CN110713992B - 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酮还原酶突变体及生产手性醇的方法。其中，该酮还原酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，突变的位点包括K200H。本发明突变得到的突变体，可以以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，高效生产手性醇，并且稳定性得到极大的提高，适合推广用于手性醇的工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及化合物合成技术领域，具体而言，涉及一种酮还原酶突变体及生产手性醇的方法。
背景技术
手性醇广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性药物都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
酮还原酶（Ketoreductase, KRED）也可以称作羰基还原酶（Carbony-reductase），酶分类号EC 1.1.1.184，常被用于还原潜手性醛或者酮从而制备手性醇。KRED不仅可以将醛类或者酮类底物转化为对应的醇产品，而且还可以催化其逆反应，即催化氧化醇底物得到对应的醛或者酮。在酮还原酶催化的反应中，需要辅因子的参与，包括还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）。
在进行醛或者酮的还原反应过程中，一般需要还原型的辅因子NADH或者NADPH的参与，而在实际反应中，会添加氧化型的辅因子NAD+或者NADP+，然后通过合适的辅因子再生体系再生为还原型的NADH或者NADPH。常用的辅因子再生体系包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸脱氢酶、仲醇和仲醇脱氢酶，亚磷酸盐和亚磷酸脱氢酶以及其它类似的***。一般来说，辅酶再生体系的更换不会实质的影响酮还原酶的功能。
尽管有多种KRED已经被用于商业化生产当中，但KRED一般在应用中存在稳定性较低的缺点，具体体现在热稳定性以及有机溶剂的耐受性。通过定向进化的手段对酶进行改造，可以提高酶的稳定性，从而更好的应用在生产当中。
发明内容
本发明旨在提供一种酮还原酶突变体及生产手性醇的方法，以提高酮还原酶的稳定性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酮还原酶突变体。该酮还原酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，突变的位点包括K200H。
进一步地，突变的位点还至少包括如下位点之一：A15、K28、G36、K39、G43、Q44、A46、V47、F59、K61、T65、K71、A94V、A144、M146、Y152、N156、I86、K208和K237；或者酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有95%以上同一性的氨基酸序列。
进一步地，突变的位点还至少包括如下突变之一：A15C、K28A/E/M/Q/R/S、G36C、K39I/V、G43C/M、Q44R、A46C、V47C、F59C 、K61E/H、T65A、K71R、A94V、A144T、M146I、Y152F、N156S、I86V、K208R和K237E。
进一步地，氨基酸突变包括如下任一种位点组合突变：Q44R+N156S+K200H 、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、 Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M。
进一步地，发生氨基酸突变包括如下任一种位点组合突变：I86V+M146I+K200H、M146I+K200H、M146L+N156S+K200H、M146L+K200H、K200H+G201D、Q44R+M146I+K200H、K61E+K200H+K237E、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H+G201D、M146L+K200H+G201D、N156S+K200H+G201D、K200H+G201D+K237E、K28E+M146I+K200H+G201D、K28E+M146L+K200H+G201D、K28E+N156S+K200H+G201D、Q44R+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、I86V+M146I+K200H+K61H、I86V+M146I+K200H+K208R、I86V+M146I+K200H+G201D、I86V+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E、和Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C。
根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述酮还原酶突变体。
根据本发明的再一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒连接有上述DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌。
根据本发明的另一个方面，提供一种生产手性醇的方法。该方法包括采用酮还原酶催化潜手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的步骤，酮还原酶为上述任一种的酮还原酶突变体。
进一步地，手性酮类化合物具有如下结构式
，其中R1和R2各自独立地为烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，杂环基和杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，芳基中的芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代；
R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代；
优选地，酮类化合物的结构是为
，其中，R3为H、F、Cl、Br或CH3，R4为H、F、Cl、Br或CH3，R5为H、F、Cl、Br、CH3，OCH3或CH2CH3；
更优选的，酮类化合物为
。
进一步地，采用酮还原酶对酮类化合物进行还原反应生产手性醇的反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。
进一步地，反应体系中酮类化合物的浓度为1 g/L~200 g/L。
进一步地，反应体系的pH值为5~9，反应体系的反应温度为4~60℃。
进一步地，辅酶为NADH。
进一步地，辅酶再生体系包括：异丙醇、辅酶NAD+和酮还原酶。
进一步地，缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲。
本发明突变得到的突变体，可以以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，高效生产手性醇，并且稳定性得到极大的提高，适合推广用于手性醇的工业生产。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
名称解释：
“酮还原酶”和“KRED”在本申请中可相互交换使用，指能够将酮基还原为其对应的醇的多肽。具体地，本申请的酮还原酶多肽能够立体选择性地将酮化合物还原为相应的醇产物。该多肽通常利用辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟作为还原剂。在本申请中，酮还原酶包括天然存在的（野生型）酮还原酶以及由人工处理产生的非天然存在的酮还原酶突变体。
“天然存在的”或“野生型”与“突变体”相对，指在自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体的序列，它可以从自然界中的来源中分离，并且没有被人工所特意地修饰或改变。
本申请中，涉及例如，细胞、核酸或多肽“重组”时，是指已经以自然界中未存在的方式进行修饰的，或与自然界中存在的形式相同，但是由合成材料和/或通过使用重组技术的处理制备或衍生而得到，或对应于天然或固有形式的细胞、核酸或多肽。其中，非限制性的实例包括在细胞中表达固有（非重组）形式之外的基因或以不同水平表达固有基因的重组细胞。
“序列同一性的百分比”是指多核苷酸之间的对比，并且通过跨比较窗比较两条最佳比对的序列来确定，其中，多核苷酸序列在比较床中的部分与参考序列相比可以包括添加或缺失（即，空位），以用于两个序列的最佳比对。百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可选地，百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。其中，“参考序列”指用作序列比较的基础的指定序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。
定点突变：是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
来源于Acetobacter pasteurianus 386B的酮还原酶KRED突变体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+147V+D42E+T199V （作为本发明的模板，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在本发明中，以“E144A”为例，表示“原氨基酸+位点+突变后的氨基酸”，即第144位的E为变为A）可以催化目标底物得到产物，但是其稳定性有待进一步提高。本发明力图通过定向进化的方法提高KRED的稳定性。
SEQ ID NO：1：
MARVASKVAIVSGAANGIGKATAQLLAKEGAKVVIGDLKEEEGQKAVAEIKAAGGEAAFVKLNVTDEAAWKAAIGQTLKLYGRLDIAVNNAGIAYSGSVESTSLEDWRRVQSINLDGVFLGTQVAIEAMKKSGGGSIVNLSSIAGMVGDPMYAAYNASKGGVRLFTKSAALHCAKSGYKIRVNSVHPGYIWTPMVAGQVKGDAAARQKLVDLHPIGHLGEPNDIAYGILYLASDESKFVTGSELVIDGGYTAQ
在本申请中，首先通过定点突变的方式在KRED上引入突变位点，对突变体进行活性检测，挑选活性提高的突变体。其中突变体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+ L146M+147V+D42E+T199V+K200H相较于起始模板，稳定性提高3倍左右。后续，以E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+147V+D42E+T199V+K200H为模板继续进行突变，以期得到稳定性提高更为显著的突变体。
利用全质粒PCR引入定点突变是简单有效，且目前使用较多的手段。其原理是：一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。突变质粒转化至宿主细胞，诱导表达出目标蛋白，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。酮还原酶诱导表达最佳条件：25 oC，0.1 mM IPTG 诱导16 h。
在本发明一种典型的实施方式中，提供一种酮还原酶突变体。该酮还原酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，突变的位点包括K200H。本发明突变得到的突变体，可以以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，高效生产手性醇，并且稳定性得到极大的提高，适合推广用于手性醇的工业生产。
优选的，突变的位点还至少包括如下位点之一：A15、K28、G36、K39、G43、Q44、A46、V47、F59、K61、T65、K71、A94V、A144、M146、Y152、N156、I86、K208和K237；或者酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有95%以上同一性的氨基酸序列。上述位点的突变可以进一步提高酶的稳定性。更优选的，突变的位点还至少包括如下突变之一：A15C、K28A/E/M/Q/R/S、G36C、K39I/V、G43C/M、Q44R、A46C、V47C、F59C 、K61E/H、T65A、K71R、A94V、A144T、M146I、Y152F、N156S、I86V、K208R和K237E。其中，“/”代表“或”。
在本发明一种典型的实施方式中，氨基酸突变包括如下任一种位点组合突变：Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H 、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、 Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M。
更优选的，发生氨基酸突变包括如下任一种位点组合突变：I86V+M146I+K200H、M146I+K200H、M146L+N156S+K200H、M146L+K200H、K200H+G201D、Q44R+M146I+K200H、K61E+K200H+K237E、I86V+M146I+K200H、M146I+K200H+G201D、M146L+K200H+G201D、N156S+K200H+G201D、K200H+G201D+K237E、K28E+M146I+K200H+G201D、K28E+M146L+K200H+G201D、K28E+N156S+K200H+G201D、Q44R+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、I86V+M146I+K200H+K61H、I86V+M146I+K200H+K208R、I86V+M146I+K200H+G201D、I86V+M146L+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E、和Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述酮还原酶突变体。该DNA分子编码的上述酮还原酶具有很好的活力。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b（+）。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性醇的方法。该方法包括采用酮还原酶对手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的步骤，酮还原酶为上述任一种酮还原酶突变体。由于本发明的上述酮还原酶突变体具有很好的活力特性，因而利用本发明的酮还原酶突变体制备的手性醇可以提高反应速率，提高底物浓度，减少酶用量，降低后处理的难度。
在本申请中，手性酮类化合物包括但不限于具有如下结构式
，其中R1和R2各自独立地为烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基和杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述芳基中的芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代；优选的，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代；
优选地，酮类化合物的结构是为
，其中，R3为H、F、Cl、Br或CH3，R4为H、F、Cl、Br或CH3，R5为H、F、Cl、Br、CH3，OCH3或CH2CH3；
更优选的，酮类化合物为
。
本申请前述宿主细胞可用于酮还原酶的表达和分离，或可选地，它们可直接用于将酮底物转化为手性醇产物。优选的，原核细胞为大肠杆菌。
以上阐述的还原反应一般需要辅因子，其通常为NADH或NADPH，并且该还原反应可包括用于再生该辅因子的***，例如D-葡萄糖、辅酶NAD+和葡萄糖脱氢酶GDH；甲酸根化合物、辅酶NAD+和甲酸根脱氢酶FDH；或异丙醇、辅酶NAD+和醇脱氢酶ADH。在使用纯化的酮还原酶的一些实施方式中，此类辅因子和任选地此类辅因子再生***，通常将与底物和酮还原酶一起添加到反应介质中。与酮还原酶类似，包含辅因子再生***的任何酶可以是此类细胞的提取物或溶解产物形式，或作为纯化的酶加入反应混合物中。在使用细胞提取物或细胞溶解产物的实施方案中，用于产生提取物或溶解产物的细胞可以是表达仅含有辅因子再生***或含有辅因子再生***和酮还原酶的酶。在使用全细胞的实施方案中，该细胞可以使表达含有辅因子再生***和酮还原酶的酶。
不论用全细胞、细胞提取物或纯化的酮还原酶，可使用单一酮还原酶，或可选地，可使用两种或更多种酮还原酶的混合物。
采用酮还原酶对手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。
由于本发明的酮还原酶突变体催化活性较高，可以增加底物的浓度，提高生产效率，反应体系中手性酮类化合物的浓度为1g/L~200 g/L。
反应体系的pH值为5~9，反应体系的反应温度为4~60℃；缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
在本申请中，酶活检测方法如下：
1. 试剂配制：
底物(R)-1-(2,4-二氯苯)乙酮母液60 mM：称取56.7 mg溶于5 mL的0.1 M 磷酸盐缓冲液（）PB） pH 7.0 buffer中，放于50℃水浴锅中溶解；
NADH母液10 mM：称取33.17 mg的NADH溶于5 mL的0.1 M PB pH 7.0 buffer中。
2. 酶活体系：
首先加入酶，然后加入底物(R)-1-(2,4-二氯苯)乙酮，NADH和Buffer的混合物，放入酶标仪中，在30℃，340 nm 波长下检测酶活。
检测体系配制见表1。
表1
| 体系 | 加入量 | 终浓度 |
| 酶突变体 | 20 µL | N/A |
| 底物 | 50 µL | 10 mM |
| NADH | 10 µL | 0.33 mM |
| 0.1 M PB pH 7.0 缓冲液 | 220 µL | N/A |
稳定性表示为残余活性，即处理后的活性与处理前活性的百分比值。
酮还原酶KRED突变体E144A+L152Y+L198Q+E201G+G6S+L146M+ 147V+D42E+T199V，在本发明中简称“模板”，所列突变位点为在该“模板”基础上进行的突变。
实施例1
分别将“模板”和突变体在45°C和53°C进行保温1 h，然后测定其活性，与不保温的进行对比，稳定性表示为其残余活性与初始活性的百分比。所有突变体的热稳定性在53°C进行测定，结果见表2。
表2
| 突变体 | 稳定性（%） |
| 模板 | +++（45℃） |
| 模板 | +（53℃） |
| K200H | ++ |
| I86V+M146I+K200H | +++ |
| M146I+K200H | +++ |
| M146L+N156S+K200H | ++++ |
| M146L+K200H | +++ |
| K200H+G201D | +++ |
| Q44R+M146I+K200H | +++ |
| K61E+K200H+K237E | ++ |
| I86V+M146I+K200H | +++ |
| M146I+K200H+G201D | ++++ |
| M146L+K200H+G201D | +++ |
| N156S+K200H+G201D | ++++ |
| K200H+G201D+K237E | +++ |
| K28E+M146I+K200H+G201D | ++++ |
| K28E+M146L+K200H+G201D | +++ |
| K28E+N156S+K200H+G201D | ++++ |
| Q44R+M146L+K200H+G201D | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D | ++++ |
| I86V+M146I+K200H+K61H | ++++ |
| I86V+M146I+K200H+K208R | ++++ |
| I86V+M146I+K200H+G201D | +++ |
| I86V+M146L+K200H+G201D | +++ |
+代表稳定性，+残余活性0-5%，++残余活性5-10%，+++残余活性10-50%，++++残余活性50-95%。
实施例2
组合饱和突变可以获得几个突变位点之间具有协同作用的突变体，而且可以对其氨基酸的组成进行优化组合。以Q44R+N156S+K200H+G201D为模板，进行突变点组合，此时酶液处理条件为65 oC处理1 h，然后测定其活性，与不保温的进行对比，稳定性表示为其残余活性与初始活性的百分比。
高通量筛选中酶液的制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200 μL酶解溶液(溶菌酶 2 mg/mL，多黏菌素0.5 mg/mL，pH = 7.0)，37 oC保温破碎3 h。酶活检测方法：首先加入酶，然后加入底物(R)-1-(2,4-二氯苯)乙酮，NADH和Buffer的混合物，放入酶标仪中，在30℃，340 nm 波长下检测酶活，结果见表3。
表3
| 突变体 | 稳定性(%) |
| Q44R+N156S+K200H+G201D | + |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E | ++++ |
+代表稳定性，+残余活性0-5%，++残余活性5-10%，+++残余活性10-50%，++++残余活性50-95%。
实施例3
以Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I为模板继续进行突变。此时酶液处理条件为71 oC处理1 h，然后测定其活性，与不保温的进行对比，稳定性表示为其残余活性与初始活性的百分比。
高通量筛选中酶液的制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200 μL酶解溶液(溶菌酶 2 mg/mL，多黏菌素0.5 mg/mL，pH = 7.0)，37 oC保温破碎3 h。酶活检测方法：首先加入酶，然后加入底物(R)-1-(2,4-二氯苯)乙酮，NADH和Buffer的混合物，放入酶标仪中，在30℃，340 nm 波长下检测酶活，结果见表4。
表4
| 突变体 | 稳定性（%） |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I | + |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T | ++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F | +++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E | ++++ |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C | ++++ |
+代表稳定性，+残余活性0-5%，++残余活性5-10%，+++残余活性10-50%，++++残余活性50-95%。
实施例4
在酶稳定性提高过程中，酶整体的刚性得到提高，因此稳定性提高的突变体同时表现出对化学物质如戊二醛，对有机溶剂如甲醇等的耐受性均有提高，这其实也是突变体整体刚性提高的外在表现。
对前文所述的突变体进行戊二醛耐受性和甲醇耐受性的测试。其中戊二醛耐受性在1%的戊二醛进行保温1 h，然后测定残余活性，醛耐受性表现为不保温和保温的活性的百分比。甲醇耐受性在60%甲醇溶液中进行保温1 h，然后测定残余活性，甲醇的耐受性表现为不保温和保温的活性的百分比，结果见表5。
表5
| 突变体 | 戊二醛耐受性（%） | 甲醇耐受性（%） |
| 模板 | * | # |
| K200H | ** | ## |
| I86V+M146I+K200H | ** | ## |
| M146L+K200H | ** | ## |
| M146L+N156S+K200H | ** | ## |
| K200H+G201D | ** | ## |
| Q44R+M146I+K200H | ** | ## |
| K61E+K200H+K237E | ** | ## |
| I86V+M146I+K200H | ** | ## |
| M146I+K200H+G201D | ** | ## |
| M146L+K200H+G201D | ** | ## |
| N156S+K200H+G201D | ** | ## |
| K200H+G201D+K237E | ** | ## |
| K28E+M146I+K200H+G201D | ** | ## |
| K28E+M146L+K200H+G201D | ** | ## |
| K28E+N156S+K200H+G201D | *** | ### |
| Q44R+M146L+K200H+G201D | ** | ## |
| Q44R+N156S+K200H+G201D | ** | ## |
| I86V+M146I+K200H+K61H | ** | ## |
| I86V+M146I+K200H+K208R | ** | ## |
| I86V+M146I+K200H+G201D | ** | ## |
| I86V+M146L+K200H+G201D | ** | ## |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H | ** | ## |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A | ** | ## |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+A94V | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C | *** | ### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E | **** | #### |
| Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C | **** | #### |
*代表醛耐受性，*残余活性0-5%，**残余活性5-10%，***残余活性10-50%，****残余活性50-95%。
#代表甲醇耐受性，#残余活性0-5%，##残余活性5-10%，###残余活性10-50%，####残余活性50-95%。
实施例 5
使用突变体Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+ G43M+G36C进行不同底物反应验证，结果见表6。
1）25 mL的反应瓶中加入底物2-氯苯乙酮 2 g，加入0.1 M的PB 7.0，2 g异丙醇，20 mg的NAD+，0.05 g酮还原酶突变体，混匀，总体积为10 mL，于50℃、200转摇床，反应16小时；
2）25 mL的反应瓶中加入底物3-氟苯乙酮 2 g，加入0.1 M的PB 7.0，2 g异丙醇，20 mg的NAD+，0.05 g酮还原酶突变体，混匀，总体积为10 mL，于50℃、200转摇床，反应16小时；
3）25 mL的反应瓶中加入底物4-甲氧基苯乙酮 2 g，加入0.1 M的PB 7.0，2 g异丙醇，20 mg的NAD+，0.05 g酮还原酶突变体，混匀，总体积为10 mL，于50℃、200转摇床，反应16小时；
4）25 mL的反应瓶中加入底物乙酰乙酸乙酯 2 g，加入0.1 M的PB 7.0，2 g异丙醇，20 mg的NAD+，0.05 g酮还原酶突变体，混匀，总体积为10 mL，于50℃、200转摇床，反应16小时。
表6
| 序号 | 底物 | 转化率(%) | ee |
| 1 | 2-氯苯乙酮 | 99 | >99% |
| 2 | 3-氟苯乙酮 | 99 | >99% |
| 3 | 4-甲氧基苯乙酮 | 99 | >99% |
| 4 | 乙酰乙酸乙酯 | 99 | >99% |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英医药化学（阜新）技术有限公司
<120> 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法
<130> PN116848KLY
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> Acetobacter pasteurianus 386B
<400> 1
Met Ala Arg Val Ala Ser Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Glu Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ala
130 135 140
Gly Met Val Gly Asp Pro Met Tyr Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Gln Val Lys Gly Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
Claims (14)
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体是在SEQ ID NO: 1基础上发生突变得到的，所述突变为如下任一种位点组合突变： Q44R+N156S+K200H+G201D、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V 、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C、 Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+I86V+K208R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+K39I、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+T65A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+V47C+F59C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+G43C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28E、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28Q、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28M、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28A、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+K28S、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+I86V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+I39V、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K71R、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+A144T、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+Y152F、Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+K28E、和Q44R+N156S+K200H+G201D+M146I+K61H+K208R+A94V+K39I+A15C+A46C+G43M+G36C。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的酮还原酶突变体。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pUC-18或pUC-19。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒，所述宿主细胞不包括植物细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌。
8.一种生产手性醇的方法，包括采用酮还原酶催化潜手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的步骤，其特征在于，所述酮还原酶为权利要求1所述的酮还原酶突变体，所述潜手性酮类化合物为(R)-1-(2,4-二氯苯)乙酮、2-氯苯乙酮、3-氟苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮或乙酰乙酸乙酯。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用酮还原酶对酮类化合物进行还原反应生产手性醇的反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应体系中所述酮类化合物的浓度为1 g/L~200 g/L。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应体系的pH值为5~9，所述反应体系的反应温度为4~60℃。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述辅酶为NADH。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生体系包括：异丙醇、辅酶NAD+和酮还原酶。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
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