JP4898210B2 - サポウイルスの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ウイルスの検出方法に関する発明である。

1972年にアメリカで発生した集団胃腸炎患者由来の糞便材料の電子顕微鏡像により、表面構造を持った直径30ｎｍ前後の小型の球形ウイルスが発見された。その後電子 顕微でこのような形状を有するウイルスをSRSV（小型球形ウイルスのこと）と暫定的に呼ぶことになった。このウイルス群の中にはノーウォークウイルスやサッポロウイルス、アストロウイルスが含まれていたが、２００２年８月に行われた第八次国際ウイルス命名委員会においてノーウォークウイルスとサッポロウイルスはCaliciviridaeに属し、前者がNorovirus（ノロウイルス）、後者がSapovirus（サポウイルス）と命名された。ノロウイルスの直径は２７〜３２ｎｍでgenogroupは２つに分けられ３０以上の遺伝子型が存在している。

サポウイルスも現在までに4つの遺伝子型が報告されている。両ウイルスともに表面構造としてカプシドがみられ、一本鎖のＲＮＡ（7.5Kb）を有している。

厚生労働省から報告されている感染症発生動向調査週報（2004年）によれば、冬季の病原体検出情報では、ノロウイルスが最も多く、特に、ノロウイルスGIIの感染が19都府県で241件検出され、GIが11件検出され、G不明が39件検出され、合計291件検出された。この他、サポウイルスが16件、ロタウイルスは20件の分離・報告となっている。サポウイルスに関してはノロウイルスに比べて低頻度と推察されているものの、乳幼児の下痢症の原因ウイルスとして挙げられている。

糞便からの下痢症ウイルス検出はノロウイルスを標的としては既に多くの衛生研究所、検査センターで実施されている。

ノロウイルスの検出については、PCR法、real-time PCR法、TRC法など多くの大量処理を行う方法が報告されている。
Arch Virol.146.2115-2132(2001) J.Med.Viro.65.413-417(2001) Arch Virol.147.1445-1451(2002)

冬期の食中毒、下痢症を引き起こす病因ウイルスの一種であるサポウイルスについて、大量処理が可能な簡便な測定系の開発が求められている。

現在、サポウイルスについてはRT-PCR法に基づく検出法がいくつか報告されている（上記非特許文献１〜３)。しかしながら、これらの従来のサポウイルスの検出法では、主としてＤＮＡ配列を決定し遺伝型を分類するために長い遺伝子領域を増幅することが必要とされ、さらに、検出の確認には電気泳動も必要とされるため、検出に際しての時間と人件費が問題となっている。また、電子顕微鏡による検出も実施されているが、施設が限られることもあり大量処理への対応が困難という問題点も指摘されている。

また、サポウイルスは大きく4つの遺伝子型に分類されているが、遺伝子配列の相同性は低く全ての遺伝子型を一度に高感度に検出することは困難であった。

本発明が解決すべき課題は、糞便等に存在するサポウイルスを、高感度かつ効率的に検出する手段を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決する手段として、サポウイルス遺伝子ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡの一部（ＲｄＲｐ領域の一部）が、各株間において高度の保存性を有することを見いだし、当該遺伝子領域の塩基配列に相応する塩基配列を有する核酸を指標として用いることに想到して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、サポウイルスのプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡとして配列番号５にて表される塩基配列の、
（１）５０７１〜５０９４番に相応する塩基配列において、１５〜２４塩基が連続する３種以上の＋鎖の核酸の組（ａ−１）を一方の遺伝子増幅用プライマーとして、及び、５１５４〜５１７８番に相応する塩基配列において１５〜２５塩基が連続する２種以上の−鎖の核酸の組（ｂ−２）を他方の遺伝子増幅用プライマーとして用い、あるいは、
（２）５０７１〜５０９４番に相応する塩基配列において１５〜２４塩基が連続する３種以上の−鎖の核酸の組（ａ−２）を一方の遺伝子増幅用プライマーとして、及び、５１５４〜５１７８番に相応する塩基配列において１５〜２５塩基が連続する２種以上の＋鎖の核酸の組（ｂ−１）を他方の遺伝子増幅用プライマーとして用いて、
検体から得られる遺伝子に対して遺伝子増幅手段を施し、これにより得られる遺伝子増幅産物を、遺伝子検出用プローブを用いて当該検体中のサポウイルスを検出する方法であって、さらに、
（３）上記３種以上の＋鎖の核酸の組（ａ−１）又は−鎖の核酸の組（ａ−２）は、配列番号１７、同１８及び同１９の核酸をそれぞれ＋鎖又は−鎖として必ず含み、
（４）上記２種以上の＋鎖の核酸の組（ｂ−１）又は−鎖の核酸の組（ｂ−２）は、配列番号２０及び同２１の核酸の組をそれぞれ＋鎖又は−鎖として必ず含み、
（５）遺伝子検出用核酸プローブは、５１０１〜５１２１番に相応する塩基配列のうち、少なくとも１０塩基以上連続した＋鎖又は−鎖の塩基配列を含む、蛍光標識された遺伝子検出用核酸プローブである、
ことを特徴とするウイルスの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。

本発明における基準株は、GeneBankにAccession No. X86560で登録されている塩基配列を有するサポウイルス株とする。また、「相応する」とは、各変異株を含んだサポウイルスにおいて、遺伝子解析の結果、上記基準株のｃＤＮＡの塩基配列で示される遺伝子領域に相応する塩基配列のことを意味する。具体的には、上記基準株のｃＤＮＡの塩基配列の拡散に対して、ストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０mM以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な塩基配列のことを意味する。さらに具体的には、図１において示される様々なサポウイルスの上記基準株のｃＤＮＡの塩基配列で示される遺伝子領域に相応する塩基配列が例示される。さらに、「相補的」とは、上記したように、ある塩基配列の拡散に対してストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０mM以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な程度の相補性を有する塩基配列のことを意味し、「相補的両塩基配列」とは、＋鎖に対する−鎖の関係を有する相補的塩基配列、及び/又は、−鎖に対する＋鎖の関係を有する相補的塩基配列の双方を含む塩基配列という意味である。

本発明により、糞便等に存在するサポウイルスを、高感度かつ効率的に検出する手段が提供される。

＜検出用のプライマーとプローブ＞
現在、GeneBankに登録されているサポウイルス株は、AJ251991株、U65427株、U95643株、X86559株、X86560株、AF294739株、U73124株、U95644株、AJ249939株、AJ271056株、U95645株、AF435814株、AY237420株、AY603425株、NC_006554株、NC_010624株である。これらの開示されている塩基配列は、各サポウイルス株の遺伝子ＲＮＡを鋳型として調製されたｃＤＮＡである。これらのサポウイルス株の遺伝子の塩基配列と、本発明の実施例で用いられたプライマープローブの位置関係を図１に示す。図１において、左端には、サポウイルス株の名称が示してあり、その最上段がAJ251991株の塩基配列を示している。各株の塩基配列の表示において、「．」は、AJ251991株と同一の塩基であることを示し、「−」と示している場合には、その塩基が存在しないことを示している。図１の表示にかかわらず、本発明の基準株はX86560株であり、本発明において基準となる配列番号は、図１におけるX86560株の配列番号である。ただし、必要に応じて各サポウイルス株の塩基配列の番号を表記として用いることもある。

本検出方法の指標となるｃＤＮＡの遺伝子領域は、サポウイルスのＲｄＲｐ領域の一部であり、図１に示した遺伝子領域は、AJ251991株は６６５〜８８６番（配列番号１：ただし、配列表の塩基配列の番号は１番から数える、以下同様である）であり、U65427株は６９５〜９１６番（配列番号２）、U95643株は７４３〜９６４番（配列番号３）、X86559株は４９３〜７１４番（配列番号４）、X86560株（基準株）は５０３４〜５２５５番（配列番号５）、AF294739株は７２０〜９４７番（配列番号６）、U73124株は６５７〜８８４番（配列番号７）、U95644株は６５７〜８８４番（配列番号８）、AJ249939株は５０３８〜５２６２番（配列番号９）、AJ271056株は６４２〜８６６番（配列番号１０）、U95645株は７４３〜９６４番（配列番号１１）、AF435814株は６５８〜８６７番（配列番号１２）、AY237420株は５０３８〜５２６２番（配列番号１３）、AY603425株は５０３７〜５２６４番（配列番号１４）、NC_006554株は５０３７〜５２６４番（配列番号１５）、NC_010624株は５０３８〜５２６２番（配列番号１６）である。

具体的に、サポウイルスの保存性領域についての知見を、サポウイルスの検出の指標として用いるに際しては、当該保存性領域を、核酸増幅法を用いて増幅して、当該保存性領域の遺伝子増幅産物を得ることが前提となる。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法を典型例とする各種の核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ(Nucleic acid Sequence based Amplication)法、ＳＤＡ(Strand Displacement Amplification)法、ＴＲＣ(Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction)法（東ソー社）、ＬＡＭＰ(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法（栄研化学社）等を用いることができる。これらの方法の中でも、容易に定量を行うことができるリアルタイムＰＣＲ法を用いることが好適である。リアルタイムＰＣＲ法の具体的な態様として、例えば、インターカレーター法、TaqManプローブ法、モレキュラービーコンプローブ法、サイクリングプローブ法等が挙げられるが、いずれの方法も用いることができる。

これらの遺伝子増幅法を用いるには、選択する核酸増幅法に基づいた遺伝子増幅用を設計・調製して用いる必要がある。当該遺伝子増幅用プライマーは、増幅を企図する遺伝子領域を、５’→３’の順方向（フォワード：Forward）と、逆方向（リバース：Reverse）に向けて遺伝子を増幅する＋−プライマーで挟み込むべく設計することが通常である。このような遺伝子増幅用プライマーにおける塩基数は、少なくとも、鋳型となる遺伝子において相補的に結合すべき領域に正しく結合することが必要であり、特徴的な塩基配列に対して相補的であるための最低限の塩基数は確保されていることが必要である。このような遺伝子増幅用プライマーにおける塩基数は、少なくとも１０塩基以上であり、好適には１５〜２５塩基程度である。また、相補的に結合するべき領域の３’側から数えて５塩基分の領域に対しては、可能な限り厳密な相補性を有するように遺伝子増幅用プライマーを設計することが好適である。

また、遺伝子増幅用プライマーの基となるべき遺伝子領域は、当該プライマーを用いて得られる遺伝子増幅産物に、少なくとも保存性領域に相応する相補的両塩基配列が含まれることが好適である。

上述したように、本検出方法において指標となるサポウイルス遺伝子の保存性領域は、プロトタイプ（基準株：X86560株）のｃＤＮＡの塩基配列の５０７１〜５１７８番（配列番号５に含まれる）に相応する相補的両塩基配列の全部又は一部である。次に、上記配列番号１〜４と６〜１６に示された塩基配列領域のうち、当該基準株（X86560株）の保存性領域の塩基配列に相応する塩基配列は、配列番号１（AJ251991株遺伝子）では７０２〜８０９番であり、配列番号２（U65427株遺伝子）では７３２〜８３９番であり、配列番号３（U95643株）では７８０〜８８７番であり、配列番号４（X86559株）では５３０〜６３７番であり、配列番号６（AF294739株）では７５７〜８６４番であり、配列番号７（U73124株）では６９４〜８０１番であり、配列番号８（U95644株）では６９４〜８０１番であり、配列番号９（AJ249939株）では５０７５〜５１５８番であり、配列番号１０（AJ271056株）では６７９〜７８６番であり、配列番号１１（U95645株）では７８０〜８８７番であり、配列番号１２(AF435814株)では６９５〜８０２番であり、配列番号１３（AY237420株）では５０７５〜５１８２番であり、配列番号１４（AY603425株）では５０７４〜５１８１番であり、配列番号１５（NC_006554株）では５０７４〜５１８１番であり、配列番号１６（NC_010624株）では５１９５〜５１８２番である。

プロトタイプ（基準株：X86560株）のｃＤＮＡの塩基配列の５０７１〜５１７８番に相応する相補的両塩基配列の一部として、特に、（１）５０７１〜５０９４番に相応する塩基配列、（２）５１０１〜５１２１番に相応する塩基配列、及び、（３）５１５４〜５１７８番に相応する塩基配列の３領域のサポウイルス株間の保存性が高く、当該部分を検出の指標（典型的にはプローブ）又は遺伝子増幅用プライマーの本質部分として用いることが好適である。すなわち、本検出方法は、検体における、サポウイルスのプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の、（１）５０７１〜５０９４番において１０塩基以上連続び、（３）５１５４〜５１７８番において１０塩基以上連続する塩基配列、からなる群から選ばれる１種以上に相応する相補的両塩基配列の核酸を指標として、サポウイルスを検出する態様をとることが好適である。これらの塩基する塩基配列、（２）５１０１〜５１２１番において１０塩基以上連続する塩基配列、及配列領域（１）〜（３）は、それぞれ図１においてボックスで囲って示している。

（Ａ）塩基配列領域（１）及び（２）の組を本質部分とする遺伝子増幅用プライマーを用いて、検体中の遺伝子の増幅を行う場合には、検出指標として塩基配列領域（１）又は（２）を本質部分とするプローブを用いることが好適である。

（Ｂ）また、塩基配列領域（２）及び（３）の組を本質部分とする遺伝子増幅用プライマーを用いて、検体中の遺伝子の増幅を行う場合には、検出指標として塩基配列領域（２）又は（３）を本質部分とするプローブを用いることが好適である。

（Ｃ）さらに、塩基配列領域（１）及び（３）の組を本質部分とする遺伝子増幅用プライマーを用いて、検体中の遺伝子の増幅を行う場合には、検出指標として塩基配列領域（１）、（２）又は（３）を本質部分とするプローブを用いることが可能であるが、領域（２）を本質部分とするプローブを用いることが好適である。

このように、塩基配列領域（１）〜（３）に相応する両塩基配列は、それぞれ、本検出方法における検出指標、又は、遺伝子増幅用プライマーの本質部分として用いることが可能であるが、特に、上記（Ｃ）の組み合わせにて本検出方法を行うことが好適であり、特に、塩基配列領域（２）を、検出用プローブの本質部分として、かつ、塩基配列領域（１）と（３）を、遺伝子増幅用プライマーの本質部分として用いることが最も好適である。

＜具体的な検出の態様＞
本検出方法を適用すべき検体は、サポウイルスを検出すべきすべてのものが対象となる。例えば、食中毒患者において、サポウイルスを検出すべき場合には、典型的には、当該食中毒患者の糞便、場合によっては嘔吐物、血液等を検体として用いることが可能である。また、食品や食品生産設備における付着物、食品生産者や食中毒患者の衣服等を検体とすることが可能である。さらに、各種の汚水や排水、海水、河川水、湖水等の水系の水を検体として用いることも可能である。これらの検体からの遺伝子の調製方法は、用いる検体の種類に応じて適切な方法を選択することが可能であるが、概ね、用いる検体を水等に浸漬又は懸濁して、これらの水から得られる上層画分から、酸フェノール法(ＡＣＰＣ法：Acid Guanidin Phenol Chroloform method)等の常法により、ウイルスＲＮＡを抽出することにより行うことができる。かかるウイルスＲＮＡに対して、選択する遺伝子増幅法による処理、例えば、逆転写酵素を用いたウイルスＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの調製等を行い、この核酸試料を、上記の遺伝子増幅用プライマーを用いて、遺伝子増幅を行うことにより、所望する遺伝子増幅産物を得ることができる（遺伝子増幅産物の確認は、例えば、電気泳動により、目的とする大きさの遺伝子増幅産物が認められるか否か、又は、特定の配列のプローブにより検出される特定の配列を含む遺伝子増幅産物が認められるか否か等を指標として行われる）。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、電気泳動の手間を省きつつ、所望する遺伝子増幅産物の定量検出を行うことが可能である。

遺伝子増幅法により得られる特定の遺伝子増幅産物を検出するための検出用核酸プローブは、上述したように塩基配列領域（１）〜（３）のいずれか、特に好適には（２）を本質部分とする核酸を有するプローブである。当該核酸プローブは、例えば、蛍光標識、アイソトープ標識、色素標識等、の標識を施した核酸であり、これらの標識を利用して、遺伝子増幅産物における検出すべき塩基配列の存在を、ハイブリダイゼーション等によりネガティブ又はポジティブに確認する方法等を用いることができる。一般的に、これらの検出手段は、遺伝子増幅操作終了後に行うものであるが、このような方法であると、遺伝子増幅操作反応後に、チューブを開けて、分析サンプルを取り出さなければならないため、実験設備や試薬を、遺伝子増幅産物で汚染させてしまう機会を増やすことになる上、時間と労力が必要であり、さらに、汚染源となった遺伝子増幅産物自体が、その後の実験テンプレートとなって擬陽性となる機会を増大させることになり得ることとなる。そこで、汚染等の危険を回避し、さらに、検出操作に費やす時間を可能な限り短縮するために、遺伝子増幅操作の過程において、遺伝子増幅産物中の特定の塩基配列をリアルタイムでモニタリングすることが可能な手段、すなわち、リアルタイムＰＣＲ法を行うことが好適である。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲ反応による遺伝子増幅産物の増幅量をリアルタイムにてモニターし解析する方法である。具体的には、段階希釈した既知量のＤＮＡをスタンダードとしてＰＣＲ反応を行い、これを基に、遺伝子の増幅が指数関数的に起こる領域で、一定の増幅産物量となるサイクル数と、初発のＤＮＡ量との相関から得られる検量線を作成し、当該検量線を基にしてサンプル中の目的とするＤＮＡ量を測定する方法である。上述したように、リアルタイムＰＣＲ法の態様として、インターカレーター法、TaqManプローブ法、モレキュラー ビーコン プローブ法、サイクリングプローブ法等が挙げられる。

インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）をＰＣＲ反応系に加える方法であり、当該蛍光を検出することにより、遺伝子増幅産物の生成量をモニターすることが可能である。

モレキュラー ビーコン プローブ法は、遺伝子増幅産物の生成を、増幅過程中（増幅過程後も可能）に、蛍光でモニターするために使用できる、ヘアピン型のハイブリダイゼーションプローブ［モレキュラー ビーコン プローブ(Molecular beacon Probe)］を用いる遺伝子の検出方法である(Nature Biotechnology 1998 16:49-53)。モレキュラー ビーコン プローブを構成する核酸の末端は、互いに相補的となっており、通常は、これらの末端同士が結合して、いわゆるステム構造を形成し、かかるステム構造におけるループ部分は、遺伝子増幅産物の目的とする領域（例えば、上記の塩基配列領域（２））に対して相補的になるように設計されている。さらに、蛍光剤と非蛍光の消光剤が核酸の両端にそれぞれ結合しており、溶液中でプローブが遊離しているときは、ヘアピン構造を形成するため、蛍光剤と消光剤は互いに作用して蛍光は消えている。しかし、核酸に相補的な塩基配列が存在する遺伝子増幅産物が存在する場合には、ループ部分が、その相補的な塩基配列に結合し、その結果、プローブ全体の構造が変化して、蛍光剤と消光剤が離れて、消光剤の蛍光剤に対する消光効果が解消するために、蛍光剤が本来の蛍光を発するようになる。この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、目的の塩基配列の存在を検出することができる。なお、モレキュラー ビーコン プローブにおける、上述した蛍光剤と消光剤の標識は、通常、核酸の５'末端に、６−carboxyfluorescein(6-FAM)や、6-carboxy-4,7,2',7'-tetrachlorofluorescein(TET)等のフルオレセイン系蛍光色素や、5-carboxytetramethylrhodsmine(TAMARA)等のローダミン系蛍光色素を標識し、さらに３'末端に、4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid(DABCYL)等の消光剤を標識することにより行うことができる（例えば、Nature Biotechnology 1996 14:303-308等）。

タック−マン プローブ法は、遺伝子増幅産物の形成を増幅過程中に蛍光でモニターすることために使用できる、ハイブリダイゼーションプローブであるタック−マン プローブ(Taq-Man Probe)（タック−マン(Taq-Man)は登録商標である）を用いる遺伝子の検出方法である（実験医学 Vol.15 No.7（増刊） p46〜51,1997等）。タック−マン プローブは、５'末端には、フルオレセイン系の蛍光色素（レポーター色素）が、３'末端には、ローダミン系の蛍光色素（クエンチャー色素）が、それぞれ標識された核酸である。レポーター色素とクエンチャー色素が、核酸を介して結合している状態では、ホエルスター(Forster)共鳴エネルギーにより、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素によって抑制されている。これに対して、プライマー及びタック−マン プローブが、遺伝子増幅産物のタック−マン プローブの核酸に相補的な核酸をアニーリングして伸長反応が進むと、TaqＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エンドヌクレアーゼ活性により、タック−マン プローブの５'末端のレポーター色素が、３'末端のクエンチャー色素から離脱すると、抑制されていたレポーター色素の蛍光強度が増大する。レポーター色素による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程における（遺伝子増幅過程終了後も可能）、目的とする塩基配列の存在を検出することができる。なお、タック−マン プローブにおける、上述した蛍光標識は、通常、核酸の５'末端に、６−ＦＡＭやＴＥＴ等のフルオレセイン系の蛍光色素を、同３'末端にＴＡＭＡＲＡ等のローダミン系の蛍光色素を、常法（例えば、Nucleic Acids Research 1993 21(16):3761-3766等）に従って行うことができる。

サイクリングプローブ法は、ＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラプローブとＲＮaseＨの組み合わせによる検出方法で、遺伝子増幅中や増幅後にて、特定の塩基配列を効率よく検出することが可能な方法である。プローブは、５'末端側が蛍光色素（リポーター）で、３'側が消光剤（クエンチャー）で標識されている。このプローブは、そのままの状態では蛍光色素と消光剤の接触により蛍光が抑制されているが、配列が相補的な増幅産物と結合した後に、ＲＮaseＨによりＲＮＡ部分が切断されると強い蛍光を発するようになる、かかる蛍光強度を測定することで、目的とする遺伝子増幅産物の量をモニターすることが可能である。

本検出方法では、サポウイルスの検出に際して、上述した手段により、目的とする核酸を定量して検出することも可能であり、定量を伴わずに、例えば、陽性若しくは陰性という定性情報として検出することも可能である。この遺伝子増幅産物等の検出情報（定量値や定性情報）を指標として、これと検体中のサポウイルスの存在・非存在、さらには存在量と関連付けることによって、所望するサポウイルスの検出を行うことができる。

＜検出用キット＞
本発明においては、本検出方法を行うための、サポウイルスの検出用キット（以下、本検出用キットともいう）も提供される。

本検出用キットには、通常、サポウイルスの保存性領域等をＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の遺伝子増幅手段により増幅するために用いる、遺伝子増幅用プライマー、及び／又は、遺伝子増幅産物における保存性領域を検出するためのプローブが含まれるが、当該プライマーとプローブの双方が含まれることが好適である。遺伝子増幅用プライマーは、上記遺伝子増幅手段にて用いることにより、サポウイルスの遺伝子の保存性領域等を遺伝子増幅産物として増幅させることが可能な核酸である。また、検出用核酸プローブは、保存性領域等の塩基配列に対応する配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸である。検出用核酸プローブは、上述のごとく、蛍光標識、色素標識、アイソトープ標識等の標識を施した核酸プローブを用いることができるが、特に、遺伝子増幅過程において、サポウイルスを検出する場合（リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合）には、上述のTaqManプローブ、又は、モレキュラー ビーコン プローブを、検出用プローブとして組み入れたものを用いることが好適である。

本検出用キットに含めることができる、遺伝子増幅用プライマーと遺伝子検出用核酸プローブについては、本検出方法の説明において開示した通りであり、実施例においても具体例を開示した。

以下、本発明の実施例を開示する。ただし、本実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。

＜プライマー及びプローブの調製＞
本実施例におけるサポウイルスの検出は、配列番号１〜１６を用いて塩基配列を設定した、以下の遺伝子増幅用プライマーと遺伝子検出用核酸プローブを用いて行った。これらの核酸は、ＡＢ１３９４８全自動核酸合成精製システム（アプライドバイオシステム社）を用いて化学合成した。

遺伝子増幅用プライマー
［Ｆｏｒｗａｒｄ−Ｐｒｉｍｅｒ］
Ｆ０１: 5’-CCAGGCTCTCGCCACCTAC-3’（配列番号１７：基準株の５０７６〜５０９４番に相当）
Ｆ０２: 5’-CCAGGCTCTCGCTACCTAC-3’（配列番号１８：AY603425株の５０７９〜５０９７番に相当）
Ｆ０３: 5’-TTTGGCCCTCGCCACCTAC-3’（配列番号１９：AF294739株の７６２〜７８０番に相当）
［Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｒｉｍｅｒ］
Ｒ０１: 5’-GCCCTCCATCTCAAACACTATTTTG-3’（配列番号２０：基準株の５１５４〜５１７８番に相当）
Ｒ０２: 5’-GCCCTCCATTTCAAACACTAATTTG-3’（配列番号２１：AF294739株の８４０〜８６４番に相当）

遺伝子検出用プローブ
［タック−マンプローブ］
5’-TGGTTYATAGGYGGTRCA-MGB-3’（配列番号２２：基準株の５１０２〜５１２０に相当）
(MGB:Minor Groove Binder(Tm enhancer))
Real-timeＰＣＲ反応用試薬として、（１）7pmol/μlに調製した上述のセンスプライマーF01〜F03、（２）10pmol/μlに調製した上述のアンチセンスプライマーR01〜R02、（３）5pmol/μlに調製した上述のTaqManプローブそれぞれを1μl、（４）2×TaqMan Master mix（アプライドバイオシステムズ）を12.5μl、D.W. 1.5μlを混合し、後述のプラスミド溶液もしくはｃＤＮＡ溶液5μlを加えた。

Real-timeＰＣＲ反応は、50℃・2分間、95℃・10分間の前処理を行い、95℃・15秒間、60℃・1分間の反応を45回行った。

本発明の検出感度はサポウイルスG1a株の増幅領域配列（配列番号２３）、G1b株の増幅領域配列（配列番号２４）、G2a株の増幅領域配列（配列番号２５）、G2b株の増幅領域配列（配列番号２６）及G4株の増幅領域配列（配列番号２７）を組み込んだプラスミドベクターの希釈系列を用いて検討した。全ての遺伝子型で検出下限は10copyであった。

食中毒あるいは下痢症の病因となるサポウイルスは、ヒトの消化器で増殖し、糞便中に含まれて***されるため、ヒトの凍結便を検体として選択した。1341例の凍結便を2mlチューブ中で4倍量のTE bufferに懸濁し、20%乳濁調製液とした。これを室温、8000rpmで10分間遠心した。上清140μlを分取し、QIAamp virus RNA kit(QIAGEN)を使用してＲＮＡ精製液50μlとした。ＲＮＡ精製液5μlをSuperScript First-Sstrand Synthesis System for ＲＴ−ＰＣＲ（Invitrogen社）の使用法に準じて42℃で2時間反応させ、20μlのｃＤＮＡ溶液とした。1341例の凍結便検体において4例（0.3%）が陽性となった。陽性となった4例のうちCt値が40以上であった3例（標的ＤＮＡ濃度が低すぎると判断した）については、従来のＲＴ−ＰＣＲ（１）（Archives of Virology(2002) 147 :1445-1451）で確認し、1例のみ陽性となった。残りの2例については、センスプライマー（SV01F : 5’-TACRAHKCNTGGTTYATAGGTGGT-3’（配列番号２８）とアンチセンスプライマー(SVG2aR : 5’-GCACTCGTTGGYCCAATGGT-3’、 SVG2b/dR :5’-CGCTGTAGGRCCAATGGT-3’、 SVG2cR : 5’-GCCGCGCTTGGTCCAATTGT-3’) （配列番号２９〜３１）を用いてG2型を特異的に検出するＲＴ−ＰＣＲ（２）を行い、陽性であることをアガロースゲル電気泳動で確認した。それぞれ得られたバンドは切り出し精製を行い、ＰＣＲに使用したプライマーでシークエンス反応を行った。（１）で陽性となったサンプルのＰＣＲ産物はaccession No. X86559と ９８％の相同性があり、(2)で陽性となったサンプルのＰＣＲ産物は2例ともAY237420と ９７％の相同性があった。

この結果、サポウイルスゲノムの特定の領域に保存されている塩基配列にもとづいて設定されたプローブ、プライマーを用いるreal-timeＰＣＲを行うことによりサポウイルスを検出できることが確認された。

サポウイルス株の遺伝子の塩基配列と、本発明の実施例で用いられたプライマープローブの位置関係を示した図面である。

Claims (7)

1. サポウイルスのプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡとして配列番号５にて表される塩基配列の、
   （１）５０７１〜５０９４番に相応する塩基配列において、１５〜２４塩基が連続する３種以上の＋鎖の核酸の組（ａ−１）を一方の遺伝子増幅用プライマーとして、及び、５１５４〜５１７８番に相応する塩基配列において１５〜２５塩基が連続する２種以上の−鎖の核酸の組（ｂ−２）を他方の遺伝子増幅用プライマーとして用い、あるいは、
   （２）５０７１〜５０９４番に相応する塩基配列において１５〜２４塩基が連続する３種以上の−鎖の核酸の組（ａ−２）を一方の遺伝子増幅用プライマーとして、及び、５１５４〜５１７８番に相応する塩基配列において１５〜２５塩基が連続する２種以上の＋鎖の核酸の組（ｂ−１）を他方の遺伝子増幅用プライマーとして用いて、
   検体から得られる遺伝子に対して遺伝子増幅手段を施し、これにより得られる遺伝子増幅産物を、遺伝子検出用プローブを用いて当該検体中のサポウイルスを検出する方法であって、さらに、
   （３）上記３種以上の＋鎖の核酸の組（ａ−１）又は−鎖の核酸の組（ａ−２）は、配列番号１７、同１８及び同１９の核酸をそれぞれ＋鎖又は−鎖として必ず含み、
   （４）上記２種以上の＋鎖の核酸の組（ｂ−１）又は−鎖の核酸の組（ｂ−２）は、配列番号２０及び同２１の核酸の組をそれぞれ＋鎖又は−鎖として必ず含み、
   （５）遺伝子検出用核酸プローブは、５１０１〜５１２１番に相応する塩基配列のうち、少なくとも１０塩基以上連続した＋鎖又は−鎖の塩基配列を含む、蛍光標識された遺伝子検出用核酸プローブである、
   ことを特徴とするウイルスの検出方法。
2. 遺伝子増幅用プライマーが、下記のフォワードプライマー（１）と、リバースプライマー（２）の組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーである、請求項１記載のウイルスの検出方法。
   （１）フォワードプライマーとして、配列番号１７、同１８及び同１９の塩基配列の核酸の組、
   （２）リバースプライマーとして、配列番号２０及び同２１の塩基配列の核酸の組。
3. 蛍光標識された遺伝子検出用核酸プローブが、モレキュラー ビーコン プローブ(Molecular beacon Probe)、または、遺伝子増幅産物の形成を増幅過程中に蛍光でモニターするために用いることができるハイブリダイゼーションプローブである、請求項１又は２記載のウイルスの検出方法。
4. ウイルスの検出方法が、サポウイルスの定量的な検出方法である、請求項１〜３のいずれかの請求項記載のウイルスの検出方法。
5. 前記検出方法における検体が、糞便検体である、請求項１〜４のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
6. 以下に示す遺伝子増幅用プライマーおよび／または遺伝子検出用核酸プローブを含む、請求項１〜５のいずれかの請求項記載のウイルスの検出方法を行うための、ウイルス検出用キット。
   （１）遺伝子増幅用プライマーは、下記のフォワードプライマー（ａ）と、リバースプライマー（ｂ）の組み合わせからなる遺伝子増幅用プライマーである。
   （ａ）フォワードプライマーとして、配列番号１７、同１８及び同１９の塩基配列の核酸の組、
   （ｂ）リバースプライマーとして、配列番号２０及び同２１の塩基配列の核酸の組、
   （２）遺伝子検出用核酸プローブは、サポウイルスのプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡとして配列番号５にて表される塩基配列の５１０１〜５１２１番に相応する塩基配列のうち、少なくとも１０塩基以上連続した＋鎖又は−鎖の塩基配列を含む、蛍光標識された遺伝子検出用核酸プローブである。
7. 蛍光標識された遺伝子検出用核酸プローブが、モレキュラー ビーコン プローブ(Molecular beacon Probe)、又は、遺伝子増幅産物の形成を増幅過程中に蛍光でモニターするために用いることができるハイブリダイゼーションプローブである、請求項６記載のウイルス検出用キット。