KR100744479B1 - 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 사이코스 에피머화 효소의 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 상기 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와, 이로부터 대량생산된 단백질을 과당과 반응시켜 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법을 제공한다.

본 발명의 사이코스 생산 방법은 새로운 효소를 이용하는 방법으로 환경친화적이고, 단가가 낮은 기질을 사용하며, 효소의 활성을 장기간 유지시킬 수 있으므로, 타가토스를 대량 생산하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

사이코스 에피머화 효소, 사이코스 생산

Description

사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법{D-Psicose production method by D-psicose epimerase}

도 1은 pH에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 활성도(A)와 온도에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 활성도(B)를 그래프로 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 사이코스 3- 에피머화 효소를 30℃에서 60℃의 온도범위에서 과당과 반응시켜 사이코스 (■)와 과당 (■) 사이에 평형 비율을 나타낸 그래프이고,

도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

본 발명은 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소(D-psicose epimerase, 이하 사이코스 3-에피머화 효소라 한다.)에 의한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.

통상적으로 사이코스(pscicose)는 과당(D-fructose)의 에피머로 과당과 비교할 때 감미의 강도와 종류에 있어서 거의 유사하다. 그러나 과당과 달리 체내 흡수 시 거의 대사되지 않으므로, 열량 기여도가 매우 낮아 다이어트 식품의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 설탕 대체 감미료로 널리 이용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취시 설사를 유발하는 등의 부작용을 일으키는 반면, 사이코스는 그러한 부작용이 없다. 그리고, 인체 내에서 대사가 되지 않아서 거의 칼로리는 제로에 가깝고 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제해서 복부비만을 감소시키는 기능을 가지고 있어 체중 감소에 도움을 주는 감미료로 사용할 수 있다. (Matsuo, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori, and H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237.; Matsuo, T., and K. Izumori. 2004. D-Psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:S127.)

이와 같은 이유로 사이코스는 다이어트 감미료로서 각광받고 있어 식품 산업 분야에 있어서 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다. 이는 사이코스는 천연물질 내에는 당밀처리과정 또는 포도당 이성화 반응과정 중에 매우 소량 존재하고 화학법으로는 합성되지 못하기 때문이다.

따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 과당을 기질로 하여 효소를 이용하여 생산하는 방법이 활발히 연구되고 있는 실정이다.

그러나, 현재까지 연구된 바에 의하면, 사이코스의 수율이 저조하여 제조원가가 상승하는 문제점이 있어왔다.

이에, 본 발명자는 종래 실험에 의해 기능이 특정되지 않고 단순히 염기서열이나 아미노산 서열로 특정된 사이코스 3- 에피머화 효소로부터 기질을 과당으로 하여 고수율의 사이코스를 생산할 수 있는 효소를 선택하고, 이의 특정 효과를 입증함으로써, 효소를 사용하여 고수율로 사이코스를 생산하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이코스 에피머화 효소의 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이코스 에피머화 효소의 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

나아가, 본 발명은 단백질을 과당과 반응시켜 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 현재까지 특성이 규명되지 않은 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 타가토스 3-에피머화 효소 유전자 또는 단백질에 대응되는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 포함한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 타가토스 3- 에피머화 효소를 과발현시켜 효소의 특성을 규명한 결과, 기질특이성이 타가토스보다 사이코스가 높아 사이코스 3-에피머화 효소임을 입증하고, 상기 효소를 사용하여 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로 본 발명에서 사용한 상기 공지 타가토스 3-에피머화 효소의 유전자는 이미 유전자를 알려져 있지만 특성이 규명이 안 된 유전자 생산 균주들인, 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima), 스트렙토마이세스 코엘리콜라 (Streptomyces coelicolor) 메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti), 아그로박테리움 투메패시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 로도피렐루라 발티카 (Rhodopirellula baltica), 피렐루라 (Pirellula sp.), 포토랍더스 루미네센스 서브스페시스 라우몬디 (Photorhabdus luminescens subsp. laumondii), 시노리비움 멜리로티 (Sinorhizobium meliloti)를 사용하였으며, 이중 아그로박테리움 투메패시엔스 ATCC33970 유래의 유전자에서 과발현된 효소(NP_535228; 서열번호 1)만이 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 가지고 있음을 본 발명에서 세계 최초로 입증하였다.

이때, 효소의 특성을 규명하기 위하여, 본 발명은 종래 실험을 통해 전혀 기 능적으로 규명되지 않고 다만 염기서열의 특성만으로 평가되어 명명된 공지의 타가토스 3-에피머화 효소의 유전자를 함유하고 있는 균주로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 타가토스 3- 에피머화 효소를 대량으로 수득한 후, 적절한 발현 벡터에 삽입하여 타가토스 3-에피머화 효소를 포함하는 재조합 벡터를 제조한 다음, 상기 재조합 벡터로 적절한 미생물에 형질전환시킨 균주를 발효 배지에서 배양하여 과발현시킨 효소를 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명의 사이코스 생산 방법은 종래 타가토스 3- 에피머화 효소라 불리우던 사이코스 3-에피머화 효소를 기질인 과당(fructose)과 반응시켜 사이코스를 얻는 공정으로 이루어진다.

또한, 본 발명은 사이코스 생산방법에서 사용되는 사이코스 3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에 국한되는 것이 아니라, 과당을 사이코스로 전환시켜줄 수 있는 것이라면 서열번호 1에서 일부 아미노산이 치환 (substitution), 삽입 (insertion), 소실 (deletion)이 있는 경우에도 사용할 수 있다.

그리고, 본 발명의 사이코스 생산 방법에서 타가토스 3-에피머화 효소유전자를 클로닝할 때 사용되는 발현벡터는, pET-24a(+)를 비롯하여 유전자 재조합에 이용되어 온 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 재조합 벡터로 형질전환시킬 수 있는 균주는, 대장균 BL21(DE3)을 사용하는 것이 바람직하나 유전자 재조합 벡터로 형질전환된 다음 원하는 유전자를 과발현하여 활성이 있는 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 균주를 사용해도 된다.

보다 구체적으로 본 발명에서 미생물 배양은 사이코스 3-에피머화 효소를 얻기 위한 재조합 균주로, 대장균 BL21(DE3)[Escherichia coli BL21(DE3] 균주를 사용하고, 미생물 생산 배지로는 LB를 사용하였고 효소 생산배지로는 글리세롤 10 g/ℓ, 펩톤 1 g/ℓ, 효모 추출물 30 g/ℓ, 이인산칼륨 0.14 g/ℓ, 일인산나트륨 1 g/ℓ로 구성된 배지를 사용하였다. 냉동 보관된 BL(DE21) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 배양하고, 상기 배양액을 발효 배지 5ℓ가 들어있는 7ℓ의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 배양한 다음, 1mM ITPG를 첨가하여 과발현되는 효소의 생산을 유도하고 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃으로 유지하는 것이 사이코스 3-에피머화 효소의 대량생산에 바람직하다.

그리고, 과발현되어 생산된 사이코스 3-에피머화 효소를 정제하기 위하여, 본 발명의 정제된 효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후, 0.85% NaCl에 두 번 세척한 후 라이소자임이 1 mg/ml이 함유된 세포파쇄 완충용액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0)에 세포를 넣어 얼음 안에서 30분간 방치하고, 상기 세포 용액을 프렌치 프레스로 15,000 lb/in²에서 파쇄한 다음, 상기 세포 파쇄물은 13,000× g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 제거하고 상등액은 0.45 μm여과지로 여과하여 정제하는 것이 바람직한 데, 이때 모든 정제과정은 저온실에서 단백질크로마토그라피(FPLC)로 수행하고, 상기 여과액을 pH 8.0인 300 mM 염화나트륨(NaCl)과 10 mM 이미다졸(imidazole)이 함유된 50 mM 인산 완충용액에 평형시킨 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 컬럼에 적용하는 데, 이때 컬럼을 같은 완충용액으로 세척시킨 후 부착된 효소는 같은 완충용액에 10 mM과 200 mM 사이의 일정 기울기 농도의 이미다졸이 포함된 용액을 1 ml/min 속도로 하여 용출(elution)되게 하는 것이 바람직하고, 상기 용출된 활성이 있는 효소의 부분(fraction)은 pH 7.5인 50 mM 피페스(PIPES) 완충용액에 평형시킨 하이프렙(HiPrep 16/60) 탈염 수지 컬럼에 첨가한 후, 첨가된 단백질을 6 ml/min 속도로 하여 씻어 내리게 하고, 모아진 효소용액을 pH 7.5인 0.15 M 염화나트륨이 포함된 50 mM 피페스 완충용액에 평형시킨 세파크릴 에스-100 에치알 (Sephacryl S-100 HR) 컬럼에 넣고 6.6 ml/min 속도로 하여 모아진 효소를 용출하고, 상기 용출된 용액은 최종적으로 50 mM 피페스 완충용액에서 투석하여 수득한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기와 같이 본 발명에 따라 수득한 사이코스 3-에피머화 효소는 분자량이 32,600Da인 단량체이고, 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme)이다.

이때, 사이코스 3 에피머화 효소를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법에서 있어서, 본 발명은 사이코스의 생산수율이 향상되는 금속이온으로 망간, 마그네슘, 철, 코발트 및 알루미늄으로 이루어진 군에서 선택된 금속이온을 0.5∼5mM, 바람직하게는 1mM을 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하다. 이는 0.5mM 미만은 상술한 생산수율의 효과가 미미하고 5mM을 초과하면 초과량에 비하여 효과가 없기 때문이다.

또한, 상기 사이코스 3- 에피머화 효소와 과당과의 반응 조건으로 기질농도는 55∼75%(w/w)의 범위로 pH 7∼8에서 55∼65℃로 반응시키는 것이 사이코스 생산수율에 있어 바람직하다. 이는 과당의 기질 농도가 55∼75%(w/w)범위에서 사이코스 생산수율이 우수하였으며, 사이코스 3-에피머화 효소의 최적 pH와 온도 범위이기 때문이다.

한편, 본 발명의 사이코스 3-에피머화 효소를 과당에 반응시켜 사이코스를 대량으로 생산하기 위한 방법으로, 대량으로 발현된 사이코스 3-에피머화 효소를 담체에 고정화하여 사용하는 게 바람직하다. 이는 담체에 고정된 효소는 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해 주기 때문인 데, 본 발명에서 사용 가능한 담체는 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 담체라면 그 어느 것을 사용해도 무방하며, 이중 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 알긴산나트륨이 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율(yeild)을 나타내는 데 유리하기 때문이다. 그리고, 본 발명에서는 사이코스의 최고 수율을 나타내기 위하여 1.5∼4.0% 농도의 알긴산나트륨, 바람직하게는 2.5%의 알긴산나트륨의 담체에 균주를 고정화하여 사용한다. 이때, 효소를 고정화할 담체로 알긴산나트륨을 사용하는 경우, 효소액의 1∼2 배 부피의 알긴산나트륨 수용액에 효소액을 첨가한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 효소-알지네이트의 결합체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 사이코스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 사이코스 생산 수율을 이전에 비해 현저하게 증가시키므로, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.

그리고, 이와 같은 방법으로 대량 생산된 사이코스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

[실험예]

본 실험예에서는 사이코스 3-에피머화 효소의 분자량을 측정하기 위하여 시남산(cinnamic acid)을 매트릭스(matrix)로 한 말디토프-매스(MALDI-TOF-MS)를 사용하였다.

그리고, 효소활성은 과당을 기질로 측정하였으며, 반응은 1.0%의 과당이 함유된 50 mM 피페스 완충용액에서 pH 7.5와 50℃에서 20분간 반응시킨 후 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 멈추었다. 이때, 과당이 함유된 피페스 완충용액은 과당이 60∼70 %의 농도가 되도록 pH 7∼8의 피페스 완충 용액에 녹여 제조하였고 40℃ ∼60 ℃로 유지되는 생물반응기에 연속적으로 기질 용액이 첨가되도록하였고, 효소활성의 비교분석을 원활하게 하기 위해 효소 1 단위(unit)는 pH 7.5와 50℃에서 분당 1 몰(mole)의 사이코스를 생산하는 양으로 정의하였다.

또한, 과당, 사이코스, 소르보스(D-sorbose), 타가토스(D-tagatose), 자일룰로스(D-xylulose) 및 리불로스(D-ribulose)의 농도는 알아이(RI) 검출기와 비피(BP)-100 칼슘이온 탄수화물 컬럼이 장착된 고압액체크로마토그라피(HPLC)로 측정하였다. 이때, 컬럼은 80℃에서 0.5 ml/min 속도로 증류수를 통과되도록 하였다.

[실시예] 사이코스 3-에피머화 효소의 물리적인 특성

(1) 사이코스 3-에피머화 효소의 대량생산

사이코스 3-에피머화 효소 유전자는 아그로박테리움 투메패시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) ATCC33970의 디앤에이(DNA)를 아그로박테리움 투메패시엔스 C58의 타가토스 3-에피머화 효소 유전자로 제안되었지만 특성이 규명 안 된 유전자의 디앤에이(DNA) 염기서열을 기본으로 프라머(primer)를 도안하여 PCR 증폭하여 대량으로 얻은 다음, 제한효소 XhoI와 NdeI을 사용하여 pET-24a(+)[Novagen]에 삽입하고, 재조합 벡터 pET-24a(+)/psicose 3-epimerase(도 3 참조)를 제조하여, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 그리고, 대량생산을 위한 배양을 하기 전에 액화질소에서 냉동보관 하였다.

그런다음, 사이코스 3-에피머화 효소를 대량생산하기 위하여, 먼저, 냉동 보관된 BL(DE21) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 종균배양을 하고, 상기 종균배양된 배양액을 발효 배지(글리세롤 10 g/ℓ, 펩톤 1 g/ℓ, 효모 추출물 30 g/ℓ, 이인산칼륨 0.14 g/ℓ, 일인산나트륨 1 g/ℓ) 5ℓ가 들어있는 7ℓ의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 본배양하였다. 이때, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM ITPG를 첨가하여 사이코스 3-에피머화 효소의 대량생산을 유도하였다. 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다.

(2) 사이코스 3-에피머화 효소의 정제

사이코스 3-에피머화 효소의 특성을 정확히 파악하기 위해서 어피니티 히스트랩 에이치피(affinity HisTrap HP) 컬럼, 탈염 하이프렙( HiPrep 16/60), 겔여과 세파크릴 에스-100 에치알 (gel filtration Sephacryl S-100 HR) 컬럼을 사용하여 정제하였다.

정제한 효소의 분자량을 측정한 결과 32,600 Da의 단량체임을 알 수 있었으며, 이의 아미노산 서열은 NCBI 등록번호(accession number) NP_535228와 동일함을 확인할 수 있었다.

(3) 사이코스 3 에피머화 효소의 금속 특이성

그리고, 금속염 효과를 조사하기 위해서 효소활성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 이디티에이(EDTA)를 처리하거나 또는 1 mM 금속이온 첨가후 측정하였으며, 이때 반응은 1.0%의 과당과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 피페스 완충용액에서 pH 7.5와 50℃에서 20분간 수행하였고 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 멈추어 측정하였다.

이의 결과, 본 발명의 사이코스 3-에피머화 효소는 망간과 코발트 이온은 효소활성을 크게 증진시켰고 구리와 아연 이온은 활성을 크게 저해하는 등, 금속효소임을 알 수 있었다.

(4) 사이코스 3-에피머화 효소의 기질특이성

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 10 mM의 기질과 0.04 단위/ml의 효소 이 함유된 50 mM 피페스 완충용액에서 pH 7.5와 50℃에서 20분간 수행하였고 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 멈추어 측정하였다.

이의 결과 타가토스에 대한 친화도 보다 사이코스에 대한 친화도가 높아 이 효소는 타가토스 3-에피머화 효소가 아니라 사이코스 3-에피머화 효소인 신규 효소로 규명되었다.

(5) 사이코스 3-에피머화 효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성

본 실시예는 pH 및 온도 변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 기질을 반응시키고, 효소 활성을 비교하고자 하였다. 이때, pH 효과를 조사하기 위해서 반응은 먼저, 1.0%의 과당과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 피페스 완충용액은 pH 6.5에서부터 7.5까지의 범위에서 반응시키고, 1.0%의 과당과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 이피피스(EPPS) 완충용액은 pH 7.5에서부터 8.5까지의 범위에서 반응을 시켰다. 이때, 금속이온을 첨가하지 않은 경우는 50℃에서, Mn이온을 첨가한 경우는 60℃에서 각각 20분간 반응을 시켰다. 그런 다음, 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 종료하고, 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다.

그리고, 온도 효과를 조사하기 위해서 반응은 온도 30℃에서 70℃까지 1.0%의 과당과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 피페스 완충용액을 금속이온을 첨가하지 않은 경우는 pH 7.5에서, Mn이온을 첨가한 경우는 pH 7.0에서 각각 20분간 반응을 시켰으며, 이때 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 종료하고 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 1(B)에 나타내었다.

이의 결과, 금속이온을 첨가하지 않은 경우 최적 pH와 온도는 각각 7.5와 50℃이었고 Mn²⁺이온을 첨가한 경우는 최적 pH와 온도는 각각 7.0과 60℃이었다.

이때, 도 1에서 pH에 따라 사이코스 3-에피머화 효소의 활성도를 나타낸 그래프(A)에서 ○는 금속이온 무첨가 피페스 완충용액을 나타낸 것이고, ●는 Mn²⁺ 첨가 피페스 완충용액을 나타내고, □는 금속이온 무첨가 이피피에스 완충용액을, ■는 Mn²⁺ 첨가 이피피에스 완충용액을 나타낸 선이다.

또한, 도 1의 (B)는 온도에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 활성도를 나타낸 것으로, ○는 금속이온 무첨가를, ●는 1.0 mM Mn²⁺ 첨가를 나타낸 것이다.

(6) 사이코스 3-에피머화 효소에 의한 사이코스와 과당의 평형

본 실시예에서는 사이코스와 과당의 평형을 구하기 위하여 반응을 0.1% 사이코스와 과당의 총당, 1 mM Mn이온과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 피페스 완충용액에서 pH 7.0, 온도 30℃에서 60℃까지 변화를 주어 각각 24시간 동안 충분히 반응이 되도록 하였다. 그리고, 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 종료한 다음. 이들의 효소 활성을 측정하였다.

이때, 도 2는 본 발명의 사이코스 3- 에피머화 효소를 30℃에서 60℃의 온도범위에서 과당과 반응시켜 사이코스 (■)와 과당 (■) 사이에 평형 비율을 나타낸 그래프이다.

이의 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 사이코스와 과당의 비율은 0:100, 25:75, 50:50, 75:25, 100:0의 5가지 초기 비율로 하여 24시간 후 최종 비율의 평균으로 평형을 구하였다. 그림 3에 나타난 것 같이 사이코스와 과당의 비율이 30℃에서 32:68 이었고 60℃에서 37:63 으로 나타났다. 이는 종래 사이코스를 생산하는 생산방법의 약 20%의 수율보다 매우 우수함을 알 수 있었다.

(7) 사이코스 3-에피머화 효소에 의한 사이코스 생산

본 발명의 고농도의 사이코스의 생산을 위하여 700 g/ℓ 과당, 1 mM Mn²⁺이온과 14 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 피페스 완충용액에서 pH 7.0, 온도 60℃에서 120분간 반응을 수행하였다. 그런다음, 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 종효하고, 효소의 활성을 측정하였다. 반응시간에 따른 사이코스 생산량은 하기 표 3에 나타내었다.

이의 결과, 배양시간 120 min에 211 g/ℓ의 사이코스가 생산되었고 이것은 전환수율 30.2%에 해당되는 것이다.

(8) 고정화 효소에 사이코스 생산 방법의 비교

사이코스 생산 방법의 효율성을 비교하기 위해 사이코스 3-에피머화 효소를 고정화시켜 생성 수율을 비교하고자 하였다.

이때, 담체에 고정된 고정화 효소로는 효소액을 상기 효소액 부피의 1.5배인 2.5% 농도의 알긴산나트륨 용액에 첨가한 다음, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 효소-알지네이트가 결합되어 생성된 비드를 사용하였다.

그리고, 상기 효소를 고정화시키는 단계를 제외하고 모든 과정을 실시예 (7)과 동일하게 수행하였다. 이때 사용한 효소량은 140단위이었으며, 10 ml에서 반응시켜 사이코스 생성량을 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

이의 결과, 상기 실시예 (7)의 자유효소는 배양시간 120 min에 211 g/ℓ로 최대 전환을 하였으나, 고정화 효소의 경우 생산속도는 자유효소보다 떨어졌으나 열안정성이 증가되어 시간이 경과 할수록 농도가 증가하여 360분에서 245 g/ℓ의 사이코스가 생산되었고, 이는 전환수율 35%에 해당되는 것이다.

(9) 생물 반응기를 이용한 사이코스의 생성 수율 확인

상기 실시예 (8)의 고정화 효소의 사이코스의 생성 수율을 확인하고자 생물 반응기에서 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 (8)과 동일한 방법으로, 고정화된 효소와 기질을 준비한 후, 고정화 효소에 기질을 첨가하여 부피를 100 ml로 만들었다. 그런다음, 높이와 직경이 각각 100cm, 26cm인 생물반응기(Pharmacia Biotech., XK 26, UK)에 효소와 기질의 혼합액을 충전한 후, 유속 10㎖/h, 60℃의 조건 하에서 반응을 시켰다. 이때 사용한 효소량은 500 단위이였으며, 사용한 과당의 농도는 장기간 사용시 고농도 과당의 석출 문제로 600 g/ℓ로 한정하여 사용하였고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

이의 결과, 효소와 기질의 반응은 30일간의 실험기간 내내 안정하였고, 생산성은 21g/ℓ/h, 과당으로부터 사이코스로의 전환율은 35%, 생산농도는 210g/ℓ이었다. 이러한 수율은 당류의 대량 생산에서 매우 우수한 수치이다.

따라서, 본 발명의 사이코스 생산 방법에서는 생물 반응기를 이용함으로써, 산업 분야에서 사이코스를 대량 생산할 수 있는 체계를 제공할 수 있게 되었다.

이상과 같이, 본 발명에 따른 사이코스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 종래 사이코스 생산과 비교하여 기질에 있어서는 단가가 낮은 기질을 사용하고, 수율에 있어서는 현저하게 높기 때문에 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 사이코스 생산 방법은 사이코스를 대량 생산해야 하는 산업 분야에 응용되어, 기능성 식품 및 의약품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 과당을 사이코스로 전환시키기 위해 사용되는 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항의 조성물을 과당과 반응시켜 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법.
5. 삭제
6. 제 4 항에 있어서,

   상기 반응에 망간, 마그네슘, 철, 코발트 및 알루미늄으로 이루어진 군에서 선택된 금속이온을 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법.
7. 제 4 항에 있어서,

   상기 반응의 기질농도는 55∼75%(w/w)인 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법.
8. 제 4 항에 있어서,

   상기 반응은 pH 7∼8에서 55∼65℃로 반응시키는 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법.
9. 제 4 항에 있어서,

   상기 조성물을 담체에 고정화하여 과당과 반응시키는 것을 특징으로 하는 사이코스 생산방법.

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