KR20170117012A - 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 급성위장관염을 일으키는 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 중 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 노로바이러스 GII 유전형 그룹과 사포바이러스를 동시에 특이도 및 민감도 높게 진단할 수 있고, 분자진단에 사용될 양성 표준자는 기존에 흔히 사용된 합성 RNA가 아닌 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성바이러스를 사용함으로써 양성 표준자의 안정성을 높여 항상 동일한 실험결과를 유지할 수 있도록 한 급성위장관염 유발 바이러스 검사 키트 및 검사 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR 분석법을 이용하여 초기 증상이 유사한 여러 급성위장관염 의심 환자의 검체로부터 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염 초기에도 소량의 바이러스의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있다.
Description
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 급성위장관염 증세를 나타내는 의심 환자의 검체로부터 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스인 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 검사하는 키트 및 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 초기 증상이 유사한 여러 급성위장관염 의심 환자의 검체로부터 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염 초기에도 소량의 바이러스의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 다양한 유전형의 노로바이러스를 특이적으로 검출할 수 있고 의심 환자의 분변, 콧물, 타액, 눈물 뿐만아니라 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 어패류 등의 환경 시료로부터도 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 민감도 높게 검출하여 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염여부에 대한 정확한 진단과 감염 확산을 조기에 차단할 수 있는 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사에 사용되는 양성 표준자(positive standard 또는 positive control)에 있어서 합성 RNA 대신 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성바이러스를 제작하여 양성 표준자로 사용함으로써 양성 표준자 및 검사의 안정성을 높여 항상 동일한 실험결과를 유지할 수 있도록 한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
급성설사는 전 세계적으로 호흡기 감염에 이어 두 번째로 많이 발생하는 감염성 질환으로 이중 바이러스성 설사증은 매년 5백만명 정도의 후진국 어린이의 사망원인으로 알려져 있다. 대표적인 바이러스성 설사의 주요한 원인체로는 로타바이러스, 아스트로바이러스, 사포바이러스, 아데노바이러스, 노로바이러스 등이 있으며, 기타 원인체로는 토로바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스도 설사를 유발하는 것으로 알려져 있다.
이들 중 노로바이러스(Norovirus)는 전 연령대에서 빈번하게 발생하는 바이러스 설사증의 원인이며, 오염된 식수나 어패류 등에 의해 감염된다. 노로바이러스는 사람 간 전염성이 매우 강하며, 낮은 온도에서도 오랜 기간 생존할 수 있다. 또한, 낮은 농도의 바이러스만으로도 설사를 유발할 수 있어 노로바이러스 검출을 위해서는 민감도가 무엇보다 중요하다.
질병관리본부의 수인성 식품매개질환 감시망 운영사업에 따르면, 매년 바이러스성 설사증이 증가하고 있으며, 이중 노로바이러스의 경우 2006년부터 지속적으로 증가하여 2007년과 2008년에는 급성위장관염 바이러스 감염의 50% 이상을 차지하는 것으로 확인되었다. 이는 2000년대 초반부터 문제가 된 노로바이러스의 감염이 국내에서도 토착화되고 있음을 시사하는 것으로 유추될 수 있다.
최근 국내 노로바이러스 감염연구에 따르면 노로바이러스 감염은 겨울철에 가장 빈번하며, 20종의 유전형이 확인되었다. 이중 노로바이러스 GII 4가 가장 높은 감염률을 보이고 GI 그룹보다는 GII 그룹의 노로바이러스의 감염이 높지만, 다양한 유전형의 노로바이러스가 고르게 감염을 일으키는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 노로바이러스의 검출에 있어서는 다양한 유전형의 노로바이러스를 모두 검출할 수 있어야 하는 것 또한 중요하다.
사포바이러스(Sapovirus)는 노로바이러스와 같이 칼리시비리데에 속하는 바이러스로서 단일사슬의 RNA 유전체를 가지며 사람과 돼지가 주요한 숙주로 작용한다. 노로바이러스가 모든 연령 대에 감염이 일어나는 것과 달리 사포바이러스는 5세 이하에서 감염이 발생한다. 노로바이러스와 달리 드물기는 하지만 사포바이러스는 병원시설 등에서 집단발병을 일으키기도 한다. 7개의 유전형 그룹(genogroup) 중 GI, GII, GIV, GV 4개의 유전형 모두 사람에게 급성 설사를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
설사바이러스 감염을 확인하는 진단법은 면역학적 반응을 기반으로 하는 진단법과 배양을 통한 방법, 전자현미경을 이용하는 방법, RT-PCR을 기반으로 하는 분자진단법 등이 있다. 설사바이러스 검체는 보통 분변으로, 다양한 물질들이 저해제로 작용할 수 있다. 통상 설사바이러스에 감염되어 증상을 보이는 경우 다량의 바이러스가 분변을 통하여 배출되기 때문에 일반적인 진단법으로 쉽게 확인이 가능하지만, 노로바이러스나 사포바이러스가 환경에 오염되어 구강을 통하여 감염되는 경우에는 적은 수의 바이러스로도 감염이 발생할 수 있기 때문에 환경시료에 대해서는 특히 분자진단법이 높은 민감도를 가져야 한다.
이와 관련하여 종래의 설사바이러스 검사를 위한 분자생물학적 진단법들은 노로바이러스 1가지 내지 2가지 유전형 만을 검출할 수 있어 다양한 유전형에 대해서는 검출이 불가능하고 실제 설사병 증세를 보이는 노로바이러스 감염 환자를 음성으로 진단할 수 있는 문제점이 있었다. 또한, 종래의 분자생물학적 진단법들은 노로바이러스와 유사한 설사병 증세를 보이는 사포바이러스를 노로바이러스와 동시에 검출할 수 없어 사포바이러스 감염 환자에 대한 치료 및 감염 차단을 조기에 할 수 없었고, 이에 따라 사포바이러스의 병원 내 전파에 의한 집단 발병을 막을 수 없는 한계가 있었다.
따라서, 급성위장관염을 일으키는 바이러스가 대부분 초기 증상이 유사하여 적절한 치료 및 병원 내 집단 발병을 막기 위해서는 정확한 원인바이러스를 감별하는 것이 매우 중요하다. 즉, 본 발명이 속한 기술분야에서는 노로바이러스의 다양한 유전형을 검출할 수 있고 노로바이러스 이외에 병원 내 전파에 의한 집단 발병을 일으키는 사포바이러스를 동시에 검출할 수 있는 기술의 제공이 필요하다.
또한, 리얼 타임 PCR을 이용한 분자진단을 위해서는 양성 표준자가 필요한데, 통상 이러한 양성 표준자로는 시험관내 전사(in vitro transcrption)를 통하여 합성하여 생산한 RNA를 사용한다. 하지만, 합성된 RNA는 노출된 상태로 있어 환경및 시료에서 존재하는 RNase에 의해 쉽게 분해될 수 있고, 다양한 환경요건에 의해 쉽게 손상될 수 있어 전술한 바와 같은 노로바이러스와 사포바이러스를 동시에 검출하는 민감한 진단법의 개발과 더불어 해결되어야 할 과제이다.
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 급성위장관염 증세를 나타내는 의심 환자의 검체로부터 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스인 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 검사하는 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 초기 증상이 유사한 여러 급성위장관염 의심 환자의 검체로부터 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염 초기에도 소량의 바이러스의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 급성위장관염 유발 칼리시비리데 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 다양한 유전형의 노로바이러스를 특이적으로 검출할 수 있고 의심 환자의 분변, 콧물, 타액, 눈물 뿐만아니라 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 어패류 등의 환경 시료로부터도 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 민감도 높게 검출하여 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염여부에 대한 정확한 진단과 감염 확산을 조기에 차단할 수 있는 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사에 사용되는 양성 표준자에 있어서 합성 RNA 대신 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성바이러스를 제작하여 양성 표준자로 사용함으로써 양성 표준자 및 검사의 안정성을 높여 항상 동일한 실험결과를 유지할 수 있도록 한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자는 리얼타임 PCR을 이용하여 급성위장관염을 일으키는 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 중 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 노로바이러스 GII 유전형 그룹과 사포바이러스를 동시에 특이도 및 민감도 높게 검사할 수 있고, 분자진단에 사용될 양성 표준자는 기존에 흔히 사용된 합성 RNA가 아닌 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성바이러스를 사용함으로써 양성 표준자의 안정성을 높여 항상 동일한 실험결과를 유지할 수 있도록 한 급성위장관염 유발 바이러스 검사 키트 및 검사 방법을 제공하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체"란 감염 의심 환자의 분변, 콧물, 타액, 눈물 외에도 급성위장관염 유발 바이러스의 유전자 검출이 가능한 환경시료, 예를 들어 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 어패류 등도 포함하는 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 RNA, DNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "합성된 렌티바이러스"는 RNA 서열 뿐만아니라 RNA로부터 생성된 cDNA 서열로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임(real-time) PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다.
SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다.
본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 검사 방법에서 사용되는 리얼타임 PCR 증폭용 프라이머 쌍으로서, 노로바이러스 GI 유전형 그룹(Norovirus GI genogroup)의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 노로바이러스 GII 유전형 그룹(Norovirus GII genogroup)의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 6 및 7의 프라이머 쌍과, 사포바이러스(Sapovirus)의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 12 및 13의 프라이머 쌍을 포함하는, 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 표적 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 노로바이러스 GI 유전형 그룹(Norovirus GI genogroup)의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열에 특이적인 프로브로서 서열번호 3 내지 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드들과 이러한 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 노로바이러스 GII 유전형 그룹(Norovirus GII genogroup)의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열에 특이적인 프로브로서 서열번호 8 내지 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드들과 이러한 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 사포바이러스(Sapovirus)의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열에 특이적인 프로브로서 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 급성위장관염 유발 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 검사용 프로브 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 검사 키트로서, 노로바이러스 GI 유전형 그룹(Norovirus GI genogroup)의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 노로바이러스 GII 유전형 그룹(Norovirus GII genogroup)의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 6 및 7의 프라이머 쌍과, 사포바이러스(Sapovirus)의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 12 및 13의 프라이머 쌍을 포함하고, 노로바이러스 GI 유전형 그룹(Norovirus GI genogroup)의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 3 내지 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드들과 이러한 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 노로바이러스 GII 유전형 그룹(Norovirus GII genogroup)의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 8 내지 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드들과 이러한 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 사포바이러스(Sapovirus)의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 검사 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
이와 관련하여, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이와 같이 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 검사 튜브에서 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭량, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭량 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭량을 산출할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법은,
검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 전술한 바와 같은 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트를 이용하여, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열을 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 표적 유전자 서열의 증폭 후, 리얼타임 PCR 결과를 확인하여 상기 검체 내의 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이러스 감염 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법은,
증폭 전, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열을 각각 증폭하는 프라이머 쌍과, 증폭되는 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열과 관련하여 표적 유전자 서열 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열 각각의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열 각각을 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이러스 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법에 있어서, 상기 양성 표준자는 서열번호 15의 노로바이러스 GI 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 서열번호 16의 노로바이러스 GII 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열 및 서열번호 17의 사포바이러스 유전자 서열을 포함하는 합성 렌티바이러스(Lentivirus)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
이와 관련하여, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이와 같이 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 검사 튜브에서 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭량, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭량 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭량을 산출할 수 있다.
또한, 본 발명은 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검출을 위한 리얼타임 PCR에 사용되는 양성 표준자(또는 '양성대조물질'이라고 함)로서, 서열번호 15의 노로바이러스 GI 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 서열번호 16의 노로바이러스 GII 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 및 서열번호 17의 사포바이러스 유전자 서열을 포함하는 합성 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 양성 표준자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 양성 표준자를 구성하는 렌티바이러스는 바이러스 팩킹 벡터가 결여되어 있다(즉, 바이러스 팩킹 벡터를 포함하지 않음).
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX, TET 및 TAMRA 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ, ZEN-IBFQ 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 급성위장관염 증세를 나타내는 의심 환자의 검체로부터 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스인 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 검사할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 초기 증상이 유사한 여러 급성위장관염 의심 환자의 검체로부터 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염 초기에도 소량의 바이러스의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 다양한 유전형의 노로바이러스를 특이적으로 검출할 수 있고 의심 환자의 분변, 콧물, 타액, 눈물 뿐만아니라 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 어패류 등의 환경 시료로부터도 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 민감도 높게 검출하여 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염여부에 대한 정확한 진단과 감염 확산을 조기에 차단할 수 있다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사에 사용되는 양성 표준자에 있어서 합성 RNA 대신 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성바이러스를 제작하여 양성 표준자로 사용함으로써 양성 표준자 및 검사의 안정성을 높여 항상 동일한 실험결과를 유지할 수 있도록 하는 장점이 있다.
도 1은 노로바이러스 GII 및 노로바이러스 GI에 대해 듀플렉스 RT-qPCR을 수행한 결과로서, 실시예 1에서 합성된 렌티바이러스(Lentivirus)에서 추출한 RNA를 연속으로 희석한 시료(1/10, 1/102, 1/103, 1/104, 1/105)를 첨가하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 2는 사포바이러스에 대해 단독으로 RT-qPCR을 수행한 결과로서, 실시예 1에서 합성된 렌티바이러스(Lentivirus)에서 추출한 RNA를 연속으로 희석한 시료(1/102, 1/103, 1/104)를 첨가하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 노로바이러스 GII, 노로바이러스 GI 및 사포바이러스에 대해 동시에 RT-qPCR을 수행한 결과로서, 실시예 1에서 합성된 렌티바이러스(Lentivirus)에서 추출한 RNA를 1/103 희석한 시료를 첨가하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 렌티바이러스 합성 벡터의 유전자 개열지도를 나타내는 도면이다.
도 5는 렌티바이러스의 구조를 설명하는 도면이다.
도 2는 사포바이러스에 대해 단독으로 RT-qPCR을 수행한 결과로서, 실시예 1에서 합성된 렌티바이러스(Lentivirus)에서 추출한 RNA를 연속으로 희석한 시료(1/102, 1/103, 1/104)를 첨가하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 노로바이러스 GII, 노로바이러스 GI 및 사포바이러스에 대해 동시에 RT-qPCR을 수행한 결과로서, 실시예 1에서 합성된 렌티바이러스(Lentivirus)에서 추출한 RNA를 1/103 희석한 시료를 첨가하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 렌티바이러스 합성 벡터의 유전자 개열지도를 나타내는 도면이다.
도 5는 렌티바이러스의 구조를 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 양성 표준자로서의 렌티바이러스 합성
노로바이러스와 사포바이러스의 동시 검출을 위한 양성 표준자로서, 합성된 유전자를 이용하여 렌티바이러스(Lentivirus)를 합성하였다(도 4 및 도 5 참조). 양성 표준자의 유전자는 서열번호 15의 노로바이러스 GI 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 서열번호 16의 노로바이러스 GII 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 및 서열번호 17의 사포바이러스 유전자 서열이 모두 포함되도록 하였으며, 이들 유전자 서열들을 모두 포함하는 렌티바이러스 양성 표준자는 주식회사 서린바이오사이언스사의 렌티바이러스 합성서비스를 이용하여 준비하였다.
합성된 렌티바이러스는 별도의 바이러스 팩킹 벡터와 함께 숙주세포에 감염시켜야만 자기 복제가 가능하도록 하여, 본 실시예에서 준비된 합성 렌티바이러스는 스스로 복제가 될 수 없도록 하였다. 즉, 합성된 렌티바이러스는 세포의 감염은 가능하지만 자기 복제를 위해서는 별도의 바이러스 팩킹 벡터가 필요하기 때문에 위험성을 현저히 감소시킬 수 있고, 또한 합성된 렌티바이러스는 다양한 화학물질을 통하여 불활화가 가능하기 때문에 감염성을 완전히 제거할 수 있어 매우 안전하다.
또한, 합성된 렌티바이러스 유전체는 단일사슬의 RNA가 캡시드(capsid) 단백질에 의해 보호되어 바이러스 파티클을 이루고 있기 때문에 환경에 매우 안정한 상태로 사용될 수 있다(도 5 참조). 즉, 합성된 렌티바이러스는 환경에 노출되어도 안정하여 동일한 실험 결과를 얻을 수 있어 기존의 RNA 단편으로 구성되는 양성표준자(양성대조물질)와 비교시 실험의 높은 재현성과, RNA 핵산의 추출 및 RNA 증폭실험의 전과정의 무결성을 확인할 수 있는 양성표준자(양성대조물질)로는 많은 이점을 가질 수 있다.
합성된 렌티바이러스에 포함되는 노로바이러스 GI 유전형 그룹(genogroup)의 유전자 서열은 GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. KJ196289의 참조서열(Reference sequence)(범위: 5030~5174)이 이용되었고, 노로바이러스 GII 유전형 그룹(genogroup)의 유전자 서열은 GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. KF039729의 참조서열(범위: 5010~5433)이 이용되었으며, 사포바이러스의 유전자 서열은 GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. X86560의 참조서열(범위: 5442~5534)이 이용되었다.
실시예 2: 노로바이러스와 사포바이러스 동시 검출을 위한 유전자 선정과 이에 특이적인 프라이머 및 프로브의 설계
노로바이러스와 사포바이러스를 동시에 검출할 수 있는 표적유전자를 선행문헌 및 GenBank 유전자 서열을 토대로 선정하였다. 이들 바이러스들을 특이적으로 검출하기 위한 표적 유전자 서열로서, 노로바이러스의 GI 유전형 그룹은 ORF1과 ORF2를 포함하는 유전자 서열을 선정하였고, 노로바이러스의 GI 유전형 그룹은 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 유전자 서열을 선정하였으며, 사포바이러스는 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 선정하였다. 선정된 이들 표적 유전자 서열들에 대해 염기서열 상동성 분석을 통하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다.
실시예 2-1: 노로바이러스 GI 및 노로바이러스 GII 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 준비
GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 KJ196289의 서열을 참조하여 노로바이러스 GI 검출을 위해 표적 서열을 특이적으로 증폭하는 프라이머와, 증폭반응 결과물을 특이적으로 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브를 디자인하였다. 또한, GenBank KF039729의 서열을 참조하여 노로바이러스 GII 검출을 위해 표적 서열을 특이적으로 증폭하는 프라이머와, 증폭반응 결과물을 특이적으로 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브를 디자인하였다.
노로바이러스 GI 및 노로바이러스 GII 검출에 사용되는 리얼타임 PCR용 프라이머와 프로브의 상세한 서열정보는 아래의 표 1과 같고, 각각의 프라이머와 프로브는 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)사에 의뢰하여 합성하였다. 노로바이러스 GI 유전형 그룹을 검출하는데 사용되는 프로브의 경우 5' 말단에 형광 물질인 HEX를 표지하였고, 3' 말단에는 IDT사의 소광물질인 ZEN-IBFQ를 표지하였다. 또한, 노로바이러스 GII 유전형 그룹을 검출하는데 사용되는 프로브의 경우 5' 말단에 형광 물질인 FAM을 표지하였고, 3' 말단에는 IDT사의 소광물질인 ZEN-IBFQ를 표지하였다. 한편, 하기 표 1의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열 (5'→3') | 온도(℃) | 위치 | 증폭산물 |
| 서열번호 1 | GI-F | CHATGTTCCGYTGGATGCG | 56.3 | 5317~5335 | 95 bp |
| 서열번호 2 | GI-R | TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC | 54.7 | 5411~5388 | |
| 서열번호 3 | GI-P1 | TGGACAGGAGATCGCRATCT | 56.8 | 5355~5374 | |
| 서열번호 4 | GI-P2 | TGGACAGGAGACCGCGATCT | 60.4 | 5355~5374 | |
| 서열번호 5 | GI-P3 | TGGGCAGGAGATCGCAATCT | 58.8 | 5355~5374 | |
| 서열번호 6 | GII-F | CACDTGGGAGGGCGAT | 55.8 | 5098~5113 | 62 bp |
| 서열번호 7 | GII-R | GTCAYTCGACGCCATC | 51.7 | 5159~5144 | |
| 서열번호 8 | GII-P1 | CATTCACAAAAYTGGGAGCCAGATTGC | 59.8 | 5141~5115 | |
| 서열번호 9 | GII-P2 | CATTCACACCTTCGGGAGCAAGATTGC | 61.8 | 5141~5115 | |
| 서열번호 10 | GII-P3 | CATTCACACCGTCGGGAGCCAGATTGC | 65 | 5141~5115 | |
| 서열번호 11 | GII-P4 | CATTCACATTCTCGGGAGCCAGATTGC | 61.5 | 5141~5115 |
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍에 의해 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자를 증폭하도록 하였고, 증폭 반응물 내에 서열번호 3, 서열번호 4 및/또는 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드가 존재하여 리얼 타임 PCR 반응 시 특이적 프로브로 작용할 수 있도록 하였다. 서열번호 3의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 1,2,4,5,6,7,8형을 특이적으로 검출할 수 있도록 설계되었고, 서열번호 4의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 3형, 그리고 서열번호 5의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 9형을 특이적으로 검출할 수 있도록 설계되었다. 따라서, 리얼 타임 PCR 증폭 반응물에 서열번호 3 내지 서열번호 5의 프로브를 모두 혼합하여 리얼 타임 PCR을 진행할 경우 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 1~9형 유전형을 모두 검출할 수 있고, 특정 유전자형 만을 확인하고자 할 경우에는 해당 프로브만을 포함시켜 리얼 타임 PCR을 수행할 수 있다.
또한, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 6 및 7의 프라이머 쌍에 의해 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자를 증폭하도록 하였고, 증폭된 표적 유전자 산물과 특이적으로 결합하는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및/또는 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드로 특이적 프로브를 구성하였다. 서열번호 8의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 1,2,3,4,10,12,17형, 서열번호 9의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 5,6,7,14형, 서열번호 10의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 15형, 그리고 서열번호 11의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 8형을 특이적으로 검출할 수 있도록 설계되었다. 리얼 타임 PCR 반응 시에는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 경우와 동일하게 서열번호 8 내지 서열번호 11의 프로브를 모두 혼합하여 리얼타임 PCR을 진행할 수 있으며, 경우에 따라 특정 유전자형 만을 확인하고자 할 경우 해당 프로브만을 포함시켜 리얼 타임 PCR을 수행할 수 있다.
실시예 2-2: 사포바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 준비
GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 X86560의 서열을 참조하여 사포바이러스 검출을 위해 표적 서열을 특이적으로 증폭하는 프라이머와, 증폭반응 결과물을 특이적으로 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브를 디자인하였다.
사포바이러스 검출에 사용되는 리얼타임 PCR용 프라이머와 프로브의 상세한 서열정보는 아래의 표 2와 같고, 각각의 프라이머와 프로브는 (주)바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 사포바이러스를 검출하는데 사용되는 프로브의 경우 5' 말단에 형광 물질인 TAMRA를 표지하였고, 3' 말단에는 EBQ를 표지하였다. 한편, 하기 표 2의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열 (5'→3') | 온도(℃) | 위치 | 증폭산물 |
| 서열번호 12 | S-F | GCTTCATCCCAACATTAACCCGTACAC | 59.7 | 5542-5468 | 93 bp |
| 서열번호 13 | S-R | CCAGAGATCGAYAGCCGGACCTC | 61.8 | 5534-5512 | |
| 서열번호 14 | S-P | CCTCTCTGGGATGTGGGCCGGGT | 67.2 | 5475-5497 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 12 및 13의 프라이머 쌍에 의해 사포바이러스의 표적 유전자(캡시드 단백질을 코딩하는 유전자)를 증폭하도록 하였고, 증폭된 표적 유전자 산물과 특이적으로 결합하는 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 특이적 프로브를 구성하였다.
한편, 노로바이러스 GI의 검출을 위한 특이적 프로브들은 5'말단에 HEX를 표지하였고, 노로바이러스 GII의 검출을 위한 특이적 프로브들은 5'말단에 FAM을 표지하였으며, 사포바이러스의 검출을 위한 특이적 프로브는 5'말단에 TAMRA를 표지함으로써, 이들 바이러스의 표적 서열의 증폭산물로부터 검출되는 형광신호의 파장들은 서로 다르게 되어 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 3가지 바이러스의 존재 유무의 검출 및 정량적 분석이 가능한 다중검출이 가능하게 된다.
실시예 3: 합성유전자를 이용한 프라이머 및 프로브 성능 평가
실시예 1에서 준비된 합성유전자(합성된 렌티바이러스)를 이용하여 각각의 바이러스 표적 유전자 서열에 대한 프라이머 및 프로브 조합의 성능을 평가하였다.
리얼 타임 PCR 증폭 실험은 (주)바이오니아의 Exicycler 96 리얼 타임 PCR 장비를 이용하여 수행하였다. 각각의 바이러스 검출을 위한 표적 유전자 서열에 대한 리얼타임 PCR을 수행하기 위한 프라이머 농도는 최종 농도가 500nM, 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브는 최종 농도가 250nM이 되도록 PCR 반응액에 첨가하였다. 또한, 원스톱(One-step) RT qPCR 반응 조성액으로는 써모사이언티픽(Thermo Scientific)사의 AgPath-ID™ One-Step RT-PCR 시약을 사용하였다.
RT qPCR은 45℃에서의 15분간 역전사(reverse transcription) 반응을 수행한 후, 95℃에서 10분간 변성하고 나서 45 사이클로 95℃ 10초, 55℃ 1분 조건을 반복하여 각각의 바이러스 검출을 위한 표적 유전자 서열을 증폭하여 수행되었다. 리얼타임 PCR 증폭반응 시 주형은 실시예 1에서 합성된 렌티바이러스(역가 1.3×1010 copies/mL)를 (주)진올 사의 엑스젠 바이럴 DNA/RNA 미니키트(Exgene viral DNA/RNA mini kit)를 사용하여 추출된 RNA를 사용하되, 10㎕의 합성 렌티바이러스 를 적용하여 100㎕로 용리(elution) 후 10배씩 연속희석한 시료를 5단계로 준비하여 얻은 1㎕의 RNA 주형을 증폭실험에 사용하였다.
또한, 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 프로브는 형광물질 및 소광물질로 이중 표지되는데, 전술한 바와 같이 노로바이러스 GI 유전형 그룹을 검출하는데 사용되는 프로브의 경우에는 5' 말단에 형광 물질인 HEX(최대 흡수파장: 535nm, 최대 방출 파장: 556nm)로 표지하였고, 3' 말단에는 IDT사의 소광물질인 ZEN-IBFQ로 표지하였다. 또한, 노로바이러스 GII 유전형 그룹을 검출하는데 사용되는 프로브의 경우에는 5' 말단에 형광 물질인 FAM(최대 흡수파장: 495nm, 최대 방출 파장: 520nm)으로 표지하였고, 3' 말단에는 IDT사의 소광물질인 ZEN-IBFQ로 표지하였다. 그리고, 사포바이러스를 검출하는데 사용되는 프로브의 경우에는 5' 말단에 형광 물질인 TAMRA(최대 흡수파장: 555nm, 최대 방출 파장: 585nm)로 표지하였고, 3' 말단에는 EBQ로 표지하였다.
한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
리얼타임(real-time) PCR 방법은 이러한 형광물질과 소광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다.
리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 전술한 이중 표지된 프로브에 의해 생기는 형광의 세기가 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 표적 유전자의 초기 주형량(본 발명의 경우 노로바이러스의 GI 유전형 그룹의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열의 카피수, 노로바이러스의 GII 유전형 그룹의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열의 카피수 및 사포바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열의 카피수)을 정확하게 반영한다. 따라서, ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열, 폴리프로테인을 코딩하는 표적 유전자 서열 및 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열을 포함하는 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열, 폴리프로테인을 코딩하는 표적 유전자 서열 및 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열이 존재하는지 여부와 시료 내에 포함된 이들 표적 유전자 서열의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 실시예에서는 노로바이러스의 GI 유전형 그룹의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열, 노로바이러스의 GII 유전형 그룹의 폴리프로테인을 코딩하는 표적 유전자 서열 및 사포바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열을 포함하도록 합성된 렌티바이러스 RNA 주형에 대해 전술한 바와 같은 조성 및 조건으로 리얼 타임 PCR을 수행하였다. 그 결과는 도 1 및 도 2에 도시하였다.
우선, 도 1에서 확인되는 바와 같이, 리얼 타임 PCR 증폭 반응을 통해 노로바이러스의 GI 유전형 그룹 및 노로바이러스의 GII 유전형 그룹을 각각 특이도 및 민감도 높게 검출하도록 설계된 표 1의 프라이머 쌍들과 프로브들은 각각의 바이러스에 특이적인 표적 유전자 서열을 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 표적 유전자 서열의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 1의 프라이머 쌍들과 프로브들의 각 조합을 이용한 리얼타임 PCR 수행 결과, 노로바이러스의 GI 유전형 그룹 및 노로바이러스의 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 모두에 대해 최초 추출된 RNA 시료를 1/105로 희석한 범위까지 민감도 높게 정량검출이 가능함을 확인하였다.
다음으로, 도 2에서 확인되는 바와 같이, 리얼 타임 PCR 증폭 반응을 통해 사포바이러스를 특이도 및 민감도 높게 검출하도록 설계된 표 2의 프라이머 쌍과 프로브는 사포바이러스에 특이적인 표적 유전자 서열을 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 표적 유전자 서열의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 2의 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 리얼타임 PCR 수행 결과, 사포바이러스의 표적 유전자 서열에 대해 최초 추출된 RNA 시료를 1/104로 희석한 범위까지 민감도 높게 정량검출이 가능함을 확인하였다.
따라서, 실시예 2에서 디자인된 표 1 및 표 2의 프라이머 쌍들과 프로브들 은 노로바이러스의 GI 유전형 그룹, 노로바이러스의 GII 유전형 그룹 및 사포바이러스의 검출을 위한 표적 유전자 서열을 유효하게 증폭시키고 민감도 높게 검출할 수 있어 리얼 타임 PCR 증폭 반응을 통한 노로바이러스 및 사포바이러스 검출과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 노로바이러스 및 사포바이러스의 동시검출을 위한 다중 리얼 타임 PCR의 수행
본 실시예에서는 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 노로바이러스의 GI 유전형 그룹, 노로바이러스의 GII 유전형 그룹 및 사포바이러스의 존재 유무를 동시에 검출할 수 있는지를 확인하였고, 형광세기에 기초한 해당 유전자의 정량적 분석이 가능한지 여부도 확인하였다. 실시예 3과 실질적으로 동일하게 리얼타임 PCR 반응을 수행하되 3종의 바이러스의 표적 유전자 서열들에 대한 리얼타임 PCR 증폭조건 중 가장 양호한 결과를 얻은 조건을 적용하였다.
실시예 3에서 설명한 바와 같이, 상기 3종 바이러스를 각각 특이적으로 검출하는 프로브들이 검출대상 바이러스 별로 서로 다른 파장의 형광신호를 나타내는 형광물질로 5'말단이 표지됨으로써, 상기 3종 바이러스의 표적 유전자 서열들의 증폭산물로부터 검출되는 형광신호의 파장들은 서로 다르게 되어 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 상기 3종 바이러스의 표적 유전자 서열들의 존재 유무, 즉 검체 내에 상기 3종 바이러스의 존재 여부를 한번에 검출할 수 있다.
다중 리얼타임 PCR 증폭은 실시예 3에서 설명한 장비, 조성 및 조건에 따라 수행하되 3종 바이러스를 동시에 검출할 수 있도록 하기 위해, 3종 바이러스 각각 을 검출하기 위한 프라이머 쌍과 프로브(들)의 조합들을 모두 PCR 증폭 조성물에 포함시켜 리얼타임 PCR을 수행하였다. 주형은 실시예 1에서 준비한 합성 렌티바이러스에서 추출한 RNA를 사용하였다(1/103으로 희석한 RNA 시료 사용). 그 결과는 도 3에 도시되어 있다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, HEX, FAM 및 TAMRA로부터의 형광신호의 곡선이 유효하게 관찰되었다. 이러한 결과는 3종 바이러스 각각에 특이적인 각각의 프로브가 각 바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물과 특이적으로 결합하여 3가지 파장의 형광신호가 모두 나타나는 것을 의미한다. 즉, 본 발명에 따르면 3종의 바이러스의 표적 유전자 서열 모두를 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 전술한 바와 같은 3종 바이러스 검출을 위한 프라이머 쌍들 및 프로브(들)의 조합들은 3종 바이러스의 신속하고도 정확한 동시 검출에 적합한 것을 알 수 있다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 리얼타임 PCR 분석법을 이용하여 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스가 검체 내에 존재하는지 여부를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 이에 따라 의심 환자의 급성위장관염 유발 바이러스 감염여부를 신뢰도 높게 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 리얼타임 PCR 분석법을 이용하여 초기 증상이 유사한 여러 급성위장관염 의심 환자의 검체로부터 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 및 사포바이러스를 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 노로바이러스 GI, 노로바이러스 GII 또는 사포바이러스 감염 초기에도 소량의 바이러스의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있다.
결국, 본 발명에 따르면, 다양한 유전형에 대해서는 검출이 불가능하여 실제 설사병 증세를 보이는 노로바이러스 감염 환자를 음성으로 진단하는 종래의 설사바이러스 분자진단법의 문제점과, 노로바이러스와 유사한 설사병 증세를 보이는 사포바이러스를 노로바이러스와 동시에 검출할 수 없어 사포바이러스 감염 환자에 대한 치료 및 감염 차단을 조기에 할 수 없고 이에 따라 사포바이러스의 병원 내 전파에 의한 집단 발병을 막을 수 없는 문제점을 해결할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GI-F forward primer
<400> 1
chatgttccg ytggatgcg 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GI-R reverse primer
<400> 2
tccttagacg ccatcatcat ttac 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GI-P1 probe
<400> 3
tggacaggag atcgcratct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GI-P2 probe
<400> 4
tggacaggag accgcgatct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GI-P3 probe
<400> 5
tgggcaggag atcgcaatct 20
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII-F forward primer
<400> 6
cacdtgggag ggcgat 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII-R reverse primer
<400> 7
gtcaytcgac gccatc 16
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII-P1 probe
<400> 8
cattcacaaa aytgggagcc agattgc 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII-P2 probe
<400> 9
cattcacacc ttcgggagca agattgc 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII-P3 probe
<400> 10
cattcacacc gtcgggagcc agattgc 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII-P4 probe
<400> 11
cattcacatt ctcgggagcc agattgc 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sapovirus S-F forward primer
<400> 12
gcttcatccc aacattaacc cgtacac 27
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sapovirus S-R reverse primer
<400> 13
ccagagatcg ayagccggac ctc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sapovirus S-P probe
<400> 14
cctctctggg atgtgggccg ggt 23
<210> 15
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GI genogroup (Reference sequence: KJ196289, Range:
5030~5174)
<400> 15
ggtggcatgg atttttacgt gcccagacaa gagccaatgt tcagatggat gagattctca 60
gatctgagca cgtgggaggg cgatcgcaat ctggctccca gttttgtgaa tgaagatggc 120
gtcgagtgac gccaacccat ctgat 145
<210> 16
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Norovirus GII genogroup (Reference sequence: KF039729, Range:
5010~5433)
<400> 16
tggcaggcca tgttccgctg gatgcgcttc catgacctcg gattgtggac aggagatcgc 60
gatcttctgc ccgaattcgt aaatgatgat ggcgtctaag gacgctacat caagcgtgga 120
tggc 124
<210> 17
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sapovirus (Reference sequence: X86560, Range: 5442~5534)
<400> 17
gcttcatccc aacattaacc cgtacacttc tcacctctct gggatgtggg ccgggtgggg 60
cggtagtttt gaggtccggc tatcgatctc tgg 93
Claims (12)
- 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데(Caliciviridae) 바이러스 검사 키트로서,
노로바이러스 GI 유전형 그룹(Norovirus GI genogroup)의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과,
노로바이러스 GII 유전형 그룹(Norovirus GII genogroup)의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 6 및 7의 프라이머 쌍과,
사포바이러스(Sapovirus)의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열을 증폭하는 서열번호 12 및 13의 프라이머 쌍과,
노로바이러스 GI 유전형 그룹(Norovirus GI genogroup)의 ORF1과 ORF2를 포함하는 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 3 내지 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드들과 이러한 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
노로바이러스 GII 유전형 그룹(Norovirus GII genogroup)의 폴리프로테인(polyprotein)을 코딩하는 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 8 내지 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드들과 이러한 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
사포바이러스(Sapovirus)의 캡시드 단백질을 코딩하는 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하고,
서열번호 3의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 1,2,4,5,6,7,8형, 서열번호 4의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 3형, 서열번호 5의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 9형, 서열번호 8의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 1,2,3,4,10,12,17형, 서열번호 9의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 5,6,7,14형, 서열번호 10의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 15형, 그리고 서열번호 11의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 8형을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트. - 제1항에 있어서,
DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트. - 제2항에 있어서,
상기 표지물질은,
상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과,
상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과,
상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트. - 제3항에 있어서,
상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트. - 제4항에 있어서,
각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하여 1개의 검사 튜브에서 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스를 한번에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 15의 노로바이러스 GI 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 서열번호 16의 노로바이러스 GII 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 및 서열번호 17의 사포바이러스 유전자 서열을 포함하는 단일사슬의 RNA(단, 염기 T 대신 염기 U를 가짐)를 포함하되, 상기 단일사슬의 RNA가 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 양성 표준자를 더 포함하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트. - 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법에 있어서,
검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트를 이용하여, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열을 다중 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 표적 유전자 서열의 증폭 후, 다중 리얼타임 PCR 결과를 확인하여 상기 검체 내의 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이러스 감염 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
서열번호 3의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 1,2,4,5,6,7,8형, 서열번호 4의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 3형, 서열번호 5의 프로브는 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 유전형 9형, 서열번호 8의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 1,2,3,4,10,12,17형, 서열번호 9의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 5,6,7,14형, 서열번호 10의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 15형, 그리고 서열번호 11의 프로브는 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 유전형 8형을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법. - 제7항에 있어서,
증폭 전, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열을 각각 증폭하는 프라이머 쌍과, 증폭되는 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열과 관련하여 표적 유전자 서열 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 다중 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열 각각의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열 각각을 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이러스 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법. - 제8항에 있어서,
상기 표지물질은,
상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과,
상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과,
상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법. - 제9항에 있어서,
상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법. - 제10항에 있어서,
각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하여 1개의 검사 튜브에서 상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹 및 상기 사포바이러스를 한번에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법. - 제8항에 있어서,
상기 노로바이러스 GI 유전형 그룹의 표적 유전자 서열, 상기 노로바이러스 GII 유전형 그룹의 표적 유전자 서열 및 상기 사포바이러스의 표적 유전자 서열의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자는, 서열번호 15의 노로바이러스 GI 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 서열번호 16의 노로바이러스 GII 유전형 그룹(genogroup) 유전자 서열, 및 서열번호 17의 사포바이러스 유전자 서열을 포함하는 단일사슬의 RNA(단, 염기 T 대신 염기 U를 가짐)를 포함하되, 상기 단일사슬의 RNA가 바이러스 캡시드 단백질에 의해서 보호된 합성 렌티바이러스(Lentivirus)인 것을 특징으로 하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 방법.
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