CN113249524A

CN113249524A - 一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量pcr引物和探针组合物及其应用

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Publication number: CN113249524A
Application number: CN202110710297.0A
Authority: CN
Inventors: 王晓虎; 高小鹏; 向华; 罗胜军; 陈晶; 黄元
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明属于兽医动物病原检测技术领域，具体涉及一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物及其应用，本发明的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物包括PCV2‑F、PCV2‑R、PCV2‑P、PCV3‑F、PCV3‑R、PCV3‑P、PCV4‑F、PCV4‑R、PCV4‑P，根据上述引物和探针组合物建立的用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒能够准确、特异、敏感的同时检测三种猪圆环病毒，为临床上PCV2、PCV3和PCV4的大规模病毒监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段，检测敏感性高、特异性强、重复性好。

Description

一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物及其应用

技术领域

本发明属于兽医动物病原检测技术领域，具体涉及一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是一种单股环状负链无囊膜的DNA病毒，可感染包括反刍动物、啮齿动物、犬类、昆虫以及贝类等多个物种，是影响全球养猪业的一种重要病毒。目前已发现四个不同的PCV血清型，分别为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和近期发现的猪圆环病毒4型(PCV4)。1974年，PCV1被发现是猪肾细胞系中的一种污染物，随后的研究证实了PCV1对猪无致病性。1996年底，PCV2从病猪中首次分离和鉴定得到，PCV2是高致病性的，在养猪业中造成了重大的经济损失，PCV2引起的疾病在临床上的主要症状包括新生仔猪先天震颤、断奶仔猪多***衰竭综合征、皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍、猪肠炎及呼吸道疾病综合征等，基于ORF2基因的ML法和贝叶斯法，PCV2又被定义了五种主要基因型：PCV2a，2b，2c，2d和2e，不同的基因型表现出不同程度的密码子使用偏倚，这主要是受自然选择的影响，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d在世界范围内流行发生，而PCV2c是主要分布于巴西和丹麦的毒株，PCV2e则是分布于美国和墨西哥的毒株。2016年，PCV3发现于美国的一头母猪中，该病毒最初是以猪皮炎、肾病综合征以及急性死亡为特征而被发现，随后在全世界流行发生，基于全长基因组的DNA序列或Cap蛋白中存在的两个氨基酸突变，PCV3可以分为三个主要进化枝：PCV3a，PCV3b和PCV3c，而且PCV3各亚型与其地理来源之间没有明显的相关性，迄今为止，PCV3的潜在疾病关联尚无定论，因此需要在实验条件下对PCV3的致病潜力进行进一步的确认。2019年4月，PCV4在中国湖南省的病猪中被发现，该病毒是一种与其他圆环病毒有明显关系的新圆环病毒，目前仅在中国有报道，PCV4是从具有严重临床症状(包括呼吸***疾病和腹泻，小部分猪的皮肤病变提示猪皮炎和肾病综合症)的猪只中发现的，但是，在健康猪中也鉴定出了PCV4 DNA，并且猪的肺，肠和其他组织的病变与PCV4的关联性不明确，因此，PCV4是否具有致病性，如果具有致病性，是否与猪中的PCV2相似，仍需进一步研究。

有研究表明，猪圆环病毒的各种血清型(PCV2、PCV3和PCV4)之间存在共感染现象，并且仅仅依靠临床症状和病理解剖很难在临床上区分这些病毒，由于目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，从而无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病毒对猪群的危害程度，并制订出针对性的防控措施。可见，在实际生产中，构建一种能够用于同时区分PCV2、PCV3和PCV4的检测方法对于猪圆环病毒不同血清型的鉴别诊断具有重要的临床意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种用于检测PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物。

本发明的第二个目的是提供上述的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物在制备辅助诊断猪圆环病毒感染的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的第四个目的是提供上述的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒在制备辅助诊断猪圆环病毒感染的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物，包括SEQ ID NO.1所示的PCV2-F、SEQ ID NO.2所示的PCV2-R、SEQ ID NO.3所示的PCV2-P、SEQ ID NO.4所示的PCV3-F、SEQ ID NO.5所示的PCV3-R、SEQ ID NO.6所示的PCV3-P、SEQID NO.7所示的PCV4-F、SEQ ID NO.8所示的PCV4-R、SEQ ID NO.9所示的PCV4-P。

猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和猪圆环病毒4型(PCV4)是不同的猪圆环病毒(PCV)血清型，不同的血清型PCV之间存在混合感染的可能，然后当前的检测方法通常只能区分单一的PCV血清型，而不能同时区分PCV2、PCV3和PCV4，因此，对这些病原体的快速诊断对于提供及时有效的治疗非常重要。为此，本发明开发了一种三重实时荧光定量PCR方法，使用不同的引物和探针组合，可同时检测多种并区别不同血清型的PCV，基于上述引物和探针组合建立的方法重复性好，组内以及组间的变异系数均小于1.5％；特异性强，检测特异性达到100％；敏感性高，敏感性达到3.8拷贝/μL；可同时检测和区分PCV2、PCV3和PCV4三种不同的血清型PCV，可供迅速评估共感染，为临床上PCV2、PCV3和PCV4的大规模病毒监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段，同时为猪圆环病毒的快速鉴别诊断和流行病学监测提供了有效、准确的工具。

本发明还提供了上述的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物在制备辅助诊断猪圆环病毒感染的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物以及标准质粒PUC57-PCV。

优选地，所述标准质粒PUC57-PCV包含SEQ ID NO.10所示的PCV2保守序列、SEQ IDNO.11所示的PCV3保守序列、SEQ ID NO.12所示的PCV4保守序列。

优选地，所述三重实时荧光定量PCR引物的浓度为20μM，探针的浓度为10μM。

优选地，所述检测试剂盒的反应体系包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液Mix10μL，PCV2-F 0.3μL，PCV2-R 0.3μL，PCV2-P 0.2μL，PCV3-F 0.35μL，PCV3-R 0.35μL，PCV3-P 0.2μL，PCV4-F 0.1μL，PCV4-R 0.1μL，PCV4-P 0.2μL，ddH₂O 5.9μL，反应体系的总体积为20μL。

具体地，所述实时荧光定量PCR反应液为2×AceQ Universal U+Probe MasterMix V2，购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

优选地，所述检测试剂盒的反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。

为增加试剂盒的实用价值，上述检测试剂盒还包括其他辅助性试剂。优选地，所述检测试剂盒还包括提取样品DNA或RNA所用的提取试剂盒或试剂，以及将RNA转录为cDNA的转录试剂盒或试剂(比如逆转录酶、逆转录引物)。

本发明还提供了上述的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒在制备辅助诊断猪圆环病毒感染的产品中的应用。

本发明还提供了采用上述的试剂盒定性检测PCV2、PCV3和PCV4的方法，具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以标准质粒PUC57-PCV为阳性对照进行三重实时荧光定量PCR检测，获取循环数(Ct值)和荧光信号的变化；PCR检测的反应体系为20μL，包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液Mix 10μL，PCV2-F(20μM)0.3μL，PCV2-R(20μM)0.3μL，PCV2-P(10μM)0.2μL，PCV3-F(20μM)0.35μL，PCV3-R(20μM)0.35μL，PCV3-P(10μM)0.2μL，PCV4-F(20μM)0.1μL，PCV4-R(20μM)0.1μL，PCV4-P(10μM)0.2μL，ddH₂O 5.9μL；反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。

(2)根据步骤(1)中的Ct值和荧光信号的变化对检测结果进行判定：

若样品中FAM通道36个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2阳性；若样品中HEX通道35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV3阳性；若样品中CY5通道34个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV4阳性；若样品中FAM通道、或ROX通道、或CY5通道分别在39、38、37个循环及以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2或PCV3或PCV4阴性；若FAM通道、HEX通道、CY5通道中分别在36-39、35-38、34-37个循环之间出现“S”型扩增曲线则判定为可疑，需重检。

使用上述检测方法可以实现PCV2、PCV3和PCV4的定性检测。

本发明还提供了采用上述的试剂盒定量检测PCV2、PCV3和PCV4的方法，具体包括以下步骤：

(1)以PCR标准质粒PUC57-PCV为模板，按10倍梯度稀释为：3.8×10⁶copies/μL、3.8×10⁵copies/μL、3.8×10⁴copies/μL、3.8×10³copies/μL、3.8×10²copies/μL，以稀释后的PUC57-PCV质粒为模板进行扩增，PCR检测的反应体系和反应程序与上述的定性检测相同，获得模板拷贝数与Ct值，然后以各标准品的浓度lg值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

(2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行三重实时荧光定量PCR检测，PCR检测的反应体系和反应程序与上述的定性检测相同，再根据荧光信号的强度和步骤(1)中的标准曲线，得出待检测样品中所含PCV2、PCV3和PCV4的拷贝数。

使用上述检测方法可以实现PCV2、PCV3和PCV4的定量检测。

本发明提供的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对PCV2、PCV3和PCV4同时准确定性和定量检测，在临床区分不同血清型的猪圆环病毒中发挥重大意义，有广阔的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物包括PCV2-F(SEQ ID NO.1)、PCV2-R(SEQ ID NO.2)、PCV2-P(SEQ ID NO.3)、PCV3-F(SEQ ID NO.4)、PCV3-R(SEQ ID NO.5)、PCV3-P(SEQ ID NO.6)、PCV4-F(SEQ ID NO.7)、PCV4-R(SEQ ID NO.8)、PCV4-P(SEQ ID NO.9)，并根据上述引物和探针组合物建立了一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒。采用本发明的试剂盒能够准确、特异、敏感的同时检测三种猪圆环病毒，为临床上PCV2、PCV3和PCV4的大规模病毒监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段，检测敏感性高、特异性强、重复性好。同时，采用本发明的试剂盒还能对三种猪圆环病毒进行定量检测，快速简便，省时省力，本发明的检测特异性达到100％，敏感性达到3.8拷贝/μL。

附图说明

图1为2020-2021年间基于我国PCV2上传的全基因***发育树；

图2为PCV2、PCV3和PCV4三重实时荧光定量PCR的扩增曲线；

图3为PCV2、PCV3和PCV4三重实时荧光定量PCR的标准曲线；

图4为PCV2、PCV3和PCV4三重实时荧光定量PCR的特异性试验结果；

图5为PCV2、PCV3和PCV4三重实时荧光定量PCR的灵敏性试验结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1用于检测PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物的设计以及检测方法的建立

1、引物及探针的筛选及优化

(1)引物设计

通过GenBank查询2020.01-2021.05期间上传的PCV2全基因序列、PCV3-Cap蛋白的序列以及PCV4的全基因序列，其中PCV2共计有175条全基因序列，PCV3-Cap蛋白的序列共计82条，PCV4共计24条全基因序列；为保证序列中包含PCV2a/b/d(我国主要流行的PCV2亚型)，添加已知亚型的PCV2序列(见表1)，通过MEGAX进行序列比对分析(见图1)，表明主要流行的PCV2亚型均包含在内；PCV3各基因型我国均存在，无需分型，PCV4在我国发现，无需分型；根据比对后的保守区域序列(SEQ ID NO 10-12)，使用Oligo 7筛选引物，选用评分为800分以上的引物和探针，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如SEQ IDNO 1-9所示。

表1PCV2标准参考毒株

所述引物及探针组合的序列分别命名为：PCV2-F、PCV2-R、PCV2-P、PCV3-F、PCV3-R、PCV3-P、PCV4-F、PCV4-R、PCV4-P；所述引物及探针组合从5’端至3’端的序列分别为：

PCV2-F：AGCGCAAGAAAATACG(SEQ ID NO.1)；

PCV2-R：CAAAATTAGCGAACCC(SEQ ID NO.2)；

PCV2-P：FAM-TCATTACCYTCCTCGCCA-BHQ2(SEQ ID NO.3)，FAM为报告荧光基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

PCV3-F：CACCCAGGACAAAGC(SEQ ID NO.4)；

PCV3-R：CGTAGAAGTCTGTCATT(SEQ ID NO.5)；

PCV3-P：HEX-ATGGCTCAACACATATGACCCCACCG-BHQ2(SEQ ID NO.6)，HEX为报告荧光基团，BHQ2为荧光淬灭基团；

PCV4-F：TCCACCATTGGTTTCTTT(SEQ ID NO.7)；

PCV4-R：ACCCCAGGACCCATCC(SEQ ID NO.8)；

PCV4-P：Cy5-ACCCACACCCTCCACTTCCAGC-BHQ3(SEQ ID NO.9)，Cy5为报告荧光基团，BHQ3为荧光淬灭基团。

PCV2、PCV3、PCV4三种病毒的保守区域序列分别为：

PCV2-Rep蛋白的保守区域序列：

ACGAGCGCAAGAAAATACGGGAGCTTCCAATCTCCCTTTTTGATTATTTTATTGTTGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAACACCCCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTG(116bp，序列号：KU311020.1，SEQID NO.10)；

PCV3-Cap蛋白的保守区域序列：

GCCGTAGAAGTCTGTCATTCCAGTTTTTTCCGGGACGTAAATGCTCCAAAGCAGTGCTCCCCATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGGTCTGGAGAAAAAGAAGAGGCTTTGTCCTGGGTGAG(137bp，序列号：MH184541.1，SEQ ID NO.11)；

PCV4-Cap蛋白的保守区域序列：

GATCCACCATTGGTTTCTTTTGTTGTTAGGCTGGAAGTGGAGGGTGTGGGTTTCCCCGGATGGGTCCTGGGGTTT(75bp，序列号：MK986820.1，SEQ ID NO.12)。

(2)定量PCR标准质粒的合成

为使后续的三种病毒优化时质粒浓度可以均一化，根据PCV2(序列号：KU311020.1)、PCV3(序列号：MH184541.1)、PCV4(序列号：MK986820.1)这3种病毒在GenBank中已公布的基因序列，将3种病毒的保守区域序列(SEQ ID NO 10-12)合成基于PUC57的单一混合包装质粒PUC57-PCV，质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、反应体系的优化

通过优化三种病毒的不同引物浓度、不同探针浓度、不同退火温度、反应总体积，选择扩增效率高，荧光信号强度Ct值小的为最佳体系，优化后的体系为20μL：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2(购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)10μL，PCV2-F(20μM)0.3μL，PCV2-R(20μM)0.3μL，PCV2-P(10μM)0.2μL，PCV3-F(20μM)0.35μL，PCV3-R(20μM)0.35μL，PCV3-P(10μM)0.2μL，PCV4-F(20μM)0.1μL，PCV4-R(20μM)0.1μL，PCV4-P(10μM)0.2μL，ddH₂O 5.9μL；其反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。

3、定性检测

(1)三重实时荧光定量PCR检测：

提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以标准质粒PUC57-PCV为阳性对照，使用步骤2中的反应体系进行三重实时荧光定量PCR检测，用得到的Ct值和荧光信号的变化实现对PCV2、PCV3和PCV4的定性检测。

(2)定性检测的判断方法为：

1)在36个循环内(包括第36个循环)，若样品在PCV2-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2阳性(样品中含有PCV2)；在36-39个循环之间(包括第36个循环但不包括第39个循环)，若样品在PCV2-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道或PCV3-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道出现“S”型扩增曲线，判定为可疑，需重检；在39个循环及以上，若样品在PCV2-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道或PCV2-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道未出现“S”型扩增曲线，则判定为阴性；

2)在35个循环内(包括第35个循环)，若样品在PCV3-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV3阳性(样品中含有PCV3)；在35-38个循环之间(包括第35个循环但不包括第38个循环)，若样品在PCV3-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道或PCV3-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道出现“S”型扩增曲线，判定为可疑，需重检；在38个循环及以上，若样品在PCV3-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道或PCV3-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道未出现“S”型扩增曲线，则判定为阴性；

3)在34个循环内(包括第34个循环)，若样品在PCV4-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV4阳性(样品中含有PCV4)；在34-37个循环之间(包括第34个循环且不包括第37个循环)，若样品在PCV4-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道或PCV4-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道出现“S”型扩增曲线，判定为可疑，需重检；在37个循环及以上，若样品在PCV4-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道或PCV4-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道未出现“S”型扩增曲线，则判定为阴性；

综上所述，定性检测结果的判定标准为：若样品中FAM通道36个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2阳性；若样品中HEX通道35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV3阳性；若样品中CY5通道34个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV4阳性；若样品中FAM通道、或ROX通道、或CY5通道分别在39、38、37个循环及以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2或PCV3或PCV4阴性；若FAM通道、HEX通道、CY5通道中分别在36-39、35-38、34-37个循环之间出现“S”型扩增曲线则判定为可疑，需重检。

4、定量检测

(1)标准曲线的构建

以构建的定量PCR标准质粒PUC57-PCV为模板，按10倍梯度稀释为：3.8×10⁶copies/μL、3.8×10⁵copies/μL、3.8×10⁴copies/μL、3.8×10³copies/μL、3.8×10²copies/μL，然后分装并于-20℃保存；使用步骤2中的反应体系对稀释后的PUC57-PCV质粒进行扩增，获得模板拷贝数与循环数(Ct值)，检测结束后，以各标准品的浓度lg值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线。

获得的模板拷贝数与循环数(Ct值)扩增曲线见图2；检测结束后，以各标准品的浓度lg(copies/μL)值(X轴)对其相应的循环数Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线(如图3所示)；

根据公式：扩增效率E＝10-^1/斜率-1，如图3所示，PCV2、PCV3和PCV4的斜率分别是：-3.383、-3.331和-3.345，计算可得PCV2、PCV3和PCV4的扩增效率分别是：97.51％、99.62％和99.05％，证明构建的三重荧光定量PCR扩增效率高。

(2)定量检测结果的确定

提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用步骤2中的反应体系进行三重实时荧光定量PCR检测，再根据荧光信号的强度和上述步骤(1)中的标准曲线，得出待检测样品中所含PCV2、PCV3和PCV4的拷贝数，实现定量检测。

实施例2三重荧光定量PCR的特异性试验

提取购自吉林正业生物制品股份有限公司的疫苗株猪传染性胃肠炎病毒(TGEV弱毒株)/流行性腹泻病毒(PEDV-CV777)/轮状病毒(Live-G5型-NX株)、猪伪狂犬病病毒(Bartha-K61弱毒株)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)、猪瘟兔化弱毒株(CVCC AV1412)的病毒DNA或者RNA，RNA病毒根据HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书进行逆转录成cDNA，-80℃保存，得到标准毒株。

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV弱毒株)/流行性腹泻病毒(PEDV-CV777)/轮状病毒病毒(G5型-NX株)、猪伪狂犬病病毒(Bartha-K61弱毒株)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)、猪瘟兔化弱毒株(CVCCAV1412)的DNA或cDNA为模板，3.8×10¹copies/μL的标准质粒PUC57-PCV为阳性对照，ddH₂O为阴性对照。使用实施例1中的反应体系和反应程序进行三重实时荧光定量PCR检测。

结果见图4，仅阳性对照有“S”型扩增曲线，PCV2、PCV3和PCV4的循环数(Ct值)分别是：34.01、34.47和33.36，对照组疫苗病毒无“S”型扩增曲线，未见Ct值，证明构建的三重荧光定量PCR特异性高，检测特异性达到100％。

实施例3三重荧光定量PCR的重复性试验

以10倍梯度稀释的定量PCR标准质粒PUC57-PCV为模板，按10倍梯度稀释为：3.8×10⁶copies/μL、3.8×10⁵copies/μL、3.8×10⁴copies/μL，使用实施例1中的反应体系和反应程序进行三重实时荧光定量PCR检测，每次三个重复，进行三次，分别计算循环数均值、标准差和变异系数；结果见表2，组内以及组间的变异系数均小于1.5％，证明建立的方法重复性好。

表2三重荧光定量PCR的重复性试验结果

实施例4三重荧光定量PCR的敏感性试验

以梯度稀释(按10倍梯度稀释)的定量PCR标准质粒PUC57-PCV作为模板，使用实施例1中的反应体系和反应程序进行三重实时荧光定量PCR检测。结果见图5，PCV2、PCV3和PCV4的检测下限均为：3.8copies/μL，分别对应的循环数：35.18、36.01和33.87；证明建立的方法具有良好的灵敏性。

实施例5用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒的建立

所述试剂盒包括实施例1中设计得到的引物及探针组合物：PCV2-F(SEQ IDNO.1)、PCV2-R(SEQ ID NO.2)、PCV2-P(SEQ ID NO.3)、PCV3-F(SEQ ID NO.4)、PCV3-R(SEQID NO.5)、PCV3-P(SEQ ID NO.6)、PCV4-F(SEQ ID NO.7)、PCV4-R(SEQ ID NO.8)、PCV4-P(SEQ ID NO.9)。

同时，还包括实施例1中合成的定量PCR标准质粒PUC57-PCV。

所述PCR检测试剂盒的反应体系为20μL，包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V210μL，PCV2-F(20μM)0.3μL，PCV2-R(20μM)0.3μL，PCV2-P(10μM)0.2μL，PCV3-F(20μM)0.35μL，PCV3-R(20μM)0.35μL，PCV3-P(10μM)0.2μL，PCV4-F(20μM)0.1μL，PCV4-R(20μM)0.1μL，PCV4-P(10μM)0.2μL，ddH₂O 5.9μL；其反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。

使用上述的试剂盒定性检测PCV2、PCV3和PCV4的方法，具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以标准质粒PUC57-PCV为阳性对照，使用上述的引物及探针组合物，按照上述的反应体系和反应程序进行三重实时荧光定量PCR检测，获取循环数(Ct值)和荧光信号的变化；

(2)根据步骤(1)中的Ct值和荧光信号的变化对检测结果进行判定：若样品中FAM通道36个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2阳性；若样品中HEX通道35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV3阳性；若样品中CY5通道34个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV4阳性；若样品中FAM通道、或ROX通道、或CY5通道分别在39、38、37个循环及以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为PCV2或PCV3或PCV4阴性；若FAM通道、HEX通道、CY5通道中分别在36-39、35-38、34-37个循环之间出现“S”型扩增曲线则判定为可疑，需重检。

使用上述的试剂盒定量检测PCV2、PCV3和PCV4的方法，具体包括以下步骤：

(1)以上述的定量PCR标准质粒PUC57-PCV为模板，按10倍梯度稀释为：3.8×10⁶copies/μL、3.8×10⁵copies/μL、3.8×10⁴copies/μL、3.8×10³copies/μL、3.8×10²copies/μL，使用上述的引物及探针组合物，按照上述的反应体系和反应程序对稀释后的PUC57-PCV质粒进行扩增，获得模板拷贝数与Ct值，然后以各标准品的浓度lg值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

(2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用上述的引物及探针组合物，按照上述的反应体系和反应程序进行三重实时荧光定量PCR检测，再根据荧光信号的强度和步骤(1)中的标准曲线，得出待检测样品中所含PCV2、PCV3和PCV4的拷贝数。

实施例6PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒的应用

血液样品采集于2020年5月-2020年7月，来自广东省24个不同的养猪场，总计93份，根据病毒总核酸快速抽提提取试剂盒(购自广州美基生物科技有限公司)进行核酸提取，然后采用实施例5中的检测试剂盒进行三重实时荧光定量PCR检测，定性定量检测的结果见表3。

如表3所示，上述93份临床血液样品中，PCV2的阳性率为58.06％，PCV3的阳性率为19.35％，PCV2与PCV3的混合感染率为10.75％，PCV4未检测到，说明PCV2与PCV3在猪场内的感染广泛存在；同时，采用实施例5中的试剂盒还检测出了各阳性样品的拷贝数；说明本发明建立的三重猪圆环病毒的荧光定量诊断方法可以实现对PCV2、PCV3和PCV4同时准确定性和定量检测，对临床疾病的防控具有重大的指导意义。

表3临床疑似样品的三重实时荧光定量PCR检测结果

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针组合物及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcgcaagaa aatacg 16

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaaattagc gaaccc 16

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FAM-TCATTACCYTCCTCGCCA-BHQ2，FAM为报告荧光基团，BHQ1为荧光淬灭基团

<400> 3

tcattaccyt cctcgcca 18

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacccaggac aaagc 15

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtagaagtc tgtcatt 17

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HEX-ATGGCTCAACACATATGACCCCACCG-BHQ2，HEX为报告荧光基团，BHQ2为荧光淬灭基团

<400> 6

atggctcaac acatatgacc ccaccg 26

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccaccattg gtttcttt 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accccaggac ccatcc 16

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cy5-ACCCACACCCTCCACTTCCAGC-BHQ3，Cy5为报告荧光基团，BHQ3为荧光淬灭基团

<400> 9

acccacaccc tccacttcca gc 22

<210> 10

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgagcgcaa gaaaatacgg gagcttccaa tctccctttt tgattatttt attgttggcg 60

aggagggtaa tgaggaagga cgaacacccc acctccaggg gttcgctaat tttgtg 116

<210> 11

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccgtagaag tctgtcattc cagttttttc cgggacgtaa atgctccaaa gcagtgctcc 60

ccattgaacg gtggggtcat atgtgttgag ccatggggtg ggtctggaga aaaagaagag 120

gctttgtcct gggtgag 137

<210> 12

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatccaccat tggtttcttt tgttgttagg ctggaagtgg agggtgtggg tttccccgga 60

tgggtcctgg ggttt 75

Claims

1.一种用于检测PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示的PCV2-F、SEQ ID NO.2所示的PCV2-R、SEQ ID NO.3所示的PCV2-P、SEQ ID NO.4所示的PCV3-F、SEQ ID NO.5所示的PCV3-R、SEQ ID NO.6所示的PCV3-P、SEQ ID NO.7所示的PCV4-F、SEQ ID NO.8所示的PCV4-R、SEQ ID NO.9所示的PCV4-P。

2.权利要求1所述的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物在制备辅助诊断猪圆环病毒感染的产品中的应用。

3.一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组合物以及标准质粒PUC57-PCV。

4.根据权利要求3所述的一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒PUC57-PCV包含SEQ ID NO.10所示的PCV2保守序列、SEQ IDNO.11所示的PCV3保守序列、SEQ ID NO.12所示的PCV4保守序列。

5.根据权利要求3所述的一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述三重实时荧光定量PCR引物的浓度为20μM，探针的浓度为10μM。

6.根据权利要求3所述的一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的反应体系包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液Mix10μL，PCV2-F0.3μL，PCV2-R0.3μL，PCV2-P0.2μL，PCV3-F0.35μL，PCV3-R0.35μL，PCV3-P0.2μL，PCV4-F0.1μL，PCV4-R0.1μL，PCV4-P0.2μL，ddH₂O5.9μL，反应体系的总体积为20μL。

7.根据权利要求3所述的一种用于PCV2、PCV3和PCV4的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的反应程序为：37℃消化2min，95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，45个循环。

8.权利要求1-7任一项所述的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒在制备辅助诊断猪圆环病毒感染的产品中的应用。