CN109402074B - 单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单加氧酶突变体及其应用。其中，该单加氧酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第45位、第95位、第106位、第108位、第114位、第186位、第190位、第191位、第249位、第257位、第393位、第436位、第499位、第500位、第501位、第503位、第504位、第559位和第560位。本发明的单加氧酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，从而大幅度降低了手性亚砜工业生产中的成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种单加氧酶突变体及其应用。
背景技术
手性亚砜广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性亚砜都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
Baeyer Villiger单加氧酶(BVMOs)属于黄素类单加氧酶，通常用来立体选择性氧化链状和环状的酮，生成相应的酯或内酯，也能催化硫、氮和磷的亲电氧化反应，同时BVMOs还能催化酮和硼的亲核氧化反应。BVMOs在手性药物的合成方面具有很大的应用，比如它可以催化含硫手性前体的氧化，被用于手性药物***和奥美拉唑的合成中(CN105695425A)。
尽管有几种BVMOs得到了商业化应用，但BVMOs普遍存在着酶活性低，酶稳定性低，副产物砜生成等问题。一般而言，我们可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产当中(Chem.Rev.2011,111:4165-4222.)。
发明内容
本发明旨在提供一种单加氧酶突变体及其应用，以解决现有技术中单加氧酶酶活性低副产物砜含量较高的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单加氧酶突变体。该单加氧酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第45位、第95位、第106位、第108位、第114位、第186位、第190位、第191位、第249位、第257位、第393位、第436位、第499位、第500位、第501位、第503位、第504位、第559位和第560位，且突变为第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第95位的丙氨酸突变为苏氨酸；第106位的半胱氨酸突变为丝氨酸；第108位的苏氨酸突变为丝氨酸；第114位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第190位的脯氨酸突变为谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸，第191位的亮氨酸突变为缬氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第436位的半胱氨酸突变为丝氨酸，第499位的亮氨酸突变为丙氨酸，第500位的甘氨酸突变为亮氨酸，第501位的丝氨酸突变为苏氨酸，第503位的异亮氨酸突变为丙氨酸，第504位的脯氨酸突变为苏氨酸、缬氨酸或丝氨酸、第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、亮氨酸或丙氨酸和第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸；或者单加氧酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，突变至少包括如下突变位点组合之一：第559位的酪氨酸突变为赖氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为精氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为异亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为谷氨酰胺；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为甘氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为精氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为天冬酰胺；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为苯丙氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为谷氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为缬氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为苏氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为异亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为组氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为酪氨酸；第560位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为组氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为赖氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬酰胺、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为脯氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为甘氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为谷氨酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为异亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第503位的天冬酰胺突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为苏氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸和第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸和第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸和第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸、第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸和第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。
根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述单加氧酶突变体。
根据本发明的又一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明的又一个方面，提供一种生产手性亚砜的方法。该方法包括单加氧酶对硫醚类化合物进行催化单加氧反应的步骤，单加氧酶为上述单加氧酶突变体。
进一步地，硫醚类化合物为
其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代。
进一步地，硫醚类化合物为
进一步地，单加氧酶为权利要求1或2的单加氧酶突变体的破碎酶液、整细胞、冻干酶粉、冻干细胞、固定化酶或固定化细胞。
进一步地，单加氧反应的反应体系中还包括辅因子，辅因子为NAD/NADH和/或NADP/NADPH，辅因子循环***包括葡萄糖和葡糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸脱氢酶、葡糖6-磷酸和葡糖-6-磷酸脱氢酶，或仲醇和仲醇脱氢酶。
进一步地，单加氧反应的反应体系中单加氧酶的加入量为底物质量的0.1倍～10倍。
进一步地，单加氧反应的温度为10～50℃，优选为30℃。
进一步地，单加氧反应在pH为7～10的条件下进行，优选pH为9。
本发明的单加氧酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的单加氧酶基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的单加氧酶，本发明的单加氧酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，从而大幅度降低了手性亚砜工业生产中的成本。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
来源于单胞菌Brachymonas petroleovorans的单加氧酶可以高选择性的催化(3-氯苄基)二甲基硫醚的转化。然而，对于(1-(3-氯苯基)环丙基)甲基硫醚的转化，来源于单胞菌Brachymonas petroleovorans的单加氧酶的催化产物的ee值只有43.9％。对其他单加氧酶进行筛选后发现，来源于红色红球菌Rhodococcus ruber-SD1的单加氧酶BVMO可以较高选择性的催化底物(1-(3-氯苯基)环丙基)甲基硫醚的转化，ee值99％，但是其活性较低，反应后副产物砜(过氧化物)含量较多，反应时添加的酶量较多，产物分离提取困难。本发明的发明人力图通过定向进化的方法提高BVMO的活性，降低酶的使用量，提高酶的选择性，降低副产物砜的含量。
本发明的发明人通过定向进化的方法提高单加氧酶SEQ ID NO：1
(MTTSIDREALRRKYAEERDKRIRPDGNDQYIRLDHVDGWSHDPYMPITPREPKLDHVTFAFIGGGFSGLVTAARLRESGVESVRIIDKAGDFGGVWYWNRYPGAMCDTAAMVYMPLLEETGYMPTEKYAHGPEILEHCQRIGKHYDLYDDALFHTEVTDLVWQEHDQRWRISTNRGDHFTAQFVGMGTGPLHVAQLPGIPGIESFRGKSFHTSRWDYDYTGGDALGAPMDKLADKRVAVIGTGATAVQCVPELAKYCRELYVVQRTPSAVDERGNHPIDEKWFAQIATPGWQKRWLDSFTAIWDGVLTDPSELAIEHEDLVQDGWTALGQRMRAAVGSVPIEQYSPENVQRALEEADDEQMERIRARVDEIVTDPATAAQLKAWFRQMCKRPCFHDDYLPAFNRPNTHLVDTGGKGVERITENGVVVAGVEYEVDCIVYASGFEFLGTGYTDRAGFDPTGRDGVKLSEHWAQGTRTLHGMHTYGFPNLFVLQLMQGAALGSNIPHNFVEAARVVAAIVDHVLSTGTSSVETTKEAEQAWVQLLLDHGRPLGNPECTPGYYNNEGKPAELKDRLNVGYPAGSAAFFRMMDHWLAAGSFDGLTFR)
对应的碱基序列为SEQ ID NO：2
(atgacaaccagtatcgatcgcgaggccctgcgccgcaaatatgccgaagagcgcgataaacgcatccgcccggatggcaacgatcagtatattcgcctggatcatgttgacggttggagccatgacccttatatgccgatcaccccgcgcgagccgaaactggaccatgttacatttgcattcatcggcggcggttttagcggtctggtgaccgccgcacgtctgcgtgaaagtggcgtggagagtgttcgcatcatcgacaaagcaggcgatttcggcggcgtttggtattggaaccgttatccgggtgccatgtgcgataccgcagcaatggtgtacatgcctctgctggaagagaccggctacatgccgacagaaaaatatgctcatggtccggagattctggagcactgtcagcgcatcggcaaacactacgacctgtatgacgatgccctgttccataccgaagttaccgacctggtgtggcaggagcatgatcagcgttggcgcatcagcacaaaccgcggtgaccatttcaccgcacagttcgttggcatgggtaccggcccgctgcacgttgcacagctgccgggtattccgggtatcgagagcttccgtggtaagagcttccataccagccgctgggactatgactatacaggtggcgacgcactgggcgcacctatggacaaactggcagacaaacgcgtggcagtgattggtaccggcgcaaccgccgttcagtgcgttccggaactggccaagtactgccgcgaactgtatgtggttcagcgcaccccgagtgccgttgatgaacgcggcaaccatccgatcgatgaaaagtggttcgcccagattgccacacctggttggcagaaacgctggctggatagctttaccgcaatctgggatggtgtgctgacagatccgagcgaactggccatcgagcatgaagacctggtgcaggatggttggacagcactgggtcagcgcatgcgtgcagccgtgggtagcgttccgattgaacagtatagcccggagaacgtgcagcgtgccctggaagaggccgacgatgaacagatggaacgcattcgcgcacgtgtggatgagattgtgaccgatcctgccaccgccgcccagctgaaagcatggtttcgccagatgtgcaagcgtccgtgcttccacgatgactatctgcctgcattcaaccgcccgaatacccatctggtggacacaggtggcaaaggcgtggagcgcattaccgaaaacggtgtggtggttgcaggtgtggaatatgaggtggactgcatcgtgtacgccagtggcttcgagttcttaggcaccggttatacagaccgtgcaggtttcgatccgaccggccgtgatggcgttaaactgagcgaacattgggcccaaggcacacgtaccctgcatggcatgcatacctacggctttccgaacctgtttgtgctgcagctgatgcagggtgcagccctgggtagcaacatcccgcacaactttgttgaagccgcccgcgtggtggccgcaattgttgatcatgtgctgagcacaggcaccagtagcgttgaaaccaccaaggaagccgaacaagcctgggtgcagctgctgctggatcacggtcgccctctgggcaacccggagtgtacacctggttattacaataatgaaggcaaaccggccgaactgaaggaccgtctgaacgttggctatccggccggtagcgccgccttttttcgtatgatggaccactggctggcagccggcagttttgatggcctgacattccgctaa)
的活性与选择性，降低酶的使用量，降低副产物砜的含量。首先通过全质粒PCR的方式在单加氧酶SEQ ID NO：1上引入突变位点，对突变体进行活性和副产物砜含量检测，挑选活性提高或副产物砜含量减少的突变体。
以BVMO为模版，设计了34对定点突变引物(M45T,V95I,C106S,D107A,T108I,T108S,M114L,M186I,P190F,P190L,L191V,L191A,C249V,C257A,C393V,C436S,L499A,L499G,G500L,S501T,N502Q,I503G,I503A,I503M,P504F,G558V,G558N,Y559F,Y559L,Y559A,Y560F,Y560L,Y560A,C555S.)利用定点突变手段，以pET-28b(+)为表达载体，获得带有目的基因的突变质粒。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。氨基酸脱氢酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。
根据本发明一种典型的实施方式，提供单加氧酶突变体。该单加氧酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第45位、第95位、第106位、第108位、第114位、第186位、第190位、第191位、第249位、第257位、第393位、第436位、第499位、第500位、第501位、第503位、第504位、第559位和第560位，且所述突变为所述第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第95位的丙氨酸突变为苏氨酸；第106位的半胱氨酸突变为丝氨酸；第108位的苏氨酸突变为丝氨酸；第114位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第190位的脯氨酸突变为谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸，第191位的亮氨酸突变为缬氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第436位的半胱氨酸突变为丝氨酸，第499位的亮氨酸突变为丙氨酸，第500位的甘氨酸突变为亮氨酸，第501位的丝氨酸突变为苏氨酸，第503位的异亮氨酸突变为丙氨酸，第504位的脯氨酸突变为苏氨酸、缬氨酸或丝氨酸、第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、亮氨酸或丙氨酸和第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸；或者所述单加氧酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第559位的酪氨酸突变为赖氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为精氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为异亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为谷氨酰胺；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为甘氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为精氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为天冬酰胺；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为苯丙氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为谷氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为缬氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为苏氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为异亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为组氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为酪氨酸；第560位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为组氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为赖氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬酰胺、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为脯氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为甘氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为谷氨酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为异亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第503位的天冬酰胺突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为苏氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸。
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸和第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸和第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸和第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸、第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸和第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。
本发明的单加氧酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的单加氧酶基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的单加氧酶，本发明的单加氧酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，并且酶的选择性有较大提高，副产物砜含量大幅降低，从而大幅度降低了手性亚砜工业生产中的成本。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述单加氧酶突变体。上述DNA编码得到的单加氧酶，提高了酶活性和酶的选择性，降低了副产物砜的含量，在手性亚砜的工业生产中可以减少加入的酶量，降低后处理分离纯化难度。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。单加氧酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导16h。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性亚砜的方法。该方法包括单加氧酶对硫醚类化合物进行催化单加氧反应的步骤，其中，单加氧酶为上述任一种单加氧酶突变体。由于本发明的上述单加氧酶突变体具有更高的酶催化活性和更高的选择性，因而利用本发明的单加氧酶突变体制备的手性亚砜不仅能够降低生产成本，而且所获得的手性亚砜ee值大于99％，de值大于99％。
在本发明一种典型的实施方式中，硫醚类化合物为
其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代。
典型的，
硫醚类化合物为
((1-(3-氯苯基)环丙基)甲基硫醚)。
单加氧酶可为单加氧酶突变体的破碎酶液、整细胞、冻干酶粉、冻干细胞、固定化酶或固定化细胞。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
10mL的反应瓶中加入(1-(3-氯苯基)环丙基)甲基硫醚16mg，加入0.1M的Tris-HCl9.0，20mg异丙醇，0.16mg的NADP+，1.6mg醇脱氢酶冻干酶粉，加入1.6mg单加氧酶BVMO冻干酶粉，混匀，总体积为1mL，于30℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟。取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm。结果见表1。
表1
| 突变体 | 活性 | 砜含量 |
| WT | - | * |
| M45T | + | * |
| V95I | + | ** |
| C106S | + | * |
| T108S | + | * |
| M114L | + | * |
| M186I | + | * |
| P190F | + | ** |
| P190L | ++ | ** |
| L191V | + | ** |
| C249V | + | * |
| C257A | + | * |
| C393V | + | * |
| C436S | + | * |
| L499A | + | ** |
| G500L | ++ | ** |
| S501T | + | ** |
| I503A | + | ** |
| Y559F | +++ | ** |
| Y559L | ++ | *** |
| Y559A | +++ | *** |
| Y560F | +++ | *** |
| Y560L | ++ | *** |
| Y560A | ++ | ** |
酶活性相比SEQ ID NO：1提高的倍数，+表示提高1-2倍，++表示提高3-5倍，+++表示提高5-10倍。砜含量在20-30％的用*表示，含量在2-20％的用**表示，含量小于2％的用***表示。
酶液制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μL酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素0.5mg/mL，pH＝7.0)，37℃保温破碎3h。
高通量筛选方法：250μL测活体系：底物终浓度2mM,NADPH终浓度0.3mM，破碎酶液加入量100μL，pH＝9.0，温度30℃。
筛选得到的突变体进行摇瓶培养，然后进行放大反应。
单加氧酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。
实施例2
10mL的反应瓶中加入(1-(3-氯苯基)环丙基)甲基硫醚20mg，加入0.1M的Tris-HCl9.0，20mg异丙醇，0.2mg的NADP+，20mg醇脱氢酶，加入20mg单加氧酶BVMO，混匀，总体积为1mL，于30℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟。取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm。
单点突变体的转化效果较母本有所提高，但并未达到理想的效果。组合饱和突变可以获得几个突变位点之间具有协同作用的突变体，而且可以对其氨基酸的组成进行优化组合。结果见表2。
表2
酶活性相比SEQ ID NO：1提高的倍数，+表示提高1-2倍，++表示提高3-5倍，+++表示提高5-10倍，++++表示提高10-20倍，+++++表示提高大于20倍。砜含量在20-30％的用*表示，含量在2-20％的用**表示，含量小于2％的用***表示。
突变点的组合可以获得更优的突变体。因此通过DNA shuffling的方法将突变位点进行随机重组，建立突变文库，然后进行筛选，试图拿到更优的突变体。
DNA shuffling是基因在分子水平上进行的有性重组。将一组同源基因用核酸酶I消化成随机片段，由这些随机片段组成文库，互为引物和模板进行PCR扩增。当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，发生模板互换和基因重组。
酶液制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μL酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素0.5mg/mL，pH＝7.0)，37℃保温破碎3h。
高通量筛选方法：250μL测活体系：底物终浓度2mM,NADPH终浓度0.3mM，破碎酶液加入量100μl，pH＝9.0，温度30℃。
筛选得到的突变体进行摇瓶培养，然后进行放大反应。
单加氧酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。
实施例3
10mL的反应瓶中加入(1-(3-氯苯基)环丙基)甲基硫醚30mg，加入0.1M的Tris-HCl9.0，30mg异丙醇，0.3mg的NADP+，30mg醇脱氢酶，加入30mg单加氧酶BVMO，混匀，总体积为1mL，于30℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟。取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm。结果见表3。
表3
| 突变体 | 活性 | 砜含量 |
| WT | - | * |
| P190L+Y559M+M45T | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C257A | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C249V | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C393V | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+M186I | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C249V+C393V | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C249V+C393V+C257A | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C249V+C393V+C257A+M45T | +++++ | *** |
| P190L+Y559M+C249V+C393V+C257A+M45T+M186I | +++++ | *** |
酶活性相比SEQ ID NO：1提高的倍数，+表示提高1-2倍，++表示提高3-5倍，+++表示提高5-10倍，++++表示提高10-20倍，+++++表示提高大于20倍。砜含量在20-30％的用*表示，含量在2-20％的用**表示，含量小于2％的用***表示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120> 单加氧酶突变体及其应用
<130> PN95814KLY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> PRT
<213> 红色红球菌(Rhodococcus ruber-SD1)
<400> 1
Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg
20 25 30
Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr
35 40 45
Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly
50 55 60
Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp
85 90 95
Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val
100 105 110
Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr
115 120 125
Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His
130 135 140
Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu
145 150 155 160
Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly
165 170 175
Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Pro Leu His
180 185 190
Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys
195 200 205
Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala
210 215 220
Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile
225 230 235 240
Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Cys Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr
245 250 255
Cys Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu
260 265 270
Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr
275 280 285
Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu
305 310 315 320
Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val
325 330 335
Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala
340 345 350
Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val
355 360 365
Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp
370 375 380
Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro
385 390 395 400
Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly
405 410 415
Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr
420 425 430
Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr
435 440 445
Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val
450 455 460
Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met
465 470 475 480
His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly
485 490 495
Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Pro His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg
500 505 510
Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser
515 520 525
Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu
530 535 540
Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr
545 550 555 560
Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly
565 570 575
Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu
580 585 590
Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg
595 600
<210> 2
<211> 1812
<212> DNA
<213> 红色红球菌(Rhodococcus ruber-SD1)
<400> 2
atgacaacca gtatcgatcg cgaggccctg cgccgcaaat atgccgaaga gcgcgataaa 60
cgcatccgcc cggatggcaa cgatcagtat attcgcctgg atcatgttga cggttggagc 120
catgaccctt atatgccgat caccccgcgc gagccgaaac tggaccatgt tacatttgca 180
ttcatcggcg gcggttttag cggtctggtg accgccgcac gtctgcgtga aagtggcgtg 240
gagagtgttc gcatcatcga caaagcaggc gatttcggcg gcgtttggta ttggaaccgt 300
tatccgggtg ccatgtgcga taccgcagca atggtgtaca tgcctctgct ggaagagacc 360
ggctacatgc cgacagaaaa atatgctcat ggtccggaga ttctggagca ctgtcagcgc 420
atcggcaaac actacgacct gtatgacgat gccctgttcc ataccgaagt taccgacctg 480
gtgtggcagg agcatgatca gcgttggcgc atcagcacaa accgcggtga ccatttcacc 540
gcacagttcg ttggcatggg taccggcccg ctgcacgttg cacagctgcc gggtattccg 600
ggtatcgaga gcttccgtgg taagagcttc cataccagcc gctgggacta tgactataca 660
ggtggcgacg cactgggcgc acctatggac aaactggcag acaaacgcgt ggcagtgatt 720
ggtaccggcg caaccgccgt tcagtgcgtt ccggaactgg ccaagtactg ccgcgaactg 780
tatgtggttc agcgcacccc gagtgccgtt gatgaacgcg gcaaccatcc gatcgatgaa 840
aagtggttcg cccagattgc cacacctggt tggcagaaac gctggctgga tagctttacc 900
gcaatctggg atggtgtgct gacagatccg agcgaactgg ccatcgagca tgaagacctg 960
gtgcaggatg gttggacagc actgggtcag cgcatgcgtg cagccgtggg tagcgttccg 1020
attgaacagt atagcccgga gaacgtgcag cgtgccctgg aagaggccga cgatgaacag 1080
atggaacgca ttcgcgcacg tgtggatgag attgtgaccg atcctgccac cgccgcccag 1140
ctgaaagcat ggtttcgcca gatgtgcaag cgtccgtgct tccacgatga ctatctgcct 1200
gcattcaacc gcccgaatac ccatctggtg gacacaggtg gcaaaggcgt ggagcgcatt 1260
accgaaaacg gtgtggtggt tgcaggtgtg gaatatgagg tggactgcat cgtgtacgcc 1320
agtggcttcg agttcttagg caccggttat acagaccgtg caggtttcga tccgaccggc 1380
cgtgatggcg ttaaactgag cgaacattgg gcccaaggca cacgtaccct gcatggcatg 1440
catacctacg gctttccgaa cctgtttgtg ctgcagctga tgcagggtgc agccctgggt 1500
agcaacatcc cgcacaactt tgttgaagcc gcccgcgtgg tggccgcaat tgttgatcat 1560
gtgctgagca caggcaccag tagcgttgaa accaccaagg aagccgaaca agcctgggtg 1620
cagctgctgc tggatcacgg tcgccctctg ggcaacccgg agtgtacacc tggttattac 1680
aataatgaag gcaaaccggc cgaactgaag gaccgtctga acgttggcta tccggccggt 1740
agcgccgcct tttttcgtat gatggaccac tggctggcag ccggcagttt tgatggcctg 1800
acattccgct aa 1812
Claims (17)
1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，所述单加氧酶突变体的氨基酸序列是由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变为：第559位的酪氨酸突变为赖氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为精氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为异亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为谷氨酰胺；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为甘氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为精氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为天冬酰胺；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为苯丙氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为谷氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为缬氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为苏氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为异亮氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为组氨酸；第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为酪氨酸；第560位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为组氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为赖氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为亮氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为天冬酰胺、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为脯氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为谷氨酰胺、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为丝氨酸、第560位的酪氨酸突变为脯氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为甘氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为苏氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为缬氨酸、第560位的酪氨酸突变为谷氨酰胺和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为丙氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为异亮氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第503位的天冬酰胺突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为苏氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为缬氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第504位的脯氨酸突变为丝氨酸和第190位脯氨酸突变为亮氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸和第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸和第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸和第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸和第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸；第190位脯氨酸突变为亮氨酸、第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸、第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸、第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸、第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸和第186位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的单加氧酶突变体。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的出发质粒为pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞；所述真核细胞为酵母。
8.一种生产手性亚砜的方法，包括单加氧酶对硫醚类化合物进行催化单加氧反应的步骤，其特征在于，所述单加氧酶为权利要求1所述的单加氧酶突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述硫醚类化合物为，其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述硫醚类化合物为。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单加氧酶为权利要求1或2所述的单加氧酶突变体的破碎酶液、整细胞、冻干酶粉、冻干细胞、固定化酶或固定化细胞。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单加氧反应的反应体系中还包括辅因子，所述辅因子为NAD/NADH和/或NADP/NADPH，辅因子循环***包括葡萄糖和葡糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸脱氢酶、葡糖6-磷酸和葡糖-6-磷酸脱氢酶，或仲醇和仲醇脱氢酶。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单加氧反应的反应体系中所述单加氧酶的加入量为底物质量的0.1倍~10倍。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单加氧反应的温度为10~50℃。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述单加氧反应的温度为30℃。
16.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单加氧反应在pH为7~10的条件下进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述单加氧反应在pH为9的条件下进行。
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| CN115305243B (zh) * | 2022-06-28 | 2023-06-02 | 江南大学 | 一种Baeyer-Villiger单加氧酶突变体及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US20030215930A1 (en) * | 2000-12-08 | 2003-11-20 | Chen Mario W. | Genes involved in cyclododecanone degradation pathway |
| US20040267001A1 (en) * | 2001-08-29 | 2004-12-30 | Bramucci Michael G. | Genes encoding baeyer-villiger monooxygenases |
| CN108300707A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-20 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用 |
-
2018
- 2018-11-05 CN CN201811307573.3A patent/CN109402074B/zh active Active
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Cloning and Characterization of a Gene Cluster for Cyclododecanone Oxidation in Rhodococcus ruber SC1;KRISTY KOSTICHKA等;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20011130;第183卷(第21期);第6478-6486页 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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