次に、細胞を超音波破砕する方法により粗酵素を得る。
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、モノオキシゲナーゼ突然変異体の、チオエーテル系化合物又はケトン系化合物の一原子酸素添加反応の触媒における使用を提供する。ここで、モノオキシゲナーゼは、上記のいずれか１つのモノオキシゲナーゼ突然変異体である。本発明の上記モノオキシゲナーゼ突然変異体がより高い酵素触媒活性を有するため、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体を用いて工業的な生産を行うと、生産コストを削減できるだけでなく、より高純度のキラル製品を得る。
本発明の１つの代表的な実施形態において、チオエーテル系化合物は
であり、上記式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示す。
であり、上記式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示す。
また、Ｒ1及びＲ2は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができる。Ｒ1及びＲ2は、好ましくは炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、より好ましくは炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基である。
アリール基として、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フラニルオキシ基、ピロリルオキシ基などが挙げられる。
アルキル基として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘプチル基などが挙げられる。アラルキル基として、ベンジル基などが挙げられる。これらの基はさらに置換されてもよく、その置換基として、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基などが挙げられる。
また、環の形成もこれらの置換基を介してもよい。ケトン系化合物は
であり、上記式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示す。
であり、上記式中、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示す。
また、Ｒ3及びＲ4は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができる。Ｒ3及びＲ4は、好ましくは炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基であり、より好ましくは炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基である。
アリール基として、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フラニルオキシ基、ピロリルオキシ基などが挙げられる。
アルキル基として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘプチル基などが挙げられる。アラルキル基として、ベンジル基などが挙げられる。これらの基はさらに置換されてもよく、その置換基として、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基などが挙げられる。また、環の形成もこれらの置換基を介してもよい。
反応式は以下のとおりである。
本発明の１つの代表的な実施形態において、本発明のモノオキシゲナーゼ突然変異体はスロペネム側鎖合成に使用され、反応式は以下のとおりである。
本発明で得られたモノオキシゲナーゼ突然変異体は、スロペネム側鎖の合成に使用することができ、放熱反応を回避し、高い光学純度の（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン（転換率＞９９％、ｅｅ値９５.０％）が得られ、この化合物の工業的生産のコストを大幅に削減させ、工業的生産におけるこの酵素の価値を高める。
モノオキシゲナーゼは、モノオキシゲナーゼ突然変異体の溶液、凍結乾燥粉末、固定化酵素又は固定化細胞であってもよい。
好ましくは、一原子酸素添加反応を触媒する補因子はＮＡＤ+/ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰ+/ＮＡＤＰＨであり、補因子循環系はグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、グルコース６－リン酸とグルコース－６－リン酸脱水素酵素、第二級アルコール（例えばイソプロパノール）及び／又は第二級アルコール脱水素酵素及び類似の系を含み、最も好ましくはイソプロパノールとアルコール脱水素酵素が使用される。
好ましくは、一原子酸素添加反応の触媒温度は１０～３７℃で、より好ましくは１５～３５℃であり、一原子酸素添加反応の触媒時間は３～４８ｈで、より好ましくは６～１６ｈであり、一原子酸素添加反応の触媒は、ｐＨ６.０～１０.０の条件で、より好ましくはｐＨ６.０～９.０の条件で行われ、このような反応条件では、酵素の触媒性能をよりよく発揮できる。
以下、実施例にて本発明の有益な効果をさらに説明する。
実施例１
モノオキシゲナーゼの部位特異的突然変異により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応を行った。
モノオキシゲナーゼの部位特異的突然変異により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応を行った。
１６ｈ後、反応系を７００μL取り、それに無水エタノール１.４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清に無水ＭｇＳＯ4を０.５ｇ加えて水を除去し、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＮ2で吹き乾かした後に、無水エタノール７００μLで再溶解し、ＧＣ分析に送った。一部の突然変異体の反応特性を以下の表１に示す。
転換率は１０％～５０％では＋、５０％～９０％では＋＋、９０％以上では＋＋＋であり、ｅｅ値は、－９９％～－５０％では＊、－５０％～０％では＊＊である。
単一部位突然変異体は、立体特異性も活性も原種よりも向上しているが、最適な効果を達成させず、このため、有益な活性部位の異なる組み合わせにより、より優れた突然変異体を獲得することができる。
実施例２
モノオキシゲナーゼの組み合わせ突然変異により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０ｍＬガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００ｍｇをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
モノオキシゲナーゼの組み合わせ突然変異により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０ｍＬガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００ｍｇをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
１６ｈ後に、反応系を７００μL取り、それに無水エタノール１.４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清に無水ＭｇＳＯ4を０.５ｇ加えて水を除去し、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＮ2で吹き乾かした後に、無水エタノール７００μLで再溶解し、ＧＣ分析に送った。一部の突然変異体の反応特性を以下の表２に示す。
転換率は、１０％～５０％では＋、５０％～９０％では＋＋、９０％以上では＋＋＋であり、ｅｅ値は、－９９％～－５０％では＊、－５０％～０％では＊＊、０％～２０％では＊＊＊、２０％～６０％では＊＊＊＊、６０％～８０％では＊＊＊＊＊、８０％～９９％では＊＊＊＊＊＊である。
実施例３
モノオキシゲナーゼの飽和突然変異により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０ｍＬ、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
モノオキシゲナーゼの飽和突然変異により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０ｍＬ、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
１６ｈ後に、反応系を７００μL取り、それに無水エタノール１.４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清に無水ＭｇＳＯ4を０.５ｇ加えて水を除去し、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＮ2で吹き乾かした後に、無水エタノール７００μLで再溶解し、ＧＣ分析に送った。一部の突然変異体の反応特性を以下の表３に示す。
活性は、転換率１０％～５０％では＋、５０％～９０％では＋＋、９０％以上では＋＋＋であり、ｅｅ値は、－９９％～－５０％では＊、－５０％～０％では＊＊、０％～２０％では＊＊＊、２０％～６０％では＊＊＊＊、６０％～８０％では＊＊＊＊＊、８０％～９９％では＊＊＊＊＊＊である。
反復飽和突然変異によって、立体特異性が向上した突然変異部位をオーバーラップして、ｅｅ値が安定的に向上した突然変異体が得られ、また、予備スクリーニングにより得られた活性部位のアミノ酸に対して組み合わせ飽和突然変異を行うことにより、進化過程において、進化結果が局所の最高点のみに限られてしまい、全体的な最高点に到達できないことを回避する。最終的には、立体特異性及び活性が最適な突然変異体が得られる。
実施例４
部分的突然変異体により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
部分的突然変異体により（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを製造する反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
１６ｈ後に、反応系を７００μL取り、それに無水エタノール１.４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清に無水ＭｇＳＯ4を０.５ｇ加えて水を除去し、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＮ2で吹き乾かした後に、無水エタノール７００μLで再溶解し、ＧＣ分析に送った。一部の突然変異体の反応特性を以下の表４に示す。
活性は、転換率１０％～５０％では＋、５０％～９０％では＋＋、９０％以上では＋＋＋であり、ｅｅ値は、－９９％～－５０％では＊、－５０％～０％では＊＊、０％～２０％では＊＊＊、２０％～６０％では＊＊＊＊、６０％～８０％では＊＊＊＊＊、８０％～９９％では＊＊＊＊＊＊である。
実施例５
（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンの製造におけるモノオキシゲナーゼの使用
５００mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１ｇをイソプロパノール８.５mLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整し、モノオキシゲナーゼ２ｇ、イソプロパノール脱水素酵素０.４ｇ、５００μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０．１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に滴下し、反応総体積を１００ｍＬ、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
（Ｒ,Ｒ）－１－オキシ－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェンの製造におけるモノオキシゲナーゼの使用
５００mLガラス三角フラスコにて、（Ｒ）－３－ヒドロキシテトラヒドロチオフェン１ｇをイソプロパノール８.５mLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整し、モノオキシゲナーゼ２ｇ、イソプロパノール脱水素酵素０.４ｇ、５００μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０．１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に滴下し、反応総体積を１００ｍＬ、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
１６ｈ後に、反応系を７００μL取り、それに無水エタノール１．４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清に無水ＭｇＳＯ4を０.５ｇ加えて水を除去し、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＮ2で吹き乾かした後に、無水エタノール７００μLで再溶解し、ＧＣ分析に送り、反応結果を以下の表５に示す。
活性は、転換率１０％～５０％では＋、５０％～９０％では＋＋、９０％以上では＋＋＋であり、ｅｅ値は、－９９％～－５０％では＊、－５０％～０％では＊＊、０％～２０％では＊＊＊、２０％～６０％では＊＊＊＊、６０％～８０％では＊＊＊＊＊、８０％～９９％では＊＊＊＊＊＊であり、収率は、０％～２０％では＃、２０％～４０％では＃＃、４０％～６０％では＃＃＃である。
実施例６
基質としての４－メチルシクロヘキサノンに対するモノオキシゲナーゼ突然変異体の反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、４－メチルシクロヘキサノン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
基質としての４－メチルシクロヘキサノンに対するモノオキシゲナーゼ突然変異体の反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、４－メチルシクロヘキサノン１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
１６ｈ後に、反応系を７００μL取り、それにアセトニトリル１.４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＨＰＬＣ分析に送った。突然変異体の反応特性を以下の表６に示す。
活性は、転換率１０％～５０％では＋、５０％～８０％では＋＋、８０％以上では＋＋＋である。
実施例７
基質としてのチオアニソールに対するモノオキシゲナーゼ突然変異体の反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、チオアニソール１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
基質としてのチオアニソールに対するモノオキシゲナーゼ突然変異体の反応特性の比較
５０mLガラス三角フラスコにて、チオアニソール１００mgをイソプロパノール８５０μLに加えて、均一に混合し、ｐＨを６.０～９.０に調整した後に、モノオキシゲナーゼ８００mg、イソプロパノール脱水素酵素０.１２ｇ、５０μL(２０mg/mL)ＮＡＤＰ+、０.１M Tris-HCl bufferを含む粗酵素液に加え、反応総体積を１０mL、系ｐＨを６.０～９.０として、１５℃～３０℃で保温して振とう反応させた。
１６ｈ後に、反応系を７００μL取り、それにアセトニトリル１.４mLを加え、１２０００rpmで５min遠心分離し、上清を取りＨＰＬＣ分析に送った。一部の突然変異体の反応特性を以下の表７に示す。
活性は、転換率１０％～５０％では＋、５０％～９０％では＋＋、９０％以上では＋＋＋であり、ｅｅ値は、０％～２０％では＊、２０％～６０％では＊＊、６０％～８０％では＊＊＊、８０％～９９％では＊＊＊＊である。
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を制限するものではなく、当業者が分かるように、本発明には様々な変更や変化があってもよい。本発明の趣旨及び原則を逸脱することなく行われる修正、同等置換や改良などであれば、本発明の特許範囲に含まれるものとする。
Claims (25)
- モノオキシゲナーゼ突然変異体であって、
アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得たアミノ酸配列であり、前記突然変異は、５０８位のフェニルアラニンのチロシン、メチオニン又はアスパラギンへの突然変異を含み、且つ前記突然変異は、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｌ１４７Ｙ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ２８０Ｙ、Ｆ５０８Ｎ＋Ｆ２８０Ｙ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｌ１４６Ｙ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｌ１４６Ｆ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ２８０Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｎ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ、Ｆ５０８Ｎ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｌ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｓ４４１Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｉ４９４Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｔ６１Ｑ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ１４５Ｆ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ａ１６９Ｋ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｓ１８９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ３３２Ｒ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ａ３２８Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｉ４９４Ａ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｇ５１２Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｗ４９Ａ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｖ１４４Ｅ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｇ１４５Ｆ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｈ１６７Ｗ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ１６９Ｋ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ１７９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ２４６Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｇ２８５Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｔ２８６Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｌ３３２Ｒ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ａ３２８Ｎ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ３８２Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｍ４２７Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｖ４２８Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｐ４３１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ４３３Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｐ４３４Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ５１１Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｇ５１２Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｌ５１３Ｖ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｐ４３１Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｙ＋Ｉ４９４Ｓ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｄ６０Ｌ＋Ｌ４２９Ｙ＋Ｗ４９３Ａ＋Ｌ１４６Ｆ＋Ｌ１４７Ｔ＋Ｉ４９４Ｍ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｗ＋Ｄ６０Ｌ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ａ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｆ２８５Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｇ４３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｐ４３４Ａ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｔ２８６Ａ＋Ｙ５０９Ｍ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ａ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｖ２４７Ｔ、Ｆ５０８Ｍ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｆ２８７Ｄ＋Ｒ３３０Ａ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｓ＋Ｌ４３８Ｙ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｖ１４４Ｅ＋Ｇ１４５Ｆ＋Ｍ４２７Ｉ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｑ６０Ｌ＋Ｌ３２２Ｒ＋Ｎ４３２Ｙ、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ａ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｐ３２１Ａ＋Ｇ５１２Ｉ、及びＦ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ａ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｌ＋Ｌ５１０Ｖ＋Ｔ６１Ｑ＋Ｒ３３０Ａ＋Ｇ４３０Ａの突然変異部位の組み合わせのうちの１つである、ことを特徴とするモノオキシゲナーゼ突然変異体。 - 請求項１に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体をコードする、ことを特徴とするＤＮＡ分子。
- 請求項２に記載のＤＮＡ分子を含有する、ことを特徴とする組換えプラスミド。
- ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である、ことを特徴とする請求項３に記載の組換えプラスミド。
- 請求項３又は４に記載の組換えプラスミドを含有する、ことを特徴とする宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の宿主細胞。
- 前記原核細胞は大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である、ことを特徴とする請求項６に記載の宿主細胞。
- 請求項１に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体の、チオエーテル系化合物又はケトン系化合物の一原子酸素添加反応の触媒における使用。
- 前記チオエーテル系化合物は
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示し、Ｒ１及びＲ２は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができる、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。 - Ｒ１及びＲ２は、炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基である、ことを特徴とする請求項９に記載の使用。
- Ｒ１及びＲ２は炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基である、ことを特徴とする請求項１０に記載の使用。
- 前記置換した又は置換していないアリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、及びピロリル基を含み、
前記置換した又は置換していないアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、及びｔ－ブチル基を含み、
前記アラルキル基はベンジル基であり、
前記置換とは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基で置換されたことを意味する、ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の使用。 - 前記ケトン系化合物は
であり、ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基を示し、Ｒ３及びＲ４は、単独に、又は両方が結合されて置換又は無置換の環を形成することができる、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。 - Ｒ３及びＲ４は、炭素数１～２０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換した又は置換していないアリール基である、ことを特徴とする請求項１３に記載の使用。
- Ｒ３及びＲ４は炭素数１～１０の任意に置換した又は置換していないアルキル基、任意に置換した又は置換していないアラルキル基、又は任意に置換又は置換していないアリール基である、ことを特徴とする請求項１４に記載の使用。
- 前記置換した又は置換していないアリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フラニル基、及びピロリル基を含み、
前記置換した又は置換していないアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓ－ブチル基、及びｔ－ブチル基を含み、
前記アラルキル基はベンジル基であり、
前記置換とは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基で置換されたことを意味する、ことを特徴とする請求項１４又は１５に記載の使用。 - スロペネム側鎖合成である、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記モノオキシゲナーゼは、請求項１又は２に記載のモノオキシゲナーゼ突然変異体の溶液、凍結乾燥粉末、固定化酵素又は固定化細胞である、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応の反応系には補因子がさらに含まれ、前記補因子はＮＡＤ+/ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰ+/ＮＡＤＰＨであり、前記補因子は補因子循環系により生成され、前記補因子循環系はグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、グルコース６－リン酸とグルコース－６－リン酸脱水素酵素、又は第二級アルコールと第二級アルコール脱水素酵素を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応の温度は１０～３７℃である、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応の温度は１５～３５℃である、ことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応の時間は３～４８時間である、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応の時間は６～１６時間である、ことを特徴とする請求項２２に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応は、ｐＨ５.０～１０.０の条件で行われる、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 前記一原子酸素添加反応は、ｐＨ６.０～９.０の条件で行われる、ことを特徴とする請求項２４に記載の使用。
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