KR20190098465A - 효모를 이용하여 이취가 개선된 발효 조성물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 발효 조성물 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는, 곡물 분말을 준비하는 단계, 효모를 이용하여 상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계, 바실러스 속 균주를 이용하여 상기 1차 발효물을 2차 발효하는 단계 및 상기 2차 발효물을 수득하는 단계를 포함하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법에 관한 것이다. 본 출원의 발효 조성물은 저분자 펩타이드의 함량이 높아, 섭취시 단백질의 소화율 및 흡수율을 높일 수 있을 뿐 아니라, 발효물 특유의 이취가 개선되어 기호성을 높일 수 있다.
Description
본 출원은 발효 조성물 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는, 곡물 분말을 준비하는 단계, 효모를 이용하여 상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계, 바실러스 속 균주를 이용하여 상기 1차 발효물을 2차 발효하는 단계 및 상기 2차 발효물을 수득하는 단계를 포함하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법; α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는, 바실러스 발효물의 이취 개선용 효모; 상기 효모를 포함하는 곡물 발효용 조성물; 상기 제조방법으로 제조된 발효 조성물; 및 상기 효모 또는 발효 조성물을 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.
곡물은 에너지 함량이 높아 사료 효율이 높고 조섬유 함량이 낮아 소화율이 좋으므로, 가축용 사료로 널리 사용되고 있다. 그러나, 곡물 사료는 단백질 및 아미노산의 조성이 낮으므로, 균형적인 영양을 위하여 이를 보충하는 급여가 필수적으로 요구된다. 이러한 단백질 공급원으로서 어분, 탈지분유, 육분, 혈분 등 동물성 단백질원과 대두, 채종, 아마 등 식물성 단백질원이 사용된다. 식물성 단백질원 중 하나인 옥수수글루텐은 옥수수전분 제조과정의 부산물로서, 단백질 함량이 높은 어분과 함량이 유사(일반 식물성 단백질원의 약 3배)하고 가격이 저렴하여 사료의 단백질 공급원으로 널리 사용되고 있다. 또한, 대두로부터 대두유를 생산한 후 남는 부산물인, 대두박은 단백질 함량이 높기 때문에 사료 내 주요한 단백질 공급원으로 사용되고 있다.
그러나 상기 대두박 또는 옥수수글루텐에 포함된 난소화성 올리고당, 제조공정상 변성된 비용해성 단백질 등에 의해 소화율이 저하되어, 사료 사용에 문제가 있어, 대두박 또는 옥수수글루텐을 양질의 고단백 사료로 사용하기 위해 단백질 부분의 소화율을 향상시킬 수 있는 새로운 가공방법의 개발이 요구되고 있다.
또한, 이와 관련하여 최근 사료 조성물에 이용될 수 있는 다양한 복합 미생물 제제가 개발되고 있으나, 미생물간의 생리작용 및 상호작용에 대해 고려하지 못하고 있다는 문제점이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 곡물 분말을 효소 처리함으로써 원료 내 수용성 당 함량을 증가시키고, 효모 발효 및 바실러스 발효를 통하여 단백질을 농축시킬 수 있으므로, 곡물 분말 내 단백질 함량비 및 생균수를 증가시켜 조성물의 기능성을 개선시킬 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 곡물 분말을 준비하는 단계, 효모를 이용하여 상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계, 바실러스 속 균주를 이용하여 상기 1차 발효물을 2차 발효하는 단계 및 상기 2차 발효물을 수득하는 단계를 포함하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은, α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는, 바실러스 발효물의 이취 개선용 효모를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 상기 효모를 포함하는 곡물 발효용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 상기 제조방법으로 제조된 발효 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 상기 효모 또는 발효 조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 출원은 곡물 분말을 준비하는 단계, 효모를 이용하여 상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계, 바실러스 속 균주를 이용하여 상기 1차 발효물을 2차 발효하는 단계 및 상기 2차 발효물을 수득하는 단계를 포함하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법의 곡물 분말을 준비하는 단계에 있어서, 상기 곡물 분말은 사료 제조 공정에서 일반적으로 사용되는 원료를 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 곡물 분말은 대두, 대두박, 옥수수 또는 옥수수글루텐 등을 포함할 수 있으며, 더 구체적으로 대두박 또는 옥수수글루텐을 포함할 수 있고, 보다 더 구체적으로 대두박 및 옥수수글루텐을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 곡물 분말은 수분 함량이 조절된 후 열처리된 것일 수 있다. 미생물이 생장하기 위해서는 일정 수준 이상의 수분이 필요하며, 원료 자체적으로 포함된 수분(5 내지 12%)에서는 미생물이 원활하게 생장하기 어려운 것으로 알려져 있다. 또한, 글루코아밀라아제, 단백질분해효소 등과 같은 대부분의 효소는 가수분해를 기반으로 분해 반응이 일어나기 때문에, 일정 수준 이상의 수분이 함유 되어야 원활한 효소 반응이 가능한 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 상기 곡물 분말 내 수분함량은 30 내지 60%일 수 있으며, 더 구체적으로는 35 내지 55%일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 40 내지 50%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 수분 함량의 범위를 갖는 조성물은 저수분으로 인한 발효속도의 지연을 방지하고 원료의 이송 및 발효 후 건조 공정에 많은 비용이 소요되는 문제점을 개선할 뿐만 아니라 열효율 측면에서 유리할 수 있다.
특히, 수분 함량은 조성물의 발효시 단백함량의 상승도에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 수분함량이 낮을수록 미생물의 생장에 불리하여, 발효에 따른 조성물의 단백함량 상승 수준이 감소하는 양상을 나타낼 수 있다. 또한, 수분 함량이 지나치게 높을 경우, 발효 종료 시점에서 포함된 수분을 제거하기 위한 건조 비용이 높아져, 제조원가가 상승하고 제품 경쟁력이 낮아지는 문제가 있을 수 있다.
한편, 열처리 과정은 원료 자체에 포함된 유해 미생물을 살균하고 대두박 또는 옥수수글루텐 내의 항영양인자(trypsin inhibitor) 같이 소화율을 저해하는 물질을 감소시킬 수 있다. 또한, 옥수수글루텐은 흡습성이 낮기 때문에, 가수 후 열처리 과정을 통해 옥수수글루텐 내에 충분한 수분이 함유될 수 있도록 도움을 줄 수 있다. 열처리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 스팀 (steam) 또는 과열 수증기 (superheated steam)를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 열처리는 구체적으로 90℃ 내지 110℃의 온도에서 20분 내지 40분 동안 이루어질 수 있으며, 더 구체적으로 95℃ 내지 105℃의 온도에서 25분 내지 35분 동안 이루어질 수 있으며, 보다 더 구체적으로 100℃의 온도에서 30분 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
열처리 온도가 낮거나 처리 시간이 짧은 경우에는 잡균의 살균 효과가 저하되고 이후의 발효 공정이 원활하게 진행되지 않는 문제점이 있으며, 열처리 온도가 높거나 처리 시간이 길어지는 경우에는 조성물 내 단백질의 변성으로 인한 소화율이 감소되어 최종 제품의 품질이 저하되는 문제점이 발생할 수 있다.
본 출원의 상기 제조방법에서, 상기 1차 발효 단계는 효모를 이용하여 상기 곡물 분말을 발효하는 단계이다.
본 출원에서 용어, “효모”는 곰팡이나 버섯 무리이지만 균사가 없고, 광합성능이나 운동성도 가지지 않는 단세포 생물의 총칭이다. 효모 자체는 값싼 지방·단백질원으로 사료에 사용되며, 식품이나 사료의 발효에도 사용될 수 있다. 상기 발효 조성물의 효모 발효에 사용되는 효모는 구체적으로 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
효모는 올리고당을 분해할 수 있는 효소를 분비하므로 식물성 사료 원료 내 올리고당을 분해할 수 있을 뿐만 아니라, 효모의 세포벽은 동물에게 유용한 성분으로 작용할 수 있으므로, 이를 이용한 발효 조성물의 제조방법은 식물성 원료의 성분 및 기능성을 개선할 수 있다.
본 출원의 효모는 α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는 효모일 수 있으며, 보다 구체적으로 기탁번호 KCCM12123P 또는 기탁번호 KCCM12124P로 기탁된 사카로마이세스 세레비지에일 수 있다. 일반적으로 모든 효모가 α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 모두 생성하는 것은 아니나, 본 출원의 효모는 상기 효소를 생성할 수 있어, 다른 효모에 비해 바실러스 발효에 의한 발효물, 발효 조성물의 이취 개선 효과가 우수하다.
발효 조성물에 접종하는 효모의 양은 발효를 좌우하는 중요한 요인이 될 수 있는데, 접종량은 구체적으로 접종 직후의 균수가 105 내지 109 CFU/g인 것일 수 있으며, 더 구체적으로는 106 내지 108 CFU/g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
접종량이 너무 적을 경우에는 종균 발효액의 소요량이 적은 반면 조성물을 발효시키는데 많은 시간이 소요되어 제품 생산에 요구되는 발효시간이 길어지고 잡균이 오염될 가능성이 높은 단점이 있다. 반면, 접종량이 너무 많을 경우에는 발효시간은 상당히 단축될 수 있으나, 접종용 종균의 생산이 부담되는 단점이 있다. 특히 사용하는 발효 균주의 생육 특성과 발효 장치의 종류에 따라 발효 성적이 크게 좌우되므로, 당업자는 생산 단계에서 균주의 특성을 고려하여 접종량을 적절히 선정할 수 있다.
본 출원의 상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계는, 곡물 분말에 효소를 추가로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, α-아밀라아제 (α-amylase) 또는 글루코아밀라아제 (glucoamylase)를 추가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 제조방법은, 곡물 분말에 효소를 처리함으로써 원료 내 수용성 당 함량을 증가시키고, 효모 발효를 통하여 원료 내 단백함량을 농축시킬 수 있으므로 곡물 분말 내 단백질 함량비를 증가시켜 조성물의 기능성을 개선할 수 있다.
상기 곡물 분말을 효소 처리하는 단계는 구조탄수화물 (structural carbohydrate)을 분해하는 단계에 해당한다.
본 출원에서, 용어 “구조탄수화물 (Structural carbohydrate)”은 식물 세포의 세포벽을 구성하는 셀룰로우즈, 헤미셀룰로우즈, 펙틴 등과 같은 이용성이 낮은 탄수화물을 의미한다. 상기 구조탄수화물은 대두박, 옥수수글루텐과 같은 사료 원료에 대한 발효 미생물의 이용률을 저해하며, 가축의 흡수율 및 소화율을 저해할 수 있다. 따라서, 구조탄수화물을 분해하여 발효 미생물의 기질 이용률, 가축의 흡수율 및 소화율을 향상시킬 수 있도록 효소를 처리하는 단계를 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 구조탄수화물을 분해하는 효소는 α-아밀라아제 (α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 셀룰라아제 (cellulase), 펙틴 분해효소 (pectin enzyme) 등이 있으며, 더욱 구체적으로, α-아밀라아제 (α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효소 처리 단계는 효소의 종류에 따라 상기 곡물 분말에 효모를 접종하여 발효시키는 단계와 동시에, 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
구체적으로, 동시에 진행되는지 여부는 사용되는 효소의 종류에 따라 달라질 수 있다. 효소마다 활성 조건이 상이하므로, 효소의 활성 조건과 효모 발효 조건을 고려하여, 효소 처리단계와 효모 발효단계가 수행될 수 있다. 예컨대, 고온성 α-아밀라아제를 사용하는 경우에는 효소 활성조건이 고온을 요구하므로, 곡물 분말을 수분 처리한 후, 열처리 전에 효소를 첨가하여 열처리 공정과 효소 처리 단계를 동시에 수행할 수 있다. 즉, 열처리 공정과 효소 처리단계 이후에, 효모 발효단계가 수행될 수 있다.
반면, 글루코아밀라아제 또는 중온성 α-아밀라아제를 사용하는 경우에는 효소 활성이 고온을 요구하지 않으므로, 곡물 분말을 수분 처리하고 열처리한 후에, 효소 처리단계를 수행할 수 있다. 이 경우에는, 효소 반응과 효모 발효가 각각 따로 진행되거나, 동시에 진행될 수 있다. 예를 들면, 글루코아밀라아제 또는 중온성 α-아밀라아제를 곡물 분말에 첨가하여 50℃ 내지 70℃ 에서 30분 내지 1시간 30분 동안 효소 반응을 진행한 후, 효모를 접종하여 효모 발효를 진행시킬 수 있다. 또는, 공정의 최적화를 위하여 효소와 효모를 동시에 첨가하여, 효소 반응단계와 효모 발효단계를 동시에 수행할 수 있다
상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계는, 곡물 분말에 글루코아밀라아제를 0.1 내지 1.0, 0.3 내지 0.7, 또는 0.5 중량%로 첨가하는 단계; 효모 배양액을 1 내지 30, 1 내지 20, 5 내지 15, 8 내지 12, 또는 10 중량% 접종하는 단계; 또는 효모 배양액이 접종된 곡물 분말에 대해 10 내지 50, 20 내지 40, 25 내지 35, 또는 30℃ 온도에서 1 내지 10, 2 내지 10, 4 내지 8, 5 내지 7 또는 6시간 동안 혐기 발효를 진행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 제조방법에서, 상기 2차 발효 단계는 바실러스 속 (genus) 균주를 이용하여 상기 1차 발효물을 추가로 발효하는 단계에 해당하며, 1차 발효 후 순차적으로 2차 발효가 이루어진다.
바실러스(Bacillus) 속은 바실러스과의 한 속으로, 바실러스 속의 세균들은 그람양성의 막대모양균(간균)이다. 구체적으로, 상기 바실러스 속 균주는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 토요이(Bacillus toyoi), 바실러스 코어귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 및 바실러스 아밀로리쿼페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주일 수 있으며, 더욱 구체적으로 바실러스 아밀로리쿼페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)일 수 있다. 보다 더 구체적으로, 상기 바실러스 속 균주는 기탁번호 KCCM11471P로 기탁된 바실러스 아밀로리쿼페시언스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
발효 조성물에 접종하는 바실러스 속 균주의 양은, 상기 효모의 접종량의 경우에 대해 전술한 바와 같다.
바실러스는 발효 중 암모니아 생성을 통해 톡 쏘는 향을 나타내며, 이는 발효 조성물의 기호성에 영향을 미칠 수 있으나, 본 출원의 상기 제조방법은 효모 및 바실러스 순차 발효를 통해 발효물 특유의 이취를 개선하여 기호성을 높일 수 있다.
또한, 효모 발효와 바실러스 속 균주에 의한 발효를 순차적으로 수행하여, 발효 조성물 내의 생균수를 월등히 증가시킬 수 있으며, 이러한 생균수 증가는 발효 조성물의 생균제 효과를 향상시킬 수 있다.
본 출원의 발효 조성물 제조방법에서는, 효모와 바실러스 각각의 특징 및 장점이 결합된 발효 조성물을 제조할 수 있다. 일반적으로, 바실러스는 알파-갈락토시다아제를 생성하지 못해, 해당결합을 갖는 다당류를 완벽히 분해하지 못하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 효모에는 알파-갈락토시다아제 생산능을 갖는 균주가 있으며, 이로써 바실러스 속 균주만으로는 분해하기 어려운 대두박 또는 옥수수글루텐의 당 성분이 효모에 의해 분해되어, 발효 균주의 성장 및 대사를 위한 기질로서 유용하게 활용될 수 있다.
구체적으로, 효모에서 발현되는 올리고당 분해효소를 통해 곡물 분말의 올리고당을 분해하고, 효모 자체의 생균수를 증가시켜 효모 내 기능성 성분 함유량을 증가시킴으로써, 발효 조성물의 기능성을 개선할 수 있다. 또한, 바실러스에서 발현되는 단백질 분해효소에 의해 곡물 분말 내의 단백질이 펩타이드로 분해됨으로써 사료 조성물의 소화율 및 흡수율을 향상시킬 수 있다.
본 출원의 발효 조성물 제조방법에서, 상기 발효는 고체발효 또는 액상발효일 수 있으며, 구체적으로 상기 발효는 고체발효일 수 있다.
본 출원에서 용어, “고체발효”는 일정량의 수분을 함유한 고체상태의 원료로 미생물에 의해 발효 생산을 하는 것을 의미한다.
본 출원의 상기 2차 발효 단계는 효모 접종 후 2 내지 10, 4 내지 8, 5 내지 7 또는 6 시간 후, 바실러스 속 균주의 배양액을 1 내지 30, 1 내지 20, 5 내지 15, 8 내지 12, 또는 10 중량% 접종하는 단계; 35 내지 40, 또는 37℃의 온도, 80 내지 100, 90 내지 100, 93 내지 97, 또는 95%의 습도에서 호기 발효를 진행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 2차 발효 단계를 거친 2차 발효물은 저분자 펩타이드의 함량이 30 내지 100%인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 40 내지 100, 50 내지 100, 60 내지 100, 40 내지 90, 50 내지 90, 40 내지 80, 50 내지 80, 40 내지 70, 또는 50 내지 7O % 인 것일 수 있다.
상기 "저분자 펩타이드"는 30kDa 이하의 분자량을 갖는 펩타이드를 의미한다. 보다 구체적으로 0.1 내지 30kDa, 1 내지 30kDa, 0.1 내지 20kDa, 1 내지 20kDa, 0.1 내지 10kDa, 1 내지 10kDa, 또는 10kDa 이하의 분자량을 갖는 펩타이드일 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태로서, 본 출원은 α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는, 바실러스 발효물의 이취 개선용 효모를 제공한다.
본 출원의 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 효모를 포함하는 곡물 발효용 조성물, 상기 효모를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 제조방법으로 제조된 발효 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 발효 조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 α-갈락토시다제, 프로테아제, 피타아제, 바실러스 발효물, 효모에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
상기 효모는 α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는 효모일 수 있으며, 보다 구체적으로 기탁번호 KCCM12123P 또는 기탁번호 KCCM12124P로 기탁된 사카로마이세스 세레비지에일 수 있다.
본 출원의 용어 “사료 조성물”이란 개체의 생명을 유지하고 상기 개체를 사육하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 상기 사료 조성물은 사료를 섭취하는 개체가 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등 영양소를 포함할 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등의 식물성 사료 또는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 어분 등의 동물성 사료가 될 수 있다. 본 출원에서 상기 사료 조성물은 사료에 첨가되는 물질 (즉, 사료 첨가제), 사료 원료 또는 개체에 급여되는 사료 자체를 모두 포함하는 개념이다.
상기 개체는 사육 대상을 의미하는 것으로 본 출원의 사료를 섭취할 수 있는 생명체라면 제한 없이 포함될 수 있다. 이에, 본 출원의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭, 오리, 거위 등이 포함되며, 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.
본 출원에 따른 사료 조성물 내 대두박 또는 옥수수글루텐의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 구체적으로는 10 내지 90 중량%, 더욱 구체적으로는 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 사료 조성물은 투여를 위해서 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
또한, 본 출원의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 출원의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.
본 출원에 따른 사료 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 구체적으로는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거칠 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 본 출원의 방법에 따라, 곡물 분말을 효소 처리함으로써 원료 내 수용성 당 함량을 증가시키고, 효모 발효 및 바실러스 발효를 통하여 단백질을 농축 및 분해할 수 있으므로, 곡물 분말 내 단백질 함량비를 증가시켜 사료 조성물의 소화율, 흡수율 및 기능성을 개선할 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 바실러스 발효물은 발효과정 동안 암모니아 등에 의한 특유의 취가 발생하며, 이는 해당 발효물을 사료 등으로 사용함에 있어 문제가 될 수 있다. 본 출원의 효모는 바실러스 발효와의 복합 발효에 사용됨으로써, 바실러스 발효로 인한 발효물의 이취를 현저히 저감시킬 수 있으며, 상기 효모를 포함하여 이취가 개선된 곡물 발효용 조성물, 사료 조성물을 제공할 수 있다.
본 출원의 발효 조성물 제조방법은, 곡물 분말을 효소 처리함으로써 원료 내 수용성 당 함량을 증가시키고, 효모 발효를 통하여 단백질을 농축시킬 수 있으므로, 곡물 분말 내 단백질 함량비를 증가시켜 발효 조성물의 기능성을 개선시킬 수 있다. 특히, 효모는 올리고당을 분해할 수 있는 효소를 분비하므로 식물성 사료 원료 내 올리고당을 분해할 수 있을 뿐만 아니라, 효모의 세포벽은 동물에게 유용한 성분으로 작용할 수 있으므로, 이를 이용한 발효 조성물의 제조방법은 식물성 원료의 성분 및 기능성을 개선할 수 있다. 또한, 본 출원의 발효 조성물의 제조방법은, 효모 발효 이후에 바실러스 발효 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 바실러스는 단백질 분해효소를 생성하므로 발효 조성물 내 단백질을 펩타이드화 할 수 있다. 이에 따라 사료의 단백질 소화율 및 흡수율을 향상시킬 수 있다. 나아가, 본 출원의 발효 조성물 제조방법은 효모 및 바실러스 순차 발효를 통해 바실러스 발효로 인한 특유의 이취를 개선하여, 조성물의 기호성을 높일 수 있다.
도 1은, 곡물 원료군, 혼합 곡물의 바실러스 단독 발효군, 혼합 곡물의 효모 단독 발효군, 및 혼합 곡물의 효모와 바실러스 복합 발효군 내 당성분을 측정한 결과에 관한 것이다.
(① 표준물질 (아래부터 Stachyose, raffinose, sucrose,glucose), ② 대두박 원료 ③ 옥수수글루텐 원료 ④ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, 바실러스 단독발효 ⑤ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, CJN1697 효모 단독발효 ⑥ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, CJN1697+ 바실러스 ⑦ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, CJN2343+ 바실러스 ⑧ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, Angest+ 바실러스)
도 2는, 곡물 원료군 (대두박, 옥수수글루텐, 및 혼합 곡물 원료), 곡물 원료의 바실러스 단독 발효군, 곡물 원료의 효모 단독 발효군, 및 곡물 원료의 효모와 바실러스 복합 발효군 각각에 대한 단백질 성분을 분석한 결과에 관한 것이다.
도 3은 CJN1697 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CJN2343 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 것이다.
(① 표준물질 (아래부터 Stachyose, raffinose, sucrose,glucose), ② 대두박 원료 ③ 옥수수글루텐 원료 ④ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, 바실러스 단독발효 ⑤ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, CJN1697 효모 단독발효 ⑥ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, CJN1697+ 바실러스 ⑦ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, CJN2343+ 바실러스 ⑧ 대두박+옥수수글루텐 혼합 곡물, Angest+ 바실러스)
도 2는, 곡물 원료군 (대두박, 옥수수글루텐, 및 혼합 곡물 원료), 곡물 원료의 바실러스 단독 발효군, 곡물 원료의 효모 단독 발효군, 및 곡물 원료의 효모와 바실러스 복합 발효군 각각에 대한 단백질 성분을 분석한 결과에 관한 것이다.
도 3은 CJN1697 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CJN2343 균주의 계통수 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 누룩 균주 스크리닝
누룩 균주들 중에서, α-갈락토시다제 (α-galactosidase), 프로테아제 (protease), 및 피타아제 (phytase) 생성능이 우수한 균주를 선별하였다. α-갈락토시다제 생성능을 확인하기 위하여 X-gal 한천 배지(NaCl 0.5%, peptone 1%, raffinose 1%, agar 1.5%, X-gal 0.5%) 를 준비하였다. 또한, 프로테아제 생성능을 확인하기 위해 탈지유가 함유된 YM 한천 배지 (2% 탈지유, yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 1%, agar 1.5%)를 준비하였으며, 피타아제 활성능을 측정하기 위해 상기 배지에 피틴을 첨가하여 배지를 준비하였다.
각 누룩 균주는 YPD 배지(glucose 2%, yeast extract 0.8%, soy peptone 0.2%)에서 30°C, 12시간 동안 배양 하여 준비되었다. 준비된 효모 배양액을 각각의 한천 배지에 5ul 점적 후 약 24시간 동안 30°C에서 효모를 배양하고, 각 점적물에 발생한 환을 통해 α- 갈락토시다제, 프로테아제, 피타아제 생성능을 측정하였다.
X-gal 한천배지를 통해 균주의 α-갈락토시다제의 생성유무를 확인하였으며, 프로테아제, 피타아제 생성능은 각 콜로니의 크기와 콜로니 주변에 발생한 환크기를 측정하여 각 효소의 생성능을 비교하였다 (환 크기/콜로니 크기) (표 1). 프로테아제 활성능이 없어 환이 전혀 발생하지 않은 균주의 경우 0으로 표기하였다. 그 결과 약 100개의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 중 α-갈락토시다제 활성을 갖는 균주는 14주였으며, 이 중에서도 곡물발효에 필요한 프로테아제 활성이 아예 존재하지 않는 균주를 제외할 경우, CJN1697, CJN2343 2개의 균주가 선별되었다.
Strain No. | a-갈락토시다제 활성 유무 | Ratio (환/콜로니 크기) |
Strain No. | a-갈락토시다제 활성 유무 | Ratio (환/콜로니 크기) |
||
프로테아제 | 피타아제 | 프로테아제 | 피타아제 | ||||
CJN1023 | X | 1.11 | 1.58 | CJN2225 | X | 1.03 | 1.32 |
CJN1025 | X | 1.51 | 1.11 | CJN2229 | X | 1.03 | 1.20 |
CJN1102 | X | 1.07 | 1.24 | CJN2343 | O | 1.13 | 1.25 |
CJN1103 | X | 1.19 | 1.29 | CJN2347 | X | 1.11 | 1.33 |
CJN1105 | X | 1.22 | 1.48 | CJN2350 | X | 1.08 | 1.34 |
CJN1108 | X | 1.11 | 1.25 | CJN2387 | X | 1.07 | 1.41 |
CJN1110 | X | 1.11 | 1.33 | CJN2389 | X | 1.09 | 1.42 |
CJN1145 | X | 1.03 | 1.32 | CJN2390 | X | 1.08 | 1.39 |
CJN1146 | X | 1.02 | 1.43 | CJN2391 | X | 1.05 | 1.37 |
CJN1147 | X | 1.00 | 1.58 | CJN2393 | X | 1.11 | 1.32 |
CJN1148 | X | 1.00 | 1.32 | CJN2394 | X | 1.10 | 1.41 |
CJN1292 | X | 1.21 | 1.42 | CJN2395 | X | 1.10 | 1.39 |
CJN1293 | X | 1.00 | 1.52 | CJN2560 | O | 0.00 | 1.09 |
CJN1294 | X | 1.13 | 1.31 | CJN2562 | O | 0.00 | 1.06 |
CJN1295 | X | 1.14 | 1.59 | CJN2563 | O | 0.00 | 1.03 |
CJN1297 | X | 1.10 | 1.38 | CJN2564 | O | 0.00 | 1.13 |
CJN1298 | X | 1.19 | 1.71 | CJN2565 | O | 0.00 | 1.18 |
CJN1334 | X | 1.23 | 1.14 | CJN2597 | O | 0.00 | 1.17 |
CJN1336 | X | 1.00 | 1.24 | CJN2600 | O | 0.00 | 1.23 |
CJN1437 | X | 1.00 | 1.33 | CJN2601 | O | 0.00 | 1.16 |
CJN1439 | X | 1.00 | 1.11 | CJN2602 | O | 0.00 | 1.10 |
CJN1440 | X | 1.12 | 1.65 | CJN2603 | X | 0.00 | 1.19 |
CJN1441 | X | 1.02 | 1.43 | CJN2604 | O | 0.00 | 1.10 |
CJN1442 | X | 1.10 | 1.66 | CJN2605 | O | 0.00 | 1.13 |
CJN1443 | X | 1.09 | 1.30 | CJN2606 | O | 0.00 | 1.13 |
CJN1697 | O | 1.02 | 1.50 | CJN2642 | X | 0.00 | 1.03 |
CJN1837 | X | 1.00 | 1.29 | CJN2643 | X | 0.00 | 1.19 |
CJN1838 | X | 1.06 | 1.41 | CJN2644 | X | 0.00 | 1.11 |
CJN1839 | X | 1.04 | 1.41 | CJN2645 | X | 0.00 | 1.15 |
CJN1840 | X | 1.03 | 1.37 | CJN2646 | X | 0.00 | 0.00 |
CJN1841 | X | 1.02 | 1.41 | CJN2647 | X | 0.00 | 1.26 |
CJN1842 | X | 1.09 | 1.39 | CJN2648 | X | 0.00 | 1.17 |
CJN1843 | X | 1.09 | 1.26 | CJN2649 | X | 0.00 | 1.13 |
CJN1844 | X | 1.06 | 1.37 | CJN2650 | X | 0.00 | 1.00 |
CJN1845 | X | 1.06 | 1.24 | CJN2651 | X | 0.00 | 1.12 |
CJN1846 | X | 1.04 | 1.37 | CJN2672 | X | 0.00 | 1.09 |
CJN1907 | X | 1.55 | 1.12 | CJN2673 | X | 0.00 | 1.06 |
CJN1973 | X | 1.05 | 1.23 | CJN2674 | X | 0.00 | 1.09 |
CJN1974 | X | 0.00 | 1.29 | CJN2675 | X | 0.00 | 1.12 |
CJN1975 | X | 0.00 | 1.19 | CJN2676 | X | 0.00 | 1.10 |
CJN1976 | X | 0.00 | 1.23 | CJN2677 | X | 0.00 | 1.09 |
CJN2022 | X | 0.00 | 1.33 | CJN2678 | X | 0.00 | 1.14 |
CJN2023 | X | 0.00 | 1.20 | CJN2679 | X | 0.00 | 1.10 |
CJN2024 | X | 0.00 | 1.32 | CJN2680 | X | 0.00 | 1.11 |
CJN2025 | X | 0.00 | 1.35 | CJN2681 | X | 0.00 | 1.18 |
CJN2026 | X | 0.00 | 1.29 | CJN2682 | X | 0.00 | 1.11 |
CJN2027 | X | 0.00 | 1.36 | CJN2683 | X | 0.00 | 1.09 |
CJN2028 | X | 0.00 | 1.29 | CJN2684 | X | 0.00 | 1.10 |
CJN2029 | X | 1.05 | 1.24 | CJN2685 | X | 0.00 | 1.06 |
CJN2030 | X | 0.00 | 1.14 | CJN2686 | X | 0.00 | 1.17 |
CJN2031 | X | 1.03 | 1.57 | CJN2687 | X | 0.00 | 1.12 |
CJN2067 | X | 1.10 | 1.45 | CJN2688 | X | 0.00 | 1.20 |
CJN2145 | X | 1.09 | 1.42 | CJN2689 | X | 0.00 | 1.16 |
CJN2147 | X | 1.03 | 1.22 | CJN2690 | X | 0.00 | 1.03 |
CJN2150 | X | 1.03 | 1.38 |
실시예 2: 발효 조성물 제조
2-1. 곡물 분말의 수분 처리 및 열처리 방법
대두박 분말 및 옥수수글루텐 분말을 각각 준비하였다. 상기 대두박 분말은 대두박 중량을 기준으로 수분 함량이 약 45%가 되도록 물을 첨가하고 100℃, 30분에서 열처리 하였다. 상기 옥수수글루텐 분말은 옥수수글루텐 중량을 기준으로 인산을 1.5중량% 첨가하고, 수분함량이 약 43%가 되도록 물을 첨가한 후, 100℃, 30분에서 열처리 하였다. 열처리가 완료된 옥수수글루텐에는 옥수수글루텐 중량을 기준으로 NaOH을 2.4 중량% 첨가하고 수분함량이 약 45%가 되도록 추가적으로 물을 첨가하였다.
2-2. 효소 처리 및 효모 발효군 제조방법
상기 실시예 2-1의 방법으로 준비된 상기 대두박 분말 및 상기 옥수수글루텐 분말을 동일한 중량비로 혼합하여 혼합 곡물 분말을 준비하였다. 상기 혼합 곡물 분말에 글루코아밀라아제를 0.5 중량% 첨가하고, 3 종의 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) (누룩균주 CJN1697, CJN2343, 및 상업용 빵효모 (Angel사로부터 구입)) 효모 배양액을 각각 10 중량% 접종하고 섞은 후, 혐기발효(30℃)를 6시간 동안 진행하여 효모 발효군을 제조하였다.
2-3. 효모 및 바실러스 발효군 제조방법
상기 실시예 2-2의 방법으로 제조된 효모 발효군에 추가적으로 바실러스 발효를 진행하였다. 보다 구체적으로는, 상기 실시예 2-2에 기재된 바와 같이, 3종의 사카로마이세스 세레비시애 (CJN1697, CJN2343, 또는 상업용 빵효모)로 발효된 각각의 효모 발효군에 대하여, 효모 접종 6시간 후 바실러스 아밀로리쿼페시언스(Bacillus amyloliquefaciens, KCCM11471P) 배양액 10 중량%를 접종하고 항온항습기 (온도 37℃, 습도 95%)에서 24시간 동안 호기발효를 진행하였다.
2-4. 각 실험군의 성분 측정
상기 실시예 2-2 및 2-3의 방법으로 제조된 각각의 실험군에 대하여, 시간별 발효 조성물 내 수분, 바실러스 생균수, 효모 생균수, 단백함량을 측정하였다. 단백함량은 발효물을 건조 후 분쇄하여 킬달 기기로 측정하였다. 측정된 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.
그 결과, 효모 발효가 진행된 모든 실험군에서 효모의 생균량은 107 cfu/g에서 108 cfu/g으로 증가하였다. 또한, 바실러스 발효가 진행된 모든 실험군에서 바실러스의 생균량은 109 내지 1010 cfu/g 수준으로 증가하였으며, 효모는 107 cfu/g에서 108 cfu/g으로 증가하였다. 또한, 효모 발효를 통하여 조성물 내 단백질량이 상승하는 것을 확인할 수 있었으며, 효모 발효 이후에 바실러스 발효가 추가로 진행된 경우에는 단백질량 상승 효과가 보다 더 좋은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 즉, 곡물 원료에 대하여 효모 발효 이후에 바실러스 발효를 수행할 경우, 바실러스에 의하여 효모의 생장이 저해되지 않으면서도 곡물 원료 내 단백질량을 더욱 증가시킬 수 있다.
실시예 3: 발효에 의한 올리고당 분해 정도 확인
곡물 원료군 2종 (대두박 원료군, 옥수수글루텐 원료군), 혼합 곡물 (대두박+옥수수글루텐)의 바실러스 단독 발효군, 혼합 곡물(대두박+옥수수글루텐)의 효모 단독 발효군, 및 혼합 곡물(대두박+옥수수글루텐)의 효모와 바실러스 복합 발효군을 각각 준비한 후, 각 군의 당성분을 분석하였다.
전처리 되지 않은, 대두박 원료군 (도 1의 ②)과 옥수수글루텐 원료군 (도 1의 ③)을 준비하였다. 각 원료의 당성분은 박층 크로마토그래피 (Thin layer chromatography, TLC)를 통해 정성적으로 분석하였다. 시료 1g에 증류수 25ml을 첨가하여 끓는 물에 15분 내지 20분 가열한 후 37℃에서 2시간 동안 진탕 추출하였다. 추출물을 원심분리 하여 상등액을 회수하여 TLC 샘플로 이용하였다. 상등액 2㎕를 실리카겔 TLC 플레이트(plate)에 스팟팅(spotting) 하고 일정수준 건조시킨 후, 전개액에 3시간 동안 전개했다. 전개가 완료된 후 발색 및 건조과정을 거쳐 올리고당 및 단당류의 스팟을 확인하였다.
혼합 곡물의 바실러스 단독 발효군 (도 1의 ④)은, 상기 실시예 2-1의 방법으로 준비된 대두박 분말과 옥수수글루텐 분말을 동일한 중량비로 혼합한 후, 혼합물에 바실러스 아밀로리쿼페시언스 배양액 10 중량%를 접종하고 항온항습기 (온도 37℃, 습도 95%)에서 24시간 동안 호기발효를 진행하여, 준비하였다.
혼합 곡물의 효모 단독 발효군 (도 1의 ⑤)은 상기 실시예 2-2의 방법으로 준비하였으며, 혼합 곡물의 효모와 바실러스 복합 발효군은 상기 실시예 2-3의 방법에 의하여 3종의 효모를 이용하여 3개의 군(도 1의 ⑥CJN1697+바실러스, ⑦바실러스, ⑧빵효모+바실러스)으로 준비하였다.
각 발효군의 당성분은 상기 대두박 원료군과 옥수수글루텐 원료군의 당성분 측정과 동일한 방법으로 측정하였다. 각각의 발효군 시료 1g에 25ml 물을 추가하여 끓는 물에 15분 내지 20분간 가열한 후 37℃에서 2시간 동안 진탕 추출하였다. 추출물을 원심분리 하여 상등액을 회수하였으며 이를 TLC 분석 샘플로 이용하였다.
도 1의 ①번 라인은 아래에서 위쪽 순서대로 스타키오스(Stachyose), 라피노스(raffinose), 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose)를 나타내는 당성분 마커이고, ②번 라인은 대두박 원료군, ③번 라인은 옥수수글루텐 원료군, ④번 라인은 대두박과 옥수수글루텐 혼합 곡물의 바실러스 단독 발효군, ⑤번 라인은 대두박과 옥수수글루텐 혼합 곡물의 CJN1697 효모 단독 발효군이며, ⑥ 내지 ⑧번 라인은 각각 대두박과 옥수수글루텐 혼합 곡물의 효모 및 바실러스 복합 발효군 (⑥CJN1697+바실러스, ⑦바실러스, ⑧빵효모+바실러스)이다.
도 1을 참조하면, 바실러스를 이용한 단독 발효군(④)에서는 대두박 내 함유된 당 성분을 완전하게 분해하지 못하여 발효과정에서 미생물이 당성분을 충분하게 이용하지 못하였기 때문에, 발효물 내 올리고당이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 효모 발효가 수행된 발효군(⑤)에서는 효모에 의하여 올리고당이 분해되고, 미생물이 분해된 당성분을 충분하게 이용하였기 때문에 올리고당 함량이 적은 것을 확인할 수 있었다.
또한, CJN1697, CJN2343 효모 균주를 사용한 발효군(⑥ 및 ⑦)에서는 상기 효소의 α-갈락토시다제 활성에 의해 발효물 내 특정 올리고당의 스팟이 관찰되지 않았으나, 상업용 빵효모(Angest®)를 이용한 발효군(⑧)은 상기 빵효모의 α-갈락토시다제 활성이 낮아, 특정 올리고당 스팟을 보임음 확인하였다.
따라서, 효모를 이용하여 제조된 발효 조성물은 조성물 내 올리고당이 분해되어 있으므로, 동물이 사료 섭취 시 이를 분해할 수 있는 개별적인 소화효소가 필요하지 않아 사료의 소화를 더 용이하게 할 수 있으며, 특히 CJN1697 또는 CJN2343 효모 균주를 이용하는 것이 보다 효과적임을 알 수 있다.
실시예 4: 발효에 의한 단백질 분해 정도 확인
상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 곡물 원료군 (대두박, 옥수수글루텐, 및 혼합 곡물 원료), 곡물 원료의 바실러스 단독 발효군, 곡물 원료의 효모 단독 발효군, 및 곡물 원료의 효모와 바실러스 복합 발효군을 각각 준비한 후, 각 군의 단백질 성분을 분석하고자 하였다.
곡물 원료군은 대두박 원료군 (제2군), 옥수수글루텐 원료군 (제3군) 및 대두박과 옥수수글루텐인 동일 중량 혼합된 혼합 곡물군 (제4군), 총 3종을 준비하였다. 각 원료의 단백질 분자량 패턴은 SDS-PAGE를 통해서 확인하였다. 시료 100mg을 8M urea 용액 5ml과 섞은 후 음파처리(sonication)하여 추출하였으며, 이를 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 각각의 상등액은 바이신코닉 산(bicinchoninic acid)을 이용하여 단백질 함량을 정량한 후 일정량의 단백질을 로딩(loading) 하여 SDS-PAGE 결과를 확보하였다.
곡물 원료의 바실러스 단독 발효군 (제5군 내지 제8군)은, 상기 실시예 2-1의 방법으로 준비된 대두박 분말과 옥수수글루텐 분말을 동일한 중량비로 혼합한 혼합 분말에 바실러스 아밀로리쿼페시언스 배양액 10 중량%를 접종하고 항온항습기 (온도 37℃, 습도 95%)에서 24시간 동안 호기발효를 진행하여, 준비하였다. 각 군의 발효 시간 (0시간, 16시간, 20시간, 24시간)은 하기의 표 3과 같다.
곡물 원료의 효모 단독 발효군 (제9군 내지 제12군)은 상기 실시예 2-2의 방법으로 준비하였으며, 곡물 원료의 효모와 바실러스 복합 발효군 (제13군 내지 제24군)은 상기 실시예 2-3의 방법에 의하여 3종의 효모를 이용하여 준비하였다. 각 군의 발효에 사용된 균주와 각 군의 발효 시간은 하기의 표 3과 같다. 효모 발효 후 바실러스 발효가 진행된 복합 발효군은, 각각 효모 발효가 6시간 진행된 후에 바실러스 발효가 진행되었다.
각 발효군의 단백질 분해 수준은 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 곡물 원료군의 단백질 분자량 분포수준을 확인하는 방법과 동일하게 시료를 전처리하였다. 시료 100mg을 8M urea와 섞고 음파처리(sonication)하여 추출하였으며, 이를 원심분리하여 얻은 상등액의 단백질량을 정량한 후 일정량의 단백질을 로딩 하여 SDS-PAGE 결과를 확보하였다. 상기 결과는 도 2에 나타내었다.
상기 표 3에서, 효모 및 바실러스 순차 발효군의 시간은, 총 발효 시간으로서 효모 발효 6시간에 바실러스 발효 시간을 더한 것이다.
도 2는, 상기 제1군 내지 제24군의 상등액 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이다.
상기 표 3 및 도 2를 참고하면, 바실러스는 단백질분해효소를 생성하며, 이로 인해 발효과정 중 고분자 단백질을 저분자 펩타이드로 분해할 수 있으므로, 바실러스 단독 발효군 및 효모와 바실러스 복합 발효군에서는 대두박 및 옥수수글루텐의 단백질이 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 효모는 단백질 분해효소를 생산하지 못하기 때문에 효모 단독 발효군에서는 단백질이 전혀 분해되지 않고 원료의 단백질 패턴을 그대로 나타내었다. 즉, 효모 발효 이후에 바실러스 발효된 조성물은 저분자 펩타이드를 포함하므로, 사료의 단백질 흡수율을 향상시킬 수 있다.
발효물 내 저분자 펩타이드의 함량을 보다 구체적으로 측정하기 위하여, GPC (Gel permeation chromatography) 방법을 사용하여 저분자 펩타이드의 분자량에 따른 분포를 측정하였다.
GPC는 분자량이 서로 다른 표준 단백질을 분석하여 retention time(RT)을 확인하고, 분자량과 RT의 표준곡선을 이용하여 분석 시료의 단백질 분포를 분자량에 따라 측정하는 방법이다. 발효에 따른 원료의 단백질 분해 수준을 확인하기 위하여, GPC 방법으로 발효물 내 단백질 분포를 분석하였다.
GPC 분석 시료는 SDS-PAGE 방법과 동일하게 전처리되었다. 시료 100mg을 8M urea 용매 5ml에 현탁 및 초음파 처리하여 추출하였으며, 이를 원심분리하여 회수한 상등액을 시린지 필터로 여과한 후 GPC 분석 시료로 이용하였다. 분석 시료로는 상기 표 3의 제4군 (대두박+옥수수글루텐 혼합원료), 제8군 (바실러스 단독발효), 제12군 (효모 단독발효), 제16군, 제20군 및 제24군 (바실러스+효모 복합발효) 각각의 발효물이 사용되었다. GPC 결과는 표 4에 나타내었다.
분자량(kDa) | 혼합원료 | Bacillus control | Yeast control | CJN1697 + B | CJN2343 + B | AngelY + B |
(제4군) | 24hr (제8군) | 30hr (제12군) | 30hr (제16군) | 30hr (제20군) | 30hr (제24군) | |
> 75 | 60.11 | 16.38 | 58.36 | 10.51 | 10.36 | 9.50 |
30 ~ 75 | 22.89 | 11.70 | 24.17 | 5.74 | 6.12 | 5.34 |
10 ~ 30 | 7.37 | 21.91 | 7.14 | 16.51 | 17.09 | 16.33 |
5 ~ 10 | 2.78 | 16.20 | 2.72 | 17.93 | 17.90 | 17.75 |
<5 | 6.86 | 33.81 | 7.61 | 49.31 | 48.53 | 51.07 |
Total | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
표 4를 참조하면, 원료에는 30 KDa 이상의 고분자 펩타이드가 82% 이상 포함되어 있었다. 바실러스로 단독 발효한 경우에는, 30 KDa 이하의 저분자 펩타이드 함량이 약 71% 정도인 반면, 바실러스와 효모로 발효된 경우에는, 30 KDa 이하의 저분자 펩타이드의 함량이 약 83% 로서, 저분자 펩타이드 함량이 크게 증가하였다. 또한, 바실러스와 효모로 발효된 발표물 내 10 KDa 이하의 저분자 펩타이드 함량은 약 66% 내지 69% 로서, 바실러스 단독 발효물의 10 KDa 이하의 저분자 펩타이드 함량과 비교하여 약 40% 증가하였다. 즉, 바실러스와 효모로 발효한 경우에는, 단백질 분해 효율이 증가하며, 발효물 내에는 저분자 펩타이드 함량이 증가하였는 바, 이를 식품 또는 사료의 원료로 사용하는 경우에는, 소화 흡수율을 크게 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: 효모 및 바실러스의 동시 발효 또는 순차 발효의 비교
효모 발효와 바실러스 발효를 동시에 진행하는 경우와, 순차적으로 진행하는 경우의 생균 수와 단백질 증가량을 측정하여 비교하고자 하였다.
상기 실시예 2-2의 방법으로 효모 발효군을 준비하였으며, 상기 실시예 2-3의 방법으로 효모와 바실러스 순차 발효군을 준비하였다. 효모와 바실러스 동시 발효군은, 실시예 2-1에 따라 준비된 대두박과 옥수수글루텐을 동일한 중량비로 혼합한 후, 글리코아밀라아제 0.5%를 첨가하고 효모와 바실러스를 동시에 접종하여 24시간 동안 호기발효하여 준비하였다. 효모와 바실러스 순차 발효군의 경우, 효모 발효 6시간 후 바실러스 발효를 진행하였다. 각 군별로 시간에 따른 수분함량, 바실러스 생균 수, 효모 생균 수, 및 단백질량을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
상기 표 5에서, 효모 및 바실러스 순차 발효군의 시간은, 총 발효 시간으로서 효모 발효 6시간에 바실러스 발효 시간을 더한 것이다.
상기 표 5를 참고하면, 효모 발효 후 바실러스 발효가 순차적으로 진행된 경우에는 바실러스 생균의 수와 효모 생균의 수가 모두 발효시간에 비례하여 증가하였다. 하지만, 효모와 바실러스를 동시 접종하여 함께 발효한 경우, 바실러스 생균의 수는 발효시간에 비례하여 증가하였으나, 효모 생균의 수는 107 cfu/g 수준에서 머무르는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 효모와 바실러스를 동시 접종하여 함께 발효한 경우, 효모가 바실러스의 생육에는 영향을 미치지 않았으나, 반대로 바실러스는 효모의 생장을 억제시켰다.
따라서, 바실러스의 단백질분해효소가 출아(budding)하여 증식하는 효모의 개체수를 감소시키기 때문인 것으로 추정되며, 고체발효에 있어서 효모와 바실러스 두 가지 미생물 모두 생육시키기 위해서는 미생물의 접종 순서가 중요한 영향을 미치는 것을 확인하였다. 특히, 먼저 효모 발효를 6시간 수행함으로써, 효모 발효과정 동안 대두박 내 올리고당이 분해되므로, 바실러스와 효모 모두 수용성 당성분을 보다 용이하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 이취 개선 문제
바실러스 발효물은 발효과정 동안 암모니아 등에 의한 특유의 취가 발생하며, 이는 사료 사용에 있어서 제한점이 될 수 있다. 따라서 본 실시예에서는 효모와 바실러스 복합발효가 바실러스 발효물의 이취를 저감시키는지 여부를 확인하였다. 대두박 및 옥수수글루텐의 혼합 원료, 바실러스 아밀로리쿼페시언스 (KCCM11471P) 단독발효물, 효모 (빵효모, CJN1697 또는 CJN2343)와 바실러스 아밀로리쿼페시언스(KCCM11471P) 복합발효물의 이취 테스트를 진행하였다(실험대상 50명). 0~5점으로 하여 점수가 높을수록 바실러스 특유의 이취가 높은 것으로 하여 점수화하였다 (표 6).
그 결과 바실러스 단독발효물 (바실러스 아밀로리쿼페시언스 (KCCM11471P) 사용)에서 가장 높은 점수가 나타났다. 또한, 상업적으로 판매되는 효모를 사용했을 때보다, CJN1697 또는 CJN2343 효모를 사용하여 바실러스 순차 발효를 수행한 경우 이취가 크게 저감된 것을 확인할 수 있었다.
원료 | 바실러스 단독발효 | 효모 및 바실러스 순차 발효 (빵효모) | 효모 및 바실러스 순차 발효 (CJN1697) | 효모 및 바실러스 순차 발효(CJN2343) | |
평균 | 1.6 | 4.75 | 3.8 | 2.5 | 2.45 |
STDEV | 0.82 | 0.55 | 0.89 | 1.00 | 0.76 |
실시예 7: 본 출원 사카로마이세스 세레비지에 (
Saccharomyces cerevisiae)
균주의 18S rRNA 유전자 염기서열 및 계통수 분석
실시예 1에서 분리된 균주를 분석하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 18S ribosomal DNA sequencing을 수행하였다: CJN1697 및 CJN2343 균주의 염색체(chromosomal) DNA를 Wizard genomic DNA purificationkit(Promega, USA)를 이용해 분리한 후, 18S rRNA sequencing에 사용하는 다용도 프라이머(universal primer)인 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')와 NS8(5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3') 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV gel and PCR clean-up system(Promega, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, 서열의 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교 분석하였다.
상기 계통수 분석 결과, 본 출원의 CJN1697, CJN2343 두 균주 모두 표준 균주인 사카로마이세스 세레비지에와 99% 상동성을 나타내었다(도 3 및 도 4). 본 출원에 따른 상기 균주 CJN1697, CJN2343은 각각 사카로마이세스 세레비지에 CJN1697, 사카로마이세스 세레비지에 CJN2343으로 명명되었고, 부다페스트 조약에 따라 2017년 10월 11일자 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁번호 KCCM12123P, KCCM12124P로 수탁되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (16)
- 곡물 분말을 준비하는 단계;
효모를 이용하여 상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계;
바실러스 속 (genus) 균주를 이용하여 상기 1차 발효물을 2차 발효하는 단계; 및
상기 2차 발효물을 수득하는 단계;를 포함하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효모는, α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효모는 기탁번호 KCCM12123P 또는 기탁번호 KCCM12124P로 기탁된 사카로마이세스 세레비지에인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 2차 발효물은 분자량 30KDa 이하의 펩타이드 함량이 40 내지 100% 인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 곡물 분말은 대두박 또는 옥수수글루텐을 포함하는 것인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 곡물 분말을 1차 발효하는 단계는, α-아밀라아제 (α-amylase) 또는 글루코아밀라아제 (glucoamylase)를 추가하는 단계를 포함하는, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 곡물 분말은 수분 함량이 조절된 후 열처리된 것인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 수분 함량은 30 내지 60%인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 바실러스 속 균주는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 토요이(Bacillus toyoi), 바실러스 코어귤런스(Bacillus coagulans), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 및 바실러스 아밀로리쿼페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 바실러스 속 균주는, 기탁번호 KCCM114371P로 기탁된 바실러스 아밀로리쿼페시언스인, 이취가 개선된 발효 조성물 제조방법.
- α-갈락토시다제, 프로테아제, 및 피타아제를 생성하는, 바실러스 발효물의 이취 개선용 효모.
- 제11항에 있어서, 상기 효모는, 기탁번호 KCCM12123P 또는 기탁번호 KCCM12124P로 기탁된 사카로마이세스 세레비지에인, 바실러스 발효물의 이취 개선용 효모.
- 제12항의 효모를 포함하는, 곡물 발효용 조성물.
- 제12항의 효모를 포함하는, 사료 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 발효 조성물.
- 제15항의 발효 조성물을 포함하는, 사료 조성물.
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