CN113993528A - 类生体组织结构体的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的为提供一种包含从多能性干细胞诱导的分化细胞的类生体组织结构体的新颖制造方法，即本发明提供一种通过将包含被分散配置于生物兼容性材料中的源自多能性干细胞的细胞的组合物移植至生体组织中，而分化诱导细胞，并与源自宿主的血管或***一起形成类生体组织结构体的方法。

Description

类生体组织结构体的制造方法
技术领域
本发明涉及通过源自多能性干细胞的分化细胞所构成的类生体组织结构体，以及其制造法及用途。
背景技术
从人工多能性细胞或胚性干细胞(ES细胞)等多能性干细胞所诱导的功能性分化细胞，可期待作为移植再生医疗的细胞供给源。今日，朝向使用组织工学的移植治疗，正尝试利用此种功能性分化细胞，构筑具有与生体器官或组织同等或类似功能的结构体(以下，记载为“类生体组织结构体”)。然而，在欲制作具有厚度的3维结构体的情况，有时无法充分对全部细胞供给氧或营养分等，维持、管理结构体中的细胞在生体外(in vitro)及生体内(in vivo)的任一者中均非易事。因此，以往的结构体，对其厚度或大小有所限制，在发挥与生体器官或组织同等或类似的功能上有不足的情形。在该领域中，依然企盼能简便地制作具有厚度的3维类生体组织结构体的新手法。
从人工多能性细胞或胚性干细胞等多能性干细胞分化诱导成进行所谓“胰脏β细胞或胰脏α细胞”的荷尔蒙分泌的内分泌细胞，应用于糖尿病的治疗的研究正进行中。迄今，报导有通过从多能性干细胞分化诱导成胰前驱细胞，将其移植至生体内，使其成熟化，制造内分泌细胞的手法。例如，在非专利文献1中，记载将从多能性干细胞分化诱导的胰前驱细胞移植至小鼠，使其成熟化，制造包含胰岛素阳性细胞及胰高血糖素(glucagon)阳性细胞的内分泌细胞的方法。然而，迄今包含胰岛素阳性细胞或胰高血糖素阳性细胞等内分泌细胞，具有厚度，且不含胰管(duct)或囊胞(cyst)的3维类生体组织结构体尚未被制造。
[现有技术文献]
[非专利文献]
[非专利文献1]Robert T et al,Stem Cell Reports.2018 Mar 13；10(3):739-750.
发明内容
[发明所欲解决的课题]
本发明的目的为提供包含从多能性干细胞诱导的分化细胞的类生体组织结构体的新颖制造方法。
[用以解决课题的手段]
本发明人等为能解决上述课题，专心检讨的结果，发现通过将包含被分散配置于生物兼容性材料中的源自多能性干细胞的细胞的组成物，移植至生体组织中，细胞可存活、被分化诱导及成熟，并与源自宿主的血管或***一起构建成类生体组织结构体。
本发明系基于这些认识而产生，包含以下的发明。
[1]一种组合物，其系在宿主动物的生体组织内制作类生体组织结构体的方法中所使用的组合物，该组合物包含生物兼容性材料及源自人类多能性干细胞的细胞，其中源自人类多能性干细胞的细胞系被分散配置于生物兼容性材料中。
[2]如[1]的组合物，其中生物兼容性材料为纤维蛋白凝胶。
[3]如[2]的组合物，其中纤维蛋白凝胶，系在前述组合物即将使用之前，将源自人类多能性干细胞的细胞及纤维蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝胶化者。
[4]如[1]至[3]中任一项的组合物，其中源自人类多能性干细胞的细胞，系以复数个球体的形态存在。
[5]如[1]至[4]中任一项的组合物，其中源自人类多能性干细胞的细胞中的Ki67阳性细胞的比率系未达3％。
[6]如[1]至[5]中任一项的组合物，其中源自人类多能性干细胞的细胞为胰岛素产生细胞。
[7]如[1]至[6]中任一项的组合物，其中前述方法包含将前述组合物移植至宿主动物的生体组织中，并将被分散配置于生物兼容性材料中的源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导。
[8]如[7]的组合物，其中宿主动物的生体组织为皮下组织。
[9]如[1]至[8]中任一项的组合物，其中类生体组织结构体包含从源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇(cluster)、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管，该分化细胞构成的复数个簇分散存在于类生体组织结构体中，该***围绕在由该分化细胞构成的复数个簇的周围，该血管侵入由该分化细胞构成的复数个簇。
[10]如[9]的组合物，其中前述分化细胞不含外分泌细胞。
[11]一种类生体组织结构体，其为包含从源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管的类生体组织结构体，其中该分化细胞构成的复数个簇系分散存在于类生体组织结构体中，该***围绕在由该分化细胞构成的复数个簇的周围，该血管侵入由该分化细胞构成的复数个簇。
[12]如[11]的类生体组织结构体，其中前述分化细胞包含胰β细胞。
[12-A]如[11]的类生体组织结构体，其中前述分化细胞包含胰β细胞及胰α细胞。
[13]如[11]至[12-A]中任一项的类生体组织结构体，其中前述分化细胞不含外分泌细胞。
[14]如[11]至[13]中任一项的类生体组织结构体，其系被用于将移植有前述类生体组织结构体的受检体的血糖值调控于正常值。
[15]一种类生体组织结构体的制造方法，其包含：将包含生物兼容性材料及源自人类多能性干细胞的细胞的组合物，移植至宿主动物的生体组织中而进行分化诱导，其中该源自人类多能性干细胞的细胞系被分散配置于生物兼容性材料中。
[16]如[15]的方法，其中生物兼容性材料为纤维蛋白凝胶。
[17]如[16]的方法，其中纤维蛋白凝胶系在前述组合物即将使用之前，将源自人类多能性干细胞的细胞及纤维蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝胶化。
[18]如[15]至[17]中任一项的方法，其中源自人类多能性干细胞的细胞系以复数个球体的形态存在。
[19]如[15]至[18]中任一项的方法，其中源自人类多能性干细胞的细胞中的Ki67阳性细胞的比率系未达3％。
[20]如[15]至[19]中任一项的方法，其中源自人类多能性干细胞的细胞为胰岛素产生细胞。
[21]如[15]至[20]中任一项的方法，其中宿主动物的生体组织为皮下组织。
[22]如[15]至[21]中任一项的方法，其中类生体组织结构体包含从分散的源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管，该分化细胞构成的复数个簇是分散于类生体组织结构体中而存在，该***围绕该分化细胞构成的复数个簇的周围，该血管侵入该分化细胞构成的复数个簇中。
[23]如[15]至[22]中任一项的方法，其中前述分化细胞不含外分泌细胞。
本说明书包含为本案优先权的基础的日本国专利申请2019-075100号的说明书及/或图式所记载的内容。
兹将本说明书所引用的所有文献、专利及专利申请原样作为参考，并汇入本说明书中。
【发明的效果】
若依照本发明，可提供包含从多能性干细胞诱导的分化细胞的类生体组织结构体的新颖制造方法。
附图说明
图1展示移植前的胰岛素产生细胞，通过流式细胞术(flow cytometry)解析蛋白质表达的结果。
图2展示经时地测定通过链脲菌素(streptozotocin)(STZ)诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠中的血中人类C-肽浓度(A)及血糖值(B)的结果，其中分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶被移植至该小鼠。
图3展示通过链脲菌素(STZ)诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠的生体内所形成的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体对葡萄糖负荷的响应的解析结果。其表示经时地测定葡萄糖负荷后的血中人类C-肽浓度(A)及血浆中葡萄糖浓度(B)的结果。
图4展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的照片。
图5展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的HE染色图。
图6展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的马森三色法(Masson trichrome)染色图。
图7展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的人类核(HuN)及PDX1的免疫组织染色图。
图8展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的胰岛素(INS)及胰高血糖素(GCG)的免疫组织染色图。
图9展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的小鼠CD31(mCD31)及嗜铬细胞分泌素A(chromogranin A)(CHGA)的免疫组织染色图。
图10展示移植6个月后从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的人类核(HuN)及Ki67的免疫组织染色图。箭头：Ki67阳性细胞。
图11展示对于通过链脲菌素(streptozotocin)(STZ)诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠，移植被分散于纤维蛋白凝胶的胰岛素产生细胞，并于移植后经时地测定所得的血中人类C-肽、胰高血糖素及血糖值。
图12展示对于通过链脲菌素(STZ)诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠及非糖尿病的NOD/SCID小鼠，移植被分散于纤维蛋白凝胶的胰岛素产生细胞，于移植28周后，从生体内摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体中的胰岛素及胰高血糖素含量的测定结果。上段表示胰岛素含量的测定结果，下段表示胰高血糖素含量的测定结果，又，各段中左边表示各小鼠的胰脏中各荷尔蒙含量的测定结果(对照)，右表示摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体中各荷尔蒙含量的测定结果。
图13展示对于移植被分散于纤维蛋白凝胶的胰岛素产生细胞，高血糖完全改善的具有Akita基因变异的NOD/SCID小鼠，负荷葡萄糖后经时地测定所得的胰高血糖素及类胰高血糖素肽-1。
图14展示对于移植被分散于纤维蛋白凝胶的胰岛素产生细胞，高血糖完全改善的STZ糖尿病NOD/SCID小鼠，在处置胰高血糖素受体拮抗剂MK-0893后负荷葡萄糖，然后经时地测定所得的血糖值及血中人类C-肽浓度。
图15展示对于移植被分散于纤维蛋白凝胶的胰岛素产生细胞，高血糖完全改善的Akita糖尿病NOD/SCID小鼠，处置类胰高血糖素肽-1受体拮抗剂Exendin-9共计3日，在处置前后测得的饱食时血中人类C-肽浓度。
实施方式
1.术语
在本说明书中，“约”表示相对于基准值变动正或负分别至25％、20％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值。优选“约”或“大概”的术语，表示相对于基准值为正或负分别15％、10％、5％、或1％的范围。
在本说明书中，“包含(comprise(s)或comprising)”意指虽表示该语句后述的要素的包含，然而不以此为限。因此，虽暗示该语句后述的要素的包含，然而非暗示其他任何要素的排除。
在本说明书中，“由…构成(consist(s)of或consisting of)”，意指包含该语句后述的所有要素，且以此为限。因此，“由…构成”的语句，表示要求或必须为所列举的要素，其他要素实质上不存在。
在本说明书中，不“使用喂养细胞(feeder cell)”，意指基本上不包含喂养细胞，不使用通过培养喂养细胞而进行预先调理(preconditioning)的培养基等。因此，在培养基中不含从喂养细胞分泌的成长因子及细胞因子(cytokine)等物质。
再者，“喂养细胞”或“喂养者”意指与其他种类的细胞共培养，可赋予能支持该细胞成长的环境的细胞。喂养细胞可源自与那些支持的细胞同种者，也可为源自与其异种者。例如，就人类细胞的喂养者而言，可使用人类皮肤纤维母细胞或人类胚性干细胞，也可使用小鼠胚纤维母细胞的初代培养物，及可使用不死化小鼠胚纤维母细胞。喂养细胞可通过放射线照射或丝裂霉素C处理等而不活化。
在本说明书中，“贴附”意指细胞附着于容器，例如，细胞于适当的培养基存在下，附着于灭菌塑料(或经涂覆的塑料)的细胞培养皿或烧瓶。在细胞之中，也有不贴附于细胞培养容器，于培养物中无法维持或成长者。与此相对地，非贴附性细胞则可不贴附于容器，于培养物中可维持，及增殖。
在本说明书中，“培养”意指使细胞在生体外环境中维持、使其成长、且/或分化。“进行培养”意指于组织或体外，例如，细胞培养皿或烧瓶中，使细胞持续、增殖(成长)、且/或分化。培养系包含2维培养(平面培养)或3维培养(悬浮培养)。
在本说明书中，“进行富集(enrich)”及“富集(enrichment)”意指使细胞的组合物等组合物中的特定构成成分的量增加，“经富集(enriched)”意指细胞的组合物，例如在用于说明细胞集团的情况，系指特定构成成分的量，与富集前的细胞集团中此种构成成分的比率相较，有所增加的细胞集团。例如，可使细胞集团等组合物，针对目标细胞型进行富集，因此，目标细胞型的比率，与富集前的细胞集团内所存在的目标细胞的比率相较，有所增加。细胞集团也可通过该技术领域中周知的细胞选择及筛选方法，针对目标细胞型进行富集。细胞集团也可通过本说明书记载的特定筛选或选择程序进行富集。本发明的特定实施形态方面，通过将标的细胞集团富集的方法，细胞集团系使关于目标细胞集团，以至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％进行富集。
在本说明书中，“消减(deplete)或(depletion)”意指使细胞或细胞的组合物等组合物中特定的构成成分的量减少，“经消减(depleted)”意指细胞或细胞的组合物，例如在用于说明细胞集团的情况，系指特定构成成分的量，与经消减前的细胞集团中此种构成成分的比率相较，有所减少的细胞集团。例如，可使细胞集团等组合物，针对目标细胞型进行消减，因此，目标细胞型的比率，与经消减前的细胞集团内所存在的目标细胞的比率相较，有所减少。细胞集团还可通过该技术领域中周知的细胞选择及筛选方法，针对目标细胞型进行消减。细胞集团还可通过本说明书中记载的特定筛选或选择程序进行消减。在本发明的特定实施形态方面，通过使目标细胞集团消减的方法，细胞集团系将关于目标细胞集团，以至少50％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％进行减少(消减)。
在本说明书中，“纯化(purify或purification)”意指将细胞的组合物等组合物中的杂质除去，关于特定的构成成分形成纯粹者，“经纯化(purified)”意指细胞的组合物，例如在用于说明细胞集团的情况，系指杂质的量，与经纯化前的细胞集团中此种构成成分的比率相较，有所减少，提升特定构成成分的纯度的细胞集团。例如，可将细胞集团等组合物，针对目标细胞型进行纯化，因此，目标细胞型的比率，与纯化前的细胞集团内所存在的目标细胞的比率相较，有所增加。细胞集团也可通过该技术领域中周知的细胞选择及筛选方法，针对目标细胞型进行纯化。细胞集团也可通过本说明书中记载的特定的筛选或选择程序进行纯化。本发明的特定实施形态中，通过将目标细胞集团纯化的方法，目标细胞集团的纯度，成为至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，或杂质(包含混杂细胞)成为无法测出的程度。
在本说明书中，“具有CDK8/19抑制活性的因子”意指具有CDK8/19的抑制活性的所有物质。与同样CDK家族的其他蛋白质对照而言，CDK8于细胞增殖中未必需要，CDK8的抑制在通常的条件下无大效果。CDK19与CDK8类似，CDK8抑制通常也伴随CDK19的抑制。
“生长因子”为促进特定细胞的分化及/或增殖的内因性蛋白质。就“生长因子”而言，例如，可列举上皮生长因子(EGF)、酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、类胰岛素生长因子l(IGF-l)、类胰岛素生长因子2(IGF-2)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转铁蛋白(transferrin)、各种白介素(interleukin)(例如，IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(例如，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、各种干扰素(interferon)(例如，IFN-γ等)及对干细胞具有效果的其他细胞因子，例如，干细胞因子(SCF)及红细胞生成素(Erythropoietin)(Epo)。
在本说明书中，“ROCK抑制剂”意指抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase)的物质，可为抑制ROCK I及ROCK II的任一者的物质。ROCK抑制剂只要具有上述的功能，无特别限定，例如，可列举N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(也称为Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基]磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂卓(H-1152)、4β-[(lR)-l-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1-甲酰胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-lH-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧代基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-甲酰胺(GSK429286A)。ROCK抑制剂不以这些为限，还可使用针对ROCK的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、结合于ROCK的抗体、显性负效(dominant negative)ROCK变异体等，作为ROCK抑制剂，可从商业上取得，也可依照周知的方法合成。
在本说明书中，“GSK3β抑制剂”为具有针对GSK3β(肝糖合成酶激酶3β)的抑制活性的物质。GSK3(肝糖合成酶激酶3)为丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶的一种，参与肝糖的产生、细胞凋亡、干细胞的维持等多个信号路径。GSK3中存在α及β的2个同功型(isoform)。本发明中所用的“GSK3β抑制剂”，只要具有GSK3β抑制活性，无特别限定，也可为合并兼具GSK3β抑制活性及GSK3α抑制活性的物质。
就GSK3β抑制剂而言，可例示CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟碱甲腈)、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑啶-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-lH-吲哚-3-基)-lH-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、肯帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂肯帕罗酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-lH-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-lH-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-乙酰肟、吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合体、OTDZT、α-4-二溴乙酰苯、锂等。GSK3β不受这些限定，也可使用针对GSK3β的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、结合于GSK3β的抗体、显性负效(dominant negative)GSK3β变异体等作为GSK3β抑制剂，可从商业上取得，也可依照周知的方法合成。
在本说明书中，“血清代替物”可列举例如，Knockout Serum Replacement(KSR:Invitrogen)、StemSure Serum Replacement(Wako)、B-27补充剂、N2-补充剂、白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、胰岛素、运铁蛋白(transferrin)、脂肪酸、胶原蛋白前驱体、微量元素(例如锌、硒(例如，***铜))、2-巯基乙醇、3'硫甘油或这些的混合物(例如，ITS-G)。就血清代替物而言，以B-27补充剂、KSR、StemSure Serum Replacement、ITS-G为优选。在培养基中添加血清代替物的情况的培养基中的浓度，为0.01至10重量％，优选为0.1至2重量％。在本发明中，以使用“血清代替物”代替血清为优选。
在本说明书中“FGFR1抑制剂”意指具有针对纤维母细胞生长因子受体(FGFR)l的抑制活性的物质。FGFRl就作为对于为生长因子的FGF1至FGF17具有高亲和性的受体而言，为4次膜贯通型酪氨酸激酶的家族(FGFR1、2、3、4)的成员。FGFR1抑制剂只要具有FGFR1抑制活性，无特别限定，可为兼具与FGFR1抑制活性合并其他FGFR的抑制活性的物质。在本说明书中“FGFR1抑制剂”意指包含即使很少，仍有FGFR1抑制活性的物质，而优选意指50％以上抑制FGFR1的物质，更优选意指FGFR1的50％抑制浓度(IC50)为以下，进一步更优选意指100nM以下的物质。就FGFR 1抑制活性的判定方法而言，只要从周知的方法选择即可，可列举如使用EnzyChrom激酶检定试剂盒(EnzyChrom Kinase Assay Kit(BioAssay Systems公司))的判定方法等。FGFR1抑制剂可利用先前周知者，其可从专利文献或非专利文献找到。
具体而言，就本发明中可利用的FGFR1抑制剂言之，可例示PD-166866(l-[2-氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-叔丁基脲：CAS No.:192705-79-6)、E-3810(CAS No.:1058137-23-7)、PD-173074(CAS No.:219580-11-7)、FGFR4-IN-1(CASNo.:1708971-72-5)、FGFR-IN-1(CAS No.:1448169-71-8)、FIIN-2(CAS No.:1633044-56-0)、AZD4547(CAS No.:1035270-39-3)、FIIN-3(CAS No.:1637735-84-2)、NVP-BGJ398(CASNo.:1310746-10-1)、NVP-BGJ398(CAS No.:872511-34-7)、CH5183284(CAS No.:1265229-25-1)、德拉赞替尼(Derazantinib)(CAS No.:1234356-69-4)、德拉赞替尼消旋物(Derazantinib Racemate)、阿魏酸(Ferulic acid)(CAS No.:1135-24-6)、SSR128129E(CAS No.:848318-25-2)、SSR128129E游离酸(CAS No.:848463-13-8)、厄达替尼(Erdafitinib)(CAS No.:1346242-81-6)、BLU9931(CAS No.:1538604-68-0)、PRN1371(CASNo.:1802929-43-6)、S49076(CAS No.:1265965-22-7)、LY2874455(CAS No.:1254473-64-7)、林昔替尼(Linsitinib)(CAS No.:867160-71-2)、多韦替尼(Dovitinib)(CAS No.:405169-16-6)、安罗替尼(Anlotinib)(CAS No.:1058156-90-3)、布立尼布(Brivanib)(CASNo.:649735-46-6)、德拉赞替尼(Derazantinib)(CAS No.:1234356-69-4)、安罗替尼盐酸盐(Anlotinib Dihydrochloride)(CAS No.:1360460-82-7)、ACTB-1003(CASNo.:939805-30-8)、BLU-554(CASNo.：1707289-21-1)、罗加拉替尼(Rogaratinib)(CAS No.:1443530-05-9)、BIBF 1120乙磺酸盐(CAS No.:656247-18-6)、TG 100572盐酸盐(CAS No.:867331-64-4)、ENMD-2076(CAS No.:934353-76-1)、布立尼布丙氨酸盐(Brivanib alaninate)(CASNo.:649735-63-7)、TG 100572(CAS No.:867334-05-2)、BIBF 1120(CAS No.:656247-17-5)、ENMD-2076酒石酸盐(CAS No.:1291074-87-7)、TSU-68(CAS No.:252916-29-3)、普那替尼(Ponatinib)(CAS No.:943319-70-8)、索凡替尼(Sulfatinib)(CAS No.:1308672-74-3)、LY2784544(CAS No.:1229236-86-5)、多韦替尼乳酸盐(Dovitinib lactate)(CAS No.:692737-80-7)、SU 5402(CAS No.:215543-92-3)、FGF-401(CAS No.:1708971-55-4)、酪氨酸激酶-IN-1(CAS No.:705946-27-6)、PP58(CAS No.:212391-58-7)、TG 100801盐酸盐(CAS No.:1018069-81-2)、克莱拉尼(Crenolanib)(CAS No.:670220-88-9)、TG100801(CASNo.:867331-82-6)、帕唑帕尼盐酸盐(Pazopanib Hydrochloride)(CAS No.:635702-64-6)、帕唑帕尼(Pazopanib)(CAS No.:444731-52-6)、PD168393(CAS No.:194423-15-9)、阿帕替尼(Apatinib)(CAS No.:1218779-75-9)、帕博西尼羟乙基磺酸盐(Palbociclibisethionate)(CAS No.:827022-33-3)、福林替尼(Foretinib)(CAS No.:849217-64-7)、乐伐替尼(Lenvatinib)(CAS No.:417716-92-8)、坦度替尼(Tandutinib)(CAS No.:387867-13-2)等或其盐(将这些化合物称为化合物群D)。又，这些化合物只要具有FGFR1抑制活性，优选只要FGFR1的50％抑制浓度(IC50)为100nM以下，也可具有选自上述的一或复数个取代基。
又，这些的化合物，只要具有FGFR1抑制活性，优选只要FGFR1的50％抑制浓度(IC50)为100nM以下，也可变换一部分的部分结构(取代基、环等)。
优选地，在本发明中，FGFR1抑制剂为CAS192705-79-6(1-[2-氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-叔丁基脲:CAS No.:192705-79-6)、E-3810(CASNo.:1058137-23-7)、PD173074(CAS No.:219580-11-7)。
FGFR1抑制剂不限定于上述所示的化合物，还可使用针对FGFR1的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、结合于FGFR1的抗体、显性负效(dominant negative)FGFR1变异体等，作为FGFR1抑制剂，可从商业上取得，也可依照周知的方法合成。
在本说明书中，“标记”意指“标记蛋白质”、“标记基因”等通过设定的细胞型特异地表达的细胞抗原或其基因。优选而言，标记为细胞表面标记，其情况、生存细胞的浓缩、分离、及/或检测变得可实施。标记可为阳性选择标记、或阴性选择标记。
标记蛋白质的检测，可为使用对该标记蛋白质特异的抗体的免疫学的检定，例如，可利用ELISA、免疫染色、流式细胞术进行。标记基因的检测，可利用该领域中周知的核酸扩增方法及/或核酸检测方法，例如，RT-PCR、微数组、生物芯片等而进行。在本说明书中，标记蛋白质为“阳性”，意指可用流式细胞术验出为阳性，为“阴性”意指用流式细胞术为检测限界以下。又，标记基因为“阳性”，意指可通过RT-PCR验出，“阴性”意指通过RT-PCR为检测限界以下。
在本说明书中，“表达(expression)”定义为细胞内由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录及/或转译翻译。
在本说明书中，“细胞”只要无特别记载，意指细胞的组成物，即细胞集团。因此，“细胞”方面不仅包含特定的细胞，也可包含一或复数个其他细胞。“细胞”中的特定细胞可通过富集或纯化，或者通过将一或复数个其他细胞消减而提高。
又，在本说明书中，“细胞”以人类细胞为优选。
2.包含源自多能性干细胞的细胞及生物兼容性材料的组成
2-1.源自多能性干细胞的细胞
在本说明书中，“多能性(pluripotency)”意指可分化成各种相异的形态或功能的组织或细胞，也可分化成3胚叶的任何***的细胞的能力。“多能性(pluripotency)”从无法分化成胎盘，因而无形成个体的能力的观点而言，与能分化成生体的所有组织，包含胎盘的“全能性(totipotency)”有所区别。
在本说明书中“专能性(multipotency)”意指可分化成复数个限定数目的***的细胞的能力。例如，间叶系干细胞、造血干细胞、神经干细胞为专能性(multipotency)，而非多能性(pluripotency)。
在本说明书中，“多能性干细胞(pluripotent stem cell)”意指胚性干细胞(ES细胞)以及潜在地具有与其同样的分化多能性，即可分化成生体的各种组织(内胚叶、中胚叶、外胚叶的全部)的能力的细胞。就具有与ES细胞同样的分化多能性的细胞而言，可列举“人工多能性干细胞”(本说明书中，也称为“iPS细胞”)。优选而言，在本发明中，多能性干细胞意指人类多能性干细胞。
就“ES细胞”而言，若为小鼠ES细胞，可利用inGenious公司、理研等所建立的各种小鼠ES细胞株，若为人类ES细胞，可利用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司所建立的各种人类ES细胞株。例如就ES细胞株而言，可利用NIH的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等、WisCell Research的H1株、H9株、理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
“人工多能性干细胞”意指通过对哺乳动物体细胞或未分化干细胞，导入特定的因子(核初期化因子)，重新编程(programming)所得到的细胞。现今，“人工多能性干细胞”有各式各样，除根据山中等人，通过对小鼠纤维母细胞导入4因子：Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc所建立的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)之外，还可使用将同样的4因子导入人类纤维母细胞所建立的源自人类细胞的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S,.et al.Cell,(2007)131:861-872.)，导入上述4因子后，以Nanog的表达作为指标筛选所建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)，以不包含c-Myc的方法所制作的iPS细胞(Nakagawa M,YamanakaS.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))，以无病毒方式导入6因子所建立的iPS细胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K et al.StemCells.31(3):458-66.)。又，也可使用根据Thomson等人所制作的导入OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28的4因子而建立的人工多能性干细胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.)，根据Daley等人所制作的人工多能性干细胞(Park IH,Daley GQ.etal.,Nature(2007)451:141-146)，根据樱田等人所制作的人工多能性干细胞日本专利(特开2008-307007号)等。
此外，还可使用公开的所有论文(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell StemCell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)，或者专利(例如，日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、W02009/007852)所记载的该领域中周知的人工多能性干细胞的任一者。
就人工多能性细胞株而言，可利用NIH、理化学研究所(理研)、京都大学等所建立的各种iPS细胞株。例如，若为人类iPS细胞株，可列举理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株，京都大学的Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、RWMH15s02株、Ff-MH15s02株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株，CDI公司的MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株，MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
在本说明书中，“源自多能性干细胞的细胞”意指通过多能性干细胞分化诱导所得到的细胞，就此种细胞而言，可列举通过多能性干细胞分化诱导的外胚叶***的细胞、中胚叶***的细胞、或内胚叶***的细胞、或这些的组合所构成的细胞。更详细而言，意指通过多能性干细胞分化诱导成的构成表皮、神经、脑、脊髓、食道、胃、小肠、大肠、膀胱、尿道、肺、甲状腺、胰脏、肝脏、肌肉、骨骼、心脏、血管、脾脏、肾脏等(不以这些为限)的器官或组织的细胞，或具有与其前驱细胞同等或类似的功能的细胞。
在优选的本发明中，“源自多能性干细胞的细胞”具有细胞彼此集合、凝集化的细胞集合体的状态，即球体的形态。源自多能性干细胞的细胞的球体可通过悬浮培养等先前周知的手法制作，或者也可使用在培养底面配置有微细空间的球体形成用培养盘(例如，商品名：Elplasia(Kuraray股份有限公司)、商品名：EZSPHERE(AGC Technologies股份有限公司)、商品名：Corning球体微培养盘(Corning International股份有限公司)。球体具有的直径为约10μm至1000μm，优选为约50μm至500μm，更优选为约50μm至300μm，进一步更优选为约50μm至200μm程度的大小。以及/或者，球体为由约100至约1000个，优选为约200至约800个，更优选为约300个至约500个左右的细胞构成。
在本发明的一实施形态中“源自多能性干细胞的细胞”是在从多能性干细胞分化成胰β细胞的过程中出现的胚体内胚叶细胞、原肠管细胞、后方前肠细胞、胰前驱细胞、内分泌前驱细胞、胰岛素产生细胞，特别优选为胰岛素产生细胞。
已知在从多能性干细胞分化成胰β细胞的过程中，随着分化阶段，出现具有不同特征的细胞(W02009/012428、WO2016/021734)。例如，此分化阶段，依照较未分化的顺序，可大致分类为多能性干细胞、胚体内胚叶细胞、原肠管细胞、后方前肠细胞、胰前驱细胞、内分泌前驱细胞、胰岛素产生细胞、胰β细胞。
“胚体内胚叶细胞”意指通过SOX17、FOXA2、BMP2、CER、及CXCR4的至少一个标记的表达而赋予特征的细胞。
“原肠管细胞”意指通过HNF1B、及HNF4A的至少一个标记的表达而赋予特征的细胞。
“后方前肠细胞”意指通过PDX-1、HNF6、及HLXB9的至少一个标记的表达而赋予特征的细胞。
“胰前驱细胞”意指通过PDX-1、NKX6.1、PTF-1α、GATA4及SOX9的至少一个标记的表达而赋予特征的细胞。
“内分泌前驱细胞”意指通过嗜铬细胞分泌素A、NeuroD及NGN3的至少一个标记的表达，及胰相关的荷尔蒙***(例如，胰岛素等)的标记未表达而赋予特征的细胞。内分泌前驱细胞也可表达PAX-4、NKX2-2、Islet-1、PDX-1、PTF-1α等标记。
“胰岛素产生细胞”意指通过胰岛素的标记的表达而赋予特征的细胞。更详细而言，“胰岛素产生细胞”系通过以约30％以上的比率包含表达胰岛素及NKX6.1两者的标记的细胞(即，胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞，以下记载为“Ins+NKX+细胞”)，且以超过约15％的比率包含只表达作为标记的胰岛素及NKX6.1中的胰岛素的细胞(即，胰岛素阳性且NKX6.1阴性的细胞，以下记载为“Ins+NKX-细胞”)而赋予特征。胰岛素产生细胞中Ins+NKX+细胞的比率的上限无特别限定，优选可为约50％以下。
胰岛素产生细胞中的Ins+NKX-细胞的比率，优选可为约20％以上，更优选为约25％以上，进一步更优选约30％以上。又，胰岛素产生细胞中Ins+NKX-细胞的比率的上限无特别限定，优选可为约40％以下。
例如，胰岛素产生细胞，以约30％以上、约50％以下的比率包含Ins+NKX+细胞，且以超过约15％、约40％以下的比率，优选为约20％以上、约40％以下的比率，更优选为约25％以上、约40％以下的比率，进一步更优选约30％以上，约40％以下的比率包含Ins+NKX-细胞。
再者，在本说明书中，胰岛素产生细胞中的设定的细胞的比率，意指相对于胰岛素产生细胞所含的全部细胞数目的比率。又，各细胞的比率，表示被分化诱导成类胰岛细胞(即被移植至生体内)的胰岛素产生细胞的值。
由于Ins+NKX-细胞多见于未成熟(分化阶段的早期)胰岛素产生细胞，表示Ins+NKX-细胞的比率越高，为越不成熟(分化阶段的早期)的胰岛素产生细胞。
胰岛素产生细胞可进一步通过选自以下的a.至f.的一个或复数个而赋予特征：
a.MAFA基因或其蛋白质的表达量低，
b.Ki67阳性细胞的比率低，
c.胰高血糖素阳性且胰岛素阴性细胞的比率低，
d.显示葡萄糖刺激性胰岛素分泌响应，
e.嗜铬细胞分泌素A阳性细胞的比率高，
f.碱性磷酸酶阳性的多能性干细胞的比率低。此处“复数”意指2、3、4、5或6。
a.MAFA基因或其基因产物的表达量低
本发明中的胰岛素产生细胞，其特征为MAFA基因或其蛋白质的表达量，比胰岛中的MAFA基因或其蛋白质的表达量低。
“胰岛”意指分化阶段比胰岛素产生细胞更进展的细胞，为包含成熟的胰β细胞，且通过为成熟胰β细胞的标记的MAFA、UCN3、及IAPP的至少一个的表达而赋予特征的细胞。胰岛可使用从健康人分离者。
胰岛素产生细胞与胰岛间的MAFA基因或其蛋白质的表达量的比较，可使用该领域中周知的手法进行，例如，可通过使用RT-PCR、微阵列、生物芯片、西方墨点法、ELISA、免疫染色、流式细胞术等手法检测、定量的MAFA基因或其蛋白质的表达量，用内部标准基因或其蛋白质的表达量校正，得到相对值，然后比较这些相对值而进行。“内部标准基因”无特别限定，例如，可利用GAPDH(甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶)(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、HPRT 1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1)等。
胰岛素产生细胞中的MAFA基因或其蛋白质的表达量，为胰岛中的MAFA基因或其蛋白质的表达量的约20％以下，优选为约15％以下，更优选为约10％以下，进一步更优选为约5％以下，特别优选为约1％以下。
由于MAFA基因或其蛋白质为成熟的胰β细胞的标记，本特征表示本发明的胰岛素产生细胞系在几乎不包含或仅以低比率包含成熟胰β细胞的程度的分化阶段。
b.Ki67阳性细胞的比率低
本发明中的胰岛素产生细胞，其特征为以小于3％的比率包含Ki67阳性细胞。
“Ki67阳性细胞”意指混杂在从多能性干细胞分化诱导的胰岛素产生细胞中，通过为标记的Ki67的表达而赋予特征的增殖性高的细胞。“Ki67”周知系作为细胞周期相关性核蛋白质，由于已知其于增殖中细胞的G1期、S期、G2期、M期可见到表达，而在为休止增殖的G0期未见到表达，故其也作为细胞增殖及细胞周期的标记。
以下，在本说明书中有时将“Ki67阳性”记载为“Ki67+”。又，有时将“Ki67阳性细胞”记载为“Ki67+细胞”。
胰岛素产生细胞中的Ki67+细胞的比率，为未达约3％，优选为未达约1％，更优选为未达约0.8％，进一步更优选为未达约0.5％。
本特征表示在胰岛素产生细胞中，几乎无Ki67+细胞的混入、残存，或为低比率。Ki67+细胞，由于其增殖性高，有对最后所得到的类生体组织结构体造成不良影响或影响存活之虞，因此其的混入、残存有时不佳。
c.胰高血糖素阳性且胰岛素阴性细胞的比率低
本发明中的胰岛素产生细胞，其特征为以未达3％的比率包含胰高血糖素阳性且胰岛素阴性(Ins-)细胞。以下，在本说明书中有将“胰高血糖素阳性”记载为“Gcg+”的情况。又，有将“胰高血糖素阳性且胰岛素阴性细胞”记载为“Gcg+Ins-细胞”的情况。
胰岛素产生细胞中的Gcg+Ins-细胞的比率，为约2.5％以下，优选为约2％以下，更优选为约1％以下，进一步更优选为约0.5％以下。
Gcg+Ins-由于为成熟的胰α细胞的标记，本特征表示本发明的胰岛素产生细胞为几乎不包含或仅以低比率包含成熟胰α细胞的程度的分化阶段。
d.显示葡萄糖刺激性胰岛素分泌响应本发明中的胰岛素产生细胞，显示葡萄糖刺激性胰岛素分泌(GSIS:Glucose Stimulated Insulin Secretion)响应。胰岛素产生细胞中的GSIS响应，可依照先前周知的手法(例如，美国申请案第11/773,944号)为基准进行，例如，可通过测定分泌于培养基中的C-肽的量而评价。C-肽，为在前胰岛素(proinsulin)的成熟化期间，以与胰岛素等莫耳的量产生的分解产物测定C-肽的量，例如，可通过使用抗C-肽单株抗体的ELISA进行。
e.嗜铬细胞分泌素A(chromogranin)阳性细胞的比率高本发明中的胰岛素产生细胞，其特征为以超过约45％的比率包含嗜铬细胞分泌素A阳性细胞。
以下，在本说明书中有将“嗜铬细胞分泌素A阳性”记载为“Chga+”的情况。又，有将“嗜铬细胞分泌素A阳性细胞”记载为“Chga+细胞”的情况。
胰岛素产生细胞中的Chga+细胞的比率，优选可为约50％以上(例如，约55％以上)，更优选为约60％以上，进一步更优选约70％以上，再进一步更优选约80％以上，特别优选为约90％以上。胰岛素产生细胞中的Chga+细胞的比率的上限无特别限定，然而例如可为约99％以下。
在Chga+细胞中包含分泌胰岛素等荷尔蒙的细胞(内分泌细胞)，这也包含上述Ins+NKX+细胞或Ins+NKX-细胞。因此，本特征显示本发明的胰岛素产生细胞以高比率包含内分泌细胞。
f.碱性磷酸酶阳性的多能性干细胞的比率低
本发明中的胰岛素产生细胞，其特征为以未达约0.01％的比率包含碱性磷酸酶阳性的多能性干细胞。
胰岛素产生细胞中的碱性磷酸酶阳性的多能性干细胞的比率，优选可为约0.008％以下，更优选为约0.005％以下，进一步更优选为约0.001％以下。
由于碱性磷酸酶为显示多能性干细胞的未分化状态的标记，本特征显示本发明的胰岛素产生细胞几乎不含，或仅以低比率包含未被分化诱导的目的以外的多能性干细胞。
碱性磷酸酶阳性的多能性干细胞，可进一步表达显示多能性的其他标记。就显示多能性干细胞的多能性的其他标记而言，可利用选自NANOG、SOX2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等中的至少一个。
从多能性干细胞向胚体内胚叶细胞、原肠管细胞、后方前肠细胞、胰前驱细胞、内分泌前驱细胞、及胰岛素产生细胞的分化诱导，可利用以下的分化诱导步骤进行：
步骤1)从多能性干细胞分化诱导成胚体内胚叶细胞；
步骤2)从胚体内胚叶细胞分化诱导成原肠管细胞；
步骤3)从原肠管细胞分化诱导成后方前肠细胞；
步骤4)从后方前肠细胞分化诱导成胰前驱细胞；
步骤5)从胰前驱细胞分化诱导成内分泌前驱细胞；
步骤6)从内分泌前驱细胞分化诱导成胰岛素产生细胞。
以下，说明各步骤，然而分化诱导成各细胞的手法不限定于这些手法。
步骤1)分化成胚体内胚叶细胞
多能性干细胞系在包含低用量的激活素A(activin A)的培养基中培养，分化成胚体内胚叶细胞。
就本步骤中所用的培养基而言，可使用RPMI培养基、MEM培养基、iMEM培养基、DMEM(杜尔贝柯改良伊格尔培养基)培养基、改良的MEM锌选择培养基(Improved MEM ZincOption Medium)、改良的MEM/l％B-27补充剂/青霉素-链霉素培养基、MCDB131/10mM葡萄糖/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/抗坏血酸/青霉素-链霉素培养基等使用于哺乳类细胞的培养的基本培养基。
激活素A能以低用量，例如，5至10ng/mL的量，包含于培养基中。
就其他方面而言，激活素A于培养基中的浓度，为约0.1至100ng/ml，优选为约1至50ng/ml，更优选为约3至10ng/ml。
培养基中可进一步添加ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂。
GSK3β抑制剂于培养基中的浓度，可随所用的GSK3β阻碍剂的种类而适宜设定，例如就GSK3β抑制剂而言，在使用CHIR99021的情况的浓度，通常为2至5μM，优选为2至4μM，特别优选为约3μM。
ROCK抑制剂于培养基中的浓度，虽可随所用的ROCK阻碍剂的种类而适宜设定，然而例如就ROCK抑制剂而言，在使用Y27632的情况的浓度，通常为5至20μM，优选为5至15μM，特别优选为约10μM。
培养基中可进一步添加胰岛素。胰岛素可以0.01至20μM，优选0.1至10μM，更优选0.5至5μM的量包含于培养基中。培养基中的胰岛素的浓度，也可为添加的B-27补充剂中所含的胰岛素的浓度，然而不以此为限。
培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。培养开始时的细胞数无特别限定，然而若为2维培养，可调成约5万至100万个细胞/cm2，优选为约10万至80万个细胞/cm2，更优选为约10至30万个细胞/cm2。又，培养开始时的细胞数无特别限定，若为3维培养，可调成约1万至100万个细胞/mL，优选为约10万至80万个细胞/mL，更优选为约30万至60万个细胞/mL。培养期间为1日至4日，优选为1日至3日，特别优选为3日。
培养温度，无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
或者，在本发明的胚体内胚叶细胞，可通过在低用量的激活素A存在下，将多能性干细胞于胰岛素作用的条件下的培养基中进行第1次培养，继而，于无胰岛素作用的条件下的培养基中进行第2次培养而制造。
(1)第1次培养
“胰岛素作用的条件”意指通过胰岛素于细胞发生胰岛素信号传达途径活化的条件。通常，胰岛素与细胞膜表面上存在的胰岛素受体结合，使受体固有的酪氨酸激酶活化，而将胰岛素受体基质蛋白家族(IRS:IRS-1、2、3)酪氨酸磷酸化。在本说明书中，将通过胰岛素与胰岛素受体的结合而启动这些一连串反应的发生，称为“发生胰岛素信号传达途径的活化”。
就胰岛素作用的条件而言，例如，可列举培养基中包含胰岛素的情况。胰岛素只要能将多能性干细胞中的胰岛素信号传达途径活化者即可，可为通过重组法制造者，也可为通过固相合成法合成而制造者。胰岛素虽可利用源自人类、非人类灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、骆驼、狗、猫、兔、小鼠、天竺鼠等者，然而优选为人类胰岛素。
在本发明中，只要能使多能性干细胞中的胰岛素信号传达途径活化，也可使用胰岛素变异体、胰岛素衍生物或胰岛素促效剂作为“胰岛素”。“胰岛素变异体”可列举由胰岛素的氨基酸序列中，1至20个，优选1至10个，进一步更优选1至5个氨基酸被删除、置换、附加或***而成的氨基酸序列构成，且可发生胰岛素信号传达途径的活化的多肽，或由与胰岛素的氨基酸序列具有80％以上，更优选90％以上，进一步更优选95％以上，最佳99％以上的序列相同性的氨基酸序列构成，且可发生胰岛素信号传达途径的活化的多肽者。氨基酸序列的比较可通过周知的手法进行，例如，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Toolat the National Center for Biological Information(美国国立生物学数据中心的基本原位比对检索工具))等，例如以默认值的设定而实施。“胰岛素衍生物”意指由胰岛素或胰岛素变异体的氨基酸残基的一部分基以化学方式置换(例如，α-甲基化、α-羟基化)、删除(例如，脱氨基化)、或修饰(例如，N-甲基化)而成的氨基酸序列构成，且具有可发生胰岛素信号传达途径的活化的多肽或具有同样作用的物质。“胰岛素促效剂”意指与胰岛素的结构无关，但可与胰岛素受体结合，发生胰岛素信号传达途径的活化的多肽或具有同样作用的物质。
第1次培养的培养基中，能以0.01至20μM，优选0.1至10μM，更优选0.5至5μM的量，包含胰岛素。培养基中的胰岛素的浓度，可为添加的B-27补充剂中所含的胰岛素的浓度，然而不以此为限。
培养基中可进一步包含ROCK抑制剂、及/或GSK3β抑制剂。ROCK抑制剂的培养基中的浓度，可依据所用的ROCK抑制剂的种类而适宜设定，然而例如使用Y-27632作为ROCK抑制剂的情况的浓度，通常可调成5至20μM，优选5至15μM，特别优选约10μM。GSK3β抑制剂的培养基中的浓度，可依据所用的GSK3/3抑制剂的种类而适宜设定，例如使用CHIR99021作为GSK3/3抑制剂的情况的浓度，通常可调成2至5μM，优选2至4μM，特别优选约3μM。
培养基中可进一步包含选自丙酮酸盐(钠盐等)、L-丙胺酰基L-谷酰氨酸、及葡萄糖构成的群组中的一种以上。丙酮酸盐能以10至1000mg/L，优选30至500mg/L，更优选50至200mg/L，特别优选约110mg/L的量包含于培养基中。L-丙胺酰基L-谷酰氨酸，能以50至2000mg/L，优选100至1500mg/L，更优选500至1000mg/L，特别优选约860mg/L的量包含于培养基中。葡萄糖能以15mM以上，优选15至30mM，更优选15至25，特别优选约25mM的量包含于培养基中。培养基中的丙酮酸盐、L-丙胺酰基L-谷酰氨酸及葡萄糖的浓度，只要为DMEM培养基(DMEM、高葡萄糖、GlutaMAXTM、丙酮酸盐(Thermo Fisher Scientific))或其他DMEM培养基中所含的丙酮酸盐、L-丙胺酰基L-谷酰氨酸及葡萄糖的浓度即可，但不以此为限定。
培养基可使用以上述基本培养基作为基础，并添加一种或一种以上的上述成分者。就基本培养基而言，优选为DMEM培养基，更优选为以上述的量包含丙酮酸盐、L-丙胺酰基L-谷酰氨酸、及葡萄糖的DMEM培养基。
第1次培养的培养期间可为选自6小时至48小时，优选为12至24小时的范围。培养温度无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。培养以2维培养及3维培养的任一者进行即可。培养开始时的细胞数，无特别限定，若为2维培养，可调成约5万至100万个细胞/cm2，优选约10万至80万个细胞/cm2，更优选约10至30万个细胞/cm2。又，培养开始时的细胞数，无特别限定，若为3维培养，可调成约1万至100万个细胞/mL，优选约10万至80万个细胞/mL，更优选约30万至60万个细胞/mL。
(2)第2次培养
“无胰岛素作用的条件”意指无法通过胰岛素而于细胞中发生胰岛素信号传达途径的活化的条件。“未于细胞发生胰岛素信号传达途径的活化”不仅意指完全未发生该胰岛素信号传达途径的活化，也意指只发生与胰岛素不存在下该胰岛素信号传达途径的活化相比，未见到有显著差异程度的轻微活化。因此，“无胰岛素作用的条件”，例如，可列举“在培养基中不含胰岛素，或者即使在培养基中包含胰岛素的情况，其仅以发生未见前述有显著差异的程度的轻微活化的量被包含”的条件。或者，也意指即使在培养基中包含胰岛素的情况，通过同时包含胰岛素信号抑制剂，而未发生前述胰岛素信号传达途径的活化。“胰岛素信号抑制剂”意指可于任一位置遮断胰岛素信号传达途径的成分。就此种胰岛素信号抑制剂而言，可列举与胰岛素、胰岛素受体、作为信号传达物质而作用的各种蛋白质等结合或竞争，因而抑制这些因子所参与的分子间相互作用的多肽或化合物等。例如，就此种胰岛素信号抑制剂而言，可列举竞争抑制ATP与PI3激酶的触媒亚单元结合的LY294002[2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮]等。胰岛素信号抑制剂不限于这些，还可使用下列者作为胰岛素信号抑制剂：与胰岛素、胰岛素受体、作为信号传达物质而作用的各种蛋白质结合的抗体，或这些的显性负效(dominant negative)型变异体；以及针对胰岛素受体或作为信号传达物质而作用的各种蛋白质的mRNA的反义寡核苷酸，或siRNA等。胰岛素信号抑制剂可从商业上取得，也可依照周知的方法合成。
培养基中可进一步包含ROCK抑制剂、及/或GSK3β抑制剂。培养基中的ROCK抑制剂、及/或GSK3β抑制剂的量，可选自上述第1次培养中所记载的范围，可为与第1次培养中所用者相同的量，也可为相异者。
培养基中可进一步包含选自丙酮酸盐、L-丙胺酰基、L-谷酰氨酸、及葡萄糖所构成的群组中的一种以上。培养基中的丙酮酸盐、L-丙胺酰基L-谷酰氨酸、及葡萄糖的量，可选自上述第1次培养中所记载的范围，可为与第1次培养中所用者相同的量，也可为相异者。
第2次培养中所用的培养基，可使用以哺乳类细胞的培养中所使用的基本培养基作为基础，并添加上述成分的一种或一种以上者。就基本培养基而言，可使用上述第1次培养中所记载者，可为与第1次培养中所用者相同的基本培养基，也可为相异者。优选为DMEM培养基，更优选为以上述的量包含丙酮酸盐、L-丙胺酰基L-谷酰氨酸、及葡萄糖的DMEM培养基。
第2次培养的培养期间，可为选自至少6小时，优选为6至72小时、进一步更优选24小时至72小时的范围。培养温度无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
第1次培养及第2次培养的培养基中，可以上述低用量包含激活素A。第1次培养及第2次培养的培养基中所含的激活素A的量，可为相同的量，也可相异。
第1次培养及第2次培养的培养基中，也可进一步添加二甲基亚砜。
通过将多能性干细胞于低用量的激活素A存在下进行培养，或者通过将多能性干细胞于低用量的激活素A存在下，在胰岛素作用的条件下的培养基中进行第1次培养，继而在无胰岛素作用的条件下的培养基中进行第2次培养，可在步骤6)以下，提高所得到的内分泌细胞的比率。
步骤2)分化成原肠管细胞
将步骤i)所得到的胚体内胚叶细胞，进一步在包含生长因子的培养基中培养，可分化诱导成为原肠管细胞。培养期间为2日至8日，优选为约4日。
培养温度无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度，为例如约5％。培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。
培养基可使用上述步骤1)中所记载的哺乳类细胞的培养中所用的基本培养基。培养基中，除生长因子之外，还可适宜添加血清代替物、维生素、抗生素等。
就生长因子而言，以EGF、KGF、FGF10为优选，以EGF及/或KGF为更优选，以KGF为进一步更优选。
生长因子的培养基中的浓度，依据所用的生长因子的种类而适宜设定，然而通常为约0.lnM至1000μM，优选为约0.lnM至100化μM。在EGF的情况，其浓度为约5至2000ng/ml(即，约0.8至320nM)，优选为约5至1000ng/ml(即，约0.8至160nM)，更优选为约10至1000ng/ml(即，约1.6至160nM)。在FGF10的情况，其浓度为约5至2000ng/ml(即，约0.3至116nM)，优选为约10至1000ng/ml(即，约0.6至58nM)，更优选为约10至1000ng/ml(即，约0.6至58nM)。例如在使用KGF作为生长因子的情况的浓度，通常为5至150ng/mL，优选为30至100ng/mL，特别优选为约50ng/mL。
步骤3)分化成后方前肠细胞
将步骤2)中所得到的原肠管细胞进一步于包含生长因子、环巴胺(cyclopamine)、头蛋白(noggin)等的培养基中培养，分化诱导成为后方前肠细胞。培养期间为1日至5日，优选为约2日。培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。
培养温度无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
培养基可使用上述步骤1)中所记载的哺乳类细胞的培养中所用的基本培养基。培养基中，除生长因子之外，还可适宜添加血清代替物、维生素、抗生素等。
就生长因子而言，以EGF、KGF、FGF10为优选，以EGF及/或KGF为更优选，以KGF为进一步更优选。
生长因子的培养基中的浓度，虽可随所用的生长因子的种类而适宜设定，然而通常为约0.lnM至1000μM，优选为约0.1nM至100μM。在EGF的情况，其浓度为约5至2000ng/ml(即，约0.8至320nM)，优选为约5至1000ng/ml(即，约0.8至160nM)，更优选为约10至1000ng/ml(即，约1.6至160nM)。在FGF10的情况，其浓度为约5至2000ng/ml(即，约0.3至116nM)，优选为约10至1000ng/ml(即，约0.6至58nM)，更优选为约10至1000ng/ml(即，约0.6至58nM)。例如在使用KGF作为生长因子的情况的浓度，通常为5至150ng/mL，优选为30至100ng/mL，特别优选为约50ng/mL。
环巴胺于培养基中的浓度，无特别限定，而通常为0.5至1.5仅M，优选为0.3至1.0μM，特别优选为约0.5μM。
头蛋白(noggin)于培养基中的浓度，无特别限定，而通常为10至200ng/mL，优选为50至150ng/mL，特别优选为约l00ng/mL。
又，培养基还可添加二甲基亚砜。
步骤4)分化成胰前驱细胞
将步骤3)中所得到的后方前肠细胞进一步于包含具有CDK8/19抑制活性的因子的培养基，优选为包含具有CDK8/19抑制活性的因子及增殖因子的培养基中培养，可分化诱导成胰前驱细胞。培养期间为2日至10日，优选为约5日。培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。在2维培养的情况，将步骤3)所得到的后方前肠细胞，依照先前报导(Toyoda etal.,Stem cell Research(2015)14,185-197)，用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理后，通过吸液(pipetting)分散，将0.25％胰蛋白酶-EDTA离心并悬浮后，再播种于步骤4)的新培养基。
培养基与步骤1)同样地，可使用哺乳类细胞的培养中所用的基本培养基。培养基中，除生长因子之外，还可适宜添加血清代替物、维生素、抗生素等。
就具有CDK8/19抑制活性的因子而言，可使用前述的各种化合物或其盐，根据所用的化合物或其盐，适宜决定对培养基的添加量，然而通常为约0.00001μM-5μM，优选为0.00001μM-lμM。就具有CDK8/19抑制活性的因子于培养基中的浓度而言，以对于CDK8/19达到50％以上的抑制活性的浓度为优选。
就生长因子而言，以EGF、KGF、FGF10为优选，以KGF及/或EGF为更优选，以KGF及EGF为进一步更优选。
生长因子的培养基中的浓度，可随所用的生长因子的种类而适宜设定，然而通常为约0.1nM至1000μM，优选为约0.1nM至100μM。在EGF的情况，其浓度为约5至2000ng/ml(即，约0.8至320nM)，优选为约5至1000ng/ml(即，约0.8至160nM)，更优选为约10至1000ng/ml(即，约1.6至160nM)。在FGF10的情况，其浓度为约5至2000ng/ml(即，约0.3至116nM)优选为约10至1000ng/ml(即，约0.6至58nM)，更优选为约10至1000ng/ml(即，约0.6至58nM)。例如在使用KGF及EGF作为生长因子的情况的浓度，EGF通常为5至150ng/mL，优选为30至100ng/mL，特别优选为约50ng/mL，KGF通常为10至200ng/mL，优选为50至150ng/mL，特别优选为约100ng/mL。
步骤4)中的培养的最初1日，系在ROCK抑制剂存在下进行，然后则可在不含ROCK抑制剂的培养基中培养。
又，培养基中还可包含PKC活化剂。就PKC活化剂而言，可使用PdBU(PKC activatorII)、TPB(PKC activator V)等，然而不以其为限。PKC活化剂的浓度系以约0.1至100ng/ml，优选约1至50ng/ml，更优选约3至10ng/ml的量添加。
又，培养基中还可添加二甲基亚砜、激活素(1至50ng/ml)。
在任一个步骤中，于培养基内，除上述成分之外，均可添加血清代替物(例如，B-27补充剂、ITS-G)。又，视需要还可添加氨基酸、L-谷酰氨酸、GlutaMAX(制品名)、非必需氨基酸、维生素、烟酰胺、抗生素(例如，抗生素-抗真菌素(Antibiotic-Antimycotic)(本说明书中，有时称为AA)、青霉素、链霉素、或这些的混合物)、抗菌剂(例如，两性霉素B(amphotericin B))、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。在培养基中添加抗生素的情况，该培养基中的浓度通常为0.01至20重量％，优选为0.1至10重量％。
培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。培养温度无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
步骤5)分化成内分泌前驱细胞
将步骤4)中所得到的胰前驱细胞进一步于包含生长因子的培养基中培养，分化诱导成为内分泌前驱细胞。培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。在2维培养的情况中，将步骤4)中所得到的胰前驱细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理后，通过吸液(pipetting)分散，将0.25％胰蛋白酶-EDTA离心并悬浮后，于步骤5)的新培养基中再播种。培养期间为2日至3日，优选为约2日。
培养基可使用上述步骤1)中所记载的哺乳类细胞的培养所用的基本培养基。在培养基中，依照先前报导(Nature Biotechnology 2014；32:1121-1133)，添加SANT1、视黄酸(retinoic acid)、ALK5抑制剂II、T3、LDN，进一步可适宜地添加Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选为FGF2)、血清代替物、维生素、抗生素等。又，培养基中也可添加二甲基亚砜。
培养系在不使用喂养细胞下，通过非贴附培养进行。培养时，可使用培养皿、烧瓶、微培养盘、多孔培养盘(Nunc公司)等或生物反应器。培养容器以经过用于降低与细胞的贴附性的表面处理为优选。
培养温度无特别限定，于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
步骤6)分化成胰岛素产生细胞
将步骤5)中所得到的内分泌前驱细胞进一步于包含FGFR1抑制剂的培养基中培养，分化诱导成为胰岛素产生细胞。培养期间为10日至30日，优选为约10至20日。
培养基可使用上述步骤1)中所记载的哺乳类细胞的培养所用的基本培养基。培养基中依照已知的报导(Nature Biotechnology 2014；32:1121-1133)，添加ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制剂XX、γ-分泌酶抑制剂RO、N-半胱氨酸、AXL抑制剂、抗坏血酸，也可进一步适宜添加Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选为FGF2)、血清代替物、维生素、抗生素等。例如，培养基中可添加ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制剂RO、及抗坏血酸，或者可添加T3、ALK5抑制剂II、ZnSO4、肝素、N-乙酰基半胱氨酸、Trolox、及R428。
培养可通过2维培养及3维培养的任一者进行。优选的培养系在不使用喂养细胞下，通过非贴附培养进行。培养时，可使用培养皿、烧瓶、微培养盘、多孔培养盘(Nunc公司)等或生物反应器。培养容器以经过用于降低与细胞的贴附性的表面处理为优选。
培养温度无特别限定，可于30至40℃(例如，37℃)进行。又，培养容器中的二氧化碳浓度为例如约5％。
培养基中，可通过能抑制FGFR1活性的任何量，包含FGFR1抑制剂，例如，可通过10μM以下，或5μM以下的量，优选为通过未达5μM、未达4μM、未达3μM、未达2μM的量，包含FGFR1阻碍剂。FGFR1抑制剂的添加量的下限无特别限定，然而可调成0.1μM以上，优选为0.5μM以上。FGFR1抑制剂的添加量，优选为未达5μM且0.1μM以上，更优选为未达5μM且0.5μM以上。FGFR1抑制剂存在下的培养，可于至少12小时，优选24小时以上、2日以上、4日以上、8日以上、10日以上、或15日以上进行。FGFR1抑制剂存在下的培养，以进行4日以上为优选。例如，步骤6)的最后约4至15日，优选最后约4至7日，可进行FGFR1抑制剂存在下的培养。在通过FGFR1抑制剂处理期间中，也可进行培养基的交换，可依照培养进度，与添加有FGFR1抑制剂且具有与交换前相同组成的培养基或具有与交换前相异组成的培养基进行交换。
在包含FGFR1抑制剂的培养基中，通过培养细胞，可抑制所得到的胰岛素产生细胞中Ki67阳性细胞的增殖。
步骤6)中所得到的胰岛素产生细胞，可使用胰蛋白酶等酵素解离而回收。所回收的胰岛素产生细胞，可冻结保存至使用为止。继而，将回收的胰岛素产生细胞于上述培养基中，以每1培养器或每1孔约50万至500万个，优选约100万至400万个，更优选约200万至300万个的量播种，进行3维培养，可得到为球体形态的胰岛素产生细胞。各球体系由约100至约1000个，优选约200至约800个，更优选约300个至约500个的细胞构成。
2-2.生物兼容性材料
在本说明书中“生物兼容性材料”意指在移植至生体内，短期或长期留置的情况，不会诱导显著的免疫响应或有害的生体反应(例如，毒性反应、凝血等)的任何材料。优选而言，“生物兼容性材料”为移植后，促进宿主的血管新生、***的产生者。又，“生物兼容性材料”以生物分解性材料为优选。就此种材料而言，可列举聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚甘醇酸(PGA)、聚乳酸-共-甘醇酸(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)(PEVA)、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚亚乙基胺、聚羟基酪酸、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙烯醇、聚富马酸丙二醇酯、聚丙烯酸、聚e-己内酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果酸、透明质酸、肝素硫酸、软骨素硫酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)蛋白多糖、肝素、甲壳素、壳聚糖、黄原胶、羧基甲基纤维素、羧基甲基壳聚糖、海藻酸、海藻酸酯、胶原蛋白、纤维素、丝素蛋白、角蛋白、明胶、纤维蛋白、普鲁兰多糖、层黏连蛋白、结冷胶、聚硅氧、氨基甲酸酯、弹性蛋白等及这些的修饰体、以及这些的组合。“生物兼容性材料”的表面，可视需要施行能进行细胞的接着的表面修饰(例如，通过细胞接着用基质(胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层黏连蛋白、纤连蛋白、基底胶(matrigel)、玻连蛋白等)的涂覆)，或通过已知控制细胞的增殖、分化或功能的官能基(例如，氨基、羧基、羟基、甲基丙烯酸基、丙烯酸基等)的改变。“生物兼容性材料”可具有块状、珠粒状、颗粒状、球状、片状、凝胶状等任何形态，可形成中实性或多孔性。就“生物兼容性材料”的形状而言，以立体形状为优选，例如，可为球体、四面体、六面体等多面体；圆柱、角柱、圆锥、截圆锥体、角锥、截角锥体、环面体、圆盘体、椭圆体或这些的变形立体等，只要细胞能分散于生物兼容性材料内的形状即可。
“生物兼容性材料”只要能进行生体内的移植及留置的大小即可，例如，边的长度最长(若为圆形则为直径)可调成约0.1至3.0cm，优选为约0.5至2.0cm，厚度为约0.1至2.0cm，优选为约0.3至1.5cm。生物兼容性材料中所含的细胞成为约50万个至500万个，优选为约100万个至300万个。
就其他方面而言，例如，“生物兼容性材料”的大小，可将边的长度最长时(若为圆形则其直径)调至约1至30cm，优选为约1至15cm，更优选为约2至10cm。
“生物兼容性材料”可进行复数移植及留置。
在本发明中，优选的“生物兼容性材料”为凝胶(水凝胶)状。生物兼容性材料的凝胶化，可根据各生物兼容性材料，依照周知的手段进行，例如，通过在生物兼容性材料的水溶液中添加交联剂(例如，钙离子、镁离子、钮离子、鎭离子等金属阳离子或其盐形态)，或者通过在水中使纤维蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)作用而进行。在本发明中，特别优选的“生物兼容性材料”为纤维蛋白凝胶。凝胶可在适当溶剂(例如，水、生理食盐水、培养基等)中，以约0.01至10重量％的任何量包含于生物相容性材料中。
在本发明中，源自多能性干细胞的细胞系分散配置于生物相容性材料中。“分散配置”意指不使源自多能性干细胞的细胞局限于任一部位，而广泛地分布配置于生物兼容性材料中。例如，在源自多能性干细胞的细胞具有球体的形态的情况，意指邻接的球体夹在生物兼容性材料之间而存在。例如，在源自多能性干细胞的细胞具有球体的形态的情况，意指邻接的球体被配置成具有约1μm以上，优选约5μm以上的间隔。
就其他方面而言，“分散配置”，意指在源自多能性干细胞的细胞具有球体的形态的情况，生物兼容性材料中的球体的一定比率以上(30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上)以互相不接触的方式配置，优选为生物兼容性材料中的球体的95％以上以互相不接触的方式配置。
就其他方面而言，“分散配置”意指在源自多能性干细胞的细胞具有球体的形态的情况，生物兼容性材料中，一定比率以上(30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上)的球体为直径50至500以m的球体(意指不互相接触成大球体)，以生物兼容性材料中95％以上的球体系直径50至500/μm的球体为优选。
就其他方面而言，“分散配置”意指在源自多能性干细胞的细胞具有球体的形态的情况，生物兼容性材料中球体以圆点状(pin dot)三维方式配置。“以圆点状(pin dot)三维方式配置”，意指不仅各球体与周围的球体拉开间隔，三维地存在，还有与周围的球体接触而存在的情况。各球体可分别为相同大小，也可为不同大小。其中“分散配置”非意指各球体配置于生物兼容性材料中后，通过凝集、融合而形成大球体。
“分散配置”可通过任何手段而达成，可通过将源自多能性干细胞的细胞液充分地搅拌混合，播种于生物兼容性材料中，以及/或者，通过调整播种于生物兼容性材料中的源自多能性干细胞的细胞的浓度，以及/或者，通过将源自多能性干细胞的细胞添加在生物兼容性材料的溶液并充分地搅拌混合而进行。例如，在生物兼容性材料为凝胶状的情况，通过在凝胶化前的生物兼容性材料的溶液中，将源自多能性干细胞的细胞，以每50至200μL，成为100至600万个细胞，优选为200至500万个细胞的量的条件混合、搅拌，于细胞沉降前进行凝胶化，可使源自多能性干细胞的细胞分散配置于生物兼容性材料中。
就其他方面而言，例如，在生物兼容性材料为凝胶状的情况，可通过在凝胶化前的生物兼容性材料的溶液，将源自多能性干细胞的细胞，以每15至50mL，成为1x107至1x1010个细胞，优选为3x108至1x109个细胞的量的条件混合、搅拌，并在细胞沉降前进行凝胶化，可使源自多能性干细胞的细胞分散配置于生物兼容性材料中。
3.类生体组织结构体
在本说明书中“类生体组织结构体”意指具有与表皮、神经、脑、脊髓、食道、胃、小肠、大肠、膀胱、尿道、肺、甲状腺、胰脏、肝脏、肌肉、骨骼、心脏、血管、脾脏、肾脏等(不以这些为限)的生体器官或组织同等或类似的功能的结构体。类生体组织结构体可通过将源自多能性干细胞的细胞分散配置于生物兼容性材料中所形成的组合物移植并留置于动物生体内，使源自多能性干细胞的细胞进行分化诱导而得到。
“动物”以哺乳动物为优选，例如，可列举人类、非人类灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、骆驼、狗、猫、兔、小鼠、天竺鼠等，然而优选为人类。
移植以在可将前述组合物固定于一定位置的生体内区域进行为优选，例如，可于动物的皮下、腹腔内、腹膜上皮、大网膜、脂肪组织、肌肉组织或胰脏、肾脏等各脏器的被膜下等进行。
移植后，组合物内的源自多能性干细胞的细胞，在生体内环境中被分化诱导乃至分化、成熟，依据所用的“源自多能性干细胞的细胞”，可得到具有与表皮、神经、脑、脊髓、食道、胃、小肠、大肠、膀胱、尿道、肺、甲状腺、胰脏、肝脏、肌肉、骨骼、心脏、血管、脾脏、肾脏等(不以这些为限)的器官或组织同等或类似的功能的结构体。
所得到的类生体组织结构体，之后可回收，也可原样留置于生体内。
类生体组织结构体，可包含通过源自多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管。
通过源自多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞，形成复数个簇，分散存在于类生体组织结构体中。各簇具有直径约10μm至1000μm，优选约50μm至500μm，更优选约50μm至300μm的大小。以及/或者，各簇系由约100至约1000个，优选约200至约800个，更优选约300个至约500个的细胞构成。类生体组织结构体中，簇可以约50个至2000个，优选约100个至500个分散而存在，然而其数可随分散配置于生物兼容性材料中的源自多能性干细胞的细胞数目而变化。“分散而存在”意指分化细胞的各簇不局限任一部位，而以广泛分布在类生体组织结构体中的方式存在。又，“分散而存在”意指使邻接的簇经由源自宿主动物的***而存在。
“源自宿主动物的***”意指源自移植有前述组合物的动物的细胞所产生的细胞外基质，包含弹性蛋白、小纤维蛋白(fibrillin)、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白等。源自宿主动物的***中，分化细胞以围绕复数个簇的周围的方式存在，埋藏于类生体组织结构体中的各簇之间。
“源自宿主动物的血管”意指源自移植有前述组合物的动物的细胞所形成的类生体组织结构体外的与宿主动物的血管相连的血管。源自宿主动物的血管侵入类生体组织结构体中的各簇，使血液循环至各簇，进行氧或营养分等的供给，或旧废物的排出。
就本发明的一实施形态而言，以源自多能性干细胞的细胞言之，在使用从多能性干细胞分化为胰β细胞的过程中出现的胚体内胚叶细胞、原肠管细胞、后方前肠细胞、胰前驱细胞、内分泌前驱细胞、或胰岛素产生细胞，优选为胰岛素产生细胞的情况，于移植至生体内之前述组成物内，这些细胞被分化诱导而成熟，可得到包含具有与胰岛同等或类似的功能的分化细胞(以下，记载为“类胰岛细胞”)的类生体组织结构体。
在以此种方式所得到的类生体组织结构体中，类胰岛细胞可通过选自以下的(a)至(g)的一或复数个赋予特征：
(a)表达MAFA、UCN3、及IAPP的至少一个标记，
(b)嗜铬细胞分泌素A阳性细胞(Chga+细胞)的比率高，
(c)Ki67阳性细胞(Ki67+细胞)的比率低，
(d)胰高血糖素阳性且胰岛素阴性细胞(Gcg+Ins-细胞)的比率高，
(e)具有于低血糖响应的胰岛素分泌作用，
(f)不含外分泌细胞，
(g)胰岛素阳性且胰高血糖素阴性细胞(Ins+Gcg-细胞)的比率高。
此处“复数”意指2、3、4、5、6或7。
(a)至(g)的特征的有无，可于分化诱导胰岛素产生细胞后(即，将前述的组合物移植至生体内后)，4周以后，优选8周以后进行评价。又，类胰岛细胞中的设定的细胞的比率，意指相对于源自移植片的细胞块的全部细胞数目的比率。
(a)表达MAFA、UCN3、及IAPP的至少一个标记在类胰岛细胞中，包含胰β细胞。胰β细胞表达为成熟标记的MAFA、UCN3、及IAPP中的至少一个标记。又，胰β细胞也可通过葡萄糖刺激所造成的胰岛素分泌上升反应而赋予特征。
(b)Chga+细胞的比率高
类胰岛细胞的特征为以约50％以上的比率包含Chga+细胞。优选类胰岛细胞中的Chga+细胞的比率，为约60％以上，更优选为约70％以上，进一步更优选为约90％以上，特别优选为约95％以上(例如，约97％以上、约98％以上)。
在Chga+细胞中，包含分泌胰岛素或胰高血糖素等荷尔蒙的细胞(内分泌细胞)，本特征显示类胰岛细胞以高比率包含内分泌细胞。
(c)Ki67+细胞的比率低
类胰岛细胞的特征为以未达约3％的比率包含Ki67阳性细胞。优选类胰岛细胞中的Ki67阳性细胞的比率为未达约1％，更优选为未达约0.8％，进一步更优选为未达约0.5％
本特征显示在类胰岛细胞中、其混入、残存不佳的情况系几乎无Ki67+细胞，或非常低的比率。
(d)Gcg+Ins-细胞的比率高
类胰岛细胞的特征为以约10％以上的比率包含Gcg+Ins-细胞。优选类胰岛细胞中的Gcg+Ins-细胞的比率为约15％以上-更优选为约20％以上，进一步更优选为约25％以上。类胰岛细胞中的Gcg+Ins-细胞的比率的上限无特别限定，例如，可为约50％以下，优选为约45％以下，更优选为约40％以下。
由于Gcg+Ins-为成熟的胰α细胞的标记，类胰岛细胞显示以比胰岛素产生细胞更高的比率包含成熟的胰α细胞。类胰岛细胞显示为比胰岛素产生细胞更成熟的分化阶段。
(e)具有对低血糖响应的胰岛素分泌作用
类胰岛细胞的特征为具有于低血糖响应的胰岛素分泌作用。“对低血糖响应的胰岛素分泌作用”，意指从低血糖时1小时以内、2小时以内、3小时以内、4小时以内、或5小时以内，胰岛素分泌量增加。“低血糖”意指血中或培养基中的葡萄糖浓度为约70mg/dL以下的情况。胰岛素分泌量的测定，可通过先前周知的任何手段进行，无特别限定，可通过测定血中或培养基中的C-肽量而进行。
通常，在生体内若变成低血糖，则通过胰高血糖素等的分泌来促进血糖值的上升，同时拮抗胰高血糖素而分泌胰岛素，以控制血糖值位准。本发明的类胰岛细胞，同样地为可控制低血糖时的血糖值位准者，在响应低血糖，促进血糖值上升的同时，具有拮抗血糖值上升而分泌胰岛素的作用。
(f)不含外分泌细胞
类胰岛细胞的特征为不含外分泌细胞。即，在动物生体内的胰岛中，类胰岛细胞通常不包含构成胰岛的大部分(约95％)的外分泌细胞，外分泌细胞即分泌包含淀粉酶或脂肪酶等消化酶的胰液的细胞。术语“不含外分泌细胞”，不仅包含类胰岛细胞中完全不含外分泌细胞的情况，还可包含类胰岛细胞中以5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、或0.5％以下的低比率包含外分泌细胞的情况。
(g)Ins+Gcg-细胞的比率高
类胰岛细胞的特征为Ins+Gcg-细胞的比率高。优选为类胰岛细胞中的Ins+Gcg-细胞的比率为约20％以上，更优选为约30％以上，进一步更优选为约40％以上。类胰岛细胞中Ins+Gcg-细胞的比率的上限无特别限定，例如，可为约80％以下，优选为约70％以下，更优选为约60％以下。
由于Ins+Gcg-为成熟的胰β细胞的标记，显示类胰岛细胞以比胰岛素产生细胞更高的比率包含成熟的胰β细胞。类胰岛细胞显示其系在比胰岛素产生细胞更成熟的分化阶段。
又，在类生体组织结构体包含类胰岛细胞的情况，类胰岛细胞可被配置成胰岛素阳性细胞在内侧，胰高血糖素阳性细胞在外侧的簇。
5.用途
依照本手法所得到的类生体组织结构体，根据所使用的“源自多能性干细胞的细胞”，具有与表皮、神经、脑、脊髓、食道、胃、小肠、大肠、膀胱、尿道、肺、甲状腺、胰脏、肝脏、肌肉、骨骼、心脏、血管、脾脏、肾脏等(不以这些为限)器官或组织同等或类似的功能，可利用于增强或维持这些器官或组织的功能，或者用于辅助或补充因疾病或障碍等原因而减低或消失的这些器官或组织的功能。
就本发明的一实施形态而言，在类生体组织结构体包含前述的类胰岛细胞的情况，该类生体组织结构体通过类胰岛细胞所分泌的胰岛素或胰高血糖素的作用，可改善及/或维持患者中的血糖值(葡萄糖)位准，可将血糖值控制于正常值。
因此，该类生体组织结构体可使用于治疗或预防必须改善及/或维持血糖值的位准的疾病、障碍、或症状。就此种疾病、障碍、或症状而言，可列举糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病)、空腹时及食后葡萄糖浓度的变调、低血糖症(例如，糖尿病患者中的通过胰岛素投与的低血糖症)等，然而不以这些为限。再者，“治疗”意指疾病、障碍、或症状的治疗、治愈、防止或寛解的改善，或、疾病、障碍、或症状的进行速度的减低。又，“预防”意指使疾病、障碍或症状的发病的可能性、危险性降低，或使疾病、障碍、或症状的发病延迟。
患者为哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴、人类)，优选为人类。
以下，通过实施例说明本发明，然而本发明不受这些实施例所限定。
实施例
实施例1：胰岛素产生细胞的制作、移植、功能及形态评价(STZ-Nod-scid小鼠)
1.方法
(1)胰岛素产生细胞的制作
从Ff-H4sO4 iPS细胞株分化诱导成胰岛素产生细胞，系依照上述步骤1)至6)或已报导者(Nature Biotechnology 2014；32:1121-1133)，通过使用生物反应器的3维培养法而实施。
即，将iPS细胞于胰岛素作用的条件下，在包含分化诱导因子(GSK3 6抑制剂、ROCK抑制剂及低用量的激活素A)的培养基(DMEM/1％B27/青霉素-链霉素/二甲基亚砜)中，进行第1次培养，继而，在无胰岛素作用的条件下，于包含分化诱导因子(低用量的激活素A)的培养基(DMEM/1％B27/青霉素-链霉素/二甲基亚砜)中，进行第2次培养，得到胚体内胚叶细胞。
将从该胚体内胚叶细胞分化诱导所得到的内分泌前驱细胞集团，于包含分化诱导因子(ALK5抑制剂II、T3、LDN、7-分泌酶抑制剂RO、抗坏血酸)及FGF受体1抑制剂(PD-166866)的培养基(改良的MEM/1％B27/青霉素-链霉素)中培养8日。再者，在包含一部分相异的分化诱导因子(ALK5抑制剂II、T3、ZnSO4、肝素、N-乙酰基半胱氨酸、Trolox、R428、Y-27632)及FGF受体1抑制剂(PD-166866)的培养基(MCDB/ITS-X/2％BSA/20mM葡萄糖/NaHCO3/Glutamax/青霉素-链霉素)中，培养4日，得到为球体形态的胰岛素产生细胞。
(2)移植前的胰岛素产生细胞的蛋白质表达评价
通过流式细胞术测定(1)中所制作的胰岛素产生细胞的蛋白质表达(胰岛素、NKX6.1、嗜铬细胞分泌素、Ki67)。
(3)胰岛素产生细胞于纤维蛋白凝胶中的分散、凝胶化将纤维蛋白凝胶制作用的纤维蛋白原(fibrinogen)(Merck Millipore，341576-100MG)于事前，以成为10mg/mL的方式溶解于基础培养基(MCDB)中，并于-80℃保存至使用为止。将凝血酶(thrombin)(Sigma，10602400001)以成为50U/mL的方式溶解于PBS(-)中，并在-80℃保存至使用为止。纤维蛋白原(fibrinogen)溶液及凝血酶(thrombin)溶液，系在即将使用前溶解而使用。
将(1)所制作的胰岛素产生细胞的球体(具有直径约50至500z/m的大小，就总数而言，包含300万个细胞)收集于1.5mL试管中，使其沉降。沉降后，尽可能除去培养液，添加100μL的纤维蛋白原(fibrinogen)溶液，充分搅拌。继而，为使凝集块不沉降，添加相对于纤维蛋白原(fibrinogen)溶液的1/2量(50μL)的凝血酶(thrombin)溶液。从添加凝血酶(thrombin)溶液算起，于室温放置5分钟以上，使其凝胶化。
(4)胰岛素产生细胞移植至生体内，及类生体组织结构体形成过程的功能评价
将(3)所制作的分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶，移植至通过链脲菌素(streptozotocin)(STZ)诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠的皮下(iPIC组)。移植后，测定血液中的人类C-肽(源自胰岛素产生细胞的胰岛素的指标)的浓度及血糖值，评价胰岛素产生细胞的存活及功能。就对照而言，设置非移植个体(假性(sham)组)及非糖尿病NOD/SCID小鼠(对照组)，测定同样的指标，进行评价。
(5)源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的对葡萄糖负荷的响应评价
将分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶进行皮下移植，于经过6个月的时点，为使血糖值短暂性地上升，进行葡萄糖强制经口投与，随后的胰岛素产生细胞的响应，通过测定血浆中葡萄糖浓度及血中人类C-肽浓度来评价。
(6)源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的一般染色及蛋白质表达的评价
将移植6个月后摘出的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体，通过多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。从固定的类生体组织结构体，制作石蜡切片及冻结切片。使用石蜡切片，进行HE染色及马森三色法(Masson trichrome)染色。又，使用冻结切片，通过免疫组织染色，评价目标蛋白质表达(人类核(HUN)、PDX1、胰岛素(INS)、胰高血糖素(GCG)、小鼠CD31(mCD31)、嗜铬细胞分泌素A(CHGA)、Ki67)。
2.结果
(1)移植前的胰岛素产生细胞的蛋白质表达评价
关于移植前的胰岛素产生细胞，将通过流式细胞术的测定结果示于图1，又，将胰岛素阳性/NKX6.1阳性细胞率、嗜铬细胞分泌素A阳性细胞率、Ki67阳性细胞率示于表1。移植前的胰岛素产生细胞，95％以上为嗜铬细胞分泌素A阳性的内分泌细胞，移植后，成熟为β细胞的胰岛素阳性/NKX6.1阳性细胞为42.6％，成熟为a细胞的胰岛素阳性/NKX6.1阴性细胞为30.3％的细胞集团。又，为增殖标记的Ki67阳性细胞非常少，仅0.4％。
【表1】
步骤6第12天
胰岛素阳性/NKX6.1阳性细胞率 42.6％
嗜铬细胞分泌素A阳性细胞率 97.3％
胰岛素阳性/NKX6.1阴性细胞率 30.3％
Ki67阳性细胞率 0.4％
(2)移植至生体内的胰岛素产生细胞形成类生体组织结构体的过程的功能评价
将移植后的血中人类C-肽浓度及血糖值的测定结果示于图2及表2。
在移植入分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶的动物中，移植3个月后，于血液中验出高浓度的人类C-肽，伴随此，高血糖得以改善。血糖值，直至6个月后仍维持正常水平。从以上结果，暗示移植入的分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶，在皮下与宿主细胞混合，同时分化、成熟，形成功能性的类生体组织结构体。
【表2】
Figure BDA0003394536730000391
N＝3以上，平均值±标准偏差；N＝2，个别值
(3)源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的对葡萄糖负荷的响应评价
将葡萄糖负荷后的血中人类C-肽浓度及血浆中葡萄糖浓度示于图3。
通过移植入分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶而形成的类生体组织结构体，在移植后6个月的时点，显示敏锐的葡萄糖响应性，即分泌人类C-肽至血中。即使移植部位为皮下也无妨，附加葡萄糖15分钟后，可见到明确的血中人类C-肽上升，确认经由丰富血流的媒介，如同实际胰岛般的生体响应。又，推测伴随血糖降低，血中人类C-肽也降低，低血糖的担忧也减少。
(4)源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的一般染色及蛋白质表达的评价
将移植后6个月时点的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的肉眼所见示于图4，将摘出的类生体组织结构体的HE染色图标于图5，将马森三色法(Masson trichrome)染色图示于图6，将目标蛋白质表达进行各种免疫组织染色的结果示于图7至10。
源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的肉眼所见(图4)，无明显的肥大，为米粒大的类生体组织结构体可容易地从皮下分离。虽同时期合计解剖4只，然而全部同样如肉眼所见。从组织学评价，显示类生体组织结构体为：1)直径50至500μm的源自胰岛素产生细胞的类胰岛细胞簇，2)以围绕其的方式配置的源自宿主的纤维性组织，3)由源自宿主的血管结构所构成(图5至10)。
3)的源自宿主的血管结构(＝小鼠CD31阳性，图9)，主要进入1)的内分泌细胞簇，在1)的类胰岛细胞簇内，可见到多数的红细胞(图5、6)。因此，强烈地暗示此类生体组织结构体，与实际的胰岛同样，实现丰富的血流，及经由血流媒介的敏锐生体反应。又，由于包含多量纤维性组织(图6)，物理性强度也高。实际上，在尝试切断源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体时，具有如软骨的强度，无法轻易地切断。
HuN阳性的源自胰岛素产生细胞的细胞，大部分为类胰岛细胞(图7至10)，也未见目标外细胞的增殖。为增殖标记的Ki67及HuN双阳性细胞也为0.5％以下，属微量者(图10)。胰岛素阳性细胞分布于1)的类胰岛细胞簇的内侧，胰高血糖素阳性细胞分布于1)的类胰岛细胞簇的外侧，此种配置可在出生前的胎儿人类胰脏，或啮齿类的胰岛中观察到。因此，暗示此类生体组织结构体，也与胎儿人类胰岛同样地，以数十年单位而发挥功能。
从以上的结果，显示通过使胰岛素产生细胞分散于纤维蛋白凝胶，并移植至生体内，在所谓皮下等血流或营养缺乏的部位可长期存活，再者，在与宿主的细胞混合而成熟，形成新的类生体组织结构体。显示所形成的皮下类生体组织结构体，实际上与生体内的胰岛同样地，具有伴随生理性且敏锐的胰岛素分泌调节的血糖值控制功能。
实施例2:具有糖尿病病态的生体内的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的形成及功能评价
1.方法
将上述实施例1的(3)所制作的分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶，分别移植至通过链脲菌素(streptozotocin)(STZ)诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠，或非糖尿病的NOD/SCID小鼠的皮下。至移植28周后为止，测定饱食时的血中人类C-肽、胰高血糖素及血糖值。
28周后，对于全部个体，摘出源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体。测定摘出的移植片类生体组织结构体的重量，于破碎、以酸乙醇处理后，测定移植片类生体组织结构体中的胰岛素及胰高血糖素含量。就对照而言，采集各移植小鼠的胰脏及非移植的非糖尿病NOD/SCID小鼠的胰脏，同样地测定荷尔蒙含量。
2.结果
将血液中的人类C-肽及胰高血糖素的浓度及血糖值的推移示于图11。至分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶的移植28周后为止，持续地检测出血中人类C-肽。血中胰高血糖素浓度也上升，与糖尿病及非糖尿病的非移植小鼠相比，为高值。暗示分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶，在皮下环境中可长期存活，由此形成的类生体组织结构体释放复数种胰岛荷尔蒙。糖尿病小鼠的高血糖在移植12周后获得改善，至28周后为止，血糖值维持正常区域。若摘出类生体组织结构体，则完全回复移植前的高血糖状态，因此显示持续且安定的高血糖改善作用系来自类生体组织结构体。
将移植片类生体组织结构体中及胰脏中的各荷尔蒙含量示于图12。与胰脏(左)比较，移植片类生体组织结构体(右)每单位重量的胰岛素及胰高血糖素的含量较多。显示移植片类生体组织结构体，如胰脏中的胰岛，以高密度地包含胰内分泌细胞。
实施例3:源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的血糖控制功能
1.方法
将上述实施例1的(3)所制作的分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶，移植至通过STZ诱发糖尿病的免疫不全NOD/SCID小鼠，或具有糖尿病自然发病的Akita基因变异的NOD/SCID小鼠的皮下。移植14周以后，使用高血糖完全改善的小鼠，实施以下的试验。
试验(1):为使血糖值短暂性地上升，进行葡萄糖强制经口投与，随后测定血中人类C-肽、胰高血糖素及胰高血糖素样肽-1浓度，评价源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的响应。使用未移植·非糖尿病NOD/SCID小鼠作为对照，测定内因性的各荷尔蒙的血中浓度。
试验(2):为了评价对上述源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的响应的胰高血糖素的参与度，在葡萄糖强制投与前，强制经口投与胰高血糖素受体拮抗剂MK-0893，实施与试验(1)同样的试验。MK-0893对人类的胰高血糖素受体比对小鼠的胰高血糖素受体显示较强的拮抗剂活性(J.Med.,Chem.2012Jul.12；55(13):6137-48)。
试验(3):为了评价对源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体所造成的胰岛素释出的类胰高血糖素肽-1的参与度，使用渗透压泵经由皮下持续投与类胰高血糖素肽-1受体拮抗剂Exendin-9共计3日，测定投与前后的血中人类C-肽浓度。
试验(4):为诱发低血糖，经由皮下投与胰岛素制剂甘精(glargine)，测定血中人类C-肽，评价随后的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体的响应。使用未移植、非糖尿病NOD/SCID小鼠作为对照，测定源自内因性胰岛的小鼠C-肽的血中浓度。
2.结果
试验(1):将葡萄糖负荷后的血中胰高血糖素及类胰高血糖素肽-1浓度示于图13。通过葡萄糖负荷，血中人类C-肽及类胰高血糖素肽-1浓度短暂性地上升，血中胰高血糖素浓度显示降低倾向。移植小鼠方面，与未移植·非糖尿病小鼠相比，血中类胰高血糖素肽-1及胰高血糖素的血中浓度呈现高值，暗示类生体组织结构体释出这些荷尔蒙。
试验(2):将葡萄糖负荷后的血糖值及血中人类C-肽浓度示于图14。若以MK-0893进行前处置，则葡萄糖负荷后的短暂性血糖值的上升减弱，血中人类C-肽浓度的上升也减弱。另一方面，MK-0893在未移植、非糖尿病小鼠中，对于血糖值及内因性小鼠C-肽的血中浓度没有影响。通过这些，显示胰高血糖素有助于通过类生体组织结构体的血糖控制作用。
试验(3):将Exendin-9的3日投与前后的饱食时血中人类C-肽浓度示于图15。血中人类C-肽浓度随Exendin-9的持续投与而降低，若停止投与，则回复投与前的水平。显示由类生体组织结构体所造成的人类C-肽的释出，受到类胰高血糖素肽-1的控制。
试验(4):血中人类C-肽，若通过投与甘精(glargine)而诱发低血糖，则其浓度大幅度地降低。此变化与未移植·非糖尿病小鼠中的内因性小鼠C-肽的血中浓度推移相同。显示诱发低血糖时，类生体组织结构体呈现与内因性胰岛类似的胰岛素分泌调节功能。
从以上说明，显示通过移植分散有胰岛素产生细胞的纤维蛋白凝胶而形成的源自胰岛素产生细胞的类生体组织结构体，发挥类似于内因性胰岛的复数种胰岛荷尔蒙所提供的生理性血糖控制功能。

Claims (23)

1.一种组合物，其系在宿主动物的生体组织内制作类生体组织结构体的方法中所使用的组合物，该组合物包含生物兼容性材料及源自人类多能性干细胞的细胞，其中源自人类多能性干细胞的细胞系被分散配置于生物兼容性材料中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该生物兼容性材料为纤维蛋白凝胶(fibrin gel)。
3.如权利要求2所述的组合物，其中该纤维蛋白凝胶系在该组成物即将使用之前，将源自人类多能性干细胞的细胞、纤维蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝胶化者。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中该源自人类多能性干细胞的细胞系以复数个球体的形态存在。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中该源自人类多能性干细胞的细胞中，Ki67阳性细胞的比率未达3％。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中该源自人类多能性干细胞的细胞为胰岛素产生细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中该方法包含将该组合物移植至宿主动物的生体组织中，并分化诱导被分散配置于生物兼容性材料中的源自人类多能性干细胞的细胞。
8.如权利要求7所述的组合物，其中该宿主动物的生体组织为皮下组织。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中该类生体组织结构体包含从源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇(cluster)、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管，该分化细胞构成的复数个簇分散存在于类生体组织结构体中，该***围绕在由该分化细胞构成的复数个簇的周围，该血管侵入由该分化细胞构成的复数个簇。
10.如权利要求9所述的组合物，其中该分化细胞不含外分泌细胞。
11.一种类生体组织结构体，其为包含从源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管的类生体组织结构体，其中该分化细胞构成的复数个簇系分散存在于类生体组织结构体中，该***围绕在由该分化细胞构成的复数个簇的周围，该血管侵入由该分化细胞构成的复数个簇。
12.如权利要求11所述的类生体组织结构体，其中该分化细胞包含胰β细胞。
13.如权利要求11或12所述的类生体组织结构体，其中该分化细胞不含外分泌细胞。
14.如权利要求11至13中任一项所述的类生体组织结构体，其中该类生体组织结构体系用于将所移植的受检体的血糖值控制于正常值。
15.一种类生体组织结构体的制造方法，其包含：将包含生物兼容性材料及源自人类多能性干细胞的细胞的组合物，移植至宿主动物的生体组织中而进行分化诱导，其中该源自人类多能性干细胞的细胞系被分散配置于生物兼容性材料中。
16.如权利要求15所述的方法，其中该生物兼容性材料为纤维蛋白凝胶。
17.如权利要求16项所述的方法，其中该纤维蛋白凝胶系于该组合物即将使用之前，与源自人类多能性干细胞的细胞、纤维蛋白原(fibrinogen)及凝血酶(thrombin)混合而凝胶化。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中该源自人类多能性干细胞的细胞系以复数个球体的形态存在。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中在该源自人类多能性干细胞的细胞中，Ki67阳性细胞的比率未达3％。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中该源自人类多能性干细胞的细胞为胰岛素产生细胞。
21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中该宿主动物的生体组织为皮下组织。
22.如权利要求15至21中任一项所述的方法，其中该类生体组织结构体包含从分散的源自人类多能性干细胞的细胞分化诱导所得到的分化细胞构成的复数个簇、源自宿主动物的***、以及源自宿主动物的血管，该分化细胞构成的复数个簇系分散存在于类生体组织结构体中，该***系围绕在由该分化细胞构成的复数个簇的周围，该血管侵入由该分化细胞构成的复数个簇。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中该分化细胞不含外分泌细胞。
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