ES2912567T3

ES2912567T3 - Uso de paneles de genes mutantes de FGFR en la identificación de pacientes con cáncer que serán responsable al tratamiento con un inhibidor de FGFR

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Publication number: ES2912567T3
Application number: ES15782109T
Authority: ES
Inventors: Jayaprakash Karkera; Suso Jesus Platero
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2022-05-26
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: AU2021277633A1; EP3198033A2; SG11201702381QA; CO2017003528A2; HRP20220496T1; KR20170062495A; LT3198033T; KR102470456B1; RS63178B1; PT3198033T; TWI706136B; AU2015321626A1; MX2017003954A; ECSP17025787A; UA122564C2; MX2022006536A; AU2015321626B2; EP3198033B1; EA037920B1; CA2962075A1

Abstract

Un método para identificar a un paciente con cáncer de vejiga que responde al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), en donde el inhibidor de FGFR comprende un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (I), **(Ver fórmula)** un N-óxido del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, y en donde el método comprende: (a) evaluar una muestra biológica del paciente en busca de un mutante de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es el polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR FGFR3 S249C, y en donde dicho evaluar comprende amplificar ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR; y determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR están presentes en la muestra, en la que la presencia de uno o más mutantes de FGFR, de los cuales un mutante sería FGFR3 S249C, indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR; o (b) evaluar una muestra biológica del paciente para determinar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es el polimorfismo de un solo nucleótido FGFR FGFR3 S249C, en donde la presencia de uno o más FGFR mutantes indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de paneles de genes mutantes de FGFR en la identificación de pacientes con cáncer que serán responsable al tratamiento con un inhibidor de FGFR

CAMPO TÉCNICO

[0001] En el presente documento se proporcionan métodos para identificar a un paciente con cáncer que responderá al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.

ANTECEDENTES

[0002] La identificación de anomalías genéticas puede ser útil en la selección de la(s) terapia(s) apropiada(s) para pacientes con cáncer. Esto también es útil para los pacientes con cáncer que fallan en la opción terapéutica principal (terapia de primera línea) para ese tipo de cáncer, particularmente si no existe un estándar de atención aceptado para la terapia de segunda línea y posteriores. Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) son una familia de tirosina quinasas receptoras involucradas en la regulación de la supervivencia, proliferación, migración y diferenciación celular. Se han observado alteraciones de FGFR en algunos tipos de cáncer. Hasta la fecha, no existen terapias aprobadas que sean eficaces en pacientes con alteraciones del FGFR.

[0003] El documento US2013/296326 describe un método mediante el cual se buscan variaciones genéticas dentro del gen que codifica para FGFR2. WO2014/071419 y WO2014/113729 proporcionan genes de fusión FGFR e inhibidores para FGFR2 para su uso en la administración a pacientes con cáncer. Wu et al. identifica las proteínas de fusión FGFR y su efecto en el tratamiento del cáncer. Trudel et al. identifica una mutación particular dentro del gen que codifica para FGFR3. WO2014/007369 identifica transcritos de fusión en marco entre el gen FGFR2 y, entre otros, BICC1. El documento EP1659175 proporciona el hallazgo de que las mutaciones dentro del gen FGFR3 confieren sensibilidad al tratamiento de enfermedades neoplásicas con inhibidores de FGFR3. WO2014/018841 proporciona un método mediante el cual se lleva a cabo el tratamiento del cáncer con inhibidores de FGFR en el caso de un gen FGFR3 mutado. El documento WO2013/179034 proporciona un método mediante el cual el FGFR3 comprende mutaciones activadoras. Singh et al. se centran en el efecto de los genes y proteínas de fusión FGFR3: TACC3 en el contexto de los inhibidores de FGFR del glioblastoma. Parker et al. describen cómo la fusión del gen tumorigénico FGFR3-TACC3 escapa a la regulación miR99a en el glioblastoma. Williams et al. describen fusiones del gen FGFR3 oncogénico en el cáncer de vejiga. WO2014/051022 proporciona la proteína de fusión FGFR3: BAIAP21L. Sabnis et al. identifica múltiples proteínas de fusión FGFR en diversos tipos de cáncer. El documento WO2013/089882 proporciona un método para visualizar la proteína de fusión FGFR2: AFF3 y la posterior aplicación de un inhibidor de la vía de fusión génica. Shinmura et al. describen una nueva mutación somática de FGFR3 en el cáncer de pulmón primario. EP1964837 considera la administración de inhibidores de FGFR3 a pacientes que padecen cáncer. Las entradas de la base de datos de Geneseq con los números de registro de EBI GSN:Ba T14432 y g Dn :ATM46802 proporcionan cebadores de PCR de fusión de genes FGFR3-TACC3 y secuencias diana de ARNm de FGFR2 humano, respectivamente.

RESUMEN

[0004] La invención proporciona un método para identificar a un paciente con cáncer de vejiga que responde al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), en donde el inhibidor de FGFR comprende un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (I),

un N-óxido del mismo, una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, o un solvato del mismo, y en donde el método comprende:

(a) evaluar una muestra biológica del paciente en busca de un mutante de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es el polimorfismo de nucleótido simple de FGFR FGFR3 S249C, y en donde dicha evaluación comprende

amplificar ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR; y

determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde la presencia de uno o más mutantes de FGFR, de los cuales un mutante sería FGFR3 S249C, indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR; o,

(b) evaluar una muestra biológica del paciente para detectar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es el polimorfismo FGFR de un solo nucleótido FGFR3 S249C, en donde la presencia de uno o más mutantes de FGFR indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

[0005] En el presente documento se describen métodos para identificar a un paciente con cáncer que responderá al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que comprende:

evaluar una muestra biológica del paciente en busca de un mutante de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es un gen de fusión de FGFR o un polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR, y en donde dicha evaluación comprende amplificar el ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR; y

determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes están presentes en la muestra, en donde la presencia de uno o más mutantes de FGFR indica que el paciente responderá al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

[0006] También se describen métodos para tratar el cáncer en un paciente que comprenden: evaluar una muestra biológica del paciente para detectar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR; y tratar al paciente con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra.

[0007] Los kits y cebadores para identificar la presencia de uno o más genes mutantes de FGFR en una muestra biológica también se proporcionan en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0008] El resumen, así como la siguiente descripción detallada, se entiende mejor cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar los métodos, kits y cebadores descritos, en los dibujos se muestran formas de realización ejemplares de los métodos, kits y cebadores; sin embargo, los métodos, kits y cebadores no se limitan a las formas de realización específicas descritas. En los dibujos:

FIG. 1 es una ilustración de ejemplos de genes de fusión de FGFR, la presencia de al menos uno de los cuales indica que un paciente responderá al tratamiento con un inhibidor de FGFR. También se ilustran (flechas pequeñas) las ubicaciones de cebadores ejemplares para amplificar los genes de fusión.

FIG. 2, que comprende las FIGS. 2A-2I, representa resultados de secuenciación de Sanger de muestras FFPET positivas para: A) FGFR3: TACC3 v1; B) FGFR3: TACC3 v3; C) intrón FGFR3: TACC3; D) FGFR3: BAIAP2L1; E) FGFR2: AFF3; F) FGFR2: BICC1; G) FGFR2: CASP7; H) FGFR2: CCDC6; y I) FGFR2: OFD1.

FIG. 3 ilustra una estrategia de ejemplo para qRT-PCR específica de s Np utilizando un oligonucleótido bloqueador didesoxi de tipo salvaje (WT) en 3'.

FIG. 4 ilustra una estrategia de validación analítica ejemplar para detectar FGFR SNP. Los experimentos se realizaron en líneas celulares RK3E manipuladas que expresaban las fusiones FGFR y se diluyeron en una línea celular de tipo salvaje que no albergaba fusiones FGFR3/FGFR2.

FIG. 5, que comprende las FIGS. 5A-5D, ilustra la PCR específica de SNP con bloqueador didesoxi WT para (A) G370C, (B) Y373C, (C) S249C y (D) R248C.

FIG. 6, que comprende las FIGS. 6A-6I, representa curvas estándar de eficiencia para los ensayos de genes de fusión FGFR: A) FGFR3: TACC3 v1; B) FGFR3: TACC3 v3; C) intrón FGFR3: TACC3; D) FGFR3: BAIAP2L1; E) FGFR2: AFF3; F) FGFR2: BICC1; G) FGFR2: CASP7; H) FGFR2: CCDC6; y I) FGFR2: OFD1.

FIG. 7 es una forma de representación ejemplar del estado del gen de fusión FGFR en vejiga (primario y metastásico), NSCLC (adenocarcinoma y escamoso), ovario, esofágico (primario y metastásico), cabeza y cuello (H&N; primario y metastásico), endometrial (metastásico), cáncer de mama y de próstata.

FIG. 8 es una forma de representación ejemplar del gen de fusión FGFR y el estado de mutación en adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas NSCLC.

FIG. 9, que comprende las FIGS. 9A-9D, representa resultados ejemplares de muestras de pacientes de fase I. Los ensayos se realizaron utilizando control de ensayo de plantilla sintética (ST), cebadores para GAPDH (muestra de control de calidad) o cebadores específicos para: A) fusiones FGFR2: BICC1; B) fusiones FGFR3: TACC3 (exón 18:exón 1); C) fusiones FGFR2: CCDC6; o D) fusiones FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3 o FGFR2: CCDC6. Las muestras de pacientes son las siguientes: A - carcinoma urotelial; B - cáncer de vejiga; C -colangiocarcinoma; y D - carcinoma suprarrenal.

FIG. 10 representa un diseño de estudio de fase I ejemplar para un primer estudio en humanos de JNJ-42756493 en pacientes con tumor sólido avanzado.

FIG. 11 representa la reducción máxima del porcentaje inhibitorio de la suma de los diámetros de las lesiones específicas de línea base con nivel de dosis mayor o igual a 6 mg. Los pacientes con tumores sólidos fueron tratados con el inhibidor de FGFR JNJ-42756493 en diferentes dosis administradas ya sea como un régimen diario o como un régimen de dosificación intermitente (7 días con - 7 días sin). Se indican las dosis y los tipos de tumores. La reducción del tumor se midió según los criterios RECIST. Los pacientes cuyos tumores albergan translocaciones y mutaciones del gen FGFR parecen ser más sensibles al inhibidor de FGFR JNJ-42756493.

FIG. 12 ilustra la expresión de varias fusiones de FGFR en células RK3E transfectadas de forma estable con la fusión de FGFR indicada.

FIG. 13, que comprende las FIGS. 13A-13B, ilustra ensayos de formación de colonias en células RK3E transfectadas de forma estable con la fusión de FGFR indicada. (A) cámaras de 6 pocillos teñidas con cristal violeta de cresilo al 0,1 % y (B) gráfico de barras que ilustra el número de colonias/100 células sembradas. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

FIG. 14, que comprende las FIGS. 14A-14H, ilustra la expresión de objetivos corriente abajo ejemplares en células r K3E transfectadas de forma estable con la fusión FGFR indicada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN ILUSTRATIVAS

[0009] Los métodos, kits y cebadores descritos pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las figuras adjuntas, que forman parte de esta descripción. Debe entenderse que los métodos, kits y cebadores divulgados no se limitan a los métodos, kits y cebadores específicos descritos y/o mostrados en este documento, y que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir formas de realización particulares a modo de solo como ejemplo y no pretende ser una limitación de los métodos, kits y cebadores reivindicados.

[0010] La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cuando se expresa un rango de valores, otra forma de realización incluye desde un valor particular y/o hasta otro valor particular. Además, la referencia a valores establecidos en rangos incluye todos y cada uno de los valores dentro de ese rango. Todos los rangos son inclusivos y combinables.

[0011] Debe apreciarse que ciertas características de los métodos, kits y cebadores divulgados que, para mayor claridad, se describen en el presente documento en el contexto de formas de realización separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única forma de realización. Por el contrario, varias características de los métodos, kits y cebadores divulgados que, por razones de brevedad, se describen en el contexto de una única forma de realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación.

[0012] Como se usa en este documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen el plural.

[0013] Las siguientes abreviaturas se utilizan a lo largo de la memoria descriptiva: FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos); LLOQ (límite inferior de cuantificación); FGFR3: TACC3 (fusión entre los genes que codifican FGFR3 y la proteína 3 que contiene espiral ácida transformadora); FGFR3: BAIAP2L1 (fusión entre los genes que codifican FGFR3 y el inhibidor de la angiogénesis específico del cerebro 1 asociado a la proteína 2 similar a la proteína 1); FGFR2: AFF3 (fusión entre genes que codifican f Gf R2 y familia AF4/FMR2, miembro 3); FGFR2: BICC1 (fusión entre genes que codifican FGFR2 y el homólogo 1 de C bicaudal); FGFR2: CASP7 (fusión entre genes que codifican FGFR2 y caspasa 7); FGFR2: CCDC6 (fusión entre genes que codifican FGFR2 y dominio enrollado que contiene 6); FGFR2: OFD1 (fusión entre genes que codifican FGFR2 y síndrome oral-facial-digital 1); FFPET (tejido embebido en parafina fijado con formalina); SNP (polimorfismo de un solo nucleótido); NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), ct (umbral del ciclo).

[0014] Como se usa en el presente documento, "tratar" y términos similares se refieren a reducir la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas del cáncer, eliminar los síntomas del cáncer y/o la causa subyacente de dichos síntomas, reducir la frecuencia o la probabilidad de los síntomas del cáncer y/o su causa subyacente, y mejorando o remediando el daño causado, directa o indirectamente, por el cáncer.

[0015] "Muestras biológicas" se refiere a cualquier muestra de un paciente en la que se pueden obtener células cancerosas y se puede aislar el ARN. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sangre, líquido linfático, médula ósea, una muestra de tumor sólido o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la muestra biológica puede ser FFPET.

[0016] Como se usa en el presente documento, "preamplificación" se refiere a un procedimiento de PCR que se realiza antes de la etapa de amplificación para aumentar la cantidad de ADNc de plantilla para la etapa de amplificación. Se puede realizar un paso de preamplificación, por ejemplo, utilizando TaqMan® PreAmp Master Mix (Life Technologies/Applied Biosystems® producto N° 4391128).

[0017] Como se usa en el presente documento, "amplificando", "amplificar" y términos similares se refieren a la generación de numerosas copias idénticas de una muestra de ácido nucleico. Las técnicas adecuadas para amplificar una muestra de ácido nucleico incluyen, entre otras, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). En algunas formas de realización, la etapa de amplificación comprende RT-PCR.

Mutantes de FGFR

[0018] Como se usa en el presente documento, la frase "mutante de FGFR" se refiere a un gen de fusión de FGFR, un polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR, o ambos.

[0019] "Fusión FGFR" o "gen de fusión FGFR" se refiere a un gen que codifica FGFR (p. ej., FGRF2 o FGFR3), o una parte del mismo, y uno de los socios de fusión descritos en el presente documento, o parte del mismo, creado por una translocación entre los dos genes. La presencia de uno o más de los siguientes genes de fusión FGFR en una muestra biológica de un paciente puede determinarse utilizando los métodos descritos: FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, Intron FGFR3: TACC3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR2: CCDC6, FGFR2: OFD1 o cualquier combinación de los mismos. La Tabla 1 proporciona los genes de fusión de FGFR y los exones del FGFR y de la pareja de fusión que están fusionados. FIG. 1 proporciona una ilustración de los diversos genes de fusión de FGFR. Las secuencias de los genes de fusión de FGFR individuales se describen en la Tabla 16.

Tabla 1

[0020] El "polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR" (SNP) se refiere a un gen FGFR2 o FGFR3 en donde un solo nucleótido difiere entre individuos. En particular, el polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR (SNP) se refiere a un gen FGFR3 en donde un solo nucleótido difiere entre individuos. La presencia de uno o más de los siguientes SNP de FGFR en una muestra biológica de un paciente puede determinarse utilizando los métodos descritos. Las secuencias de los SNP de FGFR se proporcionan en la Tabla 2.

Tabla 2

(Continuación)

[0021] Como se usa aquí, "panel de genes mutantes de FGFR" incluye uno o más de los mutantes de FGFR enumerados anteriormente. A veces, el panel de genes mutantes de FGFR depende del tipo de cáncer del paciente.

[0022] El panel de mutantes de FGFR que se usa en la etapa de evaluación de los métodos descritos se basa, en parte, en el tipo de cáncer del paciente. Para pacientes con cáncer de vejiga, un panel de genes mutantes FGFR adecuado puede comprender FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos.

[0023] Para pacientes con cáncer de vejiga metastásico, un panel de genes mutantes FGFR adecuado puede comprender FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos.

Cebadores para amplificar mutantes de FGFR

[0024] Un experto en la técnica sabe que la amplificación de ácido nucleico requiere cebadores que sean complementarios y se unan a una región 5' y 3' de la cadena de ácido nucleico que flanquea la región que se busca amplificar. Como se usa en el presente documento, "par de cebadores" se refiere a los cebadores directo e inverso usados en un paso de amplificación. Los pares de cebadores adecuados para realizar los métodos descritos se enumeran en la Tabla 3.

Tabla 3

(Continuación)

[0025] En este documento se describen cebadores que tienen la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, o cualquier combinación de los mismos.

[0026] También se describen aquí conjuntos de cebadores que tienen las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, o cualquier combinación de los mismos.

[0027] En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener secuencia de SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. En algunas formas de realización, el conjunto de cebadores puede tener las secuencias de cualquier combinación de los conjuntos de cebadores anteriores.

Inhibidores de FGFR para uso en los métodos descritos

[0028] En el presente documento se proporcionan inhibidores de FGFR adecuados para uso en los métodos descritos.

[0029] A veces, si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, el paciente puede tratarse con un inhibidor de FGFR descrito en la publicación de EE. UU. N° 2013/0072457 A1, incluida cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isómera del mismo, y un N-óxido del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo (los grupos R adecuados también se describen en la publicación de EE. UU. N° 2013/0072457 A1). En el método de la invención, el paciente puede ser tratado con N-(3,5-dimetoxifenil)-N-(1-metiletil)-N-[3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)quinoxalin-6-il]etano-1,2-diamina (denominado en el presente documento como "JNJ-42756493" o "JNJ493"):

incluyendo un N-óxido del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo. En algunos aspectos, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de HCl. En algunos aspectos, el paciente puede ser tratado con base JNJ493.

[0030] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es N-[5-[2-(3,5-dimetoxifenil)etil]-2H-pirazol-3-il]-4-(3,5-diemtilpiperazin-1-il)benzamida (AZD4547), como se describe en Gavine, P.R., et al., AZD4547: An Orally Bioavailable, Potent, and Selective Inhibitor of the Fibroblast Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Family, Cancer Res. 15 de abril de 201272; 2045:

incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isómera del mismo, y un N-óxido del mismo, una sal del mismo farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo.

[0031] A veces, el paciente puede tratarse con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimid-4-il}-1-metil-urea (NVP-BGJ398) como se describe en Publ. Int. N° W02006/000420:

incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, y un N-óxido del mismo, una sal del mismo farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo.

[0032] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-metilpiperazina-1-il)-1H-bencimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona (dovitinib) como se describe en Publ. Int. N° WO2006/127926:

incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, y un N-óxido del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo.

[0033] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es 6-(7-((1-aminociclopropil)-metoxi)-6-metoxiquinolin-4-iloxi)-W-metil-1-naftamida (AL3810) (lucitanib; E-3810), como se describe en Bello, E. et al., E-3810 Is a Potent Dual Inhibitor of VEGFR and FGFR that Exerts Antitumor Activity in Multiple Preclinical Models, Cancer Res 15 de febrero de 2011 71(A)1396-1405 e Publ. Int. N° WO2008/112408:

[0034] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es un anticuerpo anti-FGFR2 como el descrito en el documento WO2013/076186.

[0035] Los inhibidores de FGFR adecuados adicionales incluyen BAY1163877 (Bayer), BAY1179470 (Bayer), TAS-120 (Taiho), ARQ087 (ArQule), ASP5878 (Astellas), FF284 (Chugai), FP-1039 (GSK/FivePrime), Blueprint, LY-2874455 (Lilly), RG-7444 (Roche), o cualquier combinación de los mismos, incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxidos de los mismos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos o solvatos de los mismos.

[0036] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, en la que el inhibidor de FGFR es BAY1163877 (Bayer), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o solvato de los mismos.

[0037] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es BAY1179470 (Bayer), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos o solvato de los mismos.

[0038] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es TAS-120 (Taiho), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o solvato de los mismos.

[0039] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es ARQ087 (ArQule), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos o solvato de los mismos.

[0040] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es ASP5878 (Astellas), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos o solvato de los mismos.

[0041] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es FF284 (Chugai), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos o solvato de los mismos.

[0042] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es FP-1039 (GSK/FivePrime), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos o solvato de los mismos.

[0043] A veces, el paciente puede tratarse con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es Blueprint, que incluye, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o solvato de los mismos.

[0044] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es LY-2874455 (Lilly), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o solvato de los mismos.

[0045] A veces, el paciente puede ser tratado con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, donde el inhibidor de FGFR es RG-7444 (Roche), incluyendo, cuando sea químicamente posible, cualquier forma tautomérica o estereoquímicamente isomérica de los mismos, N-óxido de los mismos, sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o solvato de los mismos.

[0046] Las sales se pueden sintetizar a partir de un compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales, como los métodos descritos en Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, tapa dura, 388 páginas, agosto de 2002. En general, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente se utilizan medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Los inhibidores de FGFR para uso en los métodos descritos pueden existir como mono o disales dependiendo del pKa del ácido a partir del cual se forma la sal.

[0047] Las sales de adición de ácido se pueden formar con una amplia variedad de ácidos, tanto inorgánicos como orgánicos. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales formadas con un ácido que incluye, entre otros, acético, 2,2-dicloroacético, adípico, algínico, ascórbico (por ejemplo, L-ascórbico), L-aspártico, bencenosulfónico, benzoico, 4-acetamidobenzoico, butanoico, (+) canfórico, alcanfor-sulfónico, (+)-(1S)-alcanfor-10-sulfónico, cáprico, caproico, caprílico, cinámico, cítrico, ciclámico, dodecilsulfúrico, etano-1,2-disulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, fórmico, fumárico, galactárico, gentísico, glucoheptónico, D-glucónico, glucurónico (p. ej., D-glucurónico), glutámico (p. ej., L-glutámico), a-oxoglutárico, glicólico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, yodídico, isetiónico, láctico (por ejemplo, (+)-L-láctico, (±)-DL-láctico), lactobiónico, maleico, málico, (-)-L-málico, malónico, (±)-DL-mandélico, metanosulfónico, naftalenosulfónico (p. ej. naftaleno-2-sulfónico), naftaleno-1,5-disulfónico, 1 -hidroxi-2-naftoico, nicotínico, nítrico, oleico, orótico, oxálico, palmítico, pamoico, fosfórico, propiónico, L-piroglutámico, pirúvico, salicílico, ácidos 4-aminosalicílico, sebácico, esteárico, succínico, sulfúrico, tánico, (+)-L-tartárico, tiociánico, toluenosulfónico (p. ej., p-toluenosulfónico), undecilénico y valérico, así como aminoácidos acilados y resinas de intercambio catiónico.

[0048] Un grupo particular de sales consiste en sales formadas a partir de sales acéticas, clorhídricas, yodóricas, fosfóricas, nítricas, sulfúricas, cítricas, lácticas, succínicas, maleicas, málicas, isetiónicas, fumáricas, bencenosulfónicas, toluenosulfónicas, metanosulfónicas (mesilato), etanosulfónicas, ácidos naftalenosulfónico, valérico, propanoico, butanoico, malónico, glucurónico y lactobiónico. Otro grupo de sales de adición de ácido incluye sales formadas a partir de los ácidos acético, adípico, ascórbico, aspártico, cítrico, DL-láctico, fumárico, glucónico, glucurónico, hipúrico, clorhídrico, glutámico, DL-málico, metanosulfónico, sebácico, esteárico, succínico y tartárico.

[0049] Si el compuesto es aniónico, o tiene un grupo funcional que puede ser aniónico (por ejemplo, -COOH puede ser -COO-), entonces se puede formar una sal con un catión adecuado. Los ejemplos de cationes inorgánicos adecuados incluyen, entre otros, iones de metales alcalinos como Na+ y K+, cationes de metales alcalinotérreos como Ca2+ y Mg2+ y otros cationes como Al3+. Los ejemplos de cationes orgánicos adecuados incluyen, entre otros, iones de amonio (es decir, NH4+) y iones de amonio sustituidos (por ejemplo, NH3R+, NH2R2+, NR4+).

[0050] Los ejemplos de algunos iones de amonio sustituidos adecuados son los derivados de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina y trometamina, así como aminoácidos, como la lisina y la arginina. Un ejemplo de un ion de amonio cuaternario común es N(CH3)4+.

[0051] Cuando los compuestos contienen una función amina, estos pueden formar sales de amonio cuaternario, por ejemplo por reacción con un agente alquilante según métodos bien conocidos por el experto en la materia. Dichos compuestos de amonio cuaternario están dentro del alcance de los compuestos descritos. Los compuestos que contienen una función amina también pueden formar N-óxidos. Una referencia aquí a un compuesto que contiene una función amina también incluye el N-óxido. Cuando un compuesto contiene varias funciones amina, uno o más de un átomo de nitrógeno pueden oxidarse para formar un N-óxido. Ejemplos particulares de N-óxidos son los N-óxidos de una amina terciaria o un átomo de nitrógeno de un heterociclo que contiene nitrógeno. Los N-oxidos se pueden formar mediante el tratamiento de la amina correspondiente con un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o un perácido (p. ej., un ácido peroxicarboxílico), véase, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry, de Jerry March, 4a edición, Wiley Interscience, páginas. Más particularmente, los N-óxidos se pueden preparar mediante el procedimiento de L. W. Deady (Syn. Comm. (1977), 7, 509-514) en donde el compuesto de amina se hace reaccionar con ácido m-cloroperoxibenzoico (MCPBA), por ejemplo, en un disolvente inerte como el diclorometano.

[0052] Como se usa en el presente documento, el término "solvato" significa una asociación física del compuesto con una o más moléculas de disolvente. Esta asociación física implica diversos grados de enlace iónico y covalente, incluido el enlace de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo, cuando se incorporan una o más moléculas de disolvente en la red cristalina del sólido cristalino. El término "solvato" pretende abarcar tanto la fase de solución como los solvatos aislables. Los ejemplos no limitativos de solvatos adecuados incluyen los compuestos descritos en combinación con agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, etanolamina y similares. El compuesto puede ejercer sus efectos biológicos mientras está en solución.

[0053] Los solvatos son bien conocidos en química farmacéutica. Pueden ser importantes para los procesos de preparación de una sustancia (p. ej., en relación con su purificación), el almacenamiento de la sustancia (p. ej., su estabilidad) y la facilidad de manipulación de la sustancia, y a menudo se forman como parte del proceso de aislamiento o etapas de purificación de una síntesis química. Un experto en la materia puede determinar por medio de técnicas estándar y de uso prolongado si se ha formado un hidrato u otro solvato mediante las condiciones de aislamiento o las condiciones de purificación utilizadas para preparar un compuesto dado. Ejemplos de tales técnicas incluyen análisis termogravimétrico (TGA), calorimetría diferencial de barrido (DSC), cristalografía de rayos X (por ejemplo, cristalografía de rayos X de cristal único o difracción de rayos X en polvo) y RMN de estado sólido (SS-RMN, también conocido como Magic Angle Spinning RMN o MAS-RMN). Tales técnicas son una parte tan importante del conjunto de herramientas analíticas estándar del químico experto como la RMN, IR, HPLC y m S. Alternativamente, el experto en la materia puede formar deliberadamente un solvato utilizando condiciones de cristalización que incluyen una cantidad del disolvente necesaria para el solvato particular. Posteriormente, los métodos estándar descritos anteriormente pueden usarse para establecer si se han formado solvatos. También están incluidos todos los complejos (por ejemplo, complejos de inclusión o clatratos con compuestos tales como ciclodextrinas o complejos con metales) del inhibidor de FGFR.

[0054] Además, el compuesto puede tener una o más formas polimorfas (cristalinas) o amorfas.

[0055] Los compuestos incluyen compuestos con una o más sustituciones isotópicas, y una referencia a un elemento particular incluye dentro de su alcance todos los isótopos del elemento. Por ejemplo, una referencia al hidrógeno incluye dentro de su alcance 1H, 2H (D) y 3H (T). De manera similar, las referencias al carbono y al oxígeno incluyen dentro de su alcance, respectivamente, 12C, 13C y 14C y 16O y 18O. Los isótopos pueden ser radiactivos o no radiactivos. En una forma de realización, los compuestos no contienen isótopos radiactivos. Dichos compuestos son los preferidos para uso terapéutico. Sin embargo, en otra forma de realización, el compuesto puede contener uno o más radioisótopos. Los compuestos que contienen dichos radioisótopos pueden ser útiles en un contexto de diagnóstico.

[0056] En el método de la invención, el paciente se trata con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra, en donde el inhibidor de FGFR es N-(3,5-dimetoxifenil)-N'-(1-metiletil)-N-[3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)quinoxalin-6-il]etano-1,2-diamina (denominado en el presente "JNJ-42756493"), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo.

Métodos para tratar el cáncer en un paciente

[0057] En el presente documento se describen métodos para tratar el cáncer en un paciente que comprenden: evaluar una muestra biológica del paciente para determinar la presencia de uno o más mutantes de FGFr de un panel de genes mutantes de FGFR; y tratar al paciente con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra.

[0058] Los métodos divulgados se pueden usar para tratar una variedad de tipos de cáncer que incluyen, entre otros, cáncer de vejiga, cáncer de vejiga metastásico, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello metastásico, cáncer de esófago, cáncer de esófago metastásico, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón de células no pequeñas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, carcinoma urotelial, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer de endometrio metastásico, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, gliomas, carcinoma de colon, sarcomas, tumores sólidos de origen escamoso y mieloma múltiple.

[0059] El panel de mutantes de FGFR que se usa en la etapa de evaluación se basa, en parte, en el tipo de cáncer del paciente. Para pacientes con cáncer de vejiga, por ejemplo, un panel de genes mutantes FGFR adecuado puede comprender FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3: TACC3 v i está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3: TACC3 v3 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3: BAIAP2L1 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR2: BICC 1 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR2: AFF3 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR2: CASP7 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 R248C está presente en la muestra. En el método de la invención, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 S249C está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 G370C está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 Y373C está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga se trata con un inhibidor de FGFR si está presente en la muestra cualquier combinación de los mutantes de FGFR anteriores.

[0060] Para pacientes con cáncer de vejiga metastásico, por ejemplo, un panel de genes mutantes de FGFR adecuado puede comprender FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3: TACC3 v1 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3: TACC3 v3 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3: BAIAP2L1 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR2: BICC1 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR2: AFF3 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR2: CASP7 está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 R248C está presente en la muestra. En el método de la invención, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 S249C está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 G370C está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si FGFR3 Y373C está presente en la muestra. En algunas formas de realización, un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico se trata con un inhibidor de FGFR si cualquier combinación de los mutantes de FGFR anteriores está presente en la muestra.

[0061] En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende: aislar el ARN de la muestra biológica; sintetizar ADNc a partir del ARN aislado; preamplificar el ADNc; y amplificar el ADNc preamplificado con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR.

[0062] El aislamiento de ARN de la muestra biológica se puede realizar mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En una forma de realización, el ARN se puede aislar de la muestra biológica utilizando un kit AllPrep DNA/RNA FFPE de Qiagen (N° de producto 80234).

[0063] La síntesis de ADNc a partir de ARN aislado se puede realizar mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En una forma de realización, el ADNc se puede sintetizar a partir de ARN aislado utilizando un kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de ARNasa de a B i (N° de producto 4374966).

[0064] La preamplificación de ADNc se puede realizar mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos de amplificación son bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, el ADNc se puede preamplificar usando una Master Mix TaqMan® PreAmp (Life Technologies/Applied Biosystems® producto # 4391128).

[0065] En algunas formas de realización, la etapa de amplificación puede comprender realizar una PCR en tiempo real (qRT-PCR). Los procedimientos ejemplares de qRT-PCR se analizan en la sección de ejemplos del presente documento. En algunos aspectos, la qRT-PCR puede ser un ensayo de PCR en tiempo real Taqman®. Los procedimientos qRT-PCR pueden implicar el uso de sondas para aumentar la especificidad del ensayo. Las sondas adecuadas para usar en el ensayo qRT-PCR incluyen cualquiera de las sondas descritas en el presente documento, por ejemplo, las sondas descritas en la Tabla 15. En algunas formas de realización, por ejemplo, la PCR en tiempo real se puede realizar con una o más sondas que comprenden SEQ NO ID: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y/o SEQ ID NO: 55. En otras formas de realización, la PCR en tiempo real se puede realizar con una o más sondas que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y/o SEQ ID NO: 55. En otras formas de realización, la PCR en tiempo real se puede realizar con una o más sondas que consisten en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, y/o SEQ ID NO: 55. En otras formas de realización, la PCR en tiempo real se puede realizar con una o más sondas que tienen SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y/o SEQ ID NO: 55.

[0066] La qRT-PCR se puede realizar con uno o más oligonucleótidos bloqueantes en 3'. Los procedimientos ejemplares de qRT-PCR que usan oligonucleótidos bloqueantes en 3' se describen en la sección de Ejemplos del presente documento. Los oligonucleótidos de bloqueo en 3' adecuados incluyen, por ejemplo, los descritos en la Tabla 8. En algunas formas de realización, la qRT-PCR se puede realizar con uno o más oligonucleótidos de bloqueo en 3' que comprenden SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, s Eq ID NO: 41 y/o SEQ ID NO: 42. En algunas formas de realización, la qRT-PCR se puede realizar con uno o más oligonucleótidos bloqueantes en 3' que consisten esencialmente en SEQ ID No : 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y/o SEQ ID NO: 42. En algunas formas de realización, la qRT-PCR se puede realizar con uno o más oligonucleótidos bloqueantes en 3' que consisten en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y/o SEQ ID NO: 42. En algunas formas de realización, la qRT-PCR se puede realizar con uno o más oligonucleótidos bloqueantes en 3' que tienen SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, y/o o SEQ ID NO: 42.

[0067] Los pares de cebadores adecuados para usar en la etapa de amplificación incluyen los descritos en la Tabla 3. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: TACC3 v1 y los cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de s Eq ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: TACC3 v3 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser intrón FGFR3: TACC3 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: BAIAP2L1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID n O: 11 y SEQ ID NO: 12. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: BICC1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: AFF3 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: CASP7 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: CCDC6 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: OFD1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser R248C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 23 y SEQ iD NO: 24 o SEQ iD NO: 31 y SEQ ID NO: 32. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser S249C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 o SEQ ID No : 33 y SEQ ID NO: 34. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser G370C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 27 y Se Q ID NO: 28 o SEQ ID NO: 35 y SEQ ID No : 36. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser Y373C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 37 y SEQ ID No : 38. En algunas formas de realización, el mutante de FGFR y el par de cebadores pueden ser cualquier combinación de los mutantes de FGFR descritos anteriormente y el correspondiente par de cebadores.

[0068] En algunas formas de realización, la etapa de amplificación se puede realizar con lo siguiente:

a. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 43;

b. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 44;

C. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 46;

d. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 47;

e. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 45;

f. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 48;

g. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 49;

h. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 50;

i. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 51;

j. el par de cebadores tienen las secuencias SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 52;

k. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 53;

l. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 54;

m. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 55;

n. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 52 y el oligonucleótido bloqueante 3' tiene la secuencia de SEQ ID NO: 39;

o. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 53 y el oligonucleótido bloqueante 3' tiene la secuencia de SEQ ID NO: 40;

p. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 54 y el oligonucleótido bloqueante 3' tiene la secuencia de SEQ ID NO: 41;

q. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 55 y el oligonucleótido bloqueante 3' tiene la secuencia de SEQ ID NO: 42; o

r. cualquier combinación de los mismos.

[0069] Los métodos divulgados comprenden tratar a un paciente si uno o más mutantes de FGFR están presentes en la muestra. La presencia de uno o más mutantes de FGFR en la muestra puede determinarse, por ejemplo, secuenciando el ADNc amplificado.

[0070] Los inhibidores de FGFR adecuados para usar en los métodos de tratamiento incluyen los descritos anteriormente en este documento.

[0071] También se describen inhibidores de FGFR para usar en el tratamiento del cáncer en un paciente en donde se identifica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR mediante la evaluación de una muestra biológica obtenida del paciente para detectar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde se detecta la presencia de uno o más mutantes de FGFR en la muestra.

[0072] Además, se describen inhibidores de FGFR para uso en el tratamiento del cáncer en un paciente en donde se identifica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR mediante la evaluación de una muestra biológica obtenida del paciente para detectar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde uno o más mutantes de FGFR son un gen de fusión de FGFR o un SNP de FGFR, en donde se detecta la presencia de uno o más mutantes de FGFR en la muestra, y en donde dicha evaluación comprende amplificar ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR.

[0073] También se describen inhibidores de FGFR para uso en el tratamiento del cáncer en un paciente en donde se identifica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR mediante la evaluación de una muestra biológica obtenida del paciente para detectar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es un gen de fusión de FGFR o un SNP de FGFR, en donde se detecta la presencia de uno o más mutantes de FGFR en la muestra, y en donde dicha evaluación comprende amplificar un ADNc preamplificado con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR.

Métodos para identificar a un paciente con cáncer que responderá al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)

[0074] En el presente documento se describen métodos para identificar a un paciente con cáncer que responderá al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que comprende: evaluar una muestra biológica del paciente en busca de un mutante de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es un gen de fusión de FGFR o un polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR, y en donde dicha evaluación comprende amplificar el ADNc con un par de cebadores que se unen para y amplificar uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR y determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes están presentes en la muestra, donde la presencia de uno o más mutantes de FGFR indica que el paciente responderá al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

[0075] También se proporcionan métodos para identificar a un paciente con cáncer que responde al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que comprende: evaluar una muestra biológica del paciente en busca de un mutante de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el FGFR mutante es un gen de fusión de FGFR o un polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR, y en donde dicha evaluación comprende amplificar el ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR y determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes están presentes en la muestra, donde la presencia de uno o más mutantes de FGFR indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

[0076] Además, se proporcionan métodos para identificar a un paciente con cáncer que responde al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que comprende evaluar una muestra biológica del paciente para detectar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es un gen de fusión de FGFR o un polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR, en donde la presencia de uno o más mutantes de FGFR indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

[0077] En algunas formas de realización, la evaluación puede comprender la amplificación del ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR. En algunas formas de realización, el ADNc puede ser ADNc preamplificado.

[0078] En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende: aislar el ARN de la muestra biológica y sintetizar el ADNc del ARN aislado. En algunos aspectos, la etapa de evaluación se puede realizar en ADNc preamplificado. Por lo tanto, la etapa de evaluación puede comprender además la preamplificación del ADNc antes de dicho paso de amplificación. El aislamiento de ARN de una muestra biológica se puede realizar mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En una forma de realización, el ARN se puede aislar de la muestra biológica utilizando un kit FFPE de ADN/ARN AllPrep de Qiagen (por ejemplo, producto N° 80234). La síntesis de ADNc a partir de ARN aislado se puede realizar mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En una forma de realización, el ADNc se puede sintetizar a partir de ARN aislado utilizando un kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de ARNasa de ABI (por ejemplo, producto # 4374966). La preamplificación de ADNc se puede realizar mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos de amplificación son bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, el ADNc se puede preamplificar usando una Master Mix TaqMan® PreAmp (Life Technologies/Applied Biosystems® producto # 4391128).

[0079] Los métodos divulgados se pueden usar para identificar pacientes con varios tipos diferentes de cáncer que responderán al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que incluye, entre otros, cáncer de vejiga, cáncer de vejiga metastásico, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón de células no pequeñas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, carcinoma urotelial, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama, cáncer de endometrio, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, gliomas, carcinoma de colon, sarcomas, tumores sólidos de origen escamoso y mieloma múltiple.

[0080] El panel de mutantes de FGFR que se usa en la etapa de evaluación se basa, en parte, en el tipo de cáncer del paciente. Para pacientes con cáncer de vejiga, por ejemplo, un panel de genes mutantes FGFR adecuado puede comprender FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3: TACC3 v i está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3: TACC3 v3 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3: BAIAP2L 1 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR2: BICC1 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR2: a FF3 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR2: CASP7 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 R248C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En el método de la invención, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 S249C está presente en una muestra biológica de un paciente con cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 G370C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 Y373C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si alguna combinación de los mutantes de FGFR anteriores está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga.

[0081] Para pacientes con cáncer de vejiga metastásico, por ejemplo, un panel de genes mutantes de FGFR adecuado puede comprender FGFR3: TACC3 v i, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3: TACC3 v i está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3: TACC3 v3 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3: BAIAP2L1 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR2: BICC1 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR2: AFF3 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR2: CASP7 está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 R248C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En el método de la invención, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 S249C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 G370C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastático. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si FGFR3 Y373C está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico. En algunas formas de realización, la etapa de evaluación comprende determinar si alguna combinación de los mutantes de FGFR anteriores está presente en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de vejiga metastásico.

[0082] Los pares de cebadores adecuados para usar en la etapa de amplificación incluyen los descritos en la Tabla 3. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: TACC3 v1 y los cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de s Eq ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: TACC3 v3 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: intrón TACC3 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR3: BAIAP2L1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID n O: 11 y SEQ ID NO: 12. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: BICC1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: AFF3 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: CASP7 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: CCDC6 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser FGFR2: OFD1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser R248C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 23 y SEQ iD NO: 24 o SEQ iD NO: 31 y SEQ ID NO: 32. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser S249C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 o SEQ ID No : 33 y SEQ ID NO: 34. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser G370C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 27 y Se Q ID NO: 28 o SEQ ID NO: 35 y SEQ ID No : 36. En algunas formas de realización, el mutante FGFR y el par de cebadores pueden ser Y373C y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 37 y SEQ ID No : 38. En algunas formas de realización, el mutante de FGFR y el par de cebadores pueden ser cualquier combinación de los mutantes de FGFR descritos anteriormente y el correspondiente par de cebadores.

[0083] Los métodos divulgados comprenden determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes están presentes en la muestra. En algunas formas de realización, la etapa de determinación comprende la secuenciación del ADNc amplificado.

[0084] En algunas formas de realización, el método comprende además tratar al paciente con un inhibidor de FGFR si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes están presentes en la muestra. Los inhibidores de FGFR adecuados para usar en los métodos de tratamiento incluyen los descritos anteriormente en este documento, en particular JNJ-42756493.

Kits para identificar la presencia de genes mutantes de FGFR

[0085] Además, se describen kits para identificar la presencia de uno o más genes mutantes de FGFR en una muestra biológica que comprenden: pares de cebadores que tienen las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, Se Q ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, o cualquier combinación de los mismos; e instrucciones para realizar un ensayo para detectar uno o más genes mutantes de FGFR.

[0086] Los kits pueden comprender además una o más sondas, uno o más oligonucleótidos bloqueantes en 3', o ambos. A veces, los kits pueden comprender además una o más sondas, por ejemplo, cualquiera o más de las sondas descritas en la Tabla 15. A veces, los kits pueden comprender además uno o más oligonucleótidos bloqueantes en 3', por ejemplo, uno o más de los oligonucleótidos de bloqueo en 3' descritos en la Tabla 8. A veces, los kits pueden comprender además una o más sondas y uno o más oligonucleótidos de bloqueo en 3'. Por ejemplo, a veces, los kits pueden comprender además:

c. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 y la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 46;

f. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 48;

g. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 y la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 49;

h. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 y la sonda tiene la secuencia de SEQ ID NO: 50;

j. el par de cebadores tiene las secuencias SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 y la sonda tiene la secuencia SEQ ID NO: 52;

r. cualquier combinación de los mismos.

Sondas de oligonucleótidos

[0087] También se describen sondas de oligonucleótidos que tienen la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 43 55. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 43. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 44. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 45. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 46. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 47. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 48. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 49. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 50. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO 51. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 52. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 53. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 54. En algunas formas de realización, la sonda de oligonucleótidos puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 55.

Oligonucleótido bloqueante 3'

[0088] También se describen aquí oligonucleótidos que tienen la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 39-42. En algunas formas de realización, el oligonucleótido bloqueante 3' puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 39. En algunas formas de realización, el oligonucleótido bloqueante 3' puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 40. En algunas formas de realización, el oligonucleótido bloqueante 3' puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 41. En algunas formas de realización, el oligonucleótido bloqueante 3' puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 42.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Aislamiento y purificación de ADN de plásmido

[0089] A continuación se muestra un procedimiento ejemplar para preparar ADN de plásmido de fusión de FGFR.

[0090] Equipo requerido: centrífuga, capaz de 1500 x g; microcentrífuga; pipetas, de desplazamiento positivo o de desplazamiento por aire; vórtice; espectrofotómetro de nanogotas; agitador/incubador a 37 °C; y un horno ajustado a 37°C.

[0091] Materiales requeridos: stock bacteriano de glicerol congelado que contiene ADN de plásmido; placas de agar kanamicina LB (Teknova #L1155); caldo LB (Life Technologies #10855-021); kanamicina (Sigma #K0254); kit de purificación de plásmidos (Qiagen# 12123); etanol absoluto (Sigma Aldrich # E7023); isopropanol (Sigma Aldrich #W292907); agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC) (de IDT o Ambion # AM9932); puntas de barrera (filtro) sin ARNasa; Microtubo libre de ARNasa (1,5 a 2 mL VWR# 10011-724); pipetas serológicas; y tubos de fondo redondo de 14 ml (VWR N° 352057).

[0092] Para recuperar bacterias del stock de glicerol, se rasparon bacterias congeladas de la parte superior de un tubo de stock de glicerol utilizando una punta de pipeta estéril, se rayaron en una placa de agar LB y se colocaron boca abajo en el horno a 37°C durante la noche.

[0093] Los plásmidos de ADN se purificaron utilizando el protocolo de purificación de ADN de plásmidos de Qiagen. Brevemente, se recogió una sola colonia de la placa rayada y se incubó en un cultivo de 5 ml de medio -LB que contenía 50 |jg/ml de kanamicina durante la noche en un agitador a 37°C a aproximadamente 300 rpm. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación a 6000 x g durante 15 minutos a 4°C y el sedimento se resuspendió en 300 j l de tampón P1. Se añadieron 300 j l de tampón P2, se mezcló invirtiendo el tubo 4-6 veces y se incubó a TA (temperatura ambiente) durante 5 minutos. Se añadieron 300 j l de tampón P3 enfriado, se mezcló inmediatamente invirtiendo 4-6 veces, se incubó en hielo durante 5 minutos y se centrifugó a máxima velocidad durante 10 minutos. El sobrenadante que contenía ADN plasmídico se eliminó rápidamente. Se equilibró Qiagen-punta 20 aplicando 1 ml de tampón QBT y se dejó vaciar por flujo de gravedad. El sobrenadante se aplicó a Qiagen-punta 20 y se permitió que entrara en la resina por flujo de gravedad. Qiagen-punta 20 se lavó con 2 x 2 ml de tampón QC y el ADN se eluyó con 800 j l de tampón QF y el eluato se recogió en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. El ADN se precipitó añadiendo 0,7 volúmenes de isopropanol, se mezcló y se centrifugó inmediatamente a 15000 x g durante 30 minutos en una microcentrífuga. Se decantó el sobrenadante y se lavó el precipitado de ADN en 1 ml de etanol al 70 % y se centrifugó a 15000 x g durante 10 minutos. Se decantó el sobrenadante. El sedimento se secó al aire durante 5-10 minutos y el ADN se volvió a disolver en 100 j l o un volumen adecuado de agua libre de nucleasas. El ADN del plásmido se cuantificó mediante nanogota y se almacenó a -20°C hasta su uso posterior.

Ejemplo 2 - Generación de líneas celulares NRK

[0094] Se construyeron vectores de expresión que expresan cada una de las fusiones FGFR. A continuación, el vector de expresión se transfectó en células epiteliales de riñón de rata normales (NRK). Las líneas celulares estables se seleccionaron en medios que contenían kanamicina después de las transfecciones. A continuación, estas células se cultivaron y el ARNm se aisló y se sometió a ensayos de fusión de FGFR para confirmar la presencia del ARNm de fusiones de FGFR específico.

Ejemplo 3 - Mantenimiento de líneas celulares de fusión de FGFR

[0095] El siguiente protocolo describe un procedimiento ejemplar para cultivar y mantener las líneas celulares que sobreexpresan la fusión de FGFR de n Rk . Las líneas celulares incluyen, entre otras: NRK/FGFR3: TACC3v1, NRK/FGFR3: TACC3 v3, NRK/FGFR3: BAIAP2L1, NRK/FGFR2: BICC1, NRK/FGFR2: CASP7, NRK/FGFR2: CCDC6, NRK/FGFR2: AFF3, NRK/FGFR2: OFD1 y NRK/VECTOR VACÍO (control de plásmido).

[0096] Equipo necesario: cabina de bioseguridad, provista de sistema de aspiración al vacío; Incubadora de CO2, configurada a 37°C con 5 % de CO2; congelador a -80°C; tanque de nitrógeno líquido; baño María, ajustado a 37°C; y un microscopio.

[0097] Materiales necesarios: pipetas serológicas; frascos de cultivo de tejidos (T75 VWR # BD353136 y/o T150 VWR # 15705-074); unidades de filtración de cultivo de tejidos de 0,2 jm (Thermo Scientific #566-0020); medio de cultivo celular DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) (Life Technologies, # 11965-084); Suero Fetal Bovino (FBS), certificado, inactivado por calor (Life Technologies, # 10082147); solución antibiótica PenStrep (Life Technologies #15140-122); solución de tripsina-EDTA al 0,25 % (Life Technologies, # 25200-056); DPBS (solución tamponada de fosfato de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio) (Life Technologies, # 14190136); recipiente de congelación de células para criopreservación; pipeta de mano; medios de congelación de células (Life Technologies, # 12648-010); tubos cónicos de 15 ml (VWR # 62406-2); y crioviales (VWR # 89094-800).

[0098] Para preparar los medios de cultivo celular, se preparó medio DMEM combinando 445 ml de DMEM, 50 ml de FBS y 5 ml de PenStrep. El medio preparado se pasó a través de una unidad de filtro de 0,2 jm y se almacenó a 4°C.

[0099] Para descongelar las células congeladas, el medio DMEM preparado se calentó en un baño de agua a 37°C durante al menos 15 minutos y se colocaron 15 ml de medio calentado en un matraz T75. Las células se retiraron del tanque de nitrógeno líquido y se colocaron inmediatamente en un baño de agua a 37°C hasta que se descongelaron. Los crioviales se rociaron generosamente con alcohol al 70 % y el exceso se limpió con toallas de papel. Todo el contenido se dividió en alícuotas en el matraz T75 que contenía DMEm . El matraz se agitó suavemente para mezclar y se colocó en la incubadora durante 24 horas. Si las células no estaban listas para dividirse, se cambió el medio a DMEM recién preparado para eliminar el medio de congelación residual. Si las células estaban listas para dividirse, cada línea celular se propagó una vez que el matraz alcanzó un 80 % de confluencia (la proporción de división para cada línea celular dependía de las necesidades experimentales).

[0100] Para congelar las líneas celulares, las células se retiraron del matraz de cultivo y se centrifugaron en un tubo cónico de 15 ml durante 5 minutos a 1500 RPM a temperatura ambiente. Se aspiró el medio y se añadieron 6 ml de medio de congelación celular. Las células se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, y se dividió en alícuotas de 1 ml de solución celular en cada uno de los 5 crioviales. Los crioviales con células se colocaron en un recipiente de congelación criogénica, que se almacenó en un congelador a -80°C durante la noche, seguido de almacenamiento a largo plazo en un tanque de nitrógeno líquido.

Ejemplo 4 - Ensayo de SNP FFPET

[0101] A continuación se describe un flujo de trabajo y protocolo ejemplares para realizar un ensayo de SNP FFPET. Se realiza un procedimiento similar para los ensayos de fusión FFPET, cuyos resultados se muestran en la FIG. 2.

Desparafinización de FFPET

[0102] Los portaobjetos se sometieron a cantidades crecientes de xileno seguido de tratamiento con alcohol para eliminar la parafina.

Extracción de ARN FFPET

[0103] El procedimiento para extraer ARN de muestras de tejido embebidas en parafina fijadas con formalina de cáncer de mama para el ensayo de expresión génica corriente abajo se describe a continuación.

[0104] Equipo requerido: centrífuga con adaptador de placa, capaz de 1500 x g; microcentrífuga; pipetas, desplazamiento positivo o desplazamiento de aire; vórtice; NanoDrop 8000; bloque calefactor capaz de incubar a 37°C, 56°C y 80°C; y pipeta Pasteur (Pipet Trans EX-FT de 1,5 ml, paquete de 500, VWR N° 14670-329).

[0105] Materiales requeridos: Kit AllPrep DNA/RNA FFPE (Qiagen# 80234); Etanol absoluto (Sigma Aldrich # E7023); isopropanol; xileno; agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC) (de IDT o Ambion N° AM9932); puntas de barrera (filtro) sin ARNasa; libre de ARNasa; microtubo (1,5 a 2 mL VWR# 10011-724); y el manual del kit Qiagen AllPrep DNa /r n A FFPE.

[0106] El ARN se extrajo utilizando el kit AllPrep DNA/RNA FFPE. Brevemente, se colocó una sección de 1-10 pm en un tubo de reacción de 1,5 ml y se añadieron 800 pl de HemoDe o xileno. La muestra se agitó 3 veces durante 4 segundos, se incubó durante 2 minutos, se agitó 3 veces durante 4 segundos y se incubó durante 5 minutos.

[0107] La muestra se centrifugó durante 2 minutos a máxima velocidad (12.000 - 14.000 x g) y el sobrenadante se descartó por aspiración. Los tubos se taparon inmediatamente para evitar que se secara el tejido.

[0108] Se repitieron los pasos anteriores.

[0109] 800 pl de etanol abs. se añadió, el tubo se sacudió para desalojar el sedimento, se agitó durante 4 segundos 3 veces, se centrifugó durante 2 minutos a velocidad máxima (12.000 - 14.000 x g) y el sobrenadante se descartó por aspiración.

[0110] Se añadieron 800 pl de etanol al 70 %, se sacudió el tubo para desalojar el sedimento, se agitó durante 4 segundos 3 veces, se centrifugó durante 2 minutos a máxima velocidad y se descartó el sobrenadante por aspiración. Después de eliminar el etanol al 70 %, el tubo se volvió a girar durante 10 a 20 segundos y el líquido residual se eliminó cuidadosamente con una pipeta de calibre fino.

[0111] Los tubos abiertos se incubaron en un bloque de calentamiento durante 5 - 15 minutos a 37°C para secar al aire el sedimento de tejido.

[0112] Se resuspendió el sedimento añadiendo 150 pl de tampón PKD y se sacudió el tubo para aflojar el sedimento. Se añadieron 10 pl de proteinasa K y el tubo se mezcló mediante agitación vorticial.

[0113] Los tubos se incubaron a 56°C durante 15 minutos, se incubaron en hielo durante 3 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos a 20.000 x g.

[0114] El sobrenadante se transfirió cuidadosamente sin perturbar el sedimento a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la purificación del ARN. El sobrenadante se incubó a 80°C durante 15 minutos. El tubo se centrifugó brevemente para eliminar las gotas del interior de la tapa. Se añadieron 320 pl de tampón RLT para ajustar las condiciones de unión y el tubo se mezcló mediante agitación vorticial o pipeteo. Se añadieron 1120 pl de etanol (96-100 %) y el tubo se mezcló bien mediante vórtex o pipeteo.

[0115] Se transfirieron 700 |jl de la muestra, incluido cualquier precipitado que pudiera haberse formado, a una columna giratoria RNeasy MinElute colocada en un tubo de recogida de 2 ml y se centrifugó durante 15 segundos a > 8000 x g (> 10 000 rpm). Se descartó el flujo continuo. Este paso se repitió hasta que toda la muestra pasó por la columna de centrifugación RNeasy MinElute.

[0116] Se añadieron 350 j l de tampón FRN a la columna de centrifugación RNeasy MinElute y se centrifugaron durante 15 segundos a > 8000 x g (> 10000 rpm). Se descartó el flujo continuo.

[0117] Se añadieron 10 j l de solución madre de ADNasa I a 70 j l de tampón RDD, se mezclaron invirtiendo suavemente el tubo y se centrifugaron brevemente para recoger el líquido residual de los lados del tubo.

[0118] La mezcla de incubación de ADNasa I (80 j l ) se añadió directamente a la membrana de la columna de centrifugación RNeasy MinElute y se colocó sobre la mesa de trabajo (20-30 °C) durante 15 minutos.

[0119] Se añadieron 500 j l de tampón FRN a la columna de centrifugación RNeasy MinElute y se centrifugaron durante 15 segundos a > 8000 x g (> 10000 rpm). El flujo continuo se guardó para usarlo en el siguiente paso, ya que contiene ARN pequeños.

[0120] La columna de centrifugación RNeasy MinElute se colocó en un nuevo tubo de recogida de 2 ml (suministrado). El flujo de la etapa anterior se aplicó a la columna de centrifugación y se centrifugó durante 15 segundos a >8000 x g (>10 000 rpm). Se descartó el flujo continuo.

[0121] Se añadieron 500 j l de tampón RPE a la columna giratoria RNeasy MinElute y se centrifugaron durante 15 segundos a >8000 x g (>10000 rpm) para lavar la membrana de la columna giratoria. Se descartó el flujo continuo.

[0122] Se añadieron 500 j l de tampón RPE a la columna de centrifugación RNeasy MinElute y se centrifugaron durante 15 segundos a >8000 x g (>10.000 rpm) para lavar la membrana de la columna giratoria. Se descartó el tubo de recogida con el flujo continuo.

[0123] La columna de centrifugación RNeasy MinElute se colocó en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y se centrifugó a máxima velocidad durante 5 minutos. Se descartó el tubo de recogida con el flujo continuo.

[0124] La columna de centrifugación RNeasy MinElute se colocó en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml, se añadieron 30 j l de agua libre de ARNasa directamente a la membrana de la columna de centrifugación, se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente y se centrifugó a máxima velocidad durante 1 minuto para eluir el ARN.

[0125] Las muestras de ARN se almacenaron inmediatamente en un congelador a -80 °C.

Síntesis de ADNc

[0126] A continuación se describe un procedimiento de síntesis de ADNc para los ensayos FFPET SNP usando análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR).

[0127] Equipo requerido: centrífuga con adaptador de placa, capaz de 1500 x g, microcentrífuga; pipetas (preferiblemente pipetas monocanal y multicanal), de desplazamiento positivo o de aire; vórtice; y GeneAmp® PCR System 9700 (ABI# 4314879) o equivalente.

[0128] Materiales necesarios: kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de ARNasa, 200 reacciones (ABI N° 4374966); agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC) (de IDT) o equivalente; puntas de barrera (filtro) sin ARNasa; Microtubo libre de ARNasa (1,5 a 2 mL VWR# 10011-724); Placas de reacción de 96 pocillos ópticos MicroAmp™ (Life Technologies, N° 4306736); y película de sellado (VWR #60941-072).

[0129] Después de la extracción de ARN (descrita anteriormente), los tubos de muestra de ARN se mantuvieron en hielo.

[0130] Los componentes del kit se usaron para preparar 2x Master Mix de transcripción inversa (RT) para todas las reacciones, incluido 1 control negativo (agua). Los componentes se descongelaron en hielo durante aproximadamente 15 minutos, se invirtieron suavemente para mezclar y se centrifugaron brevemente para reducir la solución. Todos los reactivos se devolvieron al hielo. Los tubos no se agitaron en vórtex.

[0131] Se preparó una Master Mix en hielo en un tubo de 1,5 ml para el número apropiado de reacciones (N° de reacciones 10 %, por 20 j l de reacción) combinando la siguiente cantidad de reactivo por reacción: 2 j l 10X RT Buffer Mix; 0,8 j l de mezcla 25X dNTP; 2 j l de cebadores aleatorios 10X RT; 1 j l de transcriptasa inversa MultiScribe de 50 U/jl; 1 j l de inhibidor de ARNasa; y 3,2 j l de H2O libre de nucleasa/RNasa.

[0132] La Master Mix se agitó varias veces (5 a 10) para mezclar y centrifugar brevemente (1500 x g, 5 a 10 segundos). Se añadieron 10 |jl de la mezcla de reacción a los pocilios apropiados de una placa de 96 pocilios.

[0133] Las muestras de ARN se diluyeron a una concentración de 20 ng/jl. Se añadieron 10 j l de cada muestra de ARN, incluido el control negativo de agua, a los pocillos correspondientes apropiados de la placa de 96 pocillos hasta un volumen de reacción final de 20 jl. Los pocillos se mezclaron suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces, se sellaron con un sello de placa y se centrifugaron brevemente (1500 x g durante 60 segundos). Las placas se mantuvieron en hielo hasta el momento de cargarlas en el termociclador.

[0134] La placa de reacción se cargó en el termociclador ABI 9700 en Clean Lab o Workstation y se ejecutó utilizando el siguiente programa de transcripción inversa con un volumen de reacción de 20 jl:

Paso 1: 25°C durante 10 minutos

Paso 2: 37°C durante 120 minutos

Paso 3: 85°C durante 5 segundos

Paso 4: 4°C mantenimiento infinito

[0135] El ADNc sintetizado se almacenó a -20°C para el siguiente paso de preamplificación.

Preparación de la mezcla del conjunto de ensayos de preamplificación

[0136] La mezcla del conjunto de ensayos de preamplificación asociada con el protocolo de preamplificación del ensayo de SNP FFPET se preparó como se describe a continuación.

[0137] Equipo requerido: microcentrífuga; pipetas, de desplazamiento positivo o de aire; y vórtice.

[0138] Materiales requeridos: agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC) (de IDT) o equivalente; IDTE pH 8,0 (Solución IX TE) (IDT Technologies); puntas de barrera (filtro) sin ARNasa; y tubos sin ARNasa (1,5 a 2 ml VWR N° 10011-724).

[0139] Todos los ensayos TaqMan SNP se piden a Applied Biosystems, Life Technologies, Inc.

[0140] Se prepararon 100 j l de ensayos 20X SNP.

[0141] Para preparar el grupo de ensayo de preamplificación 0,2X, todos los ensayos se descongelaron en hielo durante aproximadamente 15 minutos. Se añadió el siguiente volumen de componentes a un tubo de 1,5 ml:

Tabla 4

[0142] El 0,2X PreAmp Assay Pool se agitó brevemente en vórtex para mezclar (5 a 10 segundos) y se centrifugó brevemente (1500 x g, 5-10 segundos). Se tomaron alícuotas de 100 j l de PreAmp Primer Pool en tubos de 1,5 ml y se almacenaron a -20 °C.

Preamplificación para el ensayo de SNP de tejido embebido en parafina y fijado con formalina de cáncer de mama utilizando análisis de PCR en tiempo real (RTPCR)

[0143] Equipo necesario: centrífuga con adaptador de placa, capaz de 1500 x g; microcentrífuga; pipetas, desplazamiento positivo o desplazamiento de aire; vórtice; GeneAmp® PCR System 9700 (ABI# 4314879) o equivalente.

[0144] Materiales requeridos: TaqMan® PreAmp Master Mix (2X) (Life Technologies # 4391128); Mezcla de ensayo agrupada 0,2X (consulte el Protocolo de preparación y manipulación del ensayo); Tampón IDTE 1X (Tris 10 mM/EDTA 0,1 mM, pH 7,5, de IDT) o equivalente; agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC) (de IDT) o equivalente; puntas de barrera (filtro) sin ARNasa; Microtubo libre de ARNasa (1,5 a 2 mL VWR# 10011-724); Placas de reacción de 96 pocillos ópticos MicroAmp™ (Life Technologies, N° 4306736); película adhesiva óptica MicroAmp® (Applied Biosystems PN 4311971); placas de pozo profundo (VWR# 47734-788); sellos de aluminio (VWR N° 60941-126).

[0145] Las muestras se prepararon colocando el grupo de mezcla de ensayo de ADNc y 0,2X en hielo para descongelar, aproximadamente 5 minutos, y centrifugando la placa brevemente (1500xg durante 5 a 10 segundos).

[0146] Los componentes del kit se usaron para preparar 2x PreAmp Master Mix. Los componentes del kit se dejaron descongelar en hielo durante aproximadamente 5 minutos. Después de descongelar todos los reactivos, los tubos se invirtieron suavemente para mezclarlos y se centrifugaron brevemente para reducir la solución. Todos los reactivos se devolvieron al hielo. Los tubos no se agitaron.

[0147] En una campana de laboratorio limpio o bioseguridad, cada Master Mix se preparó para el número apropiado de reacciones en hielo combinando los volúmenes requeridos de reactivos como se indica en la Tabla 5 a continuación (N° de reacciones 10 %):

Tabla 5

[0148] Los grupos de ensayo contienen cebadores y sondas.

[0149] Para evitar el cebado cruzado de los ensayos de SNP, los 5 ensayos se dividieron en 3 reacciones de preamplificación por muestra.

[0150] Cada Master Mix se agitó varias veces (5 a 10) para mezclar, seguido de una breve centrifugación (1500 xg, 5 a 10 segundos). Se dividieron en alícuotas 18,75 pl de cada Master Mix en los pocillos apropiados de una placa de reacción de 96 pocillos. Se transfirieron 6,25 pl de cada muestra de ADNc, incluido el pocillo de control negativo de agua, a los pocillos apropiados de la placa de reacción Master Mix para cada reacción de preamplificación. La muestra se mezcló suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces y se cerró la tapa. La placa se centrifugó brevemente (1500 x g durante 60 segundos) y se mantuvo en hielo hasta que estuvo lista para cargar en el termociclador.

[0151] El termociclador ABI 9700 de placa de reacción se cargó y ejecutó usando el siguiente programa:

Paso 1: 95°C durante 10 minutos

Paso 2: 95°C durante 15 segundos

Paso 3: 60°C durante 4 minutos

Paso 4: Ajustar Paso 2-3 para 10 ciclos

Si se usó un bloque dorado o plateado, se seleccionó el modo máximo y la tasa de rampa se estableció en 77 %. Si se utilizó un bloque de aluminio, se seleccionó el modo estándar (sin cambio de velocidad).

Paso 5: mantenimiento infinito a 4 °C.

Volumen de reacción establecido en 25 pl.

[0152] La placa de reacción de PreAmp se centrifugó brevemente (1500 x g durante 60 segundos) después de completar PreAmp. Se agregaron 100 |jl de IDTE a los pocilios apropiados de una nueva placa profunda de 96 pocilios y se transfirieron 25 j l de cada producto PreAmp a los pocillos correspondientes para tener un volumen de dilución final de 125 jl. Cada pocillo se mezcló pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces, la placa se selló con adhesivo de aluminio, la placa se centrifugó brevemente (1500 x g durante 5 a 10 segundos) y el producto PreAmp se almacenó a -20°C hasta su uso posterior.

Ensayo de SNP FFPET - PCR en tiempo real

[0153] A continuación se describe el procedimiento para el ensayo de SNP de tejido embebido en parafina fijado con formalina usando análisis de PCR en tiempo real.

[0154] Equipo requerido: centrífuga con adaptador de placa, capaz de 1500 x g; microcentrífuga; pipetas (preferiblemente pipetas monocanal y multicanal), desplazamiento positivo o desplazamiento de aire; vórtice; y el instrumento de PCR en tiempo real ABI ViiA 7 (Life Technologies).

[0155] Materiales requeridos: Master Mix de genotipado TaqMan (Life Technologies # 4371355); Ensayos de SNP; agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC, de IDT) o equivalente; puntas de barrera (filtro) sin ARNasa; Microtubo libre de ARNasa (1,5 a 2 mL VWR# 10011-724); película adhesiva óptica MicroAmp® (Applied Biosystems PN 4311971); y placas de reacción de 384 pocillos ópticos MicroAmp™.

[0156] La Tabla 15 enumera las secuencias de las sondas utilizadas durante los ensayos de PCR en tiempo real.

[0157] Para preparar las muestras, en un laboratorio limpio o estación de trabajo, los ensayos de SNP se colocaron en hielo para descongelarlos durante aproximadamente 5 minutos. Todos los reactivos protegidos de la luz, para proteger la exposición de las sondas fluorescentes. Las placas PreAmp diluidas se colocaron en hielo para descongelarlas en un laboratorio o estación de trabajo sucios después de preparar la Master Mix de genotipado.

[0158] Para preparar la Master Mix de genotipado, la Master Mix de genotipado se descongeló en hielo durante aproximadamente 5 minutos. La Master Mix (MM) se preparó en el número requerido de tubos en hielo. Los volúmenes requeridos de reactivos se combinaron en los tubos etiquetados apropiados como se indica en la Tabla 6 a continuación (N° de reacciones 10 %):

Tabla 6

[0159] La Master Mix se agitó varias veces (5 a 10) para mezclar y luego se centrifugó brevemente (1500 x g, 5 a 10 segundos). Se añadieron 15 j l de cada Master Mix a los pocillos apropiados de MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plates. Las placas de reacción se sellaron con película adhesiva óptica.

[0160] La placa con el producto PreAmp diluido 1:5 se colocó en hielo durante aproximadamente 5-10 minutos para descongelar. Con una pipeta multicanal, se transfirieron 5 j l de cada producto PreAmp diluido a los pocillos correspondientes apropiados. La placa de reacción se selló con película adhesiva óptica y se centrifugó brevemente (1500 x g durante 60 segundos). Las placas se mantuvieron en hielo hasta el momento de cargarlas en el termociclador.

[0161] Las siguientes condiciones se ejecutaron usando el software viiA 7 con el volumen establecido en 20 jl:

Tabla 7

qRT-PCR específico a FGFR SNP

[0162] La detección de mutaciones somáticas raras en un exceso de alelos de tipo salvaje es cada vez más importante en el diagnóstico de cáncer. Cuando las mutaciones de interés están cerca unas de otras, la detección se convierte en un desafío. Para ayudar en la identificación de FGFR SNP de FFPET, se desarrolló un ensayo qRT-PCR específico de SNP, en donde se utilizó la amplificación específica de SNP usando sondas Taqman MGB combinadas con el bloqueador de alelos de tipo salvaje (WT) didesoxi 3'. El ensayo evitó la unión no específica, mejoró el número de amplificaciones en el objetivo, minimizó las señales falsas positivas de los alelos WT y aumentó la sensibilidad del ensayo. Este ensayo de detección de SNP basado en ARN, combinado con la etapa de preamplificación en el ensayo, aumenta las señales mutantes bajas o raras.

[0163] Una estrategia de ejemplo para qRT-PCR específica de SNP usando un oligonucleótido bloqueador de WT didesoxi 3' se muestra en FIG. 3, y en la FIG. 4. Brevemente, qRT-PCR se realizó usando los cebadores FGFR SNP en presencia de un oligonucleótido bloqueador de WT didesoxi en 3', que era complementario y contenía un tramo corto de nucleótidos que flanqueaban el alelo WT. La unión del oligonucleótido bloqueador al alelo WT impidió la aplicación del alelo WT, mientras que los cebadores FGFR SNP se unieron y amplificaron específicamente el FGFR SNP. Los oligonucleótidos bloqueadores 3' didesoxi WT utilizados en la qRT-PCR específica para FGFR SNP se muestran en la Tabla 8. Los cebadores de FGFR SNP utilizados en la qRT-PCR específica para FGFR SNP fueron: SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 (FGFR3 R248C); SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 (FGFR3 S249C); SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 (FGFR3 G370C); y SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 (FGFR3 Y373). La Tabla 15 enumera las secuencias de las sondas utilizadas durante los ensayos de p Cr en tiempo real.

Tabla 8

[0164] Se prepararon muestras para estudios de validación como se muestra en la Tabla 9. Datos de validación ejemplares de la qRT-PCR específica de SNP usando un oligonucleótido bloqueador de WT didesoxi 3' para FGFR3 G370C, FGFR3 Y373, FGFR3 S249C y FGFR3 R248C se ilustra en las FIGS. 5A-5D, respectivamente. Los datos de Ct (umbral de ciclo) sin procesar para las muestras FFPE con qRT-PCR específica de SNP con oligonucleótidos bloqueadores de WT didesoxi en 3' se muestran en la Tabla 10. Los datos derivados de ADN y ARN usando diferentes plataformas/técnicas sugieren que la PCR específica de SNP con el nucleótido bloqueante 3' es un ensayo robusto, fiable y sensible. Los datos de validación sugieren que se puede detectar un alelo/SNP mutante en un gran exceso de ADN genómico portador de WT, lo que enfatiza la sensibilidad y la especificidad de cada ensayo.

Tabla 9

Tabla 10

(Continuación)

Ejemplo 5 - Validación del ensayo de detección de genes de fusión FGFR personalizado

Generación de controles positivos para ensayos de fusión FGFR

[0165] Se generaron "minigenes sintéticos" de fusión FGFR, plásmidos que codifican fusiones FGFR y líneas celulares estables que contenían fusiones FGFR. Brevemente, los minigenes sintéticos se construyeron artificialmente uniendo una serie de nucleótidos, de aproximadamente 100 pares de bases, correspondiendo entre sí a la secuencia de ADN diana del gen de interés. Los plásmidos que codifican las fusiones de FGFR se generaron mediante la clonación del ADNc que codifica los diversos genes de fusión de FGFR en un vector de expresión. Se generaron líneas celulares estables que contenían fusiones de FGFR mediante la transfección de plásmidos que codifican genes de FGFR en células epiteliales de riñón de rata normales (células NRK). Las líneas celulares estables se seleccionaron bajo el antibiótico G418. El ensayo Taqman de fusión FGFR se realizó en el ARN total aislado de estas líneas celulares para confirmar la generación satisfactoria de líneas celulares estables que expresan la fusión o fusiones FGFR. Las líneas celulares estables que expresan fusiones FGFR se usan como control positivo. La Tabla 15 enumera las secuencias de las sondas utilizadas durante los ensayos de PCR en tiempo real.

Análisis del límite inferior de cuantificación y eficacia de los ensayos de fusión de FGFR

[0166] Para determinar el límite inferior de cuantificación (LLOQ) y la eficacia de los ensayos de genes de fusión de FGFR, se generaron productos de fusión de FGFR mediante PCR TaqMan (como se describe en el Ejemplo 4) y confirmado por secuenciación de Sanger (FIG. 2). Se mezclaron 100 pg de ADN positivo para fusión con ADNc humano normal (negativo para fusión confirmado), se diluyeron en serie 1:10 y se analizaron usando Applied Biosystems ViiA7 Software v1.1. Las curvas estándar de eficiencia se muestran en la FIG. 6. El LLOQ de fusión de FGFR y la eficiencia se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11

[0167] El ensayo del gen de fusión de FGFR se validó a continuación en líneas celulares positivas para el gen de fusión. Expresión del gen de fusión FGFR, se prepararon diluciones en serie añadiendo líneas de células positivas para proteína de fusión en una línea celular negativa para proteína de fusión. Por ejemplo, se preparó una dilución en serie 1:2 para FGFR3: TACC3v1 y FGFR3: BAIAP2L1 y se añadió a 1 millón de células BAF. Se aisló el ARN (usando el kit Qiagen Rneasy), seguido de RT-PCR, preamplificación de ADNc y TaqMan Real Time PCR para el gen de fusión FGFR objetivo. Como se muestra en la Tabla 12, los ensayos FGFR3: TACC3v1 y FGFR3: BAIAP2L1 Fusion Gene TaqMan pueden detectar el objetivo de fusión en 31 de un millón de células negativas para fusión (sensibilidad del 0,003 %).

Tabla 12

Ejemplo 6 - Validación del ensayo de detección de SNP FGFR personalizado

Evaluación de mutaciones FGFR3 en cáncer de vejiga

[0168] Los SNP R248C, S249C y Y373C se observaron en aproximadamente 8 %, aproximadamente el 61 % y aproximadamente el 19 % de las muestras de cáncer de vejiga analizadas, respectivamente.

Ejemplo 7 - Análisis de muestras de cáncer

[0169] Las muestras se analizaron usando el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 13 y la FIG. 7. La Tabla 13 muestra la prevalencia de la fusión FGFR en diferentes tipos de cáncer. Fusiones de FGFR detectadas en muestras FFPE de diferentes tipos de cáncer, como vejiga (primario y metastásico), NSCLC (adenocarcinoma y escamoso), ovárico, esofágico (primario y metastásico), cabeza y cuello (H&N; primario y metastásico), endometrial (metastásico), cáncer de mama y de próstata mediante el método qRT-PCR. Todas las fusiones de FGFR probadas dieron negativo para muestras de cáncer de próstata. La fusión FGFR3: TACC3intron fue negativa en vejiga (primario), NSCLC (escamoso), ovárico y esofágico (primario), H&N (primario y metastásico) y mama. La fusión FGFR2: OFD1 fue negativa en vejiga (primario y metastásico), NSCLC (adenocarcinoma), ovario y esofágico (primario y metastásico). La fusión FGFR2: CCDC6 fue negativa en vejiga (primaria y metastásica), NSCLC (adenocarcinoma), ovárica y esofágica (primaria) y H&N (primaria y metastásica).

[0170] FIG. 8 es una forma de representación ejemplar del gen de fusión FGFR y el estado de mutación en adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas NSCLC. En las muestras de adenocarcinoma de NSCLC positivas para la fusión de FGFR, 3/17 muestras fueron positivas para la mutación EGFR, 3/17 muestras fueron positivas para la mutación KRAS y 1/17 muestras fueron positivas para la mutación cMET. Sin embargo, no se observaron mutaciones de EGFR, KRAS o cMET en muestras de carcinoma de células escamosas de NSCLC positivas para la fusión de FGFR.

Ejemplo 8 - Tratamiento de pacientes con tumores sólidos avanzados

[0171] Se realizó un ensayo clínico en donde pacientes que tenían varios tumores sólidos expresaban el FGFR3: TACC3 v1, FGFR3 Los genes de fusión: TACC3 v3, FGFR2: CCDC6 y FGFR2: BICC1 se trataron con JNJ-42756493. FIG. 9 ilustra resultados ejemplares de muestras de pacientes de fase I, en las que se detectaron fusiones de FGFR en muestras de ensayo de fase I JNJ-427493 (EDI10001) utilizando el ensayo qRT-PCR. Todos los ensayos de fusión de FGFR se realizaron simultáneamente con controles positivos (ST) y GAPDh para la evaluación del control de calidad del ARN. A) Representación gráfica de los datos de qRT-PCR generados para el pt N° 1000081: positivo solo para la fusión FGFR2: B lC c i (el recuadro muestra detalles de los valores de Ct para la fusión FGFR2: BICC1, control positivo ST y GAPDH). B) Representación gráfica de los datos de qRT-PCR generados para pt#33000158: positivo solo para la fusión FGFR3: TACC3v1 (el recuadro muestra detalles de los valores de Ct para la fusión FGFR3: TACC3v1, control positivo de ST y GAPDH). C) Representación gráfica de los datos de qRT-PCR generados para el pt N° 34000123: positivo solo para la fusión FGFR2: CCDC6 (el recuadro muestra detalles de los valores de Ct para la fusión FGFR2: CCDC6, control positivo ST y GAPDH). D) Representación gráfica de los datos de qRT-PCR generados para pt#340000115: positivo para fusiones Fg Fr 3: TACC3v1, FGFR3: TACC#v3 y FGFR2: CCDC6 (el recuadro muestra detalles de los valores Ct para fusiones FGFR, controles positivos para ST y g Ap DH).

[0172] La FIG. 10 representa un diseño de estudio de fase I ejemplar para un primer estudio en humanos de JNJ-42756493 en pacientes con tumor sólido avanzado. Se muestra una forma de representación gráfica de un método tradicional de aumento de dosis de diseño 3+3 para el ensayo clínico de fase I. La fase de escalada de dosis tuvo como objetivo establecer la dosis máxima tolerada (MTD) y la dosis recomendada de Fase II (RPD). El brazo de la Parte 1 se usó para determinar el programa de dosificación intermitente, es decir, 7 días con y siete días sin (10 mg/kg y 12 mg/kg). El brazo de la Parte 2 se utilizó para determinar los biomarcadores de EP (biomarcadores farmacodinámicos; fabricantes examinados para vincular el efecto del fármaco con el objetivo y la respuesta biológica del tumor) en los que se analizaron la biopsia y la muestra de sangre. El brazo de la Parte 3 se utilizó como cohorte de expansión de dosis e incluyó la acumulación de pacientes adicionales en indicaciones específicas (NSCLC, SCLC, mama y tumores sólidos) con diferentes criterios de elegibilidad (anomalías de FGFR: translocación/mutación/amplificaciones) para caracterizar aún más los perfiles de toxicidad del JNJ493.

Evaluación de la actividad clínica

[0173] Se observaron respuestas clínicas significativas (RECIST) con una dosificación de 9 mg una vez al día (QD), 12 mg QD y 12 mg 7d encendido/apagado en pacientes con los genes de fusión FGFR. (FIG. 11; representa todos los regímenes de dosificación).

Ejemplo 9 - Generación de células RK3E transfectadas de forma estable por fusión de FGFR

Líneas celulares que sobreexpresan la fusión de FGFR

[0174] Se adquirieron células RK3E (células epiteliales de riñón de rata) de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en DMEM complementado con FBS y antibióticos (Invitrogen, Grand Island, Nueva York, EE. UU.). Se diseñaron construcciones de genes de fusión FGFR y se clonaron en el vector de expresión pReceiver (Genecopoeia, Rockville, MD, EE. UU.), que contiene una etiqueta Ha . Los clones se transfectaron en células RK3E utilizando Amaxa Cell Line Nucleofector (Lonza, Basilea, Suiza) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células transfectadas de forma estable se seleccionaron en medio completo con 800 ug/ml de G418 (Invitrogen). La sobreexpresión de las fusiones en las células transfectadas de forma estable se confirmó mediante PCR en tiempo real e inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-pFGFR (FIG. 12). Como se muestra en la FIG. 12, las líneas celulares estables mostraron expresión de quinasas de fusión de FGFR activas, como se muestra por la expresión de fosforilación de FGFR.

Ensayo de formación de colonias

[0175] Se ensayó el crecimiento independiente del anclaje de las células RK3E transfectadas de forma estable por fusión de FGFR. Primero se sembró 1 ml de medio de cultivo con agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 % en cada uno de los tres pocillos de una placa de seis pocillos. Una vez solidificado el agar, cada pocillo recibió otro 1 ml de agar al 0,4 % en medio de cultivo que contenía 100 células. Después de 14 días, las colonias se fijaron y se tiñeron con cristal violeta de cresilo al 0,1 %. El número de colonias se determinó al microscopio mediante recuento manual de pocillos por triplicado para cada línea celular. En la FIG. 13A se muestra una vista representativa de cada línea celular que sobreexpresa la fusión. El crecimiento celular independiente del anclaje en agar blando pudo detectarse en las células transfectadas establemente por fusión de FGFR, pero no en el control de vector vacío. FIG. 13B representa un análisis cuantitativo de colonias en agar blando para células RK3E transfectadas de forma estable por fusión de FGFR y control de vector vacío. Todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado y los resultados se expresan como colonias/100 células sembradas. Todas las fusiones FGFR probadas indujeron un crecimiento independiente del anclaje, destacando su capacidad transformadora.

Expresión diana corriente abajo

[0176] Se sembraron células RK3E transfectadas establemente por fusión de FGFR en medio de crecimiento completo, se privaron de suero durante la noche y luego se volvieron a alimentar con medio de crecimiento FBS al 0,5 %. Las células se trataron con 1 mM de JNJ-42756493, AZD4547 o NVP-BGJ398 en presencia de ligandos durante 1 hora. Para la inmunotransferencia, los lisados de células completas se recolectaron en tampón RIPA (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y la concentración de proteína de la muestra se analizó utilizando el ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific). Se cargaron cantidades iguales de proteína (30 |jg por carril) en geles Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) antes de realizar una página SDS. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se probaron con anticuerpos contra p-FGFR, total-FGFR2, p-MAPK, total-MAPK, p-S6, total S6, B-actina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) y total-FGFR3 (Santa Cruz, Dallas, TX, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con tampón de bloqueo Odyssey durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4°C en una solución de anticuerpo primario diluida en tampón de bloqueo Odyssey (1: 1000). Después de tres lavados en solución salina tamponada con Tween tris al 0,1 % (TBST), las membranas se probaron con antisueros secundarios marcados con IR-tinción 670 o 800cw anti-ratón de cabra o anticonejo de burro en tampón de bloqueo Odyssey durante 1 hora a temperatura ambiente. Los lavados se repitieron después del etiquetado secundario y se tomaron imágenes de las membranas utilizando un escáner LiCor Odyssey y el software analítico Odyssey 3.0 (LiCor, Lincoln, NE, EE. UU.). Los efectos de JNJ-42756493 se compararon con AZD4547 y NVP-BGJ398. Como se muestra en la FIG. 14A-14H, el tratamiento con JNJ-42756493, AZD4547 y NVP-BGJ398 (carriles 2-4 en cada transferencia) inhibía la fosforilación de FGFR y objetivos corriente abajo, es decir, MAPK y S6.

Prueba de respuesta a fármacos para líneas celulares que sobreexpresan la fusión de FGFR

[0177] Se sembraron células RK3E transfectadas de forma estable con fusión de FGFR en placas de 96 pocillos (1000 células/pocillo) por triplicado en medio de crecimiento completo más los ligandos FGF-1 y f GF-2. Después de 24 horas, las células se privaron de suero durante la noche y luego se volvieron a alimentar con medio de cultivo FBS al 0,5 %. 72 horas después del cultivo en placas, las células se trataron con diversas concentraciones de una serie de diluciones 1:3 de 18 puntos, comenzando en 10 jM , de JNJ493, AZD4547 (AZD) y NVP-BGJ398 (NVS). Luego, las placas de microtitulación se incubaron durante 72 horas y se analizó el contenido de trifosfato de adenosina (ATP; un marcador de células metabólicamente activas) utilizando el ensayo Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega Corp., Madison, WI, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante, con modificaciones. Brevemente, se permitió que las células se equilibraran a temperatura ambiente, momento en donde se añadió una mezcla 1:1 de reactivo Cell Titer-Glo®. A continuación, las células se colocaron en un agitador orbital durante 2 minutos y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente para estabilizar la señal luminiscente. Se cuantificó la luminiscencia y se realizaron mediciones utilizando un lector de placas Envision Multilabel (Perkin Elmer; Waltham, MA, EE. UU.). Los valores de CI50 (que se muestran en la Tabla 14) se calcularon usando GraphPad Prism 5.0. Como se muestra en la Tabla 14, las células que albergan las fusiones de FGFR mostraron sensibilidad al inhibidor de FGFR JNJ-42756493, AZD4547 y NVP-BGJ398 in vitro, y JNJ-42756493 mostró una mayor sensibilidad (rango de concentración nanomolar) en comparación con AZD4547 y NVP-BGJ398, mientras que el control de vector vacío no lo hizo.

Tabla 14

Tabla 15

(Continuación)

[0178] Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar numerosos cambios y modificaciones a las formas de realización preferidas de la invención y que tales cambios y modificaciones se pueden realizar hecho. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todas las variaciones equivalentes que caen dentro del alcance de la invención.

Secuencia de nucleótidos de los genes de fusión de FGFR

[0179] Las secuencias de nucleótidos para el ADNc de fusión de FGFR que se diseñaron en vectores de expresión se proporcionan en la Tabla 16. Las secuencias subrayadas corresponden a FGFR3 o FGFR2, las secuencias en fuente normal representan los socios de fusión y los La secuencia en cursiva representa la secuencia del intrón del gen FGFR3.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar a un paciente con cáncer de vejiga que responde al tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), en donde el inhibidor de FGFR comprende un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (I),

un N-óxido del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, y en donde el método comprende:

(a) evaluar una muestra biológica del paciente en busca de un mutante de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es el polimorfismo de un solo nucleótido de FGFR FGFR3 S249C, y en donde dicho evaluar comprende

determinar si uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR están presentes en la muestra, en la que la presencia de uno o más mutantes de FGFR, de los cuales un mutante sería FGFR3 S249C, indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR; o

(b) evaluar una muestra biológica del paciente para determinar la presencia de uno o más mutantes de FGFR de un panel de genes mutantes de FGFR, en donde el mutante de FGFR es el polimorfismo de un solo nucleótido FGFR FGFR3 S249C, en donde la presencia de uno o más FGFR mutantes indica que el paciente responde al tratamiento con el inhibidor de FGFR.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el panel de genes mutantes comprende además:

(a) el gen de fusión FGFR FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, Intrón FGFR3: TACC3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR2: CCDC6 o FGFR2: OFD1, o cualquier combinación de los mismos; y/o,

(b) el polimorfismo de un solo nucleótido FGFR FGFR3 R248C, FGFR3 G370C o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el panel de genes mutantes FGFR comprende además FGFR3: TACC3 v1, FGFR3: TACC3 v3, FGFR3: BAIAP2L1, FGFR2: BICC1, FGFR2: AFF3, FGFR2: CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 G370C o FGFR3 Y373C, o cualquier combinación de los mismos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (b)-3, en donde la evaluación comprende amplificar ADNc con un par de cebadores que se unen y amplifican uno o más mutantes de FGFR del panel de genes mutantes de FGFR; opcionalmente, en donde el ADNc es ADNc preamplificado.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el mutante FGFR y el par de cebadores son FGFR3 S249C y cebadores que tienen las secuencias SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, y opcionalmente:

FGFR3: TACC3 v1 y cebadores que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; FGFR3: TACC3 v3 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8;

FGFR3: intrón TACC3 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10;

FGFR3: BAIAP2L1 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 11 y Se Q ID NO: 12;

FGFR2: BICC1 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 13 y s Eq ID NO: 14;

FGFR2: AFF3 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16;

FGFR2: CASP7 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18;

FGFR2: CCDC6 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20;

FGFR2: OFD1 y cebadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22;

FGFR3 R248C y cebadores que tienen las secuencias SEQ ID NO: 23 y s Eq ID NO: 24 o SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32;

FGFR3 G370C y cebadores que tienen las secuencias SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36;

FGFR3 Y373C y cebadores que tienen las secuencias SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38;

o cualquier combinación de los mismos.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la evaluación comprende:

aislar el ARN de la muestra biológica y sintetizar el ADNc del ARN aislado; opcionalmente, en donde el método comprende además preamplificar el ADNc antes del paso de amplificación.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) o 2-6, en donde se preamplifica el ADNc.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1(a) o 2-7, en donde la etapa de amplificación comprende realizar PCR en tiempo real; opcionalmente, donde la PCR en tiempo real se realiza con una o más sondas que comprenden SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y/o SEQ ID NO: 55; y/o, opcionalmente, donde la PCR en tiempo real se realiza con uno o más oligonucleótidos de bloqueo 3' que comprenden SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 y/o SEQ ID NO: 42.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) o 2-8, en donde dicho paso de determinación comprende secuenciar el ADNc amplificado.