CN106471135B - 肠道病毒和双埃柯病毒的分子检测 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于在生物样品中确定肠道病毒(enterovirus)和双埃柯病毒(parechovirus)存在或不存在的方法。所述方法涉及使用直接从生物样品扩增而无核苷酸提取步骤来鉴定来自所述病毒的靶核苷酸的存在或不存在，但基本上保持与测定提取核苷酸的方法相同的特异性和敏感性。还提供了使用提供的方法的诊断方法和用于实践所述方法的组合物和试剂盒。

Description

肠道病毒和双埃柯病毒的分子检测

发明领域

本发明涉及用于在生物样品中检测和区分肠道病毒和双埃柯病毒的方法。

发明背景

提供发明背景的下述讨论仅为了辅助读者理解本发明而并非承认将本发明描述为现有技术或构成现有技术。

肠道病毒属于病毒的小RNA病毒(Picornaviridae)家族。其通过与从胃肠道或上呼吸道脱落的病毒的直接接触在人与人之间传播，每年在全世界影响数百万人。其常见于呼吸道分泌物，例如感染者的唾液、痰或鼻粘液、粪便和脑脊液。肠道病毒感染可导致多种症状，范围包括轻度呼吸道疾病(普通感冒)、手足口病、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、严重新生儿败血症样疾病、和急性弛缓性麻痹。历史上，脊髓灰质炎是由肠道病毒脊髓灰质炎病毒引起的最显著的疾病。然而，还存在至少62种能在人中引起疾病的非脊髓灰质炎肠道病毒，包括柯萨奇病毒A型(Coxsackie A virus)、柯萨奇病毒B型(Coxsackie Bvirus)和埃可病毒(echovirus)。

双埃柯病毒是小RNA病毒家族的病毒属，小RNA病毒家族是具有二十面体衣壳的无包膜，正义，单链RNA病毒的大家族。衣壳是60个原体(protomer)的排列，每一个由4个蛋白形成(VP1-VP4)，并包裹线性RNA基因组。双埃柯病毒属由两个种组成：人双埃柯病毒和Ljungan病毒。人双埃柯病毒广泛传播并引起轻微的胃肠道或呼吸道疾病，但还涉及心肌炎和脑炎的情况。多于95％的人在生命早期(2-5岁的年龄内)受人双埃柯病毒感染。

病毒的临床检测通常使用多种方法中的任何一种完成。例如，病毒颗粒或核酸可从生物样品(例如脑脊液、鼻咽抽吸物、喉拭子、血液、粪便、尿液等)分离。回顾性诊断可通过血清学完成。尽管可使用血凝抑制(HAI)和酶免疫测定(EIA)以给出类型特异性诊断，但在该方法中最广泛使用的是补体固定测试(CFT)。对于更快速的诊断，可实施抗原检测或RNA检测。然而，由于这些家族中大量的病毒，多重抗原或核苷酸序列的筛选是必须的。此外，经常必须从粗制生物样品提取核酸进而精确地检测来自微生物的核酸的存在。

鉴于在快速诊断的情况下，从生物样品制备和处理病毒核酸用于检测、诊断和/或量化相关的高复杂程度，需要涉及较少步骤、较少技术需求和较短持续时间的方法。此外，进一步需要能够在人中以最少步骤数且不需要从样品提取核酸来检测并将肠道病毒和双埃柯病毒的多种类型与其他病毒加以区分的方法。

发明简述

本文提供了用于在生物样品中确定肠道病毒和/或双埃柯病毒存在或不存在的方法。

一方面，本发明提供用于在样品中确定肠道病毒存在或不存在的方法，所述方法包括：如果在样品中存在肠道病毒，使用至少一对引物扩增肠道病毒核酸，其中所述引物对的第一引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:1或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且所述引物对的第二引物具有引物元件，所述物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:2或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交。

在一些实施方案中，用于确定样品中肠道病毒存在或不存在的方法包括：(a)将生物样品加热至第一预定温度达第一预定时间以分离样品中存在的RNA二级结构，(b)将样品与反应混合剂接触以形成反应混合物，其中所述反应混合剂包含引物对、DNA聚合酶、逆转录酶和含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的多个游离核苷酸，其中引物对的一个引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:1或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且所述引物对的另一引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:2或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，(c)在允许RNA逆转录的条件下将反应混合物冷却至第二预定温度达第二预定时间，(d)扩增靶核酸序列，其中扩增包括如下步骤：在允许引物的引物元件与cDNA的第一和第二链上的其互补序列杂交(如果存在的话)并允许DNA聚合酶延伸引物的条件下，将反应混合物冷却至第三预定温度达第三预定时间，和(e)重复步骤(d)。如果在反应混合物中扩增出肠道病毒靶序列而产生扩增子，则确定所述样品中存在肠道病毒。在一些实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前实施(例如，加热生物样品，并将加热的样品与反应混合剂接触以形成反应混合物)。在一些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前实施(例如，将生物样品与反应混合剂接触以形成反应混合物，且随后加热包含生物样品的反应混合物)。

在一些实施方案中，用于检测肠道病毒的引物对的第一引物具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的完整互补物至少90％相同的引物元件和非核酸的可检测标记。在一些实施方案中，第一引物是引物-探针。在一些实施方案中，引物-探针具有包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的探针元件。探针元件可进一步包含淬灭剂、荧光团和两个自身互补的茎序列，其中每个茎序列长度为至少4、5、6或7个核苷酸。此外，引物对的第二引物可具有包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的引物元件。

在一些实施方案中，用于检测肠道病毒的引物对的第一引物具有包含与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:2的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的引物元件和非核酸的可检测标记。在一些实施方案中，第一引物是引物-探针。在一些实施方案中，引物-探针具有包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的探针元件。在一些实施方案中，探针元件进一步包含淬灭剂、荧光团和两个自身互补的茎序列，其中每个茎序列长度为至少4、5、6或7个核苷酸。在一些实施方案中，引物对的第二引物可具有与SEQID NO:1或SEQ ID NO:1的完整互补物至少90％相同的引物元件。

本发明的另一方面提供用于确定样品中双埃柯病毒存在或不存在的方法，所述方法包括：如果在样品中存在双埃柯病毒，使用至少一对引物扩增双埃柯病毒核酸，其中所述引物对的第一引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:4或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且所述引物对的第二引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:5或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交。

在一些实施方案中，用于确定样品中双埃柯病毒存在或不存在的方法包括：(a)将生物样品加热至第一预定温度达第一预定时间以分离样品中存在的RNA二级结构，提供包含样品、引物对、DNA聚合酶的反应混合物，(b)将样品与反应混合剂接触以形成反应混合物，其中所述反应混合剂包含引物对、DNA聚合酶、逆转录酶和含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的多个游离核苷酸，其中引物对的一个引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:4或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且所述引物对的另一引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQ ID NO:5或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，(c)在允许RNA逆转录的条件下将反应混合物冷却至第二预定温度达第二预定时间，(d)扩增靶核酸序列，其中扩增包括如下步骤：在允许引物的引物元件与cDNA的第一和第二链上的其互补序列杂交(如果存在的话)并允许DNA聚合酶延伸引物的条件下，将反应混合物冷却至第三预定温度达第三预定时间，和(e)重复步骤(d)。如果在反应混合物中扩增出双埃柯病毒靶序列而产生扩增子，则确定所述样品中存在双埃柯病毒。在一些实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前实施(例如，加热生物样品，并将加热的样品与反应混合剂接触以形成反应混合物)。在一些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前实施(例如，将生物样品与反应混合剂接触以形成反应混合物，且随后加热包含生物样品的反应混合物)。

在一些实施方案中，用于检测双埃柯病毒的引物对的第一引物具有包含与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:4的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的引物元件和非核酸的可检测标记。在一些实施方案中，第一引物是引物-探针。在一些实施方案中，引物-探针具有包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的探针元件。在一些实施方案中，探针元件可进一步包含淬灭剂、荧光团和两个自身互补的茎序列，其中每个茎序列长度为至少4、5、6或7个核苷酸。此外，在一些实施方案中，引物对的第二引物可具有包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的引物元件。

在一些实施方案中，用于检测双埃柯病毒的引物对的第一引物具有包含与SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:5的完整互补物至少90％相同的引物元件和非核酸的可检测标记。在一些实施方案中，第一引物是引物-探针。在一些实施方案中，引物-探针具有包含与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:6的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的引物-探针。探针元件可进一步包含淬灭剂、荧光团和两个自身互补的茎序列，其中每个茎序列长度为至少4、5、6或7个核苷酸。此外，引物对的第二引物可具有包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的引物元件。

在一些实施方案中，公开的方法用于确定样品中肠道病毒和双埃柯病毒的存在或不存在，所述样品为选自下组的生物样品：脑脊液、血液、粪便、喉拭子、直肠拭子、鼻喉拭子、血浆、血清和尿液。在一些实施方案中，在逆转录和扩增前不从生物样品提取核酸。在一些实施方案中，样品包含从RNA逆转录的cDNA。在一些实施方案中，样品包含RNA，反应混合物进一步包含逆转录酶，并将反应混合物加热至预定温度达预定时间以分离样品中的RNA二级结构并随后冷却以在逆转录酶存在下将样品中的RNA逆转录成为cDNA。

本发明的另一方面提供用于检测样品中肠道病毒和双埃柯病毒存在或不存在的方法，包括：(a)将生物样品加热至第一预定温度达第一预定时间以分离样品中存在的RNA二级结构，(b)将样品与反应混合剂接触以形成反应混合物，其中所述反应混合剂包含第一和第二引物对、DNA聚合酶、逆转录酶和含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的多个游离核苷酸，其中第一引物对的一个引物具有引物元件，所述引物元件在严格条件下与包含SEQID NO:1或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且第一引物对的另一引物具有引物元件，所述引物元件具有在严格条件下与包含SEQ ID NO:2或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且其中第二引物对的一个引物具有引物元件，所述引物元件与包含SEQ ID NO:4或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且第二引物对的另一引物具有引物元件，所述引物元件与包含SEQ ID NO:5或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，(c)在允许RNA逆转录的条件下将反应混合物冷却至第二预定温度达第二预定时间，(d)扩增靶核酸序列，其中扩增包括如下步骤：在允许引物的引物元件与cDNA的第一和第二链上的其互补序列杂交(如果存在的话)并允许DNA聚合酶延伸引物的条件下，将反应混合物冷却至第三预定温度达第三预定时间，和(e)重复步骤(d)。如果在反应混合物中扩增出肠道病毒靶序列而产生扩增子，则确定所述样品中存在肠道病毒，且如果在反应混合物中扩增出双埃柯病毒靶序列而产生扩增子，则确定所述样品中存在双埃柯病毒。在一些实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前实施(例如，加热生物样品，并将加热的样品与反应混合剂接触以形成反应混合物)。在一些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前实施(例如，将生物样品与反应混合剂接触以形成反应混合物，且随后加热包含生物样品的反应混合物)。

本发明的另一方面提供包含具有引物元件的引物的组合物，所述引物元件与选自下组的序列至少90％相同：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的完整互补物、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:2的完整互补物、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4的完整互补物、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5的完整互补物。在一些实施方案中，引物与可检测标记直接或间接连接。组合物可以是引物-探针，其进一步包含与引物元件通过聚合酶阻断基团直接或间接连接的探针元件，其中所述探针元件包含与下述至少90％相同的核酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:3的完整互补物、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的完整互补物。在一些实施方案中，引物-探针进一步包含淬灭染料，且可检测标记是荧光团。

在一个具体的实施方案中，引物-探针包含5′淬灭染料、侧翼为长度至少4个核苷酸的两个自身互补核苷酸序列的SEQ ID NO:3、荧光团和/或包含SEQ ID NO:2的核酸。在另一个具体实施方案中，引物-探针包含5′荧光团、包含侧翼为长度至少4个核苷酸的两个自身互补核苷酸序列的SEQ ID NO:6的核酸、淬灭染料和包含SEQ ID NO:5的核酸。在一些实施方案中，引物-探针进一步包含由聚乙二醇组成的间隔基。在一些实施方案中，间隔基包含18原子的基于聚乙二醇的接头。在一些实施方案中，间隔基由非核苷酸的材料组成(即非核苷酸间隔基)。在一些实施方案中，间隔基可紧邻引物元件的5′。

本发明还提供试剂盒，其包含本文公开的寡核苷酸、引物和引物-探针。在一个实施方案中，试剂盒包含具有引物元件的第一引物和具有引物元件的第二引物，所述第一引物的引物元件特异性地与包含SEQ ID NO:1或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且第二引物的引物元件特异性地与包含SEQ ID NO:2或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，其中引物的至少一种使用非核酸的可检测标记进行了标记。在一个实施方案中，试剂盒包含具有引物元件的第一引物和具有引物元件的第二引物，所述第一引物的引物元件特异性地与包含SEQ ID NO:4或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且第二引物的引物元件特异性地与包含SEQ ID NO:5或其完整的互补物或由其组成的核酸特杂交，其中引物的至少一种使用非核酸的可检测标记进行了标记。

在一个实施方案中，试剂盒包含(a)含有第一引物和第二引物的第一引物对，所述第一引物具有与包含SEQ ID NO:1或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交的引物元件，且第二引物具有与包含SEQ ID NO:2或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交的引物元件；和(b)含有第一引物和第二引物的第二引物对，所述第一引物具有与包含SEQ ID NO:3或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交的引物元件，且第二引物具有与包含SEQ ID NO:5或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交的引物元件，其中第一和第二引物对的引物的至少一种引物使用非核酸的可检测标记进行标记。

在一个实施方案中，提供了包含如本文所述的检测肠道病毒的引物对和检测双埃柯病毒的引物对的试剂盒。另一实施方案提供包含检测至少64种肠道病毒血清型的引物对和检测至少8种双埃柯病毒血清型的引物对的试剂盒。

本发明的另一方面提供扩增靶核苷酸序列的方法，包括提供包含双链靶DNA、引物对(其中第一引物与包含SEQ ID NO:1或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且第二引物与包含SEQ ID NO:2或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交)、DNA聚合酶和含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的多个游离核苷酸；将反应混合物加热至第一预定温度达第一预定时间以将双链DNA的链彼此分离；在允许第一和第二引物与靶DNA的第一和第二链上的其互补序列杂交并允许DNA聚合酶延伸引物的条件下，将反应物冷却至第二预定温度达第二预定时间，并重复上述步骤。在一些实施方案中，引物的至少一种是包含非核酸的可检测标记的引物-探针。在一些实施方案中，引物是如本文所述的引物。在一些实施方案中，DNA是cDNA。

本发明的另一方面提供扩增靶核苷酸序列的方法，包括提供含有双链靶DNA、引物对(其中第一引物与包含SEQ ID NO:4或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交，且第二引物与包含SEQ ID NO:5或其完整的互补物或由其组成的核酸特异性杂交)、DNA聚合酶和含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的多个游离核苷酸的反应混合物；将反应混合物加热至第一预定温度达第一预定时间以将双链DNA的链彼此分离；在允许第一和第二引物与靶DNA的第一和第二链上的其互补序列杂交并允许DNA聚合酶延伸引物的条件下，将反应物冷却至第二预定温度达第二预定时间，并重复上述步骤。在一些实施方案中，引物的至少一种是包含非核酸的可检测标记的引物-探针。在一些实施方案中，引物是如本文所述的引物。在一些实施方案中，DNA是cDNA。

本文公开的方法可额外用于将个体诊断为受肠道病毒或双埃柯病毒感染。

发明详述

本发明针对使用多重复合分析物检测***的用于检测肠道病毒和双埃柯病毒的诊断方法。该方法在PCR前无需提取或纯化步骤来分离病毒(即靶标)核酸。公开的方法可检测未提取的人生物样品中的64种肠道病毒血清型和双埃柯病毒血清型1-8。

更具体地，将本公开的样品到应答(sample-to-answer)测定设计为中度复杂的多重复合分析物检测***，其中初始是样品制备，随后是逆转录和实时聚合酶链式反应(PCR)检测及对靶肠道病毒和双埃柯病毒分析物的区分。在一些实施方案中，在离心微流体盘(centrifugal microfluidic disc)如可消耗Universal或Direct扩增盘(FocusDiagnostics(Cypress,CA,USA)和3M公司(St.Paul,MN,USA))中实施逆转录及实时PCR两者。在该实施方案中，直接将生物样品装载入样品至应答盘，而无需单独的前端样品制备。定性检测及肠道病毒和双埃柯病毒的区分随后利用引物-探针如

化学引物和实时PCR来在循环***如3M Integrated Cycler***上扩增和检测靶分析物。在一些实施方案中，将靶病毒基因组RNA逆转录和特异性扩增且通过荧光标记的探针在相同的反应孔中同时检测。每种病原体的存在通过不同的相应荧光信号确定。在一些实施方案中，样品中的RNA在第一反应中逆转录(其可以或可不在消耗盘中实施)，且实时PCR在单独的测定中实施。

专用于内部对照的扩增和检测的引物、探针和/或引物-探针可包括在相同的反应混合剂中以监测潜在的PCR抑制。靶标和RNA内部对照的扩增和检测所需试剂可配制为一体化的反应混合剂，其作为单反应等份提供。

除非另外表明，如本文使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指代。因此，例如，“寡核苷酸”的指代包括复数个寡核苷酸分子，且“核酸”的指代指一个或多个核酸。

如本文使用的“约”意为加或减10％。

与靶基因“在严格条件下特异性杂交”的引物对无需与完整的基因杂交。因此，引物对可扩增经扩增的完整基因或仅扩增基因的区段，取决于基因与引物特异性杂交的部分。

如本文使用的术语“扩增”或“进行扩增”包括用于拷贝靶核酸由此增加所选核酸序列拷贝数的方法。扩增可以是指数或线性的。靶核酸可以是DNA(如例如基因组DNA和cDNA)或RNA。以该方式扩增的序列形成“扩增子”。尽管下文所述的示例性方法涉及使用聚合酶链式反应(PCR)扩增，但用于扩增核酸的多种其他方法为本领域已知的(例如等温方法、滚环方法等)。本领域的技术人员将理解这些其他的方法可代替PCR方法使用或与其一起使用。参见，例如Saiki,“Amplification of Genomic DNA”in PCR Protocols,Innis etal.,Eds.,Academic Press,San Diego,CA 1990,pp 13-20；Wharam,et al.,NucleicAcids Res.2001Jun 1；29(11):E54-E54；Hafner,et al.,Biotechniques 2001Apr；30(4):852-860。

如本文指代多核苷酸所使用的术语“互补”、“互补”或“互补性”(即核苷酸序列如寡核苷酸或靶核酸)指标准的Watson/Crick配对规则。核酸序列的互补如一个序列的5′末端与另一个的3′末端配对，为“反向平行缔合”。例如，序列“5′-A-G-T-3′”与序列“3′-T-C-A-5′”互补。一些在天然核酸中不常见的碱基可包括在本文所述的核酸内；这些包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性不需要是完美的；稳定的双链可包含错配碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可考虑多种变量凭经验确定双链稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列、离子强度和错配碱基对的发生率。互补物序列还可以是与DNA序列互补的RNA序列或其互补物序列，且还可以是cDNA。如本文使用的术语“基本上互补”意为两序列特异性杂交(下文定义)。本领域的技术人员将理解的是基本上互补的序列无需沿其整个长度杂交。为“完整的互补物”或与参照序列“完全互补”的核酸由与参照序列沿为完整互补物的核酸的全长100％互补(在Watson/Crick配对规则下)的核苷酸序列组成。完整互补物不含与参照序列的错配。

如本文使用的，在检测来自可检测标记的信号以表明样品中靶核酸的存在的上下文中使用的术语“检测”不需要提供100％敏感性和/或100％特异性的方法。如已知的，鉴于患者具有靶核酸，“敏感性”是测试为阳性的可能性，而鉴于患者不具有靶核酸，“特异性”是测试为阴性的可能性。优选至少50％的敏感性，尽管至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的敏感性显然是更优选的。至少50％的特异性是优选的，尽管至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的特异性显然是更优选的。检测还涵盖具有假阳性和假阴性的测定。假阴性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假阳性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。

核酸的上下文中的“片段”指核苷酸残基序列，其为至少约5个核苷酸、至少约7个核苷酸、至少约9个核苷酸、至少约11个核苷酸或至少约17个核苷酸。片段通常少于约300个核苷酸，少于约100个核苷酸、少于约75个核苷酸、少于约50个核苷酸或少于约30个核苷酸。在一些实施方案中，片段可用于聚合酶链式反应(PCR)、多种杂交方法或微阵列方法中以鉴别或扩增RNA或DNA分子的相同或相关部分。片段或区段可唯一地鉴别本发明的每个多核苷酸序列。

如本文使用的，“试剂盒”指用于特定目的包装的组分集合。可包装试剂盒的材料的非限制性实例包括盒、袋、信封和管，但试剂盒组分可以其他类型的包装材料供应至消费者。在一些实施方案中，包括在试剂盒中的引物和/或探针为分离的多核苷酸且可在试剂盒内的管、小瓶或其他类型的容器中供应。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于使用试剂盒组分的说明书。说明书可印刷在试剂盒内的材料上或以电子形式提供。在一些实施方案中，印刷的说明书描述如何使用包含在试剂盒内的试剂以检测样品中肠道病毒和/或双埃柯病毒的存在或不存在。

如本文使用的术语“多重复合PCR”指同一反应容器内两种或多种产物的同时扩增。每种产物使用不同的引物对引发。多重复合反应可进一步包括针对以可检测部分标记的每个产物的特异性探针。在一些实施方案中，多重复合PCR反应采用引物对，其中一个引物是引物-探针如例如

引物。

如本文使用的术语“寡核苷酸”指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合组成的短多聚物。寡核苷酸长度一般至少为约10、11、12、13、14、15、20、25、40或50至多至约100、110、150或200个核苷酸，更优选地约10、11、12、13、14或15至多至约70或85nt，且最优选地，长度为约18至多至约26nt。核苷酸的单字母密码如美国专利局审查指南，第2422节，表1所述。在该方面，核苷酸名称“R”意为嘌呤如鸟嘌呤或腺嘌呤，“Y”意为嘧啶如胞嘧啶或胸腺嘧啶(如果是RNA的话为尿嘧啶)；且“M”意为腺嘌呤或胞嘧啶。寡核苷酸可用作引物或作为探针。

如本文使用的，用于扩增的“引物”包括引物元件，其中引物元件是与靶核苷酸序列互补且杂交的寡核苷酸且在DNA或RNA聚合酶的存在下导致核苷酸添加至引物的3′末端。在一些实施方案中，引物由引物元件构成。然而，如本文使用的引物可包含除引物元件外的其他元件。例如，引物可包含引物元件和可检测的标记如荧光团。此外，引物除引物元件之外还可包含探针元件。如本文使用的，整个分子称为引物。引物-探针是示例性的引物。为了最佳表达和扩增，引物中引物元件的3′核苷酸应一般与靶核酸序列在对应的核苷酸位置相同。如本文使用的术语“引物”包括可合成的全部形式的引物，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物等。如本文使用，“正向引物”具有与dsDNA的反义链互补的引物元件。“反向引物”具有与dsDNA的正义链互补的引物元件。“外源性引物”特指添加至包含待扩增的样品和/或靶核酸的反应容器的引物(即并非从反应容器中的扩增产生)。

引物中的引物元件长度通常为至少10、12、15、18或30个核苷酸直至长度约25、50、60、100、110、125或200个核苷酸，优选长度至少15直至约60个核苷酸，且最优选长度至少25直至约40个核苷酸。在一些实施方案中，引物、引物元件或探针长度为15至35个核苷酸。没有针对最佳杂交或聚合酶链式反应扩增的标准长度。对于具体引物应用的最佳长度可以H.Erlich,PCR Technology,Principles and Application for DNA Amplification,(1989)描述的方式容易地确定。引物元件可与另一组件直接或间接连接，例如所述另一组件为探针元件和/或荧光团。间接连接意为两组分通过一个或多个位于两个间接连接的组分间的其他组分连接。当其未使用中间组分直接彼此连接时，两组分直接连接。

“引物对”是针对靶核酸序列的不同区的具有引物元件的一对引物。引物对包含正向引物和反向引物，其各具有在严格条件下与双链靶核酸序列的不同链杂交的引物元件。正向引物元件与dsDNA的反义链互补且反向引物元件与正义链互补。引物对的一个引物可以是引物-探针(即包含通过聚合酶阻断基团与探针元件共价连接的PCR引物元件的双功能分子，此外，所述双功能分子可包含与淬灭剂相互作用的荧光团)。

如本文使用的“探针”是与靶核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸且与引物元件分开。探针序列不像引物元件般延伸且如本文使用的探针与“探针元件”不同，其不包含引物序列元件。然而，探针可包含额外的非杂交元件，如例如额外的核苷酸或荧光团。

探针是示例性的探针。

探针在探针的任一末端包含供体和淬灭剂荧光团且彼此足够接近从而供体的荧光团由淬灭剂占据。然而，当探针与扩增的区段杂交时，Taq聚合酶的5′至3′核酸外切酶活性裂解探针由此允许供体荧光团发射可检测的荧光。

如本文使用的“

PCR监测***”指用于实时PCR的方法。在该方法中，与扩增的核酸区段杂交的

探针包括在扩增主混合剂中。

如本文使用的“探针元件”或“探针序列元件”指引物-探针的探针部分且为与引物序列缔合的核苷酸的拉伸，在所述拉伸中所述探针与引物核酸序列连接或邻接，且在严格条件下与待检测的靶核酸序列特异性杂交。在一些实施方案中，探针序列在严格条件下与其意欲杂交的靶序列完全互补。在一些实施方案中。探针元件长度是10、15、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碱基。在一些实施方案中，探针元件进一步包含自身互补的茎序列。

如本文使用的术语“引物-探针”是双功能分子，如例如

引物，其包含在其5′末端通过聚合酶阻断基团与探针元件共价连接的PCR引物元件。探针元件包含探针靶序列(其特异性地与扩增的产物结合)-侧翼为自身互补的茎序列且能够与荧光团在一个末端形成发夹结构并与淬灭剂在另一个末端形成发夹结构。有时，荧光团与淬灭剂相互作用以减少背景荧光。引物-探针的引物序列部分在5′末端修饰从而在发夹环的起始包含PCR阻断剂(通常HEG单体作为阻断剂添加)。

在初始的PCR循环中，引物-探针的引物部分与靶杂交并且由于聚合酶的作用而发生延伸。在PCR过程中，通过包含六乙二醇(HEG)或等同物质而阻断聚合酶延伸入探针尾。在扩增的第一轮中，3′靶特异性引物与靶核酸退火并延伸，进而引物-探针现并入新合成的链，其具有新合成的用于5′探针的靶区。在下一轮变性和退火中，引物-探针发夹环的探针区与靶杂交，因此分离荧光团和淬灭剂并生成可测量的信号。该引物-探针描述于Whitcombe et al.,Nature Biotech 17:804-807(1999)，其在本文以其整体通过提述并入。

如本文使用的，“引物-探针检测***”指用于实时PCR的***，其采用这样的引物，所述引物其中引物对的至少一种引物为引物-探针，如例如

引物。

特异性针对靶核酸的寡核苷酸(例如探针或引物)在严格条件下将与靶核酸“杂交”。如本文使用，“杂交”或“进行杂交”指寡核苷酸单链与互补链通过碱基配对在限定的杂交条件下通过其进行退火的过程。

“特异性杂交”是两种核酸序列具有高度互补性的现象。特异性杂交复合物在宽松的退火条件下形成且在任何后续的洗涤步骤后仍保持。用于核酸序列退火的宽松条件常规上可由本领域的技术人员确定且可例如在65℃约6×SSC存在下发生。杂交的严格性可部分参照实施洗涤步骤的温度来表示。在限定的离子强度和pH，通常将该温度选择为低于特定序列的热熔点(Tm)约5℃至20℃。Tm是50％的靶核酸从完美匹配的探针解离的温度(在限定的离子强度和pH)。计算Tm的等式和用于核酸杂交的条件为本领域已知。特异性杂交优选在严格条件下发生，其为本领域已知。严格杂交条件为在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃的杂交，且在0.1×SSC中于60℃洗涤。杂交步骤为本领域已知且描述于例如Ausubel etal,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,1994。

如本文使用的，如果当寡核苷酸与核酸比对时寡核苷酸与核酸具有至少50％的序列同一性，则寡核苷酸对核酸是“特异性的”。对于核酸为特异性的寡核苷酸是在适当的杂交或洗涤条件下，能够与感兴趣的靶标杂交且基本上不与不感兴趣的核酸杂交的寡核苷酸。较高水平的序列同一性是优选的且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和更优选至少98％的序列同一性。序列同一性可使用商业可获得的计算机程序以采用本领域已知的算法的默认设定来确定。如本文使用的，具有“高序列同一性”的序列在比对的核苷酸位置的至少约50％具有相同的核苷酸，优选在比对的核苷酸位置的至少约60％、且更优选在比对的核苷酸位置的至少约75％具有相同的核苷酸。

对于特异性扩增(即扩增特定的靶核酸)或特异性检测(即检测特定的靶核酸序列)用作引物或探针的寡核苷酸一般能够特异性地与靶核酸在严格条件下杂交。

如本文使用，术语“样品”或“测试样品”可包含生物样品、分离的核酸或分离的微生物。在一些实施方案中，样品从生物来源(即“生物样品”)获得，如收集自受试者的组织、体液或微生物。样品来源包括但不限于痰(处理或未处理的)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管洗液(BW)血液、体液、脑脊液(CSF)、尿、血浆、血清或组织(例如活检材料)。优选的样品来源包括鼻喉拭子、伤口拭子和鼻洗液和CSF。如本文使用的术语“患者样品”指获得自寻求疾病的诊断和/或治疗的人的样品。在一些实施方案中，样品包含分离的核酸。在一些实施方案中，样品包含核酸并未提取的粗制生物样品。在一些实施方案中，样品可以是经受逆转录进而其包含cDNA的生物样品。

试剂混合物包含样品、引物和PCR和/或逆转录(RT)所需的试剂。

“扩增主混合”或“RT扩增主混合”包含用于PCR扩增和/或逆转录的全部试剂(包括引物)，但不包含待扩增的样品或靶核酸。

如本文使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”指包括待扩增和检测的感兴趣的核苷酸区段的序列。在扩增反应过程中生成的靶序列的拷贝称为扩增产物，扩增物或扩增子。靶核酸可由下述构成：染色体的区段、具有或不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分或探针或引物针对其进行设计的核酸序列。靶核酸可包括野生型序列、突变、缺失或复制、串联重复区、感兴趣的基因、感兴趣的基因的区或其任何上游或下游区如5′非翻译区(UTR)。靶核酸可代表替代序列或特定基因的等位基因。靶核酸可源自基因组DNA、cDNA或基因组RNA。如本文使用的靶核酸可以是DNA(如基因组DNA或cDNA)或RNA。在一些实施方案中，靶序列是病毒RNA序列和/或其cDNA等价物。在一些实施方案中，靶核酸是肠道病毒序列或双埃柯病毒序列。

如本文使用的“阳性对照核酸”或“内部对照”是已知在样品中以一定的量或水平存在的核酸。在一些实施方案中，阳性对照核酸并非天然存在于样品中且在将反应样品混合物经受本发明的用于确定肠道病毒和/或双埃柯病毒的存在或不存在的方法中的实时聚合酶链式反应前添加至样品。如本文使用的，分析物的“循环阈值”(Ct)是在其中荧光信号穿过特定的荧光阈值的PCR循环。Ct取决于扩增反应效率，其包括初始模板拷贝数、生物裂解物、PCR扩增、杂交或荧光探针的裂解及检测的敏感性。

如本文使用的“茎序列”是自身互补的核苷酸序列对，其在杂交核苷酸序列的探针或探针元件的侧翼。每个茎序列长度为4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，茎序列长度为6-7个核苷酸。探针元件侧翼的茎序列允许探针元件形成发夹环。

生物样品和样品制备

可使用公开的方法在其中检测肠道病毒和双埃柯病毒的样品可来自无菌和/或非无菌的地方。样品可以是生物样品，包括体液如全血、血浆、血清、无细胞血浆、尿、脑脊液(CSF)、滑膜液、胸膜液、心包液、眼内液和痰。典型的样品为血清、血浆、运输介质中的咽喉或直肠拭子、粪便和CSF。其他适当的生物样品包括组织活检物、粪便样品、气管内抽吸物、咽喉和直肠拭子样品、鼻咽样品(鼻拭子)。如本文使用的，“无细胞血浆”表明包含按体积少于1％细胞的血浆。

在一些实施方案中，生物样品疑似包含肠道病毒和/或双埃柯病毒核酸和/或其可获得自疑似受肠道病毒和/或双埃柯病毒感染的个体。在一些实施方案中，样品是这样的生物样品，其经受逆转录进而在所述生物样品中初始存在的RNA(如果存在的话包括肠道病毒和/或双埃柯病毒RNA)逆转录为cDNA的。在该实施方案中，样品包含靶cDNA。在一些实施方案中，cDNA在RT-PCR或其他检测测定前未从样品提取。

尽管公开的方法优选采用未处理的生物样品从而获得直接、流线型样品至应答的方法，但如果在根据任何本领域的技术人员已知的方法从生物样品纯化所分离的核酸(DNA和/或RNA)上使用，本文公开的检测方法也是有效的。如果合意的话，可通过离心等收集并浓缩样品。或者，生物样品可使用商业上可获得的核酸提取试剂盒处理。

逆转录和实时PCR

在本发明的方法中，肠道病毒和/或双埃柯病毒靶RNA在样品中的存在通过逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)测试。当共同使用时，逆转录和聚合酶链式反应可在两步中顺序实施，或在将全部RT和PCR反应组合物试剂添加至样品而在一步中共同实施。

在两步法中，逆转录反应组合物中样品的温育允许合成来自靶RNA的DNA拷贝。RT试剂混合剂包括与靶RNA杂交的引物以引导拷贝DNA的合成。此外，RT试剂混合剂包括dNTP、MgC1₂、KCl、逆转录酶和逆转录酶缓冲液。如果预期制备来自多于一种靶RNA的DNA拷贝，则可包括多于一种引物。然而通常不使用RNA酶抑制剂。逆转录反应的产品任选可随后转移至另一测定管，其中PCR根据本领域已知的方案实施。扩增主混合剂通常包括从逆转录模板起始合意的DNA区段的合成的引物对。此外，扩增主混合剂通常包含dNTP、DNA聚合酶如热稳定DNA聚合酶如Taq聚合酶和聚合酶缓冲液。在一些实施方案中，扩增主混合剂进一步包含阳离子表面活性剂。如果预期合成多个靶序列，则包括多于一对的引物。此外，在一些实施方案中，可添加单一新引物，其将使用最初的RT引物作为引物对的第二引物扩增DNA区段。可用于病毒样品的其他逆转录酶包括但不限于HIV逆转录酶(Ambion)、转录因子逆转录酶(Roche)、Thermoscript逆转录酶(Invitrogen)。其他可使用的DNA聚合酶包括但不限于Pfu、Vent和Sequitherm DNA聚合酶(EPICENTRE)。

在本发明方法的一些实施方案中，生物样品与包含DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、盐、脱氧核苷酸、内部对照和探针及用于靶标和内部对照的引物的RT扩增主混合剂组合，进而RT和PCR可在单个测定中实施。在一些实施方案中，将生物样品加热以分离样品中存在的RNA二级结构，且将加热的样品与RT扩增主混合剂接触以形成反应混合物。在一些实施方案中，将生物样品与RT扩增主混合剂接触以形成反应混合物，且随后将包含生物样品的反应混合物加热以分离样品中存在的RNA二级结构。

无论RT-PCR作为两步或一步实施，RT步骤首先运行且通常由单温度温育构成。在一些实施方案中，单温度为约42℃至约60℃。不同的温度适于不同的RT酶和不同的引物，如本领域的技术人员已知的，且温度应足以允许RNA逆转录为cDNA。后续的PCR反应通常由初始温育构成，所述初始温度处于足以变性cDNA且还活化热激活的Taq聚合酶的预定温度。其后为cDNA靶标扩增的多重循环。在一些实施方案中，加热和冷却循环重复至少12、13、14、15、18、19、20、21、22或23次直至15、20、25、20、25、30、35、40或更多次。在一些实施方案中，在每个循环过程中实施三个操作：靶变性、引物退火和引物延伸。在一些实施方案中，靶变性在高于约90℃发生。引物退火温度由在反应中使用的特定引物的熔解温度决定且引物延伸可在约56℃至约72℃的温度范围实施。当引物退火和延伸在相同的温度实施时，这与三温度PCR相比是一种两温度PCR，所述三温度PCR中三步的每个步骤在不同温度发生。扩增阶段完成后，通常添加最终延伸时间以确保全部扩增产物的合成。

PCR优选是多重复合PCR反应。反应混合物可包含针对肠道病毒的引物对和针对双埃柯病毒的引物对。内部对照(IC)还可利用寡核苷酸引物、探针和/或引物-探针包括在样品中。

在一些实施方案中，PCR和/或RT-PCR在离心微流体盘中实施。如本文使用，“离心微流体盘”是在热循环仪内在其轴上旋转的圆盘且包含可贮存生物样品的小室。示例性的离心微流体盘是来自Focus Diagnostics的Direct Amplification Discs(8孔)和Universal Disc(96孔)，其与3M^TM销售的3M^TMIntegrated Cycler热循环仪组合利用。3M^TMIntegrated Cycler可接受Universal或Direct Amplification Disc且能够实施每盘多重测定。在一些实施方案中，生物样品贮存在基因转子盘中。如本文使用的，“基因转子盘”是保持能够安置样品和/或样品扩增混合物的管或其他小室的离心机转子插件。基因转子盘的实例是Qiagen Rotor Discs和/或Gene Discs，其与Qiagen Rotor-Gene Q热循环仪共同使用。

靶核酸和引物

依据本发明，寡核苷酸引物和/或探针在本文所述的方法中使用以扩增和检测靶肠道病毒和/或双埃柯病毒核酸，如肠道病毒和/或双埃柯病毒特异性标记物基因的全部或部分。在一个实施方案中，方法涉及采用针对肠道病毒基因组的5′非翻译区(UTR)的引物对和针对双埃柯病毒基因组的5′UTR(包括这些区的任一或两者的片段)的引物对。肠道病毒引物对能够检测和/或与肠道病毒的至少64种血清型的5′UTR杂交。双埃柯病毒引物对能够检测和/或与双埃柯病毒的至少8种血清型的5′UTR杂交。在一些实施方案中，肠道病毒引物特异性地与阐述于GenBank登录号KC436272中的肠道病毒基因组的5′UTR的核苷酸452-599内的序列(或其互补物)杂交。在一些实施方案中，双埃柯病毒引物特异性地与阐述于GenBank登录号AJ005695中的双埃柯病毒基因组的5′UTR的位置535-599内的序列(或其互补物)杂交。

此外，还可使用引物以扩增一个或多个对照核酸序列。

本文所述的靶核酸可单独或以多重复合的形式检测，其使用针对每个靶标的单独标记来进行。在一个具体实施方案中，多重复合反应包含荧光标记的引物-探针如在特异性针对肠道病毒基因组的5′UTR的引物对中使用的

引物-探针和另一种荧光标记的引物-探针如在特异性针对双埃柯病毒基因组的5′UTR的引物对中使用的

引物-探针。在一些实施方案中，肠道病毒引物对的荧光标记不同于双埃柯病毒引物对。

在一些实施方案中，提供的引物混合基在一个或多个核苷酸位置具有简并性。简并引物在其中靶核酸序列中存在可变性的PCR中使用，即序列信息是多态性的。通常，简并引物将在引物内不多于约4、不多于约3、优选不多于约2和最优选不多于约1个核苷酸位置呈现可变性。

因此，在一些实施方案中，扩增反应中每个引物对的至少一个引物包含可检测的部分。可检测的部分可在与引物共价连接的探针上，如在引物-探针上。探针可通过本领域已知的方法可检测地标记。有效的标记包括例如荧光团(例如

FITC、罗丹明、黄原酸盐荧光体、Texas红、羧基荧光素荧光团如亚酰胺荧光素(FAM)、JOE^TM、呫吨染料如在可见光谱的红色区中发荧光且可通过淬灭剂如暗黑Hole Quencher^TM(BHQ^TM)有效淬灭的CalFluor Red

(“CFR610”)、I-BHQ2染料、Quasar

³²P、³⁵S、³H、¹⁴C、¹²⁵I、¹³¹I、电子密度试剂(例如金)、酶例如ELISA中通常使用的(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记(例如，胶体金)、磁性标记(例如Dynabeads^TM)、生物素、地高辛或半抗原和针对其已有抗血清或单克隆抗体的蛋白。荧光团具有从光吸收能量、内部转移该能量并作为特征波长的光发射该能量的能力。从光吸收能量(光子)后，荧光团将从其基态升至激发单重态的更高振动水平。在下一阶段中，一些能量作为热失去，使荧光团返回激发单重态的最低振动水平。激发单重态的最低振动水平相对稳定且具有更长的寿命。从该激发单重态，荧光团可返回其基态，通过光的发射(光子)或通过非辐射能量跃迁。从激发单重态发射的光称为荧光。其他标记包括能够与对应的受体或寡核苷酸互补物分别形成复合物的配体或寡核苷酸。该标记可直接并入待检测的核酸，或其可附接至与待检测的核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)或抗体。

因此，扩增后和/或扩增过程中，如果存在的话，可由使用不同的可检测部分如通过大小和/或颜色识别肠道病毒和/或双埃柯病毒靶区段扩增子。尽管将靶标称为“肠道病毒靶区段扩增子”或“双埃柯病毒靶区段扩增子”，应注意的是扩增子实际上从病毒基因组RNA序列的cDNA等价物生成(进而靶扩增子与病毒RNA靶序列由于存在胸腺嘧啶而不是尿嘧啶而不同)。可检测的部分可以是荧光染料。在一些实施方案中，不同的引物对以不同的可区分的可检测部分进行标记。因此例如，CFR610和FAM荧光染料可在多重复合PCR中的不同引物上存在且与获得的不同扩增子序列结合。在其他实施方案中，正向引物以一个可检测的部分标记，而反向引物以不同的可检测部分标记，例如FAM染料用于正向引物而HEX染料用于反向引物。不同可检测部分的使用对于相同长度或在长度上非常相似的扩增产物间进行区分是有用的。

在一些实施方案中，将采用的引物的探针部分可检测地标记且通过检测每个扩增产物的标记来实现检测。淬灭剂可进一步与可检测标记缔合，其阻止探针元件的靶扩增前对标记的检测。SCORPION^TM引物包含这种探针元件。

在一些实施方案中，每个引物对的至少一个引物是引物-探针。在这些实施方案中，引物-探针进一步包含与淬灭剂缔合的荧光团以减少背景荧光。使用这种荧光团标记的引物-探针进行PCR延伸后，合成的靶区附接至与探针相同的链。变性时，引物-探针的探针部分与新生成的PCR产物的一部分杂交，物理上将荧光团从淬灭剂分开，由此产生可检测的信号。因此，在一些实施方案中，每个引物对的一个引物可以是引物-探针，其在引物的5′末端包含探针序列元件，其中探针元件进一步包含荧光团和淬灭剂。

本发明的发明人发现了肠道病毒基因组的5′UTR的特定区(即5′UTR的核苷酸452-599)的检测允许肠道病毒的64种血清型的任一种的检测且可将包含肠道病毒的样品与包含其他非肠道病毒的病毒种或菌株的样品进行区分。此外，本发明的发明人发现了双埃柯病毒基因组的5′UTR的特定区(即5′UTR的核苷酸535-599)的检测允许双埃柯病毒的8种血清型的任一种的检测且将包含双埃柯病毒的样品与包含其他非双埃柯病毒的病毒种或菌株的那些进行区分。

肠道病毒检测

用于检测和/或扩增肠道病毒的引物对的引物具有与肠道病毒基因组的5′UTR的核苷酸452-599内的区杂交的引物元件。在一些实施方案中，引物对包含具有与核酸特异性杂交的引物元件的引物，所述核酸包含序列5′-AATTGTCACCATAAGCAGCCA-3′(SEQ ID NO:1)或其完整互补物，或由序列5′-AATTGTCACCATAAGCAGCCA-3′(SEQ ID NO:1)或其完整互补物组成。在一些实施方案中，引物对的一个引物包含引物元件序列或由引物元件序列组成，所述引物元件序列与SEQ ID NO:1至少90％相同或与SEQ ID NO:1的完整互补物至少90％相同且在严格条件下与SEQ ID NO:1或其完整互补物特异性杂交。在一些实施方案中，引物元件长度为至少16、17、18、19个核苷酸和/或至多18、19、20、22、25、30、40或50个核苷酸且与SEQ ID NO:1至少84、85、86或90％相同。引物元件可包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的完整互补物的至少16、17、18、19、20或21个连续核苷酸或由其组成，并与包含SEQ ID NO:1或其完整互补物或由其组成的核酸在严格条件下杂交。

在一些实施方案中，用于检测和/或扩增肠道病毒的引物对包含具有引物元件的引物，所述引物元件与包含序列5′-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3′(SEQ ID NO:2)或其完整互补物或由其组成的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，引物元件包含与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2的完整互补物至少90％相同且在严格条件下与包含SEQ ID NO:2或其完整互补物或由其组成的核酸特异性杂交的序列。在一些实施方案中，引物元件长度为至少16、17、18、19个核苷酸和/或多至18、19、20、22、25、30、40或50个核苷酸且与SEQ IDNO:2至少84、85、86或90％相同。引物元件可包含SEQ ID NO:2的至少16、17、18、19、20或21个核苷酸或SEQ ID NO:2的完整互补物或由其组成，并与包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的完整互补物或由其组成的核酸在严格条件下杂交。

在一些实施方案中，用于检测和/或扩增肠道病毒核酸的引物是引物-探针。引物-探针可包含上文讨论的引物元件，和包含与SEQ ID NO:3至少90％相同或与SEQ ID NO:3的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列的探针元件。在一些实施方案中，探针元件包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:3的互补物的至少19、20、21、22、23或24个连续的核苷酸。探针元件与对应的SEQ ID NO:3的区或SEQ ID NO:3的互补物在严格杂交条件下特异性杂交。

在一个具体实施方案中，肠道病毒引物对包含两种上述肠道病毒引物(即具有与包含SEQ ID NO:1或其互补物(或由SEQ ID NO:1或其互补物组成)的核酸特异性杂交的引物元件的引物和有与包含SEQ ID NO:2或其互补物(或由SEQ ID NO:2或其互补物组成)的核酸特异性杂交的引物元件的引物)。

在另一个具体实施方案中，肠道病毒引物对的一个引物包含SEQ IDNO:1或由其组成且肠道病毒引物对的另一个引物是引物-探针，所述引物-探针包含或由下述组成(从5′至3′方向)：与核苷酸序列连接的淬灭剂部分，所述核苷酸序列由第一茎序列(其后为ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGT(SEQ ID NO:3))和与第一茎序列互补的第二茎序列组成，在其3′末端与荧光团和核苷酸间隔基连接，所述核苷酸间隔基为10、14、15、16、17、18、19、20、21或25个原子的基于聚乙二醇的接头，随后为SEQ ID NO:2。

一个具体的肠道病毒引物对由下述组成：

肠道病毒引物1:5′d AATTGTCACCATAAGCAGCCA 3′(SEQ ID NO:1)肠道病毒引物2(引物-探针)：5′d BHQ-1-agcgcACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTgcgct-FAM-间隔基18-CCCCTGAATGCGGCTAATC 3′

其中“BHQ-1”是黑洞淬灭剂部分(black hole quencher moiety)，下划线序列是自身互补的茎序列，“FAM”是亚酰胺荧光素，且“间隔基18”是包含18原子六乙二醇接头的间隔基。

双埃柯病毒检测

用于检测和/或扩增双埃柯病毒的引物对的引物包含与双埃柯病毒基因组的5′UTR的核苷酸535-599内的区杂交的引物元件。在一些实施方案中，引物对的一个引物包含引物元件序列或由引物元件序列组成，所述引物元件序列与5′GTTGTAAGGCCCACGAA 3′(SEQID NO:4)至少90％相同或与SEQID NO:4的完整互补物至少90％相同且在严格条件下与SEQID NO:4或其完整互补物特异性杂交。在一些实施方案中，引物元件长度为至少16、17、18、19个碱基和/或多至18、19、20、22、25、30、40或50个碱基且与SEQ ID NO:4至少84、85、86或90％相同。引物元件可包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的完整互补物的至少16、17、18、19、20或21个连续的核苷酸或由其组成，且与SEQ ID NO:4或其完整互补物在严格条件下杂交。

在一些实施方案中，用于检测和/或扩增双埃柯病毒的引物对包含具有引物元件的引物，所述引物元件与包含序列5′-TCAGATCCATAGTGTCICTTGTTA-3′(SEQ ID NO:5)或其完整互补物或由其组成的核酸特异性杂交。在一些实施方案中，引物元件包含与SEQ IDNO:5至少90％相同或与SEQ ID NO:5的完整互补物至少90％相同并在严格条件下与SEQ IDNO:5或其完整互补物特异性杂交的序列。在一些实施方案中，引物元件长度为至少16、17、18、19个核苷酸和/或至多18、19、20、22、25、30、40或50个核苷酸且与SEQ ID NO:5至少84、85、86或90％相同。引物元件可包含SEQ ID NO:5的至少16、17、18、19、20或21个核苷酸或SEQ ID NO:5的完整互补物或由其组成，并与SEQ ID NO:5或或其完整互补物在严格条件下杂交。

在一些实施方案中，用于检测和/或扩增双埃柯病毒核酸的引物是引物-探针。引物-探针可包含引物元件序列(上文讨论的)和探针元件，所述探针元件包含与5′-ATGCCCAGAAGGTACCCG-3′(SEQ ID NO:6)至少90％相同的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的完整互补物至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，探针元件包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的互补物的19、20、21、22、23或24个连续核苷酸。探针元件与SEQ ID NO:6的互补物的SEQ ID NO:6的对应区在严格条件下特异性杂交。

在一个具体实施方案中，双埃柯病毒引物对包含两种上述双埃柯病毒引物(即，具有与包含SEQ ID NO:4或其互补物或由其组成的核酸特异性杂交的引物元件的引物和具有与包含SEQ ID NO:5或其互补物或由其组成的核酸特异性杂交的引物元件的引物)。

在另一个具体实施方案中，双埃柯病毒引物对的一个引物包含SEQ ID NO:4或由其组成且双埃柯病毒引物对的另一个引物是引物-探针，所述引物-探针包含或由下述组成(从5′至3′方向)：连接至核苷酸序列的荧光团，所述核苷酸序列由第一茎序列(随后为SEQID NO:5)和与第一茎序列互补的第二茎序列组成，在其3′末端与淬灭剂和间隔基连接，所述间隔基为10、14、15、16、17、18、19、20、21或25个原子的聚乙二醇接头，随后为SEQ ID NO:6。

特异性的双埃柯病毒引物对由下述组成：

双埃柯病毒引物1:5′d GTTGTAAGGCCCACGAA 3′(SEQ ID NO:4)双埃柯病毒引物2(引物-探针)：5′d CFR610-

ATGCCCAGAAGGTACC

-BHQ-2-间隔基18-TCAGATCCATAGTGTCICTTGTTA 3′

其中“CFR610”是呫吨染料Cal Fluor Red

框内序列为自身互补的茎序列，“BHQ-2”是黑洞淬灭剂且“间隔基18”是包含18个原子的六乙二醇接头的间隔基。

本发明的发明人发现了上述引物对在人生物样品中的多重复合的直接扩增反应中令人惊讶地超过其他引物对，且能够检测肠道病毒的64种血清型以及双埃柯病毒血清型1-8。

产物检测

本发明的用于确定肠道病毒和/或双埃柯病毒在样品中存在或不存在的方法涉及(除其他步骤外)确定肠道病毒或双埃柯病毒核苷酸序列在样品中是否扩增。确定步骤可在PCR扩增过程中和/或之后实施。在一些实施方案中，每个引物对的至少一个引物(即针对肠道病毒的引物对和针对双埃柯病毒的引物对)是引物-探针且在PCR扩增的过程中生成荧光信号。检测到肠道病毒序列扩增和/或双埃柯病毒序列扩增的信号，因此表明病毒存在于样品中。

在本发明中优选使用在检测扩增的样品前不需要制备步骤的实时PCR方法。大多实时方法通过监测热循环过程中荧光的变化来检测扩增的产物形成。在一些实施方案中，双埃柯病毒序列扩增对比肠道病毒序列扩增生成不同的荧光信号，因此允许观察者区分两种病毒。

可检测标记的引物-探针可用于实时PCR。对于引物-探针如

引物-探针适当的可检测标记包括荧光团如荧光素生物偶联物和胺反应性羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯(一般称为FAM)。引物-探针还包含淬灭剂。在靶标不存在下，淬灭剂几乎吸收由荧光团发射的荧光。在Scorpion PCR反应过程中，靶标存在下，荧光团和淬灭剂分离，其导致发射的荧光的增加。荧光可以在反应管中检测和测量。适当的淬灭剂包括Black Hole

(

Biosearch Technologies)。暗淬灭剂如DABCYL是不具有天然荧光的染料。BHQ染料是真暗淬灭剂，由于其聚芳族偶氮骨架而不具有天然发射。芳香环上的取代给电子和吸收电子基团产生具有广泛吸收曲线的淬灭剂的完整系列，所述广泛吸收曲线跨越可见波长：BHQ-0(493nm)、BHQ-1(534nm)、BHQ-2(579nm)和BHQ-3(672nm)。这些淬灭剂可与全部通用的受体染料配对以构建有效淬灭的qPCR探针用于多重复合测定。除通过FRET淬灭，BHQ染料也已显示经由基态复合物与报告染料的形成通过静态淬灭有效淬灭荧光。其他具有多种吸收和发射值的荧光团和淬灭剂为本领域已知。

实施例

因此，本发明一般性描述的方法通过参照下述实施例将更容易地理解，其通过例证的方式提供且并非意在限制本发明的方法和试剂盒。

实施例1

测试了临床脑脊液(CSF)样品集合或人工的合成CSF集合，且将结果与实时PCR结果进行了比较以确定Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct测定相比于利用常规核酸提取的实时PCR方法的临床表现。

Simplexa Direct测定：Simplexa Direct试剂盒(Focus Diagnostics,Cypress,CA)包含全部用于板载(on-board)提取和实时PCR的试剂。对于在Direct AmplificationDisc上的每个反应，将未处理的CSF样品直接装载入盘的一个楔形结构的样品孔中而不进行任何样品制备步骤。将扩增反应混合剂移液至楔形结构的反应孔中，其中扩增反应混合剂包含如下文所述的肠道病毒引物1和2和双埃柯病毒引物1和2：

肠道病毒引物1:5′d AATTGTCACCATAAGCAGCCA 3′(SEQ ID NO:1)

肠道病毒引物2(引物-探针):5′d BHQ-1-agcgcACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTgcgct-FAM-间隔基18-CCCCTGAATGCGGCTAATC 3′

双埃柯病毒引物1:5′d GTTGTAAGGCCCACGAA 3′(SEQ ID NO:4)

双埃柯病毒引物2(引物-探针):5′d CFR610-cgcgcgATGCCCAGAAGGTACCCGcgcg-BHQ-2-间隔基18-TCAGATCCATAGTGTCICTTGTTA 3′

反应混合剂进一步包含DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、盐、脱氧核苷酸、内部对照和探针及用于内部对照的引物。楔形结构使用箔密封且随后将Direct AmplificationDisc***3M^TM Integrated循环仪(3M,St.Paul,MN,USA)，并且逆转录和实时PCR在循环仪中开始。PCR循环条件包括下述步骤：i)样品在75℃预热，180秒，1个循环，ii)在50℃逆转录，720秒，1个循环，iii)在97℃聚合酶活化，120秒，1个循环，iv)在97℃变性，10秒及在56℃，10秒和58℃，30秒进行退火/延伸/检测，45个循环。靶DNA(源自肠道病毒和/或双埃柯病毒基因组RNA)被特异性扩增并同时在相同的反应中通过荧光标记的引物-探针加以检测。使用Integrated Cycler Studio软件实施数据收集和分析。

病毒株：在LoD研究中使用下述株：CVA1、CVA17和CVA9，和双埃柯病毒HPEV-1和HPEV-3(ZeptoMetrix,Buffalo,NY)。下述双埃柯病毒株在特异性研究中使用：HPEV1、HPEV2、HPEV3、HPEV4、HPEV5和HPEV6(ZeptoMetrix,Buffalo,NY)。

检测极限(LoD)研究：实施LoD研究以确定测定的分析敏感性。使用合成CSF中检测的4/4重复将每种病毒储存物的推定LoD确定为最低浓度(Golden West Biologicals,Temecula,CA)。

敏感性和特异性研究：使用154个CSF样品的集合对Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct测定的临床表现进行了评估，所述样品集合包括7个双埃柯病毒阳性、74肠道病毒阳性和74双埃柯病毒/肠道病毒阴性，如通过实时PCR测定所报告的。此外，使用了合成CSF中人工的24个双埃柯病毒阳性样品集合。人工集合使用Simplexa LoD的10X、4X、2X和1X浓度的双埃柯病毒血清型1-6的定量病毒贮存物来制备。

交叉反应性研究：交叉反应性使用细菌和病毒的多样化集合评估。生物集合(以其感染可给出与肠道病毒和/或双埃柯病毒感染相似的临床症状)用于确定交叉反应性。在合成CSF中集合由10⁶CFU/mL的细菌或10⁵TCID₅₀/ml的病毒组成。

结果：LoD：使用合成CSF的LoD研究显示Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct检测肠道病毒和双埃柯病毒株处于<1X 10³TCID₅₀/mL。Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct的阳性和阴性一致性相比使用常规提取步骤的实时PCR测定对于肠道病毒为分别95.6％(65/68)和89％(65/73)且对于双埃柯病毒分别为92.6％(25/27)和92.2％(71/77)。

表1-肠道病毒和双埃柯病毒株的检测极限

Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct相对阳性和阴性的一致性列于表2和3。

表2-CSF样品的肠道病毒一致性

表3-CSF样品的双埃柯病毒一致性

交叉反应性：对表4中的病原体并未检测到交叉反应性。

表4-合成CSF中测试的交叉反应性病原体

检测所选肠道病毒类型的能力进一步在后续研究中确认。在后续研究中使用Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct测定检测到的示例性肠道病毒示于表5。

表5-在后续研究中检查到的所选肠道病毒株

结论：Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct能够从未提取的CSF样品直接检测并区分肠道病毒和双埃柯病毒，具有与采用核酸提取的常规PCR测定相当的表现。通过靶向肠道病毒的5′UTR和双埃柯病毒的5′UTR，肠道病毒的64种血清型以及人CSF中的血清型1-6在该快速“样品至应答”测定中被有效地检测到。HPEV7和HPEV8并非是商业可获得用于测试的，但生物信息学(in silico)分析显示可检测到这些血清型。使用能够容纳盘的整合热循环仪，离心微流体盘中的Simplexa肠道病毒和双埃柯病毒Direct测定的表现提供了用于快速检测直接来自人生物样品的肠道病毒和双埃柯病毒的简洁***。

除非另外限定，本文使用的全部的技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。

说明性地描述的本发明可在本文未具体公开的任何元素或多种元素、限制或多种限制不存在下适当地实践。此外，本文采用的术语和表述作为描述而非限制性的术语使用，且不存在使用这些术语或表述排除任何显示和描述的特征或其部分的任何等同表述的意图，而是认为在本发明要求保护的范围内的多种修饰是可能的。

因此，应该理解的是，尽管本发明已通过本发明优选的实施方案和任选的特征具体公开，但是本领域技术人员可以采取其中所公开的本发明的修饰、改进和变化，且这些修饰、改进和变化视为在本发明的范围内。本文提供的材料、方法和实例是优选实施方案的代表，是示例性的，且并不意在限制本发明的范围。

本发明已在本文广泛和一般地描述。落入一般性公开内的每个较窄种类和亚类也形成本发明的部分。其包括使用从属(genus)去除任何主题的限定或反面限制来对本发明的一般性描述，无论排除的材料是否具体记载在本文中。

此外，其中本发明的特征或方面采取马库什组描述时，本领域的技术人员将认可本发明由此还对马库什组的任何单独的成员或成员的亚群而言进行了描述。

本文提及的全部的出版物、专利申请、专利和其他参考文献明确通过提述以其整体并入，其达到与每一篇通过单独提述并入相同的程度。在冲突的情况中，以本发明的说明书(包括定义)为准。

其他实施方案在所附的权利要求书内阐述。

Claims (11)

1.由第一引物和第二引物组成的引物对在制备用于在样品中确定肠道病毒存在或不存在的方法的装置中的用途，所述方法包括：

如果肠道病毒在所述样品中存在，使用所述引物对扩增肠道病毒的核酸，其中所述引物对由以下组成：

(i)第一引物，所述第一引物由SEQ ID NO:1组成，和

(ii)第二引物，所述第二引物由以下组成：5′淬灭染料、侧翼为长度至少4个核苷酸的两个自身互补核苷酸序列的探针序列、荧光团和由SEQ ID NO:2组成的引物序列。

2.权利要求1的用途，其中所述探针序列由SEQ ID NO:3组成。

3.权利要求1的用途，其中侧接所述探针序列的两个自身互补的茎序列中的每个茎序列长度为4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。

4.由第一引物和第二引物组成的引物对在制备用于在样品中确定双埃柯病毒存在或不存在的方法的装置中的用途，所述方法包括：

如果双埃柯病毒在所述样品中存在，使用所述引物对扩增双埃柯病毒的核酸，其中所述引物对由以下组成：

(i)第一引物，所述第一引物由SEQ ID NO:4组成，和

(ii)第二引物，所述第二引物由以下组成：5′淬灭染料、侧翼为长度至少4个核苷酸的两个自身互补核苷酸序列的探针序列、荧光团和由SEQ ID NO:5组成的引物序列。

5.权利要求4的用途，其中所述探针序列由SEQ ID NO:6组成。

6.权利要求5的用途，其中侧接所述探针序列的两个自身互补的茎序列中的每个茎序列长度为4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。

7.权利要求1至6中任一项的用途，其中所述样品是选自下组的生物样品：脑脊液、血液、粪便、喉拭子、直肠拭子、鼻喉拭子、血浆、血清和尿液。

8.权利要求7的用途，其中核酸不是提取自所述生物样品的。

9.一种试剂盒，其包含：

(a)由SEQ ID NO:1组成的第一引物对的第一引物和第一引物对的第二引物，所述第二引物由以下组成：5′淬灭染料、侧翼为长度至少4个核苷酸的两个自身互补核苷酸序列的第一探针序列、荧光团和由SEQ ID NO:2组成的引物序列；和/或

(b)由SEQ ID NO:4组成的第二引物对的第一引物，和第二引物对的第二引物，所述第二引物由以下组成：5′淬灭染料、侧翼为长度至少4个核苷酸的两个自身互补核苷酸序列的第二探针序列、荧光团和由SEQ ID NO:5组成的引物序列。

10.权利要求9的试剂盒，其中所述第一探针序列由SEQ ID NO:3组成和/或所述第二探针序列由SEQ ID NO:6组成。

11.权利要求9的试剂盒，其中侧接所述第一探针序列的两个自身互补的茎序列中的每个茎序列长度为4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，和/或侧接所述第二探针序列的两个自身互补的茎序列中的每个茎序列长度为4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。