KR101780033B1 - 노로바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 - Google Patents

노로바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real-Time RT-PCR)을 수행하여 국내에서 비세균성 급성위장관염의 원인체로서 알려진 노로바이러스 (Norovirus genogroup Ⅰ,Ⅱ)를 신속 정확하게 검출해 내는 병원성 RNA 검출 방법, 및 검출 키트에 관한 것이다.

Description

노로바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 {Primer and probes for the detection of Norovirus, and detection kits and methods thereof}
본 발명은 노로바이러스를 검출하기 위한 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출키트 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노로바이러스의 검출 뿐 아니라 노로바이러스의 유전형 중 감염성이 높은 GⅠ,GⅡ 유전형을 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출키트 및 방법에 관한 것이다.
노로 바이러스(Norovirus)는 전세계적으로 비세균성 급성위장관염의 원인체로서 알려져 있으며, 음식물이나 물등을 섭취하였을 경우 사람에게 감염성 위장염을 일으키는 장관(腸管)계 바이러스(Enteric virus)의 한 종류 이다. 노로 바이러스는 칼리시 바이러스과(Family Calicivirdae)의 속하는 바이러스로 7.5 ~ 7.5 kb 크기의 signle-stranded RNA genome을 가지며. 3개의 해독틀(open reading frame: ORF)로 구성되어 있다. 노로바이러스는 1968년 미국 오하이오주 노워크(Norwalk) 초등학교에서 발생한 집단식중독 환자의 설사변에서 처음으로 발견하였으며, 그 당시에는 (Norwalk Viruses)라고 하였다. 그 후 유사한 식중독 환자에서 노워크바이러스와 비슷한 바이러스가 계속하여 발견되었으며, 발견된 지역의 이름을 따서 하와이 바이러스, 몽고메리 바이러스, 타운톤 바이러스 등으로 부르게 되었다. 1972년 전자현미경 하에서 그 형태가 밝혀져, 이 바이러스가 바이러스 중에서도 작고 구형을 하고 있던 것에서 원형소체바이러스(small round-structured virus, SRSV)라고도 하였으며, 그 후 비세균성 급성 위장염의 환자로부터 Norwalk virus와 닮은 소형구형바이러스가 잇달아 발견되었기 때문에 일시적으로 유사노워크바이러스(Norwalk-like virus)라고도 부르기도 하였다. 2002년 8워러 국제 바이러스 분류 위원회 (International Committee on Taxonomy of Viruses: ICTV)에서 노로바이러스라는 하나의 명칭으로 통일하였다. 현재는 유전형에 따라 분류된 5가지(GⅠ,GⅡ,GⅢ,GⅣ,GⅤ)의 타입의 노로바이러스 가운데 3가지(GⅠ,GⅡ,GⅣ)가 인체 감염성이 있는 것으로 밝혀졌다(CDC, 2010).
노로 바이러스에 감염 되었을 경우, 오심, 구토, 설사, 복통을 주 증상으로 하고 대부분의 경우 증상은 경미하며 1~2일 지나면 자연 회복된다. 잠복기는 24~48 시간이며, 감염자의 대변 혹은 구토물에 있는 바이러스가 음식이나 물을 오염시키거나 혹은 감염자가 접촉한 물건, 식품 등이 오염되어 이를 먹거나 마시거나 접촉함으로서 바이러스가 입으로 들어오게 된다. 소량의 바이러스만 있어도 쉽게 감염될 수 있을 정도로 쉽게 전파되며, 전염성은 증상의 발현기에 가장 심하며 회복 후 3일에서 최장 2주일까지 유지된다 (질병관리본부 건강정보).
상용화된 노로바이러스 항원 검출용 효소면역검사(Enzyme Immunoassays, EIA) 진단 kit가 개발되어 있으나, 효소면역검사 분석법은 노로바이러스 균주에 따라서 민감도가 달라지는 단점이 있으며, 이 때문에 노로바이러스에 의한 집단발병의 원인규명시 보조적인 수단으로 사용할 수 있지만 진단을 위한 표준프로토콜로 사용하기에는 기술적인 한계를 가지는 것으로 보고되어 있다. 일반적으로 환자의 분변으로부터 바이러스 유전자를 직접 증폭하여 검출하는 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (Real-Time RT-PCR) 방법이 널리 검출진단에 사용된다. 이외에 전자현미경 관찰이나 항체 조사방법 등으로 진단이나 유병률 조사를 수행하기도 한다.
이에 본 발명자는 노로바이러스의 capsid protein 부위의 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 원스텝(Onestep) Real-Time RT-PCR을 이용한 유전자 증폭과정을 통해 GⅠ 및 GⅡ형의 노로바이러스를 각각 검출하는 방법을 사용함으로써 노로바이러스의 유전다 검출 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 노로바이러스의 감염 유무를 판단하기 위한 판별방법을 제공하기 위한 것으로, 보다 상세하게는 노로바이러스의 유전형 중 감염성이 높은 GⅠ과 GⅡ 유전형에 대한 효율적이고도 신뢰도 높은 판별방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 노로바이러스 유전자 검출을 하기 위한 진공 건조 타입의 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노로바이러스의 capsid protein을 전사하는 유전자를 검출 할 수 있는, 서열 번호 1,2 및 3 (이상, 노로바이러스 GⅠ형 특이염기서열) 과 4,5 및 6 (이상, 노로바이러스 GⅡ형 특이염기서열)의 노로바이러스에 특이적인 프라이며, 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 노로바이러스 GⅠ과 GⅡ 유전형 판별용 프라이머 세트, 노로바이러스 GⅠ과 GⅡ 유전형 판별용 프로브 세트 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는, 노로바이러스 GⅠ과 GⅡ 판별용 키트를 제공한다.
노로바이러스는 RNA 바이러스로서 유전자형간의 다양성이 매우 높고, 같은 유전형간에도 매우 많은 수의 아형이 존재하여 유전자 구조내에서 진단에 활용될 안정된 부위를 찾기 어렵다. 이에 본 발명자들은 국내 유행주 및 미국 국립 생명과학 정보 센터(www.ncbi.nim.nih.gov)에 공개된 염기서열을 기반으로 노로바이러스의 유전자 서열 중 진단에 활용할 수 있는 유전자의 상동성이 비교적 높은 부위를 선정하고, 이 부위의 진단용 프라이머를 제작한다. 프라이머는 유전형의 상동성에 따라 혼합된 염기서열로 제작한다.
진단용 프라이머, 프로브는 노로바이러스의 유전자를 검출할 수 있을 뿐 아니라 사람에게 주로 감염되는 두 가지 유전형 GⅠ, GⅡ에 특이적으로 반응할 수 있도록 고안됨으로써 유전자형의 결정도 가능하다. 또한, GⅠ형의 검출을 위한 프라이머, 프로브를 이용하여 GⅡ를 검출 할 수 없고, 반대의 경우에도 검출을 할 수가 없다.
또한 본 발명은 상기 노로바이러스 GⅠ과 GⅡ의 유전자 검출을 위한 진공 건조 타입의 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 노로바이러스 GⅠ과 GⅡ 판별용 키트를 이용하여 노로바이러스의 감염여부 및 유전형을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 노로바이러스 유전자 검출 방법은
i) 노로 바이러스에 감염이나 오염이 되었으리라고 의심되는 사람의 분변가검물, 물, 굴 등으로부터 RNA를 추출한다.
ii) 단계 i)의 바이러스의 핵산을 서열번호 1,2,3,4,5 및 6이 포함되어 있는 진공 건조된 키트를 이용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (Real-Time RT-PCR)을 수행함으로써 핵산을 증폭시키는 단계;
iii) 단계 ii)에서 증폭되는 산물을 실시간 그래프를 통해 확인 하는 단계 및 증폭 산물 중 GⅠ형 노로바이러스에 특이적으로 반응 하는 것, 및 GⅡ형 노로바이러스에 특이적으로 반응 하는 것을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 급성 위장관염의 임상 증상을 유발하는 주요 3종의 바이러스인 로타바이러스, 아스트로바이러스, 노로바이러스 중에서 노로바이러스에서만 특이적으로 반응하고, 특히 사람에게만 감염성이 나타나는 2가지 유전형(GⅠ, GⅡ)에 특이적으로 반응한다. 노로바이러스의 감염 여부를 신속하고 정화하게 확인할 수 있어 장염이나 설사질환과 같은 질병의 진단과 치료에 효과적으로 활용될 수 있다. 또한 사람에게서 감염여부뿐만 아니라 물, 굴등의 환경 검체에서도 노로바이러스의 존재 유무를 확인 할 수 있어 종래의 검사 시간을 단축하며, 사람 및 환경 검체에 함께 사용 할 수 있는 단일키트로, 경비를 현저히 절감할 수 있다.
도1 은 GⅠ형 및 GⅡ형에 특이적인 프라이머, 프로브를 이용하여 본 발명에 따른 Real-Time RT-PCR 수행결과를 나타낸 것이다.
도 2는 GⅠ형 및 GⅡ형의 노로바이러스에 대한 최소검출한계를 본 발명에 따른 Real-Time RT-PCR 수행 후 통계분석을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 GⅠ형 및 GⅡ형으로 본 발명에 따른 Real-Time RT-PCR 키트를 이용한 인체 유래 검체의 적용 실험 결과를 나나낸 것이다.
<실시예 1> 노로바이러스 특이적 프라이머의 설계 및 합성, 키트의 제작
1. 노로바이러스 유전자 검출 및 동정을 위한 프라이머 제작
GⅠ 및 GⅡ형의 노로바이러스의 2가지 유전자형을 검출하고 유전자형을 동정할 수 있는 프라이머를 제작하기 위해 노로바이러스의 유전자 중 capsid protein을 전사하는 부위를 선정하고, 상기 부위의 염기서열을 이용하여 GⅠ형의 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 서열번호 1(Norovirus GⅠ F), 서열번호 2(Norovirus GⅠ R) 로 기재되는 프라이머 및 서열번호 3(Norovirus GⅠ P)로 기재되는 프로브를 제작하였으며, 또한 GⅡ형의 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 서열번호 4(Norovirus GⅡ F), 서열번호 5(Norovirus GⅡ R)로 기재되는 프라이머 및 서열번호 6(Norovirus GⅡ P)로 기재되는 프로브를 제작하여 본 실시예에서 활용하였다(표 1).
유전자형 프라이머 염기서열 위치 서열번호
GⅠ Norovirus GⅠ F 5'CGYTGGATGCGNTTYCATGA 3' 5204 1
Norovirus GⅠ R 5'CTTAGACGCCATCATCATTY 3' 5347 2
Norovirus GⅠ P 5'JOE AGATYGCGATCYCCTGTCCA BHQ1-3' 5314 3
GⅡ Norovirus GⅡ F 5'AICCIATGTTYAGITGGATGAG 3' 5007 4
Norovirus GⅡ R 5'TCGACGCCATCTTCATTCAC 3' 5080 5
Norovirus GⅡ P 5'FAM CACRTGGGAGGGCGATCGCA BHQ1-3' 5044 6
2. 노로바이러스 진단을 위한 키트 제작
상기에서 고안된 프라이머,프로브 세트를 포함한 PCR 프리믹스 조성물을 제조하였으며, 이를 건조하기 위해 20㎕ 반응용 2X용액 10㎕을 수퍼 centra evaporator에서 30분 건조를 상온에서 진공을 걸어서 수행하여 건조 프리믹스를 제작하였다.
<실시예 2> 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 노로바이러스의 탐지
1. RNA 추출
사람에게서 유래된 검체는 다음과 같은 전처리 과정을 거친 후에 RNA를 추출하였다.
1) 분변(Stool)의 경우 멸균한 PBS 9ml에 약 1g 정도의 분변을 넣어준다.
2) 직장도찰(Rectal swab)의 경우 0.5ml의 멸균한 PBS에 면봉에 묻어 있는 분변을 잘씻어 준다.
3) 분변부유액을 약 3분간 Vortex하여 잘 섞어 준다.
4) 3,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 후 파이펫을 이용하여 상층액을 취하여 실험에 사용한다.
(식품의약품안전청 자료 참조)
물이나 굴등의 환경에서 유래된 검체는 식품의약품안전청에서 제시하는 표준 매뉴얼에 따라 전처리를 진행하였다. (http://www.kfda.go.kr/fm/index.do?nMenuCode=106)
바이러스 RNA 추출은 kit에 포함된 방법 등 적절한 실험법에 따라 실시할 수 있으며, 바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검출효율 등을 고려하여 Accuprep® Viral RNA Extraction Kits(K-3033, Bioneer Co., Ltd.,) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.
2. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (Real-Time RT-PCR)
조성물이 모두 첨가되어 건조가 되어 있는 PCR-tube에 내부 양성 물질(Internal positive control, IPC) 1㎕와 DEPC DW를 19㎕, 그리고 시료로부터 추출한 RNA 5㎕를 넣고 잘 혼합하여, spin-down 하였다. IPC는 각 tube마다 나타나는 PCR반응을 확인하기 위하여 사용되었다. PCR machine을 이용하여 PCR 반응을 진행하였으며, 역전사(Reverse Transcription) 반응 후에 실시간 중합효소 연쇄반응이 진행되는 원스텝(One-step) RT-PCR을 진행하였다. 45℃ 에서 30분간 역전사(Reverse Transcription)반응을 진행하고, 이것을 95℃에서 10분간 1차 반응, 95℃ 15초, 56℃ 1분을 45회 반복하여 추출된 RNA를 증폭시켰다.
*키트 주요 구성 성분
역전사 효소(reverse transcriptase)
Tag DNA 중합효소
10X 반응 완충액 (10X reaction buffer)
보관 안정제 (stabilizer)
프라이머(서열번호 1,2,4,5), 프로브(서열번호 3,6) 혼합액
<실시예 3> 노로바이러스 진단용 프라이머의 특이도 검증
상기 실시예 1에서 고안된 프라이머 세트가 검출하고자 하는 특이 유전자형의 노로바이러스에 대한 특이성을 나타내는지 확인하기 위해 시 교차반응을 확인하기 위하여 미국 국립 생명과학 정보 센터에 등록되어 있는 다양한 병원성 세균에 대한 서열 정보를 확인하여 교차반응을 확인하였다. 26종의 병원성 세균의 핵산을 대상으로 각 3반복 시험하여 교차반응성을 확인하였다. 교차반응 확인에 사용한 병원성 세균 및 바이러스 목록은 표2에 표시하였으며, 시험에 사용한 핵산과의 교차반응성은 없는 것으로 나타났다(도 1).
No . Pathogen Norovirus signal IPC Signal No . Pathogen Norovirus signal IPC Signal
1 Bacillus cereus - + 14 Mycobacterium massiliense - +
2 Pseudomona aeruginosa - + 15 Mycoplasma pneumoniae - +
3 Streptococcus agalactiae - + 16 Mycoplasma genitalium - +
4 Vibrio parahaemolyticus - + 17 Ureaplasma urealyticum - +
5 Streptococcus pneumoniae - + 18 Ureaplasma parvum - +
6 Campylobacter jejuni - + 19 Enterococcus faecalis - +
7 Haemophilus influenzae - + 20 Enterococcus feacium - +
8 Mycobacterium smegmatis - + 21 Staphylococcus aureus - +
9 Mycobacterium gordonae - + 22 Citrobacter freundii - +
10 Mycobacterium aubagnense - + 23 Enterobacter aerogenes - +
11 Mycobacterium terrae - + 24 Enterobacter cloacae - +
12 Mycobacterium intracellulare - + 25 Proteus mirabilis - +
13 Pseudomona aeruginosa - + 26 Salmonella Typhi - +
<실시예 4> 노로바이러스 유전자 검출법의 최소검출한계 - Limit of Detection
최소검출한계 (limit of detection, LoD)를 측정하기 위하여 임상검체를 정량하여 이용하였다. 분변 검체로부터 추출한 RNA를 25,000 copies/ml부터 2-fold dilution하여 260 copies/ml까지 6개 농도를 준비하였고, 각 농도 별로 32반복 측정하였다. 측정된 결과값은 probit analysis를 통하여 통계 분석하여, 95% 이상 검출 가능한 최소 농도를 LoD로 설정하였다. 노로바이러스의 경우 배양 및 역가실험을 통한 바이러스 역가 산출이 어려운 관계로 최소 GⅠ: 1,264 copies/ml, GⅡ: 712 copies/ml반응농도 이상의 바이러스의 핵산이 존재해야 하는 것으로 확인되었다(도 2).
<실시예 5> 노로바이러스 임상검체를 이용한 노로바이러스 유전자 검출 및 동정
노로바이러스 감염이 의심되는 인체 유래 검체를 이용하여 본 발명에 따른 노로바이러스 유전자형 특이 프라이머를 적용한 유전자 검출 및 동정을 실시하였다. 실험을 위해 노로바이러스 집단발병사례에서 확보한 124건의 인체 유래 검체를 사용하였고, 인체 유래 검체에서 추출키트를 이용하여 바이러스의 핵산을 추출한 다음 추출한 바이러스의 RNA 5 ㎕ 첨가하였다. 그 결과 124개의 인체 유래 검체 중 GⅠ형은 21개, GⅡ형은 48개, 5개의 검체에서는 GⅠ 및 GⅡ형이 동시에 검출되었다(도 3)
<110> Bioneer Corporation <120> Primer and probes for the detection of Norovirus, and detection kits and methods thereof <130> 1 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Norovirus <400> 1 cttagacgcc atcatcatty 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Norovirus <400> 2 agatygcgat cycctgtcca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Norovirus <400> 3 anccnatgtt yagntggatg ag 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Norovirus <400> 4 tcgacgccat cttcattcac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Norovirus <400> 5 cacrtgggag ggcgatcgca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Norovirus <400> 6 agatygcgat cycctgtcca 20

Claims (10)

  1. GI형 노로바이러스를 검출하기 위한, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브; 및
    GII형 노로바이러스를 검출하기 위한, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는, 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하기 위한 노로바이러스 검출용 키트.
  2. 청구항 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머는 정방향 프라이머이며, 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머는 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는, 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하기 위한 노로바이러스 검출용 키트.
  3. 청구항 1항에 있어서,
    상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브 및 상기 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브는 형광, 인광 또는 방사성 물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브인, 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하기 위한 노로바이러스 검출용 키트.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 키트에 역전사효소, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 보관 안정제 중 하나이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하기 위한 노로바이러스 검출용 키트.
  5. 삭제
  6. 청구항 1항에 있어서,
    서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브와 각각 상동인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하기 위한 노로바이러스 검출용 키트.
  7. 청구항 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 진공 건조 방법을 이용하여 제작된 것을 특징으로 하는 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하기 위한 노로바이러스 검출용 키트.
  8. 삭제
  9. 원스텝(One step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 이용하여, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 이용하여 노로바이러스 GⅠ형을 검출하고,
    서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브 이용하여 노로바이러스 GⅡ형을 검출하는 것을 특징으로 하는, 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 노로바이러스 RNA 검출 방법.
  10. 청구항 9항에 있어서,
    상기 검출방법은 환자의 분변가검물, 물 및 굴을 포함하는 환경검체로부터 핵산을 추출하여 바이러스 RNA를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 원스텝(one-step) 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 노로바이러스 RNA 검출 방법.


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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101856097B1 (ko) * 2014-11-28 2018-05-10 가톨릭대학교 산학협력단 바이러스 검출용 프로브
KR20170035562A (ko) 2015-09-23 2017-03-31 윤현규 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법
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CN112226539A (zh) * 2020-10-29 2021-01-15 上海伯杰医疗科技有限公司 一种诺如病毒核酸检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100818275B1 (ko) 2006-09-26 2008-03-31 삼성전자주식회사 노로바이러스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트,노로바이러스의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여노로바이러스의 존재를 검출하는 방법
JP2011078358A (ja) 2009-10-07 2011-04-21 Kyushu Univ ノロウイルスの検出方法
JP4898210B2 (ja) 2005-08-09 2012-03-14 株式会社ビー・エム・エル サポウイルスの検出方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090131468A (ko) * 2008-06-18 2009-12-29 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 노로바이러스 검출을 위한 프라이머 및 상기 프라이머를포함하는 노로바이러스 유전자 검출 및 유전자형 동정방법
WO2010137873A2 (ko) * 2009-05-26 2010-12-02 (주)바이오니아 신종 인플루엔자 a형 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 진단 방법
KR20120076154A (ko) * 2010-12-29 2012-07-09 서울대학교산학협력단 노로바이러스 검출을 위한 ｒｔ-ｐｃｒ용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4898210B2 (ja) 2005-08-09 2012-03-14 株式会社ビー・エム・エル サポウイルスの検出方法
KR100818275B1 (ko) 2006-09-26 2008-03-31 삼성전자주식회사 노로바이러스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트,노로바이러스의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여노로바이러스의 존재를 검출하는 방법
JP2011078358A (ja) 2009-10-07 2011-04-21 Kyushu Univ ノロウイルスの検出方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hoehne M et al., BMC Infectious Diseases, Vol.6:69, (2006. 4. 10.)
Ishida S, et al., J. Med. Virol., Vol. 80, No. 5, pp. 913-920 (2008. 3. 21.)*
Jothikumar N et al., Appl Environ Microbiol. 71(4): 1870-1875. (2005. 4.)

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