KR20230052104A - 다중 실시간 정량 pcr을 이용한 수인성 사람 노로바이러스 gi 및 gii의 동시진단 - Google Patents

다중 실시간 정량 pcr을 이용한 수인성 사람 노로바이러스 gi 및 gii의 동시진단 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람에게 급성위장관염을 일으킬 수 있는 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 동시진단 및 실시간 정량하여 신속하고 높은 검출 민감도로 확인할 수 있는 노로바이러스를 검출하기 위한 real time PCR 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

다중 실시간 정량 PCR을 이용한 수인성 사람 노로바이러스 GI 및 GII의 동시진단{Simultaneous diagnosis of water-borne Human Norovirus GI and GII using the Multiplex Real-time Quantitative PCR}
본 발명은 수인성식품매개질환을 유발하는 수인성 노로바이러스 2종의 동시진단 검사 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 수인성 바이러스 중 노로바이러스 GI 및 GII를 동시에 검사하는 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
일반적으로 식중독으로 알려져 있는 수인성식품매개질환은 병원성 미생물, 바이러스, 또는 병원체에 오염된 물, 식품 등을 섭취하여 위장관에서 증식하며 여러 감염 증상(설사, 구토, 발열, 복통 등의 위장관 감염)을 나타내는 감염병으로, 제1군 감염병(콜레라, 장티푸스, 파라티푸스, 세균성이질, 장출혈성대장균감염증 및 A형 간염)과 지정감염병 중 장관감염증 등이 포함되는 전염성 질환 중 하나이다. 이러한 병원성 미생물, 바이러스, 병원체 등은 위장관에서 증식하며, 이후 대소변을 통해 몸밖으로 빠져나가게 되는데, 이 때 빠져나간 오염물질(병원성 미생물, 바이러스, 병원체)들이 또다시 주변의 물을 오염시키면서 다른사람에게 전파되는 '분변-구강' 경로에 의해 전파되는 것이 특징이다. 수인성식품매개질환은 동일한 물을 많은 사람들이 함께 사용할 때 다수의 환자가 발생하며 폭발적으로 유행하는 특징이 있으며, 대표적인 수인성 장바이러스로는 A형 간염, 노로바이러스, 로타바이러스, 아데노바이러스, 아스트로바이러스, 칼리시바이러스, 엔테로바이러스, 콕사키바이러스, 폴리오바이러스 등이 보고되어 있다.
노로바이러스(Norovirus; NoV)는 Caliciviridae과 Norovirus속에 속하는 single-stranded positive-sense RNA로서, 피막이 없으며, 입자의 크기는 약 23-40 nm이다. 바이러스의 RNA는 7.5 kb으로 알려져 있다. 노로바이러스의 유전자는 3개의 ORF로 구성되어 있으며, polyprotein(ORF1; NS1/2, NS3-7), capsid protein(ORF2), subgenomic RNA(ORF3; VP2)로 구성되어 있다. 노로바이러스의 유전자형은 크게 7개의 유전자형으로 구분되며 이중 GI, GII가 사람에게 급성 위장염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이중 GII.4가 전 세계적으로 가장 많이 확인되는 유전자형으로 알려져 있다.
노로바이러스의 주요 감염경로는 생굴, 조개 같은 연안 양식 어패류의 섭취 또는 접촉, 오염된 식기류의 사용 및 환자의 구토물, 분변, 신체접촉 등에 의해 감염되는 것으로 알려져 있다. 노로바이러스의 임상증상은 구토, 설사, 복통, 오한 발혈 등 다른 급성위장관염 바이러스와 유사한 것으로 알려져 있다. 잠복기는 24-48시간이며, 발생 후 72시간 동안 지속되다가 빠르게 회복되는 것이 특징이다. 노로바이러스의 경우, 나이와 관계없이 소아뿐만 아니라 성인에서도 감염이 가능하며, 전 세계적으로 감염이 발생하고, 비세균성 급성 위장관염의 원인병원체 중 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 노로바이러스는 영하 20도에서도 생존이 가능하여 기온이 낮아지는 11월-4월에 빈번하게 보고되고 있으며, 산(pH 2.7, 3시간), 열(60ㅀC, 30분)에 안정적이고, 수돗물의 염소농도에서도 활동력이 있을 정도로 저항성이 강한 것이 특징이다.
노로바이러스는 배양법이 확립되어 있지 않아 현재까지 분자생물학적 검출방법인 Reverse-transcription PCR(RT-PCR), RT-nested PCR, real-time RT-PCR 등을 이용한 진단 방법이 주로 사용되고 있다. 국내 질병관리본부의 감염병 실험진단에 따르면, 환자의 검체(대변, 직장도말물, 구토물)에서 특이유전자인 ORF1와 ORF2를 표적 유전자로 하여 검사를 수행한다. 그러나, 바이러스의 존재가 매우 낮은 물환경 시료에서는 노로바이러스의 검출이 매우 미미하고, 유전자형의 분석이 어렵다는 단점이 있다.
한편, 전자현미경을 이용한 방법의 경우, 바이러스의 존재를 확인할 수 있으나, 형태학적 분석이 어렵다는 단점이 있다. 효소 면역 측정법의 경우, 임상 양상이 서로 비슷한 바이러스의 구분이 가능하다는 장점이 있지만, 바이러스의 증식, 감염성 여부의 평가가 어렵고, 위음성 결과가 보고되어 정확도가 떨어지는 단점이 있다.
Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)의 경우, 전자현미경, 효소 면역 측정법과 달리 염기서열 분석을 통한 유전자형 분석이 가능하고, target 유전자를 특이적으로 증폭 할 수 있다는 장점이 있으나, 정량이 불가능하고, 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.
반면, real time PCR 방법은 형광물질과 상쇄물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 검체 내 존재하는 target 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 target 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속, 정확하게 분석하는 방법이다. real time PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(expotential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 형광세기가 기본값(base line)을 넘어서 감지될 수 있는 Ct (threshold cycle)값을 통해 실시간 정량이 가능하며, 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, target 유전자가 존재하는지 여부와 검체 또는 시료 내에 포함된 바이러스 유전자의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다. 이러한 실시간 정량이 가능하다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명자들은 real time PCR 방법을 이용하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 형광물질을 다르게 하여 특이적으로 동시진단이 가능한 기술을 개발하였다.
Yoo et al., (2017). Evaluation of Various Real-Time Reverse Transcription Quantitative PCR Assays for Norovirus Detection. J. Microbiol. Biotechnol. 27(4); 816-824
따라서, 본 발명의 목적은 1개의 튜브에서 1개의 target 유전자만 진단하던 기존의 기술과 달리, 측정파장이 다른 2개의 형광발색 물질을 이용하여 보다 특이적이고, 신속하며 높은 검출민감도를 가지는 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 동시진단하기 위한 것으로, real time PCR을 이용한 노로바이러스 유전자형 GI, GII 감염 진단용 프라이머 세트 및/또는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상술된 프라이머 조합을 이용하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 감염여부를 동시 진단할 수 있는 진단키트 및 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 제1프라이머쌍 ; 및 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 제2프라이머쌍;을 포함하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임(real-time) PCR 프라이머 세트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 제1프라이머쌍에 포함된 서열번호 1 및 2의 염기서열은 상기 노로바이러스 GI의 ORF1 및 ORF2 부위의 염기서열(5,283-5,673; NS7-VP1 유전자)를 주형으로 설계 및 제작되고, 상기 제2프라이머쌍에 포함된 서열번호 4 내지 6은 상기 노로바이러스 GII의 Capsid protein 부위의 염기서열(5,011-5,403; VP1 유전자)을 주형으로 설계 및 제작된 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 수인성 노로바이러스 GI 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클 레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제1프로브 및 상기 수인성 노로바이러스 GII 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클 레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제2프로브;를 더 포함한다.
또한 본 발명은 상술된 어느 하나의 프라이머 세트를 포함하는 수인성 노로바이러스(Norovirus)의 유전형 GI, GII를 동시진단하기 위한 real time PCR 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 리얼타임 PCR용 프라이머 세트에 포함된 제1프로브 및 제2프로브는 각각 염기서열의 5′말단에 부착되는 형광물질과 염기서열의 3′말단에 부착되는 형광흡수물질로 구성되는데, 상기 제1프로브의 형광물질과 제2프로브의 형광물질은 서로 상이한 흡수 및 방출 파장을 갖는다.
바람직한 실시예에 있어서, DNA 중합효소, dNTPs 및 반응버퍼를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 조성물을 포함하는, 수인성 노로바이러스(Norovirus) GI, GII를 동시진단하기 위한 검출키트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 수인성 노로바이러스 GI는 Genebank accession number JQ388274.1 이고, 상기 수인성 노로바이러스 GII는 Genebank accession number KX356908.1 이다.
또한 본 발명은 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계; 상술된 어느 하나의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 상기 유전자 샘플을 리얼타임 PCR로 증폭시키는 단계; 및 상기 리얼타임 PCR 조성물에 포함된 제1 및 제2 프로브에 부착된 형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하고 분석하는 단계;를 포함하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII 진단방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 수인성 노로바이러스 GI 및 GII에 특이적인 유전자의 카피수를 알고 있는 양성 표준자를 상술된 어느 하나의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 증폭하는 단계;를 더 포함한다.
먼저, 본 발명의 real time PCR 프라이머 세트는 노로바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 동시진단 및 정량이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 노로바이러스를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 노로바이러스의 유전자형 GI, GII를 동시진단 및 정량 할 수 있는 리얼타임 PCR 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트 및 진단 방법에 의하면, 1개의 tube에서 FAM, HEX 두가지의 형광물질을 포함하고 있는 프로브의 형광발색을 분석하여 노로바이러스 GI, GII의 감염 여부를 동시 진단할 수 있어, 노로바이러스 의심 환자를 진단 및 치료를 신속하게 진행할 수 있다.
본 발명의 이러한 기술적 효과는 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 실시예에서 합성된 Genebank accession number JQ388274.1 plasmid를 연속으로 희석한 시료 (10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8)를 첨가하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 real time PCR 프라이머 세트를 이용한 monoplex real time PCR 결과 그래프이다.
도 2a, 2b 및 도 2c는 본 발명의 실시예에서 합성된 Genebank accession number JQ388274.1 plasmid를 연속으로 희석한 시료 (10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8)를 첨가하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 real time PCR 프라이머 세트를 이용한 duplex real time PCR 결과이다.
도 3a, 3b 및 3c는 본 발명의 실시예에 따른 환경시료를 통한 실증실험 결과이다.
도 4a, 4b 및 4c는 본 발명의 실시예에 따른 환경시료 실증시험 결과 음성으로 나타난 환경시료의 cDNA에 plasmid를 인위감염 후 연속으로 희석(10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5)후 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 duplex real time PCR 인위감염 검출 민감도 결과이다.
도 5a, 5b 및 5c는 본 발명의 실시예에 따른 양성대조구의 최적 칵테일을 구현을 위하여 본 발명의 프라이머조성물 및 plasmid의 농도조절 통한 duplex real time PCR 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다.
본 발명에서 언급한 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 구현예들 각각의 특징적인 부분들은 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합가능하고, 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 구현예들은 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '유전자 샘플'이란 RNA, DNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, prePCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 '합성된 노로바이러스'는 RNA 서열 뿐만 아니라 RNA로부터 생성된 cDNA 서열로 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인'리얼타임(real-time) PCR'이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임 PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법 등으로 나누어질 수 있다. SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다. TaqMan probe는 이중 표지된 프로브의 일종으로 PCR 과정 중, Annealing 단계에서 target DNA에 특이적으로 결합하지만, 상쇄물질인 quancher로 인해 reporter dye가 형광을 발하지 못하다가 extension 단계에서 DNA polymerase의 exonuclease 기능으로 인해 가수분해 되고, 이로 인해 quancher와 reporter dye가 분리되면서 형광이 나타나는 원리이다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 노로바이러스 유전자형 GI, GII 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 형광발색의 차이로 유전자형 GI, GII의 동시진단이 가능하므로, 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 급성 위장관염을 일으킬 수 있는 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 신속하고 높은 검출감도로 동시진단 할 수 있는 real time PCR 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는 것에 있다.
즉, 본 발명자들은 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 동시진단하기 위해 real time PCR 방법을 이용하였는데, real time PCR 방법은 기존의 RT-PCR (reverse transcription PCR)과 달리 실시간으로 정량 분석이 가능하고, 단시간 내에 고농도 의 유전자 증폭이 가능하기 때문이다.
따라서, 본 발명의 real time PCR 프라이머 세트는 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 동시진단 하기 위한 것으로서, 서열번호 1 및 2로 표시되는 제1프라이머쌍 ; 및 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 제2프라이머쌍;을 포함한다.
여기서, 제1프라이머쌍에 포함된 서열번호 1 및 2의 염기서열은 노로바이러스 GI(Genebank accession number JQ388274.1)의 ORF1 및 ORF2 부위의 염기서열(5,283-5,673; NS7-VP1 유전자)을 주형으로 설계 및 제작되고, 제2프라이머쌍에 포함된 서열번호 4 내지 6은 노로바이러스 GII(Genebank accession number KX356908.1)의 Capsid protein 부위의 염기서열(5,011-5,403; VP1 유전자)을 주형으로 설계 및 제작되었다.
즉, 노로바이러스의 VP1 유전자는 노로바이러스의 항원성 및 다양성과 관련 있으며, VP1 염기서열의 차이에 따라 7개의 유전자형으로 나뉘어져 있다. 이 중 GI, GII 및 GIV가 인체 감염을 일으키는 것으로 보고되어 있으며, 총 유전자형은 33개로 보고되어 있고, capsid protein은 크게 S, P1, P2 및 P3의 단백질 domain 으로 구성되어 있으며, S domain의 경우 conserved region이고, P1과 P2 단백질 서열의 변화에 따라 항원다양성(antigenic diversity)가 발생하는 것으로 보고되어 있기 때문이다.
따라서, 본 발명에서는 노로바이러스 GI의 NS7-VP1 및 GII의 VP1 유전자를 주형으로 프라이머를 설계 및 제작한 것이 특징이다.
한편, 상술된 바와 같이 real time PCR 은 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것이므로, 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있는데, 일 구현예로서 본 발명에서는 이중 표지된 프로브를 이용한 리얼타임 PCR기법을 사용할 수 있다. 이 경우 본 발명의 real time PCR 프라이머 세트는 수인성 노로바이러스 GI 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클 레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제1프로브 및 상기 수인성 노로바이러스 GII 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클 레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제2프로브;를 더 포함할 수 있다.
여기서, 제1프로브 및 제2프로브는 각각 염기서열의 5′말단에 부착되는 형광물질과 염기서열의 3′말단에 부착되는 형광흡수물질로 구성되는데, 제1프로브의 형광물질과 제2프로브의 형광물질은 서로 상이한 흡수 및 방출 파장을 갖는다.
제1 및 제2 프로브에 부착되는 형광물질은 서로 발광 및 흡수파장이 다르기만 하면 당업계에 공지된 모든 형광물질을 사용할 수 있는데, 일 구현예로서 프로브의 5'말단은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 I(SYBR green I), VIC, FAM(fluorescein), TAMRA(carboxytetramethylrhodamine), HEX(carboxy-2',4,4',5',7,7'- hexachloro flurescein), JOE, NED, TET 등으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나의 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ, ZEN-IBFQ 등으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나의 소광물질 즉 형광흡수물질로 표지될 수 있다. 형광흡수물질 또한 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광흡수물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
이와 같이 본 발명은 형광물질을 2개를 사용한 2 채널 방식의 프로브를 사용한 것이 특징인데, 일 구현예로서 후술하는 바와 같이 실시예에서 제1프로브 및 제2프로브에 사용된 형광물질은 각각 FAM (흡수파장 450-490 nm, 방출 파장 515-530 nm) 및 HEX (흡수파장 515-535 nm, 방출 파장 560-580 nm)이고, 형광흡수물질인 quencher는 BHQ™-1로 를 표지하였다. 특히 형광흡수물질은 형광물질의 빛을 흡수하는 역할이므로, 2개 프로브에 동일한 물질을 동시에 사용해도 파장에 직접적인 영향을 받지 않는다는 특징이 있다.
다음으로, 본 발명의 수인성 노로바이러스 GI, GII 동시 검출용 real time PCR 조성물은 상술된 프라이머 세트를 포함하는데, 필요한 경우 real time PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 수인성 노로바이러스 GI 및 GII검출키트는 real time PCR 조성물을 포함하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 동시진단 할 수 있는데, 수인성 노로바이러스 GI는 Genebank accession number JQ388274.1 이고, 수인성 노로바이러스 GII는 Genebank accession number KX356908.1일 수 있다.
또한, 본 발명의 인성 노로바이러스 GI 및 GII 진단방법은 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계; 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 상기 유전자 샘플을 리얼타임 PCR로 증폭시키는 단계; 및 상기 리얼타임 PCR 조성물에 포함된 제1 및 제2 프로브에 부착된 형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하고 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.
필요한 경우, 증폭시키는 단계를 수행하기 전에 수인성 노로바이러스 GI 및 GII에 특이적인 유전자의 카피수를 알고 있는 양성 표준자를 상술된 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 증폭하는 단계를 더 수행할 수 있다. 여기서, 양성 표준자는 서열번호 8로 표시되는 수인성 노로바이러스 GI에 특이적인 양성대조구 유전자와 서열번호 9로 표시되는 수인성 노로바이러스 GII에 특이적인 양성대조구 유전자일 수 있다.
형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하는 단계는, 상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp 값 또는 Ct 값)를 분석하는 단계; 상기 형광 물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 유전자 서열의 카피수와, Cp 값 또는 Ct값을 대응시키는 단계; 상기 유전자샘플에 존재하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII에 특이적인 유전자 서열의 전체 PCR 증폭기간에 대한 상기 형광 물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp 값 또는 Ct 값)를 분석하는 단계; 및 상기 유전자 샘플에 존재하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII에 특이적인 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp 값 또는 Ct 값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내에 존재하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 감염 정도를 정량적으로 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 real time PCR 프라이머 세트는 종 특이적 염기서열로부터 디자인된 프라이머로서, 실제 노로바이러스에 감염 되었는지 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 이론적으로 합성된 노로바이러스 유전자도 검출 가능하며, 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비 특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수하다. 또한, 본 발명의 real time PCR 프라이머를 이용한 반응은, 반응의 조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 하여 검출의 효율을 높일 수 있도록 설계되었다.
실시예
1. 바이러스 핵산 합성 및 염기서열 수집
노로바이러스의 동시진단 및 특이성을 확인하기 위하여, 대상바이러스인 노로바이러스 유전자형 GI의 NS7-VP1 유전자(JQ388274.1, 5,283-5,673) 및 노로바이러스 유전자형 GII의 VP1유전자(KX356908.1, 5,011-5,403)의 염기서열을 ㈜마크로젠에 의뢰하여 유전자 합성을 진행하였다. 또한, 특이적 프라이머 설계를 위하여, 참고 수인성 바이러스 12종 [Hepatitis A virus (HAV), Rotavirus-A (RV-A), Astrovirus (AstV), Sapovirus (SV), Hepatitis E virus (HEV), Aichivirus-A (AiV-A), Coxsackievirus-B5 (CoxV-B5), Parechovirus-A (PeV-A), Orthoreovirus (OrV), Poliovirus (PV), Enterovirus-71 (EV-71) 및 Enterovirus-68 (EV-68)]의 염기서열을 수집하였다.
2. 노로바이러스 유전자형 GI, GII 동시진단용 real time PCR 프라이머 제작
노로바이러스 유전자형 GI, GII를 동시진단하기 위해, 프라이머 설계는 Primer 3 및 Oligo calc 프로그램을 이용하여 설계하였다. real time PCR을 수행하기 위해서는 3종류의 프라이머(Forward, Reverse 및 probe)가 하나의 세트로 작용하여야 하며, 위와 같이 수집된 대상 바이러스 및 참고 수인성 바이러스 유전자의 염기서열을 비교하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII에 특이적인 프라이머를 제작하였다.
하기 표 1은 본 발명의 실시예에 따라 설계 제작된 동시진단 real time PCR용 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
Figure pat00001
실험예 1
노로바이러스 유전자형 GI, GII이 각 프라이머 조합에 반응하는지 확인하기 위해, monoplex real time PCR을 수행하였다. 노로바이러스 유전자형 GI의 real time PCR 조성물은 AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix (2X) 12.5 uL, ROX dye (50X) 0.5 uL, forward primer (25 pmol) 1 uL, reverse primer (25 pmol) 1 uL, probe (25 pmol), 1 uL, 주형 핵산 1 uL 및 멸균증류수 8 uL를 1개 튜브에 넣고, 주형 핵산으로 합성된 plasmid를 단계희석법으로 희석 후 리얼타임 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분 변성 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초 과정을 50회 반복하고, 95℃에서 10초, 50℃에서 95℃까지 5초당 1℃씩 증가하는 멜팅 과정을 실시하였다.
노로바이러스 GII의 real time PCR 조성물은 AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix (2X) 12.5 uL, ROX dye (50X) 0.5 uL, forward primer-1 (25 pmol) 1 uL, forward primer-2 (25 pmol) 1 uL, reverse primer (25 pmol) 1uL, probe (25 pmol), 1 uL, 주형 핵산 1 uL 및 멸균증류수 7 uL를 1개 튜브에 넣고, 주형 핵산은 합성된 plasmid를 단계희석법으로 희석 후 리얼타임 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 노로바이러스 유전자형 GI의 monoplex 반응과 동일하게 실시하였다. real time PCR의 반응을 실시간으로 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 본 발명의 리얼타임 PCR 반응용 프라이머 조성물이 노로바이러스 유전자형 GI(도 1a), GII(도 1b)를 각각의 튜브에서의 단일 증폭 되었는지를 검출 민감도로 확인한 결과이다. 10-3부터 10-8은 주형 핵산의 희석 배율을 나타낸 것이며, N은 negative control로 주형 핵산을 포함하지 않은 튜브이다. 제작된 노로바이러스 유전자형 GI, GII는 각각의 단일 프라이머 조성물로 10-5의 희석 배율까지 진단 할 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 2
실험예 1에서 반응한 리얼타임 PCR용 프라이머 조성물을 이용하여 노로바이러스 유전자형 GI, GII를 1개의 튜브에서의 동시진단을 통한 검출 민감도를 확인하기 위해, PCR 조성물은 AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix (2X) 12.5 uL, ROX dye (50X) 0.5 uL, GI 특이적 forward primer (25 pmol) 1 uL, GI 특이적 reverse primer (25 pmol) 1 uL, GI 특이적 probe (25 pmol), 1 uL, GII 특이적 forward primer-1 (10 pmol) 1 uL, GII 특이적 forward primer-2 (10 pmol) 1 uL, GII 특이적 reverse primer (10 pmol) 1uL, GII 특이적 probe (10 pmol), 1 uL, 주형 핵산 2 uL 및 멸균증류수 3 uL를 1개 튜브에 넣고, 실험예1과 동일한 PCR 반응 조건으로 real time PCR을 실시하였다. 반응 결과는 실시간으로 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 실험예2 에서 제조된 프라이머 조성물의 Duplex real-time PCR의 검출 민감도를 확인한 결과이다. 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 특이적 프라이머 조성물을 이용하여 하나의 튜브에서 동시진단을 실시한 결과, 노로바이러스 유전형 GI은 10-5(10 fg/uL), GII는 10-5(10 fg/uL)의 희석 배율까지 진단 할 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 3
바이러스가 미량 또는 극미량 오염으로 예상되는 지하수 시료를 이용하여 실증실험을 진행하였다. 지하수 시료의 채취, 탈리 및 농축에 필요한 실험 재료 및 방법은 「지하수 중 노로바이러스 관리매뉴얼(환경부, 2014)」 및 US-EPA (814-B-95-002; Virus Monitoring Protocol for the Information Collection Requirements Rule)와 동일하게 수행하였다. 수도꼭지 주변 소독 및 물을 10 L 정도 흘린 후, pH, 온도, 탁도, 잔류염소 등을 측정 및 부가장치 연결 및 시약 처리를 수행하였다. pH 8.0 이상인 경우 모듈에 0.1 M 염산 실린더를 연결하고, 잔류염소 측정이 될 경우 물 1 gal (약 3.8 L) 당 2% 티오황산나트륨 10 mL 주입하였으며, 탁도가 75 NTU 이상인 경우 하우징 앞쪽에 전처리 필터를 연결하여 시료 채취를 진행하였다. 압력계를 달아 수압 30 psi로 조절하여 지하수 시료 채취 500 L 이상을 흘려준 후 아이스박스에 담아 실험실로 이동하였다. 탈리 및 농축과정은 1.5% 소고기 추출물(beef extract) 용액을 이용하여 탈리 및 원심분리 방식으로 시료 별 농축액 20 mL을 제조 후 초저온 냉동고에서 보관하였다. 이 후 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 RNA 핵산을 추출하였다. 추출한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, 노로바이러스 유전자형 GI, GII 특이적 프라이머 조성물을 이용하여 real time PCR을 진행하였다. duplex real time PCR 조성물 및 반응 조건은 실험예 2와 동일하게 실시하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 실험예3 에서 제조된 프라이머 조성물을 이용한 Duplex real-time PCR의 환경시료 실증시험 결과이다. 환경시료 실증시험 결과 5개의 수계환경 시료 중, 2개의 환경시료에서 노로바이러스 유전자형 GI의 양성반응이 확인되었으며, 노로바이러스 유전자형 GII의 경우, 모두 음성으로 확인되었다.
실험예 4.
실험예3에서 실증실험 결과 음성으로 확인된 환경시료를 이용하여 인위감염 실험을 진행하였다. 환경시료 cDNA에 실시예 1에서 합성한 노로바이러스 GI, GII plasmid를 10배 단계희석 하여 인위감염 후, 주형핵산으로 사용하여 real time PCR을 진행하였다. duplex real time PCR 조성물 및 반응 조건은 실험예 2와 동일하게 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 환경시료에 plasmid를 주형핵산으로 인위감염 후 검출 민감도를 확인한 결과이다. 인위감염 실험 결과 노로바이러스 유전형 GI은 10-4(100 fg/uL), GII는 10-5(10 fg/uL)의 희석 배율까지 진단 할 수 있는 것을 확인하였다. Plasmid 검출민감도 실험결과와 비교했을 때, 노로바이러스 유전자형 GI에서 검출민감도의 10배 감소, GII는 검출민감도의 변화가 확인되지 않았다.
실험예 5.
본 발명에서 개발한 노로바이러스 GI, GII의 동시진단용 양성대조구 최적 칵테일을 구현을 위하여, 본 발명의 프라이머 조성물에 대한 농도조절을 통한 duplex real time PCR 반응을 진행 하였다. 최적 칵테일의 구현을 위하여 노로바이러스 유전자형 GI의 프라이머 농도는 25 pmol로 고정하였으며, 노로바이러스 유전자형 GII의 프라이머 농도는 25, 20, 15 및 10 pmol로 조절하여 duplex real time PCR 반응을 진행하였다. 또한 양성대조구로 이용될 plasmid 핵산의 최적 증폭 칵테일을 찾기 위하여, plasmid 희석배율을 조절하여 duplex real time PCR 반응을 진행 하였다. PCR 조건은 실험예 2에서 실시한 조건과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 실험예 5에서 실시한 노로바이러스 유전자형 GI, GII의 양성대조구 최적 칵테일 구현을 위한 duplex real-time PCR의 결과이다. 양성대조구 최적 칵테일 조건은 GI 특이적 프라이머의 경우, 서열번호 8로 표시되는 양성대조구 핵산은 10-3(1 pg/uL)의 희석 배율, 프라이머 농도는 25 pmol에서 가장 최적의 반응이 확인되었고, GII 특이적 프라이머의 경우, 서열번호 9로 표시되는 양성대조구 핵산은 10-4(100 fg/uL)의 희석 배율, 프라이머 농도는 10 pmol에서 가장 최적의 반응이 확인되었다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
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Claims (10)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 제1프라이머쌍 ; 및 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 제2프라이머쌍;을 포함하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임 PCR 프라이머 세트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1프라이머쌍에 포함된 서열번호 1 및 2의 염기서열은 상기 노로바이러스 GI의 ORF1 및 ORF2 부위의 염기서열(5,283-5,673; NS7-VP1 유전자)를 주형으로 설계 및 제작되고, 상기 제2프라이머쌍에 포함된 서열번호 4 내지 6은 상기 노로바이러스 GII의 Capsid protein 부위의 염기서열(5,011-5,403; VP1 유전자)을 주형으로 설계 및 제작된 것을 특징으로 하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임 PCR 프라이머 세트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 수인성 노로바이러스 GI 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클 레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제1프로브 및 상기 수인성 노로바이러스 GII 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클 레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제2프로브;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임 PCR 프라이머 세트.
  4. 제 1 항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 리얼타임 PCR용 프라이머 세트;를 포함하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임 PCR 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 리얼타임 PCR용 프라이머 세트에 포함된 제1프로브 및 제2프로브는 각각 염기서열의 5′말단에 부착되는 형광물질과 염기서열의 3′말단에 부착되는 형광흡수물질로 구성되는데,
    상기 제1프로브의 형광물질과 제2프로브의 형광물질은 서로 상이한 흡수 및 방출 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임 PCR 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    DNA 중합효소, dNTPs 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII의 동시 검출용 리얼타임 PCR 조성물.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 리얼타임 PCR 조성물을 포함하는, 수인성 노로바이러스 GI 및 GII 검출키트.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 수인성 노로바이러스 GI는 Genebank accession number JQ388274.1 이고, 상기 수인성 노로바이러스 GII는 Genebank accession number KX356908.1 인 것을 특징으로 하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII검출키트.
  9. 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계;
    제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 상기 유전자 샘플을 리얼타임 PCR로 증폭시키는 단계; 및
    상기 리얼타임 PCR 조성물에 포함된 제1 및 제2 프로브에 부착된 형광물질의 발광(emission)정도를 실시간으로 검출하고 분석하는 단계;를 포함하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII 진단방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 수인성 노로바이러스 GI 및 GII에 특이적인 유전자의 카피수를 알고 있는 양성 표준자를 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 리얼타임 PCR 조성물을 이용하여 증폭하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수인성 노로바이러스 GI 및 GII진단방법.
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Yoo et al., (2017). Evaluation of Various Real-Time Reverse Transcription Quantitative PCR Assays for Norovirus Detection. J. Microbiol. Biotechnol. 27(4); 816-824

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