KR20190100386A - 당의 무세포 생산 - Google Patents

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KR20190100386A
KR20190100386A KR1020197022938A KR20197022938A KR20190100386A KR 20190100386 A KR20190100386 A KR 20190100386A KR 1020197022938 A KR1020197022938 A KR 1020197022938A KR 20197022938 A KR20197022938 A KR 20197022938A KR 20190100386 A KR20190100386 A KR 20190100386A
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드루 에스. 쿠닝햄
다니엘 매시츠란
매튜 에두알도 모우라
윌리엄 제레미 블레이크
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그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨.
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Abstract

본원에서, 다량체성 글루코스 탄수화물 (예를 들어, 전분)을 당으로 효소적으로 전환시키기 위한 시스템, 방법 및 조성물 (예를 들어, 세포 및 세포 용해물)이 일부 실시양태에서 제공된다.

Description

당의 무세포 생산
관련 출원
본 출원은 2017년 1월 6일에 출원된 미국 가출원 U.S.S.N. 62/443,447, 및 2017년 7월 28일에 출원된 U.S.S.N. 62/538,181을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전분을 단순 당으로 전환시키기 위한 기존의 기술은 다중 생체변환 반응을 이용하고, 각각의 생체변환에 광범위한 정제 프로세스가 이어진다. 생체변환 프로세스는 비교적 저렴하지만, 고정된 효소 및 연속적인 생산 시스템 때문에, 하류 프로세싱이 비용에 크게 영향을 미친다.
중합체성 글루코스, 예컨대 전분 (예를 들어, 아밀로스 및/또는 아밀로펙틴), 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 예컨대 말토덱스트린, 또는 셀로덱스트린 (이는 용어 셀룰로스와 상호교환가능하게 사용될 수 있음)을 펜토스 (예를 들어, 리보스, 아라비노스, 또는 크실룰로스) 또는 헥소스 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 또는 프룩토스) 당으로 효소적으로 전환시키기 위한 무세포 시스템, 방법, 조성물 및 키트가 본원에서 제공된다. 본 개시내용의 방법은 무세포 반응 (예를 들어, 원-포트 (단일) 무세포 반응)에서 당 생산 경로를 실행하여, 전분 및/또는 셀룰로스/셀로덱스트린을 헥소스 및/또는 펜토스 당으로 전환시킨다. 전형적으로 기질 예컨대 글루코스가 글루코스 6-포스페이트로 인산화되는 것을 수반하고 고-에너지 포스페이트 공급원 예컨대 ATP 및 포스포에노일피루베이트를 사용하는 프로세스와 달리, 본원에 기술된 프로세스는 전형적으로 고-에너지 포스페이트 공급원을, 예를 들어, 저렴한 무기 포스페이트 (Pi)로 교체한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (전분 포스포릴라제로도 지칭됨) (EC 2.4.1.1)가 전분을 글루코스 1-포스페이트로 전환시키는데 사용되고, 그 후 이는 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6)를 통해 글루코스 6-포스페이트로 전환된다. 다른 실시양태에서, 셀로덱스트린 포스포릴라제 (셀룰로스 포스포릴라제 또는 β-(1-4) 글루칸 포스포릴라제로도 지칭됨) (EC 2.4.1.49)가 셀룰로스/셀로덱스트린을 글루코스 1-포스페이트로 전환시키는데 사용되고, 그 후 이는 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6)를 통해 글루코스 6-포스페이트로 전환된다. 본원에서 제공되는 바와 같은 특정한 당 생산 경로의 후속 효소적 반응(들)은 대부분 산물 특이적이다. 당 포스파타제 (EC 3.1.3.-)가 최종 산물을 전환시키는데 사용된다. 따라서, 반응 열역학 - 기질의 인산화 → 산물의 탈인산화 -이 산물에 유리하다.
추가로, 본원에 기술된 효소적 전환 반응은 본질적으로 비가역적이고, 따라서 원하는 헥소스 및 펜토스 당의 높은 수율을 지지한다. 대조적으로, 전분 또는 셀룰로스/셀로덱스트린을 알룰로스로 전환시키기 위한 전형적인 생체변환 방법은, 예를 들어, 3개의 별개 프로세스를 사용하는데, 이 중 2개는 가역적이고, 산물의 최종 농도는 사용되는 효소의 열역학에 의해 좌우된다. 예를 들어, 전분이 글루코스로 전환되고, 글루코스가 프룩토스로 이성질체화되며, 프룩토스가 알룰로스로 에피머화된다. 글루코스가 프룩토스로 이성질체화되는 것은 수율이 약 45%이고, 따라서, 순수한 산물을 산출하고 촉매되지 않은 기질을 재활용하기 위해 상당한 하류 프로세싱을 필요로 한다. 유사하게, 프룩토스가 알룰로스로 에피머화되는 것은 수율이 ~20%이고, 정제된 산물을 산출하고 촉매되지 않은 기질을 재활용하기 위해 실질적인 하류 프로세싱을 또 다시 필요로 한다. 본원에 기술된 무세포 시스템에서 전분을 관심 산물로 직접적으로 변환시키는 능력은 하류 프로세싱 및 기질 손실을 감소시키는 것에 의해 비용을 감소시킨다.
유리하게는, 본원에서 제공되는 프로세스에서 사용되는 다수의 효소는 열안정성이며, 이는 (1) 전환 프로세스가 수행되는 세포 용해물 내에 함유된 해로운 활성의 열적 불활성화를 가능하게 하고, (2) 생산 실행에 부정적으로 영향을 미치는 미생물 오염의 기회를 감소시킨다. 이러한 전환 경로의 효소는 호열성, 중온성, 또는 저온성 생물로부터 단리될 수 있고/있거나, 일부 실시양태에서는, 효소의 열안정성을 증가 (또는 감소)시키도록 조작될 수 있다. 호열성 생물 (호열균)은 41℃ 내지 122℃ (106℉ 내지 252℉)의 고온에서 번성한다. 중온성 생물 (중온균)은 20℃ 내지 45℃ (68℉ 내지 113℉)의 중도 온도에서 번성한다. 저온성 생물 (저온균)은 -20℃ 내지 10℃ (-4℉ 내지 50℉)의 저온에서 번성한다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 (a) 각각의 집단의 세포가 본원에 기술된 당 생산 경로의 적어도 1개의 열안정성 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 당 생산 경로의 열안정성 효소를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, 및 (e) 반응 혼합물을 기질 (예를 들어, 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체) 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계를 포함하는, 당 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 프룩토스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및/또는 아라비노스)을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 당 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 프룩토스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및/또는 아라비노스)을 생산하기 위한 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 본원에 기술된 당 생산 경로의 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 당 생산 경로의 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 임의적으로, 단계 (b)의 세포 용해물 중 1개 이상을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, (d) 단계 (b) 및 (c)의 세포 용해물을 조합하여, 당 생산 경로의 효소를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, 및 (e) 반응 혼합물을 기질 (예를 들어, 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체) 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 당 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 프룩토스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및/또는 아라비노스)을 생산하기 위한 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 본원에 기술된 당 생산 경로의 적어도 1개의 열안정성 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (d) 세포 용해물 혼합물을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, (e) 열-불활성화된 용해물에 당 생산 경로의 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하는 단계, 및 (f) 반응 혼합물을 기질 (예를 들어, 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체) 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 당 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 프룩토스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및/또는 아라비노스)을 생산하기 위한 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 본원에 기술된 당 생산 경로의 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 임의적으로, 단계 (b)의 세포 용해물 중 1개 이상을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, (d) 단계 (b) 및 (c)의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (e) 세포 용해물 혼합물에 당 생산 경로의 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하는 단계, 및 (f) 반응 혼합물을 기질 (예를 들어, 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체) 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (a) α-글루칸 포스포릴라제 (전분 포스포릴라제로도 지칭됨), 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, 및 (d) 열-불활성화된 용해물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 정제된 효소가 단계 (c) 전 또는 후에 세포 용해물에 첨가된다. 기계적, 화학적, 효소적, 삼투압적 또는 열적 용해를 포함하는 임의의 수단에 의해 세포가 용해될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 용해 단계 및 가열 (열 불활성화) 단계가 세포를 용해시키고 천연 효소 활성을 불활성화시키는 온도로 세포를 가열하는 단일 단계로서 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, 및 (e) 반응 혼합물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, (e) 열-불활성화된 용해물에 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계, 및 (f) 반응 혼합물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 셀룰로스/셀로덱스트린을 출발 기질로서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 (a) 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, 및 (d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, 및 (e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 무세포 방법은 (a) 각각의 집단의 세포가 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계, (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계, (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계, (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계, (e) 열-불활성화된 용해물에 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계, 및 (f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 포스페이트 공급원 (예를 들어, 무기 포스페이트)의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계를 포함한다.
다른 당, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 만노스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및 아라비노스의 무세포 생산이 또한 본 개시내용에 의해 포함된다.
일부 실시양태에서, 제시된 당 경로는 에너지 보조인자, 예컨대 NADH, NADPH, NAD+, 또는 NADP+의 균형을 필요로 한다. 이는 보조인자 재생 시스템을 통해 행해질 수 있다. 이러한 경우에, NADH 및 NADPH는 "환원된 보조인자" 또는 "환원제"로 지칭되고, NAD+ 및 NADP+는 "산화된 보조인자" 또는 "산화제"로 지칭된다. 과량의 환원제가 있는 경우, NAD(P)H 옥시다제 (EC# 1.6.3.1, 1.6.3.2, 1.6.2.3, 또는 1.6.3.4)를 사용하여 과량의 환원된 보조인자를 산화시켜, 옥시다제의 유형에 따라 H2O2, O- 2, 또는 H2O를 생산할 수 있다. 용해물에 유해한 손상을 야기할 수 있는 H2O2 및 O2 -가 생산되는 경우, 해로운 종을 H2O 및 O2로 전환시키기 위해 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (EC# 1.15.1.1) 및/또는 카탈라제 (EC# 1.11.1.6)를 연계하여 사용할 수 있다. 과량의 산화제가 있는 경우, 산화된 보조인자를 다시 그의 환원된 형태로 환원시키기 위해 보조인자 재생 시스템을 사용할 수 있다. 일부 예는 포르메이트 데히드로게나제 (EC# 1.2.1.2)를 사용하여 포르메이트를 CO2로 산화시키는 한편 NAD(P)+를 NAD(P)H로 환원시키는 것, 또는 포스포네이트 데히드로게나제 (EC# 1.20.1.1) 또는 술파이트 옥시도리덕타제 (EC# 1.8.1.2)를 사용하여 각각의 무기 염을 포스페이트 및 술페이트로 산화시켜, 환원된 NAD(P)H를 초래하는 것을 포함한다.
관심 대상인 특정한 당 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 프룩토스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및/또는 아라비노스)의 생산을 위해 사용되는, 효소, 예컨대 열안정성 효소를 포함하는 조작된 세포, 세포 용해물, 및 반응 혼합물이 본원에서 또한 제공된다.
도 1은 전분에서 알룰로스의 전환에 대한 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, F6P = 프룩토스 6-포스페이트, A6P = 알룰로스 6-포스페이트, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 2는 전분에서 글루코스로의 전환에 대한 2개의 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 3은 전분에서 프룩토스로의 전환에 대한 2개의 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, F6P = 프룩토스 6-포스페이트, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 4는 전분에서 소르비톨로의 전환에 대한 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, S6P = 소르비톨-6-포스페이트, F6P = 프룩토스 6-포스페이트, NADPH = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원된 형태), NADP+ = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 5는 전분에서 리불로스로의 전환에 대한 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, 6PGL = 6-포스포글루코노락톤, 6PG = 6-포스포글루코네이트, Ru5P = 리불로스 5-포스페이트, NADPH = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원된 형태), NADP+ = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, CO2 = 이산화탄소, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 6은 전분에서 리보스로의 전환에 대한 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, 6PGL = 6-포스포글루코노락톤, 6PG = 6-포스포글루코네이트, Ru5P = 리불로스 5-포스페이트, R5P = 리보스 5-포스페이트, NADPH = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원된 형태), NADP+ = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, CO2 = 이산화탄소, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 7은 전분에서 아라비노스로의 전환에 대한 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, 6PGL = 6-포스포글루코노락톤, 6PG = 6-포스포글루코네이트, Ru5P = 리불로스 5-포스페이트, Ar5P = 아라비노스 5-포스페이트, NADPH = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (환원된 형태), NADP+ = 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, CO2 = 이산화탄소, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
도 8은 전분에서 만노스로의 전환에 대한 효소적 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: G1P = 글루코스 1-포스페이트, G6P = 글루코스 6-포스페이트, F6P = 프룩토스 6-포스페이트, M6P = 만노스 6-포스페이트, 및 PO4 = 무기 포스페이트.
전분 (예를 들어, 아밀로스 또는 아밀로펙틴) 또는 셀룰로스/셀로덱스트린을 펜토스 (예를 들어, 리보스, 아라비노스, 또는 크실룰로스) 및/또는 헥소스 (예를 들어, 알룰로스, 글루코스, 또는 프룩토스) 당으로 전환시키는데 사용되는 효소적 경로가 본원에서 기술된다. 최종 산물에 따라, 이러한 효소적 경로는 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 (전분 포스포릴라제로도 지칭됨) (EC 2.4.1.1) 또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제 (셀룰로스 포스포릴라제로도 지칭됨) (EC 2.4.1.49), 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6) 및 임의의 개수의 이소머라제, 에피머라제, 및/또는 당 포스파타제를 이용한다. 일부 실시양태에서, 효소 또는 효소 중 일부분은 열안정성이다. 이러한 열안정성 효소는 전환 프로세스가 수행되는 세포 용해물 내에 함유된 유해한 활성을 불활성화시키는 당 생산 프로세스의 가열 단계를 견딜 수 있다. 이러한 열 불활성화 단계는 생산 실행에 부정적으로 영향을 미치는 미생물 오염의 기회를 감소시킨다.
따라서, 본 개시내용은, 일부 실시양태에서, 당 예컨대 헥소스 및 펜토스 당을 생산하기 위한 고도로 효율적이고 비용-효과적인 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 당 생산 경로 및 경로 효소의 비제한적인 예가 하기 표 1에서 제공된다.
표 1: 예시적인 경로 효소의 요약
Figure pct00001
Figure pct00002
알룰로스 생산
본 개시내용의 일부 측면은 알룰로스를 생산하기 위한 방법, 조성물 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 적어도 1개의 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
융합 단백질은 개개의 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 절편을 연결함으로써 생성될 수 있다. 이러한 융합 유전자의 번역은 각각의 원래의 단백질로부터 유래된 기능적 성질이 있는 단일 또는 다중 폴리펩티드를 초래한다. 다중기능적 단백질은 적어도 2개의 상이한 활성이 있는 단일 단백질이고, 여기서 이러한 기능성은 천연의 생물학적 성질 또는 조작된 효소 융합의 결과이다. 다른 효소가 단일 융합 단백질 또는 다중기능적 단백질로서 또한 발현될 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 본원에 기술된 경로 효소 중 임의의 것의 다중 기능성을 함유할 수 있다.
본원에서 제공된 바와 같은 알룰로스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 알룰로스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)는 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀룰로스/셀로덱스트린을 알룰로스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 3개 또는 적어도 4개)는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 적어도 1개의 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 적어도 1개의 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 알룰로스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 삼투압적, 기계적, 화학적 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 알룰로스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 알룰로스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에서, 세포가 기계적, 화학적, 효소적, 삼투압적 및/또는 열적 용해를 포함하는 임의의 수단에 의해 용해될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 용해 단계 및 가열 (열 불활성화) 단계가 세포를 용해시키고 원치 않는 천연 효소 활성을 불활성화시키는 온도로 세포를 가열하는 단일 단계로서 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다. 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는, 일부 실시양태에서, 그의 활성 수준이 적어도 50%만큼 감소되었을 때 불활성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 그의 활성 수준이 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 감소되었을 때 불활성인 것으로 간주된다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소) 중 적어도 일부의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소 (또는 부분적으로 정제된 효소)가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 알룰로스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 알룰로스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션할다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 예를 들어, 반응이 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소 (예를 들어, 바이오매스의 일부분)로서 존재한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물(들) (예를 들어, 미생물 세포 용해물)을 옥수수 펄프 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 알룰로스 (또는 본원에 기술된 임의의 다른 당)를 생산한다.
알룰로스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 효소를 포함한다.
표 2: 예시적인 알룰로스 경로 효소
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
알룰로스를 생산하기 위한 경로가 표 2의 경로 단계 1-5 각각으로부터 선택된 효소의 임의의 조합을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 경로 단계 1의 α-글루칸 포스포릴라제는 아퀴펙스 아에올리쿠스, 써모크리니스 미네르바에, 써모술피디박터 타카이이, 써모술푸리모나스 디스뮤탄스, 써모코쿠스 리토랄리스, 팔라에오코쿠스 파시피쿠스, 써모토가 네아폴리타나, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 피로코쿠스 아비시, 써모코쿠스 티오레두센스, 데이노코쿠스 라디오두란스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 써무스 칼도필루스, 메이오써무스 실바누스, 오세아니써무스 프로푼두스, 아르덴티카테나 마리티마, 써모코쿠스 바로필루스, 슈도써모토가 써마룸, 히드로게노박터 써모필루스, 써무스 오시마이, 메이오써무스 루베르, 및 마리니토가 피에조필라의 α-글루칸 포스포릴라제 중 어느 1개로부터 선택될 수 있고, 써모코쿠스 코다카라엔시스, 피로코쿠스 쿠쿨카니이, 암모니펙스 데겐시이, 메타노써모박터 울페이이, 메타노써무스 페르비두스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 아르카에오글로부스 풀기두스, 페로글로부스 플라시두스, 게오글로부스 아한가리, 아르카에오글로부스 베네피쿠스, 아르카에오글로부스 술파티칼리두스, 아시둘리프로푼둠 부니에, 클로스트리디움 써모셀룸, 데플루비이탈레아 파피필라, 카미니셀라 스포로게네스, 칼로라나에로박터 페리레두센스, 써모시포 말라네시엔시스, 페르비도박테리움 펜니보란스, 심비오박테리움 써모필룸, 스피로카에타 써모필라, 및 써모아나에로박터 위에겔리이의 포스포글루코뮤타제 중 어느 1개로부터 선택된 경로 단계 2의 포스코글루코뮤타제와 조합될 수 있다.
글루코스 생산
본 개시내용의 다른 측면은 글루코스를 생산하기 위한 방법, 조성물 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 글루코스 1-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 글루코스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 글루코스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 글루코스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 1-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 1-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 글루코스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 글루코스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 글루코스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 글루코스 1-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 글루코스 1-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제 및 글루코스 1-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 글루코스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 글루코스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다.
전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
글루코스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제 및 글루코스 1-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제 및 글루코스 1-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제 및 열안정성 글루코스 1-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제 및 열안정성 글루코스 1-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개)의 효소를 포함한다.
프룩토스 생산
본 개시내용의 또 다른 측면은 프룩토스를 생산하기 위한 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 프룩토스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 프룩토스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 프룩토스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개 또는 적어도 3개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프룩토스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 프룩토스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 프룩토스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 프룩토스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 프룩토스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
프룩토스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다.
만노스 생산
본 개시내용의 추가의 일부 측면은 만노스를 생산하기 위한 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 만노스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 만노스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 만노스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 만노스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 만노스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 만노스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 만노스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 만노스 6-포스페이트 이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 만노스 6-포스페이트 이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 만노스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 만노스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
만노스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함한다.
소르비톨 생산
본 개시내용의 또 다른 측면은 소르비톨을 생산하기 위한 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 알도스 데히드로게나제, 적어도 1개의 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 적어도 1개의 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 소르비톨 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 소르비톨로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 소르비톨로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 알도스 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 알도스 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 소르비톨을 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 소르비톨 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 소르비톨 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 알도스 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 알도스 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 소르비톨을 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 소르비톨을 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
소르비톨의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 2-데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다.
리불로스 생산
본 개시내용의 추가 측면은 리불로스를 생산하기 위한 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 리불로스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 리불로스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 리불로스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 리불로스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리불로스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 리불로스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 리불로스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 리불로스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 리불로스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
리불로스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 효소를 포함한다.
리보스 생산
본 개시내용의 추가의 일부 측면은 리보스를 생산하기 위한 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 리보스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 리보스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 리보스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 리보스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리보스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 리보스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 리보스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 리보스 5-포스페이트 이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 리보스 5-포스페이트 이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 리보스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 리보스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
리보스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함한다.
아라비노스 생산
본 개시내용의 추가의 일부 측면은 아라비노스를 생산하기 위한 방법, 조성물, 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제 및/또는 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 효소 중 적어도 2개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현된다.
본원에서 제공된 바와 같은 아라비노스 생산 경로의 효소는 전형적으로 숙주 세포에 대해 이종성이지만 (상이한 세포 유형으로부터 최초로 클로닝되거나 수득됨), 일부 효소는 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 아라비노스로 전환시키는데 사용되는 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 효소가 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)가 숙주 세포에 대해 내인성 (천연)이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 효소가 숙주 세포에 대해 내인성이다.
숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 세포), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 기타 세포 유형이 하기에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀로덱스트린을 아라비노스로 전환시키는데 사용되는 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 모든 효소는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 적어도 1개의 열안정성 포스포글루코뮤타제, 적어도 1개의 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 적어도 1개의 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 적어도 1개의 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 적어도 1개의 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제, 또는 상기 열안정성 효소 중 적어도 2개 이상의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아라비노스를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 용해)시켜, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개)의 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 다중 세포 용해물 (따라서, 다중 세포 집단, 예를 들어, 동일한 생물 (예를 들어, 박테리아) 또는 상이한 생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및/또는 식물 세포)로부터의 것)이 본원에서 제공되는 바와 같은 효소적 반응에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1개의 세포 집단이 아라비노스 생산 경로의 1개 이상의 효소(들)를 발현하도록 조작될 수 있는 한편, 또 다른 세포 집단 (또는 여러 다른 세포 집단)이 아라비노스 생산 경로의 또 다른 (적어도 1개의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 α-글루칸 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1개의 셀로덱스트린 포스포릴라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 포스포글루코뮤타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코노락토나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 적어도 1개의 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것, 및/또는 적어도 1개의 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 적어도 1개의 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포 용해 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물 내에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을 원치 않는 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 생산 경로의 열안정성 효소 중 임의의 것은 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은, 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키는데 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%)만큼 감소시키는데 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)의 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 첨가된다. 따라서, 반응 혼합물은, 일부 실시양태에서, 세포 용해물 내에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 1개의 정제된 효소의 조합물을 포함한다. 적어도 1개의 정제된 효소는 α-글루칸 포스포릴라제 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 아라비노스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 열-불활성화된 용해물(들)을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여 아라비노스를 생산하는 것을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 50℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 열-불활성화된 용해물을 적어도 2분 (예를 들어, 적어도 3, 4, 또는 5분) 동안 인큐베이션한다. 예를 들어, 열-불활성화된 용해물을 2-5분, 또는 2-10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 전분은, 예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오매스가 전분 대신 사용된다. 이러한 실시양태에서, 반응은 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전분 또는 셀로덱스트린은 화합물의 구성요소로서 존재한다.
아라비노스의 생산에 사용되는 세포 및 세포 용해물이 본원에서 또한 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 및/또는 효모 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개)의 효소를 포함한다.
기질 유연성 및 탈분지화 효소
본원에 기술된 모든 경로에 대해, 다수의 중합체성 글루코스 기질이 사용될 수 있다. 중합체성 글루코스 기질의 비제한적인 예는 전분, 글리코겐, 및 셀로덱스트린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 전분이다. 다른 실시양태에서, 기질은 글리코겐이다. 또 다른 실시양태에서, 기질은 셀로덱스트린이다. 일부 실시양태에서, 중합체성 글루코스 기질 (예를 들어, 전분, 글리코겐, 또는 셀룰로스/셀로덱스트린)의 부분적으로 가수분해된 버전이 사용된다. 전분 및 글리코겐은 주로 α(1-4) 결합에 의해 연결된 복수의 글루코스 단량체를 포함하는 한편, 셀로덱스트린은 β(1-4) 결합에 의해 연결된 동일한 글루코스 단량체를 포함한다. 셀로덱스트린과 다른 2개의 기질 사이의 또 다른 주요한 차이는 α(1-4) 사슬로부터의 α(1-6) 분지의 존재이다. 전분 및 글리코겐 둘 다가 이러한 분지점을 함유하지만, 글리코겐이 전분보다 실질적으로 더 분지화된다. α(1-4) 중합체의 경우, α-글루칸 포스포릴라제 (기질 선호도에 따라 α-글루칸 포스포릴라제 또는 글리코겐 포스포릴라제로도 지칭됨)는 중합체에서 한번에 1개의 글루코스를 소비하여 글루코스 1-포스페이트를 방출시킨다. 셀로덱스트린의 경우, 셀로덱스트린 포스포릴라제가 동일한 반응을 수행하여, 글루코스 1-포스페이트를 또한 방출시킨다.
전분 및 셀룰로스/셀로덱스트린의 긴 중합체는 종종 수성 용액에서 불용성이고, 침전되는 것에 더하여, 용액의 겔화 및 퇴화를 야기할 수 있다. 전분 및 셀룰로스/셀로덱스트린이 화학적 방법 (예를 들어, 산 가수분해) 또는 효소적 방법 (예를 들어, α-아밀라제)을 통해 더 작은 사슬 길이의 중합체로 부분적으로 가수분해되는 경우, 산물은 전분 및 셀룰로스에 대해 각각 말토덱스트린 및 셀로덱스트린이다. 이러한 가수분해된 유도체는 종종 이들의 모체 분자보다 더 양호하게 가용화 및 혼합되고, 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 경로에서 사용된다.
글리코겐, 전분, 또는 가수분해된 말토덱스트린의 경우, α(1-6) 분지는 임의의 당 경로의 수율을 실질적으로 감소시킬 것인데, 이는 글루칸 포스포릴라제가 중합체를 이러한 분지의 끝부분까지 저작하여, 이용가능한 글루코스의 대형 중심 코어를 전환되지 않은 채로 남기기 때문이다. 이러한 기질/경로에 대해, 글루칸 포스포릴라제에 대한 기질 이용가능성을 증가시키기 위해 탈분지화 효소가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 탈분지화 효소의 2가지의 예시적인 클래스가 있다 - 이소아밀라제 및 풀루라나제 (예를 들어, 표 3 참조). 효소적으로, 양쪽 클래스가 동일한 기능을 수행하지만, 기질 특이성이 상이하다. 탈분지화 효소를 사용하는 것이 수율을 증가시키는 한편, 사용 시기는 사용되는 기질 및 프로세스에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, α-글루칸이 α-아밀라제 및 탈분지화 효소로 전치리된 후, 생성된 탈분지화된 말토덱스트린(들)이 다른 경로 효소와 함께 반응기 내로 공급된다. 다른 실시양태에서, 탈분지화는 경로와 동시에 발생하고, 모든 경로 효소 뿐만 아니라 탈분지화 효소를 함유하는 반응 내로 분지화된 α-글루칸이 공급된다.
표 3. 예시적인 탈분지화 효소
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무세포 생산
"무세포 생산"은 살아 있는 세포를 사용하지 않으면서 생체분자 또는 화학적 화합물의 합성을 위해 생물학적 프로세스를 사용하는 것이다. 오히려, 세포가 용해되고, 효소를 함유하는 미정제 (조질) 부분이 원하는 산물의 생산을 위해 사용된다. 비제한적인 예로서, 세포가 배양되고, 수확되며, 고압 균질화에 의해 용해된다. 무세포 반응은 뱃치 또는 페드-뱃치 양식으로 수행될 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 반응 네트워크가 반응기의 작업 부피를 채우고, 세포내 환경보다 더 희석될 수 있다. 그러나, 막에 회합된 촉매를 포함하여, 실질적으로 모든 세포 촉매가 제공된다. 세포 용해 동안 내막이 단편화되고, 이러한 막의 단편이 기능적 막 소포를 형성한다. 따라서, 복합적인 생체변환이 촉매작용에 의해 실행된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Swartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13]을 참조한다.
본 개시내용의 무세포 방법 및 시스템은, 일부 실시양태에서, 본원에서 더욱 상세하게 논의된 세포 용해물 (예를 들어, 조질이거나 또는 부분적으로 정제된 세포 용해물)을 사용한다. 세포 용해물은, 예를 들어, 기계적 수단 (예를 들어, 전단 또는 파쇄)에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 화학적으로 투과성이게 된 세포와 상이하다. 본원에서 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 세포 용해 (예를 들어, 기계적 세포 용해) 동안, 반전된 막 소포가 세포 용해물 내에 형성되도록 세포 내막이 단편화된다. 용해 (예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)된 세포는 더 이상 무손상이 아니다.
일부 실시양태에서, 투과성이게 된 세포가 사용된다. 투과성이게 된 세포는 천공 (소형 구멍)을 함유하는 무손상 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 반응에서 사용하기 위해 세포 내용물을 방출하도록 세포가 투과성이게 될 수 있다.
일부 실시양태에서, 부분적으로 정제된 세포 분획이 사용된다. 부분적으로 정제된 세포 분획은 1개 이상의 세포 구성요소 (예를 들어, 세포막)가 부분적으로 또는 완전히 제거된 세포 용해물이다.
열안정성 효소
효소가 (a) 다른 천연 효소를 변성시키는 고온에 노출된 후 그의 활성의 실질적인 부분을 유지하거나, 또는 (b) 천연 효소가 낮은 속도로 기능하는 중온 내지 고온에 노출된 후에 비교적 높은 속도로 기능하는 경우에 효소는 열안정성인 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 비교적 높은 온도에 노출된 후에 50%를 초과하는 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 비교적 높은 온도에 노출된 후에 50-100% 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 비교적 높은 온도에 노출된 후에 그의 활성의 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-65%, 50-60%, 또는 50-55%를 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시킬 비교적 높은 온도에 노출된 후에 그의 활성의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%를 유지한다.
일부 실시양태에서, 중온 내지 고온에 노출된 후의 열안정성 효소의 활성은 유사한 (비-열안정성) 천연 효소의 활성보다 더 크다 (예를 들어, 이보다 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 더 큼).
열안정성 효소 (예를 들어, 포스파타제 또는 포스포릴라제)는, 예를 들어, 45℃ 내지 80℃, 또는 이를 초과하는 온도에서, 활성을 유지할 수 있다 (반응을 촉매할 수 있음). 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 45-80℃ , 45-70℃, 45-60℃, 45-50℃, 50-80℃, 50-70℃, 50-60℃, 60-80℃, 60-70℃, 또는 70-80℃의 온도에서 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 또는 80℃의 온도에서 활성을 유지할 수 있다. 열안정성 효소는 비교적 높은 온도에 노출된 후에 15분 내지 48시간, 또는 이를 초과하는 시간 동안 비교적 높은 온도에서 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 열안정성 효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42, 또는 48시간 동안 비교적 높은 온도에서 활성을 유지할 수 있다.
조작된 세포
본 개시내용의 조작된 세포는, 일부 실시양태에서, 전분 및/또는 셀룰로스/셀로덱스트린을 당으로 전환시키는데 요구되는 효소 활성 중 적어도 1개 또는 모두를 포함한다. "조작된 세포"는 적어도 1개의 조작된 (예를 들어, 재조합 또는 합성) 핵산을 포함하거나, 또는 구조적으로 및/또는 기능적으로 그의 천연-발생 대응물과 상이하도록 다른 방식으로 변형된 세포이다. 따라서, 조작된 핵산을 함유하는 세포는 "조작된 세포"로 간주된다.
본 개시내용의 조작된 세포는, 일부 실시양태에서, α-글루칸 포스포릴라제 (예를 들어, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제) 및/또는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (예를 들어, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제), 포스포글루코뮤타제 (예를 들어, 열안정성 포스포글루코뮤타제), 및 이소머라제, 에피머라제, 데히드로게나제 및 당 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소 (예를 들어, 열안정성 효소)를 포함한다.
조작된 세포는, 일부 실시양태에서, 선별성 마커를 발현한다. 선별성 마커는 세포의 형질감염 후 (또는 외래 핵산을 세포 내로 도입하는데 사용되는 다른 철차 후)에 조작된 핵산을 취하여 발현하는 조작된 세포를 선별하는데 전형적으로 사용된다. 따라서, 산물을 코딩하는 핵산이 선별성 마커를 또한 코딩할 수 있다. 선별성 마커의 예는, 비제한적으로, 항생제에 대한 저항성 또는 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질 또는 기타 화합물을 코딩하는 유전자 ((예를 들어, 앰피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자 및 클로람페니콜 저항성 유전자)을 포함한다. 기타 선별성 마커를 본 개시내용에 따라 사용할 수 있다.
핵산 (예를 들어, 조작된 핵산)이 코딩하는 산물이 세포에서 발현되면, 조작된 세포가 산물을 "발현"한다. 유전자 발현은 핵산 형태의 유전 명령이 산물, 예컨대 단백질 (예를 들어, 효소)을 합성하는데 사용되는 프로세스를 지칭하는 것으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
조작된 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 또는 기타 유형의 세포이다.
본 개시내용에서 유용한 조작된 박테리아 세포는, 비제한적으로, 조작된 에스케리키아(Escherichia) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 자이모나스(Zymonas) 종, 아세토박터(Acetobacter) 종, 시트로박터(Citrobacter) 종, 시네코시스티스(Synechocystis) 종, 리조비움(Rhizobium) 종, 클로스트리디움(Clostridium) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 크산토모나스(Xanthomonas) 종, 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 바실루스(Bacillus) 종, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 아에로모나스(Aeromonas) 종, 아조토박터(Azotobacter) 종, 코마모나스(Comamonas) 종, 미코박테리움(Mycobacterium) 종, 로도코쿠스(Rhodococcus) 종, 글루코노박터(Gluconobacter) 종, 랄스토니아(Ralstonia) 종, 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus) 종, 마이크로루나투스(Microlunatus) 종, 게오박터(Geobacter) 종, 게오바실루스(Geobacillus) 종, 아르토박터(Arthrobacter) 종, 플라보박테리움(Flavobacterium) 종, 세라티아(Serratia) 종, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 종, 써무스(Thermus) 종, 스테노프로포모나스(Stenotrophomonas) 종, 크로모박테리움(Chromobacterium) 종, 시노리조비움(Sinorhizobium) 종, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 종, 아그로박테리움(Agrobacterium) 종, 비브리오(Vibrio) 종, 및 판토에아(Pantoea) 종을 포함한다.
본 개시내용에서 유용한 조작된 효모 세포는, 비제한적으로, 조작된 사카로미세스(Saccharomyces) 종, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia) 및 피키아(Pichia)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 유용한 조작된 세포는 조작된 에스케리키아 콜라이 세포, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 세포, 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포, 및/또는 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 유용한 조작된 세포는 조작된 에스케리키아 콜라이 세포이다.
조작된 핵산
"핵산"은 공유결합으로 함께 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드이고, 일부 경우에는, 포스포디에스테르 결합을 함유할 수 있다 (예를 들어, 포스포디에스테르 "백본"). 핵산 (예를 들어, 핵산의 구성요소 또는 일부분)은 천연 발생일 수 있거나 또는 조작될 수 있다. "천연 발생" 핵산은 인간의 개입 없이 자연에 존재하는 세포 내에 존재한다. "조작된 핵산"은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "재조합 핵산"은 핵산 분자들 (예를 들어, 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의 것들)을 연결함으로써 구축된 분자를 지칭하고, 전형적으로는, 살아 있는 세포 내에서 복제될 수 있다. "합성 핵산"은 생물학적으로 합성되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 다른 수단에 의해 합성 또는 증폭된 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학적으로 변형되거나 또는 다른 방식으로 변형되었지만 천연-발생 핵산 분자와 염기 쌍을 형성할 수 있는 핵산을 포함한다. 재조합 및 합성 핵산은 상기물 중 어느 1개의 복제로부터 생성되는 분자를 또한 포함한다. 조작된 핵산은 천연 발생인 핵산의 부분을 함유할 수 있지만, 전체로서, 조작된 핵산은 천연적으로 발생하지 않고, 인간의 개입을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 산물을 코딩하는 핵산은 재조합 핵산 또는 합성 핵산이다. 다른 실시양태에서, 산물을 코딩하는 핵산은 천연 발생이다.
본원에서 제공되는 바와 같은, 효소를 코딩하는 조작된 핵산은 나머지 핵산의 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산의 제어 영역인 "프로모터"에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 자신이 조절하는 핵산의 발현을 구동시키거나 또는 그의 전사를 구동시킨다.
소정의 유전자 또는 서열의 코딩 분절의 상류에 위치하는 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 프로모터는 유전자 또는 서열과 천연적으로 회합되는 것일 수 있다. 이같은 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 코딩 핵산 서열은 일반적으로는 코딩되는 서열과 그의 천연 환경에서 회합되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. 이같은 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 단리된 프로모터; 및 "천연적으로 발생"하지 않는 합성 프로모터 또는 인핸서, 예를 들어, 관련 기술 분야에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 돌연변이를 함유하는 것을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성으로 생산하는 것에 더하여, 중합 효소 연쇄 반응 반응 (PCR)을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 서열이 생산될 수 있다.
프로모터는 자신이 조절하는 핵산과 관련하여 올바른 기능적 위치 및 배향으로 있어서 이러한 핵산의 전사 개시 및/또는 발현을 제어할 (구동시킬) 때 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다.
본 개시내용의 조작된 핵산은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. "구성적 프로모터"는 세포 내에서 지속적으로 활성인 프로모터를 지칭한다. "유도성 프로모터"는 유도제 또는 유도 작용제의 존재 하에 있거나, 이에 영향을 받거나 또는 이와 접촉되거나, 또는 억제를 야기하는 인자의 부재 하에 활성화될 때 전사 활성을 개시 또는 강화하는 프로모터를 지칭한다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 프로모터는 본원에 기술되었거나 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는, 비제한적으로, 화학적/생화학적-조절 및 물리적-조절 프로모터 예컨대 알콜-조절 프로모터, 테트라사이클린-조절 프로모터, 스테로이드-조절 프로모터, 금속-조절 프로모터, 발병기전-조절 프로모터, 온도/열-유도성, 포스페이트-조절 (예를 들어, PhoA), 및 빛-조절 프로모터를 포함한다.
유도제 또는 유도 작용제는 내인성일 수 있거나, 또는 유도성 프로모터로부터의 전사 활성을 조절하는 것에서 활성이도록 하는 방식으로 유도성 프로모터와 접촉되는 정상적으로는 외인성인 조건 (예를 들어, 빛), 화합물 (예를 들어, 화학적 또는 비-화학적 화합물) 또는 단백질일 수 있다. 따라서, 핵산의 "전사를 조절하는 신호"는 유도성 프로모터 상에 작용하는 유도제 신호를 지칭한다. 전사를 조절하는 신호는 사용되는 조절 시스템에 따라 전사를 활성화 또는 불활성화시킬 수 있다. 전사 활성화는 직접적으로 프로모터 상에 작용하여 전사를 구동시키는 것, 또는 프로모터가 전사를 구동시키는 것을 방지하는 리프레서의 불활성화에 의해 간접적으로 프로모터 상에 작용하는 것을 수반할 수 있다. 반대로, 전사 탈활성화는 직접적으로 프로모터 상에 작용하여 전사를 방지하는 것, 또는 프로모터 상에 작용하는 리프레서를 활성화시킴으로써 프로모터 상에 간접적으로 작용하는 것을 수반할 수 있다.
조작된 핵산은 형질전환, 형질감염 (예를 들어, 화학적 (예를 들어, 인산칼슘, 양이온성 중합체 또는 리포솜) 또는 비-화학적 (예를 들어, 전기천공, 초음파천공, 임페일펙션, 광학적 형질감염, 유체역학적)), 및 형질도입 (예를 들어, 바이러스 형질도입)을 비제한적으로 포함하는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
천연 발생의 세포내 핵산이 코딩하는 효소 또는 기타 단백질은 "내인성 효소" 또는 "내인성 단백질"로 지칭될 수 있다.
프로테아제 표적화
본 개시내용의 조작된 세포는 관심 당 (예를 들어, 알룰로스)의 생산에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 세포의 건강에 필요한 효소를 발현할 수 있다 (예를 들어, 내인성으로 발현할 수 있음). 이같은 효소는 본원에서 "표적 효소"로 지칭된다. 예를 들어, 조작된 세포가 발현하는 표적 효소는 기질 또는 보조인자에 대해 당 생산 경로에 공급되는 전구체의 비율을 증가시키는 효소와 경쟁할 수 있다. 또 다른 예로서, 조작된 세포가 발현하는 표적 효소는 기질 또는 보조인자에 대해 당 생산 경로의 핵심 경로 진입 효소와 경쟁할 수 있다. 또 다른 예로서, 조작된 세포가 발현하는 표적 효소는 기질 또는 보조인자에 대해 당 생산 경로의 기질 또는 보조인자를 공급하는 효소와 경쟁할 수 있다.
이러한 부정적인 영향을 무효화하거나 감소시키기 위해, 당 생산 동안의 불활성화를 위해 표적 효소가 "표적화" 및 절단될 수 있도록, 표적 효소가 자신의 단백질 서열 내에 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 포함하도록 변형될 수 있다 ( 예를 들어, 2012년 3월 1일에 공개된 미국 공개 번호 2012/0052547 A1; 및 2015년 2월 12일에 공개된 국제 공개 번호 WO 2015/021058 A2를 참조하고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨).
세포 성장기 동안 (예를 들어, 조작된 세포가 배양될 때) 세포의 원형질막공간 내에 격리되고 (표적 효소로부터 분리됨), 전환기 동안 (예를 들어, 세포 용해물을 생산하기 위한 세포 용해 후에) 표적 효소와 접촉되는 동족의 부위-특이적 프로테아제와의 접촉으로부터 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 함유하는 표적 효소의 절단이 초래된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포는, 일부 실시양태에서, (i) 전환율에 부정적으로 영향을 미치고 표적 효소의 단백질 서열 내에 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 포함하는 표적 효소를 코딩하는 조작된 핵산, 및 (ii) 표적 효소의 부위-특이적 프로테아제-인식 서열을 절단하고 원형질막공간-표적화 서열을 포함하는 부위-특이적 프로테아제를 코딩하는 조작된 핵산을 포함한다. 이러한 원형질막공간-표적화 서열은 세포가 용해될 때까지 세포의 원형질막 주위공간으로 부위-특이적 프로테아제를 격리하는 것을 담당한다. 원형질막공간-표적화 서열의 예가 하기에서 제공된다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 프로테아제의 예는, 비제한적으로, 알라닌 카르복시펩티다제, 아스타신, 박테리아 류실 아미노펩티다제, 암 응고촉진제, 카텝신 B, 클로스트리파인, 사이토졸 알라닐 아미노펩티다제, 엘라스타제, 엔도프로테이나제 Brg-C, 엔테로키나제, 개스트릭신, 젤라티나제, Gly-X 카르복시펩티다제, 글리실 엔도펩티다제, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제, 하이포더민 C, Iga-특이적 세린 엔도펩티다제, 류실 아미노펩티다제, 류실 엔도펩티다제, lysC, 리소좀 프로-X 카르복시펩티다제, 라이실 아미노펩티다제, 메티오닐 아미노펩티다제, 믹소박터, 나르딜리신, 췌장 엔도펩티다제 E, 피코르나인 2B, 피코르나인 3C, 프로엔도펩티다제, 프롤릴 아미노펩티다제, 프로단백질 전환효소 I, 프로단백질 전환효소 II, 루셀리신, 사카로펩신, 세메노겔라제, T-플라스미노겐 활성화제, 트롬빈, 조직 칼리크레인, 담배 식각 바이러스 (TEV), 토가비린, 트립토파닐 아미노펩티다제, U-플라스미노겐 활성화제, V8, 베놈빈 B, 베놈빈 BB 및 Xaa-프로 아미노펩티다제를 포함한다.
원형질막공간 표적화
당 생산 경로의 효소는 세포의 건강 (예를 들어, 생육력)에 부정적인 영향을 미치는 적어도 1개의 효소를 포함할 수 있다. 이러한 부정적인 영향을 무효화하거나 감소시키기 위해, 천연적으로는 효소가 위치하지 않고 효소가 세포의 건강에 부정적으로 영향을 미치지 않는 세포 또는 세포외 구획으로 효소가 재배치되도록, 효소가 재배치 서열을 포함하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 2011년 11월 10일에 공개된 공개 번호 US-2011-0275116-A1 참조). 예를 들어, 당 생산 경로의 효소가 세포의 원형질막 주위공간으로 재배치될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 원형질막공간-표적화 서열에 연결된 당 생산 경로의 적어도 1개의 효소를 포함한다. "원형질막공간-표적화 서열"은 자신이 연결된 단백질을 세포의 원형질막공간으로 표적화하는 아미노산 서열이다. 원형질막공간-표적화 서열에 연결된 단백질은 단백질이 발현되는 세포의 원형질막공간 내에 격리될 것이다.
원형질막공간-표적화 서열은, 예를 들어, 박테리아 분비 단백질의 N-말단으로부터 유래될 수 있다. 이러한 서열의 길이는 아미노산 약 15개 내지 약 70개로 다양하다. 원형질막공간-표적화 서열의 1차 아미노산 서열은 다양하지만, 일반적으로는 하기 구성요소를 포함하는 통상적인 구조를 갖는다: (i) N-말단 부분은 길이가 가변적이고, 일반적으로 양성 순전하를 보유하고; (ii) 아미노산 약 6개 내지 약 15개의 중앙의 소수성 코어가 이어지며; (iii) 최종 구성요소는 신호 펩티다제에 대한 절단 부위를 규정하는 4 내지 6개의 아미노산을 포함한다.
본 개시내용의 원형질막공간-표적화 서열은, 일부 실시양태에서, 그람 음성 박테리아에서 분비되는 단백질로부터 유래될 수 있다. 분비되는 단백질은 박테리아에 의해, 또는 박테리아를 감염시키는 박테리오파지에 의해 코딩될 수 있다. 분비되는 단백질의 그람 음성 박테리아 공급원의 예는, 비제한적으로, 에스케리키아, 슈도모나스, 클레브시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella), 카울로박터(Caulobacter), 메틸로모나스(Methylomonas), 아세토박터, 아크로모박터(Achromobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 아에로모나스, 아그로박테리움, 알칼리게네스, 아조토박터, 부르크홀데리아(Burkholderia), 시트로박터, 코마모나스, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 리조비움, 비브리오, 및 크산토모나스 속의 구성원을 포함한다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 원형질막공간-표적화 서의 예는, 비제한적으로, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다:
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA (서열식별번호: 1);
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (서열식별번호: 2);
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA (서열식별번호: 3);
MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA (서열식별번호: 4);
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (서열식별번호: 5);
MKKIWLALAGLVLAFSASA (서열식별번호: 6);
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA (서열식별번호: 7);
MKQALRVAFGFLILWASVLHA (서열식별번호: 8);
MRVLLFLLLSLFMLPAFS (서열식별번호: 9); 및
MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (서열식별번호: 10).
세포 배양물 및 세포 용해물
전형적으로, 조작된 세포는 배양된다. "배양함"은 세포가 제어된 조건 하에, 전형적으로는 그의 천연 환경의 외부에서 배양되는 프로세스를 지칭한다. 예를 들어, 조작된 세포, 예컨대 조작된 박테리아 세포는 액체 "배양 배지"로도 지칭되는 액체 영양분 브로스 내의 세포 현탁액으로서 성장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 미전환 전분이 세포를 성장시키기 위한 기질 공급물로서 사용된다.
통상적으로 사용되는 박테리아 에스케리키아 콜라이 성장 배지의 예는, 비제한적으로, LB (루리아 베르타니(Luria Bertani)) 밀러(Miller) 브로스 (1% NaCl): 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 1% NaCl; LB (루리아 베르타니) 레녹스 브로스(Lennox Broth) (0.5% NaCl): 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 0.5% NaCl; SOB 배지 (슈퍼 옵티멀 브로스(Super Optimal Broth)): 2% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4; SOC 배지 (슈퍼 옵티멀 브로스 + 이화성 리프레서): SOB + 20 mM 글루코스; 2x YT 브로스 (2x 효모 추출물 및 트립톤): 1.6% 펩톤, 1% 효모 추출물, 및 0.5% NaCl; TB (테리픽 브로스(Terrific Broth)) 배지: 1.2% 펩톤, 2.4% 효모 추출물, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4 및 0.4% 글리세롤; 및 SB (슈퍼 브로스(Super Broth)) 배지: 3.2% 펩톤, 2% 효모 추출물, 및 0.5% NaCl 및 또는 코르츠(Korz) 배지 (Korz, DJ et al. 1995)를 포함한다.
고밀도 박테리아 에스케리키아 콜라이 성장 배지의 예는 DNAGro™ 배지, ProGro™ 배지, AutoX™ 배지, DetoX™ 배지, InduX™ 배지, 및 SecPro™ 배지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 효소 또는 핵산의 발현을 초래하는 조건 하에 배양된다. 이같은 배양 조건은 발현되는 특정한 산물 및 상기 산물의 원하는 양에 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 30℃ 내지 40℃의 온도에서 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃의 온도에서 배양될 수 있다. 전형적으로, 조작된 세포, 예컨대 조작된 박테리아 세포는 37℃의 온도에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 12시간 내지 72시간, 또는 이를 초과하는 기간 동안 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간의 기간 동안 배양될 수 있다. 전형적으로, 조작된 세포, 예컨대 조작된 박테리아 세포는 12 내지 24시간의 기간 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 12 내지 24시간 동안 37℃의 온도에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 (예를 들어, 액체 세포 배양 배지에서) 5 내지 25의 광학 밀도 (600 nm (OD600)의 파장에서 측정됨)로 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 5, 10, 15, 20, 또는 25의 OD600으로 배양된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 1 x 104 내지 1 x 108개의 생육성 세포/ml 세포 배양 배지의 밀도로 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 또는 1 x 1010개의 생육성 세포/ml의 밀도로 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 1 x 108 내지 1 x 1010개의 생육성 세포/ml의 밀도로 배양된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 2 x 105 내지 3 x 107개의 생육성 세포/ml의 밀도로 배양된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 생물반응기에서 배양된다. 생물반응기는 세포가 배양되는 용기, 예컨대 1회용 (처분가능)이거나, 오토클레이빙이 가능하거나 또는 멸균가능할 수 있는 배양 플라스크, 접시 또는 백을 단순하게 지칭한다. 생물반응기는 유리로 만들어질 수 있거나, 또는 중합체를 기반으로 할 수 있거나, 또는 다른 물질로 만들어질 수 있다.
생물반응기의 예는, 비제한적으로, 교반 탱크 (예를 들어, 잘 혼합됨) 생물반응기 및 관형 (예를 들어, 플러그 유동) 생물반응기, 에어리프트 생물반응기, 막 교반 탱크, 스핀 필터 교반 탱크, 비브리오믹서, 유동층 반응기, 및 막 생물반응기를 포함한다. 생물반응기를 작동시키는 방식은 뱃치 또는 연속 프로세스일 수 있고, 배양되는 조작된 세포에 좌우될 것이다. 공급물 및 산물 흐름이 시스템으로부터 연속적으로 공급 및 회수될 때 생물반응기가 연속적이다. 뱃치 생물반응기는 연속적 재순환 유동이 있을 수 있지만, 연속적인 영양분 공급 또는 산물 수확이 없다. 간헐적-수확 및 페드-뱃치 (또는 뱃치 페드) 배양의 경우, 세포가 뱃치 배지와 조성 면에서 유사한 배지 내에 더 낮은 생육성 세포 밀도로 접종된다. 영양분이 다소 고갈되고 세포가 성장 정지기에 접근하고 있을 때까지 본질적으로 외부 조작 없이 세포가 기하급수적으로 성장되도록 허용된다. 이러한 시점에, 간헐적 수확 뱃치-페드 프로세스의 경우, 세포 및 산물의 일부분이 수확될 수 있고, 제거된 배양 배지에 신선한 배지가 보충된다. 이러한 프로세스가 여러번 반복될 수 있다. 재조합 단백질 및 항체의 생산을 위해, 페드-뱃치 프로세스가 사용될 수 있다. 세포는 기하급수적으로 성장 중이지만, 영양분은 고갈되고 있는 한편, 농축된 공급 배지 (예를 들어, 10-15배 농축된 기본 배지)가 추가적인 영양분을 공급하도록 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가되어, 세포 농도 및 전환기 길이의 추가적인 증가를 허용한다. 배양 배지 (브로스)를 제거하지 않으면서 신선한 배지가 세포 농도에 비례하여 첨가될 수 있다. 배지 추가를 수용하기 위해, 페드-뱃치 배양은 생물반응기의 전체 용량보다 훨씬 더 낮은 부피 (예를 들어, 최대 부피의 약 40% 내지 50%)로 시작된다.
본 개시내용의 일부 방법은 당의 대규모 생산에 관한 것이다. 대규모 생산 방법을 위해, 조작된 세포는 5 리터 (L) 내지 50 L의 부피, 또는 이를 초과하는 부피의 액체 배양 배지에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 10 L 초과 (또는 이상)의 부피의 액체 배양 배지에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L의 부피, 또는 이를 초과하는 부피의 액체 배양 배지에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 5 L 내지 10 L, 5 L 내지 15 L, 5 L 내지 20 L, 5 L 내지 25 L, 5 L 내지 30 L, 5 L 내지 35 L, 5 L 내지 40 L, 5 L 내지 45 L, 10 L 내지 15 L, 10 L 내지 20 L, 10 L 내지 25 L, 20 L 내지 30 L, 10 L 내지 35 L, 10 L 내지 40 L, 10 L 내지 45 L, 10 L 내지 50 L, 15 L 내지 20 L, 15 L 내지 25 L, 15 L 내지 30 L, 15 L 내지 35 L, 15 L 내지 40 L, 15 L 내지 45 L, 또는 15 내지 50 L의 부피의 액체 배양 배지에서 성장될 수 있다.
전형적으로, 조작된 세포의 배양 후에 세포가 용해된다. "용해시킴"은, 예를 들어, 바이러스적, 효소적, 기계적, 화학적, 열 또는 삼투압적 메카니즘에 의해, 세포가 세분되는 프로세스를 지칭한다. "세포 용해물"은 세포소기관, 막 지질, 단백질, 핵산 및 반전된 막 소포를 예를 들어 포함하는, 용해된 세포 (예를 들어, 용해된 조작된 세포)의 내용물을 함유하는 유체를 지칭한다. 본 개시내용의 세포 용해물은, 본원에서 제공되는 바와 같이, 조작된 세포의 임의의 집단을 용해시킴으로써 생산될 수 있다. "세포 용해물"은 투과성이게 된/천공된 세포를 배제할 수 있다.
"용해시킴"으로 지칭되는, 세포 용해 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것을 본 개시내용에 따라 사용할 수 있다. 이같은 세포 용해 방법은, 비제한적으로, 물리적/기계적 용해, 예컨대 균질화, 뿐만 아니라 화학적, 열적, 및/또는 효소적 용해를 포함한다.
세포 용해는 주의깊게 제어된 세포 환경을 교란하여, 조절되지 않은 내인성 프로테아제 및 포스파타제에 의한 단백질 분해 및 변형을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 프로테아제 억제제 및/또는 포스파타제 억제제가 세포 용해물에 또는 용해 전에 세포에 첨가될 수 있거나, 또는 이러한 활성이 유전자 불활성화 또는 프로테아제 표적화에 의해 제거될 수 있다.
세포 용해물은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 영양분과 조합될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 Na2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, NaCl, MgSO4, CaCl2와 조합될 수 있다. 다른 영양분의 예는, 비제한적으로, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 오로트산마그네슘, 시트르산마그네슘, 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨, 삼염기성 인산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 삼염기성 인산나트륨, 일염기성 인산암모늄, 이염기성 인산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 수산화암모늄을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 용해물은 특정한 구성요소의 강화 또는 정제 또는 감소 또는 제거를 위해 화학적, 열적, 효소적 또는 기계적 수단에 의해 추가로 변형된 파괴된 세포 현탁액으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 기계적, 열적, 화학적 또는 효소적 수단을 통한 파괴 후에, 선택된 효소 활성을 부분적으로 강화하거나 또는 원치 않는 효소 활성 또는 용해물 구성요소를 제거하기 위해 생성된 물질을 기계적 분리, 예를 들어 막 여과, 원심분리 등에 적용할 수 있다. 추가적인 예는 파괴된 세포 현탁액에 염 또는 용매를 첨가하거나 또는 파괴된 세포 현탁액의 pH 또는 온도를 변경시켜 원하는 활성을 침전시킨 후 상기 기술된 바와 같이 이러한 침전된 구성요소를 기계적으로 분리하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 염 또는 용매 첨가 또는 pH 또는 온도 변경이 원치 않는 활성의 효소를 불활성화시키나 또는 침전시킨 후 원치 않는 효소 활성 또는 활성들을 기계적으로 분리하는 것을 통해 원치 않는 활성을 제거하는 것에 활용될 수 있다.
세포 용해물은, 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 보조 인자와 조합될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 또는 효소 활성에 필요한 기타 비-단백질 화학적 화합물 (예를 들어, 무기 이온 및 조효소)와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 용해물을 전분 또는 셀룰로스/셀로덱스트린의 당으로의 전환을 초래하는 조건 하에 인큐베이션한다.
단일 반응에 사용되는 세포 용해물의 부피는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 부피는 1 내지 150 ㎥이다. 예를 들어, 세포 용해물의 부피는 1 ㎥, 5 ㎥, 10 ㎥, 15 ㎥, 20 ㎥, 25 ㎥, 30 ㎥, 35 ㎥, 40 ㎥, 45 ㎥, 50 ㎥, 55 ㎥, 60 ㎥, 65 ㎥, 70 ㎥, 75 ㎥, 80 ㎥, 85 ㎥, 90 ㎥, 95 ㎥, 100 ㎥, 105 ㎥, 110 ㎥, 115 ㎥, 120 ㎥, 125 ㎥, 130 ㎥, 135 ㎥, 140 ㎥, 145 ㎥, 또는 150 ㎥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 부피는 25 ㎥ 내지 150 ㎥, 50 ㎥ 내지 150 ㎥, 또는 100 ㎥ 내지 150 ㎥이다.
정제된 효소
본 발명의 일부 실시양태에서, 생산 반응에 첨가되기 전에 효소가 정제될 수 있다. 효소 정제는 파괴된 세포 현탁액 또는 배양된 성장 배지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 물질들의 복합적인 혼합물로부터의 특정 효소 또는 효소 활성 또는 일군의 효소 또는 효소 활성의 임의의 강화 또는 추출을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 정제된 효소 또는 단백질은 복합 매트릭스로부터 분리 또는 강화된 효소 또는 단백질인 것으로 이해되어야 하고, 여기서 다른 매트릭스 구성요소에 비교하여 그의 상대적인 농도가 증가된다. 효소를 정제하는 방법은 기계적, 크로마토그래피, 화학적, pH 또는 온도 수단을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 파괴된 세포 현탁액에 염을 첨가하는 것은 표적 효소 또는 단백질의 침전을 초래하고, 침전된 효소 또는 단백질의 기계적 분리, 예를 들어, 막 분리 또는 원심분리가 이어진다. 추가적인 예는 친화력 기반 크로마토그래피 방법 (예를 들어, 헥사-히스티딘-태그 또는 스트렙타비딘 기반 정제)을 통한 복합적인 매트릭스로부터의 효소의 분리를 포함할 수 있다.
효소적 특이성
효소 특이성은 효소가 또 다른 기질에 비교하여 1개의 기질에 대한 개선된 반응 효소 동역학, 열역학 또는 속도를 나타내는, 효소에 대해 고유한 형질인 것으로 이해되어야 한다. 특이성이 높은 효소는 촉매 속도 (전환수 또는 Kcat로 정의됨) 대 미카엘리스 상수 (Km) 또는 Kcat/Km의 비가 높은 것에 의해 가장 잘 예시된다. 기질 특이성이 높은 효소가 있는 것이 유리한데, 이것이 비-표적 산물의 생산을 감소시키는 것에 의해 반응 속도를 개선시키고 수율을 개선시키기 때문이다. 예를 들어, 알룰로스 생산을 위한 본원에 기술된 경로에는 화학 구조 면에서 유사한 몇몇 중간체, 즉 글루코스 1-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트, 프룩토스 6-포스페이트 및 알룰로스 6-포스페이트가 있다. 이러한 프로세스에서의 궁극적인 효소적 단계는 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 통해 알룰로스 6-포스페이트가 산물 알룰로스로 탈인산화되는 것이다. 알룰로스 6-포스페이트에 대한 특이성이 매우 높고 다른 경로 중간체, 즉 글루코스 1-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 및 프룩토스 6-포스페이트에 대한 특이성이 상대적으로 낮은 효소를 이용하는 것이 유리하다. 이러한 중간체들의 촉매적 탈인산화는 글루코스 또는 프룩토스의 생산을 초래할 것이고, 따라서 수율을 감소시키고 산물 복합도를 증가시킨다.
추가 실시양태
1. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제 (전분 포스포릴라제로도 지칭됨), 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
2. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
3. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제(들)가 아퀴펙스 아에올리쿠스, 써모크리니스 미네르바에, 써모술피디박터 타카이이, 써모술푸리모나스 디스뮤탄스, 써모코쿠스 리토랄리스, 팔라에오코쿠스 파시피쿠스, 써모토가 네아폴리타나, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 피로코쿠스 아비시, 써모코쿠스 티오레두센스, 데이노코쿠스 라디오두란스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 써무스 칼도필루스, 메이오써무스 실바누스, 오세아니써무스 프로푼두스, 아르덴티카테나 마리티마, 써모코쿠스 바로필루스, 슈도써모토가 써마룸, 히드로게노박터 써모필루스, 써무스 오시마이, 메이오써무스 루베르, 및 마리니토가 피에조필라 α-글루칸 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
5. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 포스포글루코뮤타제(들)가 써모코쿠스 코다카라엔시스, 피로코쿠스 쿠쿨카니이, 암모니펙스 데겐시이, 메타노써모박터 울페이이, 메타노써무스 페르비두스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 아르카에오글로부스 풀기두스, 페로글로부스 플라시두스, 게오글로부스 아한가리, 아르카에오글로부스 베네피쿠스, 아르카에오글로부스 술파티칼리두스, 아시둘리프로푼둠 부니에, 클로스트리디움 써모셀룸, 데플루비이탈레아 파피필라, 카미니셀라 스포로게네스, 칼로라나에로박터 페리레두센스, 써모시포 말라네시엔시스, 페르비도박테리움 펜니보란스, 심비오박테리움 써모필룸, 스피로카에타 써모필라, 및 써모아나에로박터 위에겔리이 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
6. 실시양태 1-5 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 포스포글루코뮤타제(들)가 써무스 써모필루스, 메이오써무스 티미두스, 써무스 필리포르미스, 마리니써무스 히드로써말리스, 써모시포 아프리카누스, 술프리히드로게니비움 아조렌세, 페르세포넬라 마리나, 마리니토가 피에조필라, 코스모토가 올레아리아, 써모토가 마리티마, 게오바실루스 스테아로써모필루스, 아녹시바실루스 플라비써무스, 써모술피디박터 타카이이, 페르비도박테리움 노도숨, 클로스트리디움 써모셀룸, 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 메타노코쿠스 잔나쉬이, 메타노토리스 이그네우스, 메타노칼도코쿠스 빌로수스, 메타노써모코쿠스 오키나웬시스, 슈도써모토가 써마룸, 데페리박터 데술푸리칸스, 및 써모비브리오 암모니피칸스 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
7. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제(들)가 써모박테리움 써모사카롤리티쿰, 써모아나에로박터 브로키이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 데페리박터 데술푸리칸스, 써모크리니스 루베르, 히드로게니비르가 종 128-5-R1-1, 브레비바실루스 써모루베르, 써모시포 아틀란티쿠스, 및 써모술피디박터 타카이이 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제(들)가 써모아나에로박터 위에겔리이, 써모아나에로박터 에타놀리쿠스, 써무스 이슬란디쿠스, 데이노코쿠스 게오써말리스 DSM 11300, 써모스파에라 아그레간스, 크레나르카에오타 아르카에온, 피로코쿠스 호리코시이 Ot3, 아퀴펙스 아에올리쿠스, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 아시도써무스 셀룰롤리티쿠스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스, 써모비피다 푸스카, 써모토가 네아폴리타나, 페트로토가 모빌리스, 및 써모데술파타토르 인디쿠스, 및 써무스 써모필루스 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
9. 하기 단계를 포함하는, 글루코스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 글루코스를 생산하는 단계.
10. 하기 단계를 포함하는, 글루코스를 생산하기 위한 무세포 방법
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 글루코스를 생산하는 단계.
11. 하기 단계를 포함하는, 글루코스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 글루코스를 생산하는 단계.
12. 하기 단계를 포함하는, 프룩토스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 프룩토스를 생산하는 단계.
13. 하기 단계를 포함하는, 프룩토스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 프룩토스를 생산하는 단계.
14. 하기 단계를 포함하는, 프룩토스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 프룩토스를 생산하는 단계.
15. 하기 단계를 포함하는, 소르비톨을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 소르비톨을 생산하는 단계.
16. 하기 단계를 포함하는, 소르비톨을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 소르비톨을 생산하는 단계.
17. 하기 단계를 포함하는, 소르비톨을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 소르비톨을 생산하는 단계.
18. 하기 단계를 포함하는, 리불로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리불로스를 생산하는 단계.
19. 하기 단계를 포함하는, 리불로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리불로스를 생산하는 단계.
20. 하기 단계를 포함하는, 리불로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리불로스를 생산하는 단계.
21. 하기 단계를 포함하는, 리보스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리보스를 생산하는 단계.
22. 하기 단계를 포함하는, 리보스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리보스를 생산하는 단계.
23. 하기 단계를 포함하는, 리보스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리보스를 생산하는 단계.
24. 하기 단계를 포함하는, 아라비노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 아라비노스를 생산하는 단계.
25. 하기 단계를 포함하는, 아라비노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 아라비노스를 생산하는 단계.
26. 하기 단계를 포함하는, 아라비노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 아라비노스를 생산하는 단계.
27. 하기 단계를 포함하는, 만노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 만노스를 생산하는 단계.
28. 하기 단계를 포함하는, 만노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 만노스를 생산하는 단계.
29. 하기 단계를 포함하는, 만노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 만노스를 생산하는 단계.
30. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 세포가 박테리아 세포를 포함하는 것인 방법.
31. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 세포가 효모 세포를 포함하는 것인 방법.
32. 실시양태 1-31 중 어느 하나에 있어서, 효소 중 적어도 1개가 세포에 대해 이종성인 방법.
33. 실시양태 1-32 중 어느 하나에 있어서, 용해 단계 (b)가 배양된 세포를 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
34. 실시양태 1-33 중 어느 하나에 있어서, 가열 단계 (c)가 세포 용해물을 적어도 50℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.
35. 실시양태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 전분이 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴 둘 다를 포함하는 것인 방법.
36. 실시양태 1-35 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제 및 열안정성 포스포글루코뮤타제가 단일 융합 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현되는 것인 방법.
37. 실시양태 1-36 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포 용해물.
38. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
39. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
40. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
41. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
42. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
43. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
44. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
45. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
46. 실시양태 38-45 중 어느 하나에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 효모 세포인 조작된 세포.
47. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
48. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
49. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
50. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
51. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
52. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
53. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
54. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
55. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
56. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
57. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
58. 실시양태 55-57 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)가 아퀴펙스 아에올리쿠스, 써모크리니스 미네르바에, 써모술피디박터 타카이이, 써모술푸리모나스 디스뮤탄스, 써모코쿠스 리토랄리스, 팔라에오코쿠스 파시피쿠스, 써모토가 네아폴리타나, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 피로코쿠스 아비시, 써모코쿠스 티오레두센스, 데이노코쿠스 라디오두란스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 써무스 칼도필루스, 메이오써무스 실바누스, 오세아니써무스 프로푼두스, 아르덴티카테나 마리티마, 써모코쿠스 바로필루스, 슈도써모토가 써마룸, 히드로게노박터 써모필루스, 써무스 오시마이, 메이오써무스 루베르, 및 마리니토가 피에조필라 셀로덱스트린 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
59. 실시양태 55-58 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 포스포글루코뮤타제(들)가 써모코쿠스 코다카라엔시스, 피로코쿠스 쿠쿨카니이, 암모니펙스 데겐시이, 메타노써모박터 울페이이, 메타노써무스 페르비두스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 아르카에오글로부스 풀기두스, 페로글로부스 플라시두스, 게오글로부스 아한가리, 아르카에오글로부스 베네피쿠스, 아르카에오글로부스 술파티칼리두스, 아시둘리프로푼둠 부니에, 클로스트리디움 써모셀룸, 데플루비이탈레아 파피필라, 카미니셀라 스포로게네스, 칼로라나에로박터 페리레두센스, 써모시포 말라네시엔시스, 페르비도박테리움 펜니보란스, 심비오박테리움 써모필룸, 스피로카에타 써모필라, 및 써모아나에로박터 위에겔리이 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
60. 실시양태 55-59 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 포스포글루코뮤타제(들)가 써무스 써모필루스, 메이오써무스 티미두스, 써무스 필리포르미스, 마리니써무스 히드로써말리스, 써모시포 아프리카누스, 술프리히드로게니비움 아조렌세, 페르세포넬라 마리나, 마리니토가 피에조필라, 코스모토가 올레아리아, 써모토가 마리티마, 게오바실루스 스테아로써모필루스, 아녹시바실루스 플라비써무스, 써모술피디박터 타카이이, 페르비도박테리움 노도숨, 클로스트리디움 써모셀룸, 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 메타노코쿠스 잔나쉬이, 메타노토리스 이그네우스, 메타노칼도코쿠스 빌로수스, 메타노써모코쿠스 오키나웬시스, 슈도써모토가 써마룸, 데페리박터 데술푸리칸스, 및 써모비브리오 암모니피칸스 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
61. 실시양태 55-60 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제(들)가 써모박테리움 써모사카롤리티쿰, 써모아나에로박터 브로키이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 데페리박터 데술푸리칸스, 써모크리니스 루베르, 히드로게니비르가 종 128-5-R1-1, 브레비바실루스 써모루베르, 써모시포 아틀란티쿠스, 및 써모술피디박터 타카이이 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
62. 실시양태 55-61 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제(들)가 써모아나에로박터 위에겔리이, 써모아나에로박터 에타놀리쿠스, 써무스 이슬란디쿠스, 데이노코쿠스 게오써말리스 DSM 11300, 써모스파에라 아그레간스, 크레나르카에오타 아르카에온, 피로코쿠스 호리코시이 Ot3, 아퀴펙스 아에올리쿠스, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 아시도써무스 셀룰롤리티쿠스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스, 써모비피다 푸스카, 써모토가 네아폴리타나, 페트로토가 모빌리스, 및 써모데술파타토르 인디쿠스, 및 써무스 써모필루스 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
63. 하기 단계를 포함하는, 글루코스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 글루코스를 생산하는 단계.
64. 하기 단계를 포함하는, 글루코스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 글루코스를 생산하는 단계.
65. 하기 단계를 포함하는, 글루코스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 글루코스를 생산하는 단계.
66. 하기 단계를 포함하는, 프룩토스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 프룩토스를 생산하는 단계.
67. 하기 단계를 포함하는, 프룩토스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 프룩토스를 생산하는 단계.
68. 하기 단계를 포함하는, 프룩토스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 프룩토스를 생산하는 단계.
69. 하기 단계를 포함하는, 소르비톨을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 소르비톨을 생산하는 단계.
70. 하기 단계를 포함하는, 소르비톨을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 소르비톨을 생산하는 단계.
71. 하기 단계를 포함하는, 소르비톨을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 소르비톨을 생산하는 단계.
72. 하기 단계를 포함하는, 리불로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리불로스를 생산하는 단계.
73. 하기 단계를 포함하는, 리불로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리불로스를 생산하는 단계.
74. 하기 단계를 포함하는, 리불로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리불로스를 생산하는 단계.
75. 하기 단계를 포함하는, 리보스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리보스를 생산하는 단계.
76. 하기 단계를 포함하는, 리보스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리보스를 생산하는 단계.
77. 하기 단계를 포함하는, 리보스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 리보스를 생산하는 단계.
78. 하기 단계를 포함하는, 아라비노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 아라비노스를 생산하는 단계.
79. 하기 단계를 포함하는, 아라비노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 아라비노스를 생산하는 단계.
80. 하기 단계를 포함하는, 아라비노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 아라비노스를 생산하는 단계.
81. 하기 단계를 포함하는, 만노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 만노스를 생산하는 단계.
82. 하기 단계를 포함하는, 만노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 만노스를 생산하는 단계.
83. 하기 단계를 포함하는, 만노스를 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
(b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
(d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
(e) 열-불활성화된 용해물에 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 만노스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
(f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 만노스를 생산하는 단계.
84. 실시양태 1-80 중 어느 하나에 있어서, 세포가 박테리아 세포를 포함하는 것인 방법.
85. 실시양태 1-80 중 어느 하나에 있어서, 세포가 효모 세포를 포함하는 것인 방법.
86. 실시양태 1-85 중 어느 하나에 있어서, 효소 중 적어도 1개가 세포에 대해 이종성인 방법.
87. 실시양태 1-86 중 어느 하나에 있어서, 용해 단계 (b)가 배양된 세포를 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
88. 실시양태 1-87 중 어느 하나에 있어서, 가열 단계 (c)가 세포 용해물을 적어도 50℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.
89. 실시양태 1-88 중 어느 하나에 있어서, 셀로덱스트린이 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴 둘 다를 포함하는 것인 방법.
90. 실시양태 1-89 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제 및 열안정성 포스포글루코뮤타제가 단일 융합 단백질 또는 이중기능적 단백질로서 발현되는 것인 방법.
91. 실시양태 1-90 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포 용해물.
92. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
93. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
94. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
95. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
96. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
97. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
98. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
99. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
100. 실시양태 35-41 중 어느 하나에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 효모 세포인 조작된 세포.
101. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
102. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
103. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
104. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
105. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
106. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
107. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
108. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 만노스 6-포스페이트 에피머라제, 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
109. 하기 단계를 포함하는, 당을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 이소머라제, 에피머라제, 데히드로게나제 및 당 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 열안정성 효소를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 단계 (a)의 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
(c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 열-불활성화된 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계.
110. 실시양태 109에 있어서, 적어도 1개의 열안정성 효소가 포스포글루코이소머라제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제로 이루어진 군으로부터 선택된 이소머라제인 방법.
111. 실시양태 109 또는 110에 있어서, 적어도 1개의 열안정성 효소가 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제인 방법.
112. 실시양태 109-111 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개의 열안정성 효소가 알도스 데히드로게나제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 및 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택된 데히드로게나제인 방법.
113. 실시양태 109-112 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개의 열안정성 효소가 글루코스 6-포스페이트 포스파타제, 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제, 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제, 리불로스 5-포스페이트 포스파타제, 리보스 5-포스페이트 포스파타제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 당 포스파타제인 방법.
114. 실시양태 109에 있어서, 당이 글루코스, 프룩토스, 알룰로스, 소르비톨, 리불로스, 리보스, 및 아라비노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
115. 실시양태 114에 있어서, 당이 글루코스이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 것인 방법.
116. 실시양태 115에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
117. 실시양태 114에 있어서, 당이 프룩토스이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 포스포글루코이소머라제 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제로부터 선택되는 것인 방법.
118. 실시양태 117에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 및 열안정성 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
119. 실시양태 114에 있어서, 당이 알룰로스이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로부터 선택되는 것인 방법.
120. 실시양태 119에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 방법.
121. 실시양태 114에 있어서, 당이 소르비톨이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 알도스 데히드로게나제 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제로부터 선택되는 것인 방법.
122. 실시양태 121에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 알도스 데히드로게나제, 및 열안정성 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
123. 실시양태 114에 있어서, 당이 리불로스이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제로부터 선택되는 것인 방법.
124. 실시양태 123에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 열안정성 리불로스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
125. 실시양태 114에 있어서, 당이 리보스이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제로부터 선택되는 것인 방법.
126. 실시양태 125에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 리보스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
127. 실시양태 114에 있어서, 당이 아라비노스이고, 적어도 1개의 열안정성 효소가 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제로부터 선택되는 것인 방법.
128. 실시양태 127에 있어서, 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 열안정성 6-포스포글루코노락토나제, 열안정성 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 열안정성 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
129. 실시양태 109-128 중 어느 하나에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 방법.
130. 실시양태 109-128 중 어느 하나에 있어서, 세포가 효모 세포인 방법.
131. 실시양태 109-130 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및/또는 적어도 1개의 열안정성 효소가 세포에 대해 이종성인 방법.
132. 실시양태 109-131 중 어느 하나에 있어서, 용해 단계 (b)가 배양된 세포를 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
133. 실시양태 109-132 중 어느 하나에 있어서, 가열 단계 (c)가 세포 용해물을 적어도 50℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.
134. 실시양태 109-133 중 어느 하나에 있어서, 전분이 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴 둘 다를 포함하는 것인 방법.
135. 실시양태 109-134 중 어느 하나에 있어서, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제 및 열안정성 포스포글루코뮤타제가 단일 융합 단백질로서 발현되는 것인 방법.
136. 하기 단계를 포함하는, 당을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 이소머라제, 에피머라제, 데히드로게나제 및 당 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 단계 (a)의 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계; 및
(c) 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계.
137. 하기 단계를 포함하는, 당을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) (ii) 포스포글루코뮤타제에 융합된 α-글루칸 포스포릴라제를 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) 이소머라제, 에피머라제, 데히드로게나제, 및 당 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(b) 단계 (a)의 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계; 및
(c) 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계.
138. 하기 단계를 포함하는, 당을 생산하기 위한 무세포 방법:
(a) 포스포글루코뮤타제에 융합된 α-글루칸 포스포릴라제를 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 단계;
(b) 이소머라제, 에피머라제, 데히드로게나제, 및 당 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 단계 (b)의 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계; 및
(d) 용해물을 전분 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 당을 생산하는 단계.
139. 실시양태 137 또는 138에 있어서, 단계 (a) 및/또는 (b)의 효소가 열안정성 효소인 방법.
140. 실시양태 139에 있어서, 방법이 세포 용해물(들)을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물(들)을 생산하는 것을 추가로 포함하는 방법.
141. 실시양태 109-138 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포 용해물.
142. 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 이소머라제, 에피머라제, 데히드로게나제 및 당 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 열안정성 효소를 포함하는 조작된 세포.
143. 실시양태 142에 있어서, 하기를 포함하는 조작된 세포:
(a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 및 열안정성 글루코스 6-포스페이트 포스파타제;
(b) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제;
(c) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제;
(d) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 알도스 데히드로게나제, 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제;
(e) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제;
(f) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제; 또는
(g) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제, 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제.
144. 실시양태 142 또는 143에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 효모 세포인 조작된 세포.
실시예
실시예 1. 전분에서 알룰로스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 알룰로스의 전환을 기술한다. 전분에서 알룰로스의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 포스포글루코이소머라제 (EC 5.3.1.9), 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제 (EC 5.3.1.-), 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여, 전분에서 알룰로스의 전환을 가능하게 한다 (도 1).
실시예 2. 전분에서 글루코스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 글루코스로의 전환을 기술한다. 전분에서 글루코스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6) 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여, 전분에서 글루코스로의 전환을 가능하게 한다 (도 2A).
이러한 실시예는 전분에서 글루코스로의 전환을 위한 또 다른 경로를 또한 기술한다. 전분에서 글루코스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 및 글루코스 1-포스페이트 포스파타제 (EC 3.1.3.10)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 전분에서 글루코스로의 전환을 가능하게 한다 (도 2B).
실시예 3. 전분에서 프룩토스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 프룩토스로의 전환을 기술한다. 전분에서 프룩토스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 포스포글루코이소머라제 (EC 5.3.1.9), 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 전분에서 프룩토스로의 전환을 가능하게 한다 (도 3).
실시예 4. 전분에서 소르비톨로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 소르비톨로의 전환을 기술한다. 전분에서 소르비톨로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 알도스 데히드로게나제 (EC 1.1.1.200), 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 전분에서 소르비톨로의 전환을 가능하게 한다 (도 4).
실시예 5. 전분에서 리불로스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 리불로스로의 전환을 기술한다. 전분에서 리불로스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49), 6-포스포글루코노락토나제 (EC 3.1.1.31), 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.44), 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-), 및 리불로스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 전분에서 리불로스로의 전환을 가능하게 한다 (도 5).
실시예 6. 전분에서 리보스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 리보스로의 전환을 기술한다. 전분에서 리보스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4 .1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49), 6-포스포글루코노락토나제 (EC 3.1.1.31), 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.44), 리보스 5-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.6) 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 전분에서 리보스로의 전환을 가능하게 한다 (도 6).
실시예 7. 전분에서 아라비노스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 전분에서 아라비노스로의 전환을 기술한다. 전분에서 아라비노스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 α-글루칸 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49), 6-포스포글루코노락토나제 (EC 3.1.1.31), 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.44), 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.6) 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 전분 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 전분에서 아라비노스로의 전환을 가능하게 한다 (도 7).
실시예 8. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 알룰로스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 알룰로스로의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 알룰로스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 포스포글루코이소머라제 (EC 5.3.1.9), 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제 (EC 5.3.1.-), 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 알룰로스로의 전환을 가능하게 한다.
실시예 9. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6) 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 전환을 가능하게 한다.
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 전환을 위한 또 다른 경로를 또한 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 및 글루코스 1-포스페이트 포스파타제 (EC 3.1.3.10)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 글루코스로의 전환을 가능하게 한다.
실시예 10. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 프룩토스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 프룩토스로의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 프룩토스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 포스포글루코이소머라제 (EC 5.3.1.9), 및 프룩토스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 프룩토스로의 전환을 가능하게 한다.
실시예 11. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 소르비톨로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 소르비톨로의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 소르비톨로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 알도스 데히드로게나제 (EC 1.1.1.200), 및 소르비톨-6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 소르비톨로의 전환을 가능하게 한다.
실시예 12. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리불로스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리불로스로의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리불로스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49), 6-포스포글루코노락토나제 (EC 3.1.1.31), 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.44), 및 리불로스 5-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-), 및 리불로스 6-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리불로스로의 전환을 가능하게 한다.
실시예 13. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리보스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리보스로의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리보스로의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49), 6-포스포글루코노락토나제 (EC 3.1.1.31), 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.44), 리보스 5-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.6) 및 리보스 5-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 리보스로의 전환을 가능하게 한다.
실시예 14. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 아라비노스로의 무세포 전환
이러한 실시예는 셀룰로스/셀로덱스트린에서 아라비노스러의 전환을 기술한다. 셀룰로스/셀로덱스트린에서 아라비노스러의 전환을 위한 적어도 1개의 효소를 코딩하는 적어도 1개의 이종성 유전자를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)를 액체 배양물에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 실시예에서 사용될 수 있는 이종성 효소의 예는 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.49), 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2, 5.4.2.5, 또는 5.4.2.6), 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49), 6-포스포글루코노락토나제 (EC 3.1.1.31), 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.44), 아라비노스 5-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.6) 및 아라비노스 5-포스페이트 포스파타제 (EC 5.3.1.-)의 열안정성 변이체를 포함한다. 성장기 말기에, 이종성 효소(들)의 발현을 유도하고, 이어서 세포 바이오매스를 수확한다. 그 후, 수확된 바이오매스를 기계적, 화학적 또는 효소적 수단을 통해 용해시킨다. 그 후, 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 이종성 효소(들)는 불활성화시키지 않는 온도로 가열한다. 셀룰로스/셀로덱스트린 공급원료, 무기 포스페이트 및 임의적인 다른 추가 영양분을 열 불활성화된 용해물에 첨가하여 셀룰로스/셀로덱스트린에서 아라비노스로의 전환을 가능하게 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 이에 대해 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되고, 이는 일부 경우에는 문서의 전문을 포괄할 수 있다.
본원에서 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수형은, 명확하게 반대로 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 하나를 초과하는 단계 또는 행동을 포함하는 본원에서 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행동의 순서가 방법의 단계 또는 행위가 열거된 순서에 반드시 제한되지는 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.
청구범위, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 이행구 예컨대 "포함하는", "포괄하는", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "수용하는", "로 구성되는" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하지만 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청의 특허 심사 절차 지침서, 섹션 2111.03에 기재된 바와 같이, "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진" 이행구만 각각 폐쇄형 또는 반폐쇄형 이행구이어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> GREENLIGHT BIOSCIENCES, INC. <120> CELL-FREE PRODUCTION OF SUGARS <130> G0830.70022WO00 <140> PCT/US2018/012516 <141> 2018-01-05 <150> US 62/443,447 <151> 2017-01-06 <150> US 62/538,181 <151> 2017-07-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala 20 25 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala 20 25 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Met Asn Lys Lys Val Leu Thr Leu Ser Ala Val Met Ala Ser Met Leu 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ala Ala His Ala 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Met Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Met Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ser Ala Ser Ala His Ala 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Leu His Ala 20 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala 1 5 10 15 Phe Ser <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Met Ala Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala 35

Claims (68)

  1. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스 화합물을 생산하는 방법:
    α-글루칸 또는 셀로덱스트린 포스포릴라제에 의해 촉매되는, 중합체성 글루코스 탄수화물을 글루코스 1-포스페이트 (G1P)로 전환시키는 단계; 포스포글루코뮤타제에 의해 촉매되는, 상기 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 전환시켜 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생산하는 단계; 포스포글루코이소머라제에 의해 촉매되는, 상기 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 전환시켜 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 생산하는 단계; 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제 (A6PE)에 의해 촉매되는, 상기 프룩토스 6-포스페이트 (F6P)를 전환시켜 알룰로스 6-포스페이트 (A6P)를 생산하는 단계; 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제 (A6PP)에 의해 촉매되는, 상기 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제 (A6P)를 알룰로스로 전환시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 중합체성 글루코스 탄수화물이 전분, 셀로덱스트린, 또는 글리코겐인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, α-글루칸 포스포릴라제가 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 써모크리니스 미네르바에(Thermocrinis minervae), 써모술피디박터 타카이이(Thermosulfidibacter takaii), 써모술푸리모나스 디스뮤탄스(Thermosulfurimonas dismutans), 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 팔라에오코쿠스 파시피쿠스(Palaeococcus pacificus), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana), 루미니클로스트리디움 써모셀룸(Ruminiclostridium thermocellum), 피로코쿠스 아비시(Pyrococcus abyssi), 써모코쿠스 티오레두센스(Thermococcus thioreducens), 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans), 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 써무스 칼도필루스(Thermus caldophilus), 메이오써무스 실바누스(Meiothermus silvanus), 오세아니써무스 프로푼두스(Oceanithermus profundus), 아르덴티카테나 마리티마(Ardenticatena maritima), 써모코쿠스 바로필루스(Thermococcus barophilus), 슈도써모토가 써마룸(Pseudothermotoga thermarum), 히드로게노박터 써모필루스(Hydrogenobacter thermophilus), 써무스 오시마이(Thermus oshimai), 메이오써무스 루베르(Meiothermus ruber), 및 마리니토가 피에조필라(Marinitoga piezophila) α-글루칸 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 셀로덱스트린 포스포릴라제가 클로스트리디움 써모셀룸(Clostridium thermocellum), 클로스트리디움 스트라미니솔벤스(Clostridium straminisolvens), 써모토가(Thermotoga) RQ2; 이그니스파에라 아그레간스(Ignisphaera aggregans), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 스피로카에타 써모필라(Spirochaeta thermophila), 칼디셀룰로시룹토르 베시이(Caldicellulosiruptor bescii), 딕티오글로무스 써모필룸(Dictyoglomus thermophilum), 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 칼디살리니박터 키리티마티엔시스(Caldisalinibacter kiritimatiensis), 데플루비이탈레아 파피필라(Defluviitalea phaphyphila), 칼디셀룰로시룹토르 크로노트스키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis), 써모코쿠스 시비리쿠스(Thermococcus sibiricus), 및 써모스파에라 아그레간스(Thermosphaera aggregans) 셀로덱스트린 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글루코뮤타제가 써모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis), 피로코쿠스 쿠쿨카니이(Pyrococcus kukulkanii), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 메타노써모박터 울페이이(Methanothermobacter wolfeii), 메타노써무스 페르비두스(Methanothermus fervidus), 술폴로부스 아시도칼다리우스, 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 페로글로부스 플라시두스(Ferroglobus placidus), 게오글로부스 아한가리(Geoglobus ahangari), 아르카에오글로부스 베네피쿠스(Archaeoglobus veneficus), 아르카에오글로부스 술파티칼리두스(Archaeoglobus sulfaticallidus), 아시둘리프로푼둠 부니에(Aciduliprofundum boonie), 클로스트리디움 써모셀룸(Clostridium thermocellum), 데플루비이탈레아 파피필라(Defluviitalea phaphyphila), 카미니셀라 스포로게네스(Caminicella sporogenes), 칼로라나에로박터 페리레두센스(Caloranaerobacter ferrireducens), 써모시포 말라네시엔시스(Thermosipho malanesiensis), 페르비도박테리움 펜니보란스(Fervidobacterium pennivorans), 심비오박테리움 써모필룸(Symbiobacterium thermophilum), 스피로카에타 써모필라(Spirochaeta thermophila), 및 써모아나에로박터 위에겔리이(Thermoanaerobacter wiegelii) 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글루코이소머라제가 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 메이오써무스 티미두스(Meiothermus timidus), 써무스 필리포르미스(Thermus filiformis), 마리니써무스 히드로써말리스(Marinithermus hydrothermalis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 술프리히드로게니비움 아조렌세(Sulfurihydrogenibium azorense), 페르세포넬라 마리나(Persephonella marina), 마리니토가 피에조필라(Marinitoga piezophila), 코스모토가 올레아리아(Kosmotoga olearia), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 게오바실루스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 아녹시바실루스 플라비써무스(Anoxybacillus flavithermus), 써모술피디박터 타카이이(Thermosulfidibacter takaii), 페르비도박테리움 노도숨(Fervidobacterium nodosum), 클로스트리디움 써모셀룸(Clostridium thermocellum), 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 메타노코쿠스 잔나쉬이(Methanococcus jannaschii), 메타노토리스 이그네우스(Methanotorris igneus), 메타노칼도코쿠스 빌로수스(Methanocaldococcus villosus), 메타노써모코쿠스 오키나웬시스(Methanothermococcus okinawensis), 슈도써모토가 써마룸(Pseudothermotoga thermarum), 데페리박터 데술푸리칸스(Deferribacter desulfuricans), 및 써모비브리오 암모니피칸스(Thermovibrio ammonificans) 포스포글루코이소머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제가 써모박테리움 써모사카롤리티쿰(Thermobacterium thermosaccharolyticum), 써모아나에로박터 브로키이(Thermoanaerobacter brockii), 칼다나에로박터 서브테라네우스(Caldanaerobacter subterraneus), 데페리박터 데술푸리칸스, 써모크리니스 루베르(Thermocrinis ruber), 히드로게니비르가(Hydrogenivirga) 종 128-5-R1-1, 브레비바실루스 써모루베르(Brevibacillus thermoruber), 써모시포 아틀란티쿠스(Thermosipho atlanticus), 및 써모술피디박터 타카이이(Thermosulfidibacter takaii) 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제가 써모아나에로박터 위에겔리이(Thermoanaerobacter wiegelii), 써모아나에로박터 에타놀리쿠스(Thermoanaerobacter ethanolicus), 써무스 이슬란디쿠스(Thermus islandicus), 데이노코쿠스 게오써말리스(Deinococcus geothermalis) DSM 11300, 써모스파에라 아그레간스(Thermosphaera aggregans), 크레나르카에오타 아르카에온(Crenarchaeota archaeon), 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii) Ot3, 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 루미니클로스트리디움 써모셀룸(Ruminiclostridium thermocellum), 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비이(Desulfotomaculum kuznetsovii), 칼다나에로박터 서브테라네우스(Caldanaerobacter subterraneus), 아시도써무스 셀룰롤리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus), 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스(Methanothermobacter thermautotrophicus), 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 및 써모데술파타토르 인디쿠스(Thermodesulfatator indicus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus), 및 박테로이데스 프라길루스(Bacteroides fragilus) 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제가 알룰로스 6-포스페이트에 특이적인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 중 적어도 1개가 열안정성이거나 또는 효소 중 적어도 2개가 열안정성인 방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 글리코겐을 α-아밀라제 및 탈분지화 효소로 전처리하여 탈분지화된 말토덱스트린을 생산하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 탈분지화 효소가 이소아밀라제 및 풀루라나제로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 이소아밀라제가 술폴로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 메탈로스파에라 하코넨시스(Metallosphaera hakonensis), 스파에로박터 써모필레스(Sphaerobacter thermophiles), 및 바실루스 렌투스(Bacillus lentus) 이소아밀라제로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 풀루라나제가 페르비도박테리움 펜니보란스(Fervidobacterium pennivorans), 써모토가(Thermotoga) 종 RQ5, 바실루스 플라보칼다리우스(Bacillus flavocaldarius), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 및 코스모토가 올레아리아(Kosmotoga olearia) 풀루라나제로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 열안정성 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
    (b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
    (d) 열-불활성화된 용해물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 전분 또는 글리코겐을 α-아밀라제 및 탈분지화 효소로 전처리하여 탈분지화된 말토덱스트린을 생산하는 것인 무세포 방법.
  17. 제15항에 있어서, 전분 또는 글리코겐을 α-아밀라제로 전처리하여 분지화된 말토덱스트린을 생산하고, 탈분지화 효소를 단계 (d)에 첨가하는 것인 무세포 방법.
  18. 제15항에 있어서, 탈분지화 효소를 단계 (d)에 첨가하는 것인 무세포 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 탈분지화 효소가 이소아밀라제 및 풀루라나제로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  20. 제19항에 있어서, 이소아밀라제가 술폴로부스 토코다이이, 메탈로스파에라 하코넨시스, 스파에로박터 써모필레스, 및 바실루스 렌투스 이소아밀라제로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 풀루라나제가 페르비도박테리움 펜니보란스, 써모토가 종 RQ5, 바실루스 플라보칼다리우스, 써모시포 아프리카누스, 및 코스모토가 올레아리아 풀루라나제로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  22. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
    (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
    (e) 반응 혼합물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  23. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 임의적으로, 단계 (b)의 세포 용해물 중 1개 이상을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
    (d) 단계 (b) 및 (c)의 세포 용해물을 조합하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계; 및
    (e) 세포 용해물 혼합물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  24. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 α-글루칸 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
    (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
    (e) 열-불활성화된 용해물에 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
    (f) 반응 혼합물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  25. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 임의적으로, 단계 (b)의 세포 용해물 중 1개 이상을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
    (d) 단계 (b) 및 (c)의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
    (e) 세포 용해물 혼합물에 α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
    (f) 반응 혼합물을 전분, 글리코겐, 또는 그의 임의의 부분적으로 가수분해된 유도체 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, α-글루칸 포스포릴라제(들)가 아퀴펙스 아에올리쿠스, 써모크리니스 미네르바에, 써모술피디박터 타카이이, 써모술푸리모나스 디스뮤탄스, 써모코쿠스 리토랄리스, 팔라에오코쿠스 파시피쿠스, 써모토가 네아폴리타나, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 피로코쿠스 아비시, 써모코쿠스 티오레두센스, 데이노코쿠스 라디오두란스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 써무스 칼도필루스, 메이오써무스 실바누스, 오세아니써무스 프로푼두스, 아르덴티카테나 마리티마, 써모코쿠스 바로필루스, 슈도써모토가 써마룸, 히드로게노박터 써모필루스, 써무스 오시마이, 메이오써무스 루베르, 및 마리니토가 피에조필라 α-글루칸 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글루코뮤타제(들)가 써모코쿠스 코다카라엔시스, 피로코쿠스 쿠쿨카니이, 암모니펙스 데겐시이, 메타노써모박터 울페이이, 메타노써무스 페르비두스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 아르카에오글로부스 풀기두스, 페로글로부스 플라시두스, 게오글로부스 아한가리, 아르카에오글로부스 베네피쿠스, 아르카에오글로부스 술파티칼리두스, 아시둘리프로푼둠 부니에, 클로스트리디움 써모셀룸, 데플루비이탈레아 파피필라, 카미니셀라 스포로게네스, 칼로라나에로박터 페리레두센스, 써모시포 말라네시엔시스, 페르비도박테리움 펜니보란스, 심비오박테리움 써모필룸, 스피로카에타 써모필라, 및 써모아나에로박터 위에겔리이 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글루코이소머라제(들)가 써무스 써모필루스, 메이오써무스 티미두스, 써무스 필리포르미스, 마리니써무스 히드로써말리스, 써모시포 아프리카누스, 술프리히드로게니비움 아조렌세, 페르세포넬라 마리나, 마리니토가 피에조필라, 코스모토가 올레아리아, 써모토가 마리티마, 게오바실루스 스테아로써모필루스, 아녹시바실루스 플라비써무스, 써모술피디박터 타카이이, 페르비도박테리움 노도숨, 클로스트리디움 써모셀룸, 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 메타노코쿠스 잔나쉬이, 메타노토리스 이그네우스, 메타노칼도코쿠스 빌로수스, 메타노써모코쿠스 오키나웬시스, 슈도써모토가 써마룸, 데페리박터 데술푸리칸스, 및 써모비브리오 암모니피칸스 포스포글루코이소머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제(들)가 써모박테리움 써모사카롤리티쿰, 써모아나에로박터 브로키이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 데페리박터 데술푸리칸스, 써모크리니스 루베르, 히드로게니비르가 종 128-5-R1-1, 브레비바실루스 써모루베르, 써모시포 아틀란티쿠스, 및 써모술피디박터 타카이이 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제(들)가 써모아나에로박터 위에겔리이, 써모아나에로박터 에타놀리쿠스, 써무스 이슬란디쿠스, 데이노코쿠스 게오써말리스 DSM 11300, 써모스파에라 아그레간스, 크레나르카에오타 아르카에온, 피로코쿠스 호리코시이 Ot3, 아퀴펙스 아에올리쿠스, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 아시도써무스 셀룰롤리티쿠스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스, 써모비피다 푸스카, 써모토가 네아폴리타나, 페트로토가 모빌리스, 및 써모데술파타토르 인디쿠스, 써무스 써모필루스, 박테로이데스 불가투스, 및 박테로이데스 프라길루스 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 글리코겐을 α-아밀라제 및 탈분지화 효소로 전처리하여 탈분지화된 말토덱스트린을 생산하는 것인 무세포 방법.
  32. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 글리코겐을 α-아밀라제로 전처리하여 분지화된 말토덱스트린을 생산하고, 반응 혼합물을 탈분지화 효소의 존재 하에 인큐베이션하는 것인 무세포 방법.
  33. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물을 탈분지화 효소의 존재 하에 인큐베이션하는 것인 무세포 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 탈분지화 효소가 이소아밀라제 및 풀루라나제로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  35. 제34항에 있어서, 이소아밀라제가 술폴로부스 토코다이이, 메탈로스파에라 하코넨시스, 스파에로박터 써모필레스, 및 바실루스 렌투스 이소아밀라제로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 풀루라나제가 페르비도박테리움 펜니보란스, 써모토가 종 RQ5, 바실루스 플라보칼다리우스, 써모시포 아프리카누스, 및 코스모토가 올레아리아 풀루라나제로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  37. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 박테리아 세포를 포함하는 것인 방법.
  38. 제15항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 효모 세포를 포함하는 것인 방법.
  39. 제15항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 중 적어도 1개가 세포에 대해 이종성인 방법.
  40. 제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 단계 (b)가 배양된 세포를 기계적으로, 화학적으로, 효소적으로, 삼투압적으로, 또는 열적으로 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제15항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 가열 단계 (c) 또는 (d)가 세포 용해물을 적어도 50℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.
  42. 제15항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 전분이 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴 둘 다를 포함하는 것인 방법.
  43. 제15항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제 및/또는 탈분지화 효소 중 2개 이상의 효소가 단일 융합 단백질, 이중기능적 또는 다중기능적 단백질로서 발현되는 것인 방법.
  44. 제15항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포 용해물.
  45. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제, 및 임의적으로 탈분지화 효소를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
  46. 제45항에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 효모 세포인 조작된 세포.
  47. α-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제, 및 임의적으로 탈분지화 효소를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
  48. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하여, 이러한 효소를 발현하는 배양된 세포를 생산하는 단계;
    (b) 배양된 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 세포 용해물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
    (d) 열-불활성화된 용해물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  49. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
    (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (c)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계; 및
    (e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  50. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 임의적으로, 단계 (b)의 세포 용해물 중 1개 이상을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
    (d) 단계 (b) 및 (c)의 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계; 및
    (e) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  51. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 열안정성 셀로덱스트린 포스포릴라제, 열안정성 포스포글루코뮤타제, 열안정성 포스포글루코이소머라제, 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 열안정성 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하는 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 적어도 2개의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
    (d) 세포 용해물 혼합물을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
    (e) 열-불활성화된 용해물에 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
    (f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  52. 하기 단계를 포함하는, 알룰로스를 생산하기 위한 무세포 방법:
    (a) 각각의 집단의 세포가 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 효소를 발현하도록 조작된 적어도 2개의 세포 집단을 배양하여, 상이한 효소를 발현하는 적어도 2개의 배양된 세포 집단을 생산하며, 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성인 단계;
    (b) 적어도 2개의 배양된 집단의 세포를 용해시켜, 적어도 2개의 세포 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 임의적으로, 단계 (b)의 세포 용해물 중 1개 이상을 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 단계 (a)의 열안정성 효소는 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여, 열-불활성화된 용해물을 생산하는 단계;
    (d) 단계 (b) 및 (c)의 세포 용해물을 조합하여, 세포 용해물 혼합물을 생산하는 단계;
    (e) 세포 용해물 혼합물에 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 정제된 효소를 첨가하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하여, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 반응 혼합물을 생산하는 단계; 및
    (f) 반응 혼합물을 셀로덱스트린 및 무기 포스페이트의 존재 하에 인큐베이션하여, 알룰로스를 생산하는 단계.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 셀로덱스트린 포스포릴라제(들)가 클로스트리디움 써모셀룸, 클로스트리디움 스트라미니솔벤스, 써모토가 RQ2; 이그니스파에라 아그레간스, 써모토가 마리티마, 스피로카에타 써모필라, 칼디셀룰로시룹토르 베시이, 딕티오글로무스 써모필룸, 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 써모시포 아프리카누스, 칼디살리니박터 키리티마티엔시스, 데플루비이탈레아 파피필라, 칼디셀룰로시룹토르 크로노트스키엔시스, 써모코쿠스 시비리쿠스, 및 써모스파에라 아그레간스 셀로덱스트린 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글루코뮤타제(들)가 써모코쿠스 코다카라엔시스, 피로코쿠스 쿠쿨카니이, 암모니펙스 데겐시이, 메타노써모박터 울페이이, 메타노써무스 페르비두스, 술폴로부스 아시도칼다리우스, 아르카에오글로부스 풀기두스, 페로글로부스 플라시두스, 게오글로부스 아한가리, 아르카에오글로부스 베네피쿠스, 아르카에오글로부스 술파티칼리두스, 아시둘리프로푼둠 부니에, 클로스트리디움 써모셀룸, 데플루비이탈레아 파피필라, 카미니셀라 스포로게네스, 칼로라나에로박터 페리레두센스, 써모시포 말라네시엔시스, 페르비도박테리움 펜니보란스, 심비오박테리움 써모필룸, 스피로카에타 써모필라, 및 써모아나에로박터 위에겔리이 포스포글루코뮤타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글루코이소머라제(들)가 써무스 써모필루스, 메이오써무스 티미두스, 써무스 필리포르미스, 마리니써무스 히드로써말리스, 써모시포 아프리카누스, 술프리히드로게니비움 아조렌세, 페르세포넬라 마리나, 마리니토가 피에조필라, 코스모토가 올레아리아, 써모토가 마리티마, 게오바실루스 스테아로써모필루스, 아녹시바실루스 플라비써무스, 써모술피디박터 타카이이, 페르비도박테리움 노도숨, 클로스트리디움 써모셀룸, 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰, 메타노코쿠스 잔나쉬이, 메타노토리스 이그네우스, 메타노칼도코쿠스 빌로수스, 메타노써모코쿠스 오키나웬시스, 슈도써모토가 써마룸, 데페리박터 데술푸리칸스, 및 써모비브리오 암모니피칸스 포스포글루코이소머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제(들)가 써모박테리움 써모사카롤리티쿰, 써모아나에로박터 브로키이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 데페리박터 데술푸리칸스, 써모크리니스 루베르, 히드로게니비르가 종 128-5-R1-1, 브레비바실루스 써모루베르, 써모시포 아틀란티쿠스, 및 써모술피디박터 타카이이 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제(들)가 써모아나에로박터 위에겔리이, 써모아나에로박터 에타놀리쿠스, 써무스 이슬란디쿠스, 데이노코쿠스 게오써말리스 DSM 11300, 써모스파에라 아그레간스, 크레나르카에오타 아르카에온, 피로코쿠스 호리코시이 Ot3, 아퀴펙스 아에올리쿠스, 루미니클로스트리디움 써모셀룸, 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비이, 칼다나에로박터 서브테라네우스, 아시도써무스 셀룰롤리티쿠스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스, 써모비피다 푸스카, 써모토가 네아폴리타나, 페트로토가 모빌리스, 및 써모데술파타토르 인디쿠스, 써무스 써모필루스, 박테로이데스 불가투스, 및 박테로이데스 프라길루스 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 무세포 방법.
  58. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 박테리아 세포를 포함하는 것인 방법.
  59. 제48항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 효모 세포를 포함하는 것인 방법.
  60. 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 중 적어도 1개가 세포에 대해 이종성인 방법.
  61. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 단계 (b)가 배양된 세포를 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  62. 제48항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 가열 단계 (c) 또는 (d)가 세포 용해물을 적어도 50℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 방법.
  63. 제48항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 셀로덱스트린 포스포릴라제가 아밀로스, 아밀로펙틴, 또는 아밀로스 및 아밀로펙틴 둘 다를 포함하는 것인 방법.
  64. 제48항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제 및/또는 및 탈분지화 효소 중 2개 이상의 효소가 단일 융합 단백질, 이중기능적 또는 다중기능적 단백질로서 발현되는 것인 방법.
  65. 제48항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포 용해물.
  66. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하는 조작된 세포.
  67. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인 조작된 세포.
  68. 셀로덱스트린 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코이소머라제, 알룰로스 6-포스페이트 에피머라제, 및 알룰로스 6-포스페이트 포스파타제를 포함하며, 임의적으로 여기서 상기 효소 중 적어도 1개는 열안정성 효소인, 단일 세포 용해물, 적어도 2개의 세포 집단으로부터 수득된 세포 용해물의 혼합물, 또는 반응 혼합물.
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