JP5424531B2 - ジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法 - Google Patents
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Description
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
しかし、タンパク質分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルt−RNA合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。NRPSは、その反応にアデノシン−5’−三リン酸(以下、ATPと略す)を必要とするため、大量のATPを反応系に添加する必要であり製造効率が悪い。
J.Biol.Chem.,119,707−720(1937)
(1)i)リン酸供与体、ii)アデノシン−5’−一リン酸(以下、AMPと略す)、アデノシン−5’−二リン酸(以下、ADPと略す)およびアデノシン−5’−三リン酸(以下、ATPと略す)からなる群より選ばれる物質、iii)ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、iv)ATP依存的に1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、およびv)1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体[以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)という]を生成、蓄積させ、該水性媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法。
[1]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質
[4]配列番号27で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質
[5]配列番号47または48で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[6]配列番号47または48で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質
[7]配列番号47または48で表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質
[8]非リボソームペプチドシンセターゼ(以下、NRPSと称す)活性を有する蛋白質
(4) ATP依存的にアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する細胞が以下の[1]〜[6]から選ばれるDNAを有する細胞である、上記(1)〜(3)のいずれか1つの製造法。
[1]配列番号14〜26および46のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号14〜26および46のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号28で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号49または50で表される塩基配列を有するDNA
[5]配列番号49または50で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[6]NRPS活性を有する蛋白質をコードするDNA
(5) ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質が以下の[1]〜[3]から選ばれる蛋白質である、上記(1)〜(4)のいずれか1つの製造法。
[1]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質
[3]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質
(6) ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する細胞が以下の[1]または[2]記載のDNAを有する細胞である、上記(1)〜(5)のいずれか1つの製造法。
[1]配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(7) アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(I)
R1aおよびR1bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR1aおよびR1bのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR2aおよびR2bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R2aおよびR2bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR1aR1bNに隣接する炭素原子上のR2aおよびR2bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにR1a及びR1bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n1が2または3である場合、2つまたは3つのR2aおよび2つまたは3つのR2bはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)または式(II)
R3aおよびR3bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR4HNに隣接する炭素原子上のR3aおよびR3bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびR4と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n2が2または3である場合、2つまたは3つのR3aおよび2つまたは3つのR3bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R4は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR4が隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR3aおよびR3bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R5はアミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノ、ジ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノまたは脂環式複素環基を表す]で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体[但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(I)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体のみであるとき、R1a及びR1bの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(II)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体のみであるとき、R5はヒドロキシである]である上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
R2cおよびR2dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アルキルを表す)または式(IV)
R5は前記と同義である)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体[但し、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(III)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体のみであるとき、R1c及びR1dの少なくとも一方は水素原子であり、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が式(IV)で表されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体のみであるとき、R5はヒドロキシである]である上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
(10)アミノ酸またはアミノ酸誘導体がL−アミノ酸、グリシンおよびβ−アラニンからなる群より選ばれるアミノ酸またはその誘導体である上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
R6aおよびR6bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR6aおよびR6bのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR7aおよびR7bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R7aおよびR7bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR6aR6bNに隣接する炭素原子上のR7aおよびR7bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにR6aおよびR6bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n3aが2または3である場合、2つまたは3つのR7aおよび2つまたは3つのR7bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R8aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR8aが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつR9aおよびR9bと結合する炭素原子ならびに該炭素原子上のR9aおよびR9bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9aおよびR9bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR8aNに隣接する炭素原子上のR9aおよびR9bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびR8aと一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n4aが2または3である場合、2つまたは3つのR9aおよび2つまたは3つのR9bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R10aはアミノ、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、モノ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノ、ジ(置換もしくは非置換の低級アルキル)アミノまたは脂環式複素環基を表す]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(7)のいずれか1つの製造法。
R6AおよびR6Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR6AおよびR6Bのいずれか一方が、隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接する炭素原子ならびに該炭素原子上のR7AおよびR7Bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R7AおよびR7Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR6AR6BNに隣接する炭素原子上のR7AおよびR7Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子ならびにR6AおよびR6Bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n3Aが2または3である場合、2つまたは3つのR7Aおよび2つまたは3つのR7Bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R8Aは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノイル、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のアロイルを表すか、またはR8Aが隣接する窒素原子、該窒素原子に隣接し、かつR9AおよびR9Bと結合する炭素原子ならびに該炭素原子上のR9AおよびR9Bのいずれか一方と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、
R9AおよびR9Bは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはR8ANに隣接する炭素原子上のR9AおよびR9Bのいずれか一方が、隣接する炭素原子、該炭素原子に隣接する窒素原子およびR8Aと一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成してもよく、n4Aが2または3である場合、2つまたは3つのR9Aおよび2つまたは3つのR9Bはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、
R10Aは前記R10aと同義である]で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(2)〜(7)のいずれか1つの製造法。
R7cおよびR7dは同一または異なって水素原子または置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、
R9cおよびR9dは同一または異なって水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表し、
R10aは前記と同義である)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(8)のいずれか1つの製造法。
R10Aは前記と同義である)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(2)〜(8)のいずれか1つの製造法。
(16)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)が式(IXa)
R9eは置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す)で表されるジペプチドまたはジペプチド誘導体である上記(1)〜(9)のいずれか1つの製造法。
(17)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)が式(IXb)
(18)ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)あるいはジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)が、L−アミノ酸、グリシン、およびβ−アラニン、ならびにそれらの誘導体から選ばれる同一または異なるアミノ酸またはアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチドまたはジペプチド誘導体である、上記(1)〜(10)のいずれか1つの製造法。
(21)微生物が原核生物である上記(20)の製造法。
(22)原核生物が、1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取り込み蛋白質ともいう)の活性が低下または喪失した微生物である上記(21)の製造法。
(24)ペプチダーゼが、配列番号55〜58のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号55〜58のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である上記(22)または(23)の製造法。
(26)原核生物が、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物である上記(21)〜(25)のいずれか1つの製造法。
(30)配列番号9〜13で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(31)配列番号22〜26で表される塩基配列を有するDNA。
(32)上記(31)のDNAとベクターDNAを連結して得られる組換え体DNA。
(34)上記(33)の細胞を培地に培養し、培養物中に上記(30)の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する該蛋白質の製造法。
Ptrp:トリプトファンプロモーター遺伝子
PT5:T5プロモーター
Ampr:アンピシリン耐性遺伝子
lacI q:ラクトースリプレッサー遺伝子
albC:albC遺伝子またはalbC類似遺伝子
本発明に用いられるATP依存的に1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質(以下、ジペプチド生成活性を有する蛋白質と略すこともある)は、該活性を有する蛋白質であれば、その由来、調製方法等はいずれでもよく、例えば以下の[1]〜[8]記載の蛋白質、
[1]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[3]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[4]配列番号27で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[5]配列番号47または48で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[6]配列番号47または48で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、
[7]配列番号47または48で表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質、および
[8]非リボソームペプチドシンセターゼ(NRPS)活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
上記において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Thrid Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)(以下、モレキュラー・クローニング第3版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987−1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号1〜13、47、48および53のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
配列番号1〜13、47、48および53のいずれかで表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−アルギニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどがあげられる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、配列番号1〜13、47、48および53のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、ジペプチド生成活性を有するためには、配列番号1〜13、47、48および53のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号1、47または53のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が65%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有していることが望ましい。
配列番号27で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつジペプチド生成活性を有する蛋白質もまた本発明に用いられる蛋白質である。
本発明で用いられる蛋白質が、ジペプチド生成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばDNA組換え法を用いて本発明に用いられる蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明で用いられる蛋白質を製造した後、該蛋白質、1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体が生成、蓄積するか否かをHPLC等により分析する方法をあげることができる。
2.本発明に用いられるポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質
本発明に用いられるポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質は、該活性を有する蛋白質であればその由来、調製方法などは問わないが、下記の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質、
[1]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質、および
[3]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
3.本発明に用いられる1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
本発明に用いられる1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA(以下、ジペプチド生成活性を有する蛋白質をコードするDNAと略す)としては、以下の[1]〜[6]に記載のDNA、
[1]配列番号14〜26および46のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号14〜26および46のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号28で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号49または50で表される塩基配列を有するDNA
[5]配列番号49または50で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつATP依存的にアミノ酸およびアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、および
[6]NRPS活性を有する蛋白質をコードするDNA、
などをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとは、配列番号14〜26、28、46、49、50および54のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0mol/l、好ましくは0.9mol/lの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度、好ましくは0.1倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol/l塩化ナトリウム、15mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第3版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、上記したBLASTおよびFASTA等を用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号14〜26、28、46、49、50および54のいずれかで表される塩基配列と少なくとも75%以上、好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
4.本発明に用いられるポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
本発明に用いられるポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAとしては、以下の[1]および[2]に記載のDNA、
[1]配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列を有するDNA、および
[2]配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA、
などをあげることができる。
配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、例えば上記したように、組換えDNA法を用いて該DNAにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
5.本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、配列番号9〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
6.本発明のDNAとしては、配列番号22〜26で表される塩基配列を有するDNAなどをあげることができる。
7.ATP依存的に1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA、およびポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAの調製
ジペプチド生成活性を有するDNAは、配列番号14〜26、46、49、50および54のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、例えばバチルス(Bacillus)属またはストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号14〜26、46、49、50および54のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、バチルス属またはストレプトマイセス属に属する微生物の染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols,Academic Press(1990)]により取得することができ、ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAは、配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列を有するDNAに基づき設計することができるプローブを用いたエシェリヒア属、ロドバクター(Rhodobacter)属、クロロフレックス属(Chloroflexus)、メソリゾビウム属(Mesorhizobium)、ストレプトマイセス属、シュードモナス(Pseudomonus)属またはシノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属する微生物などの染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、エシェリヒア属、ロドバクター属、クロロフレックス属、メソリゾビウム属、ストレプトマイセス属、シュードモナス属またはシノリゾビウム属に属する微生物などの染色体DNAを鋳型としたPCRにより取得することができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)XL1−Blue、エシェリヒア・コリXL2−Blue、エシェリヒア・コリDH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリKY3276、エシェリヒア・コリW1485、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリNo.49、エシェリヒア・コリW3110、エシェリヒア・コリNY49、エシェリヒア・コリMP347、エシェリヒア・コリNM522、エシェリヒア・コリME8415等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるDNAを保有する微生物としては、例えば配列番号14で表される塩基配列を有するDNAを含有する組換え体DNAを保有する微生物であるエシェリヒア・コリNM522/pPE43、配列番号122で表される塩基配列を有するDNAを含有する組換え体DNAを保有するエシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)/pPK−Ec1をあげることができる。
8.本発明に用いられる細胞の調製
(1)本発明に用いられる細胞としては、ジペプチド生成活性を有する蛋白質を生産する能力を有する細胞、ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する細胞、およびジペプチド生成活性を有する蛋白質とポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質の両方の蛋白質を生産する能力を有する細胞をあげることができる。
上記3および4のDNAをもとにして、必要に応じて、本発明で用いられる蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した細胞を取得することができる。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、原核生物および酵母等の微生物の細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、好ましくは微生物、より好ましくは原核生物、さらに好ましくは細菌をあげることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明に用いられるDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNAまたは本発明の製造法に用いられるDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
本発明に用いられるDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア(Serratia)属、バチルス属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、シュードモナス属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、アナベナ(Anabena)属、アナシスティス(Anacystis)属、アスロバクター(Arthrobacter)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、クロマチウム(Chromatium)属、エルビニア(Erwinia)属、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属、フォルミディウム(Phormidium)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、ロドスピリウム(Rhodospirillum)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、ストレプトマイセス属、シネコッカス(Synechoccus)属、ザイモモナス(Zymomonas)属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1−Blue、エシェリヒア・コリXL2−Blue、エシェリヒア・コリDH1、エシェリヒア・コリDH5α、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリKY3276、エシェリヒア・コリW1485、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリNo.49、エシェリヒア・コリW3110、エシェリヒア・コリNY49、エシェリヒア・コリMP347、エシェリヒア・コリNM522、バチルス・サチリスATCC33712、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)FERM BP−6030、バチルス・アミロリケファスエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクレリウム・エフィシェンス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、セラチア・フィカリア(Serratia ficaria)、セラチア・フォンチコラ(Serratia fonticola)、セラチア・リケファシエンス(Serratia liquefaciens)セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)D−0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)、アグロバクテリウム・リゾジーンズ(Agrobacterium rhizogenes)、アグロバクテリウム・ルビ(Agrobacterium rubi)、アナベナ・シリンドリカ(Anabaena cylindrica)、アナベナ・ドリオルム(Anabaena doliolum)、アナベナ・フロスアクア(Anabaena flos−aquae)、アースロバクター・オーレッセンス(Arthrobacter aurescens)、アースロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アースロバクター・グロブフォルミス(Arthrobacter globformis)、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、アースロバクター・ミソレンス(Arthrobacter mysorens)、アースロバクター・ニコチアナ(Arthrobacter nicotianae)、アースロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)、アースロバクター・プロトフォルミエ(Arthrobacter protophormiae)、アースロバクター・ロセオパラフィナス(Arthrobacter roseoparaffinus)、アースロバクター・スルフレウス(Arthrobacter sulfureus)、アースロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)、クロマチウム・ブデリ(Chromatium buderi)、クロマチウム・テピダム(Chromatium tepidum)、クロマチウム・ビノサム(Chromatium vinosum)、クロマチウム・ワーミンギ(Chromatium warmingii)、クロマチウム・フルビアタティレ(Chromatium fluviatile)、エルビニア・ウレドバラ(Erwinia ure dovora)、エルビニア・カロトバラ(Erwinia carotovora)、エルビニア・アナス(Erwinia ananas)、エルビニア・ヘリコラ(Erwinia herbicola)、エルビニア・パンクタタ(Erwinia punctata)、エルビニア・テレウス(Erwinia terreus)、メチロバクテリウム・ロデシアナム(Methylobacterium rhodesianum)、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス(Methylobacterium extorquens)、フォルミディウム・エスピー(Phormidium sp.)ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス(Rhodobacter capsulatus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドシュードモナス・ブラスチカ(Rhodopseudomonas blastica)、ロドシュードモナス・マリナ(Rhodopseudomonas marina)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドスピリウム・リブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドスピリウム・サレキシゲンス(Rhodospirillum salexigens)、ロドスピリウム・サリナラム(Rhodospirillum salinarum)、ストレプトマイセス・アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens)、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス(Streptomyces aureofaciens)、ストレプトマイセス・アウレウス(Streptomyces aureus)、ストレプトマイセス・フンジシディカス(Streptomyces fungicidicus)、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス(Streptomyces griseochromogenes)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・オリボグリセウス(Streptomyces olivogriseus)、ストレプトマイセス・ラメウス(Streptomyces rameus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・ビナセウス(Streptomyces vinaceus)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を用いることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、シワニオマイミセス(Schwanniomyces)属、ピチア(Pichia)属、またはキャンディダ(Candida)属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulans)、シワニオマイセス・アルビウス(Schwanniomyces alluvius)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、キャンディダ・ウティリス(Candida utilis)等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社より市販)、pAGE107(特開平3−22979)、pAS3−3(特開平2−227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(インビトロジェン社製)、pREP4(インビトロジェン社製)、pAGE103[J.Biochem,101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL−1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL−1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS−1、COS−7等をあげることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(いずれもインビトロジェン社製)等をあげることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413(1987)]等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いる方法(特開昭59−140885、特開昭60−70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法(特開昭60−251887)、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(特許第2606856、特許第2517813)等をあげることができる。
(2)本発明の製造法に用いられる微生物としては、上記(1)の方法により調製される微生物において、1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取込み蛋白質と略す)の活性が低下または喪失している微生物、または3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
上記ペプチダーゼとしては、ペプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、より好ましくはジペプチダーゼをあげることができる。
微生物のペプチド取り込み活性は、基質となるペプチドと微生物菌体とを水性媒体中に共存せしめ、ペプチド取り込み反応を行った後、水性媒体中に残存しているペプチド量を公知の方法、例えばHPLCなどを用いた分析法によって定量することにより測定することができる。
3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、任意の3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができ、好ましくは3種以上9種以下、より好ましくは3種以上6種以下、さらに好ましくは3種または4種のペプチダーゼの活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す微生物の染色体DNAのペプチダーゼ遺伝子やペプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖DNAを用いた方法をあげることができる。
相同組換えに用いられるDNAとしては、
(a)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖DNA、
(b)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAが直接連結している直鎖DNA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを有する直鎖DNA、および
(d)上記(a)の直鎖DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と欠損等の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)〕が認識する塩基配列を有するDNA、
をあげることができる。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号64で表される塩基配列を有するDNA、および該DNAにおいて1個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するDNAをあげることができる。
上記直鎖DNA断片は、PCRにより作製することができる。また上記直鎖DNAを含むDNAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖DNAを得ることもできる。
方法1:上記(a)または(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法2:上記方法1により取得された形質転換株に、上記(b)の直鎖DNAを導入し、該方法により染色体DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法3:
[1]上記(c)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを、染色体DNA上における方向と同一の方向で連結したDNAを合成し、上記[1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記[2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体DNA上から削除された株として選択する方法。
方法4:
[1]上記(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記[1]で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記[1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体DNA上の位置の異なる2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
9.本発明の蛋白質および本発明に用いられる蛋白質の調製
本発明の蛋白質および本発明に用いられる蛋白質(以下、本発明に用いられる蛋白質という)は、上記8の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明に用いられる蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM−FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf−900 II SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社製)、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace’s Insect Medium[Nature,195,788(1962)]等を用いることができる。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明で用いられる蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、および生産させる蛋白質の構造を変えることにより上記方法を選択することができる。
また、特開平2−227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明に用いられる蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体の場合は、例えば、本発明に用いられるDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明に用いられる蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク(特開昭63−309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
例えば、本発明に用いられる蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明に用いられる蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。
10.本発明のジペプチドおよびジペプチド誘導体の製造法
本発明の製造法としては、(1)i)リン酸供与体、ii)AMP、ADPおよびATPからなる群より選ばれる物質、iii)ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、iv)ATP依存的に1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、およびv)1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、該水性媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)の製造法、および(2)i)リン酸供与体、ii)AMP、ADPおよびATPからなる群より選ばれる物質、iii)ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、iv)ATP依存的に1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からジペプチドまたはジペプチド誘導体を生成する活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、およびv)1種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を生成、蓄積させ、そのまま、または該水性媒体から該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を採取した後、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)を修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体[以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)と称す]を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法をあげることができる。
上記アミノ酸またはアミノ酸誘導体としては、式(I)
上記製造法で製造されるペプチドまたはジペプチド誘導体(PI)としては式(VIIa)
上記製造法で製造されるジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)としては式(VIIb)
低級アルキニルとしては、例えば炭素原子数2から10の直鎖または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、より具体的にはエチニル、2−プロピニル、3−ブチニル、4−ペンチニル、5−ヘキシニル、9−デシニル等があげられる。
脂環式複素環基としては、例えば単環性または2つ以上の環が縮合した縮環性の脂環式複素環基があげられ、脂環式複素環基に含まれるヘテロ原子の種類及び個数は特に限定されないが、例えば窒素原子、硫黄原子及び酸素原子からなる群から選ばれるヘテロ原子を1または2個以上含んでいてもよく、より具体的には、例えばピロリジニル、2,5−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、1,2−ジヒドロピリジル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラゾリニル、オキサゾリニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノキサリニル、オクタヒドロキノリル、ジヒドロインドリル、1,3−ジオキソイソインドリニル等があげられる。
隣接する窒素原子および該窒素原子に隣接する炭素原子と一緒になって形成される複素環基、ならびに隣接する炭素原子および該炭素原子に隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも1個の窒素原子を含む5員または6員の単環性脂環式複素環基(該単環性脂環式複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい)、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で少なくとも1個の窒素原子を含む縮環性複素環基(該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい)等があげられ、より具体的にはピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル等があげられる。
上記製造法に用いられるAMP、ADPおよびATPからなる群より選ばれる物質は、ATP消費反応(ジペプチドまたはジペプチド誘導体の生成反応)とATP再生反応(ポリリン酸キナーゼによるATP生成反応)との共役反応が開始する濃度であればいかなる濃度であってもよく、通常は0.1mmol〜100mol/L、好ましくは1mmol〜10mol/L、より好ましくは2mmol〜5mol/Lの濃度で用いる。
上記製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドまたはジペプチド誘導体の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
実験例1 データベースを利用したジペプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス・サチリス168株由来のD−Ala−D−Alaリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列[Nature,390,249−256(1997)]をクエリーとして、バチルス・サチリス168株のゲノムDNAのデータベースであるSubtilist(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)のホモロジー検索機能を用いて、バチルス・サチリス168株のゲノムDNA配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
実験例2 ywfE遺伝子発現株の造成
実験例1で得られた塩基配列情報に従い、バチルス・サチリスのywfE遺伝子断片を以下のようにして取得した。
上記で得られたywfEを含む1.4kb断片、trpプロモーター領域を含む0.3kb断片および4.5kbの断片をライゲーションキット(タカラバイオ社製)を用いて、16℃で16時間反応させ連結した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にywfEが連結された発現ベクターであるpPE43が取得されていることを確認した(図1)。
実験例3 ジペプチドの生産
実験例2で得られたpPE43を保有するエシェリヒア・コリNM522(エシェリヒア・コリNM522/pPE43株)を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地が入った太型試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
反応終了後、反応生成物をジニトロフェノール化法で誘導体化した後にHPLC法により分析した。HPLC法による分析は、分離カラムに関東化学社製のLichrosorb−RP−18カラムを用い、溶離液として1%(v/v)リン酸、25%(v/v)アセトニトリルを用い、0.7ml/分の流動速度で行った。その結果反応液中に120mg/LのL−アラニル−L−グルタミン(L−Ala−L−Gln)が生成蓄積していることを確認した。
実験例4 C末端Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
上記DNA合成機を用いて、配列番号33および34で表される塩基配列を有するDNA(以下、それぞれプライマーE、プライマーFと呼ぶ)を合成した。プライマーEは、ywfEの開始コドン(atg)をNcoI認識配列(ccatgg)に置換した領域を含む塩基配列である。プライマーFは、ywfEの終止コドンをBamHI認識配列(ggatcc)に置換した領域を含む塩基配列である。
C末端Hisタグ付加型組換え体発現ベクターpQE60(キアゲン社製)0.2gを制限酵素NcoIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により3.4kbのDNA断片を回収した。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
pQE60ywfEを保有するエシェリヒア・コリNM522(エシェリヒア・コリNM522/pQE60ywfE株)を、50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った太型試験管に接種し28℃で17時間培養した。該培養液を50μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地の入った250ml容三角フラスコに接種し30℃で3時間培養した後、終濃度が1mmol/Lになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、さらに30℃で4時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、His Trap(Hisタグ付加タンパク精製キット、Amersham Pharmasia Biotech社製)を用いて、説明書に従いHisタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例5 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産(1)
(i)実験例4で取得した精製したHisタグ付加組換え型酵素0.04mg、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、60mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATP、30mmol/LのL−Ala、30mmol/LのL−Glnからなる0.1mlの反応液を調製し、37℃で16時間反応を行った。
(ii)酵素を0.01mg、L−Glnの代わりにL−Phe、L−Met、L−LeuまたはL−Valを含有する以外は、上記(i)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記(i)の反応条件で反応させた。
(iii)酵素を0.01mg、L−Alaの代わりにGly、L−Glnの代わりにL−PheまたはL−Metを含有する以外は、上記(1)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記(1)の反応条件で反応させた。
上記反応液組成からATPを除くとジペプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、ywfE遺伝子産物は、ATP存在下において、L−AlaとL−Gln、L−Phe、L−Met、L−LeuまたはL−Valとから、L−Ala−L−GlnおよびL−Ala−L−Ala、L−Ala−L−Phe、L−Ala−L−MetおよびL−Ala−L−Ala、L−Ala−L−LeuおよびL−Ala−L−Ala、またはL−Ala−L−ValおよびL−Ala−L−Alaを生成する活性、GlyとL−PheまたはL−MetとからGly−L−PheまたはGly−L−Metを生成する活性を有することが明らかになった。
実験例6 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産(2)
実験例4で得られた精製したHisタグ付加組換え型酵素0.04mg、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、60mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATPからなる0.1mlの反応液を調製し、表1の第1行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種L−アミノ酸、Glyまたはβ−Alaをそれぞれ30mmol/Lずつになるように反応液に添加し、37℃で16時間反応を行った。反応終了後、反応生成物をHPLC分析したところ、表1に示すジペプチドが生成していることが確認された。
実験例7 Hisタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジペプチドの生産
実験例4で得られたエシェリヒア・コリNM522/pQE60ywfE株を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った太型試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を50μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地の入った250ml容三角フラスコに接種し30℃で3時間培養した後、終濃度が1mmol/LになるようにIPTGを添加し、さらに30℃で4時間培養した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
実験例8 バチルス属に属する各種微生物からのywfE遺伝子に相当する遺伝子のクローニングとその解析
配列番号14で表される塩基配列に基づき、バチルス・サチリスATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、バチルス・アミロリケファシエンスIFO3022、およびバチルス・プミルスNRRL B−12025に存在するywfE遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
上記で調製したNRRL B−12025株の染色体DNAを鋳型にし、配列番号37および38で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いて、PCRを行った。PCRは、0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのZ−taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)、5μLのZ−taqポリメラーゼ用×10緩衝液(タカラバイオ社製)、200μmol/Lの各dNTPを含む反応液50μLを調製し、98℃で5秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
次に該プラスミドをEcoRIで切断した後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した。該DNA断片をジーンクリーンIIキットを用いて精製した。約0.5μgの該精製DNA断片を、DIG−ハイプライムDNAラベリング&デテクション スターターキットI(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いて、DIGラベル化した。DIGラベル化は、該キット添付の説明書に従って行った。
NRRL B−12025株の染色体DNAをBamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalIおよびSphIを用いてそれぞれ完全消化し、アガロース電気泳動によりDNA断片を分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)に転移させた。
ハイブリダイゼーションは、該プローブDNAと該ナイロン膜を65℃で16時間接触させ、その後該ナイロン膜を、0.1%SDSおよび2×SSCからなる溶液を用い、室温で5分間、2回洗浄し、さらに0.1%SDSおよび0.5×SSCからなる溶液を用い、65℃で15分間、2回洗浄することで行い、その他の操作、条件およびハイブリダイズしたDNAの検出は、上記したDIG−ハイプライムDNAラベリング&デテクション スターターキットIに添付されている説明書に準じて行った。
次に、NRRL B−12025株の染色体DNAをHindIIIおよびPstIを用いてそれぞれ完全消化し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した。それぞれの制限酵素消化DNAから3−4kbpの断片をジーンクリーンIIキットを用いて精製し、ライゲーションキットを用いて自己環化させた。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
上記で得られたpYWFE1〜pYWFE10に含まれるywfE遺伝子に相当する各遺伝子の塩基配列を塩基配列分析装置373A・DNAシークエンサーを用いて決定した。
pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9、pYWFE10およびpYWFE1とpYWFE7に含まれるywfE遺伝子に相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号2〜8および1に、該遺伝子の塩基配列を配列番号14〜21および46にそれぞれ示した。
実験例9 C末端Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス・サチルスATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、またはバチルス・アミロリケファシエンスIFO3022の染色体DNAを鋳型とし、実験例2記載のプライマーAおよびプライマーBをプライマーセットとして用いてPCRを行った。PCRは、0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのPfuDNAポリメラーゼ、4μLのPfuDNAポリメラーゼ用×10緩衝液、200μmol/Lの各dNTPを含む反応液40μLを調製し、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、ywfE断片に相当する約1.4kbのDNA断片がそれぞれ増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたDNAの沈殿を20μLのTEに溶解した。
次にC末端Hisタグ付加型組換え体発現ベクターpQE60 0.2μgを制限酵素NcoIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により3.4kbのDNA断片を回収した。
該反応液を用いて大腸菌NM522株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
実験例10 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例9で得られた組換え型酵素0.04mg、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、60mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATP、30mmol/LのL−Alaおよび30mmol/LのL−Glnからなる0.1mlの反応液を調製し、37℃で16時間反応を行った。
また、上記反応液組成からATPを除くとL−Ala−L−GlnおよびL−Ala−L−Alaは全く生成されなかった。
実験例11 albC遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス・ノウルセイのalbC遺伝子の塩基配列[Chemistry & Biol.,9,1355(2002)]に基づき、ストレプトマイセス・ノウルセイおよびストレプトマイセス・アルボラスよりalbC遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。
albC遺伝子の塩基配列に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、配列番号51および52で表される塩基配列を有するDNA(以下、それぞれプライマーJ、プライマーKと呼ぶ)を合成した。プライマーJは、ストレプトマイセス・ノウルセイの染色体DNAのalbC遺伝子の開始コドンを含む領域の5’末端にNcoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーKは、albC遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の5’末端にBglII認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
ファージT5プロモーターを含む発現ベクターpQE60 0.2μgを制限酵素NcoIおよびBglIIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、上記と同様の方法により3.4kbのDNA断片を回収した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
実験例12 菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実験例11で得られたpAL−nouまたはpAL−albを保有するエシエリヒア・コリNM522(エシェリヒア・コリNM522/pAL−nou株またはNM522/pAL−alb株)およびプラスミドを保有しないNM522株を50μg/mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地が入った試験管(プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様)に接種し、30℃で17時間培養した。この培養液0.5mlを50mlのLB培地が入った250ml容の三角フラスコにそれぞれ植菌し、30℃で1時間振とう培養した後、IPTGを終濃度1mmol/Lになるように添加し、さらに4時間培養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
実験例13 精製酵素を用いたジペプチドの製造(1)
実験例12と同様にエシェリヒア・コリNM522/pAL−nou株を培養した。培養終了後、遠心分離によって湿菌体を取得し、60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー(pH7.2)で洗浄後、10mmol/Lイミダゾール含有20mmol/Lリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁を4℃で超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液(10ml、蛋白質0.863mgを含む)をアマシャム社製Hisタグ精製カラムに通塔し、10mmol/Lのイミダゾールを含有する20mmol/Lのリン酸カリウムバッファー15mlを通塔することによる洗浄を行い、HisタグつきalbC蛋白質をカラム内にて精製した。次にこのHisタグ付きのalbC蛋白質を保持するカラムに、実施例12と同組成の反応液(反応液組成:60mmol/Lのリン酸カリウムバッファー(pH7.2)、10mmol/Lの塩化マグネシウム、10mmol/LのATP、1g/LのL−Leu、1g/LのL−Pheからなる反応液)2mlを通塔し、カラム内に基質を保持した状態で、30℃にて、インキュベートした。24時間後、同組成の反応液3mlでカラム内の反応液を溶出し、実験例12と同様の方法により反応液中のシクロジペプチドおよびジペプチドを定量した。
実験例14 精製酵素を用いたジペプチドの製造(2)
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実験例13と同様の方法で酵素反応を行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、1g/LのL−Ala、L−LeuまたはL−Pheに置き換えた以外は実験例13と同じ組成の溶液を用いた。
実験例15 ywfE遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、配列番号94〜97に記載の配列をそれぞれ有するDNA(以下、それぞれプライマーし、プライマーM、プライマーN、プライマーO)を合成した。配列番号94の配列は、プラスミドpQE60ywfEのywfE遺伝子のリボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ配列を含む領域について5’側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号95の配列は、ywfE遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な配列の5’側にBamHI認識配列を含む配列を付加したものである。また配列番号96の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列について5’側にEcoRI認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号97の配列は、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター領域の配列と相補的な配列の5’側にXhoI認識配列を含む配列を付加したものである。
上記で得られたywfE遺伝子を含む1.4kb断片、trpプロモーター領域を含む0.3kb断片および4.5kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、trpプロモーター下流にywfE遺伝子を含む発現ベクターであるpPE56を得た。該ベクターの構造を制限酵素消化により確認した(図4)。
エシェリヒア・コリ染色体DNA上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641−6645(2000)]に従って作製した。
(1)遺伝子欠損用DNA断片のクローニング
エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上に存在する配列番号65で表される塩基配列を有するpepD遺伝子、配列番号66で表される塩基配列を有するpepN遺伝子、配列番号67で表される塩基配列を有するpepB遺伝子、配列番号68で表される塩基配列を有するpepA遺伝子および配列番号69で表される塩基配列を有するdppA遺伝子、配列番号70で表される塩基配列を有するdppB、配列番号71で表される塩基配列を有するdppC遺伝子、配列番号72で表される塩基配列を有するdppD遺伝子および配列番号73で表される塩基配列を有するdppF遺伝子を欠損させることを目的に、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用い、エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上における各々の欠損標的遺伝子の上流および下流に位置する36bpからなる塩基配列と相同な塩基配列、および配列番号64で表される酵母由来Flp recombinaseが認識する塩基配列を有するDNAを合成した。ただし、dppA遺伝子、dppB遺伝子、dppC遺伝子、dppD遺伝子およびdppF遺伝子は、オペロンを形成しているので、該オペロンの上流および下流に位置する塩基配列と相同な塩基配列を有するDNAを合成した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃で30分間放置した。該溶液を遠心分離し、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子およびdppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を取得した。
(2)pepD遺伝子欠損エシェリヒア・コリJM101の作製
エシェリヒア・コリJM101株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することでpKD46を保持するエシェリヒア・コリJM101株(以下、エシェリヒア・コリJM101/pKD46と称す)を選択した。
プラスミドpCP20は、酵母由来Flp recombinase遺伝子を有し、該遺伝子の発現は42℃で誘導することができる。
また、上記で作製したpepD遺伝子、pepN遺伝子、pepB遺伝子、pepA遺伝子及びdppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片の、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にはFlp recombinaseが認識する塩基配列が存在するため、Flp recombinaseが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させることができる。
上記で取得したpCP20保有pKD46脱落株を薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地および100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
(3)エシェリヒア・コリJM101の染色体DNA上のpepD遺伝子およびpepN遺伝子が欠損した株の作製
上記(2)で得られたエシェリヒア・コリJPD1株をpKD46で形質転換した後、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することによりpKD46を保持するエシェリヒア・コリJPD1(以下、エシェリヒア・コリJPD1/pKD46と称す)を選択した。エシェリヒア・コリJPD1/pKD46に、電気パルス法によりpepN遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を導入し、エシェリヒア・コリJPD1/pKD46の染色体DNA上にpepN遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を取得した。
(4)エシェリヒア・コリJM101の染色体DNA上のpepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子またはdppオペロンが欠損した株、および多重遺伝子欠損株の作製
pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子またはdppオペロンの欠損株は、上記(1)で作製した各遺伝子またはオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有DNA断片を用い、上記(2)と同様の方法により作製した。
また、上記(3)の方法に準じて、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子およびdppオペロンからなる群より選ばれる2以上の遺伝子またはオペロンの多重欠損株を作製した多重欠損株が取得できたことの確認は、上記(2)と同様のPCRにより確認した。前記方法で取得されたpepD遺伝子およびdppオペロンが欠損した二重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPDP49株、pepB遺伝子、pepD遺伝子およびpepN遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPDNB43株、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した三重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDDP36株、pepA遺伝子、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDAP5株、pepB遺伝子、pepD遺伝子、pepN遺伝子およびdppオペロンが欠損した四重遺伝子欠損株をエシェリヒア・コリJPNDBP7株と名づけた。表2は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
実験例16で得られた各種ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損株を、実験例15で造成したプラスミドpPE56を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
実験例17と同様に、各種ペプチダーゼおよびペプチド取り込み蛋白質をコードする遺伝子の欠損大腸菌株を、pPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換株を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を100μg/mlのアンピシリンを含む8mlの水性媒体(リン酸水素二カリウム16g/l、リン酸二水素カリウム14g/l、硫酸アンモニウム5g/l、クエン酸(無水)1g/l、カザミノ酸(Difco社製)0.5g/l、L−Pro1g/l、L−Ala2.5g/l、L−Val2.5g/l、グルコース10g/l、ビタミンB110mg/l、硫酸マグネシウム・7水和物25mg/l、硫酸鉄・7水和物50mg/l、10mol/lの水酸化ナトリウム溶液でpH7.2に調整。グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・7水和物、硫酸鉄・7水和物は別個に蒸煮後に添加)が入った試験管に1%添加し、30℃で24時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
実験例19 ペプチダーゼおよびジペプチド取り込み系蛋白質の活性が喪失した大腸菌株を用いたグリシル−L−グルタミン(以下、Gly−L−Glnと称す)の生産性の評価
実験例17と同様に各種ペプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質をコードするオペロンの欠損株を、pPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換株を、50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液を100μg/mlのアンピシリンを含む8mlの水性媒体(リン酸水素二カリウム16g/l、リン酸二水素カリウム14g/l、硫酸アンモニウム5g/L、クエン酸(無水)1g/L、カザミノ酸(ディフコ社製)0.5g/L、L−Pro1g/L、Gly2.5g/L、L−Gln2.5g/L、グルコース10g/L、ビタミンB110mg/L、硫酸マグネシウム・7水和物25mg/L、硫酸鉄7水和物50mg/L、10mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整。L−Glnは10倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・7水和物、硫酸鉄・7水和物は別個に蒸煮後添加)が入った試験管に1%添加し、30℃で24時間反応させた。該水性媒体を遠心分離し上清を取得した。
実験例20 アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質に用いたジペプチドまたはジペプチド誘導体の酵素的製造法
実験例4で取得した精製したHisタグ付加組換え型酵素40mg/L、100mmol/LのTris−HCl(pH9.0)、30mmol/Lの塩化マグネシウム、10mmol/LのATP、各10mmol/Lの表6記載のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からなる0.1mlの反応液を調製し、37℃で2時間反応を行った。
Ala :L−アラニン
Phe :L−フェニルアラニン
Glu :L−グルタミン酸
Asp :L−アスパラギン酸
Lys :L−リジン
Cl−Ala :β−クロロ−L−アラニン
CN−Ala :β−シアノ−L−アラニン
cyc(5)Ala :β−シクロペンチル−DL−アラニン
cyc(3)Ala :β−シクロプロピルアラニン
cyc(6)Ala :β−シクロヘキシルアラニン
Cl−Phe :4−クロロフェニルアラニン
F−Phe :4−フルオロフェニルアラニン
Ni−Phe :p−ニトロフェニルアラニン
NH2−Phe :p−アミノフェニルアラニン
Phe−NH2 :フェニルアラニンアミド
Kynurenin :L−キヌレニン
Glu(OMe) :グルタミン酸−γ−メチルエステル
Glu(OEt) :グルタミン酸−γ−エチルエステル
Glu(OtBu) :グルタミン酸−γ−tブチルエステル
Glu(OBzl) :グルタミン酸−γ−ベンジルエステル
Asp(OMe) :アスパラギン酸−β−メチルエステル
Asp(OtBu) :アスパラギン酸−β−tブチルエステル
Asp(OBzl) :アスパラギン酸−β−ベンジルエステル
Lys(Ac) :アセチルリジン
Lys(Boc) :Boc−リジン
表6に示すように、コントロールである基質無添加区、およびL−Ala、L−Phe、L−Glu、L−Asp、L−Lysをそれぞれ単独の基質に用いた試験区でのADP生成量は0.02〜0.16mmol/Lであったのに対し、表6に示すアミノ酸およびアミノ酸誘導体の組み合わせでは、0.54〜6.43mmol/LものADPが生成していた。
プロトンNMR分析は、Bruker社製のDMX500を用い、以下の条件下で行った。
温度:303K
標準物質:1mmpl/Lの3−(Trimethylsilyl)−Propionic acid−D4 sodium salt(TSP)
媒体:反応液4、10および11は軽水、その他の反応液は重水
反応液中の化合物の構造は、α位のプロトンのケミカルシフトに基づき同定した。各化合物の濃度はTSPの面積を内部標準とし、α位のプロトンのシグナル面積を元に算出した(表7)。ただし、L−Ala−L−Alaは濃度が低く、α位のプロトンのシグナルが重なり合うため、β位のプロトンのシグナル面積を元に算出した。なお、括弧内は、各化合物のα位プロトンのケミカルシフト(単位はppm)を表す。
Cl−Ala(4.20)、Phe(4.02)、Cl−Ala−Phe(3.93,4.50)、Aziridine−2−carboxylic acid[Azc](2.73)、Azc−Phe(2.59,4.47)
CN−AlaおよびPheを基質に用いた反応液(反応液2)
CN−Ala(3.87)、Phe(4.00)、CN−Ala−Phe(3.71,4.48)
AlaおよびCl−Pheを基質に用いた反応液(反応液3)
Ala(3.79)、Cl−Phe(3.97)、Ala−Cl−Phe(3.90,4.43)
AlaおよびNH2−Pheを基質に用いた反応液(反応液4)
Ala(3.78)、NH2−Phe(3.93)、Ala−NH2−Phe(3.95,4.39)、Ala−Ala(β;1.55,1.36)
AlaおよびKinurenineを基質に用いた反応液(反応液5)
Ala(3.79)、Kinurenine(4.16)、Ala−Kinurenine(3.96,4.64)
AlaおよびPhe−NH2を基質に用いた反応液(反応液6)
Ala(3.79)、Phe−NH2(4.02)、Ala−Phe−NH2(3.90,4.60)
AlaおよびGlu(OMe)を基質に用いた反応液(反応液7)
Ala(3.79)、Glu(OMe)(3.76)、Ala−Glu(OMe)(4.05,4.18)、Ala−Ala(β;1.55,1.36)
AlaおよびGlu(OtBu)を基質に用いた反応液(反応液8)
Ala(3.79)、Glu(OtBu)(3.76)、Ala−Glu(OtBu)(4.04,4.18)
AlaおよびAsp(OtBu)を基質に用いた反応液(反応液9)
Ala(3.81)、Asp(OtBu)(3.98)、Ala−Asp(OtBu)(4.04,4.46)
AlaおよびLys(Boc)を基質に用いた反応液(反応液10)
Ala(3.78)、Lys(Boc)(3.73)、Ala−Lys(Boc)(4.02,4.14)
Alaおよびcyc(3)Alaを基質に用いた反応液(反応液11)
Ala(3.78)、cyc(3)Ala(3.82)、Ala−cyc(3)Ala(4.08,4.24)
Alaおよびcyc(6)Alaを基質に用いた反応液(反応液12)
Ala(3.79)、cyc(6)Ala(3.76)、Ala−cyc(6)Ala(4.02,4.22)
上記結果から、本発明の製造法により、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を基質として、直接アミノ酸とアミノ酸誘導体がペプチド結合したジペプチド誘導体が製造できることが明らかとなった。
実験例21 N−[2−(アセチルアミノ)プロピオニル]フェニルアラニンの製造
実験例6で得られたL−Ala−L−phe(100mg,0.423mmol)を塩化メチレン(10mL)に懸濁し、室温でピリジン(10mL)及び無水酢酸(1mL,11mmol)を加える。室温で24時間撹拌した後、水を加えクロロホルムで3回抽出する。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去することにより、N−[2−(アセチルアミノ)プロピオニル]フェニルアラニンを得る。
実験例22 1−{2−[N−(2−(アセチルアミノ)プロピオニル)アミノ]−3−フェニルプロピオニル}ピペリジンの製造
実験例21で得られるN−[2−(アセチルアミノ)プロピオニル]フェニルアラニン(10mg,0.036mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(5mL)に懸濁し、室温で1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(14mg,0.073mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(15mg,0.11mmol)及びピペリジン(40μL,0.40mmol)を加え50℃で24時間撹拌する。反応混合物に水を加え、クロロホルムで3回抽出する。有機層を10%塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去する。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1−{2−[N−(2−(アセチルアミノ)プロピオニル)アミノ]−3−フェニルプロピオニル}ピペリジンを得る。
なお、以下の実施例において、ジペプチドおよびアミノ酸は、ジニトロフェノール化法で誘導体化した後にHPLC法により分析した。HPLC法による分析は、分離カラムにLichrosorb−RP−18カラム(関東化学社製)を用い、溶離液として1%(v/v)リン酸、25%(v/v)アセト二トリルを用い、0.7ml/分の流動速度で行った。
ATP、ADP、AMPの分析、定量法
ATP、ADPおよびAMPの分析は、反応液を停止溶液[4mol/L尿素、100mmol/L EDTA・2Na(pH8.0)]で400倍に希釈した後、HPLC法により分析した。HPLC法による分析は、分離カラムにDevelosil C30−UG−5(150×4.6mm、野村科学社製)を用い、溶離液として200mmol/L酢酸、200mmol/Lトリエチルアミン(pH6.6)を用い、1.0ml/分の流動速度、波長254nmの吸収を測定することにより行った。
実験例4で取得したywfE遺伝子を含むプラスミドpQE60ywfE上でywfE蛋白質をコードするDNAの5’側上流に位置する配列番号98で表される塩基配列を有するDNAと3’下流に位置する配列番号99で表される塩基配列を有するDNAをプライマーセットとして用い、プラスミドpQE60ywfEを鋳型DNAとして、エラープローンPCR[Technique,1,11−15,(1989)]を行った。PCRは、鋳型DNA0.1μg、プライマー各0.5μmol/L、Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)2.5units、Taq DNAポリメラーゼ用×10緩衝液5μl、deoxyNTP各200μmol/L、および塩化マンガン0.075mmol/Lを含む反応液50μlを用い、94℃で30秒間、57℃で30秒間、72℃で1分30秒間の工程を30回繰り返し、最後に72℃で3分間インキュベートすることにより行った。増幅断片を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断後、実験例1同様に回収し、制限酵素NcoIおよびBamHIで切断したベクタープラスミドpQE60と連結して、発現プラスミドを造成し、該プラスミドおよびpQE60ywfEを用いてエシェリヒア・コリDH5α/pREP4[pREP4(キアジェン社製)を用いてエシェリヒア・コリDH5αを形質転換して取得した株]を形質転換して形質転換体を取得した。各形質転換体をエシェリヒア・コリDH5α/pBTS1〜pBTS5およびエシェリヒア・コリDH5α/pQE60ywfEと命名した。常法に従ってエシェリヒア・コリDH5α/pBTS1〜pBTS5からそれぞれプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。pBTS1に含まれるDNAの塩基配列を配列番号22、該DNAにコードされるアミノ酸配列を配列番号9に、pBTS2に含まれるDNAの塩基配列を配列番号23、該DNAにコードされるアミノ酸配列を配列番号10に、pBTS3に含まれるDNAの塩基配列を配列番号24、該DNAにコードされるアミノ酸配列を配列番号11に、pBTS4に含まれるDNAの塩基配列を配列番号25、該DNAにコードされるアミノ酸配列を配列番号12に、pBTS5に含まれるDNAの塩基配列を配列番号26、該DNAにコードされるアミノ酸配列を配列番号13に示した。
ジペプチド生成反応は、上記で得られた精製した各蛋白質50mg/L、100mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、30mmol/Lの塩化マグネシウム、60mmol/LのATPからなる0.1mlの反応液を調製し、L−AlaおよびL−Glnをそれぞれ30mmol/Lずつになるように反応液に添加し、37℃で1時間反応を行った。エシェリヒア・コリDH5α/pQE60ywfEが生産する蛋白質を熱処理せずに用いたときのL−Ala−L−Gln生成量に対する、熱処理した蛋白質を用いたときのL−Ala−L−Gln生成量を残存活性(%)とした。結果を表8に示す。
(1)各種細菌の染色体DNAの調製
エシェリヒア・コリW3110、ロドバクター・スフェロイデスATCC17023、シュードモナス・プチダKT2440(ATCC47054)およびシノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)ATCC51124はLB培地、クロロフレックス・オーランティカス(Chloroflexusaurantiacus)ATCC29366はATCC medium920培地[0.1g/lニトリロ三酢酸、0.06g/l硫酸カルシウム・二水和物、0.1g/l硫酸マグネシウム・七水和物、0.008g/l塩化ナトリウム、0.103g/l硝酸カリウム、0.689g/l硝酸ナトリウム、0.111g/lリン酸水素二ナトリウム、0.2g/l塩化アンモニウム、0.5g/l酵母エキス、0.5g/lグリシルグリシン、0.5g/l硫酸ナトリウム、微量金属溶液(0.5ml/l濃硫酸、2.28g/l硫酸マンガン・七水和物、0.5g/l硫酸亜鉛・七水和物、0.5g/l硼酸、0.025g/l硫酸銅・二水和物、0.025g/lモリブデン酸ナトリウム・二水和物(Na2MoO4・2H2O)、0.045g/l塩化コバルト・六水和物)および0.2905g/lの塩化第二鉄(FeCl3)溶液をそれぞれ培地1Lに対して1ml含む。pH8.2〜8.4)、メゾリゾビウム・ロティ(Mesorhizobiumloti)MAFF303099(かずさDNA研究所より分譲)は、1g/l酵母エキス、5g/lマンニトール、0.7g/lリン酸水素二カリウム、0.1g/lリン酸二水素カリウムおよび1g/l硫酸マグネシウム・七水和物からなる培地(pH7.0〜7.2)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomycescoelicolor)ATCC BAA−471株は、5g/lトリプトンペプトン(ディフコ社製)、3g/l酵母エキス(ディフコ社製)からなる培地(pH7.0〜7.2)を用いて、それぞれ30℃で24時間培養し、培養物を遠心分離して菌体を得た。
(2)各種細菌由来のポリリン酸キナーゼをコードする遺伝子の増幅
エシェリヒア・コリW3110のポリリン酸キナーゼをコードする遺伝子(以下、ppk遺伝子と略す)は、配列番号100および101で表される塩基配列を有するDNA、ロドバクター・スフェロイデスATCC17023のppk遺伝子は、配列番号102および103で表される塩基配列を有するDNA、クロロフレックス・オーランティカスATCC29366のppk遺伝子は、配列番号104および105で表される塩基配列を有するDNA、メゾリゾビウム・ロティMAFF303099のppk遺伝子は、配列番号106および107で表される塩基配列を有するDNA、ストレプトマイセス・セリカラーATCC BAA−471のppk遺伝子は、配列番号108および109で表される塩基配列を有するDNA、シュードモナス・プチダKT2440のppk遺伝子は、配列番号110および111で表される塩基配列を有するDNA、シノリゾビウム・メリロティATCC51124のppk遺伝子は、配列番号112および113または配列番号114および115で表される塩基配列を有するDNAをプライマーセットに用い、上記(1)の各細菌の染色体DNAを鋳型としてPCR法によって取得した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたDNAをTEに溶解した。
(3)ポリリン酸キナーゼをコードするDNAのクローニング
上記2で取得したエシェリヒア・コリW3110の染色体DNAを鋳型として増幅されたDNA断片は、NcoIおよびBamHIで消化した後、アガロースゲル電気泳動により約1.4kbのDNA断片として分離し、ジーンクリーンキットを用いて回収した後、TEに溶解した。得られたDNA断片を、NcoIおよびBamHIで消化したpET−28a(+)ベクター(ノバジェン社製)に、ライゲーションキットを用いて、16℃で1時間連結し、組換え体DNAを取得した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・クローニング第3版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出して、制限酵素処理によりその構造を解析し、配列番号116で表される塩基配列を有するエシェリヒア・コリ由来のppk遺伝子発現プラスミドpPK−Ec1が取得されていることを確認した。
生育してきた形質転換体のコロニーからモレキュラー・バイオロジー第3版に記載の方法に従ってプラスミドを抽出し、ロドバクター・スフェロイデスATCC17023由来のDNAを有するプラスミドおよびクロロフレックス・オーランティカスATCC29366由来のDNAを有するプラスミドはNdeIおよびSalI、メゾリゾビウム・ロティMAFF303099由来のDNAを有するプラスミドおよびシュードモナス・プチダKT2440由来のDNAを有するプラスミドはNdeIおよびHindIII、ストレプトマイセス・セリカラーATCC BAA−471由来のDNAを有するプラスミドはNcoIおよびSalI、シノリゾビウム・メリロティATCC51124由来のDNAを有するプラスミドは、配列番号112および113で表される塩基配列からなるプライマーDNAを用いて増幅したDNAを含有するプラスミドについてはNdeIおよびSalI、配列番号114および115で表される塩基配列からなるプライマーDNAを用いて増幅したDNAを含有するプラスミドについてはNdeIおよびBamHIでそれぞれ消化した後、アガロースゲル電気泳動により各DNA断片を分離し、ジーンクリーンキットを用いて回収しTEに溶解した。
得られたそれぞれの組換え体DNAを用いてエシェリヒア・コリTOP10を形質転換した後、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養した。
(4)ポリリン酸キナーゼ生産株の造成
上記(3)で取得した各発現プラスミドを用いてエシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)(ストラタジーン社製)を形質転換した後、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養した。
実施例2で取得されたポリリン酸キナーゼを生産するエシェリヒア・コリの形質転換体をLB培地を用いて30℃で培養した。OD(660nm)が3.0〜5.0になった時点で終濃度が2mmol/LになるようにIPTGを添加し、OD(660nm)が8.0になるまで培養した。得られた培養物を遠心分離して得られた菌体を50g/Lになるように反応液[5mmol/Lポリリン酸(シグマ社製P8510)、5mmol/L AMP、1mmol/L ADP、20mmol/L塩化マグネシウム、100mmol/L硫酸アンモニウム、60mmol/L HEPES−KOH、pH7.2]に懸濁して、37℃にて1時間反応した。
実施例1で取得した配列番号1で表されるジペプチドを生成する活性を有する蛋白質を発現するエシェリヒア・コリDH5α/pQE60ywfEを、50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地の入った太型試験管に接種し28℃で17時間培養した。該培養液を50μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地の入った250ml容三角フラスコに接種し30℃で3時間培養した後、終濃度が1mmol/LになるようにIPTGを添加し、さらに30℃で4時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例3で取得したロドバクター・スフェロイデスATCC17023由来のポリリン酸キナーゼを生産するエシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)/pPK−Rs2−1を、50μg/mlのカナマイシンを含む8mlのLB培地の入った太型試験管に接種し28℃で17時間培養した。該培養液を50μg/mlのカナマイシンを含む50mlのLB培地の入った250ml容三角フラスコに接種し30℃で3時間培養した後、終濃度が1mmol/LになるようにIPTGを添加し、さらに30℃で4時間培養した後、該培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例4と同様の方法により、エシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)/pPK−Ec1の湿菌体を調製した。該湿菌体を20g/Lの濃度になるように50g/Lのポリリン酸および100mmol/Lの硫酸マグネシウムを含む100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH8.0)に加えて、45℃にて1時間加熱処理した。該溶液を37℃に冷却した後、実施例4で調製したエシェリヒア・コリDH5α/pQE60ywfEの湿菌体、ATPおよび基質アミノ酸をそれぞれ終濃度が30g/L、5mmol/Lおよび各200mmol/Lになるように添加して、37℃にて2時間反応を行った。また、対照として加熱処理しないエシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)/pPK−Ec1の湿菌体を用いて、上記と同様にジペプチド生成反応を行った。結果を表11に示す。
実施例4で調製したエシェリヒア・コリDH5α/pQE60ywfEの湿菌体、および実施例5で調製したエシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)/pPK−Rs−21の湿菌体を、それぞれ30g/Lおよび20g/Lの濃度になるように、50g/Lのポリリン酸および100mmol/Lの硫酸マグネシウムを含む100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH8.0)に加えて、45℃にて1時間加熱処理した。該溶液を37℃に冷却した後、ATPおよび基質アミノ酸をそれぞれ終濃度が5mmol/Lおよび各200mmol/Lになるように添加して37℃にて2時間反応を行った。また、対照として加熱処理しない湿菌体を酵素源に用いて、上記と同様にジペプチド生成反応を行った。結果を表12に示す。
実験例4と同様の方法により、実施例1で取得した耐熱化した変異型ジペプチド合成酵素を生産するエシェリヒア・コリDH5α/pBTS2の湿菌体を調製した。該湿菌体および実施例5で調製したエシェリヒア・コリBL21−Gold(DE3)/pPK−Rs−21の湿菌体を、それぞれ30g/Lおよび20g/Lになるように50g/Lのポリリン酸および100mmol/Lの硫酸マグネシウムを含む100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH8.0)に加えて、52℃にて30分間加熱処理した。該溶液を37℃に冷却した後、ATPおよび基質アミノ酸をそれぞれ終濃度が5mmol/Lおよび各200mmol/Lになるように添加して反応を行った。反応中は適宜2mol/Lの水酸化ナトリウムを添加してpHを7.5〜8.0に調整した。結果を表13に示す。
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Claims (15)
- i)リン酸供与体、ii)アデノシン−5’−一リン酸(以下、AMPと略す)、アデノシン−5’−二リン酸(以下、ADPと略す)およびアデノシン−5’−三リン酸(以下、ATPと略す)からなる群より選ばれる物質、iii)ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、iv)以下の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、およびv)L−AlaとL−Ala、L−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸、GlyとL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−アミノ酪酸、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸、L−SerとL−Gln、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−His、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸、L−ThrとL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Thr、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸、L−MetとL−Cys、L−Met、L−Phe、L−Tyr、L−HisおよびL−Lysから選ばれる1種のアミノ酸、β−AlaとL−Met、L−Phe、L−HisおよびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸、L−GlnとL−Phe、またはL−α−アミノ酪酸とL−Gln、L−ArgおよびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸、を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該水性媒体から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
[1]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質 - i)リン酸供与体、ii)アデノシン−5’−一リン酸(以下、AMPと略す)、アデノシン−5’−二リン酸(以下、ADPと略す)およびアデノシン−5’−三リン酸(以下、ATPと略す)からなる群より選ばれる物質、iii)ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、iv)以下の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、およびv) L−AlaとL−Ala、L−Gln、L−Glu、Gly、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Asn、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−His、L−Asp、L−α−アミノ酪酸、L−アザセリン、L−テアニン、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸、GlyとL−Gln、Gly、L−Phe、L−Trp、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Cys、L−Tyr、L−Lys、L−Arg、L−α−アミノ酪酸、およびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸、L−SerとL−Gln、L−Phe、L−Met、L−Ser、L−Thr、L−Tyr、L−His、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸、L−ThrとL−Gln、L−Leu、L−Phe、L−Met、L−Thr、およびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸、L−MetとL−Cys、L−Met、L−Phe、L−Tyr、L−HisおよびL−Lysから選ばれる1種のアミノ酸、β−AlaとL−Met、L−Phe、L−HisおよびL−シトルリンから選ばれる1種のアミノ酸、L−GlnとL−Phe、またはL−α−アミノ酪酸とL−Gln、L−ArgおよびL−α−アミノ酪酸から選ばれる1種のアミノ酸、を水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、そのまま、または該水性媒体から該ジペプチドを採取した後、該ジペプチドを修飾し、ジペプチドまたはジペプチド誘導体[以下、ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)と称す]を生成させ、該ジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)を採取することを特徴とするジペプチドまたはジペプチド誘導体(PII)の製造法。
[1]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質
[3]配列番号1〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質 - 請求項1または2の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する細胞が以下の[1]または[2]記載のDNAを有する細胞である、請求項1または2に記載の製造法。
[1]配列番号14〜26および46のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号14〜26および46のいずれかで表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつATP依存的にアミノ酸からジペプチドを生成する活性を有する蛋白質をコードするDNA - ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質が以下の[1]〜[3]から選ばれる蛋白質である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造法。
[1]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質
[3]配列番号124〜131のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質 - ポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する細胞が以下の[1]または[2]記載のDNAを有する細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造法。
[1]配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
[2]配列番号116〜123のいずれかで表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつポリリン酸キナーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA - 細胞が微生物の細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造法。
- 微生物が原核生物である請求項6記載の製造法。
- 原核生物が、1種以上のペプチダーゼおよび1種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質(以下、ペプチド取り込み蛋白質ともいう)の活性が低下または喪失した微生物である請求項7記載の製造法。
- 原核生物が、3種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失した微生物である請求項7記載の製造法。
- ペプチダーゼが、配列番号55〜58のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号55〜58のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつペプチダーゼ活性を有する蛋白質である請求項8または9記載の製造法。
- ペプチド取り込み蛋白質が、配列番号59〜63のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号59〜63のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有する蛋白質であり、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である請求項8または10記載の製造法。
- 原核生物が、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属またはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物である請求項7〜11のいずれか1項に記載の製造法。
- エシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corymebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム(Corynebacterium lactofermentum)、コリネバクテイルム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・エフィシェンス(Corynebacterium efficiens)、バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)またはバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)である請求項12記載の製造法。
- 培養物の処理物が培養物の熱処理物、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる細胞、該細胞の熱処理物、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物および該細胞より抽出して得られる酵素標品から選ばれる処理物であり、かつATP依存的に1種以上のアミノ酸からジペプチドを生成する活性またはポリリン酸キナーゼ活性を有する処理物である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の製造法。
- 熱処理物が培養物または細胞のジペプチド分解酵素活性が減少または喪失した熱処理物である、請求項14記載の製造法。
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