KR20220025848A - Cea 및 4-1bbl에 결합하는 항체의 융합 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 새로운 인간화 CEA 항체 및 이들 CEA 항체를 포함하는 CEA 표적화 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자뿐만 아니라 암의 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

CEA 및 4-1BBL에 결합하는 항체의 융합
본원 발명은 암배아 항원 (CEA)에 결합하는 새로운 항원 결합 분자, 특히 새로운 인간화 CEA 항체 및 이들 CEA 항체를 포함하는 CEA 표적화 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자뿐만 아니라 암의 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본원 발명은 이들 분자를 생산하는 방법 및 이들을 이용하는 방법에 관한 것이다.
암배아 항원-관련된 세포 부착 분자 5 (CEACAM-5 또는 CD66e)로서 또한 지칭되는 암배아 항원 (CEA)은 약 180 kDa의 분자량을 갖는 당단백질이다. CEA는 면역글로불린 유전자 상과의 구성원이고, 그리고 글리코실포스파티딜-이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 세포막에 연결되는 7개의 도메인을 내포한다 (Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5:344-366, 1991). 이들 7개의 도메인은 단일 N 말단 가변 도메인-유사 영역 및 불변 도메인 유사 영역의 3가지 세트 (A1B1, A2B2 및 A3B3; A 도메인의 경우 92개 아미노산 및 B 도메인의 경우 86개 아미노산, Hefta L J, et al., Cancer Res. 52:5647-5655, 1992)를 포함한다.
인간 CEA 패밀리는 29개의 유전자를 내포하는데, 이 중에서 18개가 발현된다: CEA 하위군에 속하는 7개 및 임신-특이적 당단백질 하위군에 속하는 11개. 여러 CEA 하위군 구성원이 세포 부착 특성을 소유하는 것으로 생각된다. CEA는 선천성 면역에서 일정한 역할을 하는 것으로 생각된다. CEA에 밀접하게 관련된 단백질의 실존으로 인해, 다른 밀접하게 관련된 단백질에 대해 최소한의 교차반응성을 갖는, CEA에 대해 특이적인 항-CEA 항체를 조성하는 것이 어려울 수 있다.
CEA는 오랫동안, 종양 관련 항원으로서 확인되었다 (Gold and Freedman, J Exp Med. 1965, 121,439-462. CEA는 암 세포의 세포 부착, 침습 및 전이에서 결정적인 역할을 수행한다. CEA의 내인성 발현은 암-관련된 유전자의 다양한 군, 특히 세포 주기 및 아폽토시스성 유전자의 발현에 영향을 주어, 결장 종양 세포를 다양한 아폽토시스성 자극, 예컨대 5-플루오로우라실을 이용한 치료로부터 보호한다 (Soeth et al., Clin. Cancer Res. 2001, 7(7), 2022-2030). CEA는 세포외 기질에 대한 앵커리지가 박탈된 세포가 차후에 아폽토시스를 겪는, 아노이키스로서 알려져 있는 과정을 저해한다 (Ordo
Figure pct00001
ez et al., Cancer Research 2000, 60(13), 3419-3424). 이런 이유로, CEA 발현은 암 세포가 생존 이익을 획득하고 아폽토시스-유도 요법을 극복하는 한 가지 방식일 수 있다.
CEA의 높은 발현이 다양한 종양 유형에서 발견되었다 (Thompson et al., J. Clin. Lab. Anal. 1991, 5, 344-366). 이의 높은 유병률이 그 중에서도 특히, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 위암, 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 유방암에서 관찰되었다; 낮은 발현이 소세포 폐암 및 교모세포종에서 발견되었다. 상피 기원의 종양뿐만 아니라 이들의 전이는 CEA를 종양 연관된 항원으로서 내포한다. CEA의 존재 그 자체는 암성 세포로의 형질전환을 암시하지 않지만, CEA의 분포는 이를 암시한다. 정상적인 조직에서, CEA는 일반적으로 세포의 정점 표면 상에서 발현되기 때문에 (Hammarstr
Figure pct00002
m S., Semin Cancer Biol. 1999, 9(2), 67-81), 이것은 혈류 내에 항체에 접근 불가능하다. 정상적인 조직과는 대조적으로, CEA는 암성 세포의 전체 표면 위에서 발현되는 경향이 있다. 발현 패턴의 이러한 변화는 CEA가 암성 세포에서 항체 결합에 접근 가능하도록 만든다. 이에 더하여, CEA 발현이 암성 세포에서 증가한다. 게다가, 증가된 CEA 발현은 증가된 세포간 부착을 증진하고, 이것은 전이를 야기할 수 있다 (Marshall J., Semin. Oncol. 2003, 30 (Suppl. 8):30-36).
CEA는 세포 표면으로부터 쉽게 개열되고, 그리고 직접적으로 또는 림프관을 통해 종양으로부터 혈류 내로 흘러 들어간다. 이러한 특성 때문에, 혈청 CEA의 수준은 암의 진단, 그리고 암, 특히 결장직장암의 재발에 대한 선별검사를 위한 임상적 마커로서 이용되었다. 이러한 특성은 또한, CEA를 표적으로서 이용하고자 할 때 한 가지 과제를 부과하는데, 그 이유는 혈청 CEA가 현재 가용한 항-CEA 항체 중에서 대부분에 결합하여, 이들이 세포 표면 상에서 그들의 표적에 도달하는 것을 저해하고 잠재적인 임상적 효과를 제한하기 때문이다.
연구 목적을 위해, 진단 도구로서, 그리고 치료 목적을 위해, CEA에 대한 복수의 단일클론 항체가 조성되었다. 한 가지는 뮤린 항체 T84.66 (Wagener et al., J Immunol 1983, 130, 2308, Neumaier et al. 1985, J Immunol 135, 3604)인데, 이것은 또한 키메라화 (WO 1991/01990) 및 인간화 (WO 2005/086875)되었다. 다른 CEA 항체는 생쥐 단일클론 항체 PR1A3 (Richman et al., Int. J. Cancer 1987, 59, 317-328)인데, 이것은 CEA 분자의 B3 도메인 및 GPI 앵커를 표적으로 하고, 그리고 따라서 단지 막-결합된 CEA에만 결합하고 가용성 CEA에는 결합하지 않는다. 이들의 친화성 성숙된 인간화 변이체는 WO 2011/023787에서 설명된다. 뮤린 항체 A5B7로부터 유래된 인간화 항체는 WO 92/01059 및 WO 2007/071422에서 개시되었다. 하지만, 특히 치료 분자를 종양 세포로 표적화하는 데 이용을 위한, 유리한 특성을 갖는 새로운 CEA 항체를 제공하는 것이 여전히 요구된다.
TNF 수용체 상과의 구성원인 4-1BB (CD137)는 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 유도성 분자로서 최초 확인되었다 (Kwon and Weissman, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 1963-1967). 후속 연구는 NK 세포, B 세포, NKT 세포, 단핵구, 호중구, 비만 세포, 수지상 세포 (DCs) 및 비-조혈 기원의 세포 예컨대 내피 및 평활근 세포를 비롯한, 많은 다른 면역 세포 또한 4-1BB를 발현한다는 것을 증명하였다 (Vinay and Kwon, 2011, Cell Mol Immunol 8, 281-284). 상이한 세포 유형에서 4-1BB의 발현은 주로 유도성이고, 그리고 다양한 자극 신호, 예컨대 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B-세포 수용체 촉발뿐만 아니라 친염증성 사이토킨의 동시자극성 분자 또는 수용체를 통해 유도된 신호전달에 의해 주동된다 (Diehl et al., 2002, J Immunol 168, 3755-3762; Zhang et al., 2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767).
4-1BB 리간드 (4-1BBL 또는 CD137L)가 1993년도에 확인되었다 (Goodwin et al., 1993, Eur J Immunol 23, 2631-2641). 4-1BBL의 발현은 전문적인 항원 제시 세포 (APC) 예컨대 B-세포, DCs 및 대식세포에 한정되는 것으로 밝혀졌다. 4-1BBL의 유도성 발현은 αβ 및 γδ T 세포 부분집합 둘 모두를 비롯한 T 세포, 그리고 내피 세포에 대해 특징적이다 (Shao and Schwarz, 2011, J Leukoc Biol 89, 21-29).
4-1BB 수용체를 통한 (예를 들면 4-1BBL 결찰에 의한) 동시자극은 T 세포 (CD4+와 CD8+ 부분집합 둘 모두) 내에서 복수의 신호전달 캐스케이드를 활성화하여, T 세포 활성화를 강력하게 증강한다 (Bartkowiak and Curran, 2015). TCR 촉발과 조합으로, 효현성 4-1BB-특이적 항체는 T 세포의 증식을 증강하고, 림포카인 분비를 자극하고, 활성화-유도된 세포 사멸에 대한 T-림프구의 민감도를 감소시킨다 (Snell et al., 2011, Immunol Rev 244, 197-217). 이러한 기전은 암 면역요법에서 첫 번째 개념 증거로서 더욱 진전되었다. 전임상 모형에서 종양 보유 생쥐에서 4-1BB에 대한 효현성 항체의 투여는 강력한 항종양 효과를 야기하였다 (Melero et al., 1997, Nat Med 3, 682-685). 추후, 축적된 증거는 다른 면역조절 화합물, 화학요법 시약, 종양 특이적 예방접종 또는 방사선요법과 병용으로 투여될 때에만, 4-1BB가 통상적으로 항암제로서 효능을 나타낸다는 것을 암시하였다 (Bartkowiak and Curran, 2015, Front Oncol 5, 117).
TNFR-상과의 신호전달은 수용체와 맞물리도록 삼합체화 리간드의 교차연결을 필요로 하고, 야생형 Fc-결합을 필요로 하는 4-1BB 효현성 항체 역시 그러하다 (Li and Ravetch, 2011, Science 333, 1030-1034). 하지만, 기능적으로 활성 Fc 도메인을 갖는 4-1BB-특이적 효현성 항체의 전신 투여는, 생쥐에서 기능적 Fc-수용체의 부재에서 축소되거나 또는 유의미하게 개선되는 간 독성 (Dubrot et al., 2010, Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233)과 연관된 CD8+ T 세포의 유입을 유발하였다. 임상에서, Fc-적격성 4-1BB 효현성 Ab (BMS-663513) (NCT00612664)는 4 등급 간염을 유발하여, 상기 시험의 종결을 야기하였다 (Simeone and Ascierto, 2012, J Immunotoxicol 9, 241-247). 이런 이유로, 효과적이고 더 안전한 4-1BB 효현제가 요구된다.
교차연결이 단지 종양 관련 표적의 존재에서만 일어나도록, 동시자극성 4-1BBL 삼합체를 형성할 수 있는 모이어티를, 종양 관련 표적에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인과 조합하는 새로운 항원 결합 분자는 예를 들면 WO 2016/075278에서 설명된다. 하지만, 유리한 특성을 갖는 새로운 CEA 항원 결합 도메인을 도입함으로써 종양 표적화를 최적화하는 것이 여전히 요구된다.
본원 발명은 암배아 항원 (CEA)에 결합하는 새로운 항원 결합 분자, 특히 새로운 인간화 CEA 항체 및 이들 CEA 항체를 포함하는 CEA 표적화 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자뿐만 아니라 암의 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본원 발명은 이들 분자를 생산하는 방법 및 이들을 이용하는 방법에 더욱 관한 것이다.
CEA 표적화 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 CEA-발현 종양 부위에서 증가된 활성을 갖고, 자연적인 인간 4-1BB 리간드를 포함하고, 그리고 따라서 전통적인 4-1BB 효현성 항체 또는 더 인공적인 융합 단백질과 비교하여 더 적은 안전성 문제를 부과할 것이다. 이들 새로운 항원 결합 분자는 항-CEA 항원 결합 도메인을, 동시자극성 4-1BBL 삼합체를 형성할 수 있고 제약학적으로 유용할 만큼 충분히 안정적인 모이어티와 조합한다. 놀랍게도, 본원 발명의 항원 결합 분자는 비록 삼합체화 4-1BBL 엑토도메인 중에서 하나가 상기 분자의 다른 2개의 4-1BBL 엑토도메인과 상이한 다른 폴리펩티드 상에 위치되긴 하지만, 삼합체성 및 따라서 생물학적으로 활성 인간 4-1BB 리간드를 제공한다.
한 양상에서, 본원 발명은 다음을 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공하고:
CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 특징화되고, 그리고
안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인,
여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 앞서 규정된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 4-1BBL의 엑토도메인 또는 이의 단편은 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93 및 서열 번호: 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 다음을 포함하는, 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고:
CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열 번호: 95, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 및 서열 번호: 98로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 서열 번호: 87, 서열 번호: 91, 서열 번호: 89 및 서열 번호: 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징화되고, 그리고
안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인,
여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 특정한 양상에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다. 특정한 양상에서, 본원 발명은 Fc 도메인이 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 노브 인투 홀 변형을 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공한다. 특정한 양상에서, 본원 발명은 Fc 도메인의 제1 아단위가 아미노산 치환 S354C 및 T366W (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고 Fc 도메인의 제2 아단위가 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공한다.
다른 양상에서, 본원 발명은 (c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 앞서 규정된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자와 관련되고, 여기서 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 결합, 특히 Fcγ 수용체를 향한 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특히, Fc 도메인은 IgG 중쇄의 위치 234 및 235 (Kabat에 따른 EU 넘버링) 및/또는 329 (Kabat에 따른 EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함한다. 특히, Fc 도메인이 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인인 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 것이다. 다른 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 교차 Fab 분자 또는 scFV 분자이다.
한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함한다.
다른 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특정한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(i) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(j) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인,
(l) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79 또는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 85 또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 제1 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 그리고 상기 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합된다. 다른 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 제1 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CH 도메인에 융합되고, 그리고 상기 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합된다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 분자는
(i) 제1 중쇄 및 제1 경쇄로서, 둘 모두 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄,
(ii) 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 및 서열 번호: 105로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 그리고
(iii) 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104 및 서열 번호: 106으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
특히, 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 분자는
(a) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 240의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 241의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 242의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 243의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 244의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 245의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 246의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 247의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(f) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 248의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 249의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(g) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 250의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 251의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(h) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 252의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 253의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(i) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 254의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 255의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(j) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 256의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 257의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(k) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 258의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(l) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 260의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 261의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(m) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 262의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
다른 특정한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 분자는
(a) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 270의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 272의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(f) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 273의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(g) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
다른 양상에서, 본원 발명은 다음을 포함하는, 암배아 항원 (CEA)에 결합하는 신규한 인간화 항체 (hu CEACAM5)를 제공한다:
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인.
한 양상에서, 본원 발명은 암배아 항원 (CEA)의 A2 도메인, 다시 말하면 서열 번호: 311의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 결합하는 신규한 인간화 항체 (hu CEACAM5)를 제공한다. 따라서, 본원 발명은 다음을 포함하는, 암배아 항원 (CEA)의 A2 도메인에 결합하는 신규한 인간화 항체 (hu CEACAM5)를 제공한다:
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인.
한 양상에서, 암배아 항원 (CEA)의 A2 도메인에 결합하는 인간화 항체 (huCEACAM5)는
(a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(i) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(j) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인,
(l) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 다음을 포함하는, 암배아 항원 (CEA)에 결합하는 신규한 인간화 항체가 제공된다: (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인. 한 양상에서, 본원 발명은 암배아 항원 (CEA)의 A1 도메인, 다시 말하면 서열 번호: 312의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 결합하는 인간화 항체 (hu CEACAM5)를 제공한다. 따라서, 본원 발명은 다음을 포함하는, 암배아 항원 (CEA)의 A1 도메인에 결합하는 인간화 항체 (hu CEACAM5)를 제공한다: (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인.
특히, 암배아 항원 (CEA)의 A1 도메인에 결합하는 인간화 항체 (hu CEACAM5)는 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79 또는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 85 또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 한 가지 특정한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가의 양상에서, 각각, 암배아 항원 (CEA)의 A2 또는 A1 도메인에 결합하는 인간화 항체는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 특히 Fab 분자이다. 한 양상에서, 항체는 전장 IgG1 항체이다.
본원 발명의 다른 양상에 따라서, 앞서 규정된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 앞서 규정된 바와 같은 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 본원 발명은 본원 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터 및 본원 발명의 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더욱 제공한다. 일부 구체예에서 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유류 세포이다.
다른 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 생산하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 본원 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 단리하는 단계를 포함한다. 본원 발명은 또한, 본원 발명의 방법에 의해 생산된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 포괄한다.
본원 발명은 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 본원 발명의 항체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 더욱 제공한다. 다른 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 추가 치료제, 예를 들면 화학요법제 및/또는 암 면역요법에서 이용을 위한 다른 작용제를 더욱 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 추가의 양상에서, T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체, 특히 항-CEA 항-CD3 이중특이적 항체를 더욱 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
약제로서 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 본원 발명의 항체 또는 약학 조성물 또한 본원 발명에 의해 포괄된다. 한 양상에서 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에서 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 본원 발명의 약학 조성물이 제공된다. 특정한 양상에서, 암의 치료에서 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 본원 발명의 항체 또는 약학 조성물이 제공된다. 다른 양상에서, 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 또는 연장하는 데 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 본원 발명의 약학 조성물이 제공된다. 다른 양상에서, 암의 치료에서 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 본원 발명의 약학 조성물이 제공되고, 여기서 상기 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 다른 치료제, 특히 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체와 병용된다. 한 양상에서, T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자와 동시에, 이것에 앞서, 또는 이것 다음에 투여된다.
치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 특히 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 본원 발명의 항체의 용도뿐만 아니라 개체에서 질환을 치료하는 방법 역시 제공되고, 상기 방법은 약학적으로 허용되는 형태에서 본원에서 개시된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 양상에서, 질환은 암이다. 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 용도가 더욱 제공되고, 여기서 상기 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체, 특히 항-CEA/항-CD3 항체와 병용된다. 게다가, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 이의 약학 조성물의 효과량, 그리고 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체, 특히 항-Her2/항-CD3 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 개체를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 본원 발명의 약학 조성물의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 개체에서 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 또는 연장하는 방법 역시 제공된다. 임의의 상기 구체예에서 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1a 및 1b는 일가 CEA-표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자의 조립을 위한 구성요소를 도시한다. 도 1a는 C 말단에서, 돌연변이 E123R 및 Q124K (하전된 변이체)를 갖는 인간 IgG1-CL 도메인에 융합되는 이합체성 4-1BB 리간드를 도시하고, 그리고 도 1b는 C 말단에서, 돌연변이 K147E 및 K213E (하전된 변이체)를 갖는 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합되는 단량체성 4-1BB 리간드를 도시한다. 도 1c는 하전된 잔기를 갖는 CH-CL 교차를 포함하는 일가 CEA-표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc (kih) P329G LALA 융합 항원 결합 분자의 구조를 개략적으로 도해한다. 짙은 검은색 점은 노브 인투 홀 변형을 의미한다. *는 CH1과 CL 도메인에서 아미노산 변형 (이른바 하전된 변이체)을 상징한다.
도 2는 부모 뮤린 A5B7 항체의 결합과 비교하여, MKN-45에 대한 인간화 A5B7 huIgG1 P329G LALA 변이체의 결합을 도시한다. 항체가 형광 표지화된 이차 항체로 검출되었고, 그리고 형광이 유세포분석법에 의해 계측되었다.
도 3a 내지 3c는 파지 전시 캠페인에서 항원으로서 이용된 CEACAM5 단백질의 상이한 도메인을 나타내는 재조합 단백질의 개략적 도해이다. 도 3a는 4개의 Ig-유사 도메인 N, A1, B 및 A2로 구성되는 작제물 NABA-avi-His를 도시한다. 도 3b는 작제물 N(A2B2)A-avi-His를 도시하고, 그리고 도 3c는 작제물 NA(B2)A-avi-His를 도해한다.
도 4a 및 4b는 각각, 인간화 CEA 항체 A5H1EL1D의 VH와 VL 서열을 도시하고, 여기서 무작위화된 위치는 X로 표시된다.
친화성 성숙 라이브러리의 파지 벡터의 개략적 도면은 도 5a (CDRH1/H2 친화성 성숙 라이브러리), 도 5b (CDRL1/H2 친화성 성숙 라이브러리) 및 도 5c (CDRH3/CDRL3 증폭 라이브러리)에서 도시된다.
도 6a 및 6b는 친화성 성숙된, 인간화 CEA(A5H1EL1D) 항체 변이체의 VH 아미노산 서열 (도 6a) 및 VL 아미노산 서열 (도 6b)의 정렬을 도시한다.
도 7a 및 7b는 인간화 MFE23 항체 변이체의 VH 아미노산 서열 (도 7a) 및 VL 아미노산 서열 (도 7b)의 정렬을 도시한다.
도 8a, 8b 및 8c는 부모 뮤린 MFE23 항체의 결합과 비교하여, MKN-45에 대한 인간화 MFE23 huIgG1 P329G LALA 변이체의 결합을 도시한다. 항체가 형광 표지화된 이차 항체로 검출되었고, 그리고 형광이 유세포분석법에 의해 계측되었다. 그래프가 부모 MFE23 클론에 대해 낮은 결합, 중간 결합 및 유사한 결합을 나타내는 3개의 그래프로 분할되었다.
도 9a 내지 9h는 hu4-1BB 및 huN(A2-B2)A 또는 hu(NA1)BA에 대한 CEA-표적화 삼합체성 분할 4-1BBL 분자의 동시 결합에 관한 것이다. 도 9a는 검정의 셋업을 도시한다. 도 9b는 huN(A2-B2)A 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(A5B7)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 도 9c는 huN(A2-B2)A 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(A5H1EL1D)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 도 9d는 hu(NA1)BA 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(MFE23)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 도 9e는 hu(NA1)BA 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(MFE23-L28-H24)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 도 9f는 hu(NA1)BA 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(MFE23-L28-H28)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 도 9g는 huN(A2-B2)A 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(P001.177)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 도 9h는 huN(A2-B2)A 및 hu4-1BB-Fc(kih)에 대한 CEA(P005.102)-4-1BBL의 동시 결합을 도시한다. 복제물 또는 삼중물이 도시된다.
결합 검정에 이용된 상이한 CEACAM5 발현 클론의 세포 표면 CEACAM5 발현 수준은 도 10에서 도시된다. CHO-k1 (ATCC CRL-9618)로 불리는 중국 햄스터 난소 세포주가 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 (CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8) 또는 인간 CEACAM5 (CHO-k1-huCEACAM5 클론 11, 클론 12, 클론 13, 클론 17)로 형질감염되었다. 발현 수준이 유세포분석법에 의해, 적정된 APC-표지화된 항-CD66 특이적 검출 항체 (클론 CD66AB.1.1)를 이용하여 결정되었다. 검출 항체의 농도와 대비하여 중앙 형광 강도가 도시되는데, 여기서 중앙 형광 강도는 결합된 검출 항체의 양 및 이런 이유로, 세포 표면 상에서 CEACAM5 분자의 발현 수준과 양으로 상관한다. CHO-k1-cynoCEACAM5 클론 8 및 CHO-k1-huCEACAM5 클론 11은 유사한 세포 표면 CEACAM5 발현을 나타내고, 반면 CHO-k1-huCEACAM5 클론 12, 13 및 17은 높은 세포 표면 CEACAM5 발현 수준을 나타낸다.
도 11a 내지 11e에서 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 또는 인간 CEACAM5-발현 CHO-k1 세포에 결합이 도시된다. MFE23 (부모) 또는 인간화 MFE23 (huMFE23-L28-H24 또는 huMFE23-L28-H28) 또는 T84.66-LCHA (참조) 또는 대조 분자 중 어느 한 가지를 CEA-결합체로서 내포하는 상이한 이중특이적 CEA-4-1BBL 분자의 농도가 PE-접합된 이차 검출 항체의 중앙 형광 강도에 대해 블로팅된다. 블랭크 대조 (예를 들면 일차 검출 항체가 없고 이차 검출 항체만 있음)의 기준선 값을 차감함으로써, 모든 값이 기준선 교정된다. 모든 CEACAM5 항원 결합 도메인-내포 작제물은 인간 CEACAM5-발현 세포에 효율적으로 결합한다 (도 11b, 11c, 11d 및 11e). 대조적으로, 이들 CEA-결합체 중 어느 것도 시노몰구스 원숭이 CEACAM5에 검출가능하게 결합하지 않는다 (도 11a).
또한 도 12a 내지 12e에서 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 또는 인간 CEACAM5-발현 CHO-k1 세포에 결합이 도시된다. A5B7 (부모) 또는 인간화 A5B7 (A5H1EL1D 또는 MEDI-565) 또는 T84.66-LCHA (참조) 또는 대조 분자 중 어느 한 가지를 CEA-결합체로서 내포하는 상이한 이중특이적 CEA-4-1BBL 분자의 농도가 PE-접합된 이차 검출 항체의 중앙 형광 강도에 대해 블로팅된다. 블랭크 대조 (예를 들면 일차 검출 항체가 없고 이차 검출 항체만 있음)의 기준선 값을 차감함으로써, 모든 값이 기준선 교정된다. 모든 CEACAM5 항원 결합 도메인-내포 작제물은 인간 CEACAM5-발현 세포 (도 12b, 12c, 12d 및 12e)뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 (도 12a)에 효율적으로 결합한다, 예를 들면 이들 도시된 결합체는 시노몰구스 원숭이/인간 교차반응성이다.
도 13a 내지 13c는 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 또는 인간 CEACAM5-발현 CHO-k1 세포에 결합을 도시한다. A5B7 (부모) 또는 인간화 A5B7 (A5H1EL1D 또는 MEDI-565) 또는 친화성 성숙된 A5H1EL1D (친화성 성숙된 A5H1EL1D P001.177 및 친화성 성숙된 A5H1EL1D P005.102) 또는 T84.66-LCHA (참조) 또는 대조 분자 중 어느 한 가지를 CEA-결합체로서 내포하는 상이한 이중특이적 CEA-4-1BBL 분자의 농도가 PE-접합된 이차 검출 항체의 중앙 형광 강도에 대해 블로팅된다. 블랭크 대조 (예를 들면 일차 검출 항체가 없고 이차 검출 항체만 있음)의 기준선 값을 차감함으로써, 모든 값이 기준선 교정된다. 모든 CEACAM5 항원 결합 도메인-내포 작제물은 인간 CEACAM5-발현 세포 (도 13b 및 13c)뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 (도 13a)에 효율적으로 결합한다, 예를 들면 이들 도시된 결합체는 시노몰구스 원숭이/인간 교차반응성이고, 반면 결합체 A5H1EL1D는 한정된 친화성을 보여준다. 친화성 성숙은 인간 CEACAM5에 대한 및 친화성 성숙된 A5H1EL1D P005.102의 경우에, 또한 시노몰구스 원숭이 CEACAM5에 대한 A5H1EL1D의 친화성을 증가시켰다.
도 14a 내지 14d는 4-1BB 발현 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2에서 NFκB-매개된 루시페라아제 발현 활성을 도시한다. 대조와 대비하여 이중특이적 CEA-4-1BBL 결합 분자의 기능성을 검사하기 위해, 분자가 1:5 비율에서 시노몰구스 원숭이 또는 인간 CEACAM5 발현 CHO-k1 세포주의 부재 또는 존재에서 5 시간 동안, 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2와 함께 배양되었다. CEA-4-1BBL 분자 또는 이의 대조의 농도가 5 시간의 배양 및 루시페라아제 검출 용액의 첨가 후 계측된 방출광 (RLU)의 단위에 대해 블로팅된다. 블랭크 대조 (예를 들면 첨가된 항체 없음)의 기준선 값을 차감함으로써 모든 값이 기준선 교정된다. 항인간 CEACAM5 특이적 클론 MFE23 (부모) 또는 인간화 이형 (huMFE23-L28-H24, huMFE23-L28-H28, sm9b)을 내포하는 결합 검정 분자 또는 참조 클론 T84.66-LCHA에 관련하여, 분자는 결합하고 인간 CEACAM5를 통해 교차연결되고, 그리고 이런 이유로, 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2의 4-1BB-매개된 활성화를 유도한다 (도 14c 및 14d). 대조적으로, 인간 CEACAM5의 부재에서 (도 14a) 또는 시노몰구스 CEACAM5의 존재에서 (도 14b), 활성화는 유도되지 않는다.
또한 도 15a 내지 15d는 4-1BB 발현 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2에서 NFκB-매개된 루시페라아제 발현 활성을 도시한다. 대조와 대비하여 이중특이적 CEA-4-1BBL 결합 분자의 기능성을 검사하기 위해, 분자가 1:5 비율에서 시노몰구스 원숭이 또는 인간 CEACAM5 발현 CHO-k1 세포주의 부재 또는 존재에서 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2와 함께 5 시간 동안 배양되었다. CEA-4-1BBL 분자 또는 이의 대조의 농도가 5 시간의 배양 및 루시페라아제 검출 용액의 첨가 후 계측된 방출광 (RLU)의 단위에 대해 블로팅된다. 블랭크 대조 (예를 들면 첨가된 항체 없음)의 기준선 값을 차감함으로써 모든 값이 기준선 교정된다. 항인간 CEACAM5 특이적 클론 A5B7 (부모) 또는 인간화 이형 (A5H1EL1D 또는 MEDI-565) 또는 친화성 성숙된 이형 (P005.102 및 P001.177)을 내포하는 결합 검정 분자 또는 참조 클론 T84.66-LCHA에 관련하여, 분자는 결합하고 인간 CEACAM5을 통해 교차연결되고, 그리고 이런 이유로 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2의 4-1BB-매개된 활성화를 유도한다 (도 15c 및 15d). 대조적으로, 인간 CEACAM5의 부재에서 (도 15a) 어떤 분자도 활성화를 유도하지 않는다. 시노몰구스 CEACAM5의 존재에서, A5B7 유래된 클론을 내포하는 분자만 활성을 유도하고, 반면 CEA(T84.77-LCHA)-4-1BBL은 그렇지 않다 (도 15b).
정의
별도로 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 기술 용어와 과학 용어는 본원 발명이 속하는 당해 분야에서 일반적으로 이용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하는 목적으로, 하기의 정의가 적용될 것이고, 그리고 적합할 때는 언제든지, 단수로 이용된 용어는 복수를 또한 포함할 것이며 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 실례는 항체, 항체 단편 및 골격 항원 결합 단백질이다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 구역을 포함하는, 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우에, 항원 결합 분자는 항원의 특정 부분에만 결합할 수도 있는데, 상기 부분은 에피토프로 명명된다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 가변 도메인 (가변 영역으로 또한 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인" 또는 "CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 CEA에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 한 양상에서, 항원 결합 도메인은 CEA을 통한 신호전달을 활성화하거나 또는 저해할 수 있다. 특정한 양상에서, 항원 결합 도메인은 자신이 부착되는 실체 (예를 들면 4-1BBL 삼합체)를, 표면 상에서 CEA를 보유하는 특이적 유형의 종양 세포로 지향시킬 수 있다. CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본원에서 더욱 규정된 바와 같은 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 항체 또는 이의 단편과 관련하여, 용어 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티"는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 구역을 포함하는 상기 분자의 부분을 지칭한다. 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 항체 가변 도메인 (항체 가변 영역으로 또한 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. "특이적으로 결합한다"는 결합이 항원에 대해 선택적이고, 그리고 원치 않는 또는 비특이적 상호작용으로부터 차별될 수 있다는 것으로 의미된다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일특이적" 항체는 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 갖고, 이들 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 표시한다. 용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 적어도 2개의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 일정한 구체예에서 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 구별되는 세포 상에서 발현되는 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다. 용어 "다중특이적"은 항원 결합 분자가 적어도 2개의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 다중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 이중특이적 항원 결합 분자 일 수 있다.
본 출원 내에서 이용된 바와 같이, 용어 "가 (valent)"는 항원 결합 분자 내에 특정된 숫자의 결합 부위의 존재를 표시한다. 따라서, 용어 "일가", "이가", "사가" 및 "육가"는 항원 결합 분자 내에 각각, 1개 결합 부위, 2개 결합 부위, 4개 결합 부위 및 6개 결합 부위의 존재를 표시한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. "선천적 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 선천적 IgG-부류 항체는 이황화 결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종삼합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 또한 불리는 가변 영역 (VH), 그 이후에 중쇄 불변 영역으로 또한 불리는 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 또한 불리는 가변 영역 (VL), 그 이후에 경쇄 불변 영역으로 또한 불리는 경쇄 불변 도메인 (CL)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), 또는 μ (IgM)으로 불리는 5가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있으며, 이들 중에서 일부는 아형, 예를 들면 γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) 및 α2 (IgA2)로 더욱 나눠질 수 있다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 교차-Fab 분자; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예를 들면 scFv); 그리고 단일 도메인 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)를 참조한다. ScFv 단편에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Pl
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ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참조한다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다, 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)에서 설명된다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 6,248,516 B1). 항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들면 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
무손상 항체의 파파인 소화는 중쇄와 경쇄 가변 도메인, 그리고 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 각각 내포하는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 따라서, 용어 "Fab 단편" 또는 "Fab 분자"는 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인 (CL)을 포함하는 경쇄 단편, 그리고 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 소수 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 기를 보유하는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위 (2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 산출한다.
용어 "교차-Fab 분자" 또는 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄와 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역 중에서 어느 한 가지가 교환되는 Fab 분자를 지칭한다. 교차 Fab 분자의 2가지 상이한 쇄 조성물이 가능하며 본원 발명의 이중특이적 항체 내에 포함된다: 한편으로, Fab 중쇄와 경쇄의 가변 영역이 교환된다, 다시 말하면, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1)으로 구성되는 펩티드 쇄, 그리고 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성되는 펩티드 쇄를 포함한다. 이러한 교차 Fab 분자는 교차Fab (VLVH)로서 또한 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄와 경쇄의 불변 영역이 교환될 때, 교차 Fab 분자는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성되는 펩티드 쇄, 그리고 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1)으로 구성되는 펩티드 쇄를 포함한다. 이러한 교차 Fab 분자는 교차Fab (CLCH1)로서 또한 지칭된다.
"단일 쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성되는 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N 말단에서 C 말단 방향으로 하기 순서 중에서 한 가지를 갖고: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 그리고 여기서 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 및 50개 사이의 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 쇄 Fab 단편은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이에 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다. 이에 더하여, 이들 단일 쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기 (예를 들면 Kabat 넘버링에 따른 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100)의 삽입을 통한 쇄간 이황화 결합의 산출에 의해 더욱 안정화될지도 모른다.
"교차 단일 쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성되는 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N 말단에서 C 말단 방향으로 하기 순서 중에서 한 가지를 갖고: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기서 VH와 VL은 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함께 형성하고, 그리고 여기서 상기 링커는 적어도 30개 아미노산의 폴리펩티드이다. 이에 더하여, 이들 x-scFab 분자는 시스테인 잔기 (예를 들면 Kabat 넘버링에 따른 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100)의 삽입을 통한 쇄간 이황화 결합의 산출에 의해 더욱 안정화될지도 모른다.
"단일 쇄 가변 단편 (scFv)"은 10개 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된, 항체의 중쇄 (VH)와 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 통상적으로, 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 그리고 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는 예를 들면 Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)에서 설명된다. 이에 더하여, 항체 단편은 VH 도메인의 특징을 갖거나, 다시 말하면 VL 도메인과 함께 기능적 항원 결합 부위로 조립될 수 있거나, 또는 VL 도메인의 특징을 갖고, 다시 말하면 VH 도메인과 함께 기능적 항원 결합 부위로 조립될 수 있고, 그리고 따라서 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공할 수 있는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.
"골격 항원 결합 단백질"은 당해 분야에서 공지된다, 예를 들면, 섬유결합소 및 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPins)이 항원 결합 도메인에 대한 대안적 골격으로서 이용되었다, 예를 들면, Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) 및 Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)을 참조한다. 본원 발명의 한 양상에서, 골격 항원 결합 단백질은 CTLA-4 (에비바디), 리포칼린 (안티칼린), 단백질 A-유래된 분자 예컨대 단백질 A의 Z-도메인 (어피바디), A-도메인 (아비머/맥시바디), 혈청 트랜스페린 (트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인 (단일 도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인 (나노바디, aVH), VNAR 단편, 섬유결합소 (AdNectin), C-유형 렉틴 도메인 (테트라넥틴); 신규 항원 수용체 베타 락타마아제의 가변 도메인 (VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴 (아필린 분자); 인간 단백질분해효소 저해제의 쿠니츠 유형 도메인, 미세소체 예컨대 크노틴 패밀리로부터 단백질, 펩티드 앱타머 및 섬유결합소 (아드넥틴)으로 구성된 군에서 선택된다. CTLA-4 (세포독성 T 림프구-연관된 항원 4)는 주로 CD4+ T 세포 상에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 접힘을 갖는다. 항체의 CDRs에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성을 부여하기 위해 이종성 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 에비바디로서 또한 알려져 있다 (예를 들면 US7166697B1). 에비바디는 항체 (예를 들면 도메인 항체)의 단리된 가변 영역과 거의 동일한 크기를 갖는다. 추가 상세를 위해 Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)를 참조한다. 리포칼린은 작은 소수성 분자, 예컨대 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔형 구조의 개방 단부에서 다수의 루프를 갖는 강성 베타-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린은 크기에서 160-180개 아미노산 사이이고, 그리고 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 상세를 위해 Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 및 US20070224633을 참조한다. 어피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 골격이다. 상기 도메인은 대략 58개 아미노산의 3-나선 다발로 구성된다. 표면 잔기의 무작위화에 의해 라이브러리가 산출되었다. 추가 상세를 위해 Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462 및 EP 1641818A1을 참조한다. 아비머는 A-도메인 골격 패밀리로부터 유래된 멀티도메인 단백질이다. 대략 35개 아미노산의 선천적 도메인은 규정된 이황화 결합된 구조를 채택한다. 다양성은 A-도메인의 패밀리에 의해 전시되는 자연 변이의 셔플링에 의해 산출된다. 추가 상세를 위해 Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 및 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)을 참조한다. 트랜스페린은 단량체성 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린은 허용적 표면 루프에서 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 골격의 실례는 트랜스-바디를 포함한다. 추가 상세를 위해 J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)을 참조한다. 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPins)은 세포골격에 내재성 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 패밀리인 안키린으로부터 유래된다. 단일 안키린 반복은 2개의 알파 나선 및 베타 회전으로 구성되는 33개의 잔기 모티프이다. 이들은 각 반복의 제1 알파 나선 및 베타 회전에서 잔기를 무작위화함으로써, 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 인터페이스는 모듈의 개수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다 (친화성 성숙의 방법). 추가 상세를 위해, J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 및 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 및 US20040132028A1을 참조한다. 단일 도메인 항체는 단일 단량체성 가변적 항체 도메인으로 구성되는 항체 단편이다. 제1 단일 도메인은 낙타과로부터 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유래되었다 (나노바디 또는 VHH 단편). 게다가, 용어 단일 도메인 항체는 상어로부터 유래된 자율적인 인간 중쇄 가변 도메인 (aVH) 또는 VNAR 단편을 포함한다. 섬유결합소는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 골격이다. 아드넥틴은 인간 섬유결합소 III형 (FN3)의 15개 반복 단위 중 10번째 도메인의 자연 아미노산 서열의 중추로 구성된다. .베타.-샌드위치의 한쪽 단부에서 3개의 루프는 아드넥틴이 관심되는 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있게 하도록 조작될 수 있다. 추가 상세를 위해, Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005), US20080139791, WO2005056764 및 US6818418B1을 참조한다. 펩티드 앱타머는 활성 부위에서 삽입된 제약된 가변적 펩티드 루프를 내포하는 일정한 골격 단백질, 전형적으로 티오레독신 (TrxA)으로 구성되는 조합 인식 분자이다. 추가 상세를 위해, Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)을 참조한다. 미세소체는 3-4개의 시스테인 다리를 내포하는, 길이에서 25-50개 아미노산의 자연 발생 미세단백질로부터 유래된다 - 미세단백질의 실례는 KalataBI 및 코노톡신 및 크노틴을 포함한다. 이들 미세단백질은 미세단백질의 전체 접힘에 영향을 주지 않으면서 25개까지의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 가공된 크노틴 도메인에 관한 추가 상세를 위해, WO2008098796을 참조한다.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예컨대 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔형 구조의 개방 단부에서 다수의 루프를 갖는 강성 베타-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린은 크기에서 160-180개 아미노산 사이이고, 그리고 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 상세를 위해, Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), Biodrugs 19(5), 279-288 (2005), US7250297B1 및 US20070224633을 참조한다.
참조 분자로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 검정에서 항원에 대한 참조 분자의 결합을 50% 또는 그 이상 차단하는 항원 결합 분자를 지칭하고, 그리고 그 반대로, 참조 분자는 경쟁 검정에서 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 50% 또는 그 이상 차단한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 그리고 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체가 형성되는, 폴리펩티드 거대분자 상에 부위 (예를 들면 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역으로 구성되는 입체형태적 형상)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들면 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청에서 자유롭게 및/또는 세포외 기질 (ECM)에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 유용한 단백질은 별도로 지시되지 않으면, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들면 인간) 및 설치류 (예를 들면 생쥐 및 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 단백질의 임의의 선천적 형태일 수 있다. 특정한 구체예에서 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특이적 단백질이 언급되는 경우에, 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 단백질뿐만 아니라 세포 내에서 처리로부터 발생하는 상기 단백질의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다.
암배아 항원-관련된 세포 부착 분자 5 (CEACAM5)로서 또한 알려져 있는 용어 "암배아 항원 (CEA)"은 별도로 지시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간), 비인간 영장류 (예를 들면, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 CEA를 지칭한다. 인간 CEA의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P06731 (버전 151, 서열 번호: 108)에서 도시된다. CEA는 오랫동안 종양-연관된 항원으로서 확인되었다 (Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). 본래 단지 태아 조직에서만 발현되는 단백질로서 분류되었던 CEA는 현재, 여러 정상적인 성체 조직에서 확인되었다. 이들 조직은 위장관, 호흡기 및 비뇨생식로의 세포, 그리고 결장, 자궁경부, 한선 및 전립선의 세포를 비롯하여, 일차적으로 상피 기원이다 (Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992). 상피 기원의 종양뿐만 아니라 이들의 전이는 CEA를 종양 연관된 항원으로서 내포한다. CEA의 존재 그 자체는 암성 세포로의 형질전환을 암시하지 않지만, CEA의 분포는 이를 암시한다. 정상적인 조직에서, CEA는 일반적으로 세포의 정점 표면 상에서 발현되기 때문에 (Hammarstr
Figure pct00004
m S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)), 이것은 혈류 내에 항체에 접근 불가능하다. 정상적인 조직과는 대조적으로, CEA는 암성 세포의 전체 표면 위에서 발현되는 경향이 있다 (Hammarstr
Figure pct00005
m S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). 발현 패턴의 이러한 변화는 CEA가 암성 세포에서 항체 결합에 접근 가능하도록 만든다. 이에 더하여, CEA 발현이 암성 세포에서 증가한다. 게다가, 증가된 CEA 발현은 증가된 세포간 부착을 증진하고, 이것은 전이를 야기할 수 있다 (Marshall J., Semin Oncol., 30 (a Suppl. 8):30-6, 2003). 다양한 종양 실체에서 CEA 발현의 출현율이 일반적으로 매우 높다. 공개된 데이터와 일관하게, 조직 표본에서 수행된 자체 분석은 결장직장 암종 (CRC)에서 대략 95%, 췌장암에서 90%, 위암에서 80%, 비소세포 폐암 (NSCLC, 여기서 이것은 HER3과 공동발현된다)에서 60%, 그리고 유방암에서 40%로, 이의 높은 출현율을 확증하였다; 낮은 발현은 소세포 폐암 및 교모세포종에서 발견되었다.
CEA는 세포 표면으로부터 쉽게 개열되고, 그리고 직접적으로 또는 림프관을 통해 종양으로부터 혈류 내로 흘러 들어간다. 이러한 특성 때문에, 혈청 CEA의 수준은 암의 진단, 그리고 암, 특히 결장직장암의 재발에 대한 선별검사를 위한 임상적 마커로서 이용되었다 (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006).
용어 "항-CEA 항원 결합 분자" 또는 "CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자"는 상기 항원 결합 분자가 CEA를 표적으로 할 때 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 CEA에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자는 항체, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일 쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, 그리고 VH 및 골격 항원 결합 단백질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 양상에서, 관련 없는, 비-CEA 단백질에 대한 항-CEA 항원 결합 분자의 결합 정도는 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측될 때 CEA에 대한 상기 항원 결합 분자의 결합의 약 10%보다 적다. 특히, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 500 nM, ≤ 200 nM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일정한 양상에서, 항-CEA 항원 결합 분자는 상이한 종으로부터 CEA에 결합한다. 일정한 양상에서, 항-CEA 항원 결합 분자는 인간 및 시노몰구스 CEA에 결합한다.
용어 "에피토프"는 항-CEA 항체가 결합하는, 단백질성 또는 비단백질성 중 어느 한 가지인 항원 상에서 부위를 표시한다. 에피토프는 인접한 아미노산 스트레치 (선형 에피토프)로부터 형성될 수 있거나, 또는 예를 들면, 항원의 접힘으로 인해, 다시 말하면 단백질성 항원의 삼차 접힘에 의해 공간적으로 근접하는 비인접한 아미노산 (입체형태적 에피토프)을 포함할 수 있다. 선형 에피토프는 전형적으로, 변성제에 단백질성 항원의 노출 이후에도 항체에 의해 여전히 결합되는 반면, 입체형태적 에피토프는 전형적으로, 변성제로 처리 시에 파괴된다. 에피토프는 고유한 공간적 입체형태에서 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 그리고 원치 않는 또는 비특이적 상호작용으로부터 차별될 수 있다는 것으로 의미된다. 특이적 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 기기에서 분석됨) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계측될 수 있다. 한 구체예에서, 관련 없는 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 계측될 때 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, 항원에 결합하는 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
"친화성" 또는 "결합 친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)에 의해 표현될 수 있는데, 이것은 해리 및 연관 속도 상수 (각각, k오프 및 k온)의 비율이다. 따라서, 동등한 친화성은 속도 상수의 비율이 동일하게 남아있기만 하면, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 친화성을 계측하기 위한 특정 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR)이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 항원 결합 분자 (예를 들면, 항체)의 맥락에서 용어 "친화성 성숙된"은 예를 들면, 돌연변이에 의해 참조 항원 결합 분자로부터 유래되고, 동일한 항원에 결합하고, 바람직하게는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고; 그리고 상기 항원에 대한, 참조 항원 결합 분자의 것보다 높은 친화성을 갖는 항원 결합 분자를 지칭한다. 친화성 성숙은 일반적으로, 항원 결합 분자의 하나 또는 그 이상의 CDRs에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 변형을 수반한다. 전형적으로, 친화성 성숙된 항원 결합 분자는 초기 참조 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.
본원에서 이용된 바와 같이 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면 T 세포 또는 B-세포, 종양에서 세포 예컨대 암 세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에서 제시된 항원 결정인자를 지칭한다. 일정한 양상에서, 표적 세포 항원은 암 세포의 표면 상에서 항원이다. 한 양상에서, 표적 세포 항원은 CEA이다.
용어 "가변 도메인" 또는 "가변 영역"은 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs) 및 3개의 초가변 영역 (HVRs)을 포함한다. 참조: 예를 들면, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고 항원 결합 특이성을 결정하는 항원 결합 가변 도메인의 각 영역, 예를 들면 "상보성 결정 영역" ("CDRs")을 지칭한다. 일반적으로, 항원 결합 도메인은 6개 CDRs를 포함한다: VH에서 3개 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 그리고 VL에서 3개 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). 본원에서 예시적인 CDRs는 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDRs (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 그리고
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).
별도로 지시되지 않으면, CDRs는 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 결정된다. 당업자는 CDR 지정이 Chothia, 위와 같음, McCallum, 위와 같음, 또는 임의의 다른 과학적으로 용인된 명명법에 따라서 또한 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. Kabat et al.은 또한, 임의의 항체에 적용 가능한, 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 규정하였다. 당업자는 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 "Kabat 넘버링"의 이러한 시스템을 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 의해 진술된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않으면, 항체 가변 영역에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 따른다.
본원에서 이용된 바와 같이, 항원 결합 분자 (예를 들면, 항체)의 맥락에서 용어 "친화성 성숙된"은 예를 들면, 돌연변이에 의해 참조 항원 결합 분자로부터 유래되고, 동일한 항원에 결합하고, 바람직하게는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고; 그리고 상기 항원에 대한, 참조 항원 결합 분자의 것보다 높은 친화성을 갖는 항원 결합 분자를 지칭한다. 친화성 성숙은 일반적으로, 항원 결합 분자의 하나 또는 그 이상의 CDRs에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 변형을 수반한다. 전형적으로, 친화성 성숙된 항원 결합 분자는 초기 참조 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역 (CDRs) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.
본원에서 목적으로 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에 규정된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 변화의 숫자는 10 또는 그 이하, 9 또는 그 이하, 8 또는 그 이하, 7 또는 그 이하, 6 또는 그 이하, 5 또는 그 이하, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 또는 2 또는 그 이하이다. 일부 구체예에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역" 또는 "인간 불변 영역"은 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 표시한다. 이런 불변 영역은 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 의해 설명된다 (예를 들면 Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788을 또한 참조한다). 본원에서 별도로 특정되지 않으면, 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242에서 설명된 바와 같이, Kabat의 EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
용어 "CH1 도메인"은 대략 EU 위치 118로부터 EU 위치 215까지 (Kabat에 따른 EU 넘버링 시스템) 걸쳐있는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 표시한다. 한 양상에서, CH1 도메인은 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV (서열 번호: 301)의 아미노산 서열을 갖는다. 통상적으로, CH1 도메인을 힌지 영역에 연결하기 위해 EPKSC (서열 번호: 302)의 아미노산 서열을 갖는 분절이 뒤따른다.
용어 "힌지 영역"은 야생형 항체 중쇄 내에서 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분, 예를 들면 Kabat의 EU 번호 시스템에 따라서 대략 위치 216 내지 대략 위치 230, 또는 Kabat의 EU 번호 시스템에 따라서 대략 위치 226 내지 대략 위치 230을 표시한다. 다른 IgG 하위부류의 힌지 영역은 IgG1 하위부류 서열의 힌지 영역 시스테인 잔기에 맞추어 정렬함으로써 결정될 수 있다. 힌지 영역은 통상적으로, 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드로 구성되는 이합체성 분자이다. 힌지 영역은 일반적으로, 25개까지의 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 연관된 표적 결합 부위가 독립적으로 움직이는 것을 허용할 만큼 유연하다. 힌지 영역은 3개의 도메인: 상부, 중앙 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (참조: 예를 들면 Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).
한 양상에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 DKTHTCPXCP (서열 번호: 303)를 갖고, 여기서 X는 S 또는 P 중 어느 한 가지이다. 한 양상에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 HTCPXCP (서열 번호: 304)를 갖고, 여기서 X는 S 또는 P 중 어느 한 가지이다. 한 양상에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 CPXCP (서열 번호: 305)를 갖고, 여기서 X는 S 또는 P 중 어느 한 가지이다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 도메인 및 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 또는 그 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로, 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447), 또는 C 말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 Fc 영역을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 별도로 지시되지 않으면, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 한 양상에서, 본원 발명에 따른 항원 결합 분자 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 양상에서, 본원 발명에 따른 항원 결합 분자 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 대략 위치 231에서 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340에서 아미노산 잔기까지 걸친다. 한 양상에서, 탄수화물 쇄가 CH2 도메인에 부착된다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로, 대략 EU 위치 231에서 아미노산 잔기로부터 대략 EU 위치 340에서 아미노산 잔기까지 (Kabat에 따른 EU 넘버링 시스템) 걸쳐있다. 한 양상에서, CH2 도메인은 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (서열 번호: 299)의 아미노산 서열을 갖는다. CH2 도메인은 이것이 다른 도메인과 가깝게 대합되지 않는다는 점에서 고유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 무손상 선천적 Fc 영역의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 상기 탄수화물은 도메인-도메인 대합에 대한 대체물을 제공하고, 그리고 CH2 도메인을 안정시키는 데 도움을 줄 수 있는 것으로 추측되었다. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206. 한 구체예에서, 탄수화물 쇄가 CH2 도메인에 부착된다. CH2 도메인은 본원에서 선천적 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 Fc 영역 내에서 CH2 도메인의 C 말단에 잔기의 스트레치 (다시 말하면, IgG의 대략 위치 341에서 아미노산 잔기로부터 대략 위치 445에서 아미노산 잔기까지, Kabat에 따른 EU 넘버링 시스템)를 포함한다. 한 양상에서, CH3 도메인은 GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSP (서열 번호: 300)의 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서 CH3 영역은 선천적 서열 CH3 도메인, 또는 변이체 CH3 도메인 (예를 들면 이의 한쪽 쇄에서 "융기" ("노브")가 도입되고 이의 다른 쇄에서 상응하는 "공동" ("홀")이 도입된 CH3 도메인; 본원에서 명시적으로 참조로서 편입되는 US 특허 번호 5,821,333을 참조한다)일 수 있다. 이런 변이체 CH3 도메인은 본원에서 설명된 바와 같은 2개의 비동일한 항체 중쇄의 이종이합체화를 증진하는 데 이용될 수 있다.
"노브 인투 홀" 기술은 예를 들면 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이합체 형성을 증진하고 동종이합체 형성을 방해하기 위해 융기가 공동 내에 배치될 수 있도록, 융기 ("노브")를 제1 폴리펩티드의 인터페이스에서, 그리고 상응하는 공동 ("홀")을 제2 폴리펩티드의 인터페이스 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 제1 폴리펩티드의 인터페이스로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들면 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 인터페이스 내에 창출된다. 융기 및 공동은 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다. 특정한 구체예에서 노브 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나에서 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 그리고 홀 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 다른 하나에서 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 더욱 특정한 구체예에서, 노브 변형을 포함하는 Fc 도메인의 아단위는 아미노산 치환 S354C를 부가적으로 포함하고, 그리고 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 아단위는 아미노산 치환 Y349C를 부가적으로 포함한다. 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 아단위 사이에 이황화 다리의 형성을 유발하여, 이합체를 더욱 안정시킨다 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)). 넘버링은 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991의 EU 색인에 따른다.
"면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 자연 발생 대립형질 변이체뿐만 아니라 치환, 부가 또는 결실을 발생시키지만 작동체 기능 (예컨대 항체-의존성 세포 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실제적으로 감소시키지 않는 변이를 갖는 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실제적인 상실 없이, 면역글로불린의 Fc 영역의 N 말단 또는 C 말단으로부터 결실될 수 있다. 이런 변이체는 활성에 대한 최소 효과를 갖도록 하기 위해 당해 분야에서 공지된 일반적인 규칙에 따라서 선별될 수 있다 (참조: 예를 들면, Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)).
용어 "야생형 Fc 도메인"은 자연에서 발견되는 Fc 도메인의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 표시한다. 야생형 인간 Fc 도메인은 선천적 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 알로타입), 선천적 인간 IgG2 Fc 영역, 선천적 인간 IgG3 Fc 영역, 그리고 선천적 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 자연발생 변이체를 포함한다. 야생형 Fc-도메인은 서열 번호: 306 (IgG1, 백인 알로타입), 서열 번호: 307 (IgG1, 아프리카계 미국인 알로타입), 서열 번호: 308 (IgG2), 서열 번호: 309 (IgG3) 및 서열 번호: 310 (IgG4) 내에 포함된다.
용어 "변이체 (인간) Fc 도메인"은 적어도 하나의 "아미노산 돌연변이"에 의하여, "야생형" (인간) Fc 도메인 아미노산 서열의 것과 상이한 아미노산 서열을 표시한다. 한 양상에서, 변이체 Fc 영역은 선천적 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 예를 들면 선천적 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 돌연변이, 그리고 한 양상에서 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 양상에서, (변이체) Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 적어도 약 95 % 상동성을 갖는다.
"인간화" 항체는 비인간 HVRs로부터 아미노산 잔기 및 인간 FRs로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 HVRs (예를 들면, CDRs)의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 포괄된 "인간화 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 특성을 생성하기 위해 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형 또는 변경된 것이다.
용어 "작동체 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 작동체 기능의 실례는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용 (ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들면 B 세포 수용체)의 하향조절, 그리고 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 인게이지먼트 이후에, 수용체-보유 세포가 작동체 기능을 수행하도록 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) 및 FcαRI (CD89)를 포함한다. 특정 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa이다 (참조: UniProt 수탁 번호 P08637, 버전 141).
항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)은 면역 작동체 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 야기하는 면역 기전이다. 표적 세포는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 이들의 유도체가 일반적으로, Fc 영역의 N 말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "감소된 ADCC"는 앞서 규정된 ADCC의 기전에 의해, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 소정의 항체 농도에서 소정의 시점에 용해되는 표적 세포의 숫자에서 감소 및/또는 ADCC의 기전에 의해, 소정의 시점에 소정의 숫자의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 항체의 농도에서 증가 중에서 어느 한 가지로서 규정된다. ADCC에서 감소는 동일한 표준 생산, 정제, 조제 및 저장 방법 (이들은 당업자에게 공지된다)을 이용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC에서 감소는 Fc 도메인 내에 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 당해 분야에서 널리 공지된다 (참조: 예를 들면 PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831).
용어 "TNF 리간드 패밀리 구성원" 또는 "TNF 패밀리 리간드"는 친염증성 사이토킨을 지칭한다. 일반적으로 사이토킨, 그리고 특히 TNF 리간드 패밀리의 구성원은 면역계의 자극과 조화에서 결정적인 역할을 수행한다. 현재는, 19개의 사이토킨이 서열, 기능 및 구조 유사성에 근거하여 TNF (종양 괴사 인자) 리간드 상과의 구성원으로서 확인되었다. 이들 리간드 모두 C 말단 세포외 도메인 (엑토도메인), N 말단 세포내 도메인 및 단일 막경유 도메인을 갖는 II형 막경유 단백질이다. TNF 상동성 도메인 (THD)으로서 알려져 있는 C 말단 세포외 도메인은 상과 구성원 사이에 20-30% 아미노산 동일성을 갖고 수용체에 결합에 대한 책임을 진다. TNF 엑토도메인은 또한, TNF 리간드가 특이적 수용체에 의해 인식되는 삼합체성 복합체를 형성하도록 하는 책임을 진다. TNF 리간드 패밀리의 구성원은 림프독소 α (LTA 또는 TNFSF1로서 또한 알려져 있음), TNF (TNFSF2로서 또한 알려져 있음), LTβ (TNFSF3으로서 또한 알려져 있음), OX40L (TNFSF4로서 또한 알려져 있음), CD40L (CD154 또는 TNFSF5로서 또한 알려져 있음), FasL (CD95L, CD178 또는 TNFSF6으로서 또한 알려져 있음), CD27L (CD70 또는 TNFSF7로서 또한 알려져 있음), CD30L (CD153 또는 TNFSF8로서 또한 알려져 있음), 4-1BBL (TNFSF9로서 또한 알려져 있음), TRAIL (APO2L, CD253 또는 TNFSF10으로서 또한 알려져 있음), RANKL (CD254 또는 TNFSF11로서 또한 알려져 있음), TWEAK (TNFSF12로서 또한 알려져 있음), APRIL (CD256 또는 TNFSF13으로서 또한 알려져 있음), BAFF (CD257 또는 TNFSF13B로서 또한 알려져 있음), LIGHT (CD258 또는 TNFSF14로서 또한 알려져 있음), TL1A (VEGI 또는 TNFSF15로서 또한 알려져 있음), GITRL (TNFSF18로서 또한 알려져 있음), EDA-A1 (엑토디스플라신 A1로서 또한 알려져 있음) 및 EDA-A2 (엑토디스플라신 A2로서 또한 알려져 있음)로 구성된 군에서 선택된다. 상기 용어는 별도로 지시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간), 비인간 영장류 (예를 들면, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 선천적 TNF 패밀리 리간드를 지칭한다. 용어 "동시자극성 TNF 리간드 패밀리 구성원" 또는 "동시자극성 TNF 패밀리 리간드"는 T 세포의 증식 및 사이토킨 생산을 동시자극할 수 있는 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하위군을 지칭한다. 이들 TNF 패밀리 리간드는 그들의 상응하는 TNF 수용체와의 상호작용 시에 TCR 신호를 동시자극할 수 있고, 그리고 그들의 수용체와의 상호작용은 T 세포 활성화를 유발하는 신호전달 연쇄 반응을 개시하는 TNFR-연관된 인자 (TRAF)의 모집을 야기한다. 동시자극성 TNF 패밀리 리간드는 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L 및 LIGHT로 구성된 군에서 선택되고, 더욱 특히 동시자극성 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1BBL이다.
전술된 바와 같이, 4-1BBL은 II형 막경유 단백질이고 TNF 리간드 패밀리의 한 구성원이다. 서열 번호: 297의 아미노산 서열을 갖는 완전한 또는 전장 4-1BBL은 세포의 표면 상에서 삼합체를 형성하는 것으로 설명되었다. 삼합체의 형성은 4-1BBL의 엑토도메인의 특정한 모티브에 의해 가능해진다. 상기 모티브는 본원에서 "삼합체화 영역"으로서 지정된다. 인간 4-1BBL 서열 (서열 번호: 298)의 아미노산 50-254가 4-1BBL의 세포외 도메인을 형성하지만, 이들의 단편도 삼합체를 형성할 수 있다. 본원 발명의 특정한 구체예에서, 용어 "4-1BBL의 엑토도메인 또는 이의 단편"은 서열 번호: 90 (인간 4-1BBL의 아미노산 52-254), 서열 번호: 87 (인간 4-1BBL의 아미노산 71-254), 서열 번호: 89 (인간 4-1BBL의 아미노산 80-254) 및 서열 번호: 88 (인간 4-1BBL의 아미노산 85-254)에서 선택되는 아미노산을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호: 91 (인간 4-1BBL의 아미노산 71-248), 서열 번호: 94 (인간 4-1BBL의 아미노산 52-248), 서열 번호: 93 (인간 4-1BBL의 아미노산 80-248) 및 서열 번호: 92 (인간 4-1BBL의 아미노산 85-248)에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하지만, 삼합체화할 수 있는 엑토도메인의 다른 단편 또한 본원에 포함된다.
"엑토도메인"은 세포외 공간 (다시 말하면, 표적 세포 외부의 공간)으로 신장하는 막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 통상적으로, 표면과의 접촉을 개시하여, 신호 전달을 야기하는 단백질의 부분이다. 본원에서 규정된 바와 같은 TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 따라서, 세포외 공간 (세포외 도메인) 내로 신장하는 TNF 리간드 단백질의 부분을 지칭하지만, 삼합체화 및 상응하는 TNF 수용체에 결합에 대한 책임을 지는 더 짧은 부분 또는 이들의 단편 또한 포함한다. 용어 "TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인 또는 이의 단편"은 따라서, 세포외 도메인을 형성하는 TNF 리간드 패밀리 구성원의 세포외 도메인, 또는 수용체에 여전히 결합할 수 있는 이의 부분 (수용체 결합 도메인)을 지칭한다.
용어 "펩티드 링커"는 하나 또는 그 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 당해 분야에서 공지되거나 또는 본원에서 설명된다. 적합한, 비면역원성 링커 펩티드는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커 (여기서 "n"은 일반적으로 1 및 10 사이에 숫자, 전형적으로 1 및 4 사이에 숫자, 특히 2이다), 다시 말하면 GGGGS (서열 번호: 112), GGGGSGGGGS (서열 번호: 113), SGGGGSGGGG (서열 번호: 114), (G4S)3 또는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 117), GGGGSGGGGSGGGG 또는 G4(SG4)2 (서열 번호: 115) 및 (G4S)4 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 118)로 구성된 군에서 선택되는 펩티드이지만, 서열 GSPGSSSSGS (서열 번호: 116), GSGSGSGS (서열 번호: 119), GSGSGNGS (서열 번호: 120), GGSGSGSG (서열 번호: 121), GGSGSG (서열 번호: 122), GGSG (서열 번호: 123), GGSGNGSG (서열 번호: 124), GGNGSGSG (서열 번호: 125) 및 GGNGSG (서열 번호: 126)를 또한 포함한다. 특히 관심되는 펩티드 링커는 (G4S)1 또는 GGGGS (서열 번호: 112), (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS (서열 번호: 113) 및 (G4S)3 (서열 번호: 117)이다.
본 출원 내에서 이용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 알라닌 (3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루타민산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V)을 포함하는 자연 발생 카르복시 α-아미노산의 군을 표시한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질"은 항체 단편 및 항체로부터 유래되지 않는 펩티드로 구성되는 단일 쇄 폴리펩티드를 지칭한다. 한 양상에서, 융합 폴리펩티드는 항원 결합 도메인의 부분 또는 Fc 부분에 융합된 4-1BBL의 1개 또는 2개 엑토도메인 또는 이의 단편으로 구성된다. 융합은 펩티드 링커를 통해, 항원 결합 모이어티의 N 또는 C 말단 아미노산을 상기 4-1BBL의 엑토도메인 또는 이의 단편의 C 또는 N 말단 아미노산에 직접적으로 연결함으로써 발생할 수 있다.
"융합된" 또는 "연결된"은 구성요소 (예를 들면 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원의 폴리펩티드 및 엑토도메인)가 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것으로 의미된다.
참조 폴리펩티드 (단백질) 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAWI 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California로부터 공개적으로 가용하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체계에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 대안으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대해 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 아래와 같이 계산된다:
100 곱하기 분율 X/Y
여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해, 상기 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 정합으로서 채점된 아미노산 잔기의 숫자이고, 그리고 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것으로 인지될 것이다. 별도로 특정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 직전 단락에서 설명된 바와 같이 획득된다.
일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 TNF 리간드 삼합체-내포 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 예를 들면, TNF 리간드 삼합체-내포 항원 결합 분자의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. TNF 리간드 삼합체-내포 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체는 이들 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예컨대 항원 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위는 HVRs 및 프레임워크 (FRs)를 포함한다. 보존성 치환은 표제 "바람직한 치환"하에 표 A에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류 (1) 내지 (6)에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 분자 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별검사될 수 있다.
표 A
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아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 부모 항원 결합 분자 (예를 들면 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기에서 아미노산 치환이 있는 실제적인 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 결과의 변이체(들)는 부모 항원 결합 분자에 비하여 일정한 생물학적 특성 (예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변화 (예를 들면, 향상)를 가질 것이고 및/또는 부모 항원 결합 분자의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예를 들면, 파지 전시-기초된 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 산출될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 또는 그 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항원 결합 분자가 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다. 일정한 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 또는 그 이상의 CDRs 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (예를 들면, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 CDRs에서 만들어질 수 있다. 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)이 확인되고, 그리고 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항체 및 항원 사이에 접촉 포인트를 확인하기 위한 항원-항원 결합 분자 복합체의 결정 구조. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 내포하는 지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 포함한다. 상기 분자의 다른 삽입 변이체는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 CEA 항체 또는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키도록 변경된다. 이들 분자의 글리코실화 변이체는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록, 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 획득될 수 있다. 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테나리 올리고당류를 포함한다. 참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 4-1BBL 리간드 삼합체-내포 항원 결합 분자에서 올리고당류의 변형은 일정한 향상된 특성을 갖는 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다. 한 양상에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 변이체가 제공된다. 이런 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다, 예를 들면 US 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.) 또는 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 추가 변이체는 양분된 올리고당류를 갖는 것들을 포함하는데, 예를 들면, 여기서 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다, 예를 들면 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)을 참조한다. 올리고당류 내에 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 Fc 영역에 부착되는 변이체 역시 제공된다. 이런 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있고, 그리고 예를 들면 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 CEA 항체 또는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 시스테인 조작된 변이체, 예를 들면, 상기 분자의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 "thioMAbs"를 창출하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 구체예에서, 치환된 잔기는 분자의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 따라서, 항체의 접근 가능한 부위에서 위치되고, 그리고 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 면역접합체를 창출하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 하기 잔기 중에서 하나 또는 그 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항원 결합 분자는 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 바와 같이 산출될 수 있다.
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 CEA 항체 또는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 특성 또는 기능, 이중특이적 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다. 다른 양상에서, 방사선에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 일상적인 세포를 훼손하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티 근위의 세포가 사멸되는 온도까지 가열하는 파장을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
다른 양상에서, 본원에서 제공된 CEA 항체 또는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 면역접합체가 획득될 수 있다. "면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 또는 그 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (다시 말하면, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 그리고 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA (cDNA) 및 유전체 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 그리고 이들 분자 중에서 2가지 또는 그 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에서 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 중추 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA (예를 들면, cDNA) 또는 RNA (예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 산출될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 증강하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, Stadler er al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1).
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 선천적 환경으로부터 이전된 핵산 분자, DNA 또는 RNA인 것으로 의도된다. 예를 들면, 벡터에 내포된 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위하여 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 또 다른 예는 이종 숙주 세포 내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐 아니라 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 이러한 분자들을 더 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 조절 요소를 포함할 수 있다.
본원 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 예를 들면, 적어도 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드마다 5개까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것으로 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해, 참조 서열에서 5%까지의 뉴클레오티드가 결실되거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있으며, 또는 참조 서열에서 총 뉴클레오티드 중 5%까지의 숫자의 뉴클레오티드가 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 변경은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 어딘가 에서 일어날 수 있고, 참조 서열 내에 잔기 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 내에 하나 또는 그 이상의 인접한 군으로 산재될 수 있다. 현실적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본원 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 지는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 것들 (예를 들면 ALIGN-2)을 전통적으로 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정된 핵산 요소로, 재조합적으로 또는 합성적으로 산출된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 원형자 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 발현 카세트는 본원 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이들의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 작제물"과 동의어이고, 그리고 자신이 표적 세포 내에서 작동가능하게 연관되는 특이적 유전자를 도입하고 이의 발현을 주동하는 데 이용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 자신이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 본원 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정된 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 발현 벡터가 표적 세포 내부에 있게 되면, 유전자에 의해 인코딩되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기계에 의해 생산된다. 한 구체예에서, 본원 발명의 발현 벡터는 본원 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이들의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 일차 형질전환된 세포 및 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본원 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 산출하는 데 이용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면 포유류 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 생쥐 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 그리고 식물 세포, 그러나 또한 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
작용제의 "효과량"은 이것이 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 유발하는 데 필요한 양을 지칭한다.
작용제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 원하는 치료적 또는 방지적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 치료 효과량은 예를 들면 질환의 부정적인 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 또는 예방한다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 특히, 개체 또는 피험자는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 제제가 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 부형제"는 개체에게 비독성인, 약학 조성물에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 부형제로는 완충제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 이용되는데, 이것은 이런 치료 산물의 이용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 코스를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 코스 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 분자는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "암"은 증식성 질환, 예컨대 림프종, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 림프성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위암, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 자궁암, 난관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 전립선암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 세포 암종, 신우의 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 척수 축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 슈반세포종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 흑색종, 다발성 골수종, B-세포 암 (림프종), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 모양 세포성 백혈병, 만성 골수모구성 백혈병, 그리고 상기 암 중 어느 것의 불응성 이형, 또는 상기 암 중에서 한 가지 또는 그 이상의 조합을 지칭한다.
용어 "전이성 암"은 암 세포가 혈관 또는 림프관에 의해 본래 부위로부터 체내의 다른 곳에서 하나 또는 그 이상의 부위로 전파되어, 유방 이외에 하나 또는 그 이상의 장기에서 하나 또는 그 이상의 이차성 종양을 형성하는 암의 상태를 의미한다.
"진행된" 암은 국부 침습 또는 전이 중에서 어느 한 가지에 의해 기원 부위 또는 장기 외부로 확산한 암이다. 따라서, 용어 "진행된" 암은 국소 진행성 질환 및 전이성 질환 둘 모두를 포함한다.
"재발" 암은 초기 요법, 예컨대 수술에 대한 반응 후, 초기 부위에서 또는 원위 부위에서 재성장한 암이다. "국부 재발" 암은 치료 후, 이전에 치료된 암과 동일한 장소에서 재발하는 암이다. "수술 가능한" 또는 "절제 가능한" 암은 일차 장기에 국한되고 수술 (적출)에 적합한 암이다. "비-절제 가능한" 또는 "절제 불가능한" 암은 수술에 의해 제거 (절제)될 수 없다.
본원 발명에 따른 CEA에 결합하는 항원 결합 분자
본원 발명은 암배아 항원 (CEA)에 결합하는 신규한 항원 결합 분자를 제공하고, 이들 항원 결합 분자는 특히 유리한 특성 예컨대 그들이 결합하는 에피토프, 시노몰구스 원숭이/ 인간 교차반응성, 생성력, 안정성, 결합 친화성, 생물학적 활성, 표적화 효율, 감소된 독성, 그리고 CEA 항원 결합 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 다른 CEA-표적화된 항원 결합 분자와 조합되는 능력을 갖는다.
제1 양상에서, 본원 발명은 암배아 항원의 A2 도메인에 결합하는 새로운 인간화 항체 (CEACAM5)를 제공한다. 따라서, 한 양상에서, 서열 번호: 311의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 결합하는 새로운 인간화 항체가 제공된다. 한 양상에서, (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체가 제공된다. 특히, 이들 항체는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁한다. 따라서 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하지 않는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다.
한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체가 제공되고, 여기서 상기 항체는 (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하고, 그리고 여기서 VH 도메인의 프레임워크는 서열 번호: 127의 아미노산 서열을 포함하는 인간 수용자 프레임워크 (IGHV3-23-02)에 기초되고, 그리고 여기서 VL 도메인의 프레임워크는 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 인간 수용자 프레임워크 (IGKV3-11)에 기초된다. 특정한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 따라서, 한 양상에서 (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 인간화 항체가 제공되고, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가의 양상에서, 인간화 및 친화성 성숙된 항체가 제공된다. 한 양상에서, 상기 인간화 및 친화성 성숙된 항체는 (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특정한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 및 친화성 성숙된 항체는
(b) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(i) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(j) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인,
(l) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 및 친화성 성숙된 항체는 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
제2 양상에서, 본원 발명은 암배아 항원 (CEA)의 A1 도메인에 결합하는 새로운 인간화 항체를 제공한다. 따라서, 한 양상에서, 서열 번호: 312의 아미노산 서열을 포함하는 도메인에 결합하는 새로운 인간화 항체가 제공된다. 한 양상에서, (i) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체가 제공된다. 특히, 이들 항체는 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁한다. 따라서 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하지 않는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다.
한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체가 제공되고, 여기서 상기 항체는 (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 특히, VH 도메인의 프레임워크는 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 인간 수용자 프레임워크 (IGHV1-2-02)에 기초되고, 그리고 VL 도메인의 프레임워크는 서열 번호: 235의 아미노산 서열을 포함하는 인간 수용자 프레임워크 (IGKV1-39-01)에 기초된다. 한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79 또는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 85 또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체가 제공되고, 여기서 상기 항체는 (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 한 가지 특정한 양상에서, 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH) 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체가 제공된다.
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자
본원 발명은 특히 유리한 특성 예컨대 상이한 에피토프에 결합, 생성력, 안정성, 결합 친화성, 생물학적 활성, 표적화 효율, 그리고 감소된 독성을 갖는 신규한 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공한다. 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 예를 들면 T 세포 활성화 작용제 예컨대 T 세포 이중특이적 항체 (TCB)와 병용으로, 세포독성 T 세포의 (동시)자극에 특히 유용하다. 본원 발명의 항체는 또한, 활성화 Fc 수용체 예컨대 FcγRIIIa (CD16a)를 통한 동시 자극에 대한 필요 없이 다른 4-1BB-발현 면역 세포를 효율적으로 활성화할 수 있다. 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 그들의 기능을 위한 Fc 수용체 결합 및 활성화에 대한 필요성을 방지하는 것을 통해, 기능을 위해 Fc 수용체 결합 및 활성화를 필요로 하는 4-1BB 항체보다 전신 부작용의 위험은 더 적으면서, 효율적인 면역 세포 활성화를 가능하게 할 수 있다. CEA에 결합을 통해, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 종양 특이적 면역 세포 활성화를 달성하고 전신 부작용의 위험이 감소된다.
제1 양상에서, 본원 발명은 다음을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공하고:
CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 특징화되고, 그리고
안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인,
여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 앞서 규정된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 4-1BBL의 엑토도메인 또는 이의 단편은 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93 및 서열 번호: 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 다음을 포함하는, 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고:
CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열 번호: 95, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 및 서열 번호: 98로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 서열 번호: 87, 서열 번호: 91, 서열 번호: 89 및 서열 번호: 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징화되고, 그리고
안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인,
여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 것이다. 다른 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 교차 Fab 분자 또는 scFV 분자이다.
한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함한다.
다른 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특정한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(i) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(j) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인,
(l) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 한 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79 또는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 그리고 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 85 또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 제1 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 그리고 상기 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합된다. 다른 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 제1 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CH 도메인에 융합되고, 그리고 상기 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드는 자체의 C 말단에서, 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합된다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 분자는
(i) 제1 중쇄 및 제1 경쇄로서, 둘 모두 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄,
(ii) 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 및 서열 번호: 105로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 그리고
(iii) 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104 및 서열 번호: 106으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
특히, 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 분자는
(a) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 240의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 241의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 242의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 243의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 244의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 245의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 246의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 247의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(f) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 248의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 249의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(g) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 250의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 251의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(h) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 252의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 253의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(i) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 254의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 255의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(j) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 256의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 257의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(k) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 258의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(l) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 260의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 261의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(m) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 262의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
다른 특정한 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 항원 결합 분자는
(a) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 270의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 272의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(f) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 273의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(g) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
앞서 규정된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다. 한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 (a) Fab 중쇄가 C 말단에서, Fc 도메인 내에 CH2 도메인의 N 말단에 융합되는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자 및 (c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다.
특히, Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다.
Fc 수용체 결합 및/또는 작동체 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G (IgG) 분자의 Fc 도메인은 이합체이며, 이것의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 아단위는 서로 안정되게 연관될 수 있다.
Fc 도메인은 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 우호적인 조직-혈액 분포 비율을 비롯한, 우호적인 약동학적 특성을 본원 발명의 항원 결합 분자에 부여한다. 이와 동시에 이것은 하지만, 바람직한 항원-보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로, 본원 발명의 이중특이적 항체의 바람직하지 않은 표적화를 야기할 수 있다. 따라서, 특정한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 작동체 기능을 나타낸다. 한 양상에서, Fc는 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고 및/또는 작동체 기능을 유도하지 않는다. 특정한 양상에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 양상에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 특정한 양상에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 특정하게는 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특정하게는 인간 FcγRIIIa이다. 한 양상에서, Fc 도메인은 작동체 기능을 유도하지 않는다. 감소된 작동체 기능은 하기 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성 (CDC), 감소된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식균작용 (ADCP), 감소된 사이토킨 분비, 항원-제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 감소된 결합, 대식세포에 감소된 결합, 단핵구에 감소된 결합, 다형핵 세포에 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 아폽토시스, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 초회감작.
일정한 양상에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 영역 내로 도입되어, Fc 영역 변이체가 산출될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정한 양상에서, 본원 발명은 다음을 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공하고:
(a) CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 특징화되고, 그리고
(c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인으로서, 여기서 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 결합, 특히 Fcγ 수용체를 향한 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
여기서 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은
(a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인 (VH), 그리고 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인 (VL), 또는
(b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 그리고 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 작동체 기능을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개 아단위 각각에서 존재한다. 특히, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329 (EU 넘버링)의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 특히, Fc 도메인은 IgG 중쇄의 위치 234 및 235 (EU 넘버링) 및/또는 329 (EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특히, IgG 중쇄에서 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G ("P329G LALA", EU 넘버링)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 본원 발명에 따른 삼합체성 TNF 패밀리 리간드-내포 항원 결합 분자가 제공된다. 아미노산 치환 L234A 및 L235A는 이른바 LALA 돌연변이를 지칭한다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 전폐하고, 그리고 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/130831 A1에서 설명되는데, 이것은 또한, 이런 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 이의 특성 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 작동체 기능을 결정하기 위한 방법을 설명한다. "EU 넘버링"은 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991의 EU 색인에 따른 넘버링을 지칭한다.
감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 작동체 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한, Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 것들 (U.S. 특허 번호 6,737,056)을 포함한다. 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
다른 양상에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 작동체 기능을 나타낸다. 더욱 특정한 양상에서, Fc 도메인은 위치 S228 (Kabat 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 더욱 특정한 양상에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G (EU 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이런 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 또한 WO 2012/130831에서 설명된다.
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 분야에서 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전학적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성, 기타 등등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 염기서열분석에 의해 실증될 수 있다.
Fc 수용체에 결합은 예를 들면 ELISA에 의해, 또는 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 그리고 Fc 수용체는 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 적합한 이런 결합 검정은 본원에서 설명된다. 대안으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성은 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 이용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본원 발명의 이중특이적 항체의 작동체 기능은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 계측될 수 있다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 본원에서 설명된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 다른 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. 특허 번호 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정법이 이용될 수 있다 (참조: 예를 들면, 유세포분석법의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다.
일부 구체예에서, 보체 성분, 특이적으로 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 작동체 기능을 갖도록 조작되는 일부 구체예에서, 상기 감소된 작동체 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 검정은 본원 발명의 이중특이적 항체가 C1q에 결합할 수 있고, 그리고 따라서 CDC 활성을 갖는 지를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
특정한 양상에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다.
이종이합체화를 증진하는 Fc 도메인 변형
한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 특징화되고, 그리고
(c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인. 따라서, 이들은 2개의 비동일한 폴리펩티드 쇄 ("중쇄") 내에 전형적으로 포함되는, Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 모이어티를 포함한다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 차후 이합체화는 이들 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 야기한다. 재조합 생산에서 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 연결을 증진하는 변형을 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 상기 변형은 특히, Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
특정한 양상에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 중 하나에서 "노브" 변형 및 Fc 도메인의 2개 아단위 중 다른 하나에서 "홀" 변형을 포함하는, 이른바 "노브 인투 홀" 변형이다. 따라서, 특정한 양상에서, 본원 발명은 IgG 분자를 포함하는 전술된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자에 관계하는데, 여기서 제1 중쇄의 Fc 부분은 제1 이합체화 모듈을 포함하고, 제2 중쇄의 Fc 부분은 IgG 분자의 2개 중쇄의 이종이합체화를 가능하게 하는 제2 이합체화 모듈을 포함하고, 그리고 노브 인투 홀 기술에 따라서, 제1 이합체화 모듈은 노브를 포함하고 제2 이합체화 모듈은 홀을 포함한다.
노브 인투 홀 기술은 예를 들면 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이합체 형성을 증진하고 동종이합체 형성을 방해하기 위해 융기가 공동 내에 배치될 수 있도록, 융기 ("노브")를 제1 폴리펩티드의 인터페이스에서, 그리고 상응하는 공동 ("홀")을 제2 폴리펩티드의 인터페이스 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 제1 폴리펩티드의 인터페이스로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들면 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 인터페이스 내에 창출된다.
따라서, 특정한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 산출되고, 그리고 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 산출된다.
융기 및 공동은 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다.
특정한 양상에서, Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기 (T366W)로 대체되고, 그리고 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기 (Y407V)로 대체된다. 더욱 특히, Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기 (T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기 (L368A)로 대체된다. 더욱 특히, Fc 도메인의 제1 아단위에서 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기 (S354C)로 대체되고, 그리고 Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기 (Y349C)에 의해 대체된다. 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 아단위 사이에 이황화 다리의 형성을 유발한다. 이러한 이황화 다리는 이합체를 더욱 안정시킨다 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
대안적 양상에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형은 예를 들면 PCT 공개 WO 2009/089004에서 설명된 바와 같이, 정전 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 동종이합체 형성이 정전적으로 불리하지만 이종이합체화가 정전적으로 유리하게 되도록, 하전된 아미노산 잔기에 의한 2개의 Fc 도메인 아단위의 인터페이스에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 대체를 수반한다.
특정한 양상에서, 본원 발명은 Fc 도메인의 제1 아단위가 아미노산 치환 S354C 및 T366W (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 그리고 Fc 도메인의 제2 아단위가 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V (Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공한다.
CH1/CL 도메인에서 변형
정확한 대합을 더욱 향상시키기 위해, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 상이한 하전된 아미노산 치환 (이른바 "하전된 잔기")을 내포할 수 있다. 이들 변형은 교차된 또는 비-교차된 CH1과 CL 도메인에 도입된다. 특정한 양상에서, 본원 발명은 CL 도메인 중 하나에서 위치 123 (EU 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌 (R)에 의해 대체되었고 위치 124 (EU 넘버링)에서 아미노산이 리신 (K)에 의해 치환되었으며, 그리고 CH1 도메인 중 하나에서 위치 147 (EU 넘버링) 및 위치 213 (EU 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자에 관한 것이다.
더욱 특히, 본원 발명은 TNF 리간드 패밀리 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123 (EU 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌 (R)에 의해 대체되었고 위치 124 (EU 넘버링)에서 아미노산이 리신 (K)에 의해 치환되었으며, 그리고 TNF 리간드 패밀리 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147 (EU 넘버링) 및 위치 213 (EU 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자에 관한 것이다.
따라서, 특정한 양상에서, 다음을 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인,
(b) 아미노산 돌연변이 E123R과 Q124K를 포함하는 CL 도메인을 내포하는 제1 폴리펩티드 및 아미노산 돌연변이 K147E와 K213E를 포함하는 CH1 도메인을 내포하는 제2 폴리펩티드로서, 여기서 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이에 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고,
그리고 여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하고, 그리고 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH1 도메인에 연결되는 하나의 4-1BBL 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 특징화되고; 그리고
(c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인.
한 양상에서, 본원 발명은 TNF 리간드 패밀리 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123 (EU 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌 (R)에 의해 대체되었고 위치 124 (EU 넘버링)에서 아미노산이 리신 (K)에 의해 치환되었으며, 그리고 TNF 리간드 패밀리 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147 (EU 넘버링) 및 위치 213 (EU 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산 (E)에 의해 치환된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공한다. 이들 변형은 바람직하지 않은 효과 예컨대 예를 들면 오대합을 방지하는 유리한 특성을 갖는 이른바 하전된 잔기를 야기한다.
특히, CL 도메인은 아미노산 돌연변이 E123R과 Q124K를 포함하고, 그리고 CH1 도메인은 아미노산 돌연변이 K147E와 K213E를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본원 발명은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 본원에서 설명된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 더욱 제공한다.
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 전체 항원 결합 분자를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 공동발현되는 복수 (예를 들면, 2개 또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 연관되어, 기능적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린의 경쇄 부분은 면역글로불린의 중쇄 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 연관되어 면역글로불린을 형성할 것이다.
일부 양상에서, 단리된 핵산 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 발명에 따른 전체 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 인코딩한다. 특히, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 설명된 바와 같은 발명에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 내에 포함된 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본원 발명은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 인코딩하는 단리된 핵산 분자에 관계하고, 여기서 상기 핵산 분자는 (a) CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 인코딩하는 서열, (b) 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 (c) 상기 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 4-1BB 리간드 삼합체-내포 항원 결합 분자를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공되고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (a) CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티를 인코딩하는 서열, (b) 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 2개 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 (c) 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
일정한 양상에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 전령 RNA (mRNA)의 형태에서 RNA이다. 본원 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성 (예를 들면 Merrifield 고체상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 획득될 수 있다. 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 또는 그 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 폴리뉴클레오티드는 전통적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다. 본원 발명의 한 양상에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 적합한 전사/번역 제어 신호와 함께 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 (단편)의 코딩 서열을 내포하는 발현 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들면, Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)에서 설명된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (다시 말하면, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 연관되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산의 부분이다. "종결 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 만약 존재하면 코딩 영역의 일부인 것으로 고려될 수 있으며, 임의의 측접 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5'와 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 또는 그 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 게다가, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 내포할 수 있거나, 또는 2개 또는 그 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면 본원 발명의 벡터는 단백질분해 개열을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 공동번역에서 분리되는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편, 또는 이들의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 특수한 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 제한 없이 포함한다. 작동 가능한 연관은 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 그와 같은 방식으로, 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 하나 또는 그 이상의 조절 서열과 연관될 때이다. 2개의 DNA 단편 (예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그것과 연관된 프로모터)은 만약 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 유발하고, 그리고 만약 이들 2개의 DNA 단편 사이에 연관의 성격이 유전자 산물의 발현을 주동하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면 "작동가능하게 연관"된다. 따라서, 프로모터 영역은 만약 이러한 프로모터가 핵산의 전사를 달성할 수 있다면, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서만 DNA의 실제적인 전사를 주동하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 그리고 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 주동하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연관될 수 있다.
적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에서 개시된다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 알려져 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스로부터 프로모터와 인핸서 분절 (예를 들면 인트론-A와 함께 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40 (예를 들면 초기 프로모터), 그리고 레트로바이러스 (예컨대 예를 들면 라우스 육종 바이러스)를 제한 없이 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼
Figure pct00007
-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터와 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터 (예를 들면 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 알려져 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시와 종결 코돈, 그리고 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소 (특히 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES, CITE 서열로서 또한 지칭됨)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 발현 카세트는 또한, 다른 특질 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복 (LTRs) 또는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 반전 말단 반복 (ITRs)을 포함할 수 있다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 주동하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가 코딩 영역과 연관될 수 있다. 예를 들면, 만약 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 분비가 요망되면, 신호 서열을 인코딩하는 DNA가 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 핵산의 상류에 배치될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 조면소포체의 전역에서 성장 단백질 쇄의 이출이 시작되면, 성숙 단백질로부터 개열되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로, 이러한 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 갖는다는 것을 인식하는데, 신호 펩티드는 번역되는 폴리펩티드로부터 개열되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태가 생산된다. 일정한 구체예에서, 선천적 신호 펩티드, 예를 들면 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 자신과 작동가능하게 연관되는 폴리펩티드의 분비를 주동하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠론산분해효소의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추후 정제를 가능하게 하거나 (예를 들면 히스티딘 태그) 또는 융합 단백질의 표지화를 보조하는 데 이용될 수 있었던 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA가 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 단부에서 포함될 수 있다.
본원 발명의 추가 양상에서, 본원 발명의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 하나 또는 그 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드와 벡터는 각각, 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에서 설명된 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다. 한 양상에서, 숙주 세포는 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 (이의 부분)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들면 상기 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염되었다). 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본원 발명의 융합 단백질 또는 이들의 단편을 산출하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 항원 결합 분자를 복제하고 이들의 발현을 뒷받침하는 데 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 널리 알려져 있다. 이런 세포는 타당하면, 특정 발현 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입될 수 있고, 그리고 대량의 벡터 내포 세포는 대규모 발효기에 파종되어 임상적 적용을 위한 충분한 양의 항원 결합 분자를 획득하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대 대장균 (E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포, 또는 기타 유사한 것을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).
(글리코실화된) 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다. 식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명). 척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK), 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 경부 암종 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포 (예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)에서 설명된 바와 같이), MRC 5 세포, 그리고 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면, 포유류 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포를 포함하지만, 그러나 또한 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하는 표준 기술은 당해 분야에서 공지된다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄 중에서 어느 한 가지를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 산물이 중쇄와 경쇄 둘 모두를 갖는 면역글로불린이도록, 이들 면역글로불린 쇄 중에서 다른 것을 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 생산하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편의 발현에 적합한 조건 하에, 본원에서 제시된 바와 같이, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 폴리펩티드 단편을 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자에서, 이들 구성요소 (표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 최소한 하나의 모이어티, TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 하나의 폴리펩티드, 그리고 상기 4-1BBL 패밀리 구성원의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드)는 서로 유전적으로 융합되지 않는다. 상기 폴리펩티드는 이의 구성요소 (TNF 리간드 패밀리 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편 및 다른 구성요소 예컨대 CH 또는 CL)가 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 서로 융합되도록 설계된다. 링커의 조성과 길이는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 따라서 결정될 수 있고 효능에 대해 검사될 수 있다. 본원 발명의 항원 결합 분자의 상이한 구성요소 사이에 링커 서열의 실례는 본원에서 제공된 서열에서 발견된다. 원하는 경우에, 융합 단백질의 개별 구성요소를 분리하기 위한 개열 부위를 통합하기 위해 추가 서열, 예를 들면 엔도펩티다아제 인식 서열이 또한 포함될 수 있다.
일정한 구체예에서 항원 결합 분자의 일부를 형성하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 (예를 들면 Fab 단편)는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 영역을 적어도 포함한다. 가변 영역은 자연 또는 비-자연 발생 항체 및 이들의 단편의 일부를 형성하고 이들로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있다 (참조: 예를 들면 Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 비-자연 발생 항체는 고체상-펩티드 합성을 이용하여 작제될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나 (예를 들면 U.S. 특허 번호 4,186,567에서 설명된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 획득될 수 있다 (참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,969,108, McCafferty).
임의의 동물 종의 면역글로불린이 본원 발명에서 이용될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 무제한적 면역글로불린은 뮤린, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 만약 융합 단백질이 인간 이용 용도로 의도되면, 면역글로불린의 불변 영역이 인간으로부터 유래되는, 면역글로불린의 키메라 형태가 이용될 수 있다. 면역글로불린의 인간화 또는 완전 인간 형태 역시 당해 분야에서 널리 알려진 방법에 따라서 제조될 수 있다 (참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,565,332, Winter). 인간화는 (a) 비인간 (예를 들면, 공여자 항체) CDRs을, 결정적인 프레임워크 잔기 (예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지하는 데 중요한 것들)의 보유와 함께 또는 보유 없이 인간 (예를 들면 수용자 항체) 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, (b) 비인간 특이성 결정 영역 (SDRs 또는 a-CDRs; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 이들을 인간-유사 섹션으로 "은폐하는" 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)에서 검토되고, 그리고 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 합체를 설명); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다. 본원 발명에 따른 특정 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 만들어진 인간 단일클론 항체의 일부를 형성하고 이들로부터 유래될 수 있다. (참조: 예를 들면 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (참조: 예를 들면 Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 산출될 수 있다. (참조: 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). 파지는 전형적으로, 단일 쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다.
일정한 양상에서, 본원 발명의 항원 결합 분자 내에 포함된, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티 (예를 들면 Fab 단편)는 예를 들면, PCT 공개 WO 2012/020006 (친화성 성숙에 관련된 실시예 참조) 또는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2004/0132066에서 개시된 방법에 따라서, 증강된 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본원 발명의 항원 결합 분자의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 기술 (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계측될 수 있다. 특정 항원에 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인하는 데 경쟁 검정이 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 경쟁 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다. 예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 항원은 항원에 결합하는 제1 표지화된 항원 결합 분자 및 항원에 결합에 대해 제1 항원 결합 분자와 경쟁하는 능력에 대해 검사되는 제2 표지화되지 않은 항원 결합 분자를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항원 결합 분자는 하이브리도마 상층액 내에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 항원이 제1 표지화된 항원 결합 분자를 포함하지만, 제2 표지화되지 않은 항원 결합 분자를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 항원에 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리 후, 과잉의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 그리고 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 계측된다. 만약 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 대조 표본에 비하여 검사 표본에서 실제적으로 감소되면, 이것은 제2 항원 결합 분자가 항원에 결합에 대해 제1 항원 결합 분자와 경쟁한다는 것을 지시한다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
본원에서 설명된 바와 같이 제조된 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 공지된 기술 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기이동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 기타 등등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는 데 이용되는 실제 조건은 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 부분적으로 의존할 것이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 이용될 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 본질적으로 실시예에서 설명된 바와 같이 항원 결합 분자를 단리하는 데 이용될 수 있다. 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 이의 단편의 순도는 겔 전기이동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 비롯한 임의의 다양한 널리 공지된 분석법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 설명된 바와 같이 발현된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 환원 및 비환원 SDS-PAGE에 의해 증명된 바와 같이 무손상이고 적절하게 조립되는 것으로 밝혀졌다.
검정
본원에서 제공된 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해, 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 선별검사되거나, 또는 특징화될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면, 상이한 면역 세포 특히 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 증강하는 능력을 포함할 수 있다. 예를 들면 이들은 면역제어 사이토킨의 분비를 증강한다. 증강되거나 또는 증강될 수 있는 다른 면역제어 사이토킨은 예를 들면 IL2, 그랜자임 B 등이다. 생물학적 활성은 또한, 시노몰구스 결합 교차반응성뿐만 아니라 상이한 세포 유형에 결합을 포함할 수 있다. 생체내에서 및/또는 시험관내에서 이런 생물학적 활성을 갖는 항원 결합 분자 역시 제공된다.
1. 친화성 검정
4-1BB (CD137)에 대한 본원에서 제공된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 친화성은 실시예에서 진술된 방법에 따라서, 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정될 수 있고, 그리고 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. CEA에 대한 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 친화성 또는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 친화성 역시 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정될 수 있고, 그리고 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 실시예 1.1.5에서 또는 실시예 2.2에서 설명된다. 한 양상에 따라서, KD는 25 ℃에서 BIACORE® T100 기계 (GE Healthcare)를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 계측된다.
2. 결합 검정 및 다른 검정
상응하는 수용체 발현 세포에 대한 본원에서 제공된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 이용하여, 예를 들면 유세포분석법 (FACS)에 의해 평가될 수 있다. 한 양상에서, 4-1BB를 발현하는 신선한 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)가 결합 검정에서 이용될 수 있다. 이들 세포는 단리 직후에 (미경험 PMBCs) 또는 자극 후 (활성화된 PMBCs) 이용된다. 다른 양상에서, 활성화된 생쥐 비장세포 (4-1BB을 발현)가 4-1BB 발현 세포에 대한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 결합을 증명하는 데 이용될 수 있다.
추가의 양상에서, CEA를 발현하는 세포주가 이러한 표적 세포 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 증명하는 데 이용되었다. CEACAM5에 대한 결합 검정은 실시예 3.1에서 더 상세하게 설명된다.
다른 양상에서, 경쟁 검정이 CEA 또는 4-1BB, 각각에 결합에 대해 특이적 항체 또는 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 경쟁 항원 결합 분자는 특정한 항-CEA 항체 또는 특정한 4-1BB 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다.
3. 활성 검정
한 양상에서, 생물학적 활성을 갖는, CEA 및 4-1BB에 결합하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들면, CEA를 발현하는 암 세포 상에서 4-1BB를 통한 효현성 신호전달을 포함할 수 있다. 이들 검정에 의해, 시험관내에서 이런 생물학적 활성을 갖는 것으로 확인된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 역시 제공된다.
일정한 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 이런 생물학적 활성에 대해 검사된다. 본원 발명의 분자의 생물학적 활성을 검출하기 위한 검정은 실시예 3.2에서 설명된다. 게다가, 세포 용해 (예를 들면 LDH 방출의 계측에 의해), 유도된 아폽토시스 동역학 (예를 들면 카스파제 3/7 활성의 계측에 의해) 또는 아폽토시스 (예를 들면 TUNEL 검정을 이용하여)을 검출하기 위한 검정은 당해 분야에서 널리 공지된다. 이에 더하여, 이런 복합체의 생물학적 활성은 다양한 림프구 부분집합 예컨대 NK 세포, NKT 세포 또는 γδ T 세포의 생존, 증식 및 림포카인 분비에 대한 그들의 효과를 평가함으로써, 또는 항원 제시 세포 예컨대 수지상 세포, 단핵구/대식세포 또는 B-세포의 표현형과 기능을 조정하는 능력을 사정함으로써 사정될 수 있다.
약학 조성물, 제제 및 투여 루트
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에서 이용을 위한 본원에서 제공된 임의의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 본원에서 제공된 임의의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 및 적어도 한 가지의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 다른 구체예에서, 약학 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다. 추가의 양상에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다.
본원 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제에서 용해되거나 또는 분산된 한 가지 또는 그 이상의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 CEA 항체의 치료 효과량을 포함한다. 관용구 "제약학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 일반적으로 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성인, 다시 말하면, 적절하면 동물, 예컨대 예를 들면, 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 부반응을 발생시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 한 가지의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 항체 및 임의적으로 추가 활성 성분을 내포하는 약학 조성물의 제조는 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본원 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 특히, 이들 조성물은 동결 건조된 제제 또는 수성 용액이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들면 항세균제, 항진균제), 등장화제, 염, 안정제, 그리고 이들의 조합을 포함한다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면 피하, 피내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내 또는 복막내 주사에 의한 투여용으로 설계된 것들을 포함한다. 주사를 위해, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 수성 용액에서, 바람직하게는 생리학적으로 양립성 완충액 예컨대 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충액에서 조제될 수 있다. 용액은 조제 작용제 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 대안으로, 융합 단백질은 이용 전, 적합한 운반제, 예를 들면, 무균 발열원 없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 무균 주사가능 용액은 적합한 용매에서 필요한 양의 본원 발명의 융합 단백질을, 필요에 따라, 아래에 열거된 다양한 다른 성분과 통합함으로써 제조된다. 살균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액, 현탁액 또는 유제의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결 건조 기술인데, 이들 기술은 이전에 무균 여과된 액체 배지로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출한다. 액체 매질은 필요하면 적절하게 완충되어야 하고, 그리고 액체 희석제는 주사에 앞서, 충분한 식염수 또는 글루코오스로 먼저 등장성이 되도록 만들어져야 한다. 조성물은 제조와 보관의 조건하에 안정되어야 하고, 그리고 미생물, 예컨대 세균 및 균류의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 하기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 이하의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 덱스트란, 또는 기타 유사한 것을 내포할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한, 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 데 적합한 안정제 또는 작용제를 내포할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반제는 지방유 예컨대 호마유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클리트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)에서 개시된다. 지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 폴리펩티드를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 특정한 구체예에서, 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 이들 조성물에서 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 이용에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 부형제는 세포간 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 더욱 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 양상에서, sHASEGP는 한 가지 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결 건조된 항체 제제는 US 특허 번호 6,267,958에서 설명된다. 수성 항체 제제는 US 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에서 설명된 것들을 포함하는데, 후자 제제는 히스티딘-아세트산염 완충액을 포함한다.
전술된 조성물에 더하여, 융합 단백질은 또한 저장소 제조물로서 조제될 수 있다. 이런 지속성 제제는 이식 (예를 들면, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 융합 단백질은 적합한 중합성 또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용되는 오일에서 유제로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로서 조제될 수 있다.
본원 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 전통적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 과정에 의하여 제조될 수 있다. 약학 조성물은 이들 단백질의 제약학적으로 이용될 수 있는 제조물로의 처리를 가능하게 하는 한 가지 또는 그 이상의 생리학적으로 허용가능 운반체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 전통적인 방식으로 조제될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 루트에 의존한다.
CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 항체는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태에서 조성물로 조제될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실제적으로 유지하는 염이다. 이들은 산 부가염, 예를 들면 단백질성 조성물의 자유 아미노 기로 형성된 것들, 또는 무기 산 예컨대 예를 들면, 염화수소산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산 또는 만델산으로 형성된 것들을 포함한다. 자유 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다. 제약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에서 더 가용성인 경향이 있다.
본원에서 조성물은 또한, 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.
한 양상에서, 약학 조성물은 본원에서 제공된 임의의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 및 적어도 한 가지 추가 치료제를 포함할 수 있다. 한 양상에서, 약학 조성물은 본원에서 제공된 임의의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 및 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체를 포함할 수 있다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 살균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 항체가 치료 방법에서 이용될 수 있다.
치료 방법에서 이용을 위해, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 CEA 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 수 있다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
한 양상에서, 약제로서 이용을 위한 본원 발명의 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환을 치료하는 데 이용을 위한, 특히 암의 치료에서 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 CEA 항체가 제공된다. 일정한 양상에서, 치료 방법에서 이용을 위한 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양상에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공한다. 일정한 양상에서, 본원 발명은 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법에서 이용을 위한 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 제공하고, 상기 방법은 상기 항원 결합 분자의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 양상에서, 치료되는 질환은 CEA-양성 암이다. CEA-양성 암의 실례는 결장암, 췌장암, 위암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 난소암, 방광암, 식도암, 자궁경부 암종 또는 엔돔 선암종, 타액선, 자궁내막암 및 머리 & 목 소세포 암을 포함한다. 한 양상에서, CEA-양성 암은 결장 선암종, 췌장 선암종, 위 선암종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 자궁경부 암종 및 식도 선암종으로 구성된 군에서 선택된다. 특히, CEA-양성 암은 결장암 또는 비소세포 폐암 (NSCLC)이다. 따라서, 이들 암의 치료에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공된다. 치료가 필요한 개체, 환자, 또는 "피험자"는 전형적으로 포유동물, 더욱 특정하게는 인간이다.
다른 양상에서, 감염성 질환의 치료에서 이용을 위한, 특히 바이러스 감염의 치료를 위한 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공된다. 추가의 양상에서, 자가면역 질환 예컨대 예를 들면 루푸스 질환의 치료에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 약제의 제조 또는 준비에서 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 한 양상에서, 약제는 질환을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 치료 효과량을 질환을 앓는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애, 특히 암이다. 따라서, 한 양상에서, 본원 발명은 암, 특히 CEA-양성 암의 치료를 위한 약제의 제조 또는 준비에서 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. CEA-양성 암의 실례는 결장암, 췌장암, 위암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 난소암, 방광암, 식도암, 자궁경부 암종 또는 엔돔 선암종, 타액선, 자궁내막암 및 머리 & 목 소세포 암을 포함한다. 한 양상에서, CEA-양성 암은 결장 선암종, 췌장 선암종, 위 선암종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 자궁경부 암종 및 식도 선암종으로 구성된 군에서 선택된다. 특히, CEA-양성 암은 결장암 또는 비소세포 폐암 (NSCLC)이다. 당업자는 일부 사례에서 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수 없고 단지 부분적인 유익성만을 제공할 수도 있다는 것을 인식할 수 있다. 일부 양상에서, 일부 유익성을 갖는 생리학적 변화 또한 치료적으로 유익한 것으로 고려된다. 따라서, 일부 양상에서, 생리학적 변화를 제공하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"인 것으로 고려된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 양상에서 약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 일정한 양상에서, 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 양상에서, 질환은 암이다. 일정한 양상에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 (단독으로 또는 한 가지 또는 그 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 투여 루트, 환자의 체중, 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도와 코스, 융합 분자가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 임상 병력 및 융합 단백질에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 어떤 상황에서든, 투여에 대한 책임이 있는 의사가 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 개별 개체에 대한 적합한 용량(들)을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 mg/kg - 10mg/kg)의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 예를 들면, 1회 또는 그 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일량은 전술된 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수도 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우에, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 융합 단백질의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 다른 실례에서, 용량은 또한, 투여마다 약 1 μg/체중 kg, 약 5 μg/체중 kg, 약 10 μg/체중 kg, 약 50 μg/체중 kg, 약 100 μg/체중 kg, 약 200 μg/체중 kg, 약 350 μg/체중 kg, 약 500 μg/체중 kg, 약 1 mg/체중 kg, 약 5 mg/체중 kg, 약 10 mg/체중 kg, 약 50 mg/체중 kg, 약 100 mg/체중 kg, 약 200 mg/체중 kg, 약 350 mg/체중 kg, 약 500 mg/체중 kg으로부터 약 1000 mg/체중 kg 또는 그 이상까지, 그리고 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 열거된 숫자로부터 도출 가능한 범위의 실례에서, 약 5 mg/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg, 약 5 μg/체중 kg 내지 약 500 mg/체중 kg, 기타 등등의 범위가 전술된 숫자에 근거하여 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중에서 한 가지 또는 그 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3 주마다 (예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 복용량의 융합 단백질을 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 또는 그 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 일반적으로, 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 이용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위해, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 또는 적용된다. 치료 효과량의 결정은 특히 본원에서 제공된 상술된 개시에 비추어, 당업자의 능력 범위 안에 있다.
전신 투여의 경우, 치료적으로 유효 용량은 시험관내 검정, 예컨대 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 이후, 세포 배양액에서 결정된 대로의 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모형에서 공식화될 수 있다. 이런 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는 데 이용될 수 있다.
초기 용량은 또한, 당해 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모형으로부터 추정될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 근거하여 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있었다.
복용량 및 간격은 치료 효과를 유지하는 데 충분한, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 통상의 환자 용량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위 안에 있다. 치료적으로 효과적인 혈장 수준은 매일 복수 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장에서 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 계측될 수 있다.
국부 투여 또는 선택적 흡수의 사례에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 효과적인 국부 농도는 혈장 농도에 관련되지 않을 수도 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료적으로 효과적인 국부 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에서 설명된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 치료적으로 유효 용량은 일반적으로, 실제적인 독성을 유발하지 않으면서 치료적 유익성을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양액 검정 및 동물 연구가 LD50 (개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (개체군의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는 데 이용될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이에 용량 비율은 치료 지수인데, 이것은 비율 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 선호된다. 한 구체예에서, 본원 발명에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양액 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 이용에 적합한 용량의 범위를 공식화하는 데 이용될 수 있다. 용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 안에 있다. 용량은 다양한 인자, 예를 들면, 이용된 약형, 활용된 투여 루트, 개체의 상태 등에 따라서 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제제, 투여 루트 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다 (예를 들면, 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1을 참조한다).
본원 발명의 융합 단백질로 치료되는 환자에 대한 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 언제 및 어떻게 종결하거나, 중단하거나, 또는 조정할 지를 알고 있을 것이다. 반대로, 주치의는 또한, 만약 임상적 반응이 적절하지 않으면 (독성 배제) 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알고 있을 것이다. 관심되는 장애의 관리에서 투여된 용량의 크기는 치료되는 질환의 중증도, 투여 루트 등에 따라서 변할 것이다. 질환의 중증도는 예를 들면 부분적으로, 표준 예후적 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 게다가, 용량 및 아마도 투약 빈도 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라서 변할 것이다.
다른 작용제 및 치료
본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 치료 동안 한 가지 또는 그 이상의 다른 작용제와 병용으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 융합 단백질은 적어도 한 가지 추가 치료제와 공동투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이런 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 작용제를 포괄한다. 이런 추가 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 추가 치료제는 다른 항암제이다.
이런 다른 작용제는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다. 이런 다른 작용제의 효과량은 이용된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
전술된 이런 병용 요법은 병용 투여 (여기서 2가지 또는 그 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 조성물 내에 포함된다) 및 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 투여는 추가 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다.
따라서, 한 양상에서 암, 특히 CEA 양성 암의 치료에서 이용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 제공되고, 여기서 상기 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체, 특히 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체와 병용된다.
한 양상에서, 항-CEA/항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 그리고 CEA에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정한 양상에서 CEA에 결합하는 제2 결합 도메인은 CEA 상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다.
한 양상에서, 본원에서 이용된 바와 같은 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 서열 번호: 275의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 276의 CDR-H2 서열 및 서열 번호: 277의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCD3); 및/또는 서열 번호: 278의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 279의 CDR-L2 서열 및 서열 번호: 280의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCD3)을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 더욱 특히, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 서열 번호: 281의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 (VHCD3) 및/또는 서열 번호: 282의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 (VLCD3)을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다. 추가의 양상에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 서열 번호: 281의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCD3) 및/또는 서열 번호: 282의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCD3)을 포함한다.
다른 양상에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 다음을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다:
(a) 서열 번호: 283의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 284의 CDR-H2 서열 및 서열 번호: 285의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCEA) 및/또는 서열 번호: 286의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 287의 CDR-L2 서열 및 서열 번호: 288의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCEA), 또는
(b) 서열 번호: 291의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 292의 CDR-H2 서열 및 서열 번호: 293의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCEA) 및/또는 서열 번호: 294의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 295의 CDR-L2 서열 및 서열 번호: 296의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCEA).
한 양상에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 서열 번호: 289의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 (VHCEA) 및/또는 서열 번호: 290의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 (VLCEA)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 추가의 양상에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCEA) 및/또는 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCEA)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 서열 번호: 281의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCD3) 및/또는 서열 번호: 282의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCD3)을 포함하는 제1 항원 결합 도메인, 그리고 서열 번호: 289의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VHCEA) 및/또는 서열 번호: 290의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VLCEA)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
추가의 양상에서, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체와 병용되고, 그리고 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자와 동시에, 이것에 앞서, 또는 이것 다음에 투여된다.
추가의 양상에서, 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 용도가 제공되고, 여기서 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체, 특히 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체와 병용된다. 일정한 양상에서, 치료되는 질환은 CEA-양성 암이다. CEA-양성 암의 실례는 결장암, 췌장암, 위암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 난소암, 방광암, 식도암, 자궁경부 암종 또는 엔돔 선암종, 타액선, 자궁내막암 및 머리 & 목 소세포 암을 포함한다. 한 양상에서, CEA-양성 암은 결장 선암종, 췌장 선암종, 위 선암종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 자궁경부 암종 및 식도 선암종으로 구성된 군에서 선택된다. 특히, CEA-양성 암은 결장암 또는 비소세포 폐암 (NSCLC)이다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자의 치료 효과량 및 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체, 특히 앞서 규정된 바와 같은 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 양상에서, 상기 방법은 CEA-양성 암을 위한 것이다. CEA-양성 암의 실례는 유방암, 난소암, 위암, 방광암, 타액선, 자궁내막암, 췌장암 및 비소세포 폐암 (NSCLC)을 포함한다. 한 양상에서, 상기 방법은 CEA-양성 전이성 유방암을 치료하기 위한 것이다.
추가의 양상에서, 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자는 PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 작용제와 병용되고, 그리고 PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 작용제는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자와 동시에, 이것에 앞서, 또는 이것 다음에 투여된다. 이러한 양상에서, PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 작용제는 PD-L1 결합 길항제 또는 PD-1 결합 길항제이다. 특히, PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 작용제는 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-1 항체이다. 특정한 양상에서, PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 작용제는 항-PD-L1 항체이다. 특정한 양상에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 (MPDL3280A, RG7446), 더발루맙 (MEDI4736), 아벨루맙 (MSB0010718C) 및 MDX-1105로 구성된 군에서 선택된다. 더욱 특히, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다. 다른 양상에서, PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 작용제는 항-PD-1 항체이다. 특정한 양상에서, 항-PD-1 항체는 MDX 1106 (니볼루맙), MK-3475 (펨브로리주맙), CT-011 (피딜리주맙), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 및 BGB-108, 특히 펨브로리주맙 및 니볼루맙으로 구성된 군에서 선택된다.
제조 물품
본원 발명의 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자이다.
표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 제1 용기 (여기서 상기 조성물은 본원 발명의 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 제2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다.
대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다.
표 B (서열):
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
인간 면역글로불린 경쇄와 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 제공된다. 항체 쇄의 아미노산은 상기 규정된 바와 같은 Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 따른 EU 넘버링 시스템에 따라서 넘버링되고 지칭된다.
실시예
다음은 본원 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
재조합 DNA 기술
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에서 설명된 바와 같은 표준 방법이 DNA를 조작하는 데 이용되었다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다. 인간 면역글로불린 경쇄와 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242에서 제공된다.
DNA 염기서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 염기서열분석에 의해 결정되었다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절은 적합한 주형을 이용한 PCR에 의해 산출되거나, 또는 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 Geneart AG (Regensburg, Germany)에 의해 합성되었다. 정확한 유전자 서열이 가용하지 않은 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 가장 가까운 동족체로부터 서열에 기초하여 설계되었고, 그리고 유전자가 적합한 조직으로부터 유래하는 RNA로부터 RT-PCR에 의해 단리되었다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 개열 부위와 측접된 유전자 분절이 표준 클로닝 / 염기서열분석 벡터 내로 클로닝되었다. 플라스미드 DNA가 형질전환된 세균으로부터 정제되었고, 그리고 농도가 UV 분광법에 의해 결정되었다. 하위클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열이 DNA 염기서열분석에 의해 확증되었다. 유전자 분절이 개별 발현 벡터로의 하위클로닝을 가능하게 하기 위한 적합한 제한 부위를 갖도록 설계되었다. 모든 작제물은 진핵 세포에서 분비를 위한 단백질을 표적으로 하는 리더 펩티드를 코딩하는 5' 단부 DNA 서열을 갖도록 설계되었다.
세포 배양 기술
표준 세포 배양 기술은 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.에서 기술된 바와 같이 사용되었다.
단백질 정제
단백질은 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, 항원 결합 분자가 단백질 A-친화성 크로마토그래피 (평형화 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, pH 3.0)에 적용되었다. pH 3.0에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 표본의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 응집된 단백질이 pH 6.0에서 PBS에서 또는 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl에서 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, GE Healthcare)에 의해 단량체성 항체로부터 분리되었다. 단량체성 항원 결합 분자 분획물이 한 데 모아지고, 예를 들면, MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 원심 농축기를 이용하여 농축되고 (필요하면), 동결되고, 그리고 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서 보관될 수 있다. 예를 들면 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 질량 분광분석법에 의한 차후 단백질 분석 및 분석적 특징화를 위해 표본의 일부가 제공될 수 있다.
실시예 1
항-CEA 항체의 산출과 생산
1.1 항-CEA 항체 A5B7의 인간화 변이체의 산출
1.1.1 방법론
항-CEA 항체 A5B7은 예를 들면 M. J. Banfield et al, Proteins 1997, 29(2), 161-171에 의해 개시되고, 그리고 이의 구조는 단백질 구조 데이터베이스 PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman et al, The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242)에서 PDB ID:1CLO로서 발견될 수 있다. 이러한 엔트리는 중쇄와 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 항-CEA 결합체 A5B7의 인간화 동안 적합한 인간 수용자 프레임워크의 확인을 위해, 높은 서열 상동성을 갖는 수용자 프레임워크를 검색하고, CDRs을 이러한 프레임워크 위에 합체하고, 그리고 어떤 복귀돌연변이가 구상될 수 있는 지를 평가함으로써 고전적 접근법이 취해졌다. 더욱 명시적으로, 부모 항체와 대비하여 확인된 프레임워크의 각 아미노산 차이는 결합체의 구조적 완전성에 대한 영향에 대해 판단되었고, 그리고 적합할 때는 언제든지, 부모 서열을 향한 복귀돌연변이가 도입되었다. 구조적 사정은 Biovia Discovery Studio Environment, 버전 4.5를 이용하여 실행된 인하우스 항체 구조 상동성 모형화 도구로 창출된, 부모 항체 및 이의 인간화 이형 둘 모두의 Fv 영역 상동성 모형에 기초되었다.
1.1.2 수용자 프레임워크의 선택 및 이의 적합
수용자 프레임워크는 아래의 표 1에서 설명된 바와 같이 선택되었다:
수용자 프레임워크
가장 가까운 뮤린 V-영역 생식계열 인간 수용자 V-영역 생식계열의 선택
A5B7 VH
 mu-IGHV7-3-02 IGHV3-23-01 또는 IGHV3-15-01
A5B7 VL
 mu-IGKV4-72-01 IGKV3-11-01
포스트-CDR3 프레임워크 영역은 중쇄의 경우 인간 J-요소 생식계열 IGJH6, 그리고 경쇄의 경우 카파 J-요소 IGKJ2와 유사한 서열로부터 적합되었다.
구조적 고려 사항에 근거하여, 인간 수용자 프레임워크로부터 부모 결합체에서 아미노산으로의 복귀돌연변이가 중쇄의 위치 93 및 94에서 도입되었다.
1.1.3 결과의 인간화 CEA 항체의 VH와 VL 영역
인간화 CEA 항체의 결과의 VH 도메인은 아래의 표 2에서 발견될 수 있고, 그리고 인간화 CEA 항체의 결과의 VL 도메인은 아래의 표 3에서 열거된다.
인간 수용자 프레임워크 IGHV3 -23 또는 IGHV3 -15에 기초된 , 인간화 CEA 항체의 VH 도메인의 아미노산 서열
설명 서열 서열 번호
A5B7 VH뮤린 공여자 서열 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS		 7
IGHV3-23-02
인간 수용자 서열		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA
ISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
 127
인간화 변이체
3-23A5-1
 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 129
3-23A5-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 130
3-23A5-3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDR
GLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 131
3-23A5-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 132
3-23A5-1A
(전체_복귀돌연변이)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 133
3-23A5-1C (A93T)
 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 134
3-23A5-1D (K73)
 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 135
3-23A5-1E (G54A)
 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGF
IGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 23
IGHV3-15*01
인간 수용자 서열		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGR
IKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT 		128
인간화 변이체
3-15A5-1
 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 136
3-15A5-2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGYTTEYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 137
3-15A5-3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF
IGNKANGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTR
DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS		 138
중쇄의 경우, 초기 변이체 3-23A5-1이 결합 검정에서 적합한 것으로 밝혀졌고 (그러나, 부모 뮤린 항체보다 약간 적은 결합을 보여주었다), 그리고 추가 변형을 위한 시작점으로서 선택되었다. IGHV3-15에 기초된 변이체는 인간화 변이체 3-23A5-1과 비교하여 더 적은 결합 활성을 보여주었다.
부모 키메라 항체의 완전 결합 활성을 복원하기 위해, 변이체 3-23A5-1A, 3-23A5-1C 및 3-23A5-1D가 창출되었다. 변이체 3-23A5-1의 경우에 CDR-H2의 길이가 인간 수용자 서열에 적합될 수 있는 지가 또한 검사되었지만, 이러한 작제물은 결합 활성을 완전히 상실하였다. 추정 탈아미드화 핫스팟이 CDR-H2 (Asn53-Gly54) 내에 존재하기 때문에, 우리는 상기 모티프를 Asn53-Ala54로 변화시켰다. 다른 가능한 핫스팟 Asn73-Ser74는 Lys73-Ser74로 복귀돌연변이되었다. 따라서, 변이체 3-23A5-1E가 창출되었다.
인간 수용자 프레임워크 IGKV3 -11에 기초된 , 인간화 CEA 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열
설명 서열 서열 번호
A5B7 VL뮤린 공여자 서열 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYAT
SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGG
TKLEIK		 8
IGKV3-11
인간 수용자 서열		 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD
ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP		 139
인간화 변이체
A5-L1
 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYAT
SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 140
A5-L2
 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYIHWYQQKPGQAPRLLIYA
TSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQ
GTKLEIK		 141
A5-L3
 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYDA
SNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 142
A5-L4
 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYAT
SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 143
A5-L1A (전체_복귀돌연변이) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYAT
SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 144
A5-L1B (Q1T2)
 QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYAT
SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 145
A5-L1C (FR2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYAT
SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 146
A5-L1D (46,47) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYAT
SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG
TKLEIK		 24
경쇄는 인간 IGKV3-11 수용자 프레임워크에 기초하여 인간화되었다. 일련의 A5-L1 내지 A5-L4에서, 변이체 A5-L1이 우수한 결합 활성 (부모 항체보다 약간 적긴 하지만)을 보여준다는 것이 학습되었다. CDR-L1의 부분적인 인간화 (변이체 A5-L2; Kabat 위치 30 및 31)는 결합을 완전히 제거한다. 유사하게, CDR-H2의 인간화 (변이체 A5-L3; Kabat 위치 50 내지 56) 또한 결합을 완전히 제거한다. 위치 90 (변이체 A5-L4)은 결합 특성에 대한 유의미한 기여를 보여준다. 이러한 위치에서 히스티딘이 결합에 중요하다. 따라서, 추가 변형을 위해 변이체 A5-L1이 선택되었다.
일련의 A5-L1A 내지 A5-L1D는 부모 키메라 항체의 완전 결합 잠재력을 복원하기 위해 어떤 복귀돌연변이가 필요한 지의 문제를 다루었다. 변이체 A5-L1A는 Kabat 위치 1, 2, 전체 프레임워크 2, 그리고 Kabat 위치 71에서 복귀돌연변이가 어떤 추가 결합 활성도 부가하지 않는다는 것을 보여주었다. 변이체 A5-L1B, 그리고 A5-L1C는 이들 위치의 부분집합을 다루었고, 그리고 이들이 결합 특성을 변경하지 않는다는 것을 확증한다. Kabat 위치 46 및 47에서 복귀돌연변이를 갖는 변이체 A5-L1D가 최고 결합 활성을 보여주었다.
1.1.4 인간화 A5B7 항체의 선별
VH와 VL의 새로운 인간화 변이체에 기초하여, WO 2012/130831 A1에서 기술된 방법에 따라서 Fcγ 수용체에 결합을 제거하기 위한 작동체 침묵 Fc (P329G; L234A, L235A)를 갖는 huIgG1 항체로서 새로운 CEA 항체가 발현되었고, 그리고 MKN45 세포 상에서 발현되는 CEA에 이들의 결합이 검사되고 개별 부모 뮤린 A5B7 항체와 비교되었다.
huIgG1 _ LALA _ PG 항체로서 발현된 VH / VL 조합
A5-L1A A5-L1B A5-L1C A5-L1D
3-23A5-1A P1AE2164 P1AE2165 P1AE2166 P1AE2167
3-23A5-1C - - P1AE2176 P1AE2177
3-23A5-1D P1AE2179 - P1AE2181 P1AE2182
MKN45 (DSMZ ACC 409)는 CEA를 발현하는 인간 위 선암종 세포주이다. 이들 세포는 진행된 RPMI + 2% FCS + 1% 글루타맥스에서 배양되었다. MKN-45 세포의 생존력이 검사되었고, 그리고 세포가 재현탁되고 1 Mio 세포 / ml의 밀도로 조정되었다. 100 μl의 이러한 세포 현탁액 (0.1 Mio 세포를 내포)이 96 웰 둥근 바닥 평판 내로 파종되었다. 평판은 400xg에서 4 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상층액이 제거되었다. 이후 40 μl의 희석된 항체 또는 FACS 완충액이 이들 세포에 첨가되고 4 ℃에서 30 분 동안 배양되었다. 배양 후, 이들 세포는 웰마다 150 μl FACS 완충액으로 2회 세척되었다. 이후 20 μl의 희석된 이차성 PE 항인간 Fc 특이적 이차 항체 (109-116-170, Jackson ImmunoResearch)가 이들 세포에 첨가되었다. 세포는 4 ℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해, 이들 세포는 웰당 150 μl FACS 완충액으로 다시 한 번 2회 세척되었다. 세포를 고정하기 위해, 1% PFA를 내포하는 100 μl의 FACS 완충액이 웰에 첨가되었다. 계측하기 전, 이들 세포는 150 μl FACS 완충액에서 재현탁되었다. BD 유세포분석기를 이용하여 형광이 계측되었다.
도 2에서, 인간화 A5B7 변이체의 결합 곡선이 도시된다. 모든 검사된 결합체는 MKN45 세포에 결합할 수 있었지만, 부모 A5B7 항체와 비교하여 결합능이 약간 감소되었다. 클론 P1AE2167이 모든 검사된 변이체 중 최고 결합을 가졌고 추가 개발을 위해 선택되었다.
1.1.5 표면 플라스몬 공명 (BIACORE)을 이용하여, 인간 CEA에 대한 뮤린 CEA-항체 A5B7의 인간화 변이체의 Fab 단편의 친화성의 결정
인간 CEA에 대한 뮤린 CEA 항체 A5B7의 인간화 변이체의 Fab 단편의 친화성은 BIACORE T200 기기를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 사정되었다. CM5 칩 상에서, 인간 CEA (hu N(A2-B2)A-avi-His B)가 30s 동안 약 100RU까지 흐름 셀 2 상에 표준 아민 연계에 의해 40nM 농도로 고정되었다. 뮤린 CEA 항체 A5B7의 인간화 변이체의 Fab 단편이 차후에, 120s의 접촉 시간, 250 또는 1000s의 해리 시간 동안 및 30μl/분의 유속에서, 500 - 0.656nM 범위의 3-배 희석액에서 피분석물로서 주입되었다. 인간 CEA (hu N(A2-B2)A-avi-His B)의 수준에서 재생이 60s 동안 10mM 글리신/HCl pH2.0의 2회 펄스에 의해 달성되었다. 데이터는 고정되지 않은 흐름 셀 1 및 제로 농도의 피분석물에 대해 이중-참조되었다. 피분석물의 센서그램이 단순한 1:1 랭뮤어 상호작용 모형에 적합되었다. 인간 CEA (A2 도메인)에 대한 친화성 상수 [KD]는 아래의 표 5에서 요약된다.
인간 CEA (A2 도메인)에 대한, 뮤린 CEA 항체 A5B7의 상이한 인간화 변이체 를 대표하는 Fab 단편의 친화성 상수
Tapir ID 명칭 인간 N(A2-B2)A-avi-His B에 대한 친화성
[M]
P1AE0289 CEA (A5B7) Fab (부모 뮤린 항체) 5.59 E-10
P1AE4135 P1AE2164로부터 유래된 Fab 1.70 E-09
P1AE4136 P1AE2165로부터 유래된 Fab 1.25 E-09
P1AE4137 P1AE2166으로부터 유래된 Fab 1.13 E-08
P1AE4138 P1AE2167로부터 유래된 Fab 1.47 E-09
P1AE4139 P1AE2176으로부터 유래된 Fab 7.58 E-09
P1AE4140 P1AE2177로부터 유래된 Fab 7.62 E-09
P1AE4141 P1AE2179로부터 유래된 Fab 1.83 E-09
P1AE4142 P1AE2181로부터 유래된 Fab 2.64 E-09
P1AE4143 P1AE2182로부터 유래된 Fab 2.92 E-09
뮤린 CEA 항체 A5B7의 인간화 변이체는 부모 뮤린 항체보다 친화성이 낮다. P1AE2167로부터 유래된 Fab 단편 P1AE4138 (VH 변이체 3-23A5-1A를 갖는 중쇄 및 VL 변이체 A5-L1D를 갖는 C카파 경쇄)이 최종 인간화 변이체로서 선택되었다. 게다가, 탈아미드화 부위를 제거하기 위해 Kabat 위치 54에서 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이 (G54A)가 VH 도메인 내로 도입되어, VL 변이체 3-23A5-1E가 산출되었다. 최종 인간화 항체 (VH 변이체 3-23A5-1E를 갖는 중쇄 및 VL 변이체 A5-L1D를 갖는 C카파 경쇄)는 A5H1EL1D 또는 huA5B7로 명명되었다.
1.2 A5H1EL1D-유래된 친화성 성숙된 항-CEA 항체의 산출
1.2.1 파지 전시 캠페인을 위한 항원의 제조, 정제 및 특징화
뮤린 항체 A5B7 및 이의 인간화 유도체 A5H1EL1D는 각각, 약 0.8 및 약 2.5 nM의 친화성으로 CEACAM5 (CEA)의 A2 도메인에 결합한다. 파지 전시에 의한 A5H1EL1D의 친화성 성숙된 변이체의 산출을 위해, 3개의 상이한 재조합 가용성 항원이 산출되었다. 각 단백질은 부위 특이적 비오틴화를 위한 C 말단 avi 태그 및 정제를 위한 his-태그를 내포하였다: 제1 단백질은 4개의 Ig-유사 도메인 N, A1, B, A2로 구성되는 CEACAM1의 세포외 부분으로 구성되었다 (NABA-avi-His, 서열 번호: 147, 표 6). 제2 단백질은 2개의 CEACAM5 및 2개의 CEACAM1 Ig 도메인으로 구성되는 키메라 단백질이었다. CEACAM1의 4개 도메인의 서열에 기초하여, CEACAM1의 제2와 제3 도메인 (A1 및 B 도메인)을 인코딩하는 DNA가 CEACAM5의 A2 및 B2 도메인을 인코딩하는 DNA에 의해 대체되었다 (N(A2B2)A-avi-His, 서열 번호: 148, 표 6). 제3 단백질은 1개의 CEACAM5 및 3개의 CEACAM1 Ig 도메인으로 구성되는 키메라 단백질이었다. CEACAM1의 4개 도메인의 서열에 기초하여, CEACAM1의 제3 도메인 (B 도메인)을 인코딩하는 DNA가 CEACAM5의 B2 도메인을 인코딩하는 DNA에 의해 대체되었다 (NA(B2)A-avi-His, 서열 번호: 149, 표 6). 3개의 작제물에 관한 개략적 설명은 도 3a, 3b 및 3c에서 도시된다.
이용된 CEA 항원의 아미노산 서열
항원 서열 서열 번호
NABA-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGT
QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQF
HVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAMAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPR
LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTI
SPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNS
GSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNL
TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEV
FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDLEVLFQGPGSGLNDIFEAQKIE
WHEARAHHHHHH		 147
N(A2B2)A-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGT
QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQF
HVYPELPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPR
LQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTI
SPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNS
GLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNL
TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEV
FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHH
HHHH		 148
NA(B2)A-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGT
QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQF
HVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAMAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPR
LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDDPTI
SPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNS
GLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNL
TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEV
FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHH
HHHH
 149
개별 플라스미드는 EBV-유래된 단백질 EBNA (HEK EBNA)를 안정되게 발현하는 HEK 293 세포 내로 일시적으로 형질감염되었다. 비오틴 리가아제 BirA를 인코딩하는 동시에 동시형질감염된 플라스미드는 생체내에서 avi-태그-특이적 비오틴화를 허용하였다. 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 그 이후에 겔 여과를 이용한 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 단백질이 정제되었다. 단량체성 단백질 분획물이 한 데 모아지고, 농축되고 (필요하면), 동결되고, -80℃에서 저장되었다. 예를 들면 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 질량 분광분석법에 의한 차후 단백질 분석 및 분석적 특징화를 위해, 이들 표본의 일부가 제공되었다.
1.2.2 친화성 성숙된 A5H1EL1D-유래된 항체의 선별
항체 A5B7의 인간화는 SPR에 의해 계측된, CEA에 대한 친화성의 약 3 내지 4배 감소를 유발하였다. A5B7에 대한 친화성이 약 0.8 nM이긴 하지만, 약 2.5 nM의 친화성이 A5H1EL1D에 대해 계측되었다. 상이한 CEA 발현 수준을 갖는 세포주를 이용한 FACS 실험은 이러한 조사 결과를 확증하였다. 인간화 클론 A5H1EL1D의 친화성을 향상시키기 위해, 3가지 상이한 친화성 성숙 라이브러리가 만들어지고, 그리고 파지 전시에 의한 향상된 친화성을 갖는 클론의 선별에 이용되었다.
1.2.2.1 A5H1EL1D 친화성 성숙 라이브러리의 산출
친화성 성숙된 A5H1EL1D-유래된 항체의 산출은 표준 프로토콜을 이용하여 파지 전시에 의해 실행되었다 (Silacci et al, 2005). 제1 단계에서, 인간화 부모 클론 A5H1EL1D의 VH와 VL (아미노산 서열 서열 번호: 23 및 24)을 인코딩하는 DNA 서열이 파지미드 내로 클로닝되었고, 이것은 이후, 무작위화를 위한 주형으로서 이용되었다. 그 다음 단계에서, 3개의 라이브러리가 파지 전시에 의한 우호적인 클론의 선별을 위해 산출되었다. 성숙 라이브러리 1 및 2는 중쇄의 CDR1과 CDR2 또는 경쇄의 CDR1과 CDR2 중 어느 한 가지에서 무작위화되었다. 제3 성숙 라이브러리는 중쇄와 경쇄 둘 모두의 CDR3 영역에서 무작위화되었다. 개별 CDR 영역 내에 무작위화된 위치는 도 4a 및 4b에서 도시된다. 중쇄의 CDR1 및 2에서 무작위화된 성숙 라이브러리 1의 산출을 위해, 2개의 단편이 "중복 연장에 의한 스플라이싱" (SOE) PCR에 의해 조립되고 파지 벡터 내로 클로닝되었다 (도 5a). 하기 프라이머 조합이 라이브러리 단편을 산출하는 데 이용되었다: 단편 1 (LMB3 (서열 번호: 152, 표 7) 및 A5H1EL1D_H1_rev_TN (서열 번호: 150, 표 7), 그리고 단편 2 (A5H1EL1D_H2_for_TN (서열 번호: 151, 표 7) 및 HCDR3-rev-불변 (서열 번호: 153, 표 22) (표 7).
A5H1EL1D 친화성 성숙 라이브러리 H1 / H2에 대한 프라이머
명칭 서열 서열 번호:
A5H1EL1D_H1_rev_TN CAG CCA CTC GAG GCC TTT ACC CGG TGC TTG GCG TAC CCA X17 CAT X16 X15 X14 X13 GAA X12 GAA GCC AGA AGC CGC GCA GCT GAG ACG

X12: 60% T; 5% A/S/G/Y/N/D/E/Q
X13: 50% T; 20% S; 4.3% A/G/Y/N/D/E/Q
X14: 50% D; 20% S; 4.3% G/Y/T/N/A/E/Q
X15: 60% Y; 4% G/V/H/S/E/Q/N/D/R/F
X16: 50% Y; 20% A; 3.75% G/V/T/H/L/I/R/F
X17: 50% N; 20% S; 3% D/E/Q/G/Y/V/T/H/A/L		 150
A5H1EL1D_H2_for_TN CGC CAA GCA CCG GGT AAA GGC CTC GAG TGG CTG GGT X18 ATC X19 X20 X21 X22 X23 GCG TAC ACC ACG GAA TAC TCC GCC TCC

X18: 60% F; 10% A; 6 % Y/V/L/I/G
X19: 50% G; 20% S; 3% A/K/T/V/N/D/E/Q/L/I
X20: 50% N; 20% G; 3.75 % D/E/Q/S/Y/T/H/A
X21: 60% K; 5% A/T/Y/N/D/E/Q/R
X22: 60% A; 4% V/G/D/P/H/N/E/Q/L/I
X23: 60% N; 5% D/E/Q; 4.17% G/T/H/S/A/R		 151
LMB3 long CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 152
HCDR3-rev-불변 AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC GAA ATA GAA GCG CAG ACC AC 153
경쇄의 CDR1 및 2에서 무작위화된 성숙 라이브러리 2의 산출을 위해, 2개의 단편이 "중복 연장에 의한 스플라이싱" (SOE) PCR에 의해 조립되고 파지 벡터 내로 클로닝되었다 (도 5b). 하기 프라이머 조합이 라이브러리 단편을 산출하는 데 이용되었다: 단편 1 (LMB3 (서열 번호: 152, 표 8) 및 A5H1EL1D_L1_rev_TN (서열 번호: 154, 표 8), 그리고 단편 2 (A5H1EL1D_L2_for_TN (서열 번호: 155, 표 8) 및 HCDR3-rev-불변 (서열 번호: 153, 표 8).
A5H1EL1D 친화성 성숙 라이브러리 L1 / L2에 대한 프라이머
명칭 서열 서열 번호:
A5H1EL1D_L1_rev_TN GGA ACG CGG GGC CTG GCC TGG TTT TTG CTG ATA CCA X06 X05 X04 X03 X02 X01 GCT GGA TGC GCG GCA AGA CAG GGT AGC ACG

X01: 50% S; 20% V; 3.33% T/A/G/N/D/E/Q/Y/H
X02: 50% V; 20% S; 3.33% T/A/G/N/Q/F/Y/P/H
X03: 50% T; 20% S; 2.72% A/G/Y/V/P/H/N/D/E/Q/R
X04: 60% Y; 4% F/G/A/V/T/H/S/N/Q/R
X05: 70% I; 30% L
X06: 50% H; 20% A; 3.33% R/K/G/S/T/Q/Y/N/V		 154
A5H1EL1D_L2_for_TN CAG CAA AAA CCA GGC CAG GCC CCG CGT TCC TGG ATC X07 X08 X09 X10 X11 CTC GCT TCT GGT ATC CCG GCA CGT TTC TCC GGC

X07: 60% Y; 10% F; 7.5% H/K/N/S
X08: 50% A; 20% D; 3.33% V/G/S/T/Y/H/N/E/Q
X09: 50% T; 20% A; 3.33% S/G/V/P/H/N/D/E/Q
X10: 60% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q/Y/V/H
X11: 60% N; 4% D/E/Q/Y/K/T/H/S/A/R		 155
LMB3 long CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 152
HCDR3-rev-불변 AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC GAA ATA GAA GCG CAG ACC AC 153
경쇄와 중쇄의 CDR3에서 무작위화된 성숙 라이브러리 3의 산출을 위해, 2개의 단편이 "중복 연장에 의한 스플라이싱" (SOE) PCR에 의해 조립되고 파지 벡터 내로 클로닝되었다 (도 5c). 하기 프라이머 조합이 라이브러리 단편을 산출하는 데 이용되었다: 단편 1 (LMB3 (서열 번호: 152, 표 9) 및 LCDR3-rev-불변 (서열 번호: 158, 표 9), 그리고 단편 2 (A5H1EL1D_L3_for_TN (서열 번호: 156, 표 9) 및 A5H1EL1D_H3_rev_TN (서열 번호: 157, 표 9).
A5H1EL1D 친화성 성숙 라이브러리 L3 / H3에 대한 프라이머
명칭 서열 서열 번호:
A5H1EL1D_L3_for_TN GAG CCT GAA GAT TTT GCC GTA TAC TAT TGT X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 ACT TTC GGT CAG GGC ACC AAG CTG GAA ATC

X24: 90% Q; 10% H
X25: 60% H; 5% R/K/Q/E/Y/F/N/D
X26: 65% W; 7% F/Y/V/L/I
X27: 58% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q; 2% Y/V/P/H/L/I/R
X28: 58% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q; 2% Y/V/P/H/L/I/R
X29: 60% K; 5% R/H; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I
X30: 70% P; 5% A/S/T/R/S/L
X31: 60% P; 5% L/G/R/M; 2.86% A/V/L/I/F/S/R		 156
A5H1EL1D_H3_rev_TN AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC X40 X39 X38 X37 X36 X35 X34 X33 X32 AGT ACA GTA GTA GGT GGC GGT GTC TTC TGC

X32: 60% R; 10% K; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/H
X33: 60% D; 5% N/E/Q; 2.5% G/Y/V/T/H/S/A/L/I/R
X34: 60% R; 5% K/H; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I
X35: 60% G; 5% A/S/T; 2.5% Y/V/P/H/N/D/E/Q/L/I
X36: 60% L; 4% I/V/A/F; 2.4% G/Y/T/P/H/S/N/D/E/Q
X37: 60% R; 5% K/H; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I
X38: 65% F; 5% Y/W/A/V/L/I/G
X39: 60% Y; 5% F/W; 2.14% G/A/V/T/P/H/S/N/D/E/Q/L/I/R
X40: 80% F; 10% I/L		 157
LCDR3-rev-불변 ACA ATA GTA TAC GGC AAA ATC TTC AGG CTC 158
LMB3 long CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 152
HCDR3 증폭 AGA AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC 159
각 라이브러리의 단편의 조립을 위해, 동몰량의 각 단편이 이용되고 개별 외부 프라이머로 증폭되었다. HCDR3 및 LCDR3에서 무작위화된 제3 라이브러리의 단편의 조립을 위해, 프라이머 LMB3 (서열 번호: 148, 표 7)이 프라이머 "HCDR3 증폭" (서열 번호: 155, 표 9)과 병용되었다. 이러한 프라이머는 KpnI 부위를 내포하는 서열로, VH의 C 말단 단부를 연장하는 데 이용되었다. 모든 라이브러리에 대한 충분한 양의 전장 무작위화된 단편의 조립 후, 이들은 동일하게 처리된 수용자 파지미드 벡터를 끼고, NcoI/KpnI로 절단되었다. 3-배 몰 과잉의 라이브러리 삽입물이 20 μg의 파지미드 벡터로 결찰되었다. 정제된 결찰이 20회 형질전환에 이용되어, 약 0.7 x 109 내지 2 x 109 형질전환체가 산출되었다. A5H1EL1D 친화성 성숙 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자는 구조되고 PEG/NaCl 정제에 의해 정제되어, 선별에 이용되었다.
1.2.2.2 친화성 성숙된 A5H1EL1D-유래된 클론의 선별
친화성 성숙된 클론의 선별을 위해, 재조합 가용성 항원을 이용하여, 3가지 라이브러리 모두로 파지 전시 선별이 수행되었다. 하기의 패턴에 따라서 패닝 라운드가 용해 상태에서 수행되었다: 1. 0.5 시간 동안 200 nM 비오틴화된 NA(B2)A-avi-His 및 NABA-avi-his와 함께 배양에 의한 비특이적 파지미드 입자의 사전 정화, 2. 10 분 동안 5.4 x 107개 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드의 첨가에 의한, 비오틴화된 NA(B2)A-avi-His, NABA-avi-his 및 결합된 파지미드 입자의 포획, 3. 추가 선별을 위한 상층액으로부터 비-결합된 파지미드 입자의 단리, 4. 1 ml의 총 용적에서 0.5 시간 동안 20 nM 비오틴화된 N(A2B2)A-avi-His에 파지미드 입자의 결합, 5. 10 분 동안 5.4 x 107개 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드의 첨가에 의한, 비오틴화된 N(A2B2)A-avi-His 단백질 및 특이적으로 결합된 파지 입자의 포획, 6. 5 x 1 ml PBS/Tween20 및 5 x 1 ml PBS를 이용한 비드의 세척, 7. 10 분 동안 1 ml의 100 mM TEA의 첨가에 의한 파지 입자의 용리 및 500 μl 1M 트리스/HCl pH 7.4를 첨가함으로써 중화, 8. 지수적으로 성장하는 대장균 (E. coli) TG1 세균의 감염, 9. 보조파지 VCSM13으로 감염, 그리고 10. 차후 선별 라운드에서 이용되는, 파지미드 입자의 차후 PEG/NaCl 침전. 감소하는 항원 농도 (20 x 10-9 M, 10 x 10-9 M, 그리고 2 x 10-9 M)를 이용하여, 3 라운드에 걸쳐 선별이 실행되었다. 라운드 3에서, 스트렙타비딘 비드가 20 x 1ml PBS/Tween20 및 5 x 1ml PBS로 세척되었다.
특이적 결합체는 ELISA에 의해 하기와 같이 확인되었다: 웰당 100 μl의 10 nM 비오틴화된 N(A2B2)A-avi-His 단백질 또는 40 nM 비오틴화된 NA(B2)A-avi-His 단백질이 뉴트라비딘 평판 위에 코팅되었다. Fab-내포 세균 상층액이 첨가되었고, 그리고 결합 Fabs가 항-Flag/HRP 이차 항체를 이용하여 이들의 Flag-태그를 통해 검출되었다. 재조합 N(A2B2)A-avi-His 단백질에서는 ELISA-양성이지만 NA(B2)A-avi-His 단백질에서는 그렇지 않은 클론은 SPR에 의해 더욱 검사되었다.
1.2.2.3 SPR에 의한 친화성 성숙된 A5H1EL1D-유래된 변이체의 확인
ELISA-양성 클론을 더욱 특징화하기 위해, Proteon XPR36 기계를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 오프 레이트가 계측되었고, 그리고 결과가 부모 인간화 클론 A5H1EL1D와 비교되었다.
이러한 실험을 위해, 약 2000, 1000 및 500 RU의 비오틴화된 N(A2B2)A-avi-His가 스트렙타비딘-코팅된 NLC 칩을 이용하여 수직 방향으로 3개의 통로 위에 고정되었다. 비특이적 결합에 대한 대조로서, 2000 RU의 비오틴화된 NA(B2)A-avi-His 단백질이 통로 4 위에 고정되었다. 확인된 ELISA-양성 클론의 오프 레이트 분석을 위해, 주입 방향이 수평 방향으로 변경되었다. 주입 전, 각 Fab-내포 세균 상층액이 여과되고 PBS로 3-배 희석되었다. 연관 시간은 100 μl/분에서 100s이었고, 그리고 해리 시간은 600 또는 1200s 중 어느 한 가지이었다. Fab 단편이 없는 세균 상층액이 참조로서 이용되었다. 50 μl/분에서 35s 동안 10mM 글리신 pH 1.5로 재생이 수행되었다 (수직 방향).
ProteOn Manager v3.1 소프트웨어에서 센서그램을 동시에 적합시킴으로써, 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형을 이용하여 해리 속도 상수 (k오프)가 계산되었다. 가장 느린 해리 속도 상수를 갖는 Fabs를 발현하는 클론이 확인되고 최종 후보자 명단에 넣어졌다. 최종 후보자 명단에 넣어진 클론은 동일한 조건하에 추가 SPR 실험에서 재평가되었다. 이 시점에서, 각 주입 동안, 4개의 친화성 성숙된 클론이 부모 클론 A5H1EL1D와 병렬로 직접적으로 비교되었다. Fab 단편이 없는 세균 상층액이 참조로서 이용되었다. N(A2B2)A-avi-His 상에서 A5H1EL1D보다 느린 해리 속도 및 NA(B2)A-avi-His에 결합 없음을 보인 클론이 선택되었고, 그리고 상응하는 파지미드의 가변 도메인이 염기서열분석되었다. 최고 클론의 계측된 해리 속도는 표 10에서 도시되고, 그리고 개별 가변 도메인의 서열은 표 11에서 열거된다.
세균 상층액을 이용한 선별검사 분석에서 획득된, 선택된 클론의 동역학적 해리 상수 (k오프)
클론 해리 상수 kd (1/s)
A5H1EL1D 3.10E-04
P006.038 7.41E-05
P005.097 8.87E-05
P005.103 5.37E-05
P002.139 6.47E-05
P001.177 9.81E-05
P005.102 4.24E-05
부모 클론 A5H1EL1D 및 선택된 친화성 성숙된 클론의 아미노산 서열
클론 쇄 서열 번호 서열
A5H1EL1D VL 24 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
VH 23 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
P006.038 VL 32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
VH 31 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
P005.097 VL 34 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTKLEIK
VH 33 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVSS
P005.103 VL 36 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
VH 35 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVSS
P002.139 VL 38 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
VH 37 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
P001.177 VL 40 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
VH 39 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
P005.102 VL 42 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
VH 41 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
P005.102-콤보1 VL 44 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
VH 43 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
P005.102-콤보2 VL 46 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
VH 45 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
P005.103-콤보1 VL 48 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
VH 47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS
P005.103-콤보2 VL 50 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
VH 49 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS
P006.038-콤보1 VL 52 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
VH 51 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
P006.038-콤보2 VL 54 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
VH 53 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
1.2.2.4 친화성 성숙된 A5H1EL1D 클론의 Fab 정제
친화성 성숙된 클론을 더욱 특징화하기 위해, 개별 Fab 단편이 동역학적 파라미터의 정확한 분석을 위해 정제되었다. 각 클론에 대해, 500 ml 배양액이 상응하는 파지미드를 품는 세균으로 접종되고, 그리고 0.9의 600 nm (OD600)에서 계측된 흡광도에서 1mM IPTG로 유도되었다. 그 후에, 배양액이 25℃에서 하룻밤 동안 배양되고 원심분리에 의해 수확되었다. 25 ml PPB 완충액 (30 mM 트리스-HCl pH8, 1mM EDTA, 20% 수크로오스)에서 20 분 동안 재현탁된 펠렛의 배양 후, 세균이 다시 한 번 원심분리되었고, 그리고 상층액이 수확되었다. 이러한 배양 단계는 25 ml의 5 mM MgSO4 용액으로 1회 반복되었다. 양쪽 배양 단계의 상층액이 한 데 모아지고, 여과되고, IMAC 칼럼 (His gravitrap, GE Healthcare)서 부하되었다. 차후에, 상기 칼럼은 40 ml 세척 완충액 (500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 20 mM NaH2PO4 pH 7.4)으로 세척되었다. 용리 (500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, 20 mM NaH2PO4 pH 7.4) 후, 용출물은 PD10 칼럼 (GE Healthcare)을 이용하여 재완충되었다. 정제된 단백질의 수율은 300 내지 500 μg/l의 범위 안에 있었다.
1.2.2.5 정제된 친화성 성숙된 A5H1EL1D Fab 단편의 SPR 분석
전술된 바와 같은 동일한 셋업을 이용하여, Proteon XPR36 기계를 이용한 표면 플라스몬 공명에 의해, 정제된 Fab 단편의 친화성 (KD)이 계측되었다.
약 2000, 1000, 500 및 250 RU의 비오틴화된 N(A2B2)A-avi-His가 스트렙타비딘-코팅된 NLC 칩의 4개 통로 위에 수직 방향으로 고정되었다. 비특이적 결합에 대한 대조로서, 2000 RU의 비오틴화된 NA(B2)A-avi-His 단백질이 통로 5 위에 고정되었다. 정제된 클론의 친화성 (KD)의 결정을 위해, 주입 방향이 수평 방향으로 변경되었다. 정제된 Fab 단편 (변하는 농도는 100 및 3 nM 사이의 범위 안에 있다)의 2 배 연속 희석액이 100s의 연관 시간 및 1200s의 해리 시간에서, 별개의 통로 1-5를 따라서 100 μl/분으로 동시에 주입되었다. 참조를 위한 "인라인" 블랭크를 제공하기 위해, 완충액 (PBST)이 여섯 번째 통로를 따라서 주입되었다. 재생이 50 μl/분에서 35s 동안 10 mM 글리신 pH 1.5로 수행되었다 (수직 방향).
ProteOn Manager v3.1 소프트웨어에서 연관과 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써, 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형을 이용하여 연관 속도 상수 (k온) 및 해리 속도 상수 (k오프)가 계산되었다. 평형 해리 상수 (KD)가 비율 k오프/k온으로서 계산되었다. 동역학적 및 열역학적 데이터는 표 12에서 열거된다.
SPR에 의한 정제된 Fab -단편의 동역학적 및 열역학적 파라미터의 결정
클론 ID k 온 (1/Ms) k 오프 (1/s) KD (nM)
A5H1EL1D 1.08E+5 2.48E-4 2.3
P006.038 2.25E+5 5.78E-5 0.25
P005.097 0.94E+5 8.54E-5 0.91
P005.103 1.00E+5 4.99E-5 0.5
P002.139 1.05E+5 6.53E-5 0.63
P001.177 2.67E+5 7.85E-4 0.29
P005.102 1.34E+5 3.92E-4 0.29
1.2.2.6 친화성 성숙된 클론의 CDR 위치의 조합
CEA에 대한 친화성을 더욱 증가시키려는 시도에서, 여러 이전에 확인된 친화성 성숙된 결합체의 CDR 위치가 서로 조합되었다. 이것은 CDR 내에 특정한 위치뿐만 아니라 상이한 결합체로부터 CDRs의 조합을 포함한다. 모든 클론, 파지 전시-유래된 클론 및 조합 클론의 정렬은 도 6a 및 6b에서 도시된다. 모든 중쇄와 경쇄의 CDRs는 각각, 표 13 및 14에서 열거된다. VH와 VL 도메인은 표 11에서 요약된다.
친화성 성숙된 중쇄의 CDR 서열
클론 서열 번호 LCDR1 서열 번호 LCDR2 서열 번호 LCDR3
A5H1EL1D 20 GFTFTDYYMN 21 FIGNKANAYTTEYSASVKG 22 DRGLRFYFDY
P006.038 163 GFTFTDYYMN 164 FIGNKANAYTTEYSASVKG 165 DRG I RF G FDY
P005.097 169 GFTFTDYYMN 170 FIGNKANAYTTEYSASVKG 171 DRGLRF S FDY
P005.103 175 GFTFTDYYMN 176 FIGNKANAYTTEYSASVKG 177 DRG I RFYFDY
P002.139 181 GF Y FTDY A MN 182 V I S NKANAYTTEYSASVKG 183 DRGLRFYFDY
P001.177 187 GF Y FTDYYMN 188 FI S NKANAYTTEYSASVKG 189 DRGLRFYFDY
P005.102 193 GFTFTDYYMN 194 FIGNKANAYTTEYSASVKG 195 DRG I RF Q FDY
P005.102-콤보1 199 GF Y FTDYYMN 200 V I S NKANAYTTEYSASVKG 201 DRG I RF Q FDY
P005.102-콤보2 205 GF Y F S DYYMN 206 V I S NKANAYTTEYSASVKG 207 DRG I RF Q FDY
P005.103-콤보1 211 GFTFTDYYMN 212 FIGNKANAYTTEYSASVKG 213 DRG I RF S FDY
P005.103-콤보2 217 GF Y FTDYYMN 218 V I S NKANAYTTEYSASVKG 219 DRG I RF S FDY
P006.038-콤보1 223 GF Y FTDY A MN 224 V I S NKANAYTTEYSASVKG 225 DRG I RF G FDY
P006.038-콤보2 229 GFTF S DY E MN 230 FI S NKANAYTTEYSASVKG 231 DRG I RF G FDY
친화성 성숙된 경쇄의 CDR 서열
클론 서열 번호 LCDR1 서열 번호 LCDR2 서열 번호 LCDR3
A5H1EL1D 17 RASSSVTYIH 18 ATSNLAS 19 QHWSSKPPT
P006.038 160 RASSSVTYIH 161 ATSNLAS 162 QHWSS V PPT
P005.097 167 RASSSVTYIH 168 ATSNLAS 169 QHWSS Q PPT
P005.103 172 RASSSVTYIH 173 ATSNLAS 174 QHWSS IS PT
P002.139 178 H ASSSVTYIH 179 ATSNLAS 180 QHWSSKPPT
P001.177 184 RASSSVTYIH 185 ATSNLAS 186 QHWSSKPPT
P005.102 190 RASSSVTYIH 191 ATSNLAS 192 QHWSSK S PT
P005.102-콤보1 196 RASSSVTYIH 197 ATSNLAS 198 QHWSSK S PT
P005.102-콤보2 202 RASSSVTYIH 203 ATSNLAS 204 QHWSSK S PT
P005.103-콤보1 208 RASSSVTYIH 209 ATSNLAS 210 QHWSS IS PT
P005.103-콤보2 214 RASSSVTYIH 215 ATSNLAS 216 QHWSS IS PT
P006.038-콤보1 220 RASSSVTYIH 221 ATSNLAS 222 QHWSS V PPT
P006.038-콤보2 226 RASSSVTYIH 227 ATSNLAS 228 QHWSS V PPT
1.3 항-CEA 항체 MFE23의 인간화 변이체의 산출
1.3.1 방법론
항-CEA 항체 MFE23은 예를 들면 M. K. Boehm et al, Biochem. J. 2000, 346, 519-528에 의해 개시되고, 그리고 이의 구조는 단백질 구조 데이터베이스 PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman et al, The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242)에서 PDB ID:11QOK로서 발견될 수 있다. 이러한 엔트리는 중쇄와 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 항-CEA 결합체 MFE23의 인간화 동안 적합한 인간 수용자 프레임워크의 확인을 위해, 높은 서열 상동성을 갖는 수용자 프레임워크를 검색하고, CDRs을 이러한 프레임워크 위에 합체하고, 그리고 어떤 복귀돌연변이가 구상될 수 있는 지를 평가함으로써 고전적 접근법이 취해졌다. 더욱 명시적으로, 부모 항체와 대비하여 확인된 프레임워크의 각 아미노산 차이는 결합체의 구조적 완전성에 대한 영향에 대해 판단되었고, 그리고 적합할 때는 언제든지, 부모 서열을 향한 복귀돌연변이가 도입되었다. 구조적 사정은 Biovia Discovery Studio Environment, 버전 4.5를 이용하여 실행된 인하우스 항체 구조 상동성 모형화 도구로 창출된, 부모 항체 및 이의 인간화 이형 둘 모두의 Fv 영역 상동성 모형에 기초되었다.
복귀돌연변이의 선택에서 신뢰도를 증가시키기 위해, 우리는 이러한 항체가 유래할지도 모르는 가장 가까운 뮤린 상동성 서열을 확인하였다. 여기에서 우리는 뮤린 B-세포에서 이러한 항체의 성숙 동안 광범위한 체세포 초돌연변이를 겪은 위치를 찾았다. 인간화 작제물에 통합되는 이들 돌연변이는 잠재적으로 중요할 것이다.
1.3.2 수용자 프레임워크의 선택 및 이의 적합
수용자 프레임워크는 아래의 표 15에서 설명된 바와 같이 선택되었다:
수용자 프레임워크
가장 가까운 뮤린 V-영역 생식계열 인간 수용자 V-영역 생식계열의 선택
MFE23 VH m-IGHV14-4-02 IGHV1-2-02
MFE23 VL m-IGKV4-57-01 IGKV1-39-01
포스트-CDR3 프레임워크 영역은 중쇄의 경우 인간 J-요소 생식계열 IGHJ4-01, 그리고 경쇄의 경우 카파 J-요소 IGKJ4-01과 유사한 서열로부터 적합되었다. 구조적 고려 사항에 근거하여, 인간 수용자 프레임워크로부터 부모 결합체에서 아미노산으로의 복귀돌연변이가 중쇄의 Kabat 위치 71 및 93에서 도입되었다. 최종 성숙된 MFE23 서열을 야기하는, 뮤린 생식계열에서 프레임워크 돌연변이가 중요할 것이라는 고려 사항에 근거하여, VH의 Kabat 위치 94에서 잔기가 뮤린 서열로 다시 변화되었다.
MFE23 서열에서 추가 친화성 및/또는 안정성 향상을 평가하기 위해, 우리는 C.P. Graff et al., Protein Engineering, Design & Selection 2004, 17(4), 293-304에 의해 설명된 바와 같이, 하기 돌연변이: Phe26Leu, Ser30Pro, 또는 Tyr, Leu78Val을 경쇄 서열에 통합하였다.
1.3.3 결과의 인간화 CEA 항체의 VH와 VL 도메인
인간화 CEA 항체의 결과의 VH 도메인은 아래의 표 16에서 발견될 수 있고, 그리고 인간화 CEA 항체의 결과의 VL 도메인은 아래의 표 17에서 열거된다.
인간 수용자 프레임워크 IGHV1 -2-02에 기초된 , 인간화 CEA 항체의 VH 도메인의 아미노산 서열
설명 서열 서열 번호
MFE23 VH뮤린 공여자 서열 QVKLQQSGAELVRSGTSVKLSCTASGFNIKDSYMHWLRQGPEQGLEWIGW
IDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEGT
PTGPYYFDYWGQGTTVTVSS		 63
IGHV1-2-02
인간 수용자 서열		 QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIN
PNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
 232
IGHV1-69-01
인간 수용자 서열		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
 233
IGHV1-69-05
인간 수용자 서열		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
 234
인간화 변이체
MFE-H24
 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGW
IDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGT
PTGPYYFDYWGQGTLVTVSS		 75
MFE-H25
 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGW
IDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGT
PTGPYYFDYWGQGTLVTVSS		 76
MFE-H26
 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGW
IDPENGGTNYAQKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGT
PTGPYYFDYWGQGTLVTVSS		 77
MFE-H27
 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGW
IDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGT
PTGPYYFDYWGQGTLVTVSS		 78
MFE-H28
 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGW
IDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGT
PTGPYYFDYWGQGTLVTVSS		 79
MFE-H29
 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGW
IDPENGDTEYAPKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGT
PTGPYYFDYWGQGTLVTVSS		 80
인간 수용자 프레임워크 IGKV1 -39-01에 기초된 , 인간화 CEA 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열
설명 서열 서열 번호
MFE23 VL뮤린 공여자 서열 ENVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYST
SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAG
TKLELK		 64
IGKV1-39-01
인간 수용자 서열		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
 235
인간화 변이체
MFE-L24
 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYST
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGG
TKLEIK		 81
MFE-L25
 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYST
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGG
TKLEIK		 82
MFE-L26
 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYMHWYQQKPGKAPKLLIYS
TSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGG
GTKLEIK		 83
MFE-L27
 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYST
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGG
TKLEIK		 84
MFE-L28
 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYST
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGG
TKLEIK		 85
MFE-L29
 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYST
SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGG
TKLEIK		 86
도 7은 각각, 표 16 및 17에서 열거된 바와 같은 서열의 정렬을 보여준다.
인간화 CEA 결합체를 인코딩하는, 6개 중쇄 및 6개 경쇄 DNA 서열의 가변 영역은 Fcγ 수용체에 결합을 제거하기 위해, P239G, L234A 및 L235A 돌연변이를 내포하는 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 중 어느 한 가지와 인프레임으로 하위클로닝되었다 (WO 2012/130831 A1). 항체는 아래에 설명된 바와 같이 생산되었다. 결과의 36개 변이체 (표 18)가 MKN45 세포에 결합에 대해 검사되었고; 그리고 7개 변이체가 추가 개발을 위해 선택되었다.
huIgG1 _ LALA _ PG 항체로서 발현된 VH / VL 조합에 대한 명명법
MFE-L24 MFE-L25 MFE-L26 MFE-L27 MFE-L28 MFE-L29
MFE-H24 P1AE3125 P1AE3119 P1AE3113 P1AE3107 P1AE3101 P1AE3095
MFE-H25 P1AE3124 P1AE3118 P1AE3112 P1AE3106 P1AE3100 P1AE3094
MFE-H26 P1AE3123 P1AE3117 P1AE3111 P1AE3105 P1AE3099 P1AE3093
MFE-H27 P1AE3122 P1AE3116 P1AE3110 P1AE3104 P1AE3098 P1AE3092
MFE-H28 P1AE3121 P1AE3115 P1AE3109 P1AE3103 P1AE3097 P1AE3091
MFE-H29 P1AE3120 P1AE3114 P1AE3108 P1AE3102 P1AE3096 P1AE3090
1.3.4 인간화 MFE23 항체의 선택
MKN45 세포 상에서 발현된 CEA에 대한 36개의 인간화 MFE23 huIgG1 P329G LALA 변이체의 결합이 개별 부모 뮤린 MFE23 huIgG1 P329G LALA 항체와 비교되었다. 17개의 클론이 인간 CEACAM5 발현 MKN45 세포에 대한 그들의 결합 능력을 상실하였다 (도 8a). 8개의 클론이 부모 클론 MFE23과 비교하면 감소된 결합을 보여주었다 (도 8b). 11개의 클론이 부모 클론 MFE23과 비교하면 유사한 결합을 보여주었다 (도 8c). 이들 결합 곡선의 적합 EC50 값 및 곡선 아래 면적 값 (AUC)은 표 19에서 나타내진다.
도 8a, 8b 및 8c에서 나타내진 상이한 인간화 MFE23 huIgG1 P329G LALA 항체의 결합 곡선의 EC 50 값 및 곡선 아래 면적 (AUC)
MKN45에 결합 EC 50 [nM] AUC
P1AD5108-002 DP47 huIgG1 PG LALA (아이소타입 대조) 결정되지 않음 420
P1AE0096-001 MFE23 huIgG1 PG LALA (부모) 9.36 83489
P1AE3104 결정되지 않음 414
P1AE3122 결정되지 않음 422
P1AE3116 결정되지 않음 443
P1AE3092 결정되지 않음 482
P1AE3110 결정되지 않음 547
P1AE3112 결정되지 않음 551
P1AE3118 결정되지 않음 559
P1AE3111 결정되지 않음 578
P1AE3109 결정되지 않음 695
P1AE3113 결정되지 않음 757
P1AE3124 결정되지 않음 847
P1AE3123 결정되지 않음 1090
P1AE3106 결정되지 않음 1126
P1AE3117 결정되지 않음 1181
P1AE3098 결정되지 않음 1191
P1AE3108 결정되지 않음 2086
P1AE3125 결정되지 않음 3145
P1AE3094 47.57 6908
P1AE3115 20.68 10177
P1AE3119 41.90 10327
P1AE3114 30.60 12769
P1AE3121 17.13 17464
P1AE3120 12.37 24181
P1AE3105 7.92 55868
P1AE3090 42.00 61809
P1AE3093 16.14 68082
P1AE3100 9.89 74137
P1AE3091 14.60 83061
P1AE3095 11.12 84917
P1AE3096 10.46 87775
P1AE3107 5.83 91203
P1AE3102 5.41 91481
P1AE3103 5.88 92448
P1AE3099 10.21 95311
P1AE3097 6.45 98656
P1AE3101 6.58 103966
실시예 2
CEA-표적화 4-1BB 효현성 항원 결합 분자의 산출과 생산
2.1 CEA-표적화 4-1BB 리간드 삼합체-내포 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
노브-인투 홀 돌연변이를 갖는 비대칭적 인간 IgG1 분자가 아래와 같이 제조되었다: CEA에 대해 특이적인 결합체를 인코딩하는 중쇄와 경쇄 DNA 서열의 가변 영역이 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄 중 어느 한 가지와 인프레임으로 하위클로닝되었다. 인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인 (아미노산 71-248)의 일부를 인코딩하는 DNA 서열이 Uniprot 데이터베이스의 P41273 서열에 따라서 합성되었다.
(G4S)2 링커에 의해 분리되고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된, 4-1BB 리간드의 2개의 엑토도메인을 내포하는 폴리펩티드가 도 1a에서 묘사된 바와 같이 클로닝되었다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 결합기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 결합기, 인간 CL. 4-1BB 리간드의 하나의 엑토도메인을 내포하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드가 도 1b에서 설명된 바와 같이 클로닝되었다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 결합기, 인간 CH.
정확한 대합을 향상시키기 위해, 교차된 CH-CL에 하기 돌연변이가 도입되었다. 인간 CL에 융합된 이합체성 4-1BB 리간드에서 돌연변이 E123R 및 Q124K가 도입되었다. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에서, 돌연변이 K147E 및 K213E가 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/150447에서 설명된 바와 같이 인간 CH1 도메인 내로 클로닝되었다.
국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/130831에서 기술된 방법에 따라서 Fc 감마 수용체에 결합을 제거하기 위해, Fc 도메인에서 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이가 노브와 홀 중쇄의 불변 영역에 도입되었다. S354C/T366W 돌연변이를 내포하는 이합체성 리간드-Fc 노브 쇄, 단량체성 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 내포하는 표적화된 항-CEA-Fc 홀 쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은 조립된 삼합체성 4-1BB 리간드 및 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이합체의 산출을 가능하게 하였다 (도 1c).
표 20 및 21은 CEA 결합체 A5B7 및 이의 인간화 이형에 기초된, CH1-CL 교차 및 하전된 잔기를 내포하는 일가 CEA-표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc (kih) 융합 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 보여준다.
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( 뮤린 A5B7 ) 표적화된 분할 삼 합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( A5B7 )-4- 1BBL )의 아미노산 서열(*는 하전된 잔기를 의미한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
100 단량체성 4-1BBL -CH1* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
236 항- CEA(A5B7) Fc 홀 쇄 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
237 항-CEA(A5B7) 경쇄 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( A5H1EL1D ) 표적화된 분할 삼합 체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(A5H1EL1D)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
238 항- CEA(A5H1EL1D)-Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
239 항-CEA(A5H1EL1D) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
표 22 내지 33은 CEA 결합체 A5H1EL1D의 친화성 성숙된 변이체에 기초된, CH1-CL 교차 및 하전된 잔기를 내포하는 일가 CEA-표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc (kih) 융합 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 보여준다.
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P006.038) 표적화된 분할 삼합 체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P006.038)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
240 항- CEA(P006.038) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
241 항-CEA(P006.038) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.097) 표적화된 분할 삼합 체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.097)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
242 항- CEA(P005.097) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
243 항-CEA(P005.097) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.103) 표적화된 분할 삼합 체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.103)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
244 항- CEA(P005.103) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
245 항-CEA(P005.103) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P002.139) 표적화된 분할 삼합 체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P002.139)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
246 항- CEA(P002.139) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
247 항-CEA(P002.139) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P001.177) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA (P001.177)-4- 1BBL )의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
248 항- CEA(P001.177) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
249 항-CEA(P001.177) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.102) 표적화된 분할 삼합 체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.102)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
250 항- CEA(P005.102) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
251 항-CEA(P005.102) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.103- 콤보1 ) 표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.103-콤보1)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
252 항- CEA(P005.103-콤보1) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
253 항-CEA(P005.103-콤보1) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.103- 콤보2 ) 표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.103-콤보2)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
254 항- CEA(P005.103-콤보2) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
255 항-CEA(P005.103-콤보2) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.102- 콤보1 ) 표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.102-콤보1)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
256 항- CEA(P005.102-콤보1) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
257 항-CEA(P005.102-콤보1) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P005.102- 콤보2 ) 표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P005.102-콤보2)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
258 항- CEA(P005.102-콤보2) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
259 항-CEA(P005.102-콤보2) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P006.038- 콤보1 ) 표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P006.038-콤보1)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
260 항- CEA(P006.038-콤보1) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
261 항-CEA(P006.038-콤보1) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA (P006.038- 콤보2 ) 표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(P006.038.콤보2)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
262 항- CEA(P006.038-콤보2) Fc 홀 쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
263 항-CEA(P006.038-콤보2) 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
표 34는 CEA 결합체 MFE23에 기초된, CH1-CL 교차 및 하전된 잔기를 내포하는 일가 CEA-표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc (kih) 융합 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 보여주고, 그리고 표 35 내지 41은 인간화 이형에 기초된 일가 CEA-표적화된 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc (kih) 융합 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 보여준다.
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( MFE23 ) 표적화된 분할 삼합체 성 4-1BB 리간드 항원 결합 분자 (CEA(MFE23)-4-1BBL)의 아미노산 서열
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
264 항- CEA(MFE23) Fc 홀 쇄 QVKLQQSGAELVRSGTSVKLSCTASGFNIKDSYMHWLRQGPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
265 항-CEA(MFE23) 경쇄 ENVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L28-H24) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L28-H24)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L28-H24는 P1AE3101에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
266 항- CEA(huMFE23-L28-H24) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
267 항-CEA(huMFE23-L28-H24) 경쇄 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L28-H28) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L28-H28)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L28-H28은 P1AE3097에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
268 항- CEA(huMFE23-L28-H28) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
267 항-CEA(huMFE23-L28-H28) 경쇄 표 35 참조
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L28-H25) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L28-H25)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L28-H25는 P1AE3100에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
269 항- CEA(huMFE23-L28-H25) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
267 항-CEA(huMFE23-L28-H25) 경쇄 표 35 참조
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L27-H29) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L27-H29)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L27-H29는 P1AE3102에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
270 항- CEA(huMFE23-L27-H29) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
271 항-CEA(huMFE23-L27-H29) 경쇄 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L27-H28) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L27-H28)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L27-H28은 P1AE3103에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
272 항- CEA(huMFE23-L27-H28) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
271 항-CEA(huMFE23-L27-H28) 경쇄 표 38 참조
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L27-H26) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L27-H26)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L27-H26은 P1AE3105에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
273 항- CEA(huMFE23-L27-H26) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGGTNYAQKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
271 항-CEA(huMFE23-L27-H26) 경쇄 표 38 참조
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 일가 CEA ( huMFE23 -L27-H24) 표적화된 분할 삼합체성 4- 1BB 리간드 항원 결합 분자 ( CEA ( MFE23 -L27-H24)-4- 1BBL )의 아미노산 서열(CEA 결합체 huMFE23-L27-H24는 P1AE3107에서 이용된 클론에 상응한다)
서열 번호: 설명 서열
99 이합체성 4-1BBL - CL* Fc 노브 쇄 표 20 참조
100 단량체성 4-1BBL -CH1* 표 20 참조
274 항- CEA(huMFE23-L27-H24) Fc 홀 쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
271 항-CEA(huMFE23-L27-H24) 경쇄 표 38 참조
이들 이중특이적 작제물은 포유류 세포를 1:1:1:1에서 상응하는 발현 벡터 ("벡터 4-1BBL Fc-노브 쇄": "벡터 4-1BBL 경쇄": "벡터 Fc-홀 쇄 ": "벡터 경쇄")로 형질감염시킴으로써 생산되었다.
HEK293 EBNA 또는 CHO EBNA 세포에서 IgG-유사 단백질의 생산
항체 및 이중특이적 항체가 HEK293 EBNA 세포 또는 CHO EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 산출되었다. 세포가 원심분리되었고, 그리고 배지가 미리 가온된 CD CHO 배지 (Thermo Fisher, 카탈로그 번호 10743029)에 의해 대체되었다. 발현 벡터가 CD CHO 배지에 혼합되었고, PEI (폴리에틸렌이민, Polysciences, Inc, 카탈로그 번호 23966-1)가 첨가되었고, 용액이 와동되고 실온에서 10 분 동안 배양되었다. 그 후에, 세포 (2 Mio/ml)가 벡터/PEI 용액과 혼합되고, 플라스크로 이전되고, 그리고 5% CO2 공기를 갖는 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 3 시간 동안 배양되었다. 배양 후, 보충물 (총 용적의 80%)을 포함하는 Excell 배지가 첨가되었다 (W. Zhou and A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642-54050-9; 2014). 형질감염 후 1일에, 보충물 (피드, 총 용적의 12%)이 첨가되었다. 세포 상층액이 7일 후 원심분리 및 차후 여과 (0.2 μm 필터)에 의해 수확되었고, 그리고 단백질이 아래에 지시된 바와 같은 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
CHO K1 세포에서 IgG-유사 단백질의 생산
대안으로, 본원에서 설명된 항체 및 이중특이적 항체는 Evitria에 의해, 전통적인 (비-PCR 기초된) 클로닝 기술과 함께 그들의 독점적인 벡터 시스템을 이용하여, 그리고 현탁-적응된 CHO K1 세포 (본래 ATCC로부터 수령되고 Evitria에서 현탁 배양 동안 혈청 없는 성장에 적응됨)를 이용하여 제조되었다. 생산을 위해, Evitria는 자사의 독점적인, 동물-성분 없고 혈청 없는 배지 (eviGrow 및 eviMake2) 및 자사의 독점적인 형질감염 시약 (eviFect)을 이용하였다. 상층액이 원심분리 및 차후 여과 (0.2 μm 필터)에 의해 수확되었고, 그리고 단백질이 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
IgG-유사 단백질의 정제
단백질은 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, Fc 내포 단백질이 단백질 A-친화성 크로마토그래피 (평형화 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, pH 3.0)에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. pH 3.0에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 표본의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 단백질이 원심분리 (Millipore Amicon® ULTRA-15 (Art.Nr.: UFC903096)에 의해 농축되었고, 그리고 응집된 단백질이 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 단백질로부터 분리되었다.
IgG-유사 단백질의 분석
정제된 단백질의 농도는 Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡수를 계측함으로써 결정되었다. 단백질의 순도 및 분자량은 LabChipGXII (Perkin Elmer)를 이용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다. 응집체 함량의 결정은 작업 완충액 (각각, 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노수화염화물, pH 6.7 또는 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl, pH 6.2)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼 (TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 이용하여 25 ℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
예시적인 CEA - 표적화된 4- 1BB 리간드 삼합체 -내포 Fc ( kih ) 융합 항원 결합 분자의 생화학적 분석
분자 단량체 [%] (SEC) 수율 [mg/l] CE-SDS (비환원)
CEA(A5H1EL1D)-4-1-BBL 100 2.6 84
CEA(A5B7)-4-1BBL 92 1.5 92
CEA(MFE23)-4-1BBL 96 24 93
CEA(MFE23-L28-H24)-4-1BBL 92 13 97
CEA(MFE23-L28-H28)-4-1BBL 93 14 98
CEA(P001.177)-4-1BBL 91 4.8 99
CEA(P005.102)-4-1BBL 94 5.8 99
2.2 표면 플라스몬 공명에 의한, CEA-표적화 4-1BB 리간드 삼합체-내포 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능적 특징화
NABA 작제물의 형태에서, 인간 4-1BB Fc(kih) 및 인간 CEA에 동시에 결합하는 능력이 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 사정되었다. 모든 SPR 실험은 25 ℃에서 HBS-EP를 작업 완충액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, Biacore, Freiburg/Germany)으로서 이용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 인간 N(A2B2)A 단백질이 아민 연계에 의해 CM5 칩의 흐름 셀에 직접적으로 연계되었다. 대략 600 RU의 고정 수준이 이용되었다.
CEA 표적화 삼합체성 분할 4-1BBL 작제물이 90 또는 240 초에 걸쳐 흐름 셀을 통한 30 μL/분의 유동으로 200 또는 500 nM의 농도 범위에서 통과되었고, 그리고 해리가 제로 초에 세팅되었다. 인간 4-1BB Fc(kih)가 500 nM의 농도에서 90 또는 200 초에 걸쳐 흐름 셀을 통한 30 μL/분의 유동으로 제2 피분석물로서 주입되었다 (도 9a). 해리가 120 또는 600 초 동안 모니터링되었다. 어떤 단백질도 고정되지 않은 참조 흐름 셀에서 획득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이가 교정되었다.
도 9b 내지 9h에서 목격될 수 있는 바와 같이, CEA 표적화-4-1BBL 분자는 인간 CEA (N(A2B2)A 또는 hu(NA1)BA 작제물의 형태에서) 및 인간 4-1BB에 동시에 결합할 수 있다.
실시예 3
CEA-표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능적 특징화
3.1 CEACAM5 발현 세포에 결합 검정
먼저, 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 또는 인간 CEACAM5를 발현하는 세포주가 산출되었다. 인간 및 시노몰구스 CEACAM5를 인코딩하는 전장 cDNAs가 포유류 발현 벡터 내로 하위클로닝되었다. 이들 플라스미드는 제조업체의 프로토콜에 따라서 리포펙타민 LTX 시약 (Invitrogen, #15338100)을 이용하여 CHO-K1 (ATCC CRL-9618) 세포 내로 형질감염되었다. 안정되게 형질감염된 CEACAM5-양성 CHO 세포는 10% 소 태아 혈청 (FBS, Life Technologies에 의한 GIBCO, 카탈로그 번호 16000-044, 로트 941273, 감마 조사된 미코플라스마 없음, 열 비활성화) 및 2 mM L-알라닐-L-글루타민 디펩티드 (Gluta-MAX-I, Life Technologies에 의한 GIBCO, 카탈로그 번호 35050-038)로 보충된 DMEM/F-12 배지 (Lifetechnologies에 의한 GIBCO, #11320033)에서 유지되었다. 형질감염 후 2일에, 푸로마이신 (Invivogen; #ant-pr-1)이 6 μg/mL로 첨가되었고, 그리고 세포가 여러 계대 동안 배양되었다. 초기 선택 후, 인간 및 시노몰구스 CEACAM5 (검출 항체 항-CD66 클론 CD66AB.1.1)의 높은 세포 표면 발현을 갖는 세포가 BD FACSAria II 세포 분류기 (BD Biosciences)에 의해 분류되고, 그리고 안정된 세포 클론을 확립하기 위해 배양되었다. 발현 수준 및 안정성이 4 주의 기간에 걸쳐 유세포 분석에 의해 확증되었다 (도 10 참조).
결합 검정을 위해, CHO-k1-cynoCEACAM5 클론 8, CHO-k1-huCEACAM5 클론 11, CHO-k1-huCEACAM5 클론 12, CHO-k1-huCEACAM5 클론 13 또는 CHO-k1-huCEACAM5 클론 17이 수확되고, DPBS (life technologies에 의한 GIBCO, #14190-136)로 세척되고, 고정가능 생존력 염료 eF450 (eBioscience #65-0863-18)을 내포하는 DPBS에서 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다. 세포가 세척되고 384 웰 평판 (Corning #3830)에 3 x 104개 세포/웰로 파종되었다. 세포가 원심분리되었고 (350xg, 5 분), 상층액이 제거되었고, 그리고 세포가 적정된 농도의 CEA-4-1BBL 항체 또는 대조 (시작 농도 300 nM)를 내포하는 10 μL/웰 FACS-완충액 (2% FBS, 5 nM EDTA, 7.5 mM 아지드화나트륨이 공급된 DPBS)에서 재현탁되었다. 세포가 4 ℃에서 30 분 동안 배양되고, 그리고 이후 80 μL/웰 DPBS로 2회 세척되었다. 세포가 2.5 μg/mL PE 접합된 AffiniPure 항인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab`)2 단편 (Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호 109-116-098)을 내포하는 10 μL/웰 FACS-완충액에서 4 ℃에서 30 분 동안 재현탁되었다. 세포가 80 μL/웰 DPBS로 2회 세척되고, 그리고 이후 1 % 포름알데히드를 내포하는 30 μL/웰 DPBS에서 적어도 15 분 동안 고정되었다. 같은 날 또는 다음 날에 세포가 50 μL/웰 FACS-완충액에서 재현탁되고 MACSQuant 분석기 X (Miltenyi Biotec)를 이용하여 획득되었다.
도 11a-11e 및 도 12a-12e 및 도 13a-13c에서 도시된 바와 같이, CEA-4-1BBL 항체는 인간 CEACAM5-발현 CHO-k1 클론 11, 12, 13 및 17에 효율적으로 결합한다. 대조적으로 단지 CEA(A5B7)-4-1BBL, CEA (MEDI-565)-4-1BBL 및 CEA (A5H1EL1D)-4-1BBL뿐만 아니라 CEA (친화성 성숙된 A5H1EL1D P001.117)-4-1BBL 및 CEA (친화성 성숙된 A5H1EL1D P005.102)-4-1BBL만 시노몰구스 원숭이 CEACAM5 발현 CHO-k1-cynoCEACAM5 클론 8 세포주에도 결합하였다 (도 11a 및 도 12a 및 도 13a). 이런 이유로, MFE23, huMFE23-L28-H24, huMFE23-L28-H28, T84.66-LCHA는 교차반응성이 아니고, 반면 A5B7, MEDI565, A5H1EL1D 및 클론 P001.117 또는 P005.102에 기초된 친화성 성숙된 A5H1EL1D는 시노몰구스 원숭이/인간 교차반응성이다. 하지만, A5H1EL1D 및 클론 P001.117에 기초된 A5H1EL1D는 부모 클론 A5B7보다 적은 cyno 교차반응성을 보여준다.
적합 EC50 값 및 곡선 아래 면적의 값은 표 43, 표 44, 표 45 및 표 46에서 열거된다.
도 11a-11e 및 도 12a-12e에서 나타내진 상이한 인간화 CEA -4- 1BBL 분자의 결합 곡선의 EC 50 값
EC50 [nM] CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 13 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 17
CEA (T84.66-LCHA)-4-1BBL cynoCECAM5에 결합하지 않는다 2.23 2.13 2.6 1.44
CEA (A5B7)-4-1BBL 31.4 10.03 10.98 15.17 7.38
CEA (MEDI-565)-4-1BBL 8.82 1.75 2.18 6.39 1.84
CEA (A5H1EL1D)-4-1BBL 안정 상태가 아닌 것으로 결정되지 않음 296 691 안정 상태가 아닌 것으로 결정되지 않음 190
CEA (MFE23)-4-1BBL cynoCECAM5에 결합하지 않는다 0.54 2.25 5.17 0.6
CEA(huMFE23-L28-H24)-4-1BBL 1.93 4.83 6.2 1.93
CEA(huMFE23-L28-H28)-4-1BBL 2.98 8.32 15.44 3.26
DP47-4-1BBL 결정되지 않음 결정되지 않음 결정되지 않음 결정되지 않음 결정되지 않음
도 11a-11e 및 도 12a-12e에서 나타내진 상이한 인간화 CEA -4- 1BBL 분자의 결합 곡선의 곡선 아래 면적 (AUC)
AUC CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 13 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 17
CEA (T84.66-LCHA)-4-1BBL 322 18769 71116 102929 22327
CEA (A5B7)-4-1BBL 15610 15032 55691 98387 16251
CEA (MEDI-565)-4-1BBL 20630 14283 49726 82088 15254
(A5H1EL1D)-4-1BBL 6192 8764 30539 48463 9084
CEA (MFE23)-4-1BBL 430 33204 109307 168076 36340
CEA(huMFE23-L28-H24)-4-1BBL 275 24142 74663 100563 26002
CEA(huMFE23-L28-H28)-4-1BBL 270 21714 65889 78487 23077
DP47-4-1BBL 520 1297 700 752 430
도 13a-13c에서 나타내진 상이한 인간화 CEA -4- 1BBL 분자의 결합 곡선의 EC 50 값
EC50 [nM] CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12
CEA (T84.66-LCHA)-4-1BBL 결정되지 않음 6.93 10.02
CEA (A5B7)-4-1BBL 41.9 31.09 21.69
CEA (MEDI-565)-4-1BBL 9.43 6.68 10.88
CEA (A5H1EL1D)-4-1BBL 안정 상태가 아닌 것으로 결정되지 않음 61.68 148.1
CEA(P001.177)-4-1BBL 안정 상태가 아닌 것으로 결정되지 않음 33.67 43.96
CEA(P005.102)-4-1BBL 79.52 40.91 43.39
DP47-4-1BBL 결정되지 않음 결정되지 않음 결정되지 않음
도 13a-13c에서 나타내진 상이한 인간화 CEA -4- 1BBL 분자의 결합 곡선의 곡선 아래 면적 (AUC)
AUC CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12
CEA (T84.66-LCHA)-4-1BBL 5 3984 13576
CEA (A5B7)-4-1BBL 2140 3008 7903
CEA (MEDI-565)-4-1BBL 3903 2851 8310
CEA (A5H1EL1D)-4-1BBL 368 1532 4421
CEA(P001.177)-4-1BBL 164 3630 8348
CEA(P005.102)-4-1BBL 2767 3181 8992
DP47-4-1BBL 11 148 140
3.2 인간 4-1BB 및 NFκB-루시페라아제 리포터 유전자 발현 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2에서 NFκB 활성화
리간드 (4-1BBL)에 4-1BB (CD137) 수용체의 효현성 결합은 핵인자 카파 B (NFκB)의 활성화를 통해 4-1BB-하류 신호전달을 유도하고 CD8 T 세포의 생존과 활성을 증진한다 (Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS, J Immunol 2002; 169, 4882-4888). CEA-4-1BBL 항원 결합 분자에 의해 매개된 이러한 NFκB-활성화를 모니터링하기 위해, Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포주가 Promega (Germany)로부터 구입되었다. 이들 세포는 전술된 바와 같이 배양되었다. 검정을 위해, 세포가 수확되고, 그리고 10 % (v/v) FBS 및 1 % (v/v) GlutaMAX-I가 공급된 검정 배지 RPMI 1640 배지에서 재현탁되었다. 10 μL 내포 2 x 103개 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포가 뚜껑이 달린 무균 흰색 384-웰 편평 바닥 조직 배양 평판 (Corning, 카탈로그 번호:3826)의 각 웰로 이전되었다. 적정된 농도의 CEA-4-1BBL 항체 또는 대조 분자를 내포하는 10 μL의 검정 배지가 첨가되었다. 최종적으로, 단독으로, 또는 시노몰구스 원숭이 또는 인간 CEACAM5로 형질감염된 1 x 104개 세포의 상이한 CHO-k1 세포를 내포하는 10 μL의 검정 배지가 공급되었고, 그리고 평판이 세포 배양기 내에 37 ℃ 및 5 % CO2에서 6 시간 동안 배양되었다. 6 μl 새로 해동된 One-Glo 루시페라아제 검정 검출 용액 (Promega, 카탈로그 번호: E6110)이 각 웰에 첨가되었고, 그리고 발광 광 방출이 Tecan 마이크로평판 판독기 (500 ms 통합 시간, 모든 파장을 수집하는 필터 없음)를 이용하여 즉시 계측되었다.
도 14a-14d 및 도 15a-15d에서 도시된 바와 같이, CEACAM5 발현 세포의 부재에서 이들 분자 중 어느 것도 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포주에서 강한 인간 4-1BB 수용체 활성화를 유도하여, NFκB-활성화 및 이런 이유로 루시페라아제 발현을 야기할 수 없었다. CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 및 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12와 같은 인간 CEACAM5-발현 세포의 존재에서 CEA-4-1BBL 항체의 교차연결은 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포주에서 NFκB-활성화 루시페라아제 활성의 강한 증가를 야기하였는데, 이것은 표적화되지 않은 대조 DP47-4-1BBL에 의해 매개된 활성화를 초과하였다. CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8의 존재에서 활성화 유도는 이용된 CEACAM5-결합 클론에 의존한다. 클론 MFE23 (부모) 또는 인간화 MFE23 클론 huMFE23-L28-H24 또는 huMFE23-L28-H28 또는 인간화 MFE23 클론 sm9b (US 2005/0147614에서 개시됨) 또는 참조 클론 T84.66-LCHA를 내포하는 CEA-4-1BBL 항체는 시노몰구스 원숭이 CEACAM5에 결합하지 않고, 그리고 이런 이유로 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포 활성화를 유도하지 않는다 (도 14b). 다른 한편으로, 시노몰구스 원숭이/인간-교차반응성 클론 A5B7 (부모), 인간화 A5B7 클론 MEDI-565 또는 A5H1EL1D, 또는 클론 P005-102 또는 P001-177에 기초된 친화성 성숙된 A5H1EL1D를 내포하는 CEA-4-1BBL 항체는 CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8의 존재에서도 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포 활성화를 유도한다 (도 15b).
활성화 곡선의 EC50 값 및 곡선 아래 면적 (AUC)은 각각, 표 47 및 표 48에서 열거된다.
도 14a-14d 및 도 15a-15d에서 나타내진 상이한 인간화 CEA -4- 1BBL 분자의 활성화 곡선의 의 EC 50 값
EC50 [nM] CEA+ 세포 없음 평판 1 CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8 평판 1 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 평판 1 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12
DP47-4-1BBL 결정되지 않음 결정되지 않음 결정되지 않음
CEA (MFE23)-4-1BBL 결정되지 않음 0.08 0.05
CEA(huMFE23-L28-H24)-4-1BBL 결정되지 않음 cyno-교차반응성 아님 0.06 0.04
CEA(huMFE23-L28-H28)-4-1BBL 결정되지 않음 0.10 0.07
CEA(sm9b)-4-1BBL 결정되지 않음 0.05 0.03
CEA(sm9b)-4-1BBL 단일 쇄 결정되지 않음 0.09 0.07
CEA (A5B7)-4-1BBL 결정되지 않음 0.17 0.12 0.08
CEA (MEDI-565)-4-1BBL 결정되지 않음 0.20 0.11 0.06
CEA (A5H1EL1D)-4-1BBL 결정되지 않음 0.53 0.16 0.09
CEA(P001.177)-4-1BBL 결정되지 않음 0.13 0.05 0.03
CEA(P005.102)-4-1BBL 결정되지 않음 0.12 0.10 0.08
CEA (T84.66-LCHA)-4-1BBL 결정되지 않음 cyno-교차반응성 아님 0.12 0.04
도 14a-14d 및 도 15a-15d에서 나타내진 상이한 인간화 CEA -4- 1BBL 분자의 활성화 곡선의 곡선 아래 면적 (AUC)
AUC CEA+ 세포 없음 평판 1 CHO-k1-cyno CEACAM5 클론 8 평판 1 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 11 평판 1 CHO-k1-인간 CEACAM5 클론 12
DP47-4-1BBL 2929 4713 8636 6635
CEA (MFE23)-4-1BBL 2664 3940 183090 175535
CEA(huMFE23-L28-H24)-4-1BBL 2561 3600 161174 162747
CEA(huMFE23-L28-H28)-4-1BBL 2528 3418 147450 145894
CEA(sm9b)-4-1BBL 2811 3968 162068 164198
CEA(sm9b)-4-1BBL 단일 쇄 1976 2815 150488 145930
CEA (A5B7)-4-1BBL 2038 88745 145776 136594
CEA (MEDI-565)-4-1BBL 2267 76333 154791 154767
CEA (A5H1EL1D)-4-1BBL 2565 61720 130920 136891
CEA(P001.177)-4-1BBL 2870 72145 173531 171049
CEA(P005.102)-4-1BBL 2507 88789 151541 130963
CEA (T84.66-LCHA)-4-1BBL 3511 4978 82607 92372
SEQUENCE LISTING <110> F. 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Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 145 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A5-L1B (Q1T2) <400> 145 Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 146 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A5-L1C (FR2) <400> 146 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 147 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NABA-avi-His <400> 147 Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr 35 40 45 Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125 Met Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser 180 185 190 Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Ala Asn Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Cys Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asn 225 230 235 240 Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255 Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys His Ala Asn Asn Ser Val Thr 260 265 270 Gly Cys Asn Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Ile Val Thr Glu Leu Ser 275 280 285 Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335 Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val 340 345 350 Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile 355 360 365 Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln 385 390 395 400 Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 405 410 415 Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His 420 425 <210> 148 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N(A2B2)A-avi-His <400> 148 Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr 35 40 45 Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala 115 120 125 Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Val 165 170 175 Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser Val Asp His Ser 180 185 190 Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asp 225 230 235 240 Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn Ile Thr 245 250 255 Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser Ala Ser 260 265 270 Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala Leu Ser 275 280 285 Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335 Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val 340 345 350 Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile 355 360 365 Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Asn Asp 385 390 395 400 Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His His 405 410 415 His His His His 420 <210> 149 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NA(B2)A-avi-His <400> 149 Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr 35 40 45 Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125 Met Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser 180 185 190 Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Asp Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asp 225 230 235 240 Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn Ile Thr 245 250 255 Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser Ala Ser 260 265 270 Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala Leu Ser 275 280 285 Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335 Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val 340 345 350 Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile 355 360 365 Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Asn Asp 385 390 395 400 Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His His 405 410 415 His His His His 420 <210> 150 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A5H1EL1D_H1_rev_TN <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% N; 20% S; 3% D/E/Q/G/Y/V/T/H/A/L <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% Y; 20% A; 3.75% G/V/T/H/L/I/R/F <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% Y; 4% G/V/H/S/E/Q/N/D/R/F <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% D; 20% S; 4.3% G/Y/T/N/A/E/Q <220> <221> misc_feature <222> (55)..(57) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% T; 20% S; 4.3% A/G/Y/N/D/E/Q <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% T; 5% A/S/G/Y/N/D/E/Q <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, c, g, or t <400> 150 cagccactcg aggcctttac ccggtgcttg gcgtacccan nncatnnnnn nnnnnnngaa 60 nnngaagcca gaagccgcgc agctgagacg 90 <210> 151 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A5H1EL1D_H2_for_TN <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% F; 10% A; 6 % Y/V/L/I/G <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% G; 20% S; 3% A/K/T/V/N/D/E/Q/L/I <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g, or t and codes for 650% N; 20% G; 3.75 % D/E/Q/S/Y/T/H/A <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% K; 5% A/T/Y/N/D/E/Q/R <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% A; 4% V/G/D/P/H/N/E/Q/L/I <220> <221> misc_feature <222> (55)..(57) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% N; 5% D/E/Q; 4.17% G/T/H/S/A/R <400> 151 cgccaagcac cgggtaaagg cctcgagtgg ctgggtnnna tcnnnnnnnn nnnnnnngcg 60 tacaccacgg aatactccgc ctcc 84 <210> 152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMB3 long <400> 152 caggaaacag ctatgaccat gattac 26 <210> 153 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3-rev-constant <400> 153 aacggtcacc gtggtaccct ggccccagta gtcgaaatag aagcgcagac cac 53 <210> 154 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A5H1EL1D _L1_rev_TN <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% H; 20% A; 3.33% R/K/G/S/T/Q/Y/N/V <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> n is a, c, g, or t and codes for 70% I; 30% L <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% Y; 4% F/G/A/V/T/H/S/N/Q/R <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% T; 20% S; 2.72% A/G/Y/V/P/H/N/D/E/Q/R <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% V; 20% S; 3.33% T/A/G/N/Q/F/Y/P/H <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% S; 20% V; 3.33% T/A/G/N/D/E/Q/Y/H <400> 154 ggaacgcggg gcctggcctg gtttttgctg ataccannnn nnnnnnnnnn nnnngctgga 60 tgcgcggcaa gacagggtag cacg 84 <210> 155 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A5H1EL1D _L2_for_TN <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% Y; 10% F; 7.5% H/K/N/S <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% A; 20% D; 3.33% V/G/S/T/Y/H/N/E/Q <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n is a, c, g, or t and codes for 50% T; 20% A; 3.33% S/G/V/P/H/N/D/E/Q <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q/Y/V/H <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% N; 4% D/E/Q/Y/K/T/H/S/A/R <400> 155 cagcaaaaac caggccaggc cccgcgttcc tggatcnnnn nnnnnnnnnn nctcgcttct 60 ggtatcccgg cacgtttctc cggc 84 <210> 156 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A5H1EL1D _L3_for_TN <220> <221> misc_feature <222> (31)..(33) <223> n is a, c, g, or t and codes for 90% Q; 10% H <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% H; 5% R/K/Q/E/Y/F/N/D <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n is a, c, g, or t and codes for 65% W; 7% F/Y/V/L/I <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> n is a, c, g, or t and codes for 58% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q; 2% Y/V/P/H/L/I/R <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n is a, c, g, or t and codes for 58% S; 4% T/A/G/N/D/E/Q; 2% Y/V/P/H/L/I/R <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% K; 5% R/H; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g, or t and codes for 70% P; 5% A/S/T/R/S/L <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% P; 5% L/G/R/M; 2.86% A/V/L/I/F/S/R <400> 156 gagcctgaag attttgccgt atactattgt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnactttc 60 ggtcagggca ccaagctgga aatc 84 <210> 157 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A5H1EL1D _H3_rev_TN <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n is a, c, g, or t and codes for 80% F; 10% I/L <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n is a, c, g or t and codes for 60% Y; 5% F/W; 2.14% G/A/V/T/P/H/S/N/D/E/Q/L/I/R <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> n is a, c, g, or t and codes for 65% F; 5% Y/W/A/V/L/I/G <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n is a, c, g or t and codes for 60% R; 5% K/H; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% L; 4% I/V/A/F; 2.4% G/Y/T/P/H/S/N/D/E/Q <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% G; 5% A/S/T; 2.5% Y/V/P/H/N/D/E/Q/L/I <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% R; 5% K/H; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I <220> <221> misc_feature <222> (55)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (58)..(60) <223> n is a, c, g, or t and codes for 80% F; 10% I/L <220> <221> misc_feature <222> (58)..(60) <223> n is a, c, g, or t and codes for 60% R; 10% K; 2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/H <400> 157 aacggtcacc gtggtaccct ggccccagta gtcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 agtacagtag taggtggcgg tgtcttctgc 90 <210> 158 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3-rev-constant <400> 158 acaatagtat acggcaaaat cttcaggctc 30 <210> 159 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 amplification <400> 159 agaaacggtc accgtggtac cctggcccca gtagtc 36 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038)- CDR-H1 <400> 160 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 161 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038)- CDR-H2 <400> 161 Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 162 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038)- CDR-H3 <400> 162 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038)- CDR-L1 <400> 163 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 164 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038)- CDR-L2 <400> 164 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038)- CDR-L3 <400> 165 Gln His Trp Ser Ser Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 166 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.097)- CDR-H1 <400> 166 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 167 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.097)- CDR-H2 <400> 167 Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.097)- CDR-H3 <400> 168 Asp Arg Gly Leu Arg Phe Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.097)- CDR-L1 <400> 169 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 170 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.097)- CDR-L2 <400> 170 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.097)- CDR-L3 <400> 171 Gln His Trp Ser Ser Gln Pro Pro Thr 1 5 <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103)- CDR-H1 <400> 172 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 173 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103)- CDR-H2 <400> 173 Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103)- CDR-H3 <400> 174 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103)- CDR-L1 <400> 175 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103)- CDR-L2 <400> 176 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103)- CDR-L3 <400> 177 Gln His Trp Ser Ser Ile Ser Pro Thr 1 5 <210> 178 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P002.139)- CDR-H1 <400> 178 Gly Phe Tyr Phe Thr Asp Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 179 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P002.139)- CDR-H2 <400> 179 Val Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P002.139)- CDR-H3 <400> 180 Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 181 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P002.139)- CDR-L1 <400> 181 His Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P002.139)- CDR-L2 <400> 182 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P002.139)- CDR-L3 <400> 183 Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 1 5 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P001.177)- CDR-H1 <400> 184 Gly Phe Tyr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 185 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P001.177)- CDR-H2 <400> 185 Phe Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 186 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P001.177)- CDR-H3 <400> 186 Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P001.177)- CDR-L1 <400> 187 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 188 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P001.177)- CDR-L2 <400> 188 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P001.177)- CDR-L3 <400> 189 Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 1 5 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102)- CDR-H1 <400> 190 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 191 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102)- CDR-H2 <400> 191 Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102)- CDR-H3 <400> 192 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Gln Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102)- CDR-L1 <400> 193 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 194 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102)- CDR-L2 <400> 194 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102)- CDR-L3 <400> 195 Gln His Trp Ser Ser Lys Ser Pro Thr 1 5 <210> 196 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo1)- CDR-H1 <400> 196 Gly Phe Tyr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 197 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo1)- CDR-H2 <400> 197 Val Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo1)- CDR-H3 <400> 198 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Gln Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo1)- CDR-L1 <400> 199 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo1)- CDR-L2 <400> 200 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo1)- CDR-L3 <400> 201 Gln His Trp Ser Ser Lys Ser Pro Thr 1 5 <210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo2)- CDR-H1 <400> 202 Gly Phe Tyr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 203 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo2)- CDR-H2 <400> 203 Val Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 204 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo2)- CDR-H3 <400> 204 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Gln Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 205 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo2)- CDR-L1 <400> 205 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo2)- CDR-L2 <400> 206 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.102-combo2)- CDR-L3 <400> 207 Gln His Trp Ser Ser Lys Ser Pro Thr 1 5 <210> 208 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo1)- CDR-H1 <400> 208 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 209 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo1)- CDR-H2 <400> 209 Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 210 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo1)- CDR-H3 <400> 210 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 211 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo1)- CDR-L1 <400> 211 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 212 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo1)- CDR-L2 <400> 212 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo1)- CDR-L3 <400> 213 Gln His Trp Ser Ser Ile Ser Pro Thr 1 5 <210> 214 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo2)- CDR-H1 <400> 214 Gly Phe Tyr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 215 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo2)- CDR-H2 <400> 215 Val Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 216 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo2)- CDR-H3 <400> 216 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 217 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo2)- CDR-L1 <400> 217 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 218 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo2)- CDR-L2 <400> 218 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P005.103-combo2)- CDR-L3 <400> 219 Gln His Trp Ser Ser Ile Ser Pro Thr 1 5 <210> 220 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo1)- CDR-H1 <400> 220 Gly Phe Tyr Phe Thr Asp Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 221 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo1)- CDR-H2 <400> 221 Val Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 222 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo1)- CDR-H3 <400> 222 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 223 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo1)- CDR-L1 <400> 223 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 224 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo1)- CDR-L2 <400> 224 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo1)- CDR-L3 <400> 225 Gln His Trp Ser Ser Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 226 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo2)- CDR-H1 <400> 226 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met Asn 1 5 10 <210> 227 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo2)- CDR-H2 <400> 227 Phe Ile Ser Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 228 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo2)- CDR-H3 <400> 228 Asp Arg Gly Ile Arg Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 229 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (P006.038-combo2)- CDR-L1 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<400> 233 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 234 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV1-69-05 human acceptor sequence <400> 234 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 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Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 298 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 65 70 75 80 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 145 150 155 160 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 165 170 175 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr 180 185 190 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu 195 <210> 299 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 299 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 <210> 300 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 301 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 301 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 302 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 302 Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 303 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is S or P <400> 303 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro 1 5 10 <210> 304 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is S or P <400> 304 His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro 1 5 <210> 305 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is S or P <400> 305 Cys Pro Xaa Cys Pro 1 5 <210> 306 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 307 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 308 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 309 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 310 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 311 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu 1 5 10 15 Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr 20 25 30 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 35 40 45 Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn 50 55 60 Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser Val Asp 65 70 75 80 His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn 85 <210> 312 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr 20 25 30 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 35 40 45 Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn 50 55 60 Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 65 70 75 80 Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn 85 <210> 313 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (MFE-L27, L28, L29)- CDR-L1 <400> 313 Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met His 1 5 10

Claims (39)

  1. (a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인(VH), 및 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL), 또는
    (b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인;
    이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로서, 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    안정되게 회합될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인
    을 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    4-1BBL의 엑토도메인 또는 이의 단편이 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93 및 서열 번호: 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (A)
    (a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인(VH), 및 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL), 또는
    (b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인;
    (B) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로서, 서열 번호: 95, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 및 서열 번호: 98로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열 번호: 87, 서열 번호: 91, 서열 번호: 89 및 서열 번호: 94로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    (C) 안정하게 회합될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인
    을 포함하는 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 도메인의 제1 아단위 및 제2 아단위의 회합을 촉진하는 노브 인투 홀(knob-into-hole) 변형을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(Kabat EU 넘버링에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인인, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
    (a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인(VH), 및 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL); 또는
    (b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
    (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (b) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (c) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (e) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (f) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (g) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (h) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (j) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (l) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제7항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79 또는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 85 또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제7항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
    (a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (c) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (d) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (f) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (g) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 이들의 단편을 포함하는 제1 펩티드가 자체의 C 말단에서, 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고,
    상기 4-1BBL의 하나의 엑토도메인 또는 이의 단편을 포함하는 제2 펩티드가 자체의 C 말단에서, 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는,
    4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제1 중쇄 및 제1 경쇄로서, 둘 모두 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄;
    (ii) 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103 및 서열 번호: 105로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
    (iii) 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104 및 서열 번호: 106으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 분자가
    (a) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (b) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 240의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 241의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 242의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 243의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (d) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 244의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 245의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (e) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 246의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 247의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (f) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 248의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 249의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (g) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 250의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 251의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (h) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 252의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 253의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (i) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 254의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 255의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (j) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 256의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 257의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (k) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 258의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (l) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 260의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 261의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (m) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 262의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 분자가
    (a) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (b) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (c) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (d) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 270의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (e) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 272의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (f) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 273의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄; 또는
    (g) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  17. 암배아 항원(CEA)에 결합하는 인간화 항체로서,
    (a) (i) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 도메인(VH), 및 (iv) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL), 또는
    (b) (i) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 인간화 항체.
  18. 제17항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (b) 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (c) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (d) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (e) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (f) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (g) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (h) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (i) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (j) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (k) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인,
    (l) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 인간화 항체.
  19. 암배아 항원(CEA)에 결합하는 인간화 항체로서,
    (i) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 66 또는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열 번호: 69 또는 서열 번호: 70 또는 서열 번호: 313의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 인간화 항체.
  20. 제21항에 있어서,
    서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79 또는 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 85 또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 인간화 항체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이
    (a) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (b) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (c) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (d) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (e) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (f) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (g) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는, 인간화 항체.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 특히 Fab 분자인 인간화 항체.
  23. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    전장 IgG1 항체인 인간화 항체.
  24. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
  25. 제24항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체의 발현에 적합한 조건하에 제25항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 상기 인간화 항체의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 인간화 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  28. 제27항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 항체.
  29. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체; 및
    하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  30. 제31항에 있어서,
    추가 치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  32. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
  33. 암의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
  34. 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 다른 치료제와 병용되는, 제33항에 따른 사용을 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 제29항에 따른 약학 조성물.
  35. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에 사용하기 위한 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자로서, 상기 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자가 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체와 병용되고, 상기 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체가 상기 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자와 동시에, 이에 앞서, 또는 이에 이어서 투여되는, 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자.
  36. 암의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자 또는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체의 용도.
  37. 암을 앓는 개체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 암을 앓는 개체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 효과량 및 T 세포 활성화 항-CD3 이중특이적 항체의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 암을 앓는 개체에서 세포독성 T 세포 활성을 상향조절하거나 연장하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 4-1BBL 삼합체-내포 항원 결합 분자, 또는 제29항에 따른 약학 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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