KR20220162823A - Fgfr 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 데 있어서 fgfr 돌연변이 유전자 패널의 사용 - Google Patents
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Abstract
섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 방법 및 암 환자를 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 방법은 환자의 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이 유전자의 존재를 확인하기 위한 키트 및 프라이머가 또한 본 명세서에 개시되어 있다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 개시 내용이 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함되는, 2014년 9월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/056,159호의 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2015년 8월 6일자로 생성된 상기 ASCII의 사본은 103693.000782_SL.txt로 명명되며, 크기가 66,185 바이트이다.
기술분야
섬유아세포 성장 인자 수용체 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 방법 및 이를 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
유전자 이상의 확인은 암 환자에게 적절한 치료법(들)을 선택하는 데 유용할 수 있다. 이는 또한 암 유형에 대한 주요 치료 옵션 (1차 치료(front-line therapy))에 실패한 암 환자에게, 특히 2차 치료 및 후속 치료에 대한 허용되는 치료 기준이 없는 경우에 유용하다. 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR)는 세포 생존, 증식, 이동 및 분화를 조절하는 데 관여하는 수용체 티로신 키나제의 패밀리이다. FGFR 변형이 일부 암에서 관찰되었다. 현재까지, FGFR 변형을 가진 환자에게 효과가 있는 승인된 치료법은 존재하지 않는다.
섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 방법으로서, FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터 FGFR 돌연변이에 대한 환자의 생물학적 샘플을 평가하는 단계 (여기서, FGFR 돌연변이가 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이고, 상기 평가하는 단계는 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함함); 및 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계 (여기서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것임을 나타냄)를 포함하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다.
FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 환자의 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제로 치료하는 단계를 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법이 또한 개시되어 있다.
생물학적 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이 유전자의 존재를 확인하기 위한 키트 및 프라이머가 본 명세서에 추가로 제공된다.
발명의 내용 및 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 읽을 경우 더 이해된다. 개시된 방법, 키트, 및 프라이머를 설명하기 위해 도면에 방법, 키트, 및 프라이머의 예시적인 실시 형태가 도시되어 있지만, 방법, 키트, 및 프라이머는 개시된 특정 실시 형태에 한정되지 않는다. 도면에서:
도 1은 FGFR 융합 유전자의 도면이며, 이중 적어도 하나의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것을 나타낸다. 또한 융합 유전자를 증폭시키기 위한 예시적인 프라이머 위치 (작은 화살표)가 도시되어 있다.
도 2a 내지 도 2i를 포함하는 도 2는 a) FGFR3:TACC3 v1; b) FGFR3:TACC3 v3; c) FGFR3:TACC3 인트론; d) FGFR3:BAIAP2L1; e) FGFR2:AFF3; f) FGFR2:BICC1; g) FGFR2:CASP7; h) FGFR2:CCDC6; 및 i) FGFR2:OFD1에 대해 양성인 FFPET 샘플의 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)의 결과를 나타낸다.
도 3은 3' 다이데옥시 야생형 (WT) 차단제 올리고뉴클레오티드를 사용하는 SNP-특이적 qRT-PCR에 대한 예시적인 전략을 도시한다.
도 4는 FGFR SNP를 검출하기 위한 예시적인 분석적 검증 전략을 도시한다. 실험을 FGFR 융합체를 발현하고 FGFR3/FGFR2 융합체를 함유하지 않는 야생형 세포주로 희석된, 유전자조작된 RK3E 세포주에서 수행하였다.
도 5a 내지 도 5d를 포함하는 도 5는 (a) G370C, (b) Y373C, (c) S249C, 및 (d) R248C에 대한 다이데옥시 WT 차단제를 사용한 SNP-특이적 PCR을 도시한다.
도 6a 내지 도 6i를 포함하는 도 6은 하기 FGFR 융합 유전자 분석에 대한 효율 표준 곡선을 나타낸다: a) FGFR3:TACC3 v1; b) FGFR3:TACC3 v3; c) FGFR3:TACC3 인트론; d) FGFR3:BAIAP2L1; e) FGFR2:AFF3; f) FGFR2:BICC1; g) FGFR2:CASP7; h) FGFR2:CCDC6; 및 i) FGFR2:OFD1에 대해 양성인 FFPET 샘플의 생어 시퀀싱의 결과를 나타낸다.
도 7은 방광암(원발성 및 전이성), NSCLC (선암 및 편평상피), 난소암, 식도암 (원발성 및 전이성), 경두부암 (H&N; 원발성 및 전이성), 자궁내막암 (전이성), 유방암 및 전립선암에서의 FGFR 융합 유전자 상태의 예시적인 표현이다.
도 8은 NSCLC 선암 및 편평상피세포암에서의 FGFR 융합 유전자 및 돌연변이 상태의 예시적인 표현이다.
도 9a 내지 도 9d를 포함하는 도 9는 I상 환자 샘플의 예시적인 결과를 나타낸다. 합성 주형 분석 대조군 (ST), GAPDH (품질 대조군 샘플)에 대한 프라이머 또는 하기에 특이적인 프라이머를 사용하여 분석을 수행하였다: a) FGFR2:BICC1 융합체; b) FGFR3:TACC3 (엑손 18:엑손 1) 융합체; c) FGFR2:CCDC6 융합체; 또는 d) FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3 또는 FGFR2:CCDC6 융합체. 환자 샘플은 다음과 같다: A - 요로상피세포암종; B - 방광암; C - 담관암; 및 D - 신장 암종.
도 10은 진행성 고형 종양 환자에서 JNJ-42756493의 첫 임상 적용 연구를 위한 예시적인 I상 연구 계획를 나타낸다.
도 11은 6 mg 이상의 용량 수준을 갖는 기준선으로부터 표적화된 병변의 직경의 합의 감소를 최대 억제 백분율로 나타낸 것이다. 고형 종양 환자를 매일 투여 요법 또는 간헐적 투여 요법 (7일 온- 7일 오프)으로서 상이한 용량으로 투여되는 FGFR 억제제 JNJ-42756493으로 치료하였다. 용량 및 종양 유형을 나타낸다. RECIST 기준에 따라 종양의 감소를 측정하였다. 종양이 FGFR 유전자 전좌 및 돌연변이를 함유하는 환자는 FGFR 억제제 JNJ-42756493에 더 민감한 것으로 보인다.
도 12는 제시된 FGFR 융합체로 안정하게 형질감염된 RK3E 세포에서의 다양한 FGFR 융합체의 발현을 도시한다.
도 13a 및 13b를 포함하는 도 13은 제시된 FGFR 융합체로 안정하게 형질감염된 RK3E 세포에서의 콜로니 형성의 분석을 도시한다. (a) 0.1% 크레실 크리스탈 바이올렛 염색된 6-웰 챔버 및 (b) 콜로니 수/플레이팅된 100개의 세포를 도시하는 막대 그래프. 결과는 두 개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 14a 내지 도 14h를 포함하는 도 14는 제시된 FGFR 융합체로 안정하게 형질감염된 RK3E 세포에서의 예시적인 하류 표적의 발현을 예시한다.
도 1은 FGFR 융합 유전자의 도면이며, 이중 적어도 하나의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것을 나타낸다. 또한 융합 유전자를 증폭시키기 위한 예시적인 프라이머 위치 (작은 화살표)가 도시되어 있다.
도 2a 내지 도 2i를 포함하는 도 2는 a) FGFR3:TACC3 v1; b) FGFR3:TACC3 v3; c) FGFR3:TACC3 인트론; d) FGFR3:BAIAP2L1; e) FGFR2:AFF3; f) FGFR2:BICC1; g) FGFR2:CASP7; h) FGFR2:CCDC6; 및 i) FGFR2:OFD1에 대해 양성인 FFPET 샘플의 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)의 결과를 나타낸다.
도 3은 3' 다이데옥시 야생형 (WT) 차단제 올리고뉴클레오티드를 사용하는 SNP-특이적 qRT-PCR에 대한 예시적인 전략을 도시한다.
도 4는 FGFR SNP를 검출하기 위한 예시적인 분석적 검증 전략을 도시한다. 실험을 FGFR 융합체를 발현하고 FGFR3/FGFR2 융합체를 함유하지 않는 야생형 세포주로 희석된, 유전자조작된 RK3E 세포주에서 수행하였다.
도 5a 내지 도 5d를 포함하는 도 5는 (a) G370C, (b) Y373C, (c) S249C, 및 (d) R248C에 대한 다이데옥시 WT 차단제를 사용한 SNP-특이적 PCR을 도시한다.
도 6a 내지 도 6i를 포함하는 도 6은 하기 FGFR 융합 유전자 분석에 대한 효율 표준 곡선을 나타낸다: a) FGFR3:TACC3 v1; b) FGFR3:TACC3 v3; c) FGFR3:TACC3 인트론; d) FGFR3:BAIAP2L1; e) FGFR2:AFF3; f) FGFR2:BICC1; g) FGFR2:CASP7; h) FGFR2:CCDC6; 및 i) FGFR2:OFD1에 대해 양성인 FFPET 샘플의 생어 시퀀싱의 결과를 나타낸다.
도 7은 방광암(원발성 및 전이성), NSCLC (선암 및 편평상피), 난소암, 식도암 (원발성 및 전이성), 경두부암 (H&N; 원발성 및 전이성), 자궁내막암 (전이성), 유방암 및 전립선암에서의 FGFR 융합 유전자 상태의 예시적인 표현이다.
도 8은 NSCLC 선암 및 편평상피세포암에서의 FGFR 융합 유전자 및 돌연변이 상태의 예시적인 표현이다.
도 9a 내지 도 9d를 포함하는 도 9는 I상 환자 샘플의 예시적인 결과를 나타낸다. 합성 주형 분석 대조군 (ST), GAPDH (품질 대조군 샘플)에 대한 프라이머 또는 하기에 특이적인 프라이머를 사용하여 분석을 수행하였다: a) FGFR2:BICC1 융합체; b) FGFR3:TACC3 (엑손 18:엑손 1) 융합체; c) FGFR2:CCDC6 융합체; 또는 d) FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3 또는 FGFR2:CCDC6 융합체. 환자 샘플은 다음과 같다: A - 요로상피세포암종; B - 방광암; C - 담관암; 및 D - 신장 암종.
도 10은 진행성 고형 종양 환자에서 JNJ-42756493의 첫 임상 적용 연구를 위한 예시적인 I상 연구 계획를 나타낸다.
도 11은 6 mg 이상의 용량 수준을 갖는 기준선으로부터 표적화된 병변의 직경의 합의 감소를 최대 억제 백분율로 나타낸 것이다. 고형 종양 환자를 매일 투여 요법 또는 간헐적 투여 요법 (7일 온- 7일 오프)으로서 상이한 용량으로 투여되는 FGFR 억제제 JNJ-42756493으로 치료하였다. 용량 및 종양 유형을 나타낸다. RECIST 기준에 따라 종양의 감소를 측정하였다. 종양이 FGFR 유전자 전좌 및 돌연변이를 함유하는 환자는 FGFR 억제제 JNJ-42756493에 더 민감한 것으로 보인다.
도 12는 제시된 FGFR 융합체로 안정하게 형질감염된 RK3E 세포에서의 다양한 FGFR 융합체의 발현을 도시한다.
도 13a 및 13b를 포함하는 도 13은 제시된 FGFR 융합체로 안정하게 형질감염된 RK3E 세포에서의 콜로니 형성의 분석을 도시한다. (a) 0.1% 크레실 크리스탈 바이올렛 염색된 6-웰 챔버 및 (b) 콜로니 수/플레이팅된 100개의 세포를 도시하는 막대 그래프. 결과는 두 개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 14a 내지 도 14h를 포함하는 도 14는 제시된 FGFR 융합체로 안정하게 형질감염된 RK3E 세포에서의 예시적인 하류 표적의 발현을 예시한다.
예시적인 실시 형태의 상세한 설명
개시된 방법, 키트 및 프라이머는 본 개시 내용의 일부를 형성하는 첨부 도면과 관련하여 취해지는 하기 상세한 설명을 참조하여 더욱 용이하게 이해될 수 있다. 개시된 방법, 키트 및 프라이머는 본 명세서에 기술되고/되거나 도시된 특정 방법, 키트 및 프라이머로 제한되지 않으며, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시 형태를 단지 예로서 기술하기 위한 것으로, 청구된 방법, 키트 및 프라이머를 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 특정 수치 값에 대한 언급은 적어도 특정 값을 포함한다. 값의 범위가 표현되는 경우, 다른 실시 형태는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 또한, 범위로 기술된 값에 대한 언급은 그 범위 내의 각각의 그리고 모든 값을 포함한다. 모든 범위는 포괄적이며 조합가능하다.
명료함을 위해서 본 명세서에 개별적인 실시 형태의 문맥에서 기술된 개시된 방법, 키트 및 프라이머의 소정 특징부가 단일 실시 형태에서 조합되어 제공될 수도 있음을 인식하여야 한다. 역으로, 간결함을 위해 단일 실시 형태의 문맥에서 기술된 개시된 방법, 키트, 및 프라이머의 다양한 특징부가 개별적으로 또는 임의의 하위 조합으로 제공될 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a," "an," 및 "the")은 복수를 포함한다.
하기 약어가 명세서 전체에 걸쳐 사용된다: FGFR (섬유아세포 성장 인자 수용체); LLOQ (정량의 하한); FGFR3:TACC3 (FGFR3 및 형질전환 산성 코일형-코일 함유 단백질(transforming acidic coiled-coil containing protein) 3을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FGFR3:BAIAP2L1 (FGFR3 및 뇌-특이적 혈관신생 억제제 1-관련 단백질 2-유사 단백질(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2-like protein) 1을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FGFR2:AFF3 (FGFR2 및 AF4/FMR2 패밀리, 멤버 3을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FGFR2:BICC1 (FGFR2 및 비카우달(bicaudal) C 상동체(homolog) 1을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FGFR2: CASP7 (FGFR2 및 카스파제 7을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FGFR2:CCDC6 (FGFR2 및 코일형-코일 도메인 함유 6을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FGFR2:OFD1 (FGFR2 및 입-얼굴-손발가락 증후군(oral-facial-digital syndrome) 1을 암호화하는 유전자 사이의 융합); FFPET (포르말린-고정되고 파라핀-포매된 조직(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue)); SNP (단일 뉴클레오티드 다형성); NSCLC (비소세포 폐암), ct (사이클 역치(cycle threshold)).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료하는" 및 이와 유사한 용어는 암 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키는 것, 암 증상 및/또는 상기 증상의 근본적인 원인을 제거하는 것, 암 증상 및/또는 그들의 근본적인 원인의 빈도 또는 가능성을 감소시키는 것, 및 암에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 야기된 손상을 개선하거나 치료하는(remediating) 것을 말한다.
"생물학적 샘플"은 암 세포를 얻을 수 있고 RNA가 단리될 수 있는 환자로부터의 임의의 샘플을 말한다. 적합한 생물학적 샘플은 혈액, 림프액, 골수, 고형 종양 샘플 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 FFPET일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "예비-증폭"은 증폭 단계를 위한 주형 cDNA의 양을 증가시키기 위해 증폭 단계 전에 수행되는 PCR 절차를 말한다. 예를 들어, 택맨(TaqMan)® 예비증폭 마스터 믹스(PreAmp Master Mix) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)/어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)® 상품 # 4391128)을 사용하는 예비-증폭 단계가 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭시키는," "증폭시키다" 및 이와 유사한 용어는 핵산 샘플의 다수의 동일한 카피의 생성을 말한다. 핵산 샘플을 증폭하기 위한 적합한 기술에는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 증폭 단계는 RT-PCR을 포함한다.
FGFR 돌연변이
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "FGFR 돌연변이"는 FGFR 융합 유전자, FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 둘 모두를 말한다.
"FGFR 융합" 또는 "FGFR 융합 유전자"는 FGFR (예를 들어, FGRF2 또는 FGFR3) 또는 이들의 일부를 암호화하는 유전자, 및 2개의 유전자 사이의 전좌에 의해 생성된, 본 명세서에 개시된 융합 파트너 또는 이들의 일부 중 하나를 말한다. 환자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 하기 FGFR 융합 유전자의 존재는 하기 개시된 방법을 사용하여 결정될 수 있다: FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR2:OFD1 또는 이들의 임의의 조합. 표 1은 FGFR 융합 유전자 및 융합되는 FGFR 및 융합 파트너 엑손을 제공한다. 도 1은 다양한 FGFR 융합 유전자의 예시를 제공한다. 개별 FGFR 융합 유전자의 서열이 표 16에 개시되어 있다.
[표 1]
"FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성" (SNP)은 단일 뉴클레오티드가 개체마다 다른 FGFR2 또는 FGFR3 유전자를 말한다. 특히, "FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성" (SNP)은 단일 뉴클레오티드 개체마다 다른 FGFR3 유전자를 말한다. 환자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 하기 FGFR SNP의 존재는 하기 개시된 방법을 사용하여 결정될 수 있다: FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합. FGFR SNP의 서열이 표 2에 제공된다.
[표 2]
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "FGFR 돌연변이 유전자 패널"은 하나 이상의 상기 열거된 FGFR 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 유전자 패널은 환자의 암 유형에 좌우된다.
개시된 방법의 평가 단계에서 사용되는 FGFR 돌연변이 패널은 부분적으로 환자의 암 유형에 기초한다. 방광암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
전이성 방광암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
난소암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
두경부암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
전이성 두경부암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7 또는 FGFR2:OFD1 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
식도암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR2:BICC1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
전이성 식도암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
비소세포 폐 선암종 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
비소세포 폐 편평상피세포암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
전이성 자궁내막암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6 또는 FGFR2:OFD1 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
유방암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
FGFR 돌연변이를 증폭시키기 위한 프라이머
핵산의 증폭에 증폭하고자 하는 영역의 측면에 위치하는(flank) 핵산 가닥의 5' 및 3' 영역에 상보적이며 이에 결합하는 프라이머가 필요하다는 것을 당업자는 알고 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프라이머 쌍"은 증폭 단계에서 사용된 정방향 및 역방향 프라이머를 말한다. 개시된 방법을 수행하기에 적합한 프라이머의 쌍을 표 3에 열거한다.
[표 3]
서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 서열 번호:26, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열을 갖는 프라이머가 본 명세서에 개시되어 있다.
서열 번호:5 및 서열 번호:6, 서열 번호:7 및 서열 번호:8, 서열 번호:9 및 서열 번호:10, 서열 번호:11 및 서열 번호:12, 서열 번호:13 및 서열 번호:14, 서열 번호:15 및 서열 번호:16, 서열 번호:17 및 서열 번호:18, 서열 번호:19 및 서열 번호:20, 서열 번호:21 및 서열 번호:22, 서열 번호:23 및 서열 번호:24, 서열 번호:25 및 서열 번호:26, 서열 번호:27 및 서열 번호:28, 서열 번호:29 및 서열 번호:30, 서열 번호:31 및 서열 번호:32, 서열 번호:33 및 서열 번호:34, 서열 번호:35 및 서열 번호:36, 서열 번호:37 및 서열 번호:38 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 갖는 프라이머의 세트가 또한 본 명세서에 개시되어 있다.
일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:5 및 서열 번호:6의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:7 및 서열 번호:8의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:9 및 서열 번호:10의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:11 및 서열 번호:12의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:13 및 서열 번호:14의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:15 및 서열 번호:16의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:17 및 서열 번호:18의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:19 및 서열 번호:20의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:21 및 서열 번호:22의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:23 및 서열 번호:24의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:25 및 서열 번호:26의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:27 및 서열 번호:28의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:29 및 서열 번호:30의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:31 및 서열 번호:32의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:33 및 서열 번호:34의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:35 및 서열 번호:36의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 서열 번호:37 및 서열 번호:38의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 세트는 상기 프라이머 세트의 임의의 조합의 서열을 가질 수 있다.
개시된 방법에서 사용하기 위한 FGFR 억제제
개시된 방법에 사용하기에 적합한 FGFR 억제제가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 미국 특허 출원 공개 제2013/0072457 A1 (본 명세서에 참조로 포함됨)에 개시된 FGFR 억제제 (이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체를 포함함), 및 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물로 치료할 수 있다 (적합한 R 기가 또한 미국 특허 출원 공개 제2013/0072457 A1호에 개시되어 있음). 예를 들어, 일부 측면에서, 환자를 N-(3,5-다이메톡시페닐)-N'-(1-메틸에틸)-N-[3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)퀴녹살린-6-일]에탄-1,2-다이아민 (이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함) (본 명세서에서 "JNJ-42756493" 또는 "JNJ493"으로 지칭함)으로 치료할 수 있다:
일부 측면에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 HCl 염이다. 일부 측면에서, 환자를 JNJ493 염기로 치료할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체를 포함함), 및 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물로 치료할 수 있는데, 이때 문헌[Gavine, P.R., et al., AZD4547: An Orally Bioavailable, Potent, and Selective Inhibitor of the Fibroblast Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Family, Cancer Res. April 15, 2012 72; 2045:]에 기재된 바와 같이, FGFR 억제제는 N-[5-[2-(3,5-다이메톡시페닐)에틸]-2H-피라졸-3-일]-4-(3,5- 다이메틸피페라진-1-일)벤즈아미드 (AZD4547)이다:
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체를 포함함), 및 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 국제 특허 공개 제WO2006/000420호에 기재된 바와 같이, 3-(2,6- 다이클로로-3,5-다이메톡시-페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리미드-4-일}-1-메틸-우레아 (NVP-BGJ398)이다:
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체를 포함함), 및 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 국제 특허 공개 제WO2006/127926호에 기재된 바와 같이, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸피페라진-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-1H-퀴놀린-2-온 (도비티닙(dovitinib))이다:
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체를 포함함), 및 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 문헌[Bello, E. et al., E-3810 Is a Potent Dual Inhibitor of VEGFR and FGFR that Exerts Antitumor Activity in Multiple Preclinical Models, Cancer Res February 15, 2011 71(A)1396-1405] 및 국제 특허 공개 제WO2008/112408호에 기재된 바와 같이, 6-(7-((1-아미노사이클로프로필)-메톡시)-6-메톡시퀴놀린-4-일옥시)-N-메틸-1-나프트아미드 (AL3810) (루시타닙(lucitanib); E-3810)이다:
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 WO2013/076186에 기재된 바와 같은 항-FGFR2 항체이다.
추가로 적합한 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이들의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이들의 N-옥사이드, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 용매화물을 포함함)에는 BAY1163877 (바이엘(Bayer)), BAY1179470 (바이엘), TAS-120 (타이호(Taiho)), ARQ087 (아큘(ArQule)), ASP5878 (아스텔라스(Astellas)), FF284 (추가이(Chugai)), FP-1039 (GSK/파이브프라임(FivePrime)), 블루프린트(Blueprint), LY-2874455 (릴리(Lilly)), RG-7444 (로슈(Roche)) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 BAY1163877 (바이엘)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 BAY1179470 (바이엘)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 TAS-120 (타이호)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 ARQ087 (아큘)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 ASP5878 (아스텔라스)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 FF284 (추가이)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 FP-1039 (GSK/파이브프라임)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 블루프린트이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 LY-2874455 (릴리)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제 (화학적으로 가능한 경우, 이의 임의의 토토머 또는 입체화학적 이성질체, 이의 N-옥사이드, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물을 포함함)로 치료할 수 있는데, 이때 FGFR 억제제는 RG-7444 (로슈)이다.
염은 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002]에 기재된 방법과 같은 종래의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 부분을 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 수중 또는 유기 용매 중 또는 이 둘의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 비수성 매체, 예컨대 에테르, 아세트산에틸, 에탄올, 아이소프로판올 또는 아세토니트릴이 사용된다. 개시된 방법에 사용하기 위한 FGFR 억제제는 염이 형성되는 산의 pKa에 따라 모노- 또는 다이-염으로 존재할 수 있다.
산 부가염은 매우 다양한 무기 산 및 유기 산으로 형성될 수 있다. 산 부가염의 예에는 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산 (예를 들어, L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-술폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 시클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이술폰산, 에탄술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산 (예를 들어, D-글루쿠론산), 글루탐산 (예를 들어, L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 이세티온산, 락트산 (예를 들어, (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄술폰산, 나프탈렌술폰산 (예를 들어, 나프탈렌-2-술폰산), 나프탈렌-1,5-디술폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, L-피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, 톨루엔술폰산 (예를 들어, p-톨루엔술폰산), 운데실렌산 및 발레르산 뿐만 아니라 아실화 아미노산 및 양이온 교환 수지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 산으로 형성된 염이 포함된다.
염의 하나의 특정 군은 아세트산, 염산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 숙신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산 (메실레이트), 에탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 발레르산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성된 염으로 이루어진다. 산 부가염의 또 다른 군은 아세트산, 아디프산, 아스코르브산, 아스파르트산, 시트르산, DL-락트산, 푸마르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 히푸르산, 염산, 글루탐산, DL-말산, 메탄술폰산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산 및 타르타르산으로부터 형성된 염을 포함한다.
화합물이 음이온성이거나 음이온성일 수 있는 작용기 (예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있음)를 갖는 경우, 염은 적합한 양이온으로 형성될 수 있다 적합한 무기 양이온의 예에는 알칼리 금속 이온, 예컨대 Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+, 및 다른 양이온, 예컨대 Al3+가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예에는 암모늄 이온 (즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온 (예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 다이에틸아민, 다이사이클로헥실아민, 트라이에틸아민, 부틸아민, 에틸렌다이아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민 뿐만 아니라 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌으로부터 유래된 이온이다. 통상의 4차 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
화합물이 아민 작용기를 함유하는 경우에, 이는, 예를 들어, 당업자에게 널리 알려져 있는 방법에 따른 알킬화제와의 반응에 의해 4차 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4차 암모늄 화합물은 개시된 화합물의 범주 내에 있다. 아민 작용기를 함유하는 화합물은 또한 N-옥사이드를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 아민 작용기를 함유하는 화합물에 대한 지칭은 또한 N-옥사이드를 포함한다. 화합물이 여러 개의 아민 작용기를 함유하는 경우, 1개 또는 1개 초과의 질소 원자를 산화시켜 N-옥사이드를 형성할 수 있다. N-옥사이드의 특정한 예는 3차 아민 또는 질소-함유 헤테로사이클의 질소 원자의 N-옥사이드이다. N-옥사이드는 상응하는 아민을 산화제, 예컨대 과산화수소 또는 과산 (예를 들어 퍼옥시카르복실산)으로 처리하여 형성될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages]을 참조한다. 특히, N-옥사이드는 아민 화합물을, 예를 들어, 다이클로로메탄과 같은 불활성 용매 중에서 m-클로로퍼옥시벤조산 (MCPBA)과 반응시키는 문헌 [L. W. Deady (Syn. Comm. (1977), 7, 509-514)]의 절차에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용매화물"은 화합물과 하나 이상의 용매 분자와의 물리적 회합을 의미한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 비롯한 다양한 정도의 이온 결합 및 공유 결합을 포함한다. 특정 경우에, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자가 결정질 고체의 결정 격자에 혼입되는 경우에, 용매화물은 단리가능할 것이다. 용어 "용매화물"은 용액-상 및 단리가능한 용매화물을 포괄하는 것으로 의도된다. 적합한 용매화물의 비제한적 예에는 물, 아이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 아세트산에틸, 아세트산, 에탄올아민 등과 조합된 개시된 화합물이 포함된다. 화합물은 용액 중에 있는 동안에 이의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
용매화물은 제약 화학 분야에 널리 알려져 있다. 이들은 물질의 제조 방법 (예를 들어, 물질의 정제), 물질의 저장 (예를 들어, 이의 안정성) 및 물질의 취급 용이성에 있어서 중요할 수 있으며, 종종 화학적 합성의 단리 또는 정제 단계의 일부로서 형성된다. 당업자는, 주어진 화합물을 제조하기 위해 사용된 단리 조건 또는 정제 조건에 의해 수화물 또는 다른 용매화물이 형성되었는지를 표준 기술 및 장기간 사용되어 온 기술에 의해 결정할 수 있다. 이러한 기술의 예는 열중량 분석 (TGA), 시차 주사 열량측정법 (DSC), X선 결정학 (예를 들어, 단결정 X선 결정학 또는 X선 분말 회절) 및 고체 상태 NMR (SS-NMR, 매직 각 스피닝(Magic Angle Spinning) NMR 또는 MAS-NMR로도 공지되어 있음)을 포함한다. 이러한 기술은 NMR, IR, HPLC 및 MS와 같이 숙련된 화학자의 표준 분석 툴키트의 일부이다. 대안적으로, 당업자는 특정한 용매화물에 필요한 양의 용매를 포함하는 결정화 조건을 사용하여 의도적으로 용매화물을 형성할 수 있다. 이후, 상기 기재된 표준 방법을 사용하여 용매화물이 형성되었는지 여부를 확립할 수 있다. 또한 FGFR 억제제의 임의의 복합체 (예를 들어, 포접 복합체(inclusion complex) 또는 사이클로덱스트린과 같은 화합물과의 내포 화합물(clathrate) 또는 금속과의 착물)가 포함된다.
또한, 화합물은 하나 이상의 다형체 (결정질) 또는 무정형 형태를 가질 수 있다.
화합물은 하나 이상의 동위원소 치환을 갖는 화합물을 포함하며, 특정 요소에 대한 언급은 상기 원소의 모든 동위원소를 이의 범주 내에 포함한다. 예를 들어, 수소에 대한 언급은 1H, 2H (D), 및 3H (T)를 이의 범주 내에 포함한다. 유사하게, 탄소 및 산소에 대한 언급은 12C, 13C 및 14C 및 16O 및 18O를 각각 이들의 범위 내에 포함한다. 동위원소는 방사성 또는 비방사성일 수 있다. 일 실시 형태에서, 화합물은 방사성 동위원소를 함유하지 않는다. 이러한 화합물이 치료 용도에 바람직하다. 그러나, 다른 실시 형태에서, 화합물은 하나 이상의 방사성 동위원소를 함유할 수 있다. 이러한 방사성 동위원소를 함유하는 화합물은 진단학적 측면에서 유용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물로 치료하며, 이때 FGFR 억제제는 N-(3,5-다이메톡시페닐)-N'-(1-메틸에틸)-N-[3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)퀴녹살린-6-일]에탄-1,2-다이아민이다 (본 명세서에서 "JNJ-42756493"로도 지칭함).
환자의 암을 치료하는 방법
환자의 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가하는 단계; 및 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 FGFR 억제제로 치료하는 단계를 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다.
개시된 방법을 사용하여, 방광암, 전이성 방광암, 난소암, 두경부암, 전이성 두경부암, 식도암, 전이성 식도암, 비소세포 폐 선암종, 비소세포 폐 편평상피세포암, 전립선암, 폐암, 위암, 요로상피세포암종, 소세포 폐암, 유방암, 자궁내막암, 전이성 자궁내막암, 담관암, 간세포암, 교모세포종, 신경교종, 결장암, 육종, 편평상피 기원의 고형 종양, 및 다발성 골수종을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 암 유형을 치료할 수 있다.
평가 단계에서 사용되는 FGFR 돌연변이 패널은 부분적으로 환자의 암 유형에 기초한다. 예를 들어, 방광암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 전이성 방광암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 방광암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 난소암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 난소암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 두경부암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 전이성 두경부암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 식도암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR2:BICC1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 전이성 식도암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCD6이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 비소세포 폐 (NSCL) 선암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 선암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 비소세포 폐 (NSCL) 편평상피세포암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCDC6이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 전이성 자궁내막암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCDC6이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 유방암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCD6이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 간세포암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR2:OFD1, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서,FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCDC6이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
일부 실시 형태에서, 평가 단계는 생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계; 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; cDNA를 예비-증폭시키는 단계; 및 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 예비-증폭된 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함한다.
생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계는 당업자에게 알려진 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, RNA는 퀴아젠(Qiagen)의 올프렙 DNA/RNA FFPE 키트 (상품 # 80234)를 사용하여 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다.
단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계는 당업자에게 알려진 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, cDNA는 ABI의 RNase 억제제를 사용하는 고용량 cDNA 역전사효소 키트(High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit) (상품 # 4374966)를 사용하여 단리된 RNA로부터 합성될 수 있다.
cDNA의 예비-증폭은 당업자에게 알려진 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 증폭 절차는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일 실시 형태에서, cDNA는 택맨® 예비증폭 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스/어플라이드 바이오시스템즈® 상품 # 4391128)를 사용하여 예비-증폭될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 증폭 단계는 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 qRT-PCR 절차가 본 명세서의 실시예 섹션에서 논의된다. 일부 측면에서, qRT-PCR은 택맨® 실시간 PCR 분석일 수 있다. qRT-PCR 절차는 분석의 특이성을 증가시키기 위해 프로브를 사용하는 것을 포함할 수 있다. qRT-PCR 분석에 사용하기에 적합한 프로브는 본 명세서에 개시된 임의의 프로브, 예를 들어, 표 15에 개시된 프로브를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 실시간 PCR은 서열 번호: 43, 서열 번호:44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54 및/또는 서열 번호:55를 포함하는 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 실시간 PCR은 서열 번호: 43, 서열 번호:44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54 및/또는 서열 번호: 55로 본질적으로 이루어진 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 실시간 PCR은 서열 번호: 43, 서열 번호:44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54 및/또는 서열 번호: 55로 이루어진 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 실시간 PCR은 서열 번호: 43, 서열 번호:44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54 및/또는 서열 번호: 55를 갖는 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행될 수 있다.
qRT-PCR은 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하는 예시적인 qRT-PCR 절차가 본 명세서의 실시예 섹션에 개시되어 있다. 적합한 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 표 8에 개시된 것들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, qRT-PCR은 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 및/또는 서열 번호: 42를 포함하는 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, qRT-PCR은 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 및/또는 서열 번호: 42로 본질적으로 이루어진 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, qRT-PCR은 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 및/또는 서열 번호: 42로 이루어진 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, qRT-PCR은 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 및/또는 서열 번호: 42를 갖는 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다.
증폭 단계에서 사용하기에 적합한 프라이머의 쌍은 표 3에 개시된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:TACC3 v1 및 서열 번호:5 및 서열 번호:6의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:TACC3 v3 및 서열 번호:7 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:TACC3 인트론 및 서열 번호:9 및 서열 번호:10의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3: BAIAP2L1 및 서열 번호:11 및 서열 번호:12의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:BICC1 및 서열 번호:13 및 서열 번호:14의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:AFF3 및 서열 번호:15 및 서열 번호:16의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:CASP7 및 서열 번호:17 및 서열 번호:18의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:CCDC6 및 서열 번호:19 및 서열 번호:20의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:OFD1 및 서열 번호:21 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 R248C 및 서열 번호:23 및 서열 번호:24 또는 서열 번호:31 및 서열 번호:32의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 S249C 및 서열 번호:25 및 서열 번호:26 또는 서열 번호:33 및 서열 번호:34의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 G370C 및 서열 번호:27 및 서열 번호:28 또는 서열 번호:35 및 서열 번호:36의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 Y373C 및 서열 번호:29 및 서열 번호:30 또는 서열 번호:37 및 서열 번호:38의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 상기 개시된 FGFR 돌연변이 및 상응하는 프라이머 쌍의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 증폭 단계는 하기를 사용하여 수행될 수 있다:
a.
서열 번호:5 및 서열 번호:6의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:43의 서열을 갖는 프로브;
b.
서열 번호:7 및 서열 번호:8의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:44의 서열을 갖는 프로브;
c.
서열 번호:9 및 서열 번호:10의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:46의 서열을 갖는 프로브;
d.
서열 번호:11 및 서열 번호:12의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:47의 서열을 갖는 프로브;
e.
서열 번호:13 및 서열 번호:14의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:45의 서열을 갖는 프로브;
f.
서열 번호:15 및 서열 번호:16의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:48의 서열을 갖는 프로브;
g.
서열 번호:17 및 서열 번호:18의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:49의 서열을 갖는 프로브;
h.
서열 번호:19 및 서열 번호:20의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:50의 서열을 갖는 프로브;
i.
서열 번호:21 및 서열 번호:22의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:51의 서열을 갖는 프로브;
j.
서열 번호:23 및 서열 번호:24의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:52의 서열을 갖는 프로브;
k.
서열 번호:25 및 서열 번호:26의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:53의 서열을 갖는 프로브;
l.
서열 번호:27 및 서열 번호:28의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:54의 서열을 갖는 프로브;
m.
서열 번호:29 및 서열 번호:30의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:55의 서열을 갖는 프로브;
n.
서열 번호:31 및 서열 번호:32의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:52의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:39의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드;
o.
서열 번호:33 및 서열 번호:34의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:53의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:40의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드;
p.
서열 번호:35 및 서열 번호:36의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:54의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:41의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드;
q.
서열 번호:37 및 서열 번호:38의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:55의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:42의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드; 또는
r.
이들의 임의의 조합.
개시된 방법은 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는 경우, 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는, 예를 들어, 증폭된 cDNA를 시퀀싱함으로써 결정될 수 있다.
치료 방법에 사용하기에 적합한 FGFR 억제제는 본 명세서에서 이미 기재된 것들을 포함한다.
환자의 암 치료에 사용하기 위한 FGFR 억제제가 또한 개시되어 있는데, 이때 환자는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가함으로써 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응하는 것으로 확인되며, 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재가 검출된다.
환자의 암 치료에 사용하기 위한 FGFR 억제제가 또한 개시되어 있는데, 이때 환자는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가함으로써 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응하는 것으로 확인되며, 하나 이상의 FGFR 돌연변이는 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR SNP이고, 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재가 검출되며, 상기 평가하는 단계는 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함한다.
환자의 암 치료에 사용하기 위한 FGFR 억제제가 또한 개시되어 있는데, 이때 환자는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가함으로써 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응하는 것으로 확인되며, FGFR 돌연변이는 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR SNP이고, 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재가 검출되며, 상기 평가하는 단계는 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 예비-증폭된 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함한다.
섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 방법
섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 방법으로서, FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터 FGFR 돌연변이에 대한 환자의 생물학적 샘플을 평가하는 단계 (여기서, FGFR 돌연변이가 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이고, 상기 평가하는 단계는 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함함); 및 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계 (여기서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것임을 나타냄)를 포함하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다.
섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응하는 암 환자를 확인하는 방법으로서, FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터 FGFR 돌연변이에 대한 환자의 생물학적 샘플을 평가하는 단계 (여기서, FGFR 돌연변이가 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이고, 상기 평가하는 단계는 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함함); 및 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계 (여기서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응함을 나타냄)를 포함하는 방법이 또한 제공된다.
환자의 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하는 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응하는 암 환자를 확인하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 FGFR 돌연변이는 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이고, 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응한다는 것을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 평가하는 단계는 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, cDNA는 예비-증폭된 cDNA일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 평가 단계는 생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계 및 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 평가 단계는 예비증폭된 cDNA 상에서 수행될 수 있다. 따라서, 평가 단계는 상기 증폭시키는 단계 전에 cDNA를 예비-증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계는 당업자에게 알려진 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, RNA는 퀴아젠의 올프렙 DNA/RNA FFPE 키트 (예를 들어, 상품 # 80234)를 사용하여 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계는 당업자에게 알려진 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, cDNA는 ABI의 RNase 억제제를 사용하는 고용량 cDNA 역전사효소 키트 (예를 들어, 상품 # 4374966)를 사용하여 단리된 RNA로부터 합성될 수 있다. cDNA의 예비-증폭은 당업자에게 알려진 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 증폭 절차는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일 실시 형태에서, cDNA는 택맨® 예비증폭 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스/어플라이드 바이오시스템즈® 상품 # 4391128)를 사용하여 예비-증폭될 수 있다.
개시된 방법을 사용하여 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응할, 방광암, 전이성 방광암, 난소암, 두경부암, 식도암, 비소세포 폐 선암종, 비소세포 폐 편평상피세포암, 전립선암, 폐암, 위암, 요로상피세포암종, 소세포 폐암, 유방암, 자궁내막암, 담관암, 간세포암, 교모세포종, 신경교종, 결장암, 육종, 편평상피 기원의 고형 종양, 및 다발성 골수종을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다수의 상이한 유형의 암 환자를 확인할 수 있다.
평가 단계에서 사용되는 FGFR 돌연변이 패널은 부분적으로 환자의 암 유형에 기초한다. 예를 들어, 방광암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:BAIAP2L1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:BICC1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:AFF3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 전이성 방광암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v3가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:BAIAP2L1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:BICC1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:AFF3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 전이성 방광암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 난소암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:BAIAP2L1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:BICC1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:AFF3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 난소암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 두경부암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:BAIAP2L1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 두경부암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 전이성 두경부암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 두경부암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 식도암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR2:BICC1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:BICC1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 식도암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 전이성 식도암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCD6이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 식도암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 비소세포 폐 (NSCL) 선암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 인트론이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:BAIAP2L1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:AFF3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 선암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 비소세포 폐 (NSCL) 편평상피세포암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:TACC3 v3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3:BAIAP2L1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:BICC1이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:AFF3이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CASP7이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR2:CCDC6이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 R248C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 S249C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 G370C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 FGFR3 Y373C가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 평가 단계는 NSCL 편평상피세포암을 갖는 환자의 생물학적 샘플에 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 전이성 자궁내막암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCDC6이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 전이성 자궁내막암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 유방암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCD6이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 유방암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
예를 들어, 간세포암 환자의 경우, 적합한 FGFR 돌연변이 유전자 패널은 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR2:OFD1, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 v3이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:TACC3 인트론이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3:BAIAP2L1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서,FGFR2:BICC1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:AFF3이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CASP7이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:CCDC6이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR2:OFD1이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 R248C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 S249C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 G370C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, FGFR3 Y373C가 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다. 일부 실시 형태에서, 상기 FGFR 돌연변이의 임의의 조합이 샘플에 존재하는 경우, 간세포암을 갖는 환자를 FGFR 억제제로 치료한다.
증폭 단계에서 사용하기에 적합한 프라이머의 쌍은 표 3에 개시된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:TACC3 v1 및 서열 번호:5 및 서열 번호:6의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:TACC3 v3 및 서열 번호:7 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:TACC3 인트론 및 서열 번호:9 및 서열 번호:10의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR3:BAIAP2L1 및 서열 번호:11 및 서열 번호:12의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:BICC1 및 서열 번호:13 및 서열 번호:14의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:AFF3 및 서열 번호:15 및 서열 번호:16의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:CASP7 및 서열 번호:17 및 서열 번호:18의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:CCDC6 및 서열 번호:19 및 서열 번호:20의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 FGFR2:OFD1 및 서열 번호:21 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 R248C 및 서열 번호:23 및 서열 번호:24 또는 서열 번호:31 및 서열 번호:32의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 S249C 및 서열 번호:25 및 서열 번호:26 또는 서열 번호:33 및 서열 번호:34의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 G370C 및 서열 번호:27 및 서열 번호:28 또는 서열 번호:35 및 서열 번호:36의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 Y373C 및 서열 번호:29 및 서열 번호:30 또는 서열 번호:37 및 서열 번호:38의 아미노산 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 일부 실시 형태에서, FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍은 상기 개시된 FGFR 돌연변이 및 상응하는 프라이머 쌍의 임의의 조합일 수 있다.
개시된 방법은 샘플에 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 결정 단계는 증폭된 cDNA를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 샘플에 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 존재하는 경우, 방법은 환자를 FGFR 억제제로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 치료 방법에 사용하기에 적합한 FGFR 억제제는 본 명세서에서 이미 기재된 것들, 특히 JNJ-42756493을 포함한다.
FGFR 돌연변이 유전자의 존재를 확인하기 위한 키트
생물학적 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이 유전자의 존재를 확인하기 위한 키트로서, 서열 번호:5 및 서열 번호:6, 서열 번호:7 및 서열 번호:8, 서열 번호:9 및 서열 번호:10, 서열 번호:11 및 서열 번호:12, 서열 번호:13 및 서열 번호:14, 서열 번호:15 및 서열 번호:16, 서열 번호:17 및 서열 번호:18, 서열 번호:19 및 서열 번호:20, 서열 번호:21 및 서열 번호:22, 서열 번호:23 및 서열 번호:24, 서열 번호:25 및 서열 번호:26, 서열 번호:27 및 서열 번호:28, 서열 번호:29 및 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 갖는 프라이머 쌍; 및 하나 이상의 FGFR 돌연변이 유전자를 검출하기 위한 분석을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 또한 개시되어 있다.
키트는 하나 이상의 프로브, 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 프로브, 예를 들어, 표 15에 개시된 임의의 하나 이상의 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 표 8에 개시된 임의의 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 프로브 및 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 키트는 하기를 추가로 포함할 수 있다:
a.
서열 번호:5 및 서열 번호:6의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:43의 서열을 갖는 프로브;
b.
서열 번호:7 및 서열 번호:8의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:44의 서열을 갖는 프로브;
c.
서열 번호:9 및 서열 번호:10의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:46의 서열을 갖는 프로브;
d.
서열 번호:11 및 서열 번호:12의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:47의 서열을 갖는 프로브;
e.
서열 번호:13 및 서열 번호:14의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:45의 서열을 갖는 프로브;
f.
서열 번호:15 및 서열 번호:16의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:48의 서열을 갖는 프로브;
g.
서열 번호:17 및 서열 번호:18의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:49의 서열을 갖는 프로브;
h.
서열 번호:19 및 서열 번호:20의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:50의 서열을 갖는 프로브;
i.
서열 번호:21 및 서열 번호:22의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:51의 서열을 갖는 프로브;
j.
서열 번호:23 및 서열 번호:24의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:52의 서열을 갖는 프로브;
k.
서열 번호:25 및 서열 번호:26의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:53의 서열을 갖는 프로브;
l.
서열 번호:27 및 서열 번호:28의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:54의 서열을 갖는 프로브;
m.
서열 번호:29 및 서열 번호:30의 서열을 갖는 프라이머 쌍 및 서열 번호:55의 서열을 갖는 프로브;
n.
서열 번호:31 및 서열 번호:32의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:52의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:39의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드;
o.
서열 번호:33 및 서열 번호:34의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:53의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:40의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드;
p.
서열 번호:35 및 서열 번호:36의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:54의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:41의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드;
q.
서열 번호:37 및 서열 번호:38의 서열을 갖는 프라이머 쌍, 서열 번호:55의 서열을 갖는 프로브 및 서열 번호:42의 서열을 갖는 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드; 또는
r.
이들의 임의의 조합.
올리고뉴클레오티드 프로브
서열 번호:43 내지 55 중 어느 하나의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브가 또한 개시되어 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:43의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:44의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:45의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:46의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:47의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:48의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:49의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:50의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:51의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:52의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:53의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:54의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 번호:55의 서열을 가질 수 있다.
3' 블로킹 올리고뉴클레오티드
서열 번호:39 내지 42 중 어느 하나의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 또한 본 명세서에 개시되어 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:39의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:40의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:41의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드는 서열 번호:42의 서열을 가질 수 있다.
실시예
실시예 1 - 플라스미드 DNA 단리 및 정제
하기는 FGFR 융합 플라스미드 DNA를 제조하는 예시적인 절차이다.
필요한 장비: 1500 × g이 가능한 원심분리기; 마이크로원심분리기; 피펫, 용적형(positive-displacement) 또는 공기-변위(air-displacement); 볼텍서; 나노드롭(nanodrop) 분광광도계; 37℃ 진탕기/인큐베이터; 및 37℃로 설정된 오븐.
필요한 재료: 플라스미드 DNA를 함유하는 동결된 글리세롤 박테리아 스톡; 카나마이신 LB 한천 플레이트 (테크노바(Teknova) #L1155); LB 브로쓰 (라이프 테크놀로지스 #10855-021); 카나마이신 (시그마(Sigma) #K0254); 플라스미드 정제 키트 (퀴아젠# 12123); 무수 에탄올 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich) # E7023); 아이소프로판올 (시그마 알드리치 #W292907); 뉴클레아제-미함유 물 (DEPC 처리되지 않은) (IDT 또는 암비온(Ambion)으로부터 # AM9932); RNase-무함유 배리어 (필터) 팁; RNase-무함유 마이크로튜브 (1.5 내지 2 mL VWR# 10011-724); 일회용 피펫; 및 14 ml 둥근 바닥 튜브 (VWR #352057).
글리세롤 스톡으로부터 박테리아를 회수하기 위해, 멸균 피펫 팁을 사용하여 글리세롤 스톡 튜브의 상부로부터 동결된 박테리아를 긁어내고, LB 한천 플레이트 상에 도말하여, 37℃의 오븐에서 하룻밤 동안 뒤집어 놓았다.
DNA 플라스미드를 퀴아젠 플라스미드 DNA 정제 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 요약하면, 단일 콜로니를 도말된 플레이트로부터 채취하여 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 5ml -LB 배지의 배양물에서 37℃ 진탕기에서 약 300 rpm으로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 박테리아 세포를 4℃에서 15분 동안 6000 × g에서 원심분리에 의해 수확하고, 펠릿을 300 μl의 완충액 P1에서 재현탁시켰다. 300 μl의 완충액 P2를 첨가하고, 튜브를 4 내지 6회 거꾸로 뒤집어줌으로써 혼합하여, 5분 동안 RT (실온)에서 인큐베이션하였다. 300 μl의 냉각된 완충액 P3을 첨가하고, 4 내지 6회 거꾸로 뒤집어줌으로써 즉시 혼합하여, 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하고, 10분 동안 최대 속도에서 원심분리하였다. 플라스미드 DNA를 함유하는 상청액을 즉시 제거하였다. 퀴아젠-팁 20을 1 ml의 완충액 QBT을 적용하여 평형화시키고, 중력 흐름(gravity flow)에 의해 비웠다. 상청액을 퀴아젠-팁 20에 적용하고, 중력 흐름에 의해 수지에 유입시켰다. 퀴아젠-팁 20을 2 × 2ml의 완충액 QC로 세정하고, DNA를 800 μl의 완충액 QF로 용출시켜, 용출액을 1.5ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 수집하였다. DNA를 0.7 부피의 아이소프로판올을 첨가하여 침전시키고, 혼합하여, 미세원심분리기에서 30분 동안 15000 × g으로 즉시 원심분리하였다. 상청액을 디캔팅(decanted)하고, DNA 펠릿을 1 ml의 70% 에탄올로 세정하여, 15000 × g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 디캔팅하였다. 펠릿을 5 내지 10분 동안 공기 건조시키고, DNA를 100 μl 또는 적합한 부피의 뉴클레아제-미함유 물에 재용해시켰다. 플라스미드 DNA를 나노드롭에 의해 정량하고 추가 사용전까지 -20℃에서 저장하였다.
실시예 2 ― NRK 세포주의 생성
각각의 FGFR 융합체를 발현하는 발현 벡터를 제작하였다. 이어서, 발현 벡터를 정상 래트 신장 상피 세포 (NRK)로 형질감염시켰다. 안정한 세포주를 형질감염 후, 카나마이신을 함유하는 배지에서 선택하였다. 이어서, 이러한 세포를 성장시키고, mRNA를 단리하여, FGFR 융합체 분석을 실시하여, 특정 FGFR 융합 mRNA의 존재를 확인하였다.
실시예 3 ― FGFR-융합 세포주 유지
하기 프로토콜은 NRK FGFR-융합 과발현 세포주를 배양하고 유지하기 위한 예시적인 절차를 설명한다. 세포주는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: NRK/FGFR3:TACC3v1, NRK/FGFR3:TACC3 v3, NRK/FGFR3:BAIAP2L1, NRK/FGFR2: BICC1, NRK/FGFR2:CASP7, NRK/FGFR2:CCDC6, NRK/FGFR2:AFF3, NRK/FGFR2:OFD1 및 NRK/빈 벡터 (플라스미드 대조군).
필요한 장비: 진공 흡입 시스템이 장착된 생물안전 캐비닛(biosafety cabinet); 5% CO2를 포함하는 37℃로 설정된 CO2 인큐베이터; -80℃ 냉동고; 액체 질소 탱크; 37℃로 설정된 수조; 및 현미경.
필요한 재료: 일회용 피펫; 조직 배양 플라스크 (T75 VWR # BD353136 및/또는 T150 VWR# 15705-074); 조직 배양 0.2 μm 필터 유닛 (서모 사이언티픽(Thermo Scientific) #566-0020); DMEM (둘베코 변형 이글 배지) 세포 배양 배지 (라이프 테크놀로지스, # 11965-084); 공인되고 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS) (라이프 테크놀로지스, # 10082147); 펜스트렙(PenStrep) 항생제 용액 (라이프 테크놀로지스 #15140-122); 트립신-EDTA 0.25% 용액 (라이프 테크놀로지스, # 25200-056); DPBS (둘베코 인산염 완충 용액, 칼슘 및 마그네슘 미함유) (라이프 테크놀로지스, # 14190136); 냉동보존을 위한 세포 동결 용기; 핸드헬드 피펫만(pipetman); 세포 동결 배지 (라이프 테크놀로지스, # 12648-010); 15 ml 원뿔형 튜브 (VWR # 62406-2); 및 냉동바이알(cryovial) (VWR # 89094-800).
세포 배양 배지를 제조하기 위해, 445 ml의 DMEM, 50 ml의 FBS 및 5 ml의 펜스트렙을 조합하여 DMEM 배지를 제조하였다. 제조된 배지를 0.2 μm 필터 유닛을 통과시키고, 4℃에서 저장하였다.
동결된 세포를 해동하기 위해, 제조된 DMEM 배지를 37 ℃ 수조에서 적어도 15분 동안 가온시키고, 15 ml의 가온된 배지를 T75 플라스크에 넣었다. 세포를 액체 질소 탱크로부터 제거하여 해동 바로 전까지 즉시 37℃ 수조에 넣었다. 냉동바이알에 70% 알코올을 충분히 분무하고, 과량을 종이 타월로 닦았다. 전체 내용물을 DMEM을 함유하는 T75 플라스크로 분취하였다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 혼합하고, 24시간 동안 인큐베이터에 두었다. 세포가 분열될 준비가 되지 않은 경우, 배지를 새롭게 제조된 DMEM로 교체하여 잔류 동결 배지를 제거하였다. 세포가 분열될 준비가 되면, 플라스크가 80% 융합(confluency)에 도달하면 각각의 세포주는 번식하였다 (각각의 세포주의 분열비(splitting ratio)는 실험적 요구에 따른다).
세포주를 동결시키기 위해, 세포를 배양 플라스크로부터 제거하여, 15 ml 원뿔형 튜브에서 5분 동안 1500 RPM으로 RT에서 스핀 다운(spin down)시켰다. 배지를 흡인하고, 6 ml의 세포 동결 배지를 첨가하였다. 세포를 여러번 상하로 피펫팅함으로써 혼합하고 1 ml의 세포 용액을 각각 5개의 냉동바이알로 분취하였다. 세포를 함유하는 냉동바이알을 극저온동결(cryofreezing) 용기에 넣고 -80 ℃ 냉동고에서 하룻밤 동안 저장한 다음, 액체 질소 탱크에 장기간 저장하였다.
실시예 4 ― FFPET SNP 분석
FFPET SNP 분석을 수행하기 위한 예시적인 워크플로우 및 프로토콜이 하기에 설명된다. FFPET 융합체 분석을 위해 유사한 절차가 수행되며, 이 결과를 도 2에 나타낸다.
FFPET의 탈-파라핀화
슬라이드에 증가하는 양의 자일렌, 이어서 알코올을 처리를 실시하여, 파라핀을 제거하였다.
FFPET RNA 추출
하류 유전자 발현 분석을 위해 유방암 포르말린-고정되고 파라핀-포매된 조직 샘플로부터 RNA를 추출하기 위한 절차가 하기에 기재되어 있다.
필요한 장비: 1500 × g이 가능한, 플레이트 어댑터를 포함하는 원심분리기; 미세원심분리기; 피펫, 용적형 또는 공기-변위; 볼텍서; 나노드롭 8000; 37℃, 56℃ 및 80℃에서 인큐베이션이 가능한 가열 블록; 및 파스퇴르 피펫 (피펫 트랜스(Trans) EX-FT 1.5ml pk 500, VWR# 14670-329).
필요한 재료: 올프렙 DNA/RNA FFPE 키트 (퀴아젠# 80234); 무수 에탄올 (시그마 알드리치 # E7023); 아이소프로판올; 자일렌; 뉴클레아제-미함유 물 (DEPC 처리되지 않은) (IDT 또는 암비온으로부터 # AM9932); RNase-무함유 배리어 (필터) 팁; RNase-무함유; 마이크로튜브 (1.5 내지 2 mL VWR# 10011-724); 및 퀴아젠 올프렙 DNA/RNA FFPE 키트 핸드북.
RNA를 올프렙 DNA/RNA FFPE 키트를 사용하여 추출하였다. 요약하면, 하나의 1 내지 10 μm 부분을 1.5 ml 반응 튜브에 넣고, 800 μl의 헤모데(HemoDe) 또는 자일렌을 첨가하였다. 샘플을 4초 동안 3회 볼텍싱하고, 2분 동안 인큐베이션하고, 4초 동안 3회 볼텍싱하고, 5분 동안 인큐베이션하였다.
샘플을 2분 동안 최대 속도 (12,000 내지 14,000 × g)에서 원심분리하고, 상청액을 흡인으로 버렸다. 튜브를 즉시 캡핑하여(capped) 조직이 건조되는 것을 막았다.
상기 단계를 반복하였다.
800 μl 무수 에탄올을 첨가하며, 튜브를 플리킹하여(flicked) 펠릿을 제거하고, 4초 동안 3회 볼텍싱하여, 2분 동안 최대 속도 (12,000 내지 14,000 × g)에서 원심분리하고, 상청액을 흡인에 의해 제거하였다.
800 μl 70% 에탄올을 첨가하며, 튜브를 플리킹하여 펠릿을 제거하고, 4초 동안 3회 볼텍싱하여, 2분 동안 최대 속도에서 원심분리하고, 상청액을 흡인에 의해 제거하였다. 70% 에탄올의 제거 후, 튜브를 10 내지 20초 동안 재회전시키고 잔류 유체를 미세 구멍 피펫으로 조심스럽게 제거하였다.
개방 튜브를 37℃에서 5 내지 15분 동안 가열 블록에서 인큐베이션하여 조직 펠릿을 공기 건조시켰다.
150 μl 완충액 PKD를 첨가하여 펠릿을 재현탁시키고, 튜브를 플리킹하여 펠릿을 느슨하게 하였다. 10 μl 프로테이나제 K를 첨가하고, 튜브를 볼텍싱하여 혼합하였다.
튜브를 56℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 3분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여, 15분 동안 20,000 × g에서 원심분리하였다.
상청액을 펠릿을 방해하지 않으면서 RNA 정제를 위한 새로운 1.5 ml 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮겼다. 상청액을 80℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 잠시 원심분리하여, 뚜껑 안쪽의 방울을 제거하였다. 320 μl 완충액 RLT를 첨가하여 결합 조건을 조정하고, 튜브를 볼텍싱 또는 피펫팅에 의해 혼합하였다. 1120 μl 에탄올 (96 내지 100%)을 첨가하여, 튜브를 볼텍싱 또는 피펫팅에 의해 혼합하였다.
형성될 수 있는 침전물을 포함하여 700 μl의 샘플을 2 ml 수집 튜브에 놓인 RN이지 민일루트(RNeasy MinElute) 스핀 컬럼으로 옮기고 8,000 × g (≥ 10,000 rpm)에서 15 초 동안 원심 분리하였다 유통(flow-through)을 버렸다. 이러한 단계를 전체 샘플이 RN이지 민일루트 스핀 컬럼을 통과할 때까지 반복하였다.
350 μl 완충액 FRN을 RN이지 민일루트 스핀 컬럼에 첨가하여, 15초 동안 ≥8000 × g (≥10,000 rpm)에서 원심분리하였다. 유통을 버렸다.
10 μl DNase I 스톡 용액을 70 μl 완충액 RDD에 첨가하여, 튜브를 거꾸로함으로써 서서히 혼합하고, 튜브의 측면에서 잔여 액체를 수집하기 위해 잠시 원심분리하였다.
DNase I 인큐베이션 혼합물 (80 μl)을 RN이지 민일루트 스핀 컬럼 막에 직접 가하여 15분 동안 벤치탑(benchtop) (20 내지 30℃)에 두었다.
500 μl 완충액 FRN을 RN이지 민일루트 스핀 컬럼에 첨가하여, 15초 동안 ≥8000 × g (≥10,000 rpm)에서 원심분리하였다. 작은 RNA가 들어 있기 때문에 유통을 다음 단계에서 사용하기 위해 저장하였다.
RN이지 민일루트 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브 (공급된)에 넣었다. 이전 단계의 유통을 스핀 컬럼에 넣고 ≥ 8000 × g (≥10,000 rpm)에서 15 초간 원심분리하였다. 유통을 버렸다.
500 μl 완충액 RPE를 RN이지 민일루트 스핀 컬럼에 첨가하고, 15초 동안 ≥8000 × g (≥10,000 rpm)에서 원심분리하여 스핀 컬럼 막을 세정하였다. 유통을 버렸다.
500 μl 완충액 RPE를 RN이지 민일루트 스핀 컬럼에 첨가하고, 15초 동안 ≥8000 × g (≥10,000 rpm)에서 원심분리하여 스핀 컬럼 막을 세정하였다. 유통을 포함하는 수집 튜브를 버렸다.
RN이지 민일루트 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브에 넣고, 5분 동안 최고 속도로 원심분리하였다. 유통을 포함하는 수집 튜브를 버렸다.
RN이지 민일리투 스핀 컬럼을 새로운 1.5 ml 수집 튜브에 넣고, 30 μl RNase-무함유 물을 스핀 컬럼 막에 직접 첨가하여, 1분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 최고 속도로 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출하였다.
RNA 샘플을 즉시 -80℃ 냉동고에 저장하였다.
cDNA 합성
실시간 PCR (RT-PCR) 분석을 사용한 FFPET SNP 분석물의 cDNA 합성 절차가 하기에 기재되어 있다.
필요한 장비: 1500 × g이 가능한, 플레이트 어댑터를 포함하는 원심분리기, 미세원심분리기; 피펫 (단일 및 다중 채널 피펫이 바람직함), 용적형 또는 공기-변위; 볼텍서; 및 진앰프® PCR 시스템 9700 (ABI# 4314879) 또는 등가물.
필요한 재료: RNase 억제제를 사용하는 고용량 cDNA 역전사효소 키트, 200개의 반응물 (ABI# 4374966); 뉴클레아제-미함유 물 (DEPC 처리되지 않은) (IDT로부터) 또는 등가물; RNase-무함유 배리어 (필터) 팁; RNase-무함유 마이크로튜브 (1.5 내지 2 mL VWR# 10011-724); 마이크로앰프(MicroAmp)™ 광학적 96-웰 반응 플레이트 (라이프 테크놀로지스, #4306736); 및 밀봉 필름 (VWR #60941-072).
(상기 개시된) RNA 추출 후, RNA 샘플 튜브(들)를 얼음 상에서 유지시켰다.
키트 성분을 사용하여 1개의 음성 (물) 대조군을 포함한 모든 반응에 대한 2x 역전사 (RT) 마스터 믹스를 제조하였다. 성분을 약 15분 동안 얼음 위에서 해동시키고, 서서히 거꾸로 뒤집어 혼합하여 잠시 원심분리하여 용액을 떨어뜨렸다(bring down). 모든 시약을 얼음에 되돌려놓았다. 튜브를 볼텍싱하지 않았다.
반응 당 하기와 같은 양의 시약을 조합하여 적절한 수의 반응 (반응 횟수 + 10%, 20-μL 반응 당)을 위한 하나의 마스터 믹스를 얼음 상의 1.5 ml 튜브에서 제조하였다: 2 μl 10X RT 완충액 믹스; 0.8 μl 25X dNTP 믹스; 2 μl 10X RT 랜덤 프라이머; 1 μl 50U/μL 멀티스크라이브(MultiScribe) 역전사효소; 1 μl RNase 억제제; 및 3.2 μl 뉴클레아제/RNase 무함유 H20.
마스터 믹스를 여러번 (5 내지 10) 볼텍싱하여 혼합하고, 잠시 원심분리하였다 (1500 × g, 5 내지 10초). 10 μl의 반응 혼합물을 96-웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다.
RNA 샘플을 20 ng/μl의 농도로 희석하였다. 물 음성 대조군을 포함하는 10 μl의 각각의 RNA 샘플을 96-웰 플레이트의 적절한 상응하는 웰에 최종 반응 부피 20 μL로 첨가하였다. 상하로 3회 피펫팅함으로써 웰을 서서히 혼합하고, 플레이트 시일로 밀봉하며, 잠시 원심분리하였다 (60초 동안 1500 × g). 플레이트를 열 순환기(thermocycler)에 로딩할 준비가 될 때까지 얼음 상에서 유지하였다.
반응 플레이트를 클린 랩(Clean Lab) 또는 워크스테이션(Workstation)에서 ABI 9700 열 순환기로 로딩하고, 반응 부피가 20 μl인 하기 역전사 프로그램을 사용하여 실행하였다:
단계 1: 25℃ 10분 동안
단계 2: 37℃ 120분 동안
단계 3: 85℃ 5초 동안
단계 4: 4℃ 무한 유지(infinite hold)
합성된 cDNA를 예비-증폭의 다음 단계를 위해 -20℃에서 저장하였다.
예비증폭 분석 풀(pool) 혼합물의 제조
FFPET SNP 분석 예비-증폭 프로토콜과 관련된 예비증폭 분석 풀 혼합물을 하기와 같이 제조하였다.
필요한 장비: 미세원심분리기; 피펫, 용적형 또는 공기-변위; 및 볼텍서.
필요한 재료: 뉴클레아제-미함유 물 (DEPC 처리되지 않은) (IDT로부터) 또는 등가물; IDTE pH 8.0 (1X TE 용액) (IDT 테크놀로지스); RNase-무함유 배리어 (필터) 팁; 및 RNase-무함유 튜브 (1.5 내지 2mL VWR# 10011-724).
모든 택맨 SNP 분석을 어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스, 인코포레이티드로부터 주문한다.
100 μl의 20X SNP 분석을 제조하였다.
0.2X 예비증폭 분석 풀을 준비하기 위해, 모든 분석물을 약 15분 동안 얼음 상에서 해동시켰다. 하기 부피의 성분을 1.5 ml 튜브에 첨가하였다:
[표 4]
0.2X 예비증폭 분석 풀을 잠시 (5 내지 10초) 볼텍싱하여 혼합하고 잠시 원심분리하였다 (1500 × g, 5 내지 10초). 100 μl의 예비증폭 프라이머 풀을 1.5 ml 튜브로 분취하고 -20℃에서 저장하였다.
실시간 PCR (RT-PCR) 분석을 사용한 유방암 포르말린-고정되고 파라핀-포매된 조직 SNP 분석을 위한 예비-증폭
필요한 장비: 1500 × g이 가능한, 플레이트 어댑터를 포함하는 원심분리기; 미세원심분리기; 피펫, 용적형 또는 공기-변위; 볼텍서; 진앰프® PCR 시스템 9700 (ABI# 4314879) 또는 등가물.
필요한 재료: 택맨® 예비증폭 마스터 믹스 (2X) (라이프 테크놀로지스 # 4391128); 0.2X 풀링된 분석 믹스 (분석 준비 및 취급 프로토콜 참조); 1X IDTE 완충액 (10mM Tris/0.1mM EDTA, pH7.5, IDT로부터의) 또는 등가물; 뉴클레아제-미함유 물 (DEPC 처리되지 않은) (IDT로부터) 또는 등가물; RNase-무함유 배리어 (필터) 팁; RNase-무함유 마이크로튜브 (1.5 내지 2 mL VWR# 10011-724); 마이크로앰프™ 광학적 96-웰 반응 플레이트 (라이프 테크놀로지스, #4306736); 마이크로앰프® 광학적 접착 필름 (어플라이드 바이오시스템즈 PN 4311971); 깊은 웰 플레이트 (VWR# 47734-788); 호일 시일 (VWR # 60941-126).
샘플을 cDNA 및 0.2X 분석 믹스 풀을 얼음 상에 두어 약 5분 동안 해동시키고, 플레이트를 잠시 원심분리함으로써 (1500xg 5 내지 10초 동안) 제조하였다.
키트 성분을 사용하여 2x 예비증폭 마스터 믹스를 제조하였다. 키트 성분을 약 5분 동안 얼음 상에서 해동시켰다. 모든 시약을 해동시킨 후, 튜브를 서서히 뒤집어 혼합하고, 잠시 원심 분리하여 용액을 떨어 뜨렸다. 모든 시약을 얼음에 되돌려놓았다. 튜브를 볼텍싱하지 않았다.
클린 랩 또는 생물안전 후드에서, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 필요한 부피의 시약을 조합하여 적절한 수의 반응 (반응 횟수 + 10%)을 위한 각각의 마스터 믹스를 얼음 상에 준비하였다:
[표 5]
SNP 분석의 교차 프라이밍을 방지하기 위해, 5개의 모든 분석을 샘플 당 3개의 예비증폭 반응으로 나누었다.
각각의 마스터 믹스를 여러번 (5 내지 10) 볼텍싱하여 혼합한 다음, 잠시 원심분리하였다 (1500 ×g, 5 내지 10초). 18.75 μl의 각각의 마스터 믹스를 96-웰 반응 플레이트의 적절한 웰에 분취하였다. 물 음성 대조군 웰을 포함하는 6.25 μl의 각각의 cDNA 샘플을 각각의 예비증폭 반응에 대한 마스터 믹스 반응 플레이트의 적절한 웰로 옮겼다. 샘플을 상하로 3회 피펫팅하여 서서히 혼합하고, 캡을 닫았다. 플레이트를 잠시 원심분리하여 (60초 동안 1500 × g), 열 순환기에 로딩할 준비가 될 때까지 얼음 상에 유지하였다.
반응 플레이트 ABI 9700 열 순환기를 로딩하고, 하기 프로그램을 사용하여 실행하였다:
단계 1: 95℃ 10분 동안
단계 2: 95℃ 15초 동안
단계 3: 60℃ 4분 동안
단계 4: 단계 2 및 3을 10 사이클 동안 설정
금 또는 은 블록을 사용한 경우, 최대 모드가 선택되고 램프 속도가 77%로 설정되었다. 알루미늄 블록을 사용하는 경우, 표준 모드 (속도 변화 없음)를 선택하였다.
단계 5: 4℃ 무한 유지
반응 부피를 25 μL로 설정
예비증폭 반응 플레이트를 예비증폭이 완료된 후 잠시 원심분리하였다 (60초 동안 1500 × g). 100 μl의 IDTE를 새로운 깊은 96-웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하고 25 μl의 각각의 예비증폭 생성물을 최종 희석 부피가 125 μL이도록 상응하는 웰로 옮겼다. 각각의 웰을 상하로 3회 피펫팅하여 혼합하고, 플레이트를 호일 접착제로 밀봉하며, 플레이트를 잠시 원심 분리하고 (5 내지 10 초 동안 1500 × g), 예비증폭 생성물을 추가 사용 전까지 -20℃에서 저장하였다.
FFPET SNP 분석 ― 실시간 PCR
하기는 실시간 PCR 분석을 사용한 포르말린 고정되고 파라핀 내장된 조직 SNP 분석 절차이다.
필요한 장비: 1500 × g이 가능한, 플레이트 어댑터를 포함하는 원심분리기; 미세원심분리기; 피펫 (단일 및 다중 채널 피펫이 바람직함), 용적형 또는 공기-변위; 볼텍서; 및 ABI ViiA 7 실시간 PCR 장비 (라이프 테크놀로지스).
필요한 재료: 택맨 유전형 결정(Genotyping) 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스 # 4371355); SNP 분석; 뉴클레아제-미함유 물 (DEPC 처리되지 않은, IDT로부터) 또는 등가물; RNase-무함유 배리어 (필터) 팁; RNase-무함유 마이크로튜브 (1.5 내지 2 mL VWR# 10011-724); 마이크로앰프® 광학적 접착 필름 (어플라이드 바이오시스템즈 PN 4311971); 및 마이크로앰프™ 광학적 384-웰 반응 플레이트.
표 15는 실시간 PCR 분석 동안 사용된 프로브의 서열을 열거한다.
샘플을 준비하기 위해, 클린 랩 또는 워크스테이션에서 SNP 분석을 약 5분 동안 얼음 상에 놓아 해동시켰다. 형광 프로브의 노출을 보호하기 위해, 빛으로부터 모든 시약을 보호하였다. 유전형 결정 마스터 믹스를 준비한 후, 더티 랩(Dirty Lab) 또는 워크스테이션에서 희석된 예비증폭 플레이트를 얼음 상에 두어 해동시켰다.
유전형 결정 마스터 믹스를 준비하기 위해, 유전형 결정 마스터 믹스를 약 5분 동안 얼음 상에서 해동시켰다. 마스터 믹스 (MM)를 필요한 튜브 수로 얼음 상에 준비하였다. 필요한 부피의 시약을 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 적절한 표지된 튜브에서 조합하였다 (# 반응 + 10%):
[표 6]
마스터 믹스를 여러번 (5 내지 10회) 볼텍싱하여 혼합한 후, 잠시 원심분리하였다 (5 내지 10초 동안 1500 × g). 15 μl의 각각의 마스터 믹스를 마이크로앰프™ 광학적 384-웰 반응 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다. 반응 플레이트를 광학적 접착 필름으로 밀봉하였다.
1:5로 희석된 예비증폭 생성물을 갖는 플레이트를 약 5 내지 10분 동안 얼음 상에 두어 해동시켰다. 다중 채널 피펫을 사용하여, 5 μl의 각각의 희석된 예비증폭 생성물을 적절한 상응하는 웰로 옮겼다. 반응 플레이트를 광학적 접착 필름으로 밀봉하고 잠시 원심분리하였다 (60초 동안 1500 × g). 플레이트를 열 순환기에 로딩할 준비가 될 때까지 얼음 상에서 유지하였다.
부피를 20 μl로 설정한 viiA 7 소프트웨어를 사용하여 하기 조건을 실행하였다:
[표 7]
FGFR SNP-특이적 qRT-PCR
과량의 야생형 대립유전자에서 희귀한 체세포 돌연변이의 검출은 암 진단에서 점점 중요해지고 있다. 목적 돌연변이가 서로 가까운 경우 검출이 어려워진다. FFPET로부터의 FGFR SNP의 확인을 돕기 위해, SNP-특이적 qRT-PCR 분석이 개발되었는데, 3' 다이데옥시 야생형 (WT) 대립유전자 차단제와 조합된 택맨 MGB 프로브를 사용하는 SNP-특이적 증폭을 사용하였다. 이 분석은 비특이적 결합을 방지하고, 표적(on-target) 증폭의 횟수를 증가시키며, WT 대립유전자로부터 허위 양성 신호를 최소화하고, 분석의 민감도를 증가시켰다. 분석의 예비-증폭 단계와 조합된 이러한 RNA 기반 SNP 검출 분석은 낮은 또는 희귀한 돌연변이 신호를 증폭시킨다.
3' 다이데옥시 WT 차단제 올리고뉴클레오티드를 사용하는 SNP-특이적 qRT-PCR에 대한 예시적인 전략이 도 3에 도시되어 있고, 예시적인 FFPE 샘플의 검증 전략이 도 4에 예시되어 있다. 요약하면, WT 대립유전자에 상보적이며, 이의 측면에 위치하는 짧은 뉴클레오티드 스트레치(stretch)를 함유하는 3' 다이데옥시 WT 차단제 올리고뉴클레오티드의 존재 하에, FGFR SNP 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. WT 대립유전자에 대한 차단제 올리고뉴클레오티드의 결합은 WT 대립유전자의 증폭을 방해하는 반면, FGFR SNP 프라이머는 FGFR SNP에 결합하여 이를 특이적으로 증폭시켰다. FGFR SNP-특이적 qRT-PCR에 사용된 3' 다이데옥시 WT 차단제 올리고뉴클레오티드를 표 8에 나타낸다. FGFR SNP-특이적 qRT-PCR에 사용된 FGFR SNP 프라이머는 하기와 같다: 서열 번호:31 및 서열 번호:32 (FGFR3 R248C); 서열 번호:33 및 서열 번호:34 (FGFR3 S249C); 서열 번호:35 및 서열 번호:36 (FGFR3 G370C); 및 서열 번호:37 및 서열 번호:38 (FGFR3 Y373). 표 15는 실시간 PCR 분석 동안 사용된 프로브의 서열을 열거한다.
[표 8]
검증 연구를 위한 샘플을 표 9에 나타낸 바와 같이 준비하였다. FGFR3 G370C, FGFR3 Y373, FGFR3 S249C 및 FGFR3 R248C에 대한 3' 다이데옥시 WT 차단제 올리고 뉴클레오티드를 사용하는 SNP-특이적 qRT-PCR의 예시적인 검증 데이터가 도 5a 내지 5d에 각각 예시되어 있다. 3' 다이데옥시 WT 차단제 올리고뉴클레오티드를 사용하는 SNP-특이적 qRT-PCR에 대한 FFPE 샘플의 원(raw) Ct (사이클 역치) 데이터를 표 10에 나타낸다. 상이한 플랫폼/기술을 사용하여 DNA 및 RNA로부터 얻은 데이터는 3' 차단 뉴클레오티드를 사용하는 SNP-특이적 PCR이 강력하고 신뢰성 있으며 민감한 분석임을 시사한다. 검증 데이터는 하나의 돌연변이 대립유전자/SNP가 과량의 WT-보유 게놈 DNA에서 검출될 수 있음을 시사하며, 이에 따라 각 분석의 민감도와 특이성을 강조한다.
[표 9]
[표 10]
실시예 5 ― 맞춤형 FGFR 융합 유전자 검출 검정의 검증
FGFR 융합체 분석을 위한 양성 대조군의 생성
FGFR 융합 "합성 미니-유전자", FGFR 융합체를 암호화하는 플라스미드 및 FGFR 융합체를 함유하는 안정한 세포주를 생성하였다. 요약하면, 합성 미니 유전자(Synthetic mini gene)를 목적 유전자의 표적 DNA 서열에 상응하는 (약 100개의 염기쌍) 일련의 뉴클레오티드를 서로 연결시킴으로써 인위적으로 제작하였다. FGFR 융합체를 암호화하는 플라스미드를 다양한 FGFR 융합 유전자를 암호화하는 cDNA를 발현 벡터로 클로닝함으로써 생성하였다. FGFR 유전자를 암호화하는 플라스미드를 정상 래트의 신장 상피 세포 (NRK 세포)에 형질감염시킴으로써 FGFR 융합체를 함유하는 안정한 세포주를 생성하였다. 안정한 세포주를 G418 항생제 하에서 선별하였다. FGFR 융합 택맨 분석을 이들 세포주로부터 단리된 전체 RNA에 대해 수행하여, FGFR 융합체(들)를 발현하는 안정한 세포주(들)의 성공적인 생성을 확인하였다. FGFR 융합체를 발현하는 안정한 세포주를 양성 대조군으로 사용한다. 표 15는 실시간 PCR 분석 동안 사용된 프로브의 서열을 열거한다.
FGFR 융합체 분석의 효율 및 정량의 하한 분석
FGFR 융합 유전자 분석의 효율 및 정량의 하한 (LLOQ)을 측정하기 위해, FGFR 융합 생성물을 (실시예 4에 기재된 바와 같이) 택맨 PCR에 의해 생성하고, 생어 시퀀싱 (도 2)에 의해 확인하였다. 100 pg의 융합 양성 DNA를 정상 인간 cDNA (융합-음성으로 확인됨)와 혼합하고, 1:10으로 연속 희석하여, 어플라이드 바이오시스템즈 ViiA7 소프트웨어 v1.1을 사용하여 분석하였다. 효율 표준 곡선이 도 6에 도시되어 있다. FGFR 융합 LLOQ 및 효율을 표 11에 나타낸다.
[표 11]
이어서, FGFR 융합 유전자 분석을 융합 유전자 양성 세포주에서 검증하였다. 융합 단백질-양성 세포주를 융합 단백질-음성 세포주에 스파이킹(spiking)함으로써 FGFR 융합 유전자 발현, 연속 희석액을 제조하였다. 예를 들어, FGFR3:TACC3v1 및 FGFR3:BAIAP2L1 모두에 대해 1:2 연속 희석액을 제조하여, 1백만개의 BAF 세포에 스파이킹하였다. (퀴아젠 Rn이지 키트를 사용하여) RNA를 단리한 후, 표적 FGFR 융합 유전자에 대한 RT-PCR, cDNA의 예비 증폭 및 택맨 실시간 PCR을 수행하였다. 표 12에서 나타낸 바와 같이, FGFR3:TACC3v1 및 FGFR3:BAIAP2L1 융합 유전자 택맨 분석은 1백만개의 융합-음성 세포 중 31개에서 융합 표적을 검출할 수 있다 (민감도 0.003%).
[표 12]
실시예 6 ― 맞춤형 FGFR SNP 검출 분석의 검증
방광암에서 FGFR3 돌연변이의 평가
시험한 방광암 샘플의 약 8%, 약 61% 및 약 19%에서 R248C, S249C 및 Y373C SNP가 각각 관찰되었다.
실시예 7 ― 암 샘플의 분석
실시예 4에 기재된 바와 동일한 절차를 사용하여 샘플을 분석하였다. 결과를 표 13 및 도 7에 나타낸다. 표 13은 상이한 암에서 FGFR 융합의 발병률을 보여준다. 상이한 암, 예컨대 방광암 (원발성 및 전이성), NSCLC (선암 및 편평상피), 난소암, 식도암 (원발성 및 전이성), 경두부암 (H&N; 원발성 및 전이성), 자궁내막암 (전이성), 유방암 및 전립선암의 FFPE 샘플에서 qRT-PCR 방법을 사용하여 FGFR 융합체가 검출되었다. 시험한 모든 FGFR 융합체는 전립선암 샘플에 대해 음성이었다. FGFR3:TACC3인트론 융합체는 방광암 (원발성), NSCLC (편평상피), 난소암 및 식도암 (원발성), H&N (원발성 및 전이성) 및 유방암에서 음성이었다. FGFR2:OFD1 융합체는 방광암(원발성 및 전이성), NSCLC (선암), 난소암 및 식도암 (원발성 및 전이성)에서 음성이었다. FGFR2:CCDC6 융합체는 방광암(원발성 및 전이성), NSCLC (선암), 난소암 및 식도암 (원발성) 및 H&N (원발성 및 전이성)에서 음성이었다.
도 8은 NSCLC 선암 및 편평상피세포암에서의 FGFR 융합 유전자 및 돌연변이 상태의 예시적인 표현이다. FGFR 융합 양성 NSCLC 선암 샘플에서, 3/17 샘플은 EGFR 돌연변이에 대해 양성이고, 3/17 샘플은 KRAS 돌연변이에 대해 양성이며, 1/17 샘플은 cMET 돌연변이에 대해 양성이었다. 그러나 FGFR 융합 양성 NSCLC 편평상피세포암 샘플에서 EGFR, KRAS 또는 cMET 돌연변이가 관찰되지 않았다.
[표 13]
실시예 8 ― 진행성 고형 종양 환자의 치료
FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR2:CCDC6 및 FGFR2:BICC1 융합 유전자를 발현하는 다양한 고형 종양 환자를 JNJ-42756493으로 치료하는 임상 시험을 수행하였다. 도 9는 1상 환자 샘플로부터의 예시적인 결과를 나타내며, 1상 JNJ-427493 (EDI10001) 시험 샘플에서 FGFR 융합체가 qRT-PCR 분석을 사용하여 검출되었다. RNA의 품질 관리 평가를 위해, 모든 FGFR 융합체 분석을 양성 대조군 (ST) 및 GAPDH와 동시에 수행하였다. a) pt#1000081에 대해 생성된 qRT-PCR 데이터의 그래픽 표현: FGFR2:BICC1 융합체에 대해서만 양성 (삽입화는 FGFR2:BICC1 융합체, ST-양성 대조군 및 GAPDH에 대한 Ct 값을 상세히 나타냄). b) pt#33000158에 대해 생성된 qRT-PCR 데이터의 그래픽 표현: FGFR3:TACC3v1 융합체에 대해서만 양성 (삽입화는 FGFR3:TACC3v1 융합체, ST-양성 대조군 및 GAPDH에 대한 Ct 값을 상세히 나타냄). c) pt#34000123에 대해 생성된 qRT-PCR 데이터의 그래픽 표현: FGFR2:CCDC6 융합체에 대해서만 양성 (삽입화는 FGFR2:CCDC6 융합체, ST-양성 대조군 및 GAPDH에 대한 Ct 값을 상세히 나타냄). d) pt#340000115에 대해 생성된 qRT-PCR 데이터의 그래픽 표현: FGFR3:TACC3v1, FGFR3:TACC#v3 및 FGFR2:CCDC6 융합체에 대해 양성 (삽입화는 FGFR 융합체, ST-양성 대조군 및 GAPDH에 대한 Ct 값을 상세히 나타냄).
도 10은 진행성 고형 종양 환자에서, JNJ-42756493의 첫 임상 적용 연구를 위한 예시적인 1상 연구 디자인을 나타낸다. 도시된 것은 1상 임상 시험을 위한 종래의 3+3 디자인 용량 증가 방법을 도시한 그래프이다. 용량 증가 단계는 최대 내약 용량 (MTD) 및 권장 2상 용량 (RPD)을 확립하는 것을 목표로 하였다. 파트 1 부분(arm)은 간헐적인 투여 스케줄, 즉 7일 투여(on)하고 7일 중단(off) (10 mg/㎏ 및 12 mg/㎏)을 결정하는 데 사용되었다. 파트 2 부분은 생검 및 혈액 샘플을 시험하는 PD 바이오마커(biomarker) (약력학적 바이오마커; 마커는 표적에 대한 약물의 효과 및 생물학적 종양 반응성을 연결하여 평가함)를 결정하는 데 사용되었다. 파트 3 부분은 용량 확장 코호트(dose expansion cohort)에 사용되며, 상이한 적격 기준 (FGFR 변이: 전좌 / 돌연변이 / 증폭)을 갖는 특정 징후 (NSCLC, SCLC, 유방암 및 고형 종양)에서 추가 환자의 발생(accrual)을 포함하여, JNJ493의 독성 프로파일을 추가로 특성화하였다.
임상 활성 평가
FGFR 융합 유전자 환자에서 하루 한번 9mg (QD), 12mg QD 투여시 및 12mg 7일 투여/중단시 유의한 임상 반응 (RECIST)이 관찰되었다. (도 11은 모든 투여 요법을 나타낸다).
실시예 9 ― FGFR 융합체가 안정하게 형질감염된 RK3E 세포의 생성
FGFR 융합체 과발현 세포주
RK3E (래트 신장 상피 세포) 세포를 ATCC (미국 버지니아주 머내서스 소재)에서 구입하여, FBS 및 항생제 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))로 보충된 DMEM에서 배양하였다. FGFR 융합 유전자 구조물을 설계하고, HA-태그를 함유하는 p리시버(Receiver) 발현 벡터 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 진코포에이아(Genecopoeia))로 클로닝하였다. 아막사 세포주 뉴클레오펙터(Amaxa Cell Line Nucleofector) (스위스 바젤 소재의 론자(Lonza))를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 클론을 RK3E 세포로 형질감염시켰다. G418 (인비트로겐) 800㎍/ml를 함유하는 완전 배지에서, 안정하게 형질감염된 세포를 선별하였다. 안정하게 형질감염된 세포에서의 융합체의 과발현을 실시간 PCR 및 항-pFGFR 항체를 사용하는 면역블로팅으로 확인하였다 (도 12). 도 12에 나타낸 바와 같이, 안정한 세포주는 FGFR의 인산화의 발현에 의해 나타난 바와 같이 활성 FGFR 융합 키나제의 발현을 나타내었다.
콜로니 형성 분석
안정하게 형질감염된 RK3E 세포의 FGFR 융합체의 부착 비의존성 성장을 시험하였다. 0.8% 저융점 아가로스를 갖는 1 ml 배양 배지를 6-웰 플레이트 중 3개의 웰 각각에 먼저 플레이팅하였다. 한천이 응고된 후, 각 웰에 100개의 세포를 함유하는 배양 배지 중의 0.4% 한천 1 ml를 추가로 공급하였다. 14일 후, 콜로니를 고정시키고, 0.1% 크레실 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 각 세포주에 대해 3개의 반복된 웰로부터 수동으로 계수하여 콜로니의 수를 현미경으로 측정하였다. 각 융합체-과발현 세포주의 대표적인 모습이 도 13에 나타낸다. 연성 한천에서 부착 비의존성 세포 성장은 FGFR 융합체가 안정하게 형질감염된 세포에서 검출될 수 있지만, 빈(empty) 벡터 대조군에서는 검출될 수 없다. 도 13b는 FGFR 융합체가 안정하게 형질감염된 RK3E 세포 및 빈 벡터 대조군의 연성 한천에서 콜로니의 정량 분석을 나타낸다. 모든 실험을 2회 수행하였고, 결과를 콜로니/플레이팅된 100개의 세포로 표현한다. 시험한 모든 FGFR 융합체는 부착 비의존성 성장을 유도하여, 이들의 형질전환 능력을 강조하였다.
하류 표적 발현
FGFR 융합체가 안정하게 형질감염된 RK3E 세포를 완전 성장 배지에 플레이팅하고, 하룻밤 동안 무혈청으로 기아상태에 둔 다음(serum starved), 0.5% FBS 성장 배지를 재공급하였다. 세포를 리간드의 존재 하에서 1시간 동안 1μM의 JNJ-42756493, AZD4547 또는 NVP-BGJ398로 처리하였다. 면역블로팅을 위해, RIPA 완충액 (미국 매사추세츠주 월섬 소재의 서모 사이언티픽)에서 전세포 용해물을 수집하여, BCA 단백질 분석(BCA Protein Assay) (서모 사이언티픽)을 사용하여 샘플의 단백질 농도를 분석하였다. 동량의 단백질 (레인당 30 ㎍)을 4 내지 12% Bis-Tris 겔 (인비트로겐) 상에 로딩한 후, SDS-페이지를 수행하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, p-FGFR, 총(total)-FGFR2, p-MAPK, 총-MAPK, p-S6, 총 S6, B- 액틴 (미국 매사추세츠주 덴버 소재의 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)) 및 총-FGFR3 (미국 텍사스주 댈러스 소재의 산타 크루즈(Santa Cruz))에 대한 항체로 탐침하였다. 막을 실온에서 1시간 동안 오디세이(Odyssey) 차단 완충액으로 차단하고, 오디세이 차단 완충액으로 희석한 (1:1000) 1차 항체 용액에서 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 0.1% 트윈 트리스 완충 식염수(Tween tris buffered saline; TBST)에서 3회 세정한 후, 막을 실온에서 1시간 동안 오디세이 차단 완충액에서, 염소 항-마우스 또는 당나귀 항-토끼 IR-염료 670 또는 800cw로 표지된 2차 항혈청으로 탐침하였다. 2차 표지 후에 세정을 반복하고, 막을 리코르(LiCor) 오디세이 스캐너 및 오디세이 3.0 분석 소프트웨어 (미국 뉴잉글랜드주 링컨 소재의 리코르)를 사용하여 이미지화하였다. JNJ-42756493의 효과를 AZD4547 및 NVP-BGJ398과 비교하였다. 도 14a 내지 14h에 나타낸 바와 같이, JNJ-42756493, AZD4547 및 NVP-BGJ398 (각 블롯에서 레인 2 내지 4)의 처리는 FGFR 및 하류 표적인 MAPK 및 S6의 인산화를 억제하였다.
FGFR 융합체 과발현 세포주에 대한 약물 반응 검사
FGFR 융합체가 안정하게 형질감염된 RK3E 세포를 완전 성장 배지 + 리간드 FGF-1 및 FGF-2에서 96웰 플레이트 (1000개의 세포/웰)에 삼중으로 시딩(seeded)하였다. 24시간 후, 세포를 하룻밤 동안 무혈청으로 기아상태에 둔 다음, 0.5% FBS 성장 배지를 재공급하였다. 플레이팅 72시간 후, 세포를 JNJ493, AZD4547 (AZD) 및 NVP-BGJ398 (NVS)의 10μM에서 시작하는 18 포인트 1:3 희석액 시리즈의 다양한 농도로 처리하였다. 이어서, 미량정량판을 72시간 동안 인큐베이션하고, (수정된) 제조업자의 지침에 따라 셀타이터-글로(Cell Titer-Glo)® 발광 세포 생존율 분석(Luminescent Cell Viability assay) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.))을 사용하여 아데노신 삼인산 (ATP, 대사 활성 세포 마커) 함량에 대해 분석하였다. 요약하면, 세포를 실온으로 평형을 이루게 두는데, 이때 셀타이터-글로® 시약의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 이어서, 세포를 2분 동안 회전식 진탕기에 놓고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여, 발광 신호를 안정화시켰다. 발광을 정량하고 엔비젼 멀티라벨(Envision Multilabel) 플레이트 판독기 (미국 매사추세츠주 월댐 소재의 펄킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정을 수행하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0을 사용하여 IC50 값 (표 14에 도시됨)을 계산하였다. 표 14에 나타낸 바와 같이, FGFR 융합체를 보유하는 세포는 시험관 내에서 FGFR 억제제인 JNJ-42756493, AZD4547 및 NVP-BGJ398에 대한 민감도를 나타내었는데, JNJ-42756493은 AZD4547 및 NVP-BGJ398에 비하여 개선된 민감도 (나노몰 농도 범위)를 나타내는 반면, 빈 벡터 대조군은 그렇지 않았다.
[표 14]
[표 15]
본 기술 분야의 숙련인은 다수의 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 실시양태로 수행될 수 있으며, 이러한 변화 및 변형은 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 청구된 청구범위는 모든 이러한 동등한 변형을 본 발명의 사상 및 범주 내로서 포함하고자 한다.
이 문서에 인용되거나 기재된 각 특허, 특허 출원 및 출판물의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
FGFR 융합 유전자의 뉴클레오티드 서열
발현 벡터로 유전자 조작된 FGFR 융합 cDNA의 뉴클레오티드 서열이 표 16에 제공되어 있다. 밑줄친 서열은 FGFR3 또는 FGFR2에 상응하고, 정상적인 글꼴의 서열은 융합 파트너를 나타내며, 이탤릭체로 나타낸 서열은 FGFR3 유전자의 인트론 서열을 나타낸다.
[표 16]
실시 형태
하기 실시 형태의 목록은 이전 설명을 대신하거나 대체하기보다는 보완하기 위한 것이다.
실시 형태 1. 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응하는 암 환자를 확인하는 방법으로서,
환자의 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 FGFR 돌연변이에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 여기서 FGFR 돌연변이는 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이고, 상기 평가하는 단계는
FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계; 및
FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응한다는 것을 나타내는, 방법.
실시 형태 2. 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응하는 암 환자를 확인하는 방법으로서,
환자의 생물학적 샘플을 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 여기서 FGFR 돌연변이는 FGFR 융합 유전자 또는 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이고, 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응한다는 것을 나타내는, 방법.
실시 형태 3. FGFR 융합 유전자가 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 4. FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성이 R248C, S249C, G370C 또는 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 5. 암이 방광암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 6. 암이 전이성 방광암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 7. 암이 난소암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 8. 암이 두경부암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 9. 암이 전이성 두경부암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 10. 암이 식도암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR2:BICC1, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 11. 암이 전이성 식도암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 12. 암이 비소세포 폐암 선암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 13. 암이 비소세포 폐암 편평상피세포암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 14. 암이 전이성 자궁내막암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 15. 암이 유방암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCD6 또는 FGFR2:OFD1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 16. 암이 간세포암이고, FGFR 돌연변이 유전자 패널이 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 인트론, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR2:OFD1, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C 또는 FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법.
실시 형태 17. 평가하는 단계가 FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함하는, 실시 형태 2 내지 실시 형태 16 중 어느 하나의 방법.
실시 형태 18. cDNA가 예비-증폭된 cDNA인, 실시 형태 17의 방법.
실시 형태 19. FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍이
FGFR3:TACC3 v1 및 서열 번호:5 및 서열 번호:6의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR3:TACC3 v3 및 서열 번호:7 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR3:TACC3 인트론 및 서열 번호:9 및 서열 번호:10의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR3:BAIAP2L1 및 서열 번호:11 및 서열 번호:12의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR2:BICC1 및 서열 번호:13 및 서열 번호:14의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR2:AFF3 및 서열 번호:15 및 서열 번호:16의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR2:CASP7 및 서열 번호:17 및 서열 번호:18의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR2:CCDC6 및 서열 번호:19 및 서열 번호:20의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
FGFR2:OFD1 및 서열 번호:21 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
R248C 및 서열 번호:23 및 서열 번호:24 또는 서열 번호:31 및 서열 번호:32의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
S249C 및 서열 번호:25 및 서열 번호:26 또는 서열 번호:33 및 서열 번호:34의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
G370C 및 서열 번호:27 및 서열 번호:28 또는 서열 번호:35 및 서열 번호:36의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
Y373C 및 서열 번호:29 및 서열 번호:30 또는 서열 번호:37 및 서열 번호:38의 아미노산 서열을 갖는 프라이머;
또는 이들의 임의의 조합인, 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 하나의 방법.
실시 형태 20. 평가하는 단계가 생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계 및 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계를 포함하는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 19 중 어느 하나의 방법.
실시 형태 21. 증폭시키는 단계 이전에 cDNA를 예비-증폭시키는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 20의 방법.
실시 형태 22. cDNA가 예비증폭되는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 3 내지 실시 형태 21 중 어느 하나의 방법.
실시 형태 23. 증폭시키는 단계가 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 3 내지 실시 형태 22 중 어느 하나의 방법.
실시 형태 24. 실시간 PCR이 서열 번호:43, 서열 번호:44, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:52, 서열 번호:53, 서열 번호:54 및/또는 서열 번호:55를 포함하는 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행되는, 실시 형태 23의 방법.
실시 형태 25. 실시간 PCR이 서열 번호:39, 서열 번호:40, 서열 번호:41 및/또는 서열 번호:42를 포함하는 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되는, 실시 형태 23 또는 실시 형태 24의 방법.
실시 형태 26. 상기 결정하는 단계가 증폭된 cDNA를 시퀀싱하는 단계를 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 3 내지 실시 형태 25 중 어느 하나의 방법.
실시 형태 27. 생물학적 샘플에서 하나 이상의 FGFR 돌연변이 유전자의 존재를 확인하기 위한 키트로서,
서열 번호:5 및 서열 번호:6, 서열 번호:7 및 서열 번호:8, 서열 번호:9 및 서열 번호:10, 서열 번호:11 및 서열 번호:12, 서열 번호:13 및 서열 번호:14, 서열 번호:15 및 서열 번호:16, 서열 번호:17 및 서열 번호:18, 서열 번호:19 및 서열 번호:20, 서열 번호:21 및 서열 번호:22, 서열 번호:23 및 서열 번호:24, 서열 번호:25 및 서열 번호:26, 서열 번호:27 및 서열 번호:28, 서열 번호:29 및 서열 번호:30, 서열 번호:31 및 서열 번호:32, 서열 번호:33 및 서열 번호:34, 서열 번호:35 및 서열 번호:36, 서열 번호:37 및 서열 번호:38 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 갖는 프라이머 쌍; 및
하나 이상의 FGFR 돌연변이 유전자를 검출하기 위한 분석을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
실시 형태 28. 하나 이상의 프로브, 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드 또는 둘 모두를 추가로 포함하는, 실시 형태 27의 키트.
실시 형태 29.
a.
프라이머 쌍이 서열 번호:5 및 서열 번호:6의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:43의 서열을 가지며;
b.
프라이머 쌍이 서열 번호:7 및 서열 번호:8의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:44의 서열을 가지며;
c.
프라이머 쌍이 서열 번호:9 및 서열 번호:10의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:46의 서열을 가지며;
d.
프라이머 쌍이 서열 번호:11 및 서열 번호:12의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:47의 서열을 가지며;
e.
프라이머 쌍이 서열 번호:13 및 서열 번호:14의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:45의 서열을 가지며;
f.
프라이머 쌍이 서열 번호:15 및 서열 번호:16의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:48의 서열을 가지며;
g.
프라이머 쌍이 서열 번호:17 및 서열 번호:18의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:49의 서열을 가지며;
h.
프라이머 쌍이 서열 번호:19 및 서열 번호:20의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:50의 서열을 가지며;
i.
프라이머 쌍이 서열 번호:21 및 서열 번호:22의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:51의 서열을 가지며;
j.
프라이머 쌍이 서열 번호:23 및 서열 번호:24의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:52의 서열을 가지며;
k.
프라이머 쌍이 서열 번호:25 및 서열 번호:26의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:53의 서열을 가지며;
l.
프라이머 쌍이 서열 번호:27 및 서열 번호:28의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:54의 서열을 가지며;
m.
프라이머 쌍이 서열 번호:29 및 서열 번호:30의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:55의 서열을 가지며;
n.
프라이머 쌍이 서열 번호:31 및 서열 번호:32의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:52의 서열을 가지며 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드가 서열 번호:39의 서열을 갖고;
o.
프라이머 쌍이 서열 번호:33 및 서열 번호:34의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:53의 서열을 가지며 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드가 서열 번호:40의 서열을 갖고;
p.
프라이머 쌍이 서열 번호:35 및 서열 번호:36의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:54의 서열을 가지며 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드가 서열 번호:41의 서열을 갖고;
q.
프라이머 쌍이 서열 번호:37 및 서열 번호:38의 서열을 갖고 프로브가 서열 번호:55의 서열을 가지며 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드가 서열 번호:42의 서열을 갖거나; 또는
r.
이들의 임의의 조합을 포함하는, 실시 형태 28의 키트.
실시 형태 30. 서열 번호:5, 서열 번호:6, 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:9, 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13, 서열 번호:14, 서열 번호:15, 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18, 서열 번호:19, 서열 번호:20, 서열 번호:21, 서열 번호:22, 서열 번호:23, 서열 번호:24, 서열 번호:25, 서열 번호:26, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38 또는 이들의 임의의 조합의 아미노산 서열을 갖는 프라이머.
실시 형태 31. 서열 번호:5 및 서열 번호:6, 서열 번호:7 및 서열 번호:8, 서열 번호:9 및 서열 번호:10, 서열 번호:11 및 서열 번호:12, 서열 번호:13 및 서열 번호:14, 서열 번호:15 및 서열 번호:16, 서열 번호:17 및 서열 번호:18, 서열 번호:19 및 서열 번호:20, 서열 번호:21 및 서열 번호:22, 서열 번호:23 및 서열 번호:24, 서열 번호:25 및 서열 번호:26, 서열 번호:27 및 서열 번호:28, 서열 번호:29 및 서열 번호:30, 서열 번호:31 및 서열 번호:32, 서열 번호:33 및 서열 번호:34, 서열 번호:35 및 서열 번호:36, 서열 번호:37 및 서열 번호:38 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 갖는 프라이머의 세트.
실시 형태 32. 서열 번호:43 내지 55 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브.
실시 형태 33. 서열 번호:39 내지 42 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
SEQUENCE LISTING
<110> JANSSEN PHARMACEUTICA N.V.
<120> USE OF FGFR MUTANT GENE PANELS IN IDENTIFYING CANCER PATIENTS
THAT WILL BE RESPONSIVE TO TREATMENT WITH AN FGFR INHIBITOR
<130> 103693.000782
<140>
<141>
<150> 62/056,159
<151> 2014-09-26
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 268
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tcggaccgcg gcaactacac ctgcgtcgtg gagaacaagt ttggcagcat ccggcagacg 60
tacacgctgg acgtgctgga gtgctccccg caccggccca tcctgcaggc ggggctgccg 120
gccaaccaga cggcggtgct gggcagcgac gtggagttcc actgcaaggt gtacagtgac 180
gcacagcccc acatccagtg gctcaagcac gtggaggtga atggcagcaa ggtgggcccg 240
gacggcacac cctacgttac cgtgctca 268
<210> 2
<211> 378
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gaccgcggca actacacctg cgtcgtggag aacaagtttg gcagcatccg gcagacgtac 60
acgctggacg tgctgggtga gggccctggg gcggcgcggg ggtgggggcg gcagtggcgg 120
tggtggtgag ggagggggtg gcccctgagc gtcatctgcc cccacagagc gctgcccgca 180
ccggcccatc ctgcaggcgg ggctgccggc caaccagacg gcggtgctgg gcagcgacgt 240
ggagttccac tgcaaggtgt acagtgacgc acagccccac atccagtggc tcaagcacgt 300
ggaggtgaat ggcagcaagg tgggcccgga cggcacaccc tacgttaccg tgctcaaggt 360
gggccaccgt gtgcacgt 378
<210> 3
<211> 234
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gcgggcaatt ctattgggtt ttctcatcac tctgcgtggc tggtggtgct gccagccgag 60
gaggagctgg tggaggctga cgaggcgtgc agtgtgtatg caggcatcct cagctacggg 120
gtgggcttct tcctgttcat cctggtggtg gcggctgtga cgctctgccg cctgcgcagc 180
ccccccaaga aaggcctggg ctcccccacc gtgcacaaga tctcccgctt cccg 234
<210> 4
<211> 301
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ctagaggttc tctccttgca caacgtcacc tttgaggacg ccggggagta cacctgcctg 60
gcgggcaatt ctattgggtt ttctcatcac tctgcgtggc tggtggtgct gccagccgag 120
gaggagctgg tggaggctga cgaggcgggc agtgtgtgtg caggcatcct cagctacggg 180
gtgggcttct tcctgttcat cctggtggtg gcggctgtga cgctctgccg cctgcgcagc 240
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c 301
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<213> Artificial Sequence
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cacgaggact ccggggccta cagctgccgg cagcggctca cgcagcgcgt actgtgccac 360
ttcagtgtgc gggtgacaga cgctccatcc tcgggagatg acgaagacgg ggaggacgag 420
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gccaaccaga cggcggtgct gggcagcgac gtggagttcc actgcaaggt gtacagtgac 840
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gacggcacac cctacgttac cgtgctcaag acggcgggcg ctaacaccac cgacaaggag 960
ctagaggttc tctccttgca caacgtcacc tttgaggacg ccggggagta cacctgcctg 1020
gcgggcaatt ctattgggtt ttctcatcac tctgcgtggc tggtggtgct gccagccgag 1080
gaggagctgg tggaggctga cgaggcgggc agtgtgtatg caggcatcct cagctacggg 1140
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cgacaggtgt ccctggagtc caacgcgtcc atgagctcca acacaccact ggtgcgcatc 1320
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gacctggtgt ctgagatgga gatgatgaag atgatcggga aacacaaaaa catcatcaac 1620
ctgctgggcg cctgcacgca gggcgggccc ctgtacgtgc tggtggagta cgcggccaag 1680
ggtaacctgc gggagtttct gcgggcgcgg cggcccccgg gcctggacta ctccttcgac 1740
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gtggcccggg gcatggagta cttggcctcc cagaagtgca tccacaggga cctggctgcc 1860
cgcaatgtgc tggtgaccga ggacaacgtg atgaagatcg cagacttcgg gctggcccgg 1920
gacgtgcaca acctcgacta ctacaagaag acgaccaacg gccggctgcc cgtgaagtgg 1980
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gaggagctct tcaagctgct gaaggagggc caccgcatgg acaagcccgc caactgcaca 2160
cacgacctgt acatgatcat gcgggagtgc tggcatgccg cgccctccca gaggcccacc 2220
ttcaagcagc tggtggagga cctggaccgt gtccttaccg tgacgtccac cgacgtaaag 2280
gcgacacagg aggagaaccg ggagctgagg agcaggtgtg aggagctcca cgggaagaac 2340
ctggaactgg ggaagatcat ggacaggttc gaagaggttg tgtaccaggc catggaggaa 2400
gttcagaagc agaaggaact ttccaaagct gaaatccaga aagttctaaa agaaaaagac 2460
caacttacca cagatctgaa ctccatggag aagtccttct ccgacctctt caagcgtttt 2520
gagaaacaga aagaggtgat cgagggctac cgcaagaacg aagagtcact gaagaagtgc 2580
gtggaggatt acctggcaag gatcacccag gagggccaga ggtaccaagc cctgaaggcc 2640
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<213> Artificial Sequence
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tcggaccgcg gcaactacac ctgcgtcgtg gagaacaagt ttggcagcat ccggcagacg 720
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ggggaagatc atggacaggt tcgaagaggt tgtgtaccag gccatggagg aagttcagaa 4020
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Claims (18)
- 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 억제제를 사용한 치료에 반응하는 방광암 환자를 확인하는 방법으로서,
환자의 생물학적 샘플을, FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 하나 이상의 FGFR 돌연변이는 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7 또는 이들의 조합을 포함하고,
여기서 상기 FGFR 억제제는 하기 화학식 (I)의 구조를 가지는 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고,
여기서, FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, 또는 이들의 조합의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것임을 나타내는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 평가하는 단계가
EGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계; 및
FGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, 또는 이들의 조합의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것임을 나타내는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 FGFR 단일 뉴클레오티드 다형성 FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, FGFR3 Y373C, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 평가하는 단계가
EGFR 돌연변이 유전자 패널로부터의 하나 이상의 FGFR 돌연변이를 증폭시키는 한 쌍의 프라이머로 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제4항에 있어서, cDNA가 예비-증폭된(pre-amplified) cDNA인 것인, 방법.
- 제5항에 있어서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍이
서열 번호 5 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3:TACC3 v1 및 프라이머;
서열 번호 7 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3:TACC3 v3 및 프라이머;
서열 번호 11 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3:BAIAP2L1 및 프라이머;
서열 번호 13 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 가지는 FGFR2:BICC1 및 프라이머;
서열 번호 15 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가지는 FGFR2:AFF3 및 프라이머;
서열 번호 17 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 가지는 FGFR2:CASP7 및 프라이머;
또는 이들의 임의의 조합인 것인, 방법. - 제6항에 있어서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍이
서열 번호 5 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3:TACC3 v1 및 프라이머;
서열 번호 7 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3:TACC3 v3 및 프라이머;
또는 둘 모두인 것인, 방법. - 제6항에 있어서, 하나 이상의 FGFR 돌연변이 및 프라이머 쌍이
서열 번호 23 및 서열 번호 24 또는 서열 번호 31 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3 R248C 및 프라이머;
서열 번호 25 및 서열 번호 26 또는 서열 번호 33 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3 S249C 및 프라이머;
서열 번호 27 및 서열 번호 28 또는 서열 번호 35 및 서열 번호 36의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3 G370C 및 프라이머;
서열 번호 29 및 서열 번호 30 또는 서열 번호 37 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 가지는 FGFR3 Y373C 및 프라이머;
또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제4항에 있어서, 평가하는 단계가 생물학적 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 및 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 증폭시키는 단계가 실시간 중합효소 연쇄 반응(실시간 PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제10항에 있어서, 실시간 PCR이 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 48 및 서열 번호 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
- 제11항에 있어서, 실시간 PCR이 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54 및 서열 번호 55로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 하나 이상의 프로브를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
- 제12항에 있어서, 실시간 PCR이 서열 번호 39, 서열 번호 41 및 서열 번호 42로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 하나 이상의 3' 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 결정하는 단계가, 증폭된 cDNA를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서 하나 이상의 FGFR 돌연변이가 FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, 또는 둘 모두를 포함하고,
여기서, GFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, 또는 둘 모두의 존재는 환자가 FGFR 억제제를 사용한 치료에 반응할 것임을 나타내는 것인, 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR 억제제가 하기 화학식 (I)의 구조를 가지는 화합물인 것인, 방법:
.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 방광암이 전이성 방광암인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 방광암이 요로상피세포암종인 것인, 방법.
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