KR20230062277A - 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 및 이의 용도 - Google Patents

탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 및 이의 용도 Download PDF

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윤기남
송기영
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Abstract

본 발명은 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 β-갈락토시다아제 (β-galactosidase), 아밀라아제 (amylase) 및 셀룰라아제 (cellulase)와 같은 탄수화물 분해효소를 생산 및 분비하는, 돼지의 소화기관 유래 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP) 및 이의 탄수화물 분해효소 생산능을 이용한 미생물 제제, 사료 첨가제 및 건강기능식품 등을 제공한다.

Description

탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 및 이의 용도 {Novel strain of Mitsuokella multacida producing carbohydrase and use thereof}
본 발명은 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 β-갈락토시다아제 (β-galactosidase), 아밀라아제 (amylase) 및 셀룰라아제 (cellulase)와 같은 탄수화물 분해효소를 생산 및 분비하는, 돼지의 소화기관 유래 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP) 및 이의 탄수화물 분해효소 생산능을 이용한 미생물 제제, 사료 첨가제 및 건강기능식품 등을 제공한다.
β-갈락토시다아제 (β-galactosidase)는 유당과 같은 β-D-갈락토피라노사이드 (β-D-galactopyranoside)에서 비환원 말단 β-D-갈락토오스 (β-D-galactose)를 가수분해하거나, 갈락토오스 (Galactose)의 전이반응을 촉매한다. 일반적으로, 이 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 가지 특성을 가지고 있는데, 모두 산업적으로 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분해하여 유당불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당 (Galactooligosaccharide)의 제조에 이용된다.
β-갈락토시다제는 여러 종류의 미생물, 식물, 그리고 동물에서 발견되나, 현재 산업적으로 이용되는 대다수의 β-갈락토시다제는 미생물에서 분리된 것이다. 당 전이 반응의 특이성이 다른 β-갈락토시다제가 바실러스 속(Bacillus sp), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp) 등에서 분리되었으며, 그 외의 고온성 미생물에서 분리된 내열성 효소에 관한 연구도 다양하게 진행되었다.
한편, 난소화성 탄수화물은 영양적 가치가 떨어지며, 반추동물에서도 사료로서의 효율성이 떨어지고 물리적으로도 이물감을 준다. 특히, 돼지나 닭 같은 단위 동물은 이러한 난소화성 탄수화물이 주성분을 이루는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 효소를 가지고 있지 않아 세포벽 내에 들어있는 곡물의 전분이나 단백질 이용 효율이 매우 떨어진다. 따라서, 농축부산물에 존재하는 난소화성 탄수화물의 분해는 사료로서의 가치를 매우 높일 수 있다. 예를 들어, 소의 경우 볏짚을 직접 소화하는 것이 아니고 위에 존재하는 미생물의 도움으로 소화를 하는데, 이와 같은 작용을 볏짚에 적용하여 미생물로 볏짚에 함유된 셀룰로오스를 당화시킴으로써 사료 가치를 높일 수 있다. 난소화성 탄수화물인 셀룰로오스를 당화시키기 위해서는 셀룰라아제 (cellulase) 같은 효소가 필요하며, 효소 자체로 당화를 하기에는 실용화에 어려움이 많으므로 효소를 제공해 줄 미생물이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0080951호에는 흑염소 반추위 미생물 유래의 베타 갈락토시다아제 cel1-KG95 유전자를 이용하여 β-갈락토시다아제 활성 효소 단백질을 생산하고, 이를 섬유소 분해 증진용 사료 첨가제로 활용할 수 있다는 것이 개시되어 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 축산 사료 원료의 소화 흡수율을 증진시키면서, 일반 사료뿐만 아니라 난소화성 탄수화물을 주성분으로 하는 대두박, 팜박 등과 같은 사료 원료의 가치를 증진시키고, 농축부산물의 사료 자원화로 곡류 사료 대체 및 경쟁력을 확보하고자, β-갈락토시다아제를 비롯하여 난소화성 탄수화물 분해효소를 생산 및/또는 분비하는 균주를 돼지의 장내 미생물로부터 분리 및 동정하고, 이를 가축용 사료 첨가제, 건강기능식품 등으로 활용하고자 하였다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 탄수화물 분해효소를 생산 및/또는 분비하는 균주, 이를 포함하는 미생물 제제, 사료 첨가제 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호 KCTC14733BP로 기탁된, 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주를 제공한다.
추가로, 본 발명은 상기 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 미생물 제제를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) BG03 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP)는 β-갈락토시다아제, 아밀라아제 및 셀룰라아제와 같은 다양한 탄수화물 분해효소를 생산 및 분비하므로, 이를 적용함으로써 축산 사료 원료의 소화 흡수율을 증진시킬 수 있고, 난소화성 탄수화물 처리 기술 개발 및 대두박, 팜박과 같은 농축부산물의 사료 자원화로 곡류 사료를 대체하여 부가가치 상승을 기대할 수 있다.
도 1은 β-갈락토시다아제 효소 생산 후보 균주의 발굴을 위해 상업적으로 판매되는 β-갈락토시다아제 및 이의 기질인 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-갈락토피라노사이드)을 이용하여 겔 확산 검정 분석 조건을 확립한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 β-갈락토시다아제 효소 생산 후보 균주의 세포 용해물 (cell lysate)의 탄수화물 기질 4종 (전분, CM-셀룰로오스, X-gal 및 LGB) 각각에 대한 분해 활성을 겔 확산 검정 (Gel diffusion assay) 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)로 확인된 균주 생균의 탄수화물 기질 4종 (전분, CM-셀룰로오스, X-gal 및 LGB) 각각에 대한 분해 활성을 겔 확산 검정 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)로 확인된 균주의 배양액의 탄수화물 기질 4종 (전분, CM-셀룰로오스, X-gal 및 LGB) 각각에 대한 분해 활성을 겔 확산 검정 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 축산 사료 원료의 소화 흡수율을 증진시키면서, 난소화성 탄수화물을 주성분으로 하는 농축산부산물의 사료 가치를 증진시키고, 이들을 사료 자원화함으로써 곡류 사료 대체 및 경쟁력을 확보하기 위한 수단으로, β-갈락토시다아제 (β-galactosidase)를 비롯하여 난소화성 탄수화물 분해효소를 생산 및/또는 분비하는 미생물을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 돼지의 장내 유래 미생물 중 β-갈락토시다아제 (β-galactosidase), 아밀라아제 (amylase) 및 셀룰라아제 (cellulase)와 같은 탄수화물 분해효소를 동시에 생성 및/또는 분비하는 균주를 분리하였고, 16S RNA 유전자 분석을 통해 해당 균주가 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)임을 확인하여, 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다 (기탁번호 KCTC14733BP).
본 발명의 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP)는 β-갈락토시다아제, 아밀라아제 및 셀룰라아제와 같은 다양한 탄수화물 분해효소를 생산 및 분비하므로, 기존 축산 사료 원료의 소화 흡수율 증진 및 난소화성 탄수화물의 분해 활성을 증진시키기 위한 목적으로 사료 또는 식품에 첨가될 수 있고, 다양한 건강기능성 식품으로 활용가능하다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 기탁번호 KCTC14733BP로 기탁된, 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주에 관한 것이다.
본 발명의 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP)는 돼지의 소화기관, 특히 장내에서 유래된 것이다.
상기 탄수화물 분해효소는 β-갈락토시다아제 (β-galactosidase), 아밀라아제 (amylase) 및 셀룰라아제 (cellulase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP)의 분리 및 동정 방법은 다음과 같다.
먼저, 돼지의 분변에서 채취한 시료를 적절히 희석한 후, 이를 배지에 도말하고, 배양시켜 콜로니를 형성시킨 후, 미생물 균주를 분리하고 이의 세포 용해물을 제조하였다. 그런 다음, X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-갈락토피라노사이드)을 이용하여 상업 효소 β-갈락토시다아제 활성 분석 조건을 도 1과 같이 확립하고, 100 종 이상의 돼지 장내 유래 미생물 세포 용해물로부터 β-갈락토시다아제 활성 후보 균주 4종을 표 1과 같이 발굴하였다.
이때, 상기 배지로는 LBG 평판배지, 트립틱 소이(Tryptic soy) 평판배지, 뉴트리언트(Nutrient) 평판배지, 루리아-버타니(Luria-bertani) 평판배지 등을 사용할 수 있으며, 활성을 확인하고자 하는 효소의 종류에 따라 효소의 기질을 유일한 탄소원으로 첨가하여 해당 효소의 활성을 평가할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 후보 균주의 탄수화물 분해 활성을 확인하기 위해, 이의 세포 용해물을 이용하여, 4종의 탄수화물 기질 (전분, CM-셀룰로오스, X-gal 및 LBG)에 대한 분해 활성을 겔 확산 검정 방법에 따라 확인하였다. 그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 β-갈락토시다아제 생산 추정 후보 균주 4종은 모두 아밀라아제 및 셀룰라아제 효소 활성을 보유하고 있으며, 이들 중 BG03 균주는 β-갈락토시다아제 효소 활성이 가장 강력한 것으로 확인되었다.
가장 강력한 β-갈락토시다아제 효소 활성을 보유하는 것으로 확인된 후보 균주 BG03은, 16S RNA 유전자 분석 결과, 표 2에서 확인되는 바와 같이 16S RNA 유전자 서열이 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)와 99% 상동성을 나타내어, 최종적으로 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)로 동정되었다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)로 동정된 균주의 생균 및 배양액을 이용하여, 4종의 탄수화물 기질 (전분, CM-셀룰로오스, X-gal 및 LBG)에 대한 분해 활성을 겔 확산 검정 방법에 따라 추가로 확인하였다. 그 결과, 도 3 및 4에서 확인되는 바와 같이 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)로 동정된 BG03 균주의 생균 및 이의 배양액은 아밀라아제, 셀룰라아제 및 β-갈락토시다아제 효소들을 생산하며, 배양액 실험 결과를 바탕으로 하였을 때, 해당 효소들은 모두 세포외 유형인 것으로 추정된다.
따라서, 본 발명의 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida)로 동정된 BG03 균주는 아밀라아제, 셀룰라아제 및 β-갈락토시다아제 효소 활성을 보유하며, 동시에 아밀라아제, 셀룰라아제 및 β-갈락토시다아제 효소 생산능 및 분비능을 갖는다. 이러한 탄수화물 분해효소는 난소화성 탄수화물 분해효소 및 락토오스 분해효소에 해당하므로, 본 발명의 균주는 난소화성 탄수화물 및 락토오스의 분해 활성을 증진시켜 소화 흡수를 개선시키기 위한 목적으로 미생물 제제로서 사료 또는 식품에 첨가될 수 있고, 다양한 건강기능성 식품으로 활용가능하다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 전술한 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "세포 용해물"은 본 발명에 따른 상기 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주를 bead ruptor를 이용한 파쇄와 같은 물리적인 방법으로 단순히 터트려 추출하여 얻은 세포 내에 존재하는 모든 수용성 구성물질을 통칭하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수도 있다.　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주 자체를 의미하는 것으로 돼지의 분변으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제 형태로 제조되어 사료, 식품 또는 건강기능식품 등에 다양하게 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 상기 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주는 락토오스 또는 난소화성 탄수화물의 분해 활성을 증진시키기 위한 목적으로 사료에 첨가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 균주, 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 및 사과산 등과 같은 유기산; 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염)등과 같은 인산염; 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등과 같은 천연 항산화제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소 및 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들어, 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들어, 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들어, 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들어, 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들어, 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 첨가제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하며, 특히, 돼지가 바람직하나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 사료 첨가제에 포함되는 본 발명의 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주, 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물의 양은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 락토오스, 아밀로오스 또는 셀룰로오스와 같은 탄수화물을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 상기 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주는 락토오스 또는 난소화성 탄수화물의 분해 활성을 증진시키기 위한 목적으로 식품에 첨가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 균주, 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 용어, "건강기능식품 (Health functional food 또는 nutraceutical)"은, 특정보건용 식품, 기능성 식품, 건강식품과 동일한 용어로, 양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 난소화성 탄수화물의 분해 활성 증진에 유용한 효과를 얻기 위해 저제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어, "식품적으로 허용 가능한 담체"란 균주를 자극하지 않으면서, 이의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 식품학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
구체적으로, 상기 식품은 본 발명에 따른 균주를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡 슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등으로 사용될 수 있다.
상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 균주의 함량은 제형에 따라 조절할 수 있다. 본 발명에 따른 균주를 유효성분으로 포함하는 것 이외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 제제, 사료 첨가제 및 건강기능식품은 탄수화물 분해 활성 증진, 특히 락토오스 또는 난소화성 탄수화물 분해 증진 효능을 나타내며, 상기 난소화성 탄수화물은 셀룰로오스이거나, 셀룰로오스를 유효성분으로 다수 함유하는 볏짚, 밀짚 부산, 채소 부산물 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하기에 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 20 mg, 유당수화물 100 mg 및 탈크 10 mg.
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당수화물 100 mg 및 스테아르산마그네슘 2 mg.
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 10 mg, 미결정셀룰로오스 3 mg, 유당수화물 14.8 mg 및 스테아르산마그네슘 0.2 mg.
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 균주 10 mg, 만니톨 180 mg, 주사용 멸균 증류수 2974 mg 및 인산일수소나트륨 26 mg.
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플 당(2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 10 mg, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g, 정제수 적량 및 레몬향 적량.
상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강기능식품의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 10 mg, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B1 0.13 ㎎, 비타민 B2 0.15 ㎎, 비타민 B6 0.5 ㎎, 비타민 B12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎.
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 사료 첨가제 조성물의 제조
본 발명에 따른 미츠오켈라 멀타시다 균주 (기탁번호 KCTC14733BP), 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물 10 g, 비타민 B1 0.2 g, 비타민 B2 0.2 g, 비타민 D 0.2 g, 비타민 E 0.2 g, 비타민 P 0.2 g, 판토텐산 0.2 g, 아미노산 0.2 g, 콜린 0.2 g 및 부형제로서 글루코오즈 178.4 g을 혼합하여 본 발명의 사료 첨가제 조성물을 제조하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
β-갈락토시다아제 생산 균주의 분리
1-1. 돼지의 장 유래 미생물 균주의 분리
천안에 위치한 국립축산과학원 양돈장 내 사육중에 있는 3원교잡 (LYD) 돼지들로부터 채취한 각각의 분변 시료 중 1 g을 멸균 생리 식염수 (0.85% NaCl) 9 mL에 현탁시키고, 5%의 양 혈액 (sheep blood)이 포함된 TSA (Tryptic soy agar) 배지 (이하, TSA 혈액 배지)에 104 ~ 106으로 희석한 희석액 0.1 mL을 도말하여 37℃ 혐기성 배양기에서 48 시간 배양하였으며, 배양 후 해당 배지 표면에 증식한 독립된 단일 집락을 백금이로 다시 채취하여 혐기적 조건하에서 같은 배지에 재접종과 배양하는 과정을 수차례 실시하여 순수하게 분리된 균주 100종 이상을 확보하였다.
1-2. β-갈락토시다아제 효소 생산 장 유래 미생물 후보 균주 발굴을 위한 대상 효소 기질 X-gal 이용 겔 확산 검정 분석 조건 확립
돼지 분변으로부터 분리된 100종 이상의 장 유래 미생물 균주의 β-갈락토시다아제 활성 유무 확인을 위하여, β-갈락토시다아제 효소에 특이적으로 반응하여 초록색을 나타내는 기질인 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-갈락토피라노사이드)을 0.02%되게 첨가된 멸균 TSA 배지를 제조한 후, 여기에 상업적으로 판매되는 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 유래 β-갈락토시다아제 (Sigma-Aldrich, G5160) 효소를 멸균 인산완충생리식염수 (PBS; Phosphate buffered saline) 용액에 10, 20, 50 및 100 mU 활성 단위로 희석하여 5 μL 씩 48 시간 접종 및 배양하여 겔 확산 분석 조건을 확립하였다 [도 1].
1-3. 돼지 장 유래 미생물 균주 세포 용해물을 이용한 β-갈락토시다아제 효소 생산 균주 4종 선별
앞서 확립된 X-gal TSA 배지 분석 조건를 이용하여 β-갈락토시다아제 효소를 생산하는 돼지 장 유래 미생물 후보 균주를 발굴하고자, 확보된 100종 이상의 균주 각각을 TSA 혈액 배지에 도말하여 37℃에서 24 시간 혐기적 배양을 하였다. 이어 미생물 균주의 세포 용해물을 제조하기 위하여, 도말되어 증식된 각각의 미생물 콜로니들은 균주별로 모아 PBS 용액에 현탁시키고 bead ruptor (직경 0.2 mm 유리 비드 포함)에서 5 분간 파쇄를 실시하였으며, 10000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 얻어진 상층액을 멸균 여과 필터 (pore size 0.2 μm)로 여과하여 준비하였다. 얻어진 균주별 세포 용해물은 단백질 농도가 200 μg/mL이 되도록 희석한 후, 이중 25 μL (단백질 농도 기준 5 μg)를 X-gal 기질이 포함된 TSA 배지에 세번에 나누어 접종하고 37℃에서 48 시간 배양을 통해 β-갈락토시다아제 효소 활성 존재 유무를 평가하였다. 실험 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 100종 이상의 돼지 장 유래 미생물로부터 4종의 균주가 β-갈락토시다아제 효소 활성을 지니고 있음이 확인되었다.
100종 이상 돼지 장 유래 미생물 중 선별된 β-갈락토시다아제 활성 보유 균주 탐색 결과
효소 활성 균주 균수
β-갈락토시다아제 활성 BG01 4
BG02
BG03
BG04
β-갈락토시다아제 생산 후보 균주 4종의 탄수화물 기질별 분해 활성 평가
선별된 β-갈락토시다아제 활성 보유 돼지 장 유래 미생물 후보 균주 4종이 해당 분해 활성 이외에도 다른 탄수화물에 대한 분해능을 가지는지 살펴보기 위하여, 기질로서 1%의 전분, 0.2%의 CM-셀룰로오스, 0.25%의 로커스트 빈 검(LBG; locust bean gum)이 포함된 각각의 TSA 배지를 제조하고 여기에 β-갈락토시다아제 생산 후보 균주 4종의 세포 용해물 5 μg을 접종하고 혐기적 조건하에서 48 시간 배양하였다. 배양의 종료시점에 이르러 이들 후보 균주 4종의 전분 분해 활성 평가는 Gram's iodine 염색법을, 그리고 CM-셀룰로오스 및 LBG 분해 활성 평가는 Congo red 염색법을 이용하여 나타나는 투명한 환의 존재 유무로 판단하였다. 실험의 검증을 위한 대조구로는 0.02% X-gal 함유 TSA 배지를 이용하였다. 실험 결과, 도 2에 제시한 것과 같이 이들 후보 균주 4종 역시 앞서의 결과와 동일한 β-갈락토시다아제 활성을 보유하고 있음이 재검증을 통해 확인되었으며, 전분 및 CM-셀룰로오스 분해 활성 또한 지니고 있음을 나타내었다. 게다가 BG03 균주의 경우, 다른 3종의 후보 균주들 보다 β-갈락토시다아제 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 그러나, LBG 분해 활성은 이들 후보 균주 4종 모두 가지고 있지 않았다.
우수한 β-갈락토시다아제 효소 생산 BG03 균주의 동정
β-갈락토시다아제 활성이 가장 우수하였던 돼지 장 유래 미생물 후보 균주 BG03의 균주 동정을 위하여, 해당 미생물의 16S RNA 유전자 분석을 염기서열 전문 분석업체인 ㈜마크로젠에 의뢰하였다. 그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 해당 BG03 균주는 상동성 99%를 나타내며 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주인 것으로 동정되었다.
β-갈락토시다아제 활성 우수 후보 균주 BG03의 16S RNA 유전자 분석 결과
No. 동정 결과 상동성 유전자 서열
BG03 Mitsuokella multacida 99% CACAGTCGGCGTCTCCAGCGGATGCTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGGA GGGGTCGATACCTCCTACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTAC
CAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAG
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(서열번호 1)
미츠오켈라 멀타시다 ( Mitsuokella multacida ) BG03 균주의 생균 및 배양액의 탄수화물 기질별 분해 활성 평가
선별된 돼지 장 유래 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) BG03 균주의 세포 용해물이 가지는 전분, CM-셀룰로오스 및 X-gal과 같은 다양한 탄수화물 기질들에 대한 분해 활성이 해당 균주의 생균 및 배양액에서도 재현되는지를 확인하기 위하여, BG03 균주를 TSA 혈액 배지에 도말하여 단일 콜로니 배양을 실시한 다음 단일 집락 하나를 10 mL의 TS 배양액 (Tryptic soy broth)에 접종하여 37℃에서 혐기적인 조건하에서 24 시간 배양하였다. 이후 4000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 생균과 배양액을 분리하였다. BG03 생균의 경우, 동일 원심분리 조건에서 1 mL PBS 용액으로 2번 세척을 실시한 후에 최종적으로 같은 용량의 PBS 용액에 현탁하여 이중 10 μL를 앞서 수행한 BG03 균주 세포 용해물 실험에 이용하였던 동일한 1% 전분, 0.2% CM-셀룰로오스, 0.02% X-gal 및 0.25% LBG가 함유된 TSA 배지에 각각 접종하여 혐기적 조건하에서 48 시간 배양을 통해 탄수화물 기질별 분해 활성 정도를 평가하였다. 또한 BG03 균주 배양액은 멸균 여과 필터 (pore size 0.2 μm)로 여과한 후에 냉동하고 동결건조기를 이용하여 수분을 완전히 제거한 다음 여기에 멸균 증류수 2 mL을 첨가하여 최종적으로 5배 농축시켜 제조하였다. 제조된 5배 농축 BG03 균주 배양액은 생균 접종 시에 이용된 동일한 4종의 기질별 TSA 배지들에 각각 25 μL씩 4번 총 100 μL 접종하여 혐기적 조건에서 48시간 배양에 따른 활성 평가를 실시하였다. 실험 결과, 도 3에 나타낸 것처럼 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) BG03 균주 생균 역시 해당 균주의 세포 용해물 실험 결과와 일치하는 분해 활성을 나타내었다. 즉, BG03 균주 생균은 아밀라아제, 셀룰라아제 및 β-갈락토시다아제 효소 활성을 지니고 있음이 관찰되었으며, 이는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) BG03 균주가 적어도 이들 3종의 탄수화물 분해 효소들을 생산한다는 것을 의미하였다. 반면, LBG에 대한 분해 활성은 나타나지 않았다. 또한, 해당 BG03 균주의 배양액도 도 4에서 나타낸 것처럼 생균 및 세포 분해물의 평가 결과와 일치하여 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) BG03 균주는 생균 내에서 생산된 3종의 탄수화물 분해 효소들을 최종적으로 세포 외부로 분비한다는 것을 암시하였다.
생균 및 배양액의 탄수화물 기질별 분해 활성 평가를 통해 아밀라아제, 셀룰라아제 및 β-갈락토시다아제와 같은 3종의 탄수화물 분해 효소들을 생산 및 분비하는 것으로 확인된 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) BG03 균주는 한국생명공학연구원에 기탁하여 아래와 같이 기탁번호를 부여받았다.
한국생명공학연구원 KCTC14733BP 20211018
SEQUENCE LISTING <110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Novel strain of Mitsuokella multacida producing carbohydrase and use thereof <130> 1069326 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1199 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mitsuokella multacida 16S RNA <400> 1 cacagtcggc gtctccagcg gatgcttatt gcgttaactc cggcacagga ggggtcgata 60 cctcctacac ctagcattca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc 120 gctccccacg ctttcgagcc tcagcgtcag ttacagtcca gaaagccgcc ttcgccactg 180 gtgttcctcc taatatctac gcatttcacc gctacactag gaattccgct ttcctctcct 240 gcactcaaga agaccagttt ccatcccctc acggggttga gccccgcact tttaagatag 300 acttgatctc ccgcctgcgc tccctttacg cccaataatt ccggacaacg ctcgccacct 360 acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct tcctcgtcag gtaccgtcat 420 tggaaacggt tattcacaat ctccacattc gtccccgaca acagagcttt acgagtcgaa 480 acccttcttc actcacgcgg cgttgctccg tcaggcttgc gcccattgcg gaagattccc 540 cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tgtctcagtt ccaatgtggc cgttcatcct 600 ctcagaccgg ctactgatcg tcgccttggt aagccgttac cccaccaact agctaatcag 660 acgcagaccc atcgtaaagc gatagcttac aagtagaggc catctttagt agagctccca 720 tgcggaagtt ccacaacatt cggtattagc agtcctttcg gactgttgtc cccatcttta 780 cggcaggttg tctacgcgtt actcacccgt ttgccactcg actttcaaaa gcaagctttc 840 aatcgtctcg ttcgacttgc atgtgttaag cacgccgcca gcgttcgtct gaccggggga 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaacc cccccccggg ggggggaggg gggtttattc cccccccccc 960 ccaaaacacc cccggggggg ttttttttgg ggggaaaaaa aaaaaattct ccccctttga 1020 aaaaaaaaaa aaaaaggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 1080 gggggcgggg gggggggggg ggccgggccg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 1140 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggggggg 1199

Claims (10)

  1. 탄수화물 분해효소를 생산하는 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주 (기탁번호 KCTC14733BP).
  2. 제1항에 있어서, 돼지의 소화기관 유래인 것인, 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 분해효소는 β-갈락토시다아제 (β-galactosidase), 아밀라아제 (amylase) 및 셀룰라아제 (cellulase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 16S RNA 염기서열을 포함하는, 미츠오켈라 멀타시다 (Mitsuokella multacida) 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주, 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 미생물 제제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주, 이의 세포 용해물, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가제.
  7. 제6항에 있어서, 탄수화물 분해 활성 증진을 위해 첨가되는, 사료 첨가제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 탄수화물은 락토오스 또는 난소화성 탄수화물을 포함하는, 사료 첨가제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 난소화성 탄수화물은 셀룰로오스이거나, 셀룰로오스를 유효성분으로 포함하는 볏짚, 밀짚 부산물, 채소 부산물 또는 이들의 혼합물인, 사료 첨가제.
  10. 제6항에 있어서, 돼지의 사료에 첨가되는 것인, 사료 첨가제.
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