KR20210151903A

KR20210151903A - 생체 조직형 구조체의 제조 방법

Info

Publication number: KR20210151903A
Application number: KR1020217036679A
Authority: KR
Inventors: 히데유키 히요시; 다이스케 모치다; 노리코 야마조에; 준지 야마우라; 다로 도요다; 슈헤이 고나가야
Original assignee: 오리즈루 세라퓨틱스 가부시키가이샤
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2021-12-14
Also published as: IL287063A; SG11202111123SA; WO2020209389A1; US20220168357A1; TW202104590A; AU2020270703A1; BR112021020115A2; CA3136401A1; EP3954436A4; EP3954436A1; JPWO2020209389A1; CN113993528A

Abstract

본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 유도되는 분화 세포를 포함하는 생체 조직형 구조체의 신규 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고, 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치된 포함하는 조성물을, 생체 조직 중에 이식함으로써, 세포를 분화 유도하고, 호스트 유래의 혈관이나 결합 조직과 함께, 생체 조직형 구조체를 형성시키는 방법을 제공한다.

Description

생체 조직형 구조체의 제조 방법

본 발명은 다능성 줄기 세포 유래의 분화 세포로 구성되는 생체 조직형 구조체, 그리고, 그 제조법 및 용도에 관한 것이다.

인공 다능성 세포나 배성 줄기 세포 (ES 세포) 등의 다능성 줄기 세포로부터 유도되는 기능성 분화 세포는, 이식 재생 의료의 세포 공급원으로서 기대되고 있다. 오늘날에는, 조직 공학을 이용한 이식 치료를 향하여, 그와 같은 기능성 분화 세포를 이용하여 생체 기관이나 조직과 동등하거나 또는 유사한 기능을 갖는 구조체 (이하,「생체 조직형 구조체」로 기재한다) 를 구축하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 두께가 있는, 3 차원적인 구조체를 제작하고자 할 경우, 모든 세포에 산소나 영양분 등을 충분히 공급할 수 없는 경우가 있어, 구조체 중의 세포를 유지·관리하는 것은 in vitro 및 in vivo 중 어디에서도 용이하지 않았다. 그 때문에, 종래의 구조체에는 그 두께나 크기에 제한이 있고, 생체 기관이나 조직과 동등하거나 또는 유사한 기능을 발휘하기에는 충분하지 못한 경우가 있었다. 당해 분야에 있어서는 여전히, 두께가 있는, 3 차원적인 생체 조직형 구조체를 간편하게 제작할 수 있는 새로운 수법이 절실히 요망되고 있었다.

인공 다능성 세포나 배성 줄기 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터, 췌 β 세포나 췌 α 세포와 같은 호르몬을 분비하는 내분비 세포를 분화 유도하여, 당뇨병의 치료에 응용하는 연구가 진행되고 있다. 지금까지, 다능성 줄기 세포로부터 췌 전구 세포로 분화 유도하고, 그것을 생체 내에 이식하여, 성숙화시킴으로써 내분비 세포를 제조하는 수법이 보고되어 있다. 예를 들어, 비특허문헌 1 에는, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된, 췌 전구 세포를 마우스에 이식하고 성숙화시킴으로써, 인슐린 양성 세포 및 글루카곤 양성 세포를 포함하는 내분비 세포를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 지금까지 인슐린 양성 세포나 글루카곤 양성 세포 등의 내분비 세포를 포함하고, 두께가 있으며, 췌관 (duct) 이나 낭포 (cyst) 를 포함하지 않는, 3 차원적인 생체 조직형 구조체는 제조되지 않았다.

Robert T et al, Stem Cell Reports. 2018 Mar 13 ; 10 (3) : 739-750.

본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 유도되는 분화 세포를 포함하는 생체 조직형 구조체의 신규 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치된 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 포함하는 조성물을, 생체 조직 중에 이식함으로써, 세포는 생착하고, 분화 유도되어 성숙하고, 호스트 유래의 혈관이나 결합 조직과 함께, 생체 조직형 구조체를 구축할 수 있는 것을 알아내었다.

본 발명은 이들 지견에 기초하는 것으로서, 아래의 발명을 포함한다.

[1] 생체 조직형 구조체를 호스트 동물의 생체 조직 내에 제작하는 방법에 있어서 사용되는, 생체 적합성 재료와 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 포함하는 조성물로서, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치되어 있는, 조성물.

[2] 생체 적합성 재료가 피브린 겔인, [1] 의 조성물.

[3] 피브린 겔이, 상기 조성물의 사용 직전에, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포와 피브리노겐과 트롬빈을 혼합하여 겔화된 것인, [2] 의 조성물.

[4] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 복수의 스페로이드의 형태로 존재하는, [1] ∼ [3] 중 어느 하나인 조성물.

[5] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포에 있어서의 Ki67 양성 세포의 비율이 3 ％ 미만인, [1] ∼ [4] 중 어느 하나인 조성물.

[6] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 인슐린 산생 세포인, [1] ∼ [5] 중 어느 하나인 조성물.

[7] 상기 방법이, 상기 조성물을 호스트 동물의 생체 조직 중에 이식하여, 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치된 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 분화 유도하는 것을 포함하는, [1] ∼ [6] 중 어느 하나인 조성물.

[8] 호스트 동물의 생체 조직이 피하 조직인, [7] 의 조성물.

[9] 생체 조직형 구조체가, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하고, 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터가 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재하며, 그 결합 조직이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸고, 그 혈관이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터에 침입해 있는, [1] ∼ [8] 중 어느 하나인 조성물.

[10] 상기 분화 세포가 외분비 세포를 포함하지 않는, [9] 의 조성물.

[11] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하는 생체 조직형 구조체로서, 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터가 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재하고, 그 결합 조직이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸며, 그 혈관이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터에 침입해 있는, 생체 조직형 구조체.

[12] 상기 분화 세포가 췌 β 세포를 포함하는, [11] 의 생체 조직형 구조체.

[12-A] 상기 분화 세포가 췌 β 세포 및 췌 α 세포를 포함하는, [11] 의 생체 조직형 구조체.

[13] 상기 분화 세포가 외분비 세포를 포함하지 않는, [11] ∼ [12-A] 중 어느 하나인 생체 조직형 구조체.

[14] 상기 생체 조직형 구조체가 이식된 피검체의 혈당치를 정상치로 컨트롤하기 위해서 사용되는, [11] ∼ [14] 중 어느 하나인 생체 조직형 구조체.

[15] 생체 조직형 구조체의 제조 방법으로서,

생체 적합성 재료와 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 포함하는 조성물로서, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치되어 있는, 조성물을 호스트 동물의 생체 조직 중에 이식하여 분화 유도하는 것을 포함하는, 방법.

[16] 생체 적합성 재료가 피브린 겔인, [15] 의 방법.

[17] 피브린 겔이, 상기 조성물의 사용 직전에, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포와 피브리노겐과 트롬빈을 혼합하여 겔화되는, [16] 의 방법.

[18] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 복수의 스페로이드의 형태로 존재하는, [15] ∼ [17] 중 어느 하나의 방법.

[19] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포에 있어서의 Ki67 양성 세포의 비율이 3 ％ 미만인, [15] ∼ [18] 중 어느 하나의 방법.

[20] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 인슐린 산생 세포인, [15] ∼ [19] 중 어느 하나의 방법.

[21] 호스트 동물의 생체 조직이 피하 조직인, [15] ∼ [20] 중 어느 하나의 방법.

[22] 생체 조직형 구조체가, 분산된 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하고, 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터가 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재하며, 그 결합 조직이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸고, 그 혈관이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터에 침입해 있는, [15] ∼ [21] 중 어느 하나의 방법.

[23] 상기 분화 세포가 외분비 세포를 포함하지 않는, [15] ∼ [22] 중 어느 하나의 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2019-075100호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아 들이는 것으로 한다.

본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 유도되는 분화 세포를 포함하는 생체 조직형 구조체의 신규 제조 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은, 이식 전의 인슐린 산생 세포에 대해서, 플로사이트메트리에 의해서 단백질 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 2 는, 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔을 이식한 스트렙토조토신 (STZ) 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스에 있어서의 혈중 인간 C-펩티드 농도 (A) 및 혈당치 (B) 를 시간 경과적으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 3 은, 스트렙토조토신 (STZ) 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스의 생체 내에 형성된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 글루코오스 부하에 대한 응답의 해석 결과를 나타낸다. 글루코오스 부하 후의 혈중 인간 C-펩티드 농도 (A) 및 혈장 중 글루코오스 농도 (B) 를 시간 경과적으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 4 는, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 사진도를 나타낸다.
도 5 는, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 HE 염색 이미지를 나타낸다.
도 6 은, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 마손 트리크롬 염색 이미지를 나타낸다.
도 7 은, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 인간 핵 (HuN) 및 PDX1 의 면역 조직 염색 이미지를 나타낸다.
도 8 은, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 인슐린 (INS) 및 글루카곤 (GCG) 의 면역 조직 염색 이미지를 나타낸다.
도 9 는, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 마우스 CD31 (mCD31) 및 크로모그라닌 A (CHGA) 의 면역 조직 염색 이미지를 나타낸다.
도 10 은, 이식으로부터 6 개월 후에 생체 내에서 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 인간 핵 (HuN) 및 Ki67 의 면역 조직 염색 이미지를 나타낸다. 화살표 : Ki67 양성 세포.
도 11 은, 스트렙토조토신 (STZ) 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스에 대해서 피브린 겔에 분산시킨 인슐린 산생 세포를 이식하고, 이식 후에 시간 경과적으로 측정한 혈중 인간 C-펩티드, 글루카곤 및 혈당치를 나타낸다.
도 12 는, 스트렙토조토신 (STZ) 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스 및 비당뇨병의 NOD/SCID 마우스에 대해서 피브린 겔에 분산시킨 인슐린 산생 세포를 이식하고, 이식으로부터 28 주 후에 생체 내에서 적출한 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체에 있어서의 인슐린 및 글루카곤 함량의 측정 결과를 나타낸다. 상단은 인슐린 함량의 측정 결과, 하단은 글루카곤 함량의 측정 결과를 나타내고, 또, 각 단에 있어서, 왼쪽은 각 마우스의 췌장에 있어서의 각 호르몬 함량의 측정 결과 (대조) 를 나타내고, 오른쪽은 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체에 있어서의 각 호르몬 함량의 측정 결과를 나타낸다.
도 13 은, 피브린 겔에 분산시킨 인슐린 산생 세포를 이식하여 고혈당이 완전히 개선된 Akita 유전자 변이를 갖는 NOD/SCID 마우스에 대해서, 글루코오스를 부하한 후에 시간 경과적으로 측정한 글루카곤 및 글루카곤형 펩티드-1 을 나타낸다.
도 14, 는 피브린 겔에 분산시킨 인슐린 산생 세포를 이식하여 고혈당이 완전히 개선된 STZ 당뇨병 NOD/SCID 마우스에 대해서, 글루카곤 수용체 안타고니스트 MK-0893 을 처치한 후에 글루코오스를 부하하고, 그 후 시간 경과적으로 측정한 혈당치 및 혈중 인간 C-펩티드 농도를 나타낸다.
도 15, 는 피브린 겔에 분산시킨 인슐린 산생 세포를 이식하여 고혈당이 완전히 개선된 Akita 당뇨병 NOD/SCID 마우스에 대해서, 글루카곤형 펩티드-1 수용체 안타고니스트 Exendin-9 를 3 일간 처치하고, 처치 전후에 측정한 포식시의 혈중 인간 C-펩티드 농도를 나타낸다.

1. 용어

본 명세서에 있어서,「약」이란, 기준치에 대해서 플러스 또는 마이너스 각각 25 ％, 20 ％, 10 ％, 8 ％, 6 ％, 5 ％, 4 ％, 3 ％, 2 ％ 또는 1 ％ 까지 변동하는 값을 나타낸다. 바람직하게는,「약」또는「대략」이라는 용어는, 기준치에 대해서 플러스 또는 마이너스 각각 15 ％, 10 ％, 5 ％, 또는 1 ％ 의 범위를 나타낸다.

본 명세서에 있어서,「∼ 를 포함하다 (comprise(s) 또는 comprising)」란, 그 어구에 이어지는 요소의 포함을 나타내지만 이것에 한정되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 그 어구에 이어지는 요소의 포함은 시사하지만, 다른 임의의 요소의 제외는 시사하지 않는다.

본 명세서에 있어서,「∼ 로 이루어지다 (consist(s) of 또는 consisting of)」란, 그 어구에 이어지는 모든 요소를 포함하며, 또한, 이것에 한정되는 것을 의미한다. 따라서,「∼ 로 이루어지다」라는 어구는, 열거된 요소가 요구되거나 또는 필수이고, 다른 요소는 실질적으로 존재하지 않는 것을 나타낸다.

본 명세서에 있어서,「피더 세포를 사용」하지 않는다란, 기본적으로 피더 세포를 포함하지 않는 것, 피더 세포를 배양함으로써 프레컨디셔닝한 배지 등을 사용하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 배지 중에는 피더 세포로부터 분비되는 성장 인자 및 사이토카인 등의 물질은 포함되지 않는다.

또한,「피더 세포」또는「피더」란, 별도의 종류의 세포와 공배양되고, 그 세포를 지지하고, 성장할 수 있는 환경을 만들어주는 세포를 의미한다. 피더 세포는, 그것들이 지지하는 세포와는 동일한 종에서 유래해도 되고, 상이한 종에서 유래해도 된다. 예를 들어, 인간 세포의 피더로서, 인간 피부 선유아 세포 또는 인간 배성 줄기 세포를 사용해도 되고, 마우스배 선유아 세포의 초대 배양물, 및 불사화 (不死化) 마우스배 선유아 세포를 사용해도 된다. 피더 세포는, 방사선 조사 또는 마이토마이신 C 처리 등에 의해서 불활성화할 수 있다.

본 명세서에 있어서,「접착」이란, 세포가 용기에 부착되어 있는 것, 예를 들어, 세포가 적절한 배지의 존재 하에서 멸균 플라스틱 (또는 코팅된 플라스틱) 의 세포 배양 디시 또는 플라스크에 부착되어 있는 것을 가리킨다. 세포 중에는, 세포 배양 용기에 접착시키지 않으면 배양물 중에서 유지할 수 없거나, 혹은 성장하지 않는 것도 있다. 이에 비해서, 비접착성 세포는, 용기에 접착시키지 않고 배양물 중에서 유지되어 증식할 수 있다.

본 명세서에 있어서,「배양」이란, 세포를 인비트로 환경에서 유지하고, 성장시키며, 또한/또는 분화시키는 것을 가리킨다. 「배양하다」란, 조직 또는 체외에서, 예를 들어, 세포 배양 디시 또는 플라스크 중에서 세포를 지속시키고, 증식시키며 (성장시키며), 또한/또는 분화시키는 것을 의미한다. 배양에는 2 차원 배양 (평면 배양) 이나, 3 차원 배양 (부유 배양) 이 포함된다.

본 명세서에 있어서,「부화하다 (enrich)」및「부화하는 것 (enrichment)」이란, 세포의 조성물 등의 조성물 중의 특정한 구성 성분의 양을 증가시키는 것을 가리키고,「부화된 (enriched)」이란, 세포의 조성물, 예를 들어, 세포 집단을 설명하기 위해서 사용될 경우, 특정한 구성 성분의 양이, 부화되기 전의 세포 집단에 있어서의 그와 같은 구성 성분의 비율과 비교하여 증가되어 있는 세포 집단을 가리킨다. 예를 들어, 세포 집단 등의 조성물을, 표적 세포형에 관해서 부화할 수 있고, 따라서, 표적 세포형의 비율은, 부화되기 전의 세포 집단 내에 존재하는 표적 세포의 비율과 비교하여 증가된다. 세포 집단은, 당 기술 분야에서 공지된 세포 선택 및 선별 방법에 의해서, 표적 세포형에 대해서 부화할 수도 있다. 세포 집단은, 본 명세서에 기재한 특정한 선별 또는 선택 프로세스에 의해서 부화할 수도 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서는, 표적 세포 집단을 부화하는 방법에 의해서, 세포 집단이 표적 세포 집단에 관해서 적어도 20 ％, 30 ％, 40 ％, 50 ％, 60 ％, 70 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 부화된다.

본 명세서에 있어서,「고갈되다 (deplete)」및「고갈되는 것 (depletion)」이란, 세포 혹은 세포의 조성물 등의 조성물 중의 특정한 구성 성분의 양을 감소시키는 것을 가리키고,「고갈된 (depleted)」이란, 세포 혹은 세포의 조성물, 예를 들어, 세포 집단을 설명하기 위해서 사용될 경우, 특정한 구성 성분의 양이, 고갈되기 전의 세포 집단에 있어서의 그와 같은 구성 성분의 비율과 비교하여 감소되어 있는 세포 집단을 가리킨다. 예를 들어, 세포 집단 등의 조성물을, 표적 세포형에 관해서 고갈시킬 수 있고, 따라서, 표적 세포형의 비율은, 고갈되기 전의 세포 집단 내에 존재하는 표적 세포의 비율과 비교하여 감소된다. 세포 집단은, 당 기술 분야에서 공지된 세포 선택 및 선별 방법에 의해서, 표적 세포형에 대해서 고갈시킬 수도 있다. 세포 집단은, 본 명세서에 기재한 특정한 선별 또는 선택 프로세스에 의해서 고갈시킬 수도 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서는, 표적 세포 집단을 고갈시키는 방법에 의해서, 세포 집단은 표적 세포 집단에 관해서 적어도 50 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 감소 (고갈) 되어 있다.

본 명세서에 있어서,「순화하다 (purify)」및「순화하는 것 (purification)」이란, 세포의 조성물 등의 조성물 중의 불순물을 없애, 특정한 구성 성분에 대해서 순수한 것으로 하는 것을 가리키고,「순화된 (purified)」이란, 세포의 조성물, 예를 들어, 세포 집단을 설명하기 위해서 사용될 경우, 불순물의 양이, 순화되기 전의 세포 집단에 있어서의 그와 같은 구성 성분의 비율과 비교하여 감소되어, 특정한 구성 성분의 순도가 향상되어 있는 세포 집단을 가리킨다. 예를 들어, 세포 집단 등의 조성물을, 표적 세포형에 관해서 순화할 수 있고, 따라서, 표적 세포형의 비율은, 순화되기 전의 세포 집단 내에 존재하는 표적 세포의 비율과 비교하여 증가된다. 세포 집단은, 당 기술 분야에서 공지된 세포 선택및 선별 방법에 의해서, 표적 세포형에 대해서 순화시킬 수도 있다. 세포 집단은, 본 명세서에 기재한 특정한 선별 또는 선택 프로세스에 의해서 순화시킬 수도 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서는, 표적 세포 집단을 순화시키는 방법에 의해서, 표적 세포 집단의 순도는, 적어도 70 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 가 되거나, 불순물 (협잡 세포를 포함한다) 은 검출할 수 없을 정도가 될 수 있다.

본 명세서에 있어서,「CDK8/19 저해 활성을 갖는 인자」란, CDK8/19 의 저해 활성을 갖는 모든 물질을 의미한다. 동일한 CDK 패밀리의 다른 단백질과는 대조적으로, CDK8 은, 세포 증식에는 필요치 않게 되어, CDK8 의 저해는, 통상적인 조건 하에서는 큰 효과가 없다. CDK19 와 CDK8 은 유사하여, CDK8 저해는 통상적으로 CDK19 의 저해도 수반한다.

「증식 인자」는 특정한 세포의 분화 및/또는 증식을 촉진하는 내인성 단백질이다. 「증식 인자」로는, 예를 들어, 상피 성장 인자 (EGF), 산성 선유아 세포 증식 인자 (aFGF), 염기성 선유아 세포 증식 인자 (bFGF), 간 세포 증식 인자 (HGF), 인슐린형 증식 인자 1 (IGF-1), 인슐린형 증식 인자 2 (IGF-2), 케라티노사이트 증식 인자 (KGF), 신경 증식 인자 (NGF), 혈소판 유래 증식 인자 (PDGF), 형질 전환 증식 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF), 트란스페린, 다양한 인터류킨 (예를 들어, IL-1 ∼ IL-18), 다양한 콜로니-자극 인자 (예를 들어, 과립구/매크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)), 다양한 인터페론 (예를 들어, IFN-γ 등) 및 줄기 세포에 대한 효과를 갖는 다른 사이토카인, 예를 들어, 줄기 세포 인자 (SCF) 및 에리트로포이에틴 (Epo) 을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서,「ROCK 저해제」란, Rho 키나아제 (ROCK : Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 를 저해하는 물질을 의미하고, ROCK I 과 ROCK Ⅱ 중 어느 것을 저해하는 물질이어도 된다. ROCK 저해제는, 상기한 기능을 갖는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르보아미드 (Y-27632 로 칭하기도 한다), Fasudil (HA1077), (2S)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐]술포닐]헥사하이드로-1H-1,4-디아제핀 (H-1152), 4β-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(4-피리딜)벤젠-1젠카르보아미드 (Wf-536), N-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4PER(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르보아미드 (Y-30141), N-(3-{[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시}페닐)-4-{[2-(4-모르폴리닐)에틸]-옥시}벤즈아미드 (GSK269962A), N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-6-메틸-2-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3,4-디하이드로-1H-피리딘-5-카르복사미드 (GSK429286A) 를 들 수 있다. ROCK 저해제는 이것들에 한정되는 것이 아니고, ROCK 의 mRNA 에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드나 siRNA, ROCK 에 결합하는 항체, 도미넌트 네거티브 ROCK 변이체 등도 ROCK 저해제로서 사용할 수 있고, 상업적으로 입수 가능하거나 공지된 방법에 의해서 합성할 수 있다.

본 명세서에 있어서,「GSK3β 저해제」란, GSK3β (글리코겐 신타제 키나아제 3β) 에 대한 저해 활성을 갖는 물질이다. GSK3 (글리코겐 신타제 키나아제 3) 은, 세린/트레오닌 프로테인 키나아제의 일종이고, 글리코겐의 산생이나 아폽토시스, 줄기 세포의 유지 등에 관련된 많은 시그널 경로에 관여한다. GSK3 에는 α 와 β 의 2 가지의 아이소폼이 존재한다. 본 발명에서 사용되는「GSK3β 저해제」는, GSK3β 저해 활성을 가지면 특별히 한정되지 않고, GSK3β 저해 활성과 함께 GSK3α저해 활성을 겸비하는 물질이어도 된다.

GSK3β 저해제로는, CHIR98014 (2-[[2-[(5-니트로-6-아미노피리딘-2-일)아미노]에틸]아미노]-4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-1-일)피리미딘), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴), TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), TWS-119 (3-[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시]페놀), 켄파울론 (Kenpaullone), 1-아자켄파울론 (Azakenpaullone), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), SB415286 (3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온) 및 AR-AO144-18, CT99021, CT20026, BIO, BIO-아세톡심, 피리도카르바졸-시클로펜타디에닐루테늄 복합체, OTDZT, 알파-4-디브로모아세토페논, 리튬 등을 예시할 수 있다. GSK3β 는 이것들에 한정되는 것이 아니고, GSK3β 의 mRNA 에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드나 siRNA, GSK3β 에 결합하는 항체, 도미넌트 네거티브 GSK3β 변이체 등도 GSK3β 저해제로서 사용할 수 있고, 상업적으로 입수 가능하거나, 공지된 방법에 의해서 합성할 수 있다.

본 명세서에 있어서「혈청 대체물」이란, 예를 들어, Knockout Serum Replacement (KSR : Invitrogen), StemSure Serum Replacement (Wako), B-27 서플리먼트, N2-서플리먼트, 알부민 (예를 들어, 지질 리치 알부민), 인슐린, 트란스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어, 아연, 셀렌 (예를 들어, 아셀렌산나트륨)), 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이것들의 혼합물 (예를 들어, ITS-G) 을 들 수 있다. 혈청 대체물로는, B-27 서플리먼트, KSR, StemSure Serum Replacement, ITS-G 가 바람직하다. 배지에 혈청 대체물을 첨가하는 경우의 배지 중의 농도는 0.01 ∼ 10 중량 ％, 바람직하게는 0.1 ∼ 2 중량 ％ 이다. 본 발명에 있어서는, 혈청 대신에「혈청 대체물」을 사용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서「FGFR1 저해제」란, 선유아 세포 증식 인자 수용체 (FGFR1) 에 대한 저해 활성을 갖는 물질이다. FGFR1 은, 성장 인자인 FGF1 ∼ FGF17 에 대해서 높은 친화성을 갖는 수용체로서, 4 회 막 관통형 티로신 키나아제의 패밀리 (FGFR1, 2, 3, 4) 의 멤버이다. FGFR1 저해제는, FGFR1 저해 활성을 가지면 특별히 한정되지 않고, FGFR1 저해 활성과 함께 그 밖의 FGFR 의 저해 활성을 겸비하는 물질이어도 된다. 본 명세서에 있어서「FGFR1 저해제」란, FGFR1 저해 활성을 조금이라도 갖고 있는 물질이 함유되는데, 바람직하게는, FGFR1 을 50 ％ 이상 저해하는 물질을 가리키고, 보다 바람직하게는 FGFR1 의 50 ％ 저해 농도 (IC₅₀) 가 1 μM 이하, 더욱 바람직하게는 100 nM 이하인 물질을 가리킨다. FGFR1 저해 활성의 판정 방법으로는, 공지된 방법으로 선택하면 되고, 예를 들어 EnzyChrom Kinase Assay Kit (BioAssay Systems 사) 를 사용한 판정 방법 등을 들 수 있다. FGFR1 저해제는 종래 공지된 것을 이용할 수 있고, 특허문헌 또는 비특허문헌에서 찾아 볼 수 있다.

구체적으로는, 본 발명에 있어서 이용 가능한 FGFR1 저해제로는, PD-166866 (1-[2-아미노-6-(3,5-디메톡시페닐)-피리도(2,3-d)피리미딘-7-일]-3-tert-부틸우레아 : CAS No.: 192705-79-6), E-3810 (CAS No.: 1058137-23-7), PD-173074 (CAS No.: 219580-11-7), FGFR4 -IN-1 (CAS No.: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (CAS No.: 1448169-71-8), FIIN-2 (CAS No.: 1633044-56-0), AZD4547 (CAS No.: 1035270-39-3), FIIN-3 (CAS No.: 1637735-84-2), NVP-BGJ398 (CAS No.: 1310746-10-1), NVP-BGJ398 (CAS No.: 872511-34-7), CH5183284 (CAS No.: 1265229-25-1), Derazantinib (CAS No.: 1234356-69-4), Derazantinib Racemate, Ferulic acid (CAS No.: 1135-24-6), SSR128129E (CAS No.: 848318-25-2), SSR128129E free acid (CAS No.: 848463-13-8), Erdafitinib (CAS No.: 1346242-81-6), BLU9931 (CAS No.: 1538604-68-0), PRN1371 (CAS No.: 1802929-43-6), S49076 (CAS No.: 1265965-22-7), LY2874455 (CAS No.: 1254473-64-7), Linsitinib (CAS No.: 867160-71-2), Dovitinib (CAS No.: 405169-16-6), Anlotinib (CAS No.: 1058156-90-3), Brivanib (CAS No.: 649735-46-6), Derazantinib (CAS No.: 1234356-69-4), Anlotinib Dihydrochloride (CAS No.: 1360460-82-7), ACTB-1003 (CAS No.: 939805-30-8), BLU-554 (CAS No.: 1707289-21-1), Rogaratinib (CAS No.: 1443530-05-9), BIBF 1120 esylate (CAS No.: 656247-18-6), TG 100572 Hydrochloride (CAS No.: 867331-64-4), ENMD-2076 (CAS No.: 934353-76-1), Brivanib alaninate (CAS No.: 649735-63-7), TG 100572 (CAS No.: 867334-05-2), BIBF 1120 (CAS No.: 656247-17-5), ENMD-2076 Tartrate (CAS No.: 1291074-87-7), TSU-68 (CAS No.: 252916-29-3), Ponatinib (CAS No.: 943319-70-8), Sulfatinib (CAS No.: 1308672-74-3), LY2784544 (CAS No.: 1229236-86-5), Dovitinib lactate (CAS No.: 692737-80-7), SU 5402 (CAS No.: 215543-92-3), FGF-401 (CAS No.: 1708971-55-4), Tyrosine kinase-IN-1 (CAS No.: 705946-27-6), PP58 (CAS No.: 212391-58-7), TG 100801 Hydrochloride (CAS No.: 1018069-81-2), Crenolanib (CAS No.: 670220-88-9), TG 100801 (CAS No.: 867331-82-6), Pazopanib Hydrochloride (CAS No.: 635702-64-6), Pazopanib (CAS No.: 444731-52-6), PD168393 (CAS No.: 194423-15-9), Apatinib (CAS No.: 1218779-75-9), Palbociclibisethionate (CAS No.: 827022-33-3), Foretinib (CAS No.: 849217-64-7), Lenvatinib (CAS No.: 417716-92-8), Tandutinib (CAS No.: 387867-13-2), 등 또는 그 염 (이들 화합물을, 화합물군 D 로 한다) 을 예시할 수 있다. 또, 이것들의 화합물은, FGFR1 저해 활성을 갖는 한, 바람직하게는 FGFR1 의 50 ％ 저해 농도 (IC₅₀) 가 100 nM 이하인 한, 상기에서 선택되는 1 또는 복수의 치환기를 갖고 있어도 된다.

또, 이들 화합물은, FGFR1 저해 활성을 갖는 한, 바람직하게는 FGFR1 의 50 ％ 저해 농도 (IC₅₀) 가 100 nM 이하인 한, 일부의 부분 구조 (치환기, 고리 등) 가 변환되어 있어도 된다.

바람직하게는, 본 발명에 있어서 FGFR1 저해제는, CAS192705-79-6 (1-[2-아미노-6-(3,5-디메톡시페닐)-피리도(2,3-d)피리미딘-7-일]-3-tert-부틸우레아 : CAS No.: 192705-79-6), E-3810 (CAS No.: 1058137-23-7), PD173074 (CAS No.: 219580-11-7) 이다.

FGFR1 저해제는 상기에 나타낸 화합물에 한정되는 것은 아니고, FGFR1 의 mRNA 에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드나 siRNA, FGFR1 에 결합하는 항체, 도미넌트 네거티브 FGFR1 변이체 등도 FGFR1 저해제로서 사용할 수 있고, 상업적으로 입수 가능하거나 공지된 방법에 의해서 합성할 수 있다.

본 명세서에 있어서,「마커」란,「마커 단백질」,「마커 유전자」등, 소정의 세포형에 의해서 특이적으로 발현되는 세포 항원 또는 그 유전자를 의미한다. 바람직하게는, 마커는 세포 표면 마커이고, 그 경우, 생존 세포의 농축, 단리, 및/또는 검출을 실시할 수 있게 된다. 마커는, 양성 선택 마커, 또는 음성 선택 마커일 수 있다.

마커 단백질의 검출은, 당해 마커 단백질에 특이적 항체를 사용한 면역학적 어세이, 예를 들어, ELISA, 면역 염색, 플로사이트메트리를 이용하여 행할 수 있다. 마커 유전자의 검출은, 당해 분야에서 공지된 핵산 증폭 방법 및/또는 핵산 검출 방법, 예를 들어, RT-PCR, 마이크로어레이, 바이오칩 등을 이용하여 행할 수 있다. 본 명세서 중에 있어서, 마커 단백질이「양성」이라는 것은, 플로사이트메트리에서 양성으로 검출되는 것을 의미하고,「음성」이라는 것은, 플로사이트메트리에서 검출 한계 이하인 것을 의미한다. 또, 마커 유전자가「양성」이라는 것은, RT-PCR 에 의해서 검출되는 것을 의미하고,「음성」이라는 것은 RT-PCR 에서 검출 한계 이하인 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서,「발현 (expression)」이란, 세포 내의 프로모터에 의해서 구동되는 특정한 뉴클레오티드 배열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.

본 명세서에 있어서,「세포」란 특기하지 않는 한, 세포의 조성물, 즉 세포 집단을 의미한다. 따라서,「세포」에는 특정한 세포뿐만 아니라, 1 또는 복수의 별도의 세포도 포함될 수 있다. 「세포」에 있어서의 특정한 세포는, 부화 또는 순화함으로써, 혹은 1 또는 복수의 별도의 세포를 고갈시킴으로써 높일 수 있다.

또, 본 명세서에 있어서,「세포」는, 인간 세포가 바람직하다.

2. 다능성 줄기 세포 유래의 세포와 생체 적합성 재료를 포함하는 조성물

2-1. 다능성 줄기 세포 유래의 세포

본 명세서에 있어서,「다능성 (pluripotency)」이란, 다양하고 상이한 형태나 기능을 갖는 조직이나 세포로 분화할 수 있고, 3 배엽의 어느 계통의 세포로도 분화할 수 있는 능력을 의미한다. 「다능성 (pluripotency)」은, 배반 (胚盤) 으로는 분화할 수 없고, 따라서 개체를 형성할 능력이 없다는 점에서, 배반을 포함시켜, 생체의 모든 조직으로 분화할 수 있는「전능성 (totipotency)」과는 구별된다.

본 명세서에 있어서「다능성 (multipotency)」이란, 복수의 한정적인 수의 계통의 세포로 분화할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 간엽계 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포는 multipotent 이지만, pluripotent 는 아니다.

본 명세서에 있어서,「다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)」란, 배성 줄기 세포 (ES 세포) 및 이것과 동일한 분화 다능성, 즉 생체의 다양한 조직 (내배엽, 중배엽, 외배엽의 모두) 으로 분화하는 능력을 잠재적으로 갖는 세포를 가리킨다. ES 세포와 동일한 분화 다능성을 갖는 세포로는,「인공 다능성 줄기 세포」(본 명세서 중,「iPS 세포」라고 칭하기도 한다) 를 들 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서, 다능성 줄기 세포란 인간 다능성 줄기 세포이다.

「ES 세포」로는, 마우스 ES 세포이면, inGenious 사, 리켄 (理硏) 등이 수립한 각종 마우스 ES 세포주가 이용 가능하고, 인간 ES 세포이면, NIH, 리켄, 쿄토 대학, Cellartis 사가 수립한 각종 인간 ES 세포주가 이용 가능하다. 예를 들어, ES 세포주로는, NIH 의 CHB-1 ∼ CHB-12 주, RUES1 주, RUES2 주, HUES1 ∼ HUES28 주 등, WisCell Research 의 H1 주, H9 주, 리켄의 KhES-1 주, KhES-2 주, KhES-3 주, KhES-4 주, KhES-5 주, SSES1 주, SSES2 주, SSES3 주 등을 이용할 수 있다.

「인공 다능성 줄기 세포」란, 포유 동물 체세포 또는 미분화 줄기 세포에, 특정한 인자 (핵 초기화 인자) 를 도입하여 재프로그래밍함으로써 얻어지는 세포를 가리킨다. 현재,「인공 다능성 줄기 세포」에는 여러 가지가 있고, 야마나카 등에 의해서, 마우스 선유아 세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 의 4 인자를 도입함으로써, 수립된 iPS 세포 (Takahashi K., Yamanaka S., Cell, (2006) 126 : 663-676) 외에, 동일한 4 인자를 인간 선유아 세포에 도입하여 수립된 인간 세포 유래의 iPS 세포 (Takahashi K., Yamanaka S., et al., Cell, (2007) 131 : 861-872.), 상기 4 인자 도입 후, Nanog 의 발현을 지표로 하여 선별하고, 수립한 Nanog-iPS 세포 (Okita K., Ichisaka T., and Yamanaka S., (2007). Nature 448, 313-317.), c-Myc 를 포함하지 않는 방법으로 제작된 iPS 세포 (Nakagawa M., Yamanaka S., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106)), 바이러스 프리로 6 인자를 도입하여 수립된 iPS 세포 (Okita K., et al., Nat. Methods 2011 May ; 8 (5) : 409-12, Okita K., et al., Stem Cells. 31 (3) : 458-66.) 도 사용할 수 있다. 또, Thomson 등에 의해서 제작된 OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28 의 4 인자를 도입하여 수립된 인공 다능성 줄기 세포 (Yu J., Thomson JA., et al., Science (2007) 318 : 1917-1920.), Daley 등에 의해서 제작된 인공 다능성 줄기 세포 (Park IH., Daley GQ., et al., Nature (2007) 451 : 141-146), 사쿠라다 등에 의해서 제작된 인공 다능성 줄기 세포 (일본 공개특허공보 2008-307007호) 등도 사용할 수 있다.

이 밖에, 공개되어 있는 모든 논문 (예를 들어, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue5, 568-574 ; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650 ; Huangfu D., Melton DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No7, 795-797), 혹은 특허 (예를 들어, 일본 공개특허공보 2008-307007호, 일본 공개특허공보 2008-283972호, US2008/2336610, US2009/047263, WO2007/069666, WO2008/118220, WO2008/124133, WO2008/151058, WO2009/006930, WO2009/006997, WO2009/007852) 에 기재되어 있는 당해 분야에서 공지된 인공 다능성 줄기 세포의 모두 사용할 수 있다.

인공 다능성 세포주로는, NIH, 리켄 (리켄), 쿄토 대학 등이 수립한 각종 iPS 세포주가 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 iPS 세포주이면, 리켄의 HiPS-RIKEN-1A 주, HiPS-RIKEN-2A 주, HiPS-RIKEN-12A 주, Nips-B2 주, 쿄토 대학의 Ff-WJ-18 주, Ff-I01s01 주, Ff-I01s02 주, Ff-I01s04 주, Ff-I01s06 주, Ff-I14s03 주, Ff-I14s04 주, QHJI01s01 주, QHJI01s04 주, QHJI14s03 주, QHJI14s04 주, RWMH15s02 주, Ff-MH15s02 주, 253G1 주, 201B7 주, 409B2 주, 454E2 주, 606A1 주, 610B1 주, 648A1 주, CDI 사의 MyCell iPS Cells (21525. 102. 10A) 주, MyCell iPS Cells (21526. 101. 10A) 주 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서,「다능성 줄기 세포 유래의 세포」란, 다능성 줄기 세포에서 분화 유도되어 얻어진 세포를 의미하고, 이와 같은 세포로는, 다능성 줄기 세포에서 분화 유도된 외배엽 계통의 세포, 중배엽 계통의 세포, 혹은 내배엽 계통의 세포, 또는 그것들의 조합으로 이루어지는 세포를 들 수 있다. 보다 상세하게는, 다능성 줄기 세포에서 분화 유도된, 표피, 신경, 뇌, 척수, 식도, 위, 소장, 대장, 방광, 요도, 폐, 갑상선, 췌장, 간장, 근육, 골격, 심장, 혈관, 비장, 신장 등 (이것들에 한정되지는 않는다) 의 기관이나 조직을 구성하는 세포나 그 전구 세포와 동등하거나 또는 유사한 기능을 갖는 세포를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명에 있어서「다능성 줄기 세포 유래의 세포」는, 세포끼리가 집합·응집화된 세포 집합체 상태, 즉 스페로이드의 형태를 갖는다. 다능성 줄기 세포 유래의 세포의 스페로이드는 부유 배양 등의 종래 공지된 수법에 의해서 제작하는 것이 가능하거나, 혹은, 배양 바닥면에 미세 공간이 배치된 스페로이드 형성용의 배양 플레이트 (예를 들어, 상품명 : 엘플라시아 (주식회사 쿠라레), 상품명 : EZSPHERE (AGC 테크노 글래스 주식회사), 상품명 : Corning 스페로이드 마이크로 플레이트 (코닝 인터네셔널 주식회사) 를 사용해도 된다. 스페로이드는 직경이 약 10 ㎛ ∼ 1000 ㎛, 바람직하게는 약 50 ㎛ ∼ 500 ㎛, 보다 바람직하게는 약 50 ㎛ ∼ 300 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 50 ㎛ ∼ 200 ㎛ 정도의 크기를 갖는다. 그리고/혹은, 스페로이드는 약 100 ∼ 약 1000 개, 바람직하게는 약 200 ∼ 약 800 개, 보다 바람직하게는 약 300 개 ∼ 약 500 개 정도의 세포로 이루어진다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서「다능성 줄기 세포 유래의 세포」는, 다능성 줄기 세포로부터 췌 β 세포로 분화되는 과정에서 출현하는, 배체 내배엽 세포, 원(原)장관 세포, 후방 전장 세포, 췌 전구 세포, 내분비 전구 세포, 인슐린 산생 세포이고, 특히 바람직하게는 인슐린 산생 세포이다.

다능성 줄기 세포로부터 췌 β 세포로 분화하는 과정에 있어서는, 분화 단계에 따라서 상이한 특징을 갖는 세포가 출현하는 것이 알려져 있다 (WO2009/012428, WO2016/021734). 예를 들어, 이 분화 단계는 비교적 미분화된 순으로, 다능성 줄기 세포, 배체 내배엽 세포, 원장관 세포, 후방 전장 세포, 췌 전구 세포, 내분비 전구 세포, 인슐린 산생 세포, 췌 β 세포로 크게 분류할 수 있다.

「배체 내배엽 세포」란, SOX17, FOXA2, BMP2, CER, 및 CXCR4 중 적어도 하나의 마커의 발현에 의해서 특징지어지는 세포를 의미한다.

「원장관 세포」란, HNF1B, 및 HNF4A 중 적어도 하나의 마커의 발현에 의해서 특징지어지는 세포를 의미한다.

「후방 전장 세포」란, PDX-1, HNF6, 및 HLXB9 중 적어도 하나의 마커의 발현에 의해서 특징지어지는 세포를 의미한다.

「췌 전구 세포」란, PDX-1, NKX6.1, PTF-1α, GATA4 및 SOX9 중 적어도 하나의 마커의 발현에 의해서 특징지어지는 세포를 의미한다.

「내분비 전구 세포」란, 크로모그라닌 A, NeuroD 및 NGN3 중 적어도 하나의 마커의 발현, 및 췌 관련의 호르몬계 (예를 들어, 인슐린 등) 의 마커가 발현되어 있지 않음으로써 특징지어지는 세포를 의미한다. 내분비 전구 세포는, PAX-4, NKX2-2, Islet-1, PDX-1, PTF-1α 등의 마커가 발현되어 있어도 된다.

「인슐린 산생 세포」는, 인슐린의 마커의 발현에 의해서 특징지어지는 세포를 의미한다. 보다 상세하게는,「인슐린 산생 세포」는, 인슐린 및 NKX6.1 의 양방의 마커를 발현하는 세포 (즉, 인슐린 양성이며 또한 NKX6.1 양성의 세포 이하,「Ins＋NKX＋ 세포」로 기재한다) 를 약 30 ％ 이상의 비율로 포함하며, 또한 마커로서 인슐린 및 NKX6.1 중 인슐린만을 발현하는 세포 (즉, 인슐린 양성이며 또한 NKX6.1 음성의 세포, 이하,「Ins＋NKX- 세포」로 기재한다) 를 약 15 ％ 초과의 비율로 포함함으로써 특징지어진다. 인슐린 산생 세포에 있어서의,「Ins＋NKX＋ 세포」의 비율의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 50 ％ 이하로 할 수 있다.

인슐린 산생 세포에 있어서의, Ins＋NKX- 세포의 비율은 바람직하게는 약 20 ％ 이상, 보다 바람직하게는 약 25 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 30 ％ 이상으로 할 수 있다. 또, 인슐린 산생 세포에 있어서의, Ins＋NKX- 세포의 비율의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 40 ％ 이하로 할 수 있다.

예를 들어, 인슐린 산생 세포는, Ins＋NKX＋ 세포를 약 30 ％ 이상, 약 50 ％ 이하의 비율로 포함하며, 또한 Ins＋NKX- 세포를 약 15 ％ 초과, 약 40 ％ 이하의 비율, 바람직하게는, 약 20 ％ 이상, 약 40 ％ 이하의 비율, 보다 바람직하게는 약 25 ％ 이상, 약 40 ％ 이하의 비율, 더욱 바람직하게는 약 30 ％ 이상, 약 40 ％ 이하의 비율로 포함한다.

또한, 본 명세서 중, 인슐린 산생 세포에 있어서의 소정의 세포의 비율이란, 인슐린 산생 세포에 포함되는 전체 세포수에 대한 비율을 의미한다. 또, 각 세포의 비율은, 췌도형 세포로의 분화 유도에 부쳐지는 (즉, 생체 내로의 이식에 부쳐지는) 인슐린 산생 세포에 있어서의 값을 나타낸다.

Ins＋NKX- 세포는, 성숙하지 않은 (분화 단계가 빠른) 인슐린 산생 세포에서 많이 보여지는 점에서, Ins＋NKX- 세포의 비율이 높을수록, 보다 성숙하지 않은 (분화 단계가 빠른) 인슐린 산생 세포인 것을 나타낸다.

인슐린 산생 세포는 추가로, 아래의 a. ∼ f. :

a. MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량이 낮은 것,

b. Ki67 양성 세포의 비율이 낮은 것,

c. 글루카곤 양성이며 또한 인슐린 음성 세포의 비율이 낮은 것,

d. 글루코오스 자극성 인슐린 분비 응답을 나타내는 것,

e. 크로모그라닌 A 양성 세포의 비율이 높은 것,

f. 알칼리 포스파타아제 양성의 다능성 줄기 세포의 비율이 낮은 것,

에서 선택되는 1 또는 복수에 의해서 특징지을 수 있다. 여기에서「복수」란, 2, 3, 4, 5 또는 6 을 의미한다.

a. MAFA 유전자 또는 그 유전자 산물의 발현량이 낮은 것

본 발명에 있어서의 인슐린 산생 세포는, MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량이, 췌도에 있어서의 MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량과 비교해서 낮은 것을 특징으로 한다.

「췌도」란, 인슐린 산생 세포보다 분화 단계가 진행된 세포를 의미하고, 성숙한 췌 β 세포를 포함하며, 성숙한 췌 β 세포의 마커인 MAFA, UCN3, 및 IAPP 중 적어도 하나의 발현에 의해서 특징지어지는 세포이다. 췌도는, 정상인으로부터 단리된 것을 사용할 수 있다.

인슐린 산생 세포와 췌도간의 MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량의 비교는, 당해 분야에서 공지된 수법을 사용하여 행할 수 있고, 예를 들어, RT-PCR, 마이크로어레이, 바이오칩, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역 염색, 플로사이트메트리 등의 수법을 이용하여 검출·정량된 MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량을, 내부 표준 유전자 또는 그 단백질의 발현량으로 보정하여 얻어진 상대치를 비교함으로써 행할 수 있다. 「내부 표준 유전자」는 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), β-액틴, β2-마이크로 글로불린, HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase1) 등을 이용할 수 있다.

인슐린 산생 세포에 있어서의 MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량은, 췌도에 있어서의 MAFA 유전자 또는 그 단백질의 발현량의 약 20 ％ 이하, 바람직하게는 약 15 ％ 이하, 보다 바람직하게는 약 10 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 ％ 이하, 특히 바람직하게는 약 1 ％ 이하이다.

MAFA 유전자 또는 그 단백질은 성숙한 췌 β 세포의 마커인 점에서, 본 특징은 본 발명의 인슐린 산생 세포가, 성숙한 췌 β 세포를 거의 포함하지 않거나, 낮은 비율로 포함하는 정도의 분화 단계에 있는 것을 나타낸다.

b. Ki67 양성 세포의 비율이 낮은 것

본 발명에 있어서의 인슐린 산생 세포는, Ki67 양성 세포를 3 ％ 미만의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다.

「Ki67 양성 세포」란, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 인슐린 산생 세포 중에 혼재하는, 마커로서 Ki67 의 발현에 의해서 특징지어지는 증식성이 높은 세포를 의미한다. 「Ki67」는 세포 주기 관련 핵 단백질로서 공지되어 있고, 증식 중인 세포의 G1 기, S 기, G2 기, M 기에서 발현이 확인되고, 증식을 휴지하고 있는 G0 기에서는 발현이 확인되지 않기 때문에, 세포 증식과 세포 주기의 마커로도 알려져 있다.

이하, 본 명세서 중에 있어서「Ki67 양성」을「Ki67＋」로 기재하는 경우가 있다. 또,「Ki67 양성 세포」를「Ki67＋ 세포」로 기재하는 경우가 있다.

인슐린 산생 세포에 있어서의 Ki67＋ 세포의 비율은, 약 3 ％ 미만, 바람직하게는 약 1 ％ 미만, 보다 바람직하게는 약 0.8 ％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.5 ％ 미만이다.

본 특징은 인슐린 산생 세포에 있어서, Ki67＋ 세포의 혼입·잔존이 거의 없거나, 낮은 비율인 것을 나타낸다. Ki67＋ 세포는 그 증식성이 높은 점에서, 최종적으로 얻어지는 생체 조직형 구조체에 대한 악영향이나 생착에 영향을 미칠 우려가 있어, 그 혼입·잔존은 바람직하지 않은 경우가 있다.

c. 글루카곤 양성이며 또한 인슐린 음성 세포의 비율이 낮은 것

본 발명에 있어서의 인슐린 산생 세포는, 글루카곤 양성이며 또한 Ins- 세포를 3 ％ 미만의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다. 이하, 본 명세서 중에 있어서「글루카곤 양성」을「Gcg＋」로 기재하는 경우가 있다. 또,「글루카곤 양성이며 또한 인슐린 음성 세포」를「Gcg＋Ins- 세포」로 기재하는 경우가 있다.

인슐린 산생 세포에 있어서의 Gcg＋Ins- 세포의 비율은, 약 2.5 ％ 이하, 바람직하게는 약 2 ％ 이하, 보다 바람직하게는 약 1 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.5 ％ 이하이다.

Gcg＋Ins- 는 성숙한 췌 α 세포의 마커인 점에서, 본 특징은 본 발명의 인슐린 산생 세포가, 성숙한 췌 α 세포를 거의 포함하지 않거나, 낮은 비율로 포함하는 정도의 분화 단계에 있는 것을 나타낸다.

d. 글루코오스 자극성 인슐린 분비 응답을 나타내는 것

본 발명에 있어서의 인슐린 산생 세포는, 글루코오스 자극성 인슐린 분비 (GSIS : Glucose Stimulated Insulin Secretion) 응답을 나타낸다.

인슐린 산생 세포에 있어서의 GSIS 응답은, 종래 공지된 수법 (예를 들어, 미국 출원 제11/773,944호) 에 준하여 행할 수 있고, 예를 들어, 배지 중에 분비되는 C-펩티드의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. C-펩티드는, 프로 인슐린의 성숙화 동안에, 인슐린에 대해서 등몰량으로 산생되는 분해 산물이다. C-펩티드의 양을 측정하는 것은, 예를 들어, 항 C-펩티드모노클로널 항체를 사용한 ELISA 에 의해서 행할 수 있다.

e. 크로모그라닌 A 양성 세포의 비율이 높은 것

본 발명에 있어서의 인슐린 산생 세포는, 크로모그라닌 A 양성 세포를 약 45 ％ 초과의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 명세서 중에 있어서「크로모그라닌 A 양성」을「Chga＋」로 기재하는 경우가 있다. 또,「크로모그라닌 A 양성 세포」를「Chga＋ 세포」로 기재하는 경우가 있다.

인슐린 산생 세포에 있어서의, Chga＋ 세포의 비율은 바람직하게는 약 50 ％ 이상 (예를 들어, 약 55 ％ 이상), 보다 바람직하게는 약 60 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 70 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 80 ％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90 ％ 이상으로 할 수 있다. 인슐린 산생 세포에 있어서의 Chga＋ 세포의 비율의 상한은 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어, 약 99 ％ 이하로 할 수 있다.

Chga＋ 세포에는 인슐린 등의 호르몬을 분비하는 세포 (내분비 세포) 가 포함되고, 이것에는 상기 Ins＋NKX＋ 세포나 Ins＋NKX- 세포도 포함된다. 따라서, 본 특징은 본 발명의 인슐린 산생 세포가, 내분비 세포를 높은 비율로 포함하는 것을 나타낸다.

f. 알칼리 포스파타아제 양성의 다능성 줄기 세포의 비율이 낮은 것

본 발명에 있어서의 인슐린 산생 세포는, 알칼리 포스파타아제 양성의 다능성 줄기 세포를 약 0.01 ％ 미만의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다.

인슐린 산생 세포에 있어서의, 알칼리 포스파타아제 양성의 다능성 줄기 세포의 비율은 바람직하게는 약 0.008 ％ 이하, 보다 바람직하게는 약 0.005 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.001 ％ 이하로 할 수 있다.

알칼리 포스파타아제는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 나타내는 마커인 점에서, 본 특징은 본 발명의 인슐린 산생 세포가, 분화 유도되어 있지 않은 목적 외의 다능성 줄기 세포를 거의 포함하지 않거나, 낮은 비율로 포함하는 것을 나타낸다.

알칼리 포스파타아제 양성의 다능성 줄기 세포는, 다능성을 나타내는 다른 마커를 더욱 발현하고 있어도 된다. 다능성 줄기 세포의 다능성을 나타내는 다른 마커로는, NANOG, SOX2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 등에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있다.

다능성 줄기 세포로부터 배체 내배엽 세포, 원장관 세포, 후방 전장 세포, 췌 전구 세포, 내분비 전구 세포, 및 인슐린 산생 세포로의 분화 유도는, 이하의 분화 유도 공정을 이용하여 행할 수 있다 :

공정 1) 다능성 줄기 세포로부터 배체 내배엽 세포로 분화 유도한다 ;

공정 2) 배체 내배엽 세포로부터 원장관 세포로 분화 유도한다 ;

공정 3) 원장관 세포로부터 후방 전장 세포로 분화 유도한다 ;

공정 4) 후방 전장 세포로부터 췌 전구 세포로 분화 유도한다 ;

공정 5) 췌 전구 세포로부터 내분비 전구 세포로 분화 유도한다 ;

공정 6) 내분비 전구 세포로부터 인슐린 산생 세포로 분화 유도한다.

이하, 각 공정을 설명하지만, 각 세포로의 분화 유도는 이들 수법에 한정되지 않는다.

공정 1) 배체 내배엽 세포로의 분화

다능성 줄기 세포는, 저용량의 액티빈 A 를 포함하는 배지 중에서 배양하여, 배체 내배엽 세포로 분화시킨다.

본 공정에서 사용하는 배지로는, RPMI 배지, MEM 배지, iMEM 배지, DMEM (둘베코 개변 이글 배지) 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, Improved MEM/1 ％ B-27 서플리먼트/페니실린 스트렙토마이신 배지, MCDB131/10 mM 글루코오스/20 mM 글루코오스/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/아스코르브산/페니실린 스트렙토마이신 배지 등, 포유류 세포의 배양에 사용되는 기본 배지를 사용할 수 있다.

액티빈 A 는 배지 중에 저용량으로, 예를 들어, 5 ∼ 10 ng/㎖ 의 양으로 포함시킬 수 있다.

별도의 양태로서, 액티빈 A 의 배지 중의 농도는, 약 0.1 ∼ 100 ng/㎖, 바람직하게는 약 1 ∼ 50 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 3 ∼ 10 ng/㎖이다.

배지에는, 추가로 ROCK 저해제, GSK3β 저해제를 첨가할 수 있다.

GSK3β 저해제의 배지 중의 농도는, 사용하는 GSK3β 저해제의 종류에 따라서 적절히 설정되고, 예를 들어 GSK3β 저해제로서 CHIR99021 을 사용하는 경우의 농도는, 통상적으로 2 ∼ 5 μM, 바람직하게는 2 ∼ 4 μM, 특히 바람직하게는 약 3 μM 이다.

ROCK 저해제의 배지 중의 농도는, 사용하는 ROCK 저해제의 종류에 따라서 적절히 설정되는데, 예를 들어 ROCK 저해제로서 Y27632 를 사용하는 경우의 농도는, 통상적으로 5 ∼ 20 μM, 바람직하게는 5 ∼ 15 μM, 특히 바람직하게는 약 10 μM 이다.

배지에는, 추가로 인슐린을 첨가할 수 있다. 인슐린은 배지 중에 0.01 ∼ 20 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 5 μM 의 양으로 포함시킬 수 있다. 배지 중의 인슐린의 농도는, 첨가한 B-27 서플리먼트에 포함되는 인슐린의 농도여도 되지만, 이것에 한정되지 않는다.

배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 배양 개시시의 세포수는, 특별히 한정되지 않지만, 2 차원 배양이면, 약 5 만 ∼ 100 만 세포 개/㎠, 바람직하게는 약 10 만 ∼ 80 만 세포 개/㎠, 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 30 만 세포 개/㎠ 로 할 수 있다. 또, 배양 개시시의 세포수는, 특별히 한정되지 않지만, 3 차원 배양이면, 약 1 만 ∼ 100 만 세포 개/㎖, 바람직하게는 약 10 만 ∼ 80 만 세포 개/㎖, 보다 바람직하게는 약 30 만 ∼ 60 만 세포 개/㎖ 로 할 수 있다. 배양 기간은 1 일 ∼ 4 일, 바람직하게는 1 일 ∼ 3 일, 특히 바람직하게는 3 일이다.

배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 행한다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는, 예를 들어 5 ％ 정도이다.

혹은, 본 발명에 있어서 배체 내배엽 세포는, 저용량의 액티빈 A 의 존재 하, 다능성 줄기 세포를, 인슐린이 작용하는 조건 하의 배지 중에서 제 1 배양을 행하고, 계속해서, 인슐린이 작용하지 않는 조건 하의 배지 중에서 제 2 배양을 행함으로써 제조할 수 있다.

(1) 제 1 배양

「인슐린이 작용하는 조건」이란, 인슐린에 의해서 세포에 있어서의 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키는 조건을 의미한다. 통상적으로, 인슐린은, 세포막 표면 상에 존재하는 인슐린 리셉터와 결합하고, 리셉터에 내재하는 티로신 키나아제를 활성화시켜, 인슐린 리셉터 기질 단백 패밀리 (IRS : IRS-1, 2, 3) 를 티로신 인산화한다. 본 명세서에 있어서는, 인슐린과 인슐린 리셉터의 결합에 의해서 개시되는 이들 일련의 반응이 일어나는 것을,「인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으킨다」고 한다.

인슐린이 작용하는 조건으로는, 예를 들어, 배지 중에 인슐린을 포함하는 경우를 들 수 있다. 인슐린은, 다능성 줄기 세포에 있어서의 인슐린 시그널 전달 경로를 활성화할 수 있는 것이면 되고, 재조합법으로 제조한 것이어도 되며, 고상 합성법으로 합성하여 제조한 것이어도 된다. 인슐린은, 인간, 비인간 영장류, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 라마, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 모르모트 등에서 유래하는 것을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 인간 인슐린이다.

본 발명에 있어서는, 다능성 줄기 세포에 있어서의 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키는 한, 인슐린 변이체, 인슐린 유도체 또는 인슐린 아고니스트도「인슐린」으로서 사용할 수 있다. 「인슐린 변이체」란, 인슐린의 아미노산 배열에 있어서 1 ∼ 20 개, 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개의 아미노산이 결손, 치환, 부가 혹은 삽입된 아미노산 배열로 이루어지며, 또한 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키는 것이 가능한 폴리펩티드나, 인슐린의 아미노산 배열과 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지며, 또한 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키는 것이 가능한 폴리펩티드를 갖는 것을 들 수 있다. 아미노산 배열의 비교는 공지된 수법에 의해서 행할 수 있고, 예를 들어, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (미국 국립 생물학 정보 센터의 기본 로컬 얼라이먼트 검색 툴)) 등을, 예를 들어, 디폴트의 설정으로 사용하여 행할 수 있다. 「인슐린 유도체」란, 인슐린 또는 인슐린 변이체의 아미노산 잔기의 일부의 기가 화학적으로 치환 (예를 들어, α-메틸화, α-하이드록실화), 결손 (예를 들어, 탈아미노화), 또는 수식 (예를 들어, N-메틸화) 된 아미노산 배열로 이루어지며, 또한 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키는 것이 가능한 폴리펩티드 또는 동일한 작용을 갖는 물질을 의미한다. 「인슐린 아고니스트」란, 인슐린의 구조와 관계없이, 인슐린 리셉터와 결합하여 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키는 것이 가능한 폴리펩티드 또는 동일한 작용을 갖는 물질을 의미한다.

제 1 배양의 배지에는, 인슐린을 0.01 ∼ 20 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 5 μM 의 양으로 포함시킬 수 있다. 배지 중의 인슐린의 농도는, 첨가된 B-27 서플리먼트에 포함되는 인슐린의 농도여도 되지만, 이것에 한정되지 않는다.

배지에는, 추가로 ROCK 저해제, 및/또는 GSK3β 저해제를 포함시킬 수 있다. ROCK 저해제의 배지 중의 농도는, 사용하는 ROCK 저해제의 종류에 따라서 적절히 설정되는데, 예를 들어 ROCK 저해제로서 Y-27632 를 사용하는 경우의 농도는, 통상적으로 5 ∼ 20 μM, 바람직하게는 5 ∼ 15 μM, 특히 바람직하게는 약 10 μM 로 할 수 있다. GSK3β 저해제의 배지 중의 농도는, 사용하는 GSK3β 저해제의 종류에 따라서 적절히 설정되고, 예를 들어 GSK3β 저해제로서 CHIR99021 을 사용하는 경우의 농도는, 통상적으로 2 ∼ 5 μM, 바람직하게는 2 ∼ 4 μM, 특히 바람직하게는 약 3 μM 로 할 수 있다.

배지에는, 추가로 피루브산염 (나트륨염 등), L-알라닐 L-글루타민, 및 글루코오스로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상을 포함시킬 수 있다. 피루브산염은 배지 중에, 10 ∼ 1000 ㎎/ℓ, 바람직하게는 30 ∼ 500 ㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 50 ∼ 200 ㎎/ℓ, 특히 바람직하게는 약 110 ㎎/ℓ 의 양으로 포함시킬 수 있다. L-알라닐 L-글루타민은 배지 중에, 50 ∼ 2000 ㎎/ℓ, 바람직하게는 100 ∼ 1500 ㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 500 ∼ 1000 ㎎/ℓ, 특히 바람직하게는 약 860 ㎎/ℓ 의 양으로 포함시킬 수 있다. 글루코오스는 배지 중에, 15 mM 이상, 바람직하게는 15 ∼ 30 mM, 보다 바람직하게는 15 ∼ 25 mM, 특히 바람직하게는 약 25 mM 의 양으로 포함시킬 수 있다. 배지 중의 피루브산염, L-알라닐 L-글루타민 및 글루코오스의 농도는, DMEM 배지 (DMEM, high glucose, GlutaMAXTM, pyruvate (Thermo Fisher Scientific)) 또는 그 밖의 DMEM 배지에 포함되는 피루브산염, L-알라닐 L-글루타민 및 글루코오스의 농도여도 되지만, 이것에 한정되지 않는다.

배지는, 상기 기본 배지를 베이스로 하여 상기 성분의 1 또는 그 이상을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 기본 배지로는, 바람직하게는 DMEM 배지이고, 보다 바람직하게는 피루브산염, L-알라닐 L-글루타민, 및 글루코오스를 상기한 양으로 포함하는 DMEM 배지이다.

제 1 배양의 배양 기간은 6 시간 ∼ 48 시간, 바람직하게는 12 ∼ 24 시간에서 선택되는 범위로 할 수 있다. 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 행한다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는, 예를 들어 5 ％ 정도이다. 배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 배양 개시시의 세포수는, 특별히 한정되지 않지만, 2 차원 배양이면, 약 5 만 ∼ 100 만 세포 개/㎠, 바람직하게는 약 10 만 ∼ 80 만 세포 개/㎠, 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 30 만 세포 개/㎠ 로 할 수 있다. 또, 배양 개시시의 세포수는 특별히 한정되지 않지만, 3 차원 배양이면, 약 1 만 ∼ 100 만 세포 개/㎖, 바람직하게는 약 10 만 ∼ 80 만 세포 개/㎖, 보다 바람직하게는 약 30 만 ∼ 60 만 세포 개/㎖ 로 할 수 있다.

(2) 제 2 배양

「인슐린이 작용하지 않는 조건」이란, 인슐린에 의한 세포에 있어서의 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화가 일어나지 않는 조건을 의미한다. 「세포에 있어서의 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화를 일으키지 않는다」란, 당해 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화가 전혀 일어나지 않는 것을 의미할 뿐만 아니라, 인슐린 비존재 하에 있어서의 당해 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화와 비교해서 유의한 차가 확인되지 않을 정도의 미미한 활성화밖에 일어나지 않는 경우도 의미하는 것이다. 따라서,「인슐린이 작용하지 않는 조건」이란, 예를 들어, 배지 중에 인슐린이 포함되지 않는 것, 혹은, 배지 중에 인슐린이 포함되는 경우여도, 그 양이 상기 유의한 차가 확인되지 않을 정도의 미미한 활성화밖에 일어나지 않는 양으로 포함되는 조건이 들 수 있다. 혹은, 배지 중에 인슐린이 포함되는 경우여도, 함께 인슐린 시그널 저해제를 포함함으로써, 상기 인슐린 시그널 전달 경로의 활성화가 일어나지 않는 경우도 의미한다. 「인슐린 시그널 저해제」는, 인슐린 시그널 전달 경로를 어느 위치에서 차단하는 것이 가능한 성분을 의미한다. 이와 같은 인슐린 시그널 저해제로는, 인슐린, 인슐린 리셉터, 시그널 전달 물질로서 작용하는 각종 단백질 등에 결합되거나 또는 경합하고, 이들 인자가 관여하는 분자간의 상호 작용을 저해하는 폴리펩티드나 화합물 등을 들 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 인슐린 시그널 저해제로는, PI3 키나아제의 촉매 서브 유닛에 대한 ATP 결합을 경합 저해하는 LY294002 [2-(4-모르폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-온] 등을 들 수 있다. 인슐린 시그널 저해제는 이것들에 한정되는 것이 아니고, 인슐린, 인슐린 리셉터, 시그널 전달 물질로서 작용하는 각종 단백질에 결합하는 항체나 그것들의 도미넌트 네거티브형 변이체, 그리고 인슐린 리셉터나 시그널 전달 물질로서 작용하는 각종 단백질의 mRNA 에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드나 siRNA 등도 인슐린 시그널 저해제로서 사용할 수 있다. 인슐린 시그널 저해제는, 상업적으로 입수 가능하거나 공지된 방법에 따라서 합성할 수 있다.

배지에는, 추가로 ROCK 저해제, 및/또는 GSK3β 저해제를 포함시킬 수 있다. 배지 중의 ROCK 저해제, 및/또는 GSK3β 저해제의 양은 상기 제 1 배양에 있어서 기재한 범위에서 선택할 수 있고, 제 1 배양에서 사용되는 것과 동일한 양이어도 되고, 상이해도 된다.

배지에는, 추가로 피루브산염, L-알라닐 L-글루타민, 및 글루코오스로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상을 포함시킬 수 있다. 배지 중의 피루브산염, L-알라닐 L-글루타민, 및 글루코오스의 양은 상기 제 1 배양에 있어서 기재한 범위에서 선택할 수 있고, 제 1 배양에서 사용되는 것과 동일한 양이어도 되고, 상이해도 된다.

제 2 배양에서 사용하는 배지 배지는, 포유류 세포의 배양에 사용되는 기본 배지를 베이스로 하여 상기 성분의 1 또는 그 이상을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 기본 배지로는, 상기 제 1 배양에 있어서 기재한 것을 사용할 수 있고, 제 1 배양에서 사용되는 것과 동일한 기본 배지여도 되고, 상이해도 된다. 바람직하게는, DMEM 배지이고, 보다 바람직하게는 피루브산염, L-알라닐 L-글루타민, 및 글루코오스를 상기한 양으로 포함하는 DMEM 배지이다.

제 2 배양의 배양 기간은 적어도 6 시간, 바람직하게는 6 ∼ 72 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간 ∼ 72 시간에서 선택되는 범위로 할 수 있다. 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 행한다. 배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는, 예를 들어 5 ％ 정도이다.

제 1 배양 및 제 2 배양의 배지에는, 액티빈 A 를 상기 저용량으로 포함시킬 수 있다. 제 1 배양 및 제 2 배양의 배지에 포함되는 액티빈 A 의 양은 동일한 양이어도 되고, 상이해도 된다.

제 1 배양 및 제 2 배양의 배지에는, 추가로 디메틸술폭시드를 첨가해도 된다.

다능성 줄기 세포를, 저용량의 액티빈 A 의 존재 하에서 배양을 행함으로써, 혹은, 다능성 줄기 세포를, 저용량의 액티빈 A 의 존재 하, 인슐린이 작용하는 조건 하의 배지 중에서 제 1 배양을 행하고, 계속해서, 인슐린이 작용하지 않는 조건 하의 배지 중에서 제 2 배양을 행함으로써, 공정 6) 이후에서 얻어지는 내분비 세포의 비율을 높일 수 있다.

공정 2) 원장관 세포로의 분화

공정 1) 에서 얻어진 배체 내배엽 세포를, 추가로 증식 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 원장관 세포로 분화 유도한다. 배양 기간은 2 일 ∼ 8 일, 바람직하게는 약 4 일이다.

배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 행한다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는, 예를 들어 5 ％ 정도이다. 배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다.

배지는, 상기 공정 1) 에서 기재되는, 포유류 세포의 배양에 사용되는 기본 배지를 사용할 수 있다. 배지에는, 증식 인자 외에, 혈청 대체물, 비타민, 항생 물질 등을 적절히 첨가해도 된다.

증식 인자로는, EGF, KGF, FGF10 이 바람직하고, EGF 및/또는 KGF 가 보다 바람직하며, KGF 가 더욱 바람직하다.

증식 인자의 배지 중의 농도는, 사용하는 증식 인자의 종류에 따라서 적절히 설정되는데, 통상적으로 약 0.1 nM ∼ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ∼ 100 μM 이다. EGF 의 경우, 그 농도는, 약 5 ∼ 2000 ng/㎖ (즉, 약 0.8 ∼ 320 nM), 바람직하게는 약 5 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 0.8 ∼ 160 nM), 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 1.6 ∼ 160 nM) 이다. FGF10 의 경우, 그 농도는, 약 5 ∼ 2000 ng/㎖ (즉, 약 0.3 ∼ 116 nM), 바람직하게는 약 10 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 0.6 ∼ 58 nM), 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 0.6 ∼ 58 nM) 이다. 예를 들어 증식 인자로서 KGF 를 사용하는 경우의 농도는, 통상적으로 5 ∼ 150 ng/㎖, 바람직하게는 30 ∼ 100 ng/㎖, 특히 바람직하게는 약 50 ng/㎖ 이다.

공정 3) 후방 전장 세포로의 분화

공정 2) 에서 얻어진 원장관 세포를, 추가로 증식 인자, 시클로파민, 노긴 등을 포함하는 배지에서 배양하여, 후방 전장 세포로 분화 유도한다. 배양 기간은 1 일 ∼ 5 일, 바람직하게는 약 2 일 정도이다. 배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다.

시클로파민의 배지 중의 농도는, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 통상적으로 0.5 ∼ 1.5 μM, 바람직하게는 0.3 ∼ 1.0 μM, 특히 바람직하게는 약 0.5 μM 이다.

노긴의 배지 중의 농도는, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 통상적으로 10 ∼ 200 ng/㎖, 바람직하게는 50 ∼ 150 ng/㎖, 특히 바람직하게는 약 100 ng/㎖ 이다.

또 배지에는 디메틸술폭시드를 첨가해도 된다.

공정 4) 췌 전구 세포로의 분화

공정 3) 에서 얻어진 후방 전장 세포를, 추가로 CDK8/19 저해 활성을 갖는 인자를 포함하는 배지, 바람직하게는 CDK8/19 저해 활성을 갖는 인자와 증식 인자를 포함하는 배지에서 배양하여, 췌 전구 세포로 분화 유도해도 된다. 배양 기간은 2 일 ∼ 10 일, 바람직하게는 약 5 일 정도이다. 배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 2 차원 배양의 경우에는, 공정 3) 에서 얻어진 후방 전장 세포를, 기보 (旣報) (Toyoda et al., Stem cell Research (2015) 14, 185-197) 에 따라서, 0.25 ％ 트립신-EDTA 로 처리 후에 피펫팅함으로써 분산하고, 0.25 ％ 트립신-EDTA 를 원심 분리하여 현탁한 후, 공정 4) 의 새로운 배지에 재파종한다.

배지는, 공정 1) 과 마찬가지로, 포유류 세포의 배양에 사용되는 기본 배지를 사용할 수 있다. 배지에는, 증식 인자 외에, 혈청 대체물, 비타민, 항생 물질 등을 적절히 첨가해도 된다.

CDK8/19 저해 활성을 갖는 인자로는, 전술한 각종 화합물 또는 그 염을 사용할 수 있고, 사용하는 화합물 또는 그 염에 따라서, 배지에의 첨가량은 적절히 결정되지만, 통상적으로 약 0.00001 μM - 5 μM, 바람직하게는 0.00001 μM - 1 μM 이다. CDK8/19 저해 활성을 갖는 인자의 배지 중의 농도로는, CDK8/19 에 대해서 50 ％ 이상의 저해 활성에 달하는 농도가 바람직하다.

증식 인자로는, EGF, KGF, FGF10 이 바람직하고, KGF 및/또는 EGF 가 보다 바람직하며, KGF 및 EGF 가 더욱 바람직하다.

증식 인자의 배지 중의 농도는, 사용하는 증식 인자의 종류에 따라서 적절히 설정되는데, 통상적으로 약 0.1 nM ∼ 1000 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM ∼ 100 μM 이다. EGF 의 경우, 그 농도는, 약 5 ∼ 2000 ng/㎖ (즉, 약 0.8 ∼ 320 nM), 바람직하게는 약 5 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 0.8 ∼ 160 nM), 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 1.6 ∼ 160 nM) 이다. FGF10 의 경우, 그 농도는, 약 5 ∼ 2000 ng/㎖ (즉, 약 0.3 ∼ 116 nM), 바람직하게는 약 10 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 0.6 ∼ 58 nM), 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 1000 ng/㎖ (즉, 약 0.6 ∼ 58 nM) 이다. 예를 들어, 증식 인자로서, KGF 및 EGF 를 사용하는 경우의 농도는, EGF 는 통상적으로 5 ∼ 150 ng/㎖, 바람직하게는 30 ∼ 100 ng/㎖, 특히 바람직하게는 약 50 ng/㎖, KGF 는 통상적으로 10 ∼ 200 ng/㎖, 바람직하게는 50 ∼ 150 ng/㎖, 특히 바람직하게는 약 100 ng/㎖ 이다.

공정 4) 에 있어서의 배양의 최초의 1 일은 ROCK 저해제의 존재 하에서 행하고, 이후에는 ROCK 저해제를 포함하지 않는 배지에서 배양해도 된다.

또, 배지에는 PKC 활성화제를 포함시켜도 된다. PKC 활성화제로는, PdBU (PKC activator Ⅱ), TPB (PKC activator V) 등을 사용하지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. PKC 활성화제의 농도는 약 0.1 ∼ 100 ng/㎖, 바람직하게는 약 1 ∼ 50 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 3 ∼ 10 ng/㎖ 로 첨가한다.

또, 배지에는 디메틸술폭시드, 액티빈 (1 ∼ 50 ng/㎖) 을 첨가해도 된다.

어느 공정에 있어서도, 배지에는, 상기한 성분 외에, 혈청 대체물 (예를 들어, B-27 서플리먼트, ITS-G) 을 첨가해도 된다. 또, 필요에 따라서, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX (제품명), 비필수 아미노산, 비타민, 니코틴아미드, 항생 물질 (예를 들어, Antibiotic-Antimycotic (본 명세서 중, AA 라고 칭하는 경우가 있다), 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 이것들의 혼합물), 항균제 (예를 들어, 암포테리신 B), 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 첨가해도 된다. 배지에 항생 물질을 첨가하는 경우에는, 그 배지 중의 농도는 통상적으로 0.01 ∼ 20 중량 ％, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 중량 ％ 이다.

배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ (예를 들어, 37 ℃) 에서 행한다. 또, 배양 용기 중의 이산화탄소 농도는, 예를 들어 5 ％ 정도이다.

공정 5) 내분비 전구 세포로의 분화

공정 4) 에서 얻어진 췌 전구 세포를, 추가로 증식 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 내분비 전구 세포로 분화 유도한다. 배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 2 차원 배양의 경우에는, 공정 4) 에서 얻어진 췌 전구 세포를, 0.25 ％ 트립신-EDTA 로 처리 후에 피펫팅함으로써 분산하고, 0.25 ％ 트립신-EDTA 를 원심 분리하여 현탁한 후, 공정 5) 의 새로운 배지에 재파종한다. 배양 기간은 2 일 ∼ 3 일, 바람직하게는 약 2 일이다.

배지는, 상기 공정 1) 에서 기재되는, 포유류 세포의 배양에 사용되는 기본 배지를 사용할 수 있다. 배지에는, 기보 (Nature Biotechnology 2014 ; 32 : 1121-1133) 에 따라서, SANT1, 레티노산, ALK5 인히비터 Ⅱ, T3, LDN 을 첨가하고, 추가로 Wnt 저해약, ROCK 저해제, FGF (바람직하게는 FGF2), 혈청 대체물, 비타민, 항생 물질 등을 적절히 첨가해도 된다. 또, 배지에는 디메틸술폭시드를 첨가해도 된다.

배양은, 피더 세포를 사용하지 않고, 비접착 배양에서 행한다. 배양시에는, 디시, 플라스크, 마이크로 플레이트, 다공 플레이트 (Nunc 사) 등 혹은 바이오리엑터가 사용된다. 배양 용기는, 세포와의 접착성을 저하시키기 위한 표면 처리가 되어 있는 것이 바람직하다.

공정 6) 인슐린 산생 세포로의 분화

공정 5) 에서 얻어진 내분비 전구 세포를, 추가로 FGFR1 저해제를 포함하는 배지에서 배양하여 인슐린 산생 세포로 분화 유도한다. 배양 기간은 10 일 ∼ 30 일, 바람직하게는 약 10 ∼ 20 일이다.

배지는, 상기 공정 1) 에서 기재되는, 포유류 세포의 배양에 사용되는 기본 배지를 사용할 수 있다. 배지에는, 기보 (Nature Biotechnology 2014 ; 32 : 1121-1133) 에 따라서, ALK5 인히비터 Ⅱ, T3, LDN, γ-secretase 저해제 XX, γ-secretase 저해제 RO, N-시스테인, AXL 인히비터, 아스코르브산을 첨가하고, 추가로 Wnt 저해약, ROCK 저해제, FGF (바람직하게는 FGF2), 혈청 대체물, 비타민, 항생 물질 등을 적절히 첨가해도 된다. 예를 들어, 배지에는 ALK5 인히비터 Ⅱ, T3, LDN, γ-secretase 저해제 RO, 및 아스코르브산을 첨가해도 되고, 혹은 T3, ALK5 인히비터 Ⅱ, ZnSO₄, 헤파린, N-아세틸시스테인, Trolox, 및 R428 을 첨가해도 된다.

배양은 2 차원 배양 및 3 차원 배양 중 어느 것에서 행해도 된다. 바람직하게는, 배양은, 피더 세포를 사용하지 않고, 비접착 배양에서 행한다. 배양시에는, 디시, 플라스크, 마이크로 플레이트, 다공 플레이트 (Nunc 사) 등 혹은 바이오리엑터가 사용된다. 배양 용기는, 세포와의 접착성을 저하시키기 위한 표면 처리가 되어 있는 것이 바람직하다.

배지에는, FGFR1 저해제를, FGFR1 활성을 저해하는 것이 가능한 임의의 양으로 포함시킬 수 있고, 예를 들어, 10 μM 이하, 또는 5 μM 이하의 양으로, 바람직하게는 5 μM 미만, 4 μM 미만, 3 μM 미만, 2 μM 미만의 양으로 포함시킬 수 있다. FGFR1 저해제의 첨가량의 하한은, 특별히 한정되지 않지만, 0.1 μM 이상, 바람직하게는 0.5 μM 이상으로 할 수 있다. FGFR1 저해제의 첨가량은, 바람직하게는, 5 μM 미만 0.1 μM 이상이고, 보다 바람직하게는 5 μM 미만 0.5 μM 이상이다. FGFR1 저해제의 존재 하에 있어서의 배양은, 적어도 12 시간, 바람직하게는 24 시간 이상, 2 일 이상, 4 일 이상, 8 일 이상, 10 일 이상, 또는 15 일 이상 행할 수 있다. FGFR1 저해제의 존재 하에 있어서의 배양은, 4 일 이상 행하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 공정 6) 의 마지막 약 4 ∼ 15 일, 바람직하게는 마지막 약 4 ∼ 7 일간에 대해서, FGFR1 저해제의 존재 하에 있어서의 배양을 행할 수 있다. FGFR1 저해제에 의한 처리 기간 중에도 배지의 교환은 가능하고, 배양 스케줄에 따라서, FGFR1 저해제가 첨가된 교환 전과 동일한 조성을 갖는 배지 또는 상이한 조성을 갖는 배지와 교환할 수 있다.

FGFR1 저해제를 포함하는 배지 중에서, 세포를 배양함으로써, 얻어지는 인슐린 산생 세포에 있어서의 Ki67 양성 세포의 증식을 억제할 수 있다.

공정 6) 에서 얻어진 인슐린 산생 세포는, 트립신 등의 효소를 사용하여 해리하여 회수할 수 있다. 회수된 인슐린 산생 세포는 사용할 때까지 동결 보존할 수 있다. 이어서, 회수된 인슐린 산생 세포를 상기 배지 중에, 1 배양기 또는 1 웰당, 약 50 만 ∼ 500 만 개, 바람직하게는 약 100 만 ∼ 400 만 개, 보다 바람직하게는 약 200 만 ∼ 300 만 개의 양으로 파종하여 3 차원 배양을 행하고, 인슐린 산생 세포를 스페로이드의 형태로 얻을 수 있다. 각 스페로이드는 약 100 ∼ 약 1000 개, 바람직하게는 약 200 ∼ 약 800 개, 보다 바람직하게는 약 300 개 ∼ 약 500 개 정도의 세포로 이루어진다.

2-2. 생체 적합성 재료

본 명세서에 있어서「생체 적합성 재료」란, 생체 내에 이식하여, 단기 또는 장기 유치했을 경우에, 현저한 면역 응답이나 유해한 생체 반응 (예를 들어, 독성 반응, 응혈 등) 을 유도하지 않는 임의의 재료를 의미한다. 바람직하게는,「생체 적합성 재료」는 이식 후, 호스트의 혈관 신생, 결합 조직의 산생을 촉진하는 것이다. 또,「생체 적합성 재료」는 생분해성 재료인 것이 바람직하다. 이와 같은 재료로는, 폴리락트산 (PLA), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리우레탄 (PU), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리글리콜산 (PGA), 폴리락트산-co-글리콜산 (PLGA), 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-하이드록시발레레이트) (PHBV), 폴리(에틸렌-co-비닐아세테이트) (PEVA) 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌아민, 폴리하이드록시부티르산, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리비닐알코올, 폴리푸마르산프로필렌, 폴리아크릴산, 폴리e-카프로락톤, 폴리메타크릴산, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF), 펙틴산, 히알루론산, 헤파린황산, 콘드로이틴황산, 헤파란황산프로테오글리칸, 헤파린, 키틴, 키토산, 잔탄, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸키토산, 알긴산, 알긴산에스테르, 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 피브로인, 케라틴, 젤라틴, 피브린, 풀루란, 라미닌, 게랭, 실리콘, 우레탄, 엘라스틴 등 및 그것들의 수식체, 그리고 그것들의 조합을 들 수 있다. 「생체 적합성 재료」의 표면은, 필요에 따라서, 세포의 접착을 가능하게 하는 표면 수식 (예를 들어, 세포 접착용 기질 (콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴, 마트리겔, 비트로넥틴 등) 에 의한 코팅) 이나, 세포의 증식, 분화나 기능을 제어하는 것이 알려져 있는 관능기 (예를 들어, 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메타크릴산기, 아크릴산기 등) 로의 개변이 실시되어 있어도 된다. 「생체 적합성 재료」는, 블록상, 비드상, 펠릿상, 구상, 시트상, 겔상 등의 임의의 형태를 가질 수 있고, 중실 (中實) 또는 다공성으로 할 수 있다. 「생체 적합성 재료」의 형상으로는, 입체 형상이 바람직하고, 예를 들어, 구체, 사면체, 육면체 등의 다면체, 원주, 각주, 원추, 원추대, 각뿔, 각뿔대, 토러스체, 원반체, 타원체 그것들의 변형 입체 등이어도 되고, 세포가 생체 적합성 재료 중에 분산될 수 있는 형상이면 된다. 「생체 적합성 재료」는 생체 내로의 이식 및 유치가 가능한 크기이면 되고, 예를 들어, 변의 길이가 가장 긴 지점에서 (원이면 직경) 약 0.1 ∼ 3.0 ㎝, 바람직하게는 약 0.5 ∼ 2.0 ㎝ 이고, 두께가 약 0.1 ∼ 2.0 ㎝, 바람직하게는 약 0.3 ∼ 1.5 ㎝ 로 할 수 있다. 생체 적합성 재료 중에 포함되는 세포는 약 50 만 개 ∼ 500 만 개, 바람직하게는 약 100 만 개 ∼ 300 만 개 정도로 이루어진다.

별도의 양태로는, 예를 들어,「생체 적합성 재료」의 크기는, 변의 길이가 가장 긴 지점에서 (원이면 직경) 약 1 ∼ 30 ㎝, 바람직하게는 약 1 ∼ 15 ㎝, 보다 바람직하게는 약 2 ∼ 10 ㎝ 로 할 수 있다.

「생체 적합성 재료」는, 복수 이식 및 유치해도 된다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는「생체 적합성 재료」는 겔 (하이드로 겔) 상이다. 생체 적합성 재료의 겔화는 각 생체 적합성재에 따른 공지된 수단에 따라서 행할 수 있고, 예를 들어, 생체 적합성 재료의 수용액에 가교제 (예를 들어, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 스트론튬 이온, 바륨 이온 등의 금속 카티온이나 그 염 형태) 를 첨가함으로써, 혹은, 수중에서 피브리노겐과 트롬빈을 작용시킴으로써 행할 수 있다. 본 발명에 있어서, 특히 바람직하게는「생체 적합성 재료」는 피브린 겔이다. 겔은 적당한 용매 (예를 들어, 물, 생리 식염수, 배지 등) 중에 생체 적합성 재료를 약 0.01 ∼ 10 중량 ％ 정도의 임의의 양으로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 다능성 줄기 세포 유래의 세포는 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치된다. 「분산되어 배치」란, 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 어느 부위에 국한시키지 않고, 생체 적합성 재료 중에 널리 분포시켜 배치하는 것을 의미한다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 스페로이드의 형태를 가질 경우, 인접하는 스페로이드가 생체 적합성 재료를 개재시켜 존재하는 것을 의미한다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 스페로이드의 형태를 가질 경우, 인접하는 스페로이드가 약 1 ㎛ 이상, 바람직하게는 약 5 ㎛ 이상의 간격을 갖고 배치되는 것을 의미한다.

별도의 양태로는,「분산되어 배치」란, 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 스페로이드의 형태를 가질 경우, 생체 적합성 재료 중의 스페로이드의 일정한 비율 이상 (30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상) 이 서로 접촉하지 않도록 배치되고, 바람직하게는 생체 적합성 재료 중의 스페로이드의 95 ％ 이상이 서로 접촉하지 않도록 배치되는 것을 의미한다.

별도의 양태로는,「분산되어 배치」란, 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 스페로이드의 형태를 가질 경우, 생체 적합성 재료 중의 스페로이드가, 일정한 비율 이상 (30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상) 이 직경 50 ∼ 500 ㎛ 의 스페로이드이고 (서로 접촉하여 큰 스페로이드로 되어 있지 않는 것을 의미한다), 바람직하게는 생체 적합성 재료 중의 스페로이드의 95 ％ 이상이 직경 50 ∼ 500 ㎛ 의 스페로이드인 것을 의미한다.

별도의 양태로는,「분산되어 배치」란, 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 스페로이드의 형태를 가질 경우, 생체 적합성 재료 중에 스페로이드가 물방울상 (pin dot) 으로 3 차원적으로 배치되어 있는 것을 의미한다. 「물방울상 (pin dot) 으로 3 차원적으로 배치」란, 각 스페로이드가 주위의 스페로이드와 간격을 두고 3 차원적으로 존재할 뿐만 아니라, 주위의 스페로이드와 접촉하여 존재하는 경우도 의미한다. 각 스페로이드는 각각 동일한 크기여도 되고, 상이한 크기여도 된다. 여기에서「분산되어 배치」란, 각 스페로이드가 생체 적합성 재료 중에 배치된 후, 응집·융합하여 보다 큰 스페로이드를 형성하는 것을 의미하는 것은 아니다.

「분산되어 배치」는 임의의 수단에 의해서 달성하는 것이 가능하지만, 다능성 줄기 세포 유래의 세포액을 충분히 교반 혼합하여 생체 적합성 재료에 파종함으로써, 그리고/혹은, 생체 적합성 재료에 파종하는 다능성 줄기 세포 유래의 세포의 농도를 조정함으로써, 그리고/혹은, 생체 적합성 재료의 용액에 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 첨가하여 충분히 교반 혼합함으로써 행할 수 있다. 예를 들어, 생체 적합성 재료가 겔상인 경우, 겔화시키기 전의 생체 적합성 재료의 용액에, 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 50 ∼ 200 ㎕ 당, 100 ∼ 600 만 세포 개, 바람직하게는 200 ∼ 500 만 세포 개의 양이 되도록 혼합하여 교반하고, 세포가 침강하기 전에 겔화함으로써, 다능성 줄기 세포 유래의 세포는 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치할 수 있다.

별도의 양태로는, 예를 들어, 생체 적합성 재료가 겔상인 경우, 겔화시키기 전의 생체 적합성 재료의 용액에, 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 15 ∼ 50 ㎖ 당, 1 × 10⁷ ∼ 1 × 10¹⁰ 세포 개, 바람직하게는 3 × 10⁸ ∼ 1 × 10⁹ 세포 개의 양이 되도록 혼합하여 교반하고, 세포가 침강하기 전에 겔화함으로써, 다능성 줄기 세포 유래의 세포는 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치할 수 있다.

3. 생체 조직형 구조체

본 명세서에 있어서「생체 조직형 구조체」란, 표피, 신경, 뇌, 척수, 식도, 위, 소장, 대장, 방광, 요도, 폐, 갑상선, 췌장, 간장, 근육, 골격, 심장, 혈관, 비장, 신장 등 (이것들에 한정은 되지 않는다) 의 생체 기관이나 조직과 동등하거나 또는 유사한 기능을 갖는 구조체를 의미한다. 생체 조직형 구조체는, 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치되어 이루어지는 조성물을 동물 생체 내에 이식하고, 유치하여, 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 분화 유도함으로써 얻을 수 있다.

「동물」은 포유 동물이 바람직하고, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 라마, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 모르모트 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 인간이다.

이식은, 상기 조성물을 일정한 위치에서 고정시킬 수 있는 생체 내 영역에서 행하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 동물의 피하, 복강 내, 복막 상피, 대망 (大網), 지방 조직, 근육 조직이나 췌장, 신장 등의 각 장기의 피막 하 등에서 행할 수 있다.

이식 후, 조성물 내의 다능성 줄기 세포 유래의 세포는 생체 내 환경에 있어서 분화 유도되어 분화·성숙하고, 사용된「다능성 줄기 세포 유래의 세포」에 따라서, 표피, 신경, 뇌, 척수, 식도, 위, 소장, 대장, 방광, 요도, 폐, 갑상선, 췌장, 간장, 근육, 골격, 심장, 혈관, 비장, 신장 등 (이것들에 한정은 되지 않는다) 의 기관이나 조직과 동등하거나 또는 유사한 기능을 갖는 구조체를 얻을 수 있다.

얻어진 생체 조직형 구조체는, 그 후, 회수되어도 되고, 그대로 생체 내에 유치해도 된다.

생체 조직형 구조체는, 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하고 있어도 된다.

다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포는 복수의 클러스터를 형성하여, 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재한다. 각 클러스터는, 직경이 약 10 ㎛ ∼ 1000 ㎛, 바람직하게는 약 50 ㎛ ∼ 500 ㎛ 정도, 보다 바람직하게는 약 50 ㎛ ∼ 300 ㎛ 정도의 크기를 갖는다. 그리고/혹은, 각 클러스터는 약 100 ∼ 약 1000 개, 바람직하게는 약 200 ∼ 약 800 개, 보다 바람직하게는 약 300 개 ∼ 약 500 개 정도의 세포로 이루어진다. 생체 조직형 구조체 중에는, 클러스터가 약 50 개 ∼ 2000 개, 바람직하게는 약 100 개 ∼ 500 개 정도 분산되어 존재할 수 있지만, 이 수는 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치된 다능성 줄기 세포 유래의 세포수에 따라서 변화할 수 있다. 「분산되어 존재」란, 분화 세포의 각 클러스터가 어느 부위에 국한되지 않고, 생체 조직형 구조체 중에 널리 분포하여 존재하는 것을 의미한다. 또,「분산되어 존재」란 인접하는 클러스터가 호스트 동물 유래의 결합 조직을 개재시켜 존재하는 것을 의미한다.

「호스트 동물 유래의 결합 조직」이란, 상기 조성물이 이식된 동물 유래의 세포가 산생하는 세포 외 매트릭스를 의미하고, 엘라스틴, 피브릴린, I 형 콜라겐, Ⅲ 형 콜라겐 등이 포함된다. 호스트 동물 유래의 결합 조직은, 분화 세포는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸도록 존재하고, 생체 조직형 구조체에 있어서의 각 클러스터 사이를 매립한다.

「호스트 동물 유래의 혈관」이란, 상기 조성물이 이식된 동물 유래의 세포로 형성되고, 생체 조직형 구조체 외의 호스트 동물의 혈관과 연결되는 혈관을 의미한다. 호스트 동물 유래의 혈관은, 생체 조직형 구조체에 있어서의 각 클러스터에 침입해 있고, 각 클러스터로 혈액을 순환하여, 산소나 영양분 등의 공급이나 노폐물의 배출을 행한다.

본 발명의 일 실시형태로서, 다능성 줄기 세포 유래의 세포로서, 다능성 줄기 세포로부터 췌 β 세포로 분화하는 과정에 있어서 출현하는, 배체 내배엽 세포, 원장관 세포, 후방 전장 세포, 췌 전구 세포, 내분비 전구 세포, 또는 인슐린 산생 세포, 바람직하게는 인슐린 산생 세포를 사용한 경우, 생체 내에 이식된 전술한 조성물 내에서 이들 세포는 분화 유도되어 성숙하고, 췌도와 동등하거나 또는 유사한 기능을 갖는 분화 세포 (이하,「췌도형 세포」로 기재한다) 를 포함하는 생체 조직형 구조체를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 생체 조직형 구조체에 있어서, 췌도형 세포는, 아래의 (a) ∼ (g) :

(a) MAFA, UCN3, 및 IAPP 중 적어도 하나의 마커를 발현하는 것,

(b) 크로모그라닌 A 양성 세포 (Chga＋ 세포) 의 비율이 높은 것,

(c) Ki67 양성 세포 (Ki67＋ 세포) 의 비율이 낮은 것,

(d) 글루카곤 양성이며 또한 인슐린 음성 세포 (Gcg＋Ins- 세포) 의 비율이 높은 것,

(e) 저혈당에 응답한 인슐린 분비 작용을 갖는 것,

(f) 외분비 세포를 포함하지 않는 것,

(g) 인슐린 양성이며 또한 글루카곤 음성 세포 (Ins＋Gcg- 세포) 의 비율이 높은 것,

에서 선택되는 1 또는 복수에 의해서 특징지을 수 있다. 여기에서「복수」란, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 을 의미한다.

(a) ∼ (g) 의 특징의 유무는, 인슐린 산생 세포를 분화 유도하고 나서 (즉, 전술한 조성물을 생체 내에 이식하고 나서), 4 주일 이후, 바람직하게는 8 주일 이후에 평가할 수 있다. 또, 췌도형 세포에 있어서의 소정의 세포의 비율이란, 이식편에서 유래하는 세포괴의 전체 세포수에 대한 비율을 의미한다.

(a) MAFA, UCN3, 및 IAPP 중 적어도 하나의 마커를 발현하는 것

췌도형 세포에는, 췌 β 세포가 포함된다. 췌 β 세포는 성숙 마커인 MAFA, UCN3, 및 IAPP 중 적어도 하나의 마커를 발현한다. 또, 췌 β 세포는 글루코오스 자극에 의한 인슐린 분비 상승 반응에 의해서도 특징지을 수 있다.

(b) Chga＋ 세포의 비율이 높은 것

췌도형 세포는, Chga＋ 세포를 약 50 ％ 이상의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 췌도형 세포에 있어서의, Chga＋ 세포의 비율은 약 60 ％ 이상이고, 보다 바람직하게는 약 70 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 90 ％ 이상, 특히 바람직하게는 약 95 ％ 이상 (예를 들어, 약 97 ％ 이상, 약 98 ％ 이상) 이다.

Chga＋ 세포에는 인슐린이나 글루카곤 등의 호르몬을 분비하는 세포 (내분비 세포) 가 포함되고, 본 특징은 췌도형 세포가, 내분비 세포를 높은 비율로 포함하는 것을 나타낸다.

(c) Ki67＋ 세포의 비율이 낮은 것

췌도형 세포는, Ki67 양성 세포를 약 3 ％ 미만의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 췌도형 세포에 있어서의, Ki67 양성 세포의 비율은 약 1 ％ 미만, 보다 바람직하게는 약 0.8 ％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.5 ％ 미만이다.

본 특징은 췌도형 세포에 있어서, 그 혼입·잔존이 바람직하지 않은 경우가 있는 Ki67＋ 세포는 거의 없거나, 매우 낮은 비율인 것을 나타낸다.

(d) Gcg＋Ins- 세포의 비율이 높은 것

췌도형 세포는, Gcg＋Ins- 세포를 약 10 ％ 이상의 비율로 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 췌도형 세포에 있어서의, Gcg＋Ins- 세포의 비율은 약 15 ％ 이상이고, 보다 바람직하게는 약 20 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 25 ％ 이상이다. 췌도형 세포에 있어서의 Gcg＋Ins- 세포의 비율의 상한은 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어, 약 50 ％ 이하, 바람직하게는 약 45 ％ 이하, 보다 바람직하게는 약 40 ％ 이하로 할 수 있다.

Gcg＋Ins- 는 성숙한 췌 α 세포의 마커인 점에서, 췌도형 세포가, 성숙한 췌 α 세포를 인슐린 산생 세포보다 높은 비율로 포함하는 것을 나타낸다. 췌도형 세포가, 인슐린 산생 세포보다 성숙한 분화 단계에 있는 것을 나타낸다.

(e) 저혈당에 응답한 인슐린 분비 작용을 갖는 것

췌도형 세포는, 저혈당에 응답한 인슐린 분비 작용을 갖는 것을 특징으로 한다. 「저혈당에 응답한 인슐린 분비 작용」이란, 저혈당시부터 1 시간 이내, 2 시간 이내, 3 시간 이내, 4 시간 이내, 또는 5 시간 이내에 인슐린 분비량이 증가되는 것을 의미한다. 「저혈당」이란 혈중 또는 배지 중의 글루코오스 농도가, 약 70 ㎎/㎗ 이하인 경우를 의미한다. 인슐린 분비량의 측정은 종래 공지된 임의의 수단으로 행할 수 있고, 특별히 한정은 되지 않지만, 혈중 또는 배지 중의 C-펩티드량을 측정함으로써 행할 수 있다.

통상적으로, 생체 내에서는 저혈당이 되면, 글루카곤 등의 분비에 의해서 혈당치의 상승이 촉진됨과 함께, 글루카곤에 길항하여 인슐린이 분비되고, 혈당치 레벨이 컨트롤된다. 본 발명의 췌도형 세포는 마찬가지로, 저혈당에 대한 혈당치 레벨의 컨트롤을 가능하게 하는 것으로서, 저혈당에 응답하여 혈당치의 상승을 촉진함과 함께, 이것에 길항하여 인슐린을 분비하는 작용을 갖는다.

(f) 외분비 세포를 포함하지 않는 것

췌도형 세포는, 외분비 세포를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 즉, 동물 생체 내의 췌도에 있어서 통상적으로 그 대부분 (약 95 ％) 을 구성하는, 아밀라아제나 리파아제 등의 소화 효소를 포함하는 췌액을 분비하는 외분비 세포는, 췌도형 세포에는 포함되지 않는다. 「외분비 세포를 포함하지 않는다」라는 용어에는, 췌도형 세포에 있어서 외분비 세포가 전혀 포함되지 않는 경우뿐만 아니고, 췌도형 세포에 있어서 5 ％ 이하, 4 ％ 이하, 3 ％ 이하, 2 ％ 이하, 1 ％ 이하, 또는 0.5 ％ 이하의 낮은 비율로 외분비 세포가 포함되는 경우도 포함시킬 수 있다.

(g) Ins＋Gcg- 세포의 비율이 높은 것

췌도형 세포는, Ins＋Gcg- 세포의 비율이 높은 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 췌도형 세포에 있어서의, Ins＋Gcg- 세포의 비율은 약 20 ％ 이상이고, 보다 바람직하게는 약 30 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 40 ％ 이상이다. 췌도형 세포에 있어서의 Ins＋Gcg- 세포의 비율의 상한은 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어, 약 80 ％ 이하, 바람직하게는 약 70 ％ 이하, 보다 바람직하게는 약 60 ％ 이하로 할 수 있다.

Ins＋Gcg- 는 성숙한 췌 β 세포의 마커인 점에서, 췌도형 세포가, 성숙한 췌 β 세포를 인슐린 산생 세포보다 높은 비율로 포함하는 것을 나타낸다. 췌도형 세포가, 인슐린 산생 세포보다 성숙한 분화 단계에 있는 것을 나타낸다.

또, 생체 조직형 구조체가 췌도형 세포를 포함하는 경우, 췌도형 세포는 인슐린 양성 세포가 내측에, 글루카곤 양성 세포가 외측에 배치된 클러스터를 형성할 수 있다.

5. 용도

본 수법에 의해서 얻어진 생체 조직형 구조체는, 사용된「다능성 줄기 세포 유래의 세포」에 따라서, 표피, 신경, 뇌, 척수, 식도, 위, 소장, 대장, 방광, 요도, 폐, 갑상선, 췌장, 간장, 근육, 골격, 심장, 혈관, 비장, 신장 등 (이것들에 한정은 되지 않는다) 의 기관이나 조직과 동등하거나 또는 유사한 기능을 갖고, 그들 기관이나 조직의 기능을 증강 또는 유지하기 위해서, 혹은, 질환이나 장해 등의 원인에 의해서 저감 또는 소실된 그들 기관이나 조직의 기능을 보조 또는 보충하기 위해서 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태로서, 생체 조직형 구조체가 전술한 췌도형 세포를 포함하는 경우, 당해 생체 조직형 구조체는 췌도형 세포가 분비하는 인슐린이나 글루카곤의 기능에 의해서 환자에 있어서의 혈당치 (글루코오스) 의 레벨을 개선 및/또는 유지할 수 있고, 혈당치를 정상치로 컨트롤할 수 있다.

따라서, 당해 생체 조직형 구조체는, 혈당치의 레벨을 개선 및/또는 유지할 필요가 있게 되는 질환, 장해, 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위해서 사용할 수 있다. 이와 같은 질환, 장해, 또는 증상으로는, 당뇨병 (1 형 당뇨병, 2 형 당뇨병), 공복시 및 식후 글루코오스 레벨의 변조, 저혈당증 (예를 들어, 당뇨병 환자에 있어서의 인슐린 투여에 의한 저혈당증) 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정은 되지 않는다. 또한,「치료」란, 질환, 장해, 또는 증상의 치료, 치유, 방지 혹은, 관해 (寬解) 의 개선, 또는, 질환, 장해, 또는 증상의 진행 속도의 저감을 의미한다. 또,「예방」이란, 질환, 장해, 또는 증상의 발증의 가능성, 위험성을 저하시키거나, 또는 질환, 장해, 또는 증상의 발증을 지연시키는 것을 의미한다.

환자는 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 원숭이, 인간) 이고, 바람직하게는 인간이다.

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 인슐린 산생 세포의 제작, 이식, 기능·형태 평가 (STZ-Nod-scid 마우스)

1. 방법

(1) 인슐린 산생 세포의 제작

Ff-I14s04 iPS 세포주로부터 인슐린 산생 세포로의 분화 유도는, 상기 공정 1) ∼ 6) 이나 기보 (Nature Biotechnology 2014 ; 32 : 1121-1133) 에 따라서, 바이오리엑터를 사용한 3 차원 배양법에 의해서 실시하였다.

즉, iPS 세포를 인슐린이 작용하는 조건 하에서 분화 유도 인자 (GSK3β 저해제, ROCK 저해제 및 저용량의 액티빈 A) 를 포함하는 배지 (DMEM/1 ％ B27/페니실린 스트렙토마이신/디메틸술폭시드) 에서 제 1 배양을 행하고, 계속해서, 인슐린이 작용하지 않는 조건 하에서 분화 유도 인자 (저용량의 액티빈 A) 를 포함하는 배지 (DMEM/1 ％ B27/페니실린 스트렙토마이신/디메틸술폭시드) 에서 제 2 배양을 행하여 배체 내배엽 세포를 얻었다.

그 배체 내배엽 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 내분비 전구 세포 집단을 분화 유도 인자 (ALK5 인히비터 Ⅱ, T3, LDN, γ-secretase 저해제 RO, 아스코르브산) 와 FGF 수용체 1 저해제 (PD-166866) 를 포함하는 배지 (Improved MEM/1 ％ B27/페니실린 스트렙토마이신) 에서 8 일간 배양하였다. 또한, 일부 상이한 분화 유도 인자 (ALK5 인히비터 Ⅱ, T3, ZnSO₄, 헤파린, N-아세틸시스테인, Trolox, R428, Y-27632) 와 FGF 수용체 1 저해제 (PD-166866) 를 포함하는 배지 (MCDB/ITS-X/2 ％ BSA/20 mM 글루코오스/NaHCO3/Glutamax/페니실린 스트렙토마이신) 에서 4 일간 배양하여, 스페로이드의 형태로 인슐린 산생 세포를 얻었다.

(2) 이식 전의 인슐린 산생 세포의 단백질 발현 평가

(1) 에서 제작한 인슐린 산생 세포의 단백질 발현 (인슐린, NKX6.1, 크로모그라닌, Ki67) 을 플로사이트메트리에 의해서 측정하였다.

(3) 인슐린 산생 세포의 피브린 겔로의 분산·겔화

피브린 겔 제작용의 피브리노겐 (머크 밀리포아, 341576-100MG) 을, 사전에 기초 배지 (MCDB) 에 10 ㎎/㎖ 가 되도록 용해시키고, 사용까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 트롬빈 (시그마, 10602400001) 을, PBS (-) 에 50 U/㎖ 가 되도록 용해시키고, 사용까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 피브리노겐 용액과 트롬빈 용액은, 사용 직전에 용해시켜 사용하였다.

(1) 에서 제작한 인슐린 산생 세포의 스페로이드 (직경 50 ∼ 500 ㎛ 정도의 크기를 갖고, 총수로는 300 만 세포를 포함한다) 를 1.5 ㎖ 튜브에 모아 침강시킨다. 침강 후, 배양액을 가능한 한 제거하고, 100 ㎕ 의 피브리노겐 용액을 첨가하여, 충분히 교반하였다. 이어서, 응집괴가 침강하기 전에, 피브리노겐 용액에 대해서 1/2 양 (50㎕) 의 트롬빈 용액을 첨가하였다. 트롬빈 용액을 첨가하고 나서 5 분 이상, 실온에서 방치하고, 겔화시켰다.

(4) 생체 내로의 인슐린 산생 세포의 이식과 생체 조직형 구조체 형성 과정의 기능 평가

(3) 에서 제작한 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔을, 스트렙토조토신 (STZ) 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스의 피하에 이식하였다 (iPIC 군). 이식 후, 혈액 중의 인간 C-펩티드 (인슐린 산생 세포 유래 인슐린의 지표) 의 농도 및 혈당치를 측정하여, 인슐린 산생 세포의 생착 및 기능을 평가하였다. 대조로서, 비이식 개체 (sham 군) 및 비당뇨병 NOD/SCID 마우스 (control 군) 를 형성하고, 동일한 지표를 측정, 평가하였다.

(5) 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 글루코오스 부하에 대한 응답 평가

인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔을 피하 이식하고, 6 개월 경과한 시점에서, 일과적으로 혈당치를 상승시키기 위해서 글루코오스 강제 경구 투여를 행하고, 그 후의 인슐린 산생 세포의 응답을 혈장 중 글루코오스 농도 및 혈중 인간 C-펩티드 농도를 측정하여 평가하였다.

(6) 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 일반 염색 및 단백질 발현의 평가

이식으로부터 6 개월 후에 적출된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체를 파라포름알데히드로 고정시켰다. 고정된 생체 조직형 구조체로부터, 파라핀 절편 및 동결 절편을 제작하였다. 파라핀 절편을 사용하여, HE 염색 및 마손 트리크롬 염색을 행하였다. 또, 동결 절편을 사용하여, 목적 단백질 발현 (인간 핵 (HuN), PDX1, 인슐린 (INS), 글루카곤 (GCG), 마우스 CD31 (mCD31), 크로모그라닌 A (CHGA), Ki67)) 을 면역 조직 염색에 의해서 평가하였다.

2. 결과

(1) 이식 전의 인슐린 산생 세포의 단백질 발현 평가

이식 전의 인슐린 산생 세포에 대해서, 플로사이트메트리에 의한 측정 결과를 도 1 에, 또, 인슐린 양성/NKX6.1 양성 세포율, 크로모그라닌 A 양성 세포율, Ki67 양성 세포율을 표 1 에 나타낸다. 이식 전의 인슐린 산생 세포는, 95 ％ 이상이 크로모그라닌 A 양성의 내분비 세포이고, 이식 후 β 세포로 성숙하는 인슐린 양성/NKX6.1 양성 세포가 42.6 ％, α 세포로 성숙하는 인슐린 양성/NKX6.1 음성 세포가 30.3 ％ 인 세포 집단이었다. 또, 증식 마커인 Ki67 양성 세포는 0.4 ％ 로 극히 미미하였다.

(2) 생체 내에 이식한 인슐린 산생 세포가 생체 조직형 구조체를 형성하는 과정의 기능 평가

이식 후의 혈중 인간 C-펩티드 농도 및 혈당치의 측정 결과를 도 2 및 표 2 에 나타낸다. 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔을 이식한 동물에서는, 이식으로부터 3 개월 후에는 혈액 중에 고농도의 인간 C-펩티드가 검출되고, 그것에 수반하여 고혈당이 개선되었다. 혈당치는 6 개월 후까지 정상 레벨을 유지하였다. 이상으로부터, 이식된 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔이 피하에서 호스트 세포와 서로 혼합되면서 분화, 성숙하고, 기능하는 생체 조직형 구조체를 형성하는 것이 시사되었다.

(3) 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 글루코오스 부하에 대한 응답 평가

글루코오스 부하 후의 혈중 인간 C-펩티드 농도 및 혈장 중 글루코오스 농도를 도 3 에 나타낸다. 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔의 이식에 의해서 형성된 생체 조직형 구조체는, 이식으로부터 6 개월의 시점에서, 예민한 글루코오스 응답성의 혈중 인간 C-펩티드의 분비를 나타내었다. 이식 부위가 피하에도 불구하고, 글루코오스 부가 15 분 후부터 명확한 혈중 인간 C-펩티드의 상승이 확인되고, 풍부한 혈류를 통한 실제의 췌도 그대로의 생체 응답이 확인되었다. 또, 혈당 저하에 수반하여 혈중 인간 C-펩티드도 저하되어 있어, 저혈당의 우려도 적다고 추찰된다.

(4) 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 일반 염색 및 단백질 발현의 평가

이식으로부터 6 개월 시점의 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 육안 소견을 도 4 에, 적출된 생체 조직형 구조체의 HE 염색 이미지를 도 5 에, 마손 트리크롬 염색 이미지를 도 6 에, 목적 단백질 발현을 각각 면역 조직 염색한 결과를 도 7 ∼ 10 에 나타낸다.

인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 육안 소견 (도 4) 은, 두드러진 비대함도 없고, 미립 (米粒) 크기의 생체 조직형 구조체이고, 용이하게 피하에서 단리 가능하였다. 동 시기에 합계 4 마리를 해부한 결과, 모두 동일한 육안 소견이었다. 조직학적 평가로부터, 생체 조직형 구조체는, 1) 직경 50 ∼ 500 ㎛ 의 인슐린 산생 세포 유래의 췌도형 세포 클러스터, 2) 그것을 둘러싸도록 배치된 호스트 유래의 섬유성 조직, 3) 호스트 유래의 혈관 구조에 의해서 구성되어 있는 것이 기재되었다 (도 5 ∼ 10).

3) 의 호스트 유래의 혈관 구조 (= 마우스 CD31 양성, 도 9) 는 주로, 1) 의 내분비 세포 클러스터에 들어가 있고, 1) 의 췌도형 세포 클러스터 내에서는 다수의 적혈구가 확인되었다 (도 5, 6). 따라서, 본 생체 조직형 구조체는, 실제의 췌도와 마찬가지로, 풍부한 혈류와, 혈류를 통한 예민한 생체 반응을 실현하고 있는 것이 크게 시사된다. 또, 섬유성 조직을 많이 포함하기 때문에 (도 6), 물리적인 강도도 높다. 실제로 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 절단을 시도했을 때에는, 연골과 같은 강도가 있어, 용이하게는 절단할 수 없었다.

HuN 양성의 인슐린 산생 세포 유래의 세포는, 대부분이 췌도형 세포 (도 7 ∼ 10) 이고, 목적 외의 세포의 증식도 확인되지 않는다. 증식 마커인 Ki67 과 HuN 양(兩) 양성의 세포도 0.5 ％ 이하로 경미하였다 (도 10). 인슐린 양성 세포는 1) 의 췌도형 세포 클러스터의 내측에, 글루카곤 양성 세포는 1) 의 췌도형 세포 클러스터의 외측에 분포하고 있고, 이와 같은 배치는 출생 전의 태아 인간 췌장, 혹은 설치류의 췌도에서 관찰된다. 따라서, 본 생체 조직형 구조체도, 태아 인간 췌도와 마찬가지로 수십 년 단위로 기능할 수 있는 것이 시사된다.

이상의 결과로부터, 인슐린 산생 세포는 피브린 겔에 분산시켜 생체 내에 이식함으로써, 피하라고 하는 혈류나 영양이 부족한 부위에 장기 생착하고, 나아가서는 호스트의 세포와 서로 섞여 성숙하여, 새로운 생체 조직형 구조체를 형성하는 것으로 나타내어졌다. 형성된 피하 생체 조직형 구조체는, 실제로 생체 내에 있는 췌도와 마찬가지로, 생리적이며 또한 예민한 인슐린 분비 조절에 수반되는 혈당치 제어 기능을 갖는 것으로 나타내어졌다.

실시예 2 : 당뇨병 병태를 갖는 생체 내에 있어서의 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 형성과 기능 평가

1. 방법

상기 실시예 1 의 (3) 에서 제작된 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔을, 스트렙토조토신 (STZ) 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스, 또는 비당뇨병의 NOD/SCID 마우스의 피하에 각각 이식하였다. 이식 28 주 후까지, 포식시의 혈중 인간 C-펩티드, 글루카곤 및 혈당치를 측정하였다.

28 주 후에 모든 개체에 대해서 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체를 적출하였다. 적출된 이식편 생체 조직형 구조체의 중량을 측정하고, 파쇄, 산에탄올 처리한 후에 이식편 생체 조직형 구조체 중의 인슐린 및 글루카곤 함량을 측정하였다. 대조로서, 각 이식 마우스의 췌장 및 비이식의 비당뇨병 NOD/SCID 마우스의 췌장을 채취하고, 동일하게 호르몬 함량을 측정하였다.

2. 결과

혈액 중의 인간 C-펩티드 및 글루카곤의 농도 그리고 혈당치의 추이를 도 11 에 나타낸다. 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔의 이식 28 주 후까지 지속적으로 혈중에서 인간 C-펩티드를 검출하였다. 혈중 글루카곤 농도도 상승되어 있어, 당뇨병 및 비당뇨병의 비이식 마우스에 비해서 높은 수치였다. 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔은 피하 환경에서 장기 생착하고, 그리고 형성된 생체 조직형 구조체는 복수의 췌도 호르몬을 방출하는 것이 시사되었다. 당뇨병 마우스의 고혈당은 이식 12 주 후까지 개선되고, 혈당치는 28 주 후까지 정상역을 유지하였다. 생체 조직형 구조체를 적출하면 이식 전의 고혈당 상태로 완전히 되돌아갔기 때문에, 지속적이며 또한 안정적인 고혈당 개선 작용은 생체 조직형 구조체에서 유래하는 것으로 나타내어졌다.

이식편 생체 조직형 구조체 중 및 췌장 중의 각 호르몬 함량을 도 12 에 나타낸다. 췌장 (왼쪽) 과 비교하여, 이식편 생체 조직형 구조체 (오른쪽) 는 단위 중량당 인슐린 및 글루카곤의 함량이 많았다. 이식편 생체 조직형 구조체는, 췌장 중의 췌도와 같이 췌 내분비 세포를 고밀도로 포함하고 있는 것으로 나타내어졌다.

실시예 3 : 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 혈당 제어 기능

1. 방법

상기 실시예 1 의 (3) 에서 제작한 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔을, STZ 에 의해서 당뇨병을 유발한 면역 부전 NOD/SCID 마우스, 또는 당뇨병을 자연 발병시키는 Akita 유전자 변이를 갖는 NOD/SCID 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 14 주 후 이후, 고혈당이 완전히 개선된 마우스를 사용하여 아래의 시험을 실시하였다.

시험 (1) : 일과적으로 혈당치를 상승시키기 위해서 글루코오스 강제 경구 투여하고, 그 후의 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 응답을 혈중 인간 C-펩티드, 글루카곤 및 글루카곤형 펩티드-1 농도를 측정하여 평가하였다. 대조로서, 비이식·비당뇨병 NOD/SCID 마우스를 사용하여, 내인성의 각 호르몬의 혈중 농도를 측정하였다.

시험 (2) : 상기 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 응답에 대한 글루카곤의 관여를 평가하기 위해서, 글루코오스 강제 투여 전에 글루카곤 수용체 안타고니스트 MK-0893 을 강제 경구 투여하고, 시험 (1) 과 동일한 시험을 실시하였다. MK-0893 은, 마우스보다 인간의 글루카곤 수용체에 대해서 강한 안타고니스트 활성을 나타낸다 (J Med Chem. 2012 Jul 12 ; 55 (13) : 6137-48).

시험 (3) : 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체에 의한 인슐린 방출에 대한 글루카곤형 펩티드-1 의 관여를 평가하기 위해서, 글루카곤형 펩티드-1 수용체 안타고니스트 Exendin-9 를 삼투압 펌프에 의해서 3 일간 피하 지속 투여하고, 투여 전후의 혈중 인간 C-펩티드 농도를 측정하였다.

시험 (4) : 저혈당을 유발하기 위해서 인슐린 제제 글라진을 피하 투여하고, 그 후의 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체의 응답을 혈중 인간 C-펩티드를 측정하여 평가하였다. 대조로서, 비이식·비당뇨병 NOD/SCID 마우스를 사용하여, 내인성 췌도 유래의 마우스 C-펩티드의 혈중 농도를 측정하였다.

2. 결과

시험 (1) : 글루코오스 부하 후의 혈중 글루카곤 및 글루카곤형 펩티드-1 농도를 도 13 에 나타낸다. 글루코오스 부하에 의해서 혈중 인간 C-펩티드 및 글루카곤형 펩티드-1 농도는 일과적으로 상승하고, 혈중 글루카곤 농도는 저하 경향을 나타내었다. 이식 마우스에서는 비이식·비당뇨병 마우스에 비해서 혈중 글루카곤형 펩티드-1 및 글루카곤의 혈중 농도가 높은 수치를 나타내어, 생체 조직형 구조체가 이들 호르몬을 방출하고 있는 것이 시사되었다.

시험 (2) : 글루코오스 부하 후의 혈당치 및 혈중 인간 C-펩티드 농도를 도 14 에 나타낸다. MK-0893 을 전처치하면, 글루코오스 부하 후의 일과적인 혈당치의 상승이 감약하고, 혈중 인간 C-펩티드 농도의 상승도 감약하였다. 한편으로, MK-0893 은, 비이식·비당뇨병 마우스에 있어서 혈당치 및 내인성 마우스 C-펩티드의 혈중 농도에 영향을 주지 않았다. 이것들로부터, 생체 조직형 구조체에 의한 혈당 제어 작용에 글루카곤이 기여하고 있는 것으로 나타내어졌다.

시험 (3) : Exendin-9 의 3 일간 투여 전후의 포식시의 혈중 인간 C-펩티드 농도를 도 15 에 나타낸다. 혈중 인간 C-펩티드 농도는 Exendin-9 의 지속 투여에 의해서 저하되고, 투여를 멈추면 투여 전의 레벨로 되돌아갔다. 생체 조직형 구조체에 의한 인간 C-펩티드의 방출은 글루카곤형 펩티드-1 에 의한 제어를 받은 것으로 나타내어졌다.

시험 (4) : 혈중 인간 C-펩티드 농도는 글라진 투여에 의해서 저혈당을 유발하면 크게 저하되었다. 이 변화는 비이식·비당뇨병 마우스에 있어서의 내인성 마우스 C-펩티드의 혈중 농도 추이와 동일하였다. 저혈당 유발시에 생체 조직형 구조체가 내인성 췌도에 유사한 인슐린 분비 조절 기능을 나타내는 것으로 나타내어졌다.

이상으로부터, 인슐린 산생 세포가 분산된 피브린 겔의 이식에 의해서 형성된 인슐린 산생 세포 유래 생체 조직형 구조체는, 내인성 췌도에 유사한, 복수의 췌도 호르몬이 기여하는 생리적인 혈당 제어 기능을 발휘하는 것으로 나타내어졌다.

Claims

생체 조직형 구조체를 호스트 동물의 생체 조직 내에 제작하는 방법에 있어서 사용되는, 생체 적합성 재료와 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 포함하는 조성물로서, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치되어 있는, 조성물.
제 1 항에 있어서,
생체 적합성 재료가 피브린 겔인, 조성물.
제 2 항에 있어서,
피브린 겔이, 상기 조성물의 사용 직전에, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포와 피브리노겐과 트롬빈을 혼합하여 겔화된 것인, 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 복수의 스페로이드의 형태로 존재하는, 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포에 있어서의 Ki67 양성 세포의 비율이 3 ％ 미만인, 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 인슐린 산생 세포인, 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이, 상기 조성물을 호스트 동물의 생체 조직 중에 이식하여, 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치된 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 분화 유도하는 것을 포함하는, 조성물.
제 7 항에 있어서,
호스트 동물의 생체 조직이 피하 조직인, 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
생체 조직형 구조체가, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하고, 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터가 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재하며, 그 결합 조직이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸고, 그 혈관이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터에 침입해 있는, 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 분화 세포가 외분비 세포를 포함하지 않는, 조성물.
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하는 생체 조직형 구조체로서, 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터가 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재하고, 그 결합 조직이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸며, 그 혈관이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터에 침입해 있는, 생체 조직형 구조체.
제 11 항에 있어서,
상기 분화 세포가 췌 β 세포를 포함하는, 생체 조직형 구조체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 분화 세포가 외분비 세포를 포함하지 않는, 생체 조직형 구조체.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생체 조직형 구조체가 이식된 피검체의 혈당치를 정상치로 컨트롤하기 위해서 사용되는, 생체 조직형 구조체.
생체 조직형 구조체의 제조 방법으로서,
생체 적합성 재료와 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포를 포함하는 조성물로서, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 생체 적합성 재료 중에 분산되어 배치되어 있는, 조성물을 호스트 동물의 생체 조직 중에 이식하여 분화 유도하는 것을 포함하는, 방법.
제 15 항에 있어서,
생체 적합성 재료가 피브린 겔인, 방법.
제 16 항에 있어서,
피브린 겔이, 상기 조성물의 사용 직전에, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포와 피브리노겐과 트롬빈을 혼합하여 겔화되는, 방법.
제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 복수의 스페로이드의 형태로 존재하는, 방법.
제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포에 있어서의 Ki67 양성 세포의 비율이 3 ％ 미만인, 방법.
제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 인슐린 산생 세포인, 방법.
제 15 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
호스트 동물의 생체 조직이 피하 조직인, 방법.
제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
생체 조직형 구조체가, 분산된 인간 다능성 줄기 세포 유래의 세포로부터 분화 유도되어 얻어진 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터, 호스트 동물 유래의 결합 조직, 그리고 호스트 동물 유래의 혈관을 포함하고, 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터가 생체 조직형 구조체 중에 분산되어 존재하며, 그 결합 조직이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터의 주위를 둘러싸고, 그 혈관이 그 분화 세포로 이루어지는 복수의 클러스터에 침입해 있는, 방법.
제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분화 세포가 외분비 세포를 포함하지 않는, 방법.