KR20170020867A - H1 프로모터를 사용하여 crispr 가이드 rna를 발현시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

H1 프로모터를 사용하여 crispr 가이드 rna를 발현시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원에 기재된 내용은 H1 프로모터를 사용하여 CRISPR 가이드 RNA를 발현하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 5' 뉴클레오티드의 변형된 특이성을 갖는 CRISPR 가이드 RNA (gRNA)를 발현시키기 위한 H1 프로모터의 사용, 및 Cas9 뉴클레아제 및 gRNA를 동시에 발현시키는 양방향 프로모터로서의 H1 프로모터 서열의 사용을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. RNA 리보자임 및 조절가능한 앱타자임의 사용을 통한 생체내 gRNA 발현의 발현과 조절을 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.

Description

H1 프로모터를 사용하여 CRISPR 가이드 RNA를 발현시키기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE EXPRESSION OF CRISPR GUIDE RNAS USING THE H1 PROMOTER}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 6월 16일 출원된 미국 가출원 번호 62/012,802의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.
전자식으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
본 출원은 서열 목록을 함유한다. EFS-Web을 통해 "111232-00401_ST25.txt"라는 ASCII 텍스트 파일로 전자 방식으로 제출되었다. 서열 목록은 14,827 바이트 크기이며 2015년 6월 2일 생성되었다. 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
배경
cas (CRISPR-관련) 유전자와 함께 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: CRISPR)는 박테리아 및 고세균에서 침습한 외래 핵산에 대한 획득된 내성을 제공하는 적응 면역 시스템을 포함한다 (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-12). CRISPR은 종종 파아지 또는 플라스미드 DNA에서 유래하는 스페이서로 불리는 유사한 크기의 독특한 가변 DNA 서열에 의해 간격을 둔 짧은 보존된 반복부 서열 어레이로 구성된다 (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-12, Bolotin et al. (2005)) Microbiology 151: 2551-61, Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-82). CRISPR-Cas 시스템은, CRISPR 영역에 삽입되고 매칭 서열을 운반하는 플라스미드 및 파아지로의 후속 노출에 대한 면역을 제공하는 외래 DNA (스페이서)의 짧은 조각을 획득함으로써 작용한다 (Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709- 12; Brouns et al. (2008) Science 321: 960-64). 이는 외래 핵산의 crRNA-매개된 사일런싱을 가능하게 하는 이러한 CRISPR-Cas 간섭/면역이다 (Horvath & Barrangou (2010) Science 327:167-70; Deveau et al. (2010) Annu. Rev. Microbiol. 64:475-93; Marraffini & Sontheimer (2010) Nat. Rev. Genet. 11:181-90; Bhaya et al. (2011) Annu. Rev. Genet. 45:273-97; Wiedenheft et al. (2012) Nature 482:331-338).
합성 가이드 RNA (gRNA)와 커플링된 Cas9 단백질 (Makarova et al. (2011) Nat. Rev. Microbiol. 9:467-77)의 뉴클레아제 활성에 의존적인 CRISPR 작제물의 사용은 최근 게놈-공학에서 변혁을 일으켰으며, 이는 DNA 서열의 전례없는 조작을 가능하게한다. CRISPR/Cas9 작제물은 합성하기 단순하고 신속하며 다중화될 수 있다. 그러나, 상대적으로 용이한 이들의 합성에도 불구하고, CRISPR은 표적화 가능한 게놈 공간에 대한 이들의 접근과 관련된 기술적 한계를 가지며, 이는 Cas9 자체의 특성 및 이의 gRNA의 합성 둘 모두와 함수 관계에 있다.
CRISPR 시스템에 의한 절단은 20-뉴클레오티드 DNA 서열에 대한 gRNA 및 필요한 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) 즉, 표적 부위에 대한 3'에서 발견된 짧은 뉴클레오티드 모티프의 상보적 염기쌍을 필요로 한다 (Jinek et al. (2012) Science 337: 816-821). 이론적으로 CRISPR 기술을 사용하여 게놈에서 임의의 고유한 N20-PAM 서열을 표적화할 수 있다. 한 가지 제약은 사용된 특이적 Cas9의 기원 종에 따라 달라지는 PAM 서열의 DNA 결합 특이성이다. 현재 가장 제약이 없으며 가장 일반적으로 사용되는 Cas9 단백질은 S. 피로게네스로부터 비롯되며, 이는 서열 NGG를 인식하며, 따라서 게놈에서 임의의 고유의 21-뉴클레오티드 서열에 이은 2개의 구아노신 뉴클레오티드 (N20NGG)가 표적화될 수 있다. 단백질 성분에 의해 부과된 이용가능한 표적화 공간의 확장은 변형된 PAM 요건을 갖는 신규한 Cas9 단백질의 발견 및 사용 (Conget al. (2013) Science 339:819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110(39):15644-9), 또는 진행중인 돌연변이유발 또는 유도된 진화를 통한 신규한 Cas9 변종의 생성으로 제한된다.
CRISPR 시스템의 두 번째 기술적 제약은 5' 구아노신 뉴클레오티드에서 시작되는 gRNA 발현으로부터 발생한다. 타입 III 클래스의 RNA 중합효소 III 프로모터의 사용은 gRNA 발현에 특히 적합한데, 이러한 짧은 비-코딩 전사물은 잘 규정된 말단을 가지고 있고, 1+ 뉴클레오티드를 배제한 전사에 필요한 모든 요소가 업스트림 프로모터 영역에 함유되어 있기 때문이다. 그러나, 일반적으로 사용되는 U6 프로모터는 전사를 개시하기 위해 구아노신 뉴클레오티드를 필요로 하기 때문에, U6 프로모터의 사용은 게놈 표적화 부위를 GN19NGG로 추가로 제한한다 (Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Ding et al. (2013) Cell Stem Cell 12:393-394). T7, T3 또는 SP6 프로모터에 의한 시험관내 전사와 같은 대안적인 접근법은 또한 구아노신 뉴클레오티드(들) 개시를 필요로 할 것이다 (Adhya et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:147-151; Melton et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:7035-7056; Pleiss et al. (1998) RNA 4:1313-1317).
개요
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 통상적으로, 당해 기술에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 핵산 (예를 들어, DNA) 기술, 면역학, 및 RNA 간섭 (RNAi)의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술 중 일부에 대한 비제한적인 설명은 하기 공개 문헌에서 찾아볼 수 있다: Ausubel, F., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, and Current Protocols in Cell Biology, all John Wiley & Sons, N.Y., edition as of December 2008; Sambrook, Russell, and Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E. and Lane, D., Antibodies- Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988; Freshney, R. I., "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique", 5th ed., John Wiley & Sons, Hoboken, N.J., 2005. 치료제 및 인간 질병에 관한 비제한적 정보는 문헌 [Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., McGraw Hill, 2005, Katzung, B. (ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange 10th ed. (2006) or 11th edition (July 2009)]에서 찾아볼 수 있다. 유전자 및 유전자 질환에 대한 비제한적 정보는 하기에서 찾아볼 수 있다: McKusick, V. A.: Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998 (12th edition) 또는 더욱 최근의 온라인 데이터베이스: Online Mendelian Inheritance in Man, OMIMTM McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), 2010년 5월 1일에 하기 웹 사이트에서 입수가능: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ 및 Online Mendelian Inheritance in Animals (OMIA), 동물종에서 유전자, 유전 질환 및 특성 (인간 제외 및 마우스), 하기 웹 사이트에서 입수가능: http://omia.angis.org.au/contact.shtml. 여기에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 기타 간행물 (예를 들어, 과학 기사, 서적, 웹 사이트 및 데이터베이스)은 전체적으로 참조로 포함된다. 명세서가 임의의 통합된 참조와 상충되는 경우, 본 명세서 (통합된 참조를 기반으로 할 수 있는 이의 임의의 보정 포함)가 기준이 될 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 용어는 표준 기술에서 허용되는 의미로 사용된다. 다양한 용어에 대한 표준 약어가 본원에 사용된다.
본원에 기재된 내용은 H1 프로모터를 사용하여 CRISPR 가이드 RNA를 발현하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 내용은 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및 b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 일부 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 망막 광수용체 세포이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 타입-II Cas9 단백질이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 로돕신이다. 일부 양태에서, 시스템은 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자로 패키징된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 내용은 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하며, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질이 DNA 분자를 전달하고, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형되는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 또 다른 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 기재된 내용은 또한 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 여기에서 세포는 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하며, 방법은 세포 내로 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화된, H1 프로모터; 및 b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하며, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 망막 광수용체 세포이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 타입-II Cas9 단백질이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 로돕신이다. 일부 양태에서, 시스템은 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 내용은 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 내로 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화된, H1 프로모터; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하며, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형되는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 기재된 내용은 또한, 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 전사를 한 방향으로 제공하는 조정 요소로서, gRNA는 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되며, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, 조정 요소; 및 b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 반대 방향으로 제공하는 조정 요소를 포함하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단시켜 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시시킨다. 일부 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 망막 광수용체 세포이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 타입-II Cas9 단백질이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 로돕신이다. 일부 양태에서, 시스템은 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 내용은 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 전사를 한 방향으로 제공하는 조정 요소로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, 조정 요소; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 반대 방향으로 제공하는 조정 요소를 포함하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하며, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형된다. 또 다른 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 추가의 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 기재된 내용은 또한, 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 여기에서 세포는 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하며, 방법은 세포 내로 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 전사를 한 방향으로 제공하는 조정 요소로서, gRNA는 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, 조정 요소; 및 b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 반대 방향으로 제공하는 조정 요소를 포함하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단시켜 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시시킨다. 일부 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 진핵 세포는 망막 광수용체 세포이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 타입-II Cas9 단백질이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 로돕신이다. 일부 양태에서, 시스템은 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된다.
본원에 기재된 내용은 또한, 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 세포 내로 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 전사를 한 방향으로 제공하는 조정 요소로서, gRNA는 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, 조정 요소; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 반대 방향으로 제공하는 조정 요소를 포함하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단시키며, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형된다. 또 다른 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 추가의 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 기재된 내용은 또한, a) 촉매 코어 및 이로부터 연장된 헬릭스 I, 헬릭스 II, 및 헬릭스 III 듀플렉스 영역을 포함하는 시스-작용 해머헤드 리보자임으로서, 헬릭스 II 듀플렉스 영역 및 헬릭스 III 듀플렉스 영역 각각은 촉매 코어 반대의 루프 영역을 포함하며, 헬릭스 II 듀플렉스 영역은 리간드에 결합하는 앱타머를 포함하는, 시스-작용 해머헤드 리보자임; b) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하며, 뉴클레오티드 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 포함하며, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단이 헬릭스 III 듀플렉스 영역에 직접 커플링된, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머-조절된 리보자임을 제공하며; 여기에서 리간드의 앱타머로의 결합은 리보자임에서 입체형태적 변화를 유도하여 리보자임이 뉴클레오티드 서열의 5' 말단과 헬릭스 III 듀플렉스 영역 사이에 자가-절단되고, 이에 의해 gRNA가 생성된다. 또한, (i) RNA로 전사되는 경우 앱타머-조절된 리보자임을 생성하는 코딩 서열; 및 (ii) 진핵 세포에서 RNA의 전사를 조절하는 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는 발현 작제물이 제공된다. 발현 작제물을 포함하는 진핵 세포가 또한 제공된다. 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법이 또한 제공되며, 여기에서 세포는 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하며, 방법은 세포 내로 발현 작제물을 도입시키고, 리보자임의 활성을 변화시키는 양의 리간드와 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 특히 여기에서 세포는 포유동물 또는 인간 대상체의 세포이다. 한 양태에서, 리간드는 테오필린이다.
본원에 기재된 내용은 또한, 안구 신경변성 질환을 이러한 질화의 치료가 필요한 대상체에서 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) i) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 대상체의 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및 ii) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (i) 및 (ii)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하고, (b) 유효량의 시스템을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사가 대상체에서 관찰되었다. 일부 양태에서, 안구 신경변성 질환은 녹내장, 망막 변성 및 연령-관련 황반 변성으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 안구 신경변성 질환은 망막 색소변성 (RP)이다. 일부 양태에서, 세포는 망막 광수용체 세포이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 로돕신이다. 일부 양태에서, H1 프로모터는 양방향성이다. 일부 양태에서, 시스템은 대상체로의 투여 전 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된다. 일부 양태에서, 대상체로의 투여는 망막하 주입에 의해 발생한다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 타입-II Cas9 단백질이다. 일부 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함한다. 일부 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은 리보자임의 활성을 변화시키는 양의 리간드와 발현 작제물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 리간드는 테오필린이다.
본원에 기재된 내용의 특정 양태는 상기 기술되었으며, 이는 본원에 기재된 내용에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 논의되며, 기타 양태는 본원 하기에서 가장 잘 설명된 바와 같이 첨부된 실시예 및 도면과 관련하여 취해질 경우 설명이 진행됨에 따라 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
이와 같이, 본원에 기재된 내용을 일반적인 용어로 기술되었으며, 이제는 첨부 도면에 대한 참조가 이루어질 것이며, 이러한 도면은 반드시 일정 규모로 그려진 것은 아니다:
도 1a, 도 1b, 도 1c 및 도 1d는 H1 프로모터로부터 gRNA 합성을 통해 CRISPR 표적화를 지시하는 능력의 평가를 나타낸다. gRNA 발현 작제물을 묘사하는 개략도가 도1a에 도시된다. 상부: U6 프로모터는 +1 구아노신 뉴클레오티드를 갖는 gRNA만을 발현한다; 하부: H1 프로모터는 퓨린 (아데노신 또는 구아노신) 뉴클레오티드에서 시작하는 gRNA의 발현을 추진할 수 있다. 하부에서, 게놈 서열 AN19NGG를 표적으로 하는 gRNA와 Cas9 단백질의 카툰 묘사가 도시된다 (도시된 서열은 SEQ ID NO: 30이다). +1 A의 위치가 표시된다. eGFP 표적화된 파괴 검정의 개략적 개요가 도 1b에 도시된다. eGFP 형광은 CRISPR 표적화 이어서, 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ-매개된 복구에 의해 파괴되어, 코딩 서열을 파괴하는 프레임이동 돌연변이를 유발하여 형광 손실을 발생시킨다. 도 1c는 U6 또는 H1 프로모터 발현된 gRNA에 의한 성공적인 CRISPR 표적화를 입증하는 현미경 이미지를 보여준다. H7 ES 세포를 염색하고, 콜로니를 가시화시켜, 콜로니에서 GFP 형광 모자이크 영역을 나타내는 핵 (왼쪽, 자홍색), eGFP 형광 (중간, 녹색), 및 융합된 이미지 (오른쪽)를 보여줬다. 오른쪽에는 각 작제물에 대한 유동 세포측정에 의한 eGFP 형광 손실의 정량화가 도시된다. 하부는 발현 모자이크를 보여주는 H1 발현된 gRNA에 의해 표적화된 H7 콜로니의 더 높은 배율이다. 척도 막대, 50 μM. NHEJ의 빈도에 대한 서베이어 검정-기반 정량화가 도 1d에 도시되어 있다. 대조군 (첫 번째 레인), U6 발현된 gRNA (두 번째 레인), H1 발현된 gRNA (세 번째 레인), 및 마커 (네 번째 레인)를 묘사하는 바이오분석기 겔 이미지. 인델 % (비절단 (u) 내지 절단 (c) 밴드의 일부에 의해 계산됨)은 하기에 나타낸다.
도 2는 HEK-293 세포에서 NHEJ의 서베이어 분석 및 정량화를 보여준다. 상부에 도시된 것은 eGFP 도식이며, 화살표는 표적화 부위를 나타낸다. 플러스 가닥의 표적 부위는 오른쪽을 지시하도록 나타내고, 마이너스 가닥 표적은 왼쪽을 지시하도록 나타냈으며; 청색 화살표는 H1 프로모터 gRNA를 나타내며, 주황색 화살표는 U6 프로모터 gRNA를 나타낸다. 하부에 도시된 것은 서베이어 검정으로부터의 바이오분석기 겔이다. 표적 부위 좌표는 상부에 기록되었으며, 계산된 인델 %는 하부에 나타내었다.
도 3a, 도 3b, 도 3c는 AAVS1 로커스에서의 표적화 및 상동성 재조합을 나타낸다. H1 프로모터 (AAVS1-1a 내지 -1-3a)에 의해 발현된 3개의 gRNA, U6 프로모터 (AAVS-1-1 내지 -1-3)에 의해 발현된 3개의 gRNA, 및 gRNA를 표적화하지 않는 대조군의 서베이어 분석은 도 3a에 도시되어 있다. 도 3b는 AAVS-1 표적화 도너 벡터 (상부에는 AAVS1 로커스로 표기됨 (표지된 "AAVS1"))의 개략도 및 H1::AAVS1-3a gRNA 및 AAVS-1 표적화 벡터로의 전기천공 후 GFP-파지티브 H7 ES 세포 콜로니의 세포 이미징을 도시한다. 상동성 재조합에 의한 정확한 통합을 나타내는 표적화 접합 영역의 생어 (Sanger) 시퀀싱이 도 3c에 도시된다 (도시된 서열은 SEQ ID NO:31임).
도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 게놈에서 GN19NGG 및 AN19NGG 부위의 생물정보학적 분석을 보여준다. 인간 게놈에서의 CRISPR 부위의 빈도를 묘사하는 Circos 플롯이 도 4a에 도시되어있다. 외부 원은 인간의 크로모좀 기호를 묘사한다. 안쪽으로 이동하면서 GN19NGG (주황색), AN19NGG (청색), RN19NGG (보라색) CRISPR 부위 빈도는 크로모좀을 따라 표시된다. 원 안에는 인간 엑손 밀도 (흑색) 및 OMIM 질병 로커스 (청색)가 플롯팅된다. 게놈에서 CRISPR 부위 사이의 빈도와 간격이 도 4b에 도시되어 있다. 게놈에 있는 인접한 GN19NGG (주황색), AN19NGG (청색) 부위의 빈도와 간격의 막대그래프가 도시된다. 평균값과 중간값은 RN19NGG 부위를 포함하는 플롯 내에 삽입되어 있다. 도 4c는 인간 유전자 (좌측) 또는 OMIM 질환 로커스 (우측)에서의 GN19NGG 대 AN19NGG 부위 빈도의 막대그래프 정량화를 보여준다. 도 4d는 6개 게놈에서 GN19NGG 대 AN19NGG 빈도를 정량화한 막대그래프를 보여준다: 인간, 소, 마우스, 래트, 닭 및 지브라피쉬.
도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 도 5e 및 도 5f는 게놈에서 GN19NGG 및 AN19NGG 부위의 생물정보학적 분석을 보여준다. 인간 게놈에서 각 gRNA 부위의 밀도를 묘사한 3개 패널이 도시된다: GN19NGG (도 5a), AN19NGG (도 5b), 및 RN19NGG (도 5c). 각 플롯 내부에, CRISPR 부위의 밀도는 각 크로모좀에 따라 플롯팅된다. 반투명 (주황색, 청색 또는 보라색)으로 겹쳐진 것은 스무스 가우스 커널(SMOOTH gAUSSIAN kERNEI)로서 계산된 밀도 곡선이다. 점선은 35bp를 나타낸다; 기준으로서, 평균적으로 TALEN 표적화 부위는 매 35 염기 쌍을 발생시키는 것으로 추정되고, ZFN 부위는 매 2백 염기 쌍마다 발생한다 (Sander et al. (2011) Nature Methods 8:67-69; Cermak et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39(12):e82). 인간 크로모좀 당 누적 평균 CRISPR 표적화 밀도의 막대그래프가 도 5d에 도시된다. GN19NGG (주황색), AN19NGG (청색), 및 RN19NGG (보라색)는 각 CRISPR 부위를 나타낸다. 점선은 35 bp 기준을 나타낸다. 도 5e는 게놈에서 인접 CRISPR 부위 사이의 빈도와 간격을 보여준다. 게놈에 있는 인접한 GN19NGG (주황색) 및 AN19NGG (청색) 부위의 빈도와 간격의 막대그래프가 도시된다. 평균값과 중간값은 플롯 내부에 삽입되어 있다. 인간 게놈에서 모든 GN19NGG (왼쪽 위), AN19NGG (오른쪽 위) 및 RN19NGG (아래) 부위의 SeqLogo가 도 5f에 도시되어 있다.
도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 6d, 도 6e, 및 도 6f는 AT/GC 게놈 함량 및 CRISPR 부위 빈도를 보여준다: AT (청색) 또는 GC (주황색) 퍼센트는 인간, 소, 마우스, 래트, 닭 및 지브라피쉬 게놈에 대한 표시된다 (도 6a). AT/GC 함량으로 표준화된 GN19NGG (주황색) 및 AN19NGG (청색) 부위의 빈도가 표시된다 (도 6b). GN19NGG (좌측), AN19NGG (중간) 및 RN19NGG (우측) 부위에 대한 가닥 별 CRISPR 부위 빈도가 도 6c에 도시된다. 플러스 가닥 (왼쪽 열)은 청색-녹색으로 나타내고, 마이너스 가닥 (오른쪽 열)은 보라-적색으로 나타냈다. 드로소필라 (Drosophila), C. 엘레강스 (C.elgans) 및 S. 세레비시애 (S. cerevisiae)에서의 GN19NGG (주황색) 및 AN19NGG (청색) 부위 빈도는 도 6d에 나타내었다. 도 6e는 AT (청색) 또는 GC (주황색) 함량 퍼센트를 보여주고, 도 6f는 CRISPR 부위의 표준화된 빈도를 보여준다.
도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d는 H7 ES 세포에서 내인성 유전자 (MERTK)에서 AN19NGG의 CRISPR 표적화를 보여준다. MERTK 로커스 및 다양한 단백질 도메인의 개략도가 도 7a에 도시되어 있다. 엑손 2의 표적 부위는 더 큰 규모로 하기 도시되어 있으며, 이는 CRISPR AN19NGG 표적 부위 (도시된 서열은 SEQ ID NO: 32임)를 나타낸다. 서베이어 검정에 의한 엑손2에서 CRISPR 표적화의 정량화는 도 7b에 도시되어 있다. 엑손 2의 CRISPR 부위는 상부에 묘사되어 있으며, 다양한 프라이머 (화살표)가 서베이어 검정에 사용된다; F1:R1 및 F2:R2 둘 모두는 표적 부위에 걸쳐 있는 반면, 대조군 PCR 생성물, F3:R3은 표적 부위 바로 외부에 있다. 서베이어 검정으로부터의 겔은 아래에 도시되어 있으며, 3개의 대조군 생성물은 왼쪽에 도시되어 있으며, 표적화는 오른쪽에 도시되어 있다. 하부에 인델 % 빈도가 표시된다. 도 7c는 돌연변이 주의 생어 시퀀싱을 보여준다. 클로날 주를 분리하고 시퀀싱하였으며, 이는 AN19NGG 부위에서 CRISPR 표적화이 이러한 영역에서 돌연변이 유발을 발생시켰음을 나타낸다. 정렬된 크로마토그램은 클로닝된 6개의 독특한 돌연변이를 보여준다 (wt는 SEQ ID NO: 33이며; Δ12는 SEQ ID NO:34이며; Δ1는 SEQ ID NO:35이며; Δ2, +2는 SEQ ID NO:36이고; Δ6은 SEQ ID NO:37이며; Δ7는 SEQ ID NO:38임). 도 7d는 H7-유래된 RPE 세포에서 Mertk 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 레인 1, 3 및 4는 넉아웃 라인을 나타내며, 레인 2는 이형접합 주로부터의 발현을 나타낸다.
도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d는 U6 또는 H1 발현된 gRNA에 의한 온-표적 및 오프-표적 부위에서 유도된 오프-표적 히트 (off-target hits)의 분석을 보여준다. H1 프로모터 (청색) 또는 U6 프로모터 (주황색)의 적정량으로부터의 VEGFA T1 gRNA 발현 수준의 qRT-PCR 분석은 도 8a에 도시되어 있다. VEGFA T1의 온-표적 및 오프-표적 분석은 도 8b에 도시되어 있다. 서베이어 분석은 좌측에 나타내고, 미스매치를 갖는 오른쪽의 표적 서열은 적색으로 나타내었다 (T1, SEQ ID NO: 20; OT1-3, SEQ ID NO:21; OT1-4, SEQ ID NO: 22; OT1-6, SEQ ID NO:23; OT1-11, SEQ ID NO: 24). 도 8c는 VEGFA T3 표적을 갖는 도 8b와 동일하다 (VEGFA T3, SEQ ID NO: 25; OT3-1, SEQ ID NO: 26; OT3-2, SEQ ID NO: 27; OT3-4, SEQ ID NO: 28; OT3-18, SEQ ID NO:29). VEGFA T1의 온-표적 내지 오프-표적 특이성은 도 8d에 도시되어 있다. H1 프로모터 (청색) 또는 U6 프로모터 (주황색) 사이의 온-표적 돌연변이유발/오프-표적 돌연변이 유발의 비율이 표시된다. 1.0에서의 점선 아래의 값은 온-표적 돌연변이 유발보다 더 큰 오프-표적 돌연변이 유발을 나타낸다. 모든 부분에 대해, 온-표적 및 오프-표적 부위는 문헌 [Fu et al. ((2013) Nat. Biotechnol. 31(9):822-6) and Cho et al. ((2014) Genome Research 24:132-141)]에 표지된다.
도 9a 및 도 9b는 CRISPR 표적화를 위한 gRNA를 발현하는데 있어서 U6 대 H1 프로모터의 특성을 보여준다. 도 9a의 상부 도표는 내인성 인간 U6 프로모터 및 전사 개시 부위를 보여준다 (SEQ ID NO: 39). 도 9a의 하부 도표는 다양한 +1 뉴클레오티드를 갖는 gRNA를 추진하기 위한 U6 프로모터의 용도를 나타낸다. U6이 개시하기 위해 G를 필요로 하기 때문에 (상단 왼쪽), A (상단 오른쪽), C (하단 왼쪽), 또는 T (하단 왼쪽)로 시작되는 패널은 아마도 첫 번째 다운스트림 G를 개시하여 절두된 gRNA로 이어진다 (U6:GN19NGG는 SEQ ID NO:40임; U6:AN19NGG는 SEQ ID NO:41임; U6:CN19NGG는 SEQ ID NO:42임; U6:TN19NGG는 SEQ ID NO:43임). 도 9b의 상부 도표는 내인성 인간 H1 프로모터 및 전사 개시 부위를 보여준다 (SEQ ID NO: 44). 도 9b의 하부 도표는 다양한 +1 뉴클레오티드를 갖는 gRNA를 추진하기 위한 H1 프로모터의 용도를 나타낸다. H1은 전장 gRNA를 유도하는 G (왼쪽 위) 또는 A (오른쪽 위)로 시작할 수 있다. 또한, H1은 C 및 T 뉴클레오티드에서 개시하는 전사를 허용하며, 이는 H1 프로모터의 임의의 +1 뉴클레오티드 다운스트림에 대한 전장 전사물에 대해 허용될 것으로 보고되었다 (H1: GN19NGG는 SEQ ID NO: 45이고, H1: AN19NGG는 SEQ ID NO: 46이고, H1: CN19NGG는 SEQ ID NO: 47이고, H1: TN19NGG는 SEQ ID NO: 48임).
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d, 및 도 10e는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 동시에 발현시키기 위해 양방향성 프로모터로서 H1 프로모터의 사용을 보여준다. 좌측 (마이너스 가닥)을 향한 pol II 전사물로서 Cas9 및 우측 (플러스 가닥)을 향한 pol III 전사물로서 가이드 RNA를 발현시키는 양방향성 H1 프로모터가 도시된다 (도 10a). 전체 발현 카세트는 약 4.4kb이다. 도 10b는 양방향성 H1 작제물로부터 CRISPR-매개된 절단을 유도하는 능력을 시험하기 위해 사용된 작제물을 나타낸다. eGFP를 표적화하는 gRNA를 사용하는 양방향성 작제물을 플라스미드 내로 클로닝시키고, GFP를 발현시키는 인간 줄기 세포에서 발현시켰다. GFP의 손실은 시각적으로 검출되며 (중간 패널, 화살촉), 이는 발현 작제물로 인한 GFP의 성공적인 발현 및 표적화를 나타낸다 (도 10c). 성공적인 CRISPR 표적화는 또한, 레인 2 및 3에서 2개의 밴드의 존재로 서베이어 검정을 통해 도시된다 (도 10d). 아데노-관련 바이러스의 패키징 범위 내에 있는 ~ 4.75b의 컴팩트 표적화 카세트를 생성하기 위해 H1 프로모터를 사용한 양방향성 CRISPR 작제물은 도 10e에 도시된다. SV40 종결인자는 주황색으로 표시되며, 작제물은 바이러스 생성에 필요한 반전 말단 반복부 (ITR) 서열에 측면 인접한다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 가이드 RNA의 5' 말단을 생성하기 위한 해머헤드 리보자임 (Hammerhead Ribozyme)을 도시한다. 5' 시스-해머헤드 리보자임 (SEQ ID NO: 49) 및 gRNA (SEQ ID NO: 50)의 도해가 도 11a에 도시된다. 해머헤드 리보자임의 서열이 표시되고, 촉매 작용에 중요한 뉴클레오티드가 표시된다 (적색은 매우 중요함, 주황색은 중요함). 절단 위치는 화살표로 표시된다. 리보자임 절단시 (하부), 생성된 gRNA는 새로 형성된 5' 위치에서의 어떠한 뉴클레오티드에 대한 제약 없이 방출된다. 해머헤드-gRNA를 발현하는 작제물은 도 11b에 도시된다. 프로모터 일반적으로, U6, H1 또는 T7과 같은 pol III 프로모터는 5' 시스-해머헤드 리보자임을 발현하는데 이용될 수 있으며, 이는 자가-절단 후 gRNA를 방출시킬 것이다. 2개의 로커스의 표적화는 서베이어 검정 (HH1 = SEQ ID NO:51; HH2 = SEQ ID NO: 52)으로 나타냈으며, 5' 시스-해머헤드 리보자임에 의해 성공적인 절단 (화살표)을 갖는다 (도 11c).
도 12는 특이적 앱타머의 존재하에 gRNA를 처리하기 위해 앱타자임을 사용하는 조절가능한 CRISPR 작제물을 보여준다. 특히, 도 12는 gRNA의 5' (청색)인 테오필린 앱타자임을 형성하는 해머헤드 리보자임의 헬릭스 II에 융합된 테오필린 앱타머 (주황색)를 도시한다. 테오필린의 결합은 헬릭스 II를 안정화시키고 이어서 해머헤드 자가-절단을 허용하고 gRNA (SEQ ID NO: 50)를 자유롭게 한다. Cas9와 함께 gRNA는 현재 CRISPR 시스템에 의한 절단을 표적으로 할 수 있다. 해머헤드 리보자임, SEQ ID NO: 55.
도 13은 H1RNA 및 PARP-2 로커스의 게놈 구성을 보여준다. 상기 도시된 것은 오른쪽으로 전사된 PARP-2 유전자 (청색) 및 왼쪽으로 전사된 H1RNA 유전자 (주황색)를 묘사한다 (축척으로 도시됨). 두 유전자 모두에 대한 프로모터 영역의 확대된 영역이 하부에 도시된다.
도 14는 H1 pol II 활성에 대한 eGFP 리포터를 보여준다. 인간 H1 프로모터 서열은 우측으로의 eGFP의 pol II 전사로 배향된다. 최적화될 3개의 성분은 이탤릭체로 표시된다.
도 15는 eGFP 리포터 발현을 보여준다. 상부 패널은 내인성 H1 프로모터를 나타내며, 하부 패널은 Kozak 서열을 갖는 발현을 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 Cas9 및 gRNA의 양방향성 발현을 보여준다. 양방향성 표적화 작제물의 개략도가 도 16a에 도시된다. 표준의 2개 벡터 전달 (레인 2 및 5) 또는 단일 표적화 플라스미드의 전달 (레인 3 및 6)을 이용한 2개의 상이한 로커스에서의 절단 비교가 도 16b에 도시된다. T7EI 검정에 의해 측정된 바와 같은 게놈 변형%는 각 레인 아래에 표시된다.
도 17은 hRho:GFP 노킨 (knockin) 마우스로부터의 로돕신 로커스를 보여준다. 상부에서 각 마우스 및 인간 서열은 3'UTR의 말단에 대한 rho 프로모터 영역의 도식 위에 나타낸다 (축척으로 도시됨). 하부에서 P23 및 gRNA의 위치를 나타내는 확대된 영역이 아래 도시된다 (화살촉).
도 18a, 도 18b, 및 도 18c는 생체내에서 P23H 대립 유전자의 특이적 표적화를 나타낸다. 도 18a는 P23 표적화를 보여준다 (WT(C57BL/6J, SEQ ID NO:56; P23H(CCC→CAC), SEQ ID NO:57; WT(CAST/EiJ), SEQ ID NO:58). 도 18b는 2개의 야생형 마우ㅡ 계통으로부터의 로돕신의 시퀀싱을 보여준다; SNP는 화살표로 나타낸다 (C57BL/6J DNA 서열, SEQ ID NO:56; C57BL/6J 단백질 서열, SEQ ID NO:59; CAST/EiJ+/+ DNA 서열, SEQ ID NO:58; CAST/EiJ+/+ 단백질 서열, SEQ ID NO:59). 도 18c는 P23H 육종 체계를 도시한다 : P23H 동형접합 마우스 (흑색)는 WT Cast (백색)와 교차하고, 생성된 이형접합 새끼 (회색)는 AAV5의 망막하 전달에 의해 처리될 것이다.
도 19는 로돕신 로커스의 대립 형질-특이적 표적화를 보여준다. C57BL/6J (P23H) 대립 유전자의 절단 대 단일 염기 미스매치 (Cast)의 비교가 도시된다. T7EI 검정에 의해 측정된 게놈 변형%는 아래에 표시된다.
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상세한 설명
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게놈-편집 기법 예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) (Porteus, and Baltimore (2003) Science 300: 763; Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785; Sander et al. (2011) Nature Methods 8:67-69; Wood et al. (2011) Science 333:307) 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) (Wood et al. (2011) Science 333:307; Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Christian et al. (2010) Genetics 186:757-761; Miller et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148; Zhang et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:149-153; Reyon et al. (2012) Nat. Biotechnol. 30:460-465)는 표적화된 게놈 변형을 일으키고 정확하게 질병 돌연변이를 수정할 수 있는 가능성을 부여하는 능력이 부여된다. 이들 기술은 효과적이지만, ZFN 및 TALEN 쌍 모두 주어진 DNA 표적 부위에 크고 고유한 인식 단백질을 합성해야하므로 현실적인 한계에 직면해 있다. 몇몇 그룹은 최근 이러한 핵심적 한계를 회피한 조작된 타입 II CRISPR/Cas9 시스템의 사용을 통한 고효율 게놈 편집을 보고했다 (Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Jinek et al. (2013) eLife 2:e00471; Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Cho et al. (2013) Nat. Biotechnol . 31:230-232; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol . 31:227-229). 상대적으로 시간 소모적이고 제조하기 까다로운 ZFN 및 TALEN과는 달리, 합성 가이드 RNA (gRNA)와 커플링된 Cas9 단백질의 뉴클레아제 활성에 의존적인 CRISPR 작제물은 합성이 빠르고 간단하며 다중화될 수 있다. 그러나, 상대적으로 용이한 이들의 합성에도 불구하고, CRISPR은 Cas9 자체의 특성 및 이의 gRNA의 합성 둘 모두와 함수 관계에 있는, 표적화 가능한 공간으로의 이들의 접근과 관련된 기술적 제약을 갖는다.
CRISPR 시스템에 의한 절단은 20-뉴클레오티드 DNA 서열에 대한 gRNA의 상보적 염기쌍 및 필요한 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) 즉, 표적 부위에 대한 3'에서 발견된 짧은 뉴클레오티드 모티프를 필요로 한다 (Jinek et al. (2012) Science 337: 816-821). 이론적으로 CRISPR 기술을 사용하여 게놈에서 임의의 고유한 N20-PAM 서열을 표적화할 수 있다. 한 가지 제약은 사용된 특이적 Cas9의 기원 종에 따라 달라지는 PAM 서열의 DNA 결합 특이성이다. 현재 가장 제약이 없으며 가장 일반적으로 사용되는 Cas9 단백질은 S. 피로게네스로부터 비롯되며, 이는 서열 NGG를 인식하며, 따라서 게놈에서 임의의 고유의 21-뉴클레오티드 서열에 이은 2개의 구아노신 뉴클레오티드 (N20NGG)가 표적화될 수 있다. 단백질 성분에 의해 부과된 이용가능한 표적화 공간의 확장은 변형된 PAM 요건을 갖는 신규한 Cas9 단백질의 발견 및 사용 (Conget al. (2013) Science 339 : 819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110(39):15644-9), 또는 진행중인 돌연변이유발 또는 유도된 진화를 통한 신규한 Cas9 변종의 생성으로 제한된다. CRISPR 시스템의 두 번째 기술적 제약은 5' 구아노신 뉴클레오티드에서 시작되는 gRNA 발현으로부터 발생한다. 타입 III 클래스의 RNA 중합효소 III 프로모터의 사용은 gRNA 발현에 특히 적합한데, 이러한 짧은 비-코딩 전사물은 잘 규정된 말단을 가지고 있고, 1+ 뉴클레오티드를 배제한 전사에 필요한 모든 요소가 업스트림 프로모터 영역에 함유되어 있기 때문이다. 그러나, 일반적으로 사용되는 U6 프로모터는 전사를 개시하기 위해 구아노신 뉴클레오티드를 필요로 하기 때문에, U6 프로모터의 사용은 게놈 표적화 부위를 GN19NGG로 추가로 제한한다 (Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Ding et al. (2013) Cell Stem Cell 12:393-394). T7, T3 또는 SP6 프로모터에 의한 시험관내 전사와 같은 대안적인 접근법은 또한 구아노신 뉴클레오티드(들) 개시를 필요로 할 것이다 (Adhya et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:147-151; Melton et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:7035-7056; Pleiss et al. (1998) RNA 4:1313-1317).
본원에 기재된 내용은 5' 뉴클레오티드의 변형된 특이성으로 인해 많은 게놈에서 CRISPR/Cas9 시스템의 정밀도를 두 배 이상 향상시키는 가이드 RNA (gRNA 또는 sgRNA)를 발현시키는 H1 프로모터의 용도 발견에 관한 것이다. gRNA를 발현시키기 위해 H1 프로모터를 사용하여 내인성 유전자를 발현 및 변형시키는 능력은 AN19NGG 및 GN19NGG 게놈 부위 둘 모두를 표적으로하는데 사용될 수 있다. AN19NGG 부위는 인간 게놈의 GN19NGG 부위보다 15% 초과로 빈번하게 발생하며, 표적화 공간의 확장 또한 인간 유전자 및 질병 로커스에서 풍부해진다. 따라서, 현재 개시된 내용은 인간 게놈 및 다른 진핵 생물 종 내의 표적화 공간을 두 배 초과로 함으로써 CRISPR 기술의 다능성을 향상시킨다. 게다가, 이러한 변형은 기존의 CRISPR, TALEN 또는 Zinc-핑거 기술보다 인간 게놈에서 더 높은 해상도의 표적화를 허용한다.
또한, 본원에 기재된 내용은 Cas9 및 gRNA를 동시에 발현시키기 위한 양방향성 프로모터로서의 H1 프로모터 서열의 사용이 바이러스 벡터에 의해 삽입 및 전달될 수 있는 컴팩트한 완전-기능성 발현 카세트의 생성을 허용한다는 발견에 관한 것이다.
본원에 기재된 내용은 또한 RNA 리보자임 및 조절가능한 앱타자임의 생체 내에서의 gRNA 발현을 발현 및 조절하기 위한 용도에 관한 것이다.
I. H1 프로모터를 사용한 CRISPR 가이드 RNA의 발현
A. 조성물
일부 구체예에서, 본원에 기재된 내용은 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및 b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 내용은 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질이 DNA 분자를 전달하고, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형되는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 한 양태에서, 표적 서열은 임의의 뉴클레오티드 예를 들어, N20NGG로 시작하는 표적 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 GN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 CN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 TN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG 또는 GN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 추가의 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 기재된 내용은 또한, 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 전사를 한 방향으로 제공하는 조정 요소로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, 조정 요소; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 반대 방향으로 제공하는 조정 요소를 포함하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하며, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형된다. 한 양태에서, 표적 서열은 임의의 뉴클레오티드 예를 들어, N20NGG로 시작하는 표적 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 GN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 CN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 TN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG 또는 GN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 추가의 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
일부 구체예에서, CRISPR 복합체는 세포의 핵 (예를 들어, 진핵 세포)에서 검출 가능한 양으로 CRISPR 복합체의 축적을 유도하기에 충분한 강도의 하나 이상의 핵 편재 서열을 포함한다. 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 진핵 생물에서 CRISPR 복합체 활성을 위한 핵 편재화 서열은 필요하지 않으나, 그러한 서열을 포함하는 것은 특히 핵에서 핵산 분자를 표적화하는 것과 같ㅇ,S 시스템의 활성을 향상시키는 것으로 여겨진다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소는 타입 II CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소는 Cas9 효소이다. 일부 구체예에서, Cas9 효소는 S. 뉴모니애(S. pneumoniae), S. 피오게네스(pyogenes) 또는 S. 써모필루스(S. thermophilus) Cas9이고, 이들 유기체로부터 유래된 변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다.
일반적으로, 본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "벡터"는 핵산 분자로서 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 비제한적으로, 단일-가닥, 이중-가닥 또는 부분적 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단, 비 자유 말단 (예를 들어, 환형)을 포함하는 핵산 분자; DNA, RNA 또는 이 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 것으로서, 여기에 예컨대, 표준 분자 클로닝 기법에 의해 추가적인 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 바이러스-유도된 DNA 또는 RNA 서열은 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스) 내로 패키징하기 위한 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 형질감염을 위한 바이러스에 의해 운반된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에서 유용한 일반적인 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본원에 기재된 내용의 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용되도록 즉, 발현될 핵산 서열에 작동가능하게-연결되도록 숙주 세포를 기반을 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입도는 경우 숙주 세포에서) 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하고자 한다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 기타 발현 조정 요소 (예를 들어, 전사 종결 신호 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 요소는 예를 들어, 문헌 [Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif]에 기술되어 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 항시적 발현을 지시하는 요소 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 요망되는 관심 조직 예컨대, 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관 (예를 들어, 간, 췌장), 또는 특정 세포 유형 (예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 또한 조직 또는 세포-유형 특이적일 수 있거나 아닐 수 있는 세포-주기 의존성 또는 발달 단계-의존적 방식과 같은 일시적-의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 비제한적으로 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예는 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (선택적으로 CMV 인핸서를 가짐) (예를 들어, Boshart et al (1985) Cell 41:521-530), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
또한, 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소 예컨대, WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 세그먼트 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol.8:466-472); SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열(O’Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78(3):1527-31)이 포함된다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 엔코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 전사물, 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다 (예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이의 돌연변이체, 이의 융합 단백질 등). 유익한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 유형의 세포를 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 결합 분석으로부터 규정된 로커스(유전자자리), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 쇼트-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후 예컨대, 라벨링 성분과의 컨주게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 기재된 내용의 양태에서, 용어 "키메라 RNA", "키메라 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일 가이드 RNA" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호교환적으로 사용되며 가이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 특정하는 가이드 RNA 내의 약 20bp 서열을 지칭하며, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "야생형"은 당업자가 이해하는 당해 분야의 용어이며, 변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자 또는 특성의 전형적인 형태를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 자연에서 발생하는 것에서 벗어나는 패턴을 갖는 품질의 발휘를 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "비-천연 발생" 또는 "조작된"은 상호교환적으로 사용되며 인간의 수조작과 관련됨을 나타낸다. 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 언급할 때 이러한 용어는, 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 이들과 함께 자연계에서 자연적으로 회합되고 자연에서 발견되는 것으로서 적어도 하나의 다른 성분을 적어도 실질적으로 갖지 않음을 의미한다.
"상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 또는 다른 비-전통적 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제 2 핵산 서열과 수소 결합 (예를 들어, 왁슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자에서 잔기의 백분율을 나타낸다 (예를 들어, 10개 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개가 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적임). "완벽한 상보성"은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기가 제 2 핵산 서열의 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합한다는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "실질적으로 상보적인"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 엄격한 조건하에 혼성화하는 2개의 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 혼성화에 대한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 상보성을 갖는 핵산이 표적 서열과 주로 혼성화되고 비-표적 서열에는 실질적으로 혼성화되지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 많은 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화되는 온도가 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적 예는 문헌 [Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.]에 상세히 기술되어 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍, 호그스테인 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 이중 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가 혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단과 같은보다 광범위한 과정에서 한 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화될 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보체 (complement)"라고 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사물 내로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사물 및 엔코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 생성물"이라고 할 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유도되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비 아미노산에 의해 방해될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 폴리머; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 리피드화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 예컨대, 라벨링 성분과의 컨쥬게이션을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 모두, 및 아미노산 유사체 및 펩티도모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
본원에 기재된 내용의 실시는 달리 기술되지 않는 한 당해 기술 범위 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상적 인 기술을 사용한다 (Sambrook, Fritsch and Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition; Ausubel et al., eds. (1987) Current Protocols in Molecular Biology); MacPherson et al., eds. (1995) Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney, ed. (1987) Animal Cell Culture).
본원에 기재된 내용의 여러 양태는 하나 이상의 벡터, 또는 그러한 벡터를 포함하는 벡터 시스템 또한, 박테 자체에 관한 것이다. 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사물 (예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 대장균과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.]에서 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 전사되고 번역될 수 있다.
벡터는 원핵 생물에서 도입되고 증식될 수 있다. 일부 구체예에서, 원핵생물은 진핵 세포 내로 도입될 벡터의 복사체를 증폭시키기 위해 또는 진핵 세포로 도입될 벡터의 생성에서 중간 벡터로서 사용된다 (예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드를 증폭시킴). 일부 구체예에서, 원핵생물은 벡터의 복사체를 증폭시키고 하나 이상의 핵산을 발현시키고, 예컨대, 숙주 세포 또는 숙주 유기체로 전달하기 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공하기 위해 사용된다. 원핵생물에서의 단백질의 발현은 거의 대게 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 항시적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 갖는 대장균에서 수행된다.
융합 벡터는 그 안에 엔코딩된 단백질, 예컨대 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 첨가한다. 이러한 융합 벡터는 (i) 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 것; (ii) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키는 것; 및 (iii) 친화성 정제에서 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제를 돕는 것과 같은 하나 이상의 목적을 수행할 수 있다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 분해 절단 부위가 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 단백질의 정제에 후속하여 융합 모이어티로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있다. 이러한 효소 및 이들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A 각각을 표적 재조합 단백질로 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
적합한 유동성 비-융합 대장균 발현 벡터의 예는 pTrc (Amrann et al. (1988) Gene 69:301-315) 및 pET 11d (Studier et al. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.)를 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세리비새 (Saccharomyces cerivisae)에서의 발현 벡터의 예로는 pYepSec1 (Baldari, et al.(1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) 및 picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 하나 이상이 서열의 발현을 추진할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8을 포함한다 (Seed (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조정 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용된 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 시미안 바이러스 40, 및 본원에 기재되고 당업계에 공지된 기타의 것으로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 기타 적합한 발현 시스템에 있어서, 예를 들어, 문헌 [Chapters 16 and 17 of Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조하시오.
일부 구체예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산의 발현을 유도할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현하는데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적 예는 알부민 프로모터 (간-특이적; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), 림프구-특이적 프로모터 (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol 43: 235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J.8: 729-733) 및 면역글로불린 (Baneiji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), 뉴론-특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 5473-5477), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund et al.(1985) Science 230: 912-916) 및 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 우유 유청 프로모터; 미국 특허 번호 4,873,316 및 유럽 출원 공개 번호 264,166)를 포함한다. 발달-조절된 프로모터 예를 들어, 쥣과 hox 프로모터 (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) 및 α-페토단백질 프로모터 (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev.3: 537-546)가 또한, 포함된다.
일부 구체예에서, 조절 요소는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하도록 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, SPIDR (Spacer Interspersed Direct Repeats)로서 또한 공지된 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)는 일반적으로 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 로커스의 패밀리를 구성한다. CRISPR 로커스는 대장균에서 인식된 구별되는 부류의 산재성 짧은 서열 반복부 (SSR)의 구별되는 부류 (Ishino et al. (1987) J. Bacteriol., 169:5429-5433; and Nakata et al. (1989) J. Bacteriol., 171:3553-3556) 및 관련 유전자를 포함한다. 유사한 산재성 SSR은 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 아나배나(Anabaena), 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다 (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol., 10:1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis., 5:254-263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30; and Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol., 17:85-93). CRISPR 로커스는 전형적으로, 짧은 규칙적 간격의 반복부로 불리는 반복부의 구조에 의해 기타 SRSR과 상이하다 (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33; and Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol., 36:244-246). 일반적으로, 반복부는 실질적으로 일정한 길이의 독특한 개재 서열에 의해 규칙적으로 이격된 클러스터에서 발생하는 짧은 요소이다 (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol., 36:244-246). 반복 서열은 균주간에 고도로 보존되지만, 산재된 반복부의 수 및 스페이서 영역의 서열은 전형적으로 균주마다 다르다 (van Embden et al. (2000) J. Bacteriol., 182: 2393-2401). CRISPR 로커스는 비제한적으로, 애로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 설폴로부스(Sulfolobus), 아르캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로카르쿨라(Halocarcula), 메탄박테리움(Methanobacterium), 메타노코쿠스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피루스(Methanopyrus), 피로코쿠스(Pyrococcus), 피크로필러스(Picrophilus), 테르니오플라스니아(Thernioplasnia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴프릭스(Aquifrx), 포르프브로모나스(Porphvromonas), 클로로비움(Chlorobium), 테르무스(Thermus), 바실루스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 써모아내로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자르쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 제오박터(Geobacter), 마이로코커스(Myrococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 월리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스체리치아(Escherichia), 레지오넬라(Legionella), 메틸로코커스(Methylococcus), 파스테우렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 크산토모나스(Xanthomonas), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema) 및 써모토가(Thermotoga)를 포함하는 40개 이상의 원핵 생물에서 확인되었다 (Jansen et al. (2002) Mol. Microbiol., 43: 1565-1575, Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-82).
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 CRISPR-관련 ( "Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 요소를 집합적으로 지칭하며, Cas 유전자를 엔코딩하는 서열, 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 상황에서 "스페이서"로서 또한 언급됨), 또는 CRISPR 로커스로부터의 다른 서열 및 전사물을 포함한다. 일부 구체예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 타입 I, 타입 II 또는 타입 III CRISPR 시스템으로부터 유도된다. 일부 구체예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 상황에서 프로토스페이서로서 또한 언급됨)의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소를 특징으로 한다.
CRISPR 복합체의 형성과 관련하여, "표적 서열"은 이에 대한 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기에서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발시키고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 진핵 세포의 소기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 내부에 존재할 수 있다. 표적 서열을 포함하는 표적화된 로커스 내로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드" 또는 "편집 서열"로서 언급된다. 본원에 기재된 내용의 양태에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형으로서 언급될 수 있다. 본원에 기재된 내용의 양태에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
일부 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위 예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 (또한 "클로닝 부위"로서 언급됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 삽입 부위 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 삽입 부위)가 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물은 세포 내 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 대하여 CRISPR 활성을 표적화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 그 초과의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 그러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있고, 선택적으로 세포에 전달될 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 엔코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체, 또는 그의 변형된 형태를 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있다; 예를 들어, S. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노한 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 SwissProt 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 일부 구체예에서, 변형되지 않은 CRISPR 효소는 Cas9와 같은 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소는 Cas9이고, S. 피오게네스 또는 S. 뉴모니애로부터의 Cas9일 수 있다.
일부 구체예에서, CRISPR 효소는 표적 서열 내부 및/또는 표적 서열의 상보체 내부와 같은 표적 서열의 위치에서 한 가닥 또는 두 가닥 모두의 절단을 지시한다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 또는 그 초과의 염기 쌍 내의 한 가닥 또는 두 가닥 모두의 절단을 지시한다. 일부 구체예에서, 벡터는 변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리 뉴클레오티드의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단하는 능력이 결여되도록, 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 엔코딩한다.
일부 구체예에서, CRISPR 효소를 엔코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 사람이 아닌 영장류를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유류와 같은 특정 유기체의 진핵 세포일 수 있거나 이러한 특정 유기체로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는, 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 그 초과의 코돈)을 숙주 세포의 유전자에서 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용된 코돈으로 대체시킴으로써 관심 숙주세포에서 향상된 발현을 위한 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 바이어스를 나타낸다. 코돈 바이어스 (코돈 사용의 유기체간의 차이)는 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 관련이 있으며, 이는 이어서 특히, 특정 전달 RNA (tRNA) 분자의 이용가능성 및 번역되는 코돈의 특성에 의존적인 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRAN의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들어 "코돈 사용 데이터베이스 (Codon Usage Database)"에서 쉽게 입수가능하며, 이들 표는 여러 가지 방식으로 적용될 수 있다. 문헌 [Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28:292] 참조. Gene Forge (Aptagen, Jacobus, Pa.)와 같은 특정 숙주 세포에서 발현을 위한 특정 서열을 최적화하는 코돈에 대한 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용 가능하다. 일부 구체예에서, CRISPR 효소를 엔코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 그 초과 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용된 코돈에 상응한다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화되고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하도록 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구체예에서, 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 97.5%, 99% 또는 그 초과이다. 서열을 정렬시키기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 최적의 정렬이 결정될 수 있으며, 상기 알고리즘의 비제한적 예는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler Transform을 기반으로 하는 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 입수가능), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 입수가능)를 포함한다. 일부 구체예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구쳬예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 길이이다.
CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험할 가이드 서열을 포함하여 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예컨대, CRISPR 서열의 성분을 엔코딩하는 벡터로 형질감염시킴으로써 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공되고, 이어서 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 서베이어 검정에 의해 표적 서열 내부의 선택적 절단이 평가될 수 있다. 유사하게는, 표적 폴리 뉴클레오티드 서열의 절단은 테스트 튜브에서, 표적 서열, 테스트하고자 하는 가이드 서열 및 테스트 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 테스트 가이드 서열 반응과 대조군 가이드 서열 반응 간의 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자가 고안할 수 있을 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적으로 하도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 고유한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인 (CRISPR 효소 이외에 예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 부가적인 단백질 서열 및 선택적으로, 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는 비제한적으로, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 비제한적으로, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed , DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함하는 자동형광 단백질을 포함한다. CRISPR 효소는 비제한적으로, 말토오스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체 및 단순 포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 엔코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 부가적인 도메인은 참조로서 본원에 통합된 US20110059502에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 태깅된 CRISPR 효소가 표적 서열의 위치를 확인하는데 사용된다.
본원에 기재된 내용의 양태에서, 비제한적으로 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed , DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함하는 자동형광 단백질을 포함하는 리포터 유전자가 세포 내로 도입되어 유전자 단백질을 엔코딩할 수 있으며, 이는 마커로서 작용하며 이에 의해 유전자 생성물의 발현의 변화 또는 변형이 측정된다. 본원에 기재된 내용의 추가의 구체예에서, 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자는 벡터를 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 기재된 내용의 바람직한 구체예에서, 유전자 생성물은 루시퍼라제이다. 본원에 기재된 내용의 추가의 구체예에서, 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
일반적으로, 본원에 기재된 내용의 프로모터 구체예는 하기를 포함한다: 1) TATA 박스, PSE (Proximal Sequence Element) 및 DSE (Distal Sequence Element)를 포함하는 완전한 Pol III 프로모터; 및 2) 역방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 PSE 및 TATA 박스를 포함하는 제 2의 기본적인 Pol III 프로모터. 이의 뉴클레오티드 서열을 따라 이름을 딴 TATA 박스는 Pol III 특이성의 주요 결정인자이다. 전사된 서열에 대해 nt. -23 내지 -30 사이의 지점에 일반적으로 위치하며, 전사된 서열의 시작의 주요 결정인자이다. PSE는 일반적으로 nt. -45 내지 -66 사이에 위치한다. DSE는 기본 Pol III 프로모터의 활성을 향상시킨다. H1 프로모터에서, PSE와 DSE 사이에 갭이 없다.
양방향성 프로모터는 1) 3개의 외부 조정 요소 DSE, PSE 및 TATA 박스를 함유하는 완전한 통상적인 단방향성 Pol III 프로모터; 및 2) 역방향으로 DSE의 5' 말단에 융합된 PSE 및 TATA 박스를 포함하는 제 2의 기본 Pol III 프로모터로 구성된다. TATA 결합 단백질에 의해 인식되는 TATA 박스는 Pol III를 프로모터 영역으로 모집시키는데 필수적이다. TATA 박스로의 TATA 결합 단백질의 결합은 SNAPc와 PSE의 상호작용에 의해 안정화된다. 함께, 이들 요소는 Pol III를 정확하게 위치시켜 발현된 서열을 전사시킬 수 있다. DSE는 또한, Pol III 프로모터의 완전한 활성에 필수적이다 (Murphy et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12:3247-3261; Mittal et al. (1996) Mol. Cell Biol. 16:1955-1965; Ford and Hernandez (1997) J.Biol.Chem., 272:16048-16055; Ford et al. (1998) Genes, Dev., 12:3528-3540; Hovde et al. (2002) Genes Dev. 16:2772-2777). 전사는 DSE 내에서 전사 인자 Oct-1 및/또는 SBF/Staf와 이들의 모티프의 상호작용에 의해 100 배까지 향상된다 (Kunkel and Hixon (1998) Nucl. Acid Res., 26: 1536-1543). 전방향 및 역방향 배향된 기본 프로모터가 이중-가닥 DNA 주형의 반대 가닥 상에 서열의 전사를 유도하기 때문에, 역방향 배향된 기본 프로모터의 파지티브 가닥이 DSE의 네거티브 가닥의 5' 말단에 부가된다. H1 프로모터의 제어하에 발현된 전사물은 4 또는 5 T의 비파괴된 서열에 의해 종결된다.
H1 프로모터에서, DSE는 PSE와 TATA 박스에 인접해있다 (Myslinski et al. (2001) Nucl. Acid Res. 29: 2502-2509). 서열 반복을 최소화하기 위해, 이 프로모터는 U6 프로모터로부터 유래된 PSE 및 TATA 박스를 부가함으로써 역방향으로의 전사가 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향으로 만들어졌다. 양방향 H1 프로모터의 작제를 용이하게 하기 위해, 작은 스페이서 서열이 또한, 역방향 배향된 기본 프로모터와 DSE 사이에 삽입될 수 있다.
B. 방법
일부 구체예에서, 본원에 기재된 내용은 또한 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 세포 내로 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, H1 프로모터; 및 b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 내용은 또한, 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 세포 내로 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, H1 프로모터; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하며, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형되는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함한다. 한 양태에서, 표적 서열은 임의의 뉴클레오티드 예를 들어, N20NGG로 시작하는 표적 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 GN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 CN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 TN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG 또는 GN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 기재된 내용은 또한, 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 세포 내로 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는 a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 전사를 한 방향으로 제공하는 조정 요소로서, gRNA는 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, 조정 요소; 및 b) 타입-II Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 반대 방향으로 제공하는 조정 요소를 포함하며, 이에 의해 gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단시키며, 이에 의해 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 변형된다. 한 양태에서, 표적 서열은 임의의 뉴클레오티드 예를 들어, N20NGG로 시작하는 표적 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 GN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 CN19NGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 TN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 AN19NGG 또는 GN19NGG를 포함한다. 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 또 다른 양태에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 추가의 양태에서, 진핵 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 내용은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 벡터, 이의 하나 이상의 전사물, 및/또는 이로부터 전사된 하나 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 내용은 상기 방법에 의해 생성된 세포, 및 상기 세포를 포함하거나 이로부터 생성된 유기체 (예컨대, 동물, 식물 또는 진균류)를 추가로 제공한다. 일부 구체예에서, 가이드 서열과 조합된 (및 임의로 복합된) CRISPR 효소가 세포에 전달된다. 통상적인 바이러스성 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 포유류 세포 또는 표적 조직에서 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 CRISPR 시스템의 성분을 엔코딩하는 핵산을 배양 중인 세포 또는 숙주 유기체에 투여하는데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA (예를 들어, 본원에 기재된 벡터의 전사물), 네이키드 핵산, 및 리포솜과 같은 전달 비히클과 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스성 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로의 전달 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는다. 유전자 요법 절차에 대한 검토에 있어서는, 문헌 [Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel and Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217; Mitani and Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1998) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36; Kremer and Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddada et al. (1995) Current Topics in Microbiology and Immunology. Doerfler and Bohm (eds); and Yu et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26]을 참조하시오.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 마이크로인젝션, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질: 핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 DNA 흡수 강화제를 포함한다. 리포펙션은 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 시중에서 판매된다 (예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024에 기재된 것들을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)으로 수행될 수 있다.
표적화된 리포솜 예컨대, 면역지질(immunolipid) 복합체를 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297: Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389; Remy et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654; Gao et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722; Ahmad et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820; U.S. Pat. No. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787).
핵산 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특정 세포에 대해 표적화시키고 바이러스 페이로드를 핵으로 수송(trafficking)하기 위한 고도로 발달된 공정을 이용한다. 바이러스 벡터는 (생체 내에서) 환자에게 직접 투여될 수 있거나 시험관내에서 세포를 처리하는데 사용될 수 있으며, 변형된 세포는 선택적으로 환자에게 투여될 수 있다 (생체 외). 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 종종 삽입된 전이유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 많은 다양한 세포 유형 및 표적 조질에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 이종 엔벨로프 단백질을 혼입시킴으로써 변화될 수 있으며, 표적 세포의 잠재적인 표적 군집을 확장시킨다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 도입시키거나 감염시키고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존적일 것이다. 레트로바이러스 벡터는 6-10 kb 이하의 이종 서열에 대한 패키징 용량을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이어서 이는 치료학적 유전자를 표적 세포로 통합시켜 영구적 전이유전자 발현을 제공하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터로는 쥣과 류케미아 바이러스 (MuLV), 긴팔 원숭이 류케미아 바이러스 (GaLV), 시미안 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 및 이들의 조합물을 기반으로 하는 벡터를 포함한다 (예를 들어, Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommnerfelt et al. (1990) J. Virol. 176:58-59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al. (1991) J. Virol. 65:2220-2224; PCT/US94/05700). 일과성 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있으며 세포 분열을 필요로하지 않는다. 이러한 벡터를 이용하여 높은 역가와 발현 수준이 얻어졌다. 이러한 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-관련 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산 및 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차에서 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는데 이용될 수 있다 (예를 들어, West et al. (1987) Virology 160:38-47; U.S. Pat. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351). 재조합 AAV 벡터의 작제는 미국 특허 번호 5,173,414; 문헌 [Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260; Tratschin et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6466-6470; and Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:03822-3828]을 포함하는 많은 공개문헌에 기술되어 있다.
패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포와 레트로 바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 세포주를 생성함으로써 생산된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 후속적인 숙주 내로의 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하고, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트로 대체된다. 이러한 누락된 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 지니며, 이는 패키징 및 숙주 게놈 내로의 통합에 요구된다. 바이러스 DNA는, 다른 AAV 유전자를 엔코딩하는 헬퍼 플라스미드, 즉 rep 및 cap을 함유하지만 ITR 서열이 결핍된 세포주에 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결핍으로 인해 상당량 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어, 아데노 바이러스가 AAV보다 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 추가의 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용된 US20030087817을 참조한다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된다. 일부 구체예에서, 세포는 자연적으로 대상채에서 발생하는 것처럼 형질감염된다. 일부 구체예에서, 형질감염되는 세포는 대상체로부터 취해진다. 일부 구체예에서, 세포는 세포주와 같은 대상체로부터 취해진 세포로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 다양한 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 세포주의 예는 비제한적으로 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피세포, BALB/3T3 마우스 배아 섬유아세포, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 인간 태아 섬유아세포; 10.1 마우스 섬유아세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-MeI 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN/OPCT 세포주, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 세포주, U373, U87, U937, VCaP, Vero 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, 및 이의 유전자전이 변종. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 출처로부터 입수가능하다 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, ATCC) (Manassus, Va) 참조). 일부 구체예에서, 본원에 기술 된 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 하나 이상의 벡터-유도된 서열을 포함하는 새로운 세포주를 수립하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템의 성분 (예를 들어, 하나 이상의 벡터의 일시적인 형질감염 또는 RNA로의 형질감염)으로 일시적으로 형질감염되고 CRISPR 복합체의 활성을 통해 변형된 세포가 변형을 함유하나 임의의 다른 외인성 서열은 결핍된 세포를 포함하는 신규한 세포주를 수립하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유도된 세포주는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는데 사용된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터는 비-인간 유전자전이 동물을 생산하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 유전자전이 동물은 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 포유 동물이다. 특정 구체예에서, 유기체 또는 대상체는 식물이다. 유전자전이 동물을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 세포 형질감염 방법으로 시작한다.
한 양태에서, 본원에 기재된 내용은 진핵 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공하며, 이는 생체내, 생체외 또는 시험관내일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 인간 또는 인간외 동물로부터의 세포 또는 세포 군집을 샘플링하고, 세포 또는 세포들을 변형시키는 것을 포함한다. 배양은 생체 외 어떤 단계에서도 일어날 수 있다. 심지어 세포 또는 세포들은 인간외 동물로 재도입될 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기재된 내용은 진핵 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 CRISPR 복합체를 표적 폴리뉴클레오티드에 결합시켜 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 수행함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함하며, 여기에서 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열에 혼성화된 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함한다.
한 양태에서, 본원에 기재된 내용은 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합하여 결합이 폴리뉴클레오티드의 증가된 또는 감소된 발현을 유도하도록 하는 것을 포함하며, CRISPR 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화된 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함한다.
일 양태에서, 본원에 기재된 내용은 CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소를 사용하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 기재된 내용의 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 효과적인 수단을 제공한다. 본 발명에 기재된 내용의 CRISPR 복합체는 다수의 세포 유형에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형 (예를 들어, 결실, 삽입, 전위, 불활성화, 활성화)시키는 것을 포함하는 다양한 유용성을 갖는다. 이와 같이, 본원에 기재된 내용의 CRISPR 복합체는 예를 들어, 유전자 요법, 약물 스크리닝, 질병 진단 및 예후에서 다양한 영역의 적용 범위를 갖는다. 예시적인 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함한다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에 대해 내인성이거나 외인성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵에 잔존하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질) 또는 비-코딩 서열 (예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크 DNA)을 코딩하는 서열일 수 있다. 이론에 한정되지 않으면서, 표적 서열은 PAM (프로토스페이서 인접 모티프) 즉, CRISPR 복합체에 의해 인식된 짧은 서열과 연관되는 것으로 간주된다. PAM에 대한 정확한 서열 및 길이 요건은 사용되는 CRISPR 효소에 따라 다르지만, PAM은 전형적으로, 프로토스페이서 (즉, 표적 서열)에 인접한 2-5개 염기쌍 서열이다. PAM 서열의 예가 하기 실시예 부분에 제공되며, 당업자는 주어진 CRISPR 효소와 함께 사용하기 위한 추가의 PAM 서열을 동정할 수 있을 것이다.
표적 폴리뉴클레오티드의 예는 신호 생화학 경로, 예를 들어, 신호 생화학 경로-관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 관련된 서열을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질병 관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "질병-관련" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 질환이 없는 조직 또는 세포 대조군과 비교하여 질환-감염된 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태의 전사 또는 번역 생성물을 생산하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며; 이는 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며, 여기에서 변형된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 상관관계가 있다. 질병-관련 유전자는 또한 질병의 직접적인 원인이거나 질병의 원인이 되는 유전자(들)와 연관불균형을 맺고 있는 돌연변이(들) 또는 유전자 변이를 갖는 유전자를 지칭한다. 전사된 또는 번역된 생성물은 공지되거나 비공지될 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준일 수 있다.
본원에 기재된 내용의 구체예는 또한, DNA 반복 불안정성 및 신경계 장애와 관련된, 유전자 넉 아웃, 유전자 증폭 및 특정 돌연변이 복구와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다 (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct. 13, 2011-Medical). 일렬 반복 서열의 특정 양태는 20개 초과의 인간 질병에 대한 원인인 것으로 밝혀졌다 (McIvor et al. (2010) RNA Biol. 7(5):551-8). CRISPR-Cas 시스템은 게놈 불안정성의 이러한 결함을 수정하기 위해 활용될 수 있다.
본원에 기재된 내용의 추가의 또 다른 양태에서, CRISPR-Cas 시스템은 문헌 [Traboulsi, ed. (2012) Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, Oxford University Press.]에 추가로 기재된 몇몇 유전자 돌연변이로부터 발생하는 안구 결함을 교정하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 내용의 여러 추가 양태는 광범위한 유전자 질병과 관련된 결함을 교정하는 것과 관련된다. 예를 들어, 유전자 뇌 질병은 비제한적으로, 부신백색질형성장애증, 뇌량의 무발생증, 에카르디 증후군,알퍼스병, 알츠하이머병, 바르트 증후군, 배튼병, CADASIL, 소뇌 변성, 파브리병, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 헌팅톤병 및 기타 세염기증폭 질환, 라이병, 레쉬-니한 증후군, 멘케스병, 사립체 근병증 및 NINDS 거대후두각을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 병태는 신생물일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 병태는 연령-관련 황반변성일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 정신분열증 장애일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 트리뉴클레오티드 반복 장애일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 취약 X 증후군일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 세크레타제 관련 장애일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 병태는 프리온-관련 장애일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 ALS일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 병태는 약물 중독일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 자폐증일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 알츠하이머병일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 염증일 수 있다. 일부 구체예에서, 병태는 파킨슨병일 수 있다.
파킨슨병과 관련된 단백질의 예는 비제한적으로, α-시누클레인, DJ-1, LRRK2, PINK1, 파킨(Parkin), UCHL1, 신필린(Synphilin)-1 및 NURR1을 포함한다.
중독-관련 단백질의 예는 예를 들어, ABAT를 포함할 수 있다.
염증-관련 단백질의 예로는 예를 들어, Ccr2 유전자에 의해 엔코딩된 단핵세포 화학유인물질 단백질-1 (MCP1), Ccr5 유전자에 의해 엔코딩된 C-C 케모킨 수용체 타입 5 (CCR5), Fcgr2b 유전자에 의해 엔코딩된 IgG 수용체 IIB (FCGR2b, 또한, CD32로 명명됨), 또는 Fcer1g 유전자에 의해 엔코딩된 Fc 엡실론 R1g (FCER1g) 단백질을 포함할 수 있다.
심혈관 질환 관련 단백질의 예로는 예를 들어, IL1B (인터루킨 1, 베타), XDH (크산틴 데하이드로게나제), TP53 (종양 단백질 p53), PTGIS (프로스타글란딘 12 (프로스타시글린) 신타제), MB (마이오글로빈), IL4 (인터루킨 4) ANGPT1 (안지오포이에틴 1), ABCG8 (ATP-결합 카세트, 하위 계열 G (WHITE), 구성원 8) 또는 CTSK (카텝신 K)를 포함할 수 있다.
알츠하이머병 관련 단백질의 예는 예를 들어, 지질단백질 수용체 단백질 (VLDLR) 유전자에 의해 엔코딩된 매우 저밀도의 VLDLR, 유비퀴틴-유사 조절제 활성화 효소 1 (UBA1) 유전자에 의해 엔코딩되는 UBA1, 또는 UBA3 유전자에 의해 엔코딩된 NEDD8-활성화 효소 E1 촉매 서브유닛 단백질 (UBE1C)을 포함할 수 있다.
자폐 스펙트럼 장애와 관련된 단백질의 예로는 예를 들어, 벤조디아자핀 수용체 (말초) 관련 단백질 1 (BZRAP1) 유전자에 의해 엔코딩된 BZRAP1, AF4/FMR2 계열 구성원 2 단백질 (AFF2) 유전자에 의해 엔코딩된 AFF2 (MFR2라고도 함), 취약 X 정신 지체 상염색체 상동 1 단백질 (FXR1) 유전자에 의해 엔코딩된 FXR1, 또는 취약 X 정신 지체 상염색체 상동 2 단백질 (FXR2) 유전자에 의해 엔코딩된 FXR2를 포함할 수 있다.
황반 변성과 관련된 단백질의 예로는 예를 들어, ATP-결합 카세트, ABCR 유전자에 의해 엔코딩된 하위 계열 A (ABC1) 구성원 4 단백질 (ABCA4), 아포지질단백질 E 단백질 (APOE) 유전자에 의해 엔코딩된 APOE, 또는 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2 단백질 (CCL2) 유전자에 의해 엔코딩된 CCL2를 포함할 수 있다.
정신 분열과 관련된 단백질의 예는 NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
종양 억제와 관련된 단백질의 예로는 예를 들어, ATM (모세 혈관 확장증), ATR (모세 혈관 확장증 및 Rad3 관련), EGFR (표피 성장 인자 수용체), ERBB2 (v-erb-b2 적혈구 류케미아 바이러스성 종양유전자 동족체 2), ERBB3 (v-erb-b2 적혈모구성 류케미아 바이러스성 종양유전자 동족체 3), ERBB4 (v-erb-b2 적혈모구성 류케미아 바이러스 종양유전자 동족체 4), Notch 1, Notch 2, Notch 3 또는 Notch 4를 포함할 수 있다.
세크레타제 장애와 관련된 단백질의 예는 예를 들어, PSENEN (프레세닐린 증강인자 2 상동체 (C. 엘레강스)), CTSB (카텝신 B), PSEN1 (프레세닐린 1), APP (아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질), APH1B (앞 인두 결함 1 상동체 B (C. 엘레 강스)), PSEN2 (프레세닐린 2 (알츠하이머병 4)) 또는 BACE1 (베타-사이트 APP-절단 효소 1)를 포함할 수 있다.
근위축 측삭 경화증과 관련된 단백질의 예로는 SOD1 (슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1), ALS2 (근위축 측삭 경화증 2), FUS (육종에서 융합됨), TARDBP (TAR DNA 결합 단백질), VAGFA (혈관 내피 성장 인자 A), VAGFB (혈관 내피 성장 인자 B), 및 VAGFC (혈관 내피 성장 인자 C) 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
프리온 질병 관련된 단백질의 예로는 SODI (슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1), ALS2 (근위축 측삭 경화증 2), FUS (육종에서 융합됨), TARDBP (TAR DNA 결합 단백질), VAGFA (혈관 내피 성장 인자 A), VAGFB (혈관 내피 성장 인자 B), 및 VAGFC (혈관 내피 성장 인자 C) 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
프리온 장애에서 신경변성 병태와 관련된 단백질의 예는 예를 들어, A2M (알파-2-마크로글로불린), AATF (전사 인자를 길항하는 아폽토시스), ACPP (산성 포스파타제 전립선), ACTA2 (액틴 알파 2 평활근 대동맥), ADAM22 (ADAM 메탈로펩티다제 도메인), ADORA3 (아데노신 A3 수용체) 또는 ADRA1D (알파-1D 아드레날린 수용체에 대한 알파-1D 아드레날린성 수용체)를 포함할 수 있다.
면역 결핍과 관련된 단백질의 예로는 예를 들어, A2M [α-2-마크로글로불린]; AANAT [아릴알킬아민 N-아세틸트랜스퍼라제]; ABCA1 [ATP-결합 카세트, 하위 계열 A (ABC1), 구성원 1]; ABCA2 [ATP-결합 카세트, 하위 계열 A (ABC1), 구성원 2]; 또는 ABCA3 [ATP-결합 카세트, 하위 계열 A (ABC1), 구성원 3]을 포함할 수 있다.
트리뉴클레오티드 반복 장애와 관련된 단백질의 예로는 예를 들어, AR (안드로겐 수용체), FMR1 (취약 X 정신 지체 1), HTT (헌팅틴) 또는 DMPK (근육 영양 장애-단백질 키나제), FXN (프라탁신), ATXN2 (아탁신 2)를 포함한다.
신경전달 장애와 관련된 단백질의 예로는 예를 들어, SST (소마토스타틴), NOS1 (산화 질소 신타제 1 (신경원성)), ADRA2A (아드레날린성, 알파-2A 수용체), ADRA2C (아드레날린성, 알파-2C 수용체), TACR1 (탁키키닌 수용체 1), 또는 HTR2c (5-하이드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 2C)를 포함한다.
신경발달-관련 서열의 예로는 예를 들어, A2BP1 (아탁신 2-결합 단백질 1), AADAT (아미노 아디페이트 아미노트랜스퍼라제), AANAT (아릴알킬아민 N-아세틸트랜스퍼라제), ABAT (4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제), ABCA1 (ATP-결합 카세트, 하위 계열 A (ABC1), 구성원 1), 또는 ABCA13 (ATP-결합 카세트, 하위 계열 A (ABC1), 구성원 13)을 포함한다.
본 시스템으로 치료가능한 바람직한 병태의 추가의 예는 하기로부터 선택될 수 있다: 아이카르디-고우티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres Syndrome); 알렉산더 질환 (Alexander Disease); 알란-헤른돈-두들리 증후군(Allan-Herndon-Dudley Syndrome); POLG-관련 장애(POLG-Related Disorders); 알파-만노시도증(Alpha-Mannosidosis) (타입 II 및 III); 알스트롬 증후군(Alstroem Syndrome); 안젤만 증후군(Angelman; Syndrome); 모세혈관확장성 운동실조(Ataxia-Telangiectasia); 신경 세로이드-리포푸신증(Neuronal Ceroid-Lipofuscinoses); 베타-지중해빈혈(Beta-Thalassemia); 양쪽 시신경 위축 (Bilateral Optic Atrophy) 및 (영아) 시신경 위축 타입 1; 망막아세포종 (양쪽성); 카나반병(Canavan Disease); 뇌눈얼굴골격 증후군 1(Cerebrooculofacioskeletal Syndrome 1) (COFS1); 뇌힘줄황색종증(Cerebrotendinous Xanthomatosis); 코넬리아디란지 증후군(Cornelia de Lange Syndrome); MAPT-관련 장애; 유전자 프리온 병; 드라벳 증후군(Dravet Syndrome); 조발성 유전형 알츠하이머병(Early-Onset Familial Alzheimer Disease); 프리드리히 운동실조(Friedreich Ataxia) [FRDA]; 프린스 증후군(Fryns Syndrome); 푸코사이드축적증(Fucosidosis); 후쿠야마형 선천성 근이영양증(Fukuyama Congenital Muscular Dystrophy); 갈락토시알리도시스(Galactosialidosis); 고셰병(Gaucher Disease); 유기적 산혈증(Organic Acidemias); 혈구탐식성림프조직구증식증(Hemophagocytic Lymphohistiocytosis); 허치슨-길포드 조로증 증후군(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome); 뮤코리피드증(Mucolipidosis) II; 영아 자유 시알산 축적병(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease); PLA2G6-관련 신경변성; 제벨 랑쥐 닐슨 증후군(Jervell and Lange-Nielsen Syndrome); 연접부 수포성 표피박리증(Junctional Epidermolysis Bullosa); 헌팅턴병(Huntington Disease); 크라베병(Krabbe Disease) (영아); 미토콘드리아 DNA-관련 라이 증후군 (Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome) 및 NARP; 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan Syndrome); LIS1-연관 평평뇌증(Lissencephaly); 로우 증후군(Lowe Syndrome); 메이플 시럽 뇨증(Maple Syrup Urine Disease); MECP2 중복 증후군(Duplication Syndrome); ATP7A-관련 구리 수송 장애(Copper Transport Disorders); LAMA2-관련 근육퇴행 위축(Muscular Dystrophy); 아릴설파타제 A 결핍증(Arylsulfatase A Deficiency); 점액다당류증(Mucopolysaccharidosis) 타입 I, II 또는 III; 퍼옥시좀 형성 장애(Peroxisome Biogenesis Disorders), 젤웨거 증후군 스펙트럼(Zellweger Syndrome Spectrum); 뇌 철 축적병을 동반한 신경변성 (Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation Disorders); 산 스핑고마이엘리나제 결핍(Acid Sphingomyelinase Deficiency); 니만-피크병(Niemann-Pick Disease) 타입 C; 글리신 뇌병증(Glycine Encephalopathy); ARX-관련 질병; 우레아 사이클 장애(Urea Cycle Disorders); COL1A 1/2-관련 불완전 골형성증(Osteogenesis Imperfecta); 미토콘드리아 DNA 결실 증후군; PLP1-관련 장애; 페리 증후군(Perry Syndrome); 펠란-맥더미드 증후군(Phelan-McDermid Syndrome); 글리코겐 축적병(Glycogen Storage Disease) 타입 II (폼페병) (영아); MAPT-관련 장애; MECP2-관련 장애; 점상 연골 이형성증 (Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata) 타입 1; 로버트 증후군(Roberts Syndrome); 샌드호프병(Sandhoff Disease); 쉰들러병(Schindler Disease)-타입 1; 아데노신 데아미나제 결핍증(Adenosine Deaminase Deficiency); 스미드-렘리-오피츠 증후군(Smith-Lemli-Opitz Syndrome); 적수성 근위축(Spinal Muscular Atrophy), 영아-발병 척수소뇌실조증(Infantile-Onset Spinocerebellar Ataxia); 헥소사미니다제 A 결핍증(Hexosaminidase A Deficiency); 치사성 이형성증(Thanatophoric Dysplasia) 타입 1; 콜라겐 타입 VI-관련 장애; 어셔 증후군(Usher Syndrome) 타입 I; 선천성 근위축증(Congenital Muscular Dystrophy); 울프-허쉬호른 증후군(Wolf-Hirschhorn Syndrome); 리소좀산 리파제 결핍증(Lysosomal Acid Lipase Deficiency); 및 색소피부 건조증(Xeroderma Pigmentosum).
II. 생체내에서 gRNA 발현을 발현시키고 조절하기 위한 RNA 리보자임 및 조절가능한 앱타자임
본원에 기재된 내용은 또한, 생체 내 gRNA 발현을 발현 및 조절하기 위한 RNA 리보자임 및 조절가능한 앱타자임의 용도, 특히 비제한적 1차 뉴클레오티드 특이성을 갖는 가이드 RNA의 시스-처리를 위한 5' 해머헤드 리보자임의 용도 및 RNA 앱타자임을 통한 gRNA 기능의 생체내 조절에 관한 것이다.
따라서, 본원에 기재된 내용은 또한, a) 촉매 코어 및 이로부터 연장된 헬릭스 I, 헬릭스 II, 및 헬릭스 III 듀플렉스 영역을 포함하는 시스-작용 해머헤드 리보자임으로서, 헬릭스 II 듀플렉스 영역 및 헬릭스 III 듀플렉스 영역 각각은 촉매 코어 반대의 루프 영역을 포함하며, 헬릭스 II 듀플렉스 영역은 리간드에 결합하는 앱타머를 포함하는, 시스-작용 해머헤드 리보자임; b) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하며, 뉴클레오티드 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 포함하며, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단이 헬릭스 III 듀플렉스 영역에 직접 커플링된, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머-조절된 리보자임으로서; 리간드의 앱타머로의 결합은 리보자임에서 입체형태적 변화를 유도하여 리보자임이 뉴클레오티드 서열의 5' 말단과 헬릭스 III 듀플렉스 영역 사이에 자가-절단되고, 이에 의해 gRNA가 생성되는, 앱타머-조절된 리보자임을 제공한다. 또한, (i) RNA로 전사되는 경우 앱타머-조절된 리보자임을 생성하는 코딩 서열; 및 (ii) 진핵 세포에서 RNA의 전사를 조절하는 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는 발현 작제물이 제공된다. 발현 작제물을 포함하는 진핵 세포가 또한 제공된다. 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변화시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 세포 내로 발현 작제물을 도입시키고, 리보자임의 활성을 변화시키는 양의 리간드와 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 특히 여기에서 세포는 포유동물 또는 인간 대상체의 세포이다. 한 양태에서, 리간드는 테오필린이다.
리보자임은 자가-절단 또는 결찰과 같은 다양한 화학 반응을 촉매하는 RNA 분자이다 (Long and Uhlenbeck (1993) FASEB J. 7: 25-30). 다양한 자연 발생 리보자임이 바이러스, 비로이드 및 원생 동물에서 확인되었다. 제 1 촉매 RNA 중 하나는 담배 고리 자리 비로이드 (sTRSV)의 위성 RNA에서 발견되었다 (De la Pena et al. (2003) EMBO J. 22: 5561-70). 생체 내에서 이러한 병원성 비로이드는 복제 동안 cis 및 자가-절단으로 작용하는 것으로 나타났다. 제 1 리보자임의 발견 이후, 헤어핀 및 해머헤드 리보자임을 포함하는 다양한 종류의 천연 리보자임이 확인되었고 광범위하게 특징 규명되었다.
해머헤드 리보자임 (hRz)은 가장 광범위하게 연구된 리보자임 중 하나이다 (Long and Uhlenbeck (1993) Faseb J. 7: 25-30; Pley et al. (1994) Nature 372:68-74; Hammann et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5503-8; Blount and Uhlenbeck (2005) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34:415-40). 이는 11개의 뉴클레오티드 (nt)의 고도로 보존된 촉매 코어에 수렴된 3개의 나선형 영역으로 구성된다 (Khvorova et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10:708-12; Salehi-Ashtiani and Szostak (2001) Nature 414: 82-4). 절단은 서열 특이적이며 5'-NUX-3' 삼중항을 표적으로 하며, 여기에서 N은 임의의 염기이고, U는 우라실이고, X는 구아닌을 제외한 임의의 염기이다. 효율적이고 신속한 절단에 최적인 NUX는 GUC이다. 리보자임 절단은, 절단 부위의 3' X로부터 직접적으로 2' 하이드록실 기가 탈프로톤화될 때 촉매된다. 이이서, 이러한 친핵성 물질은 잘리기 쉬운 포스페이트를 공격하고, 펜타-배위된 트리고날 바이-피라미달 전이 상태를 통해, 5' 및 3' 생성물을 생성한다 (Blount and Uhlenbeck (2005) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34: 415- 40).
활성 입체형태로의 hRz의 폴딩은 이중 2가 이온 결합 이벤트를 통해 진행되는 것으로 가정된다. 높은 친화력 결합 이벤트가 500μM에서 발생하고 3차 상호작용의 제 1 세트를 배열시킨다. 제 2의 낮은 친화력의 이온의 첨가는 10mM에서 발생하고, 헬릭스 I이 헬릭스 III로부터 폴딩되어 헬릭스 II와 상호작용하도록 hRz 스템 배향을 재구성한다 (Hammann et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5503-8). 특정 스템 루프를 유지하지 않는 보존된 촉매 코어를 지닌 HRz는 최소 해머헤드 리보자임 (mhRzs)으로 불린다. mhRz는 높은 2가 이온 농도 (10mM)에서 활성이지만, 낮은 농도에서 mhRz는 효과적으로 불활성이다 (De la Pena et al. (2003) EMBO J., 22: 5561-70; Khvorova et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10:708-12). 천연 hRz의 결정 구조는 "키싱 루프 (kissing loop)"로서 상호작용하는 스템 루프 중 두 개를 갖는 "Y"-형상 분자를 나타낸다 (Pley et al. (1994) Nature. 372: 68-74). 스템 루프에서 짝이 없는 염기 사이의 이러한 3차 상호작용은 촉매적 활성 입체형태를 안정화시키고 높은 2가 이온 상태를 피하기 위해 제안된다. 연구자들은 루프를 mhRz 디자인에 재편입시킴으로써, 100 내지 500μM의 생물학적으로 관련된 2가 이온 농도에서 시험관내 촉매 활성을 복원함을 입증하였다 (De la Pena et al. (2003) EMBO J. 22: 5561-70; Khvorova et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10:708-12; Canny et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126: 10848-9; Penedo et al. (2004) RNA 10: 880-8; Saksmerprome et al. (2004) RNA 10:1916-24; Weinberg and Rossi (2005) FEBS Lett. 579:1619-24). HRz는 생체내 촉매 활성을 위한 디자인 역할의 설명을 통해, 현재 효과적인 유전자 발현 조절인자가 될 것으로 기대된다.
따라서, 해머헤드 리보자임은 코어, 코어로부터 연장된 3개의 스템을 함유한다. 용어 "스템"과 "헬릭스"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 코어로부터 연장되는 3개의 스템은 본원에서 스템 I, 스템 II 및 스템 III (또는 헬릭스 I, 헬릭스 II 및 헬릭스 III), 및 적어도 하나의 루프로서 언급되며, 이는 코어로부터의 스템의 반대 말단에 위치한다. 시스-작용 리보자임의 구체예에서, 리보자임은 2개의 루프를 함유하며, 하나는 스템 II (또는 헬릭스 II)의 말단에 위치하며, 다른 하나는 스템 III (또는 헬릭스 III)의 말단에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같은, "시스-절단 해머헤드 리보자임"은 절단 전 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된 해머헤드 리보자임이다. 시스-절단 해머헤드 리보자임은 자체 절단될 수 있다.
스템 (또는 헬릭스)은 적어도 일부가 이중-가닥인, 리보자임 코어로부터 연장되는 핵산 모티프이다. 특정 구체예에서, 리보자임 코어로부터 스템의 반대 말단에 루프가 존재하며, 이러한 루프는 이중-가닥 스템의 2개 가닥을 연결시킨다. 특정 구체예에서, 스템은 2 내지 20개의 상보적인 염기쌍을 포함한다. 특정 구체예에서, 스템은 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 상보적 염기쌍을 포함한다.
특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 30%는 상보적 염기쌍의 일부이다. 나머지 염기 쌍은 매칭되지 않은 비-상보적인 염기 쌍일 수 있거나, 돌출부의 일부일 수 있다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 40%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 50%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 60%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 70%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 80%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 90%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 95%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 99%는 상보적 염기 쌍의 일부이다. 특정 구체예에서, 스템의 뉴클레오티드 중 적어도 100%는 상보적 염기 쌍의 일부이다.
루프는 또 다른 가닥과 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드의 서열이며, 코어와 반대의 스템의 원위 말단에 위치한다. 특정 구체예에서, 루프는 1 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구체예에서, 루프는 2 내지 10개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구체예에서, 루프는 3 내지 8개 뉴클레오티드 길이이다. 루프는 루프가 부착된 스템에 따라 넘버링된다. 따라서, 루프 I은 코어 반대편 스템 I의 말단에 위치하고, 루프 II는 코어 반대편 스템 II의 말단에 위치하고, 루프 III는 코어 반대쪽 스템 III의 말단에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같이, "스템/루프"는 이러한 스템 내부에서 임의의 돌출부와 함께 전체 스템 (또는 헬릭스), 및 스템 말단에서의 루프를 지칭한다. 예를 들어, 스템/루프 II는 스템 II 내부의 임의의 돌출부를 포함하는 스템 II, 및 루프 II를 포함한다. 스템에 루프가 결여된 경우, 그러면 스템/루프는 그러한 스템 내부의 임의의 돌출부와 함께 스템을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "돌출부"는 또 다른 가닥과 쌍을 이루지 않으며 이중-가닥 핵산 서열 양쪽에 측면 인접한 뉴클레오티드의 서열이다. 특정 구체예에서, 돌출부는 스템 내부에 위치한다. 돌출부가 스템 내부에 위치하는 경우, 돌출부의 뉴클레오티드는 스템의 일부인 것으로 간주된다. 특정 구체예에서, 해머헤드 리보자임은 하나 초과의 돌출부를 포함한다. 특정 구체예에서, 스템 내부의 돌출부는 코어로부터의 2개의 염기 쌍에 위치한다. 특정 구체예에서, 스템의 하나 또는 양 가닥은 돌출부를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은, CRISPR-Cas 시스템 gRNA를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 포함하며, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단은 헬릭스 Ⅲ 듀플렉스 영역에 직접 커플링된다. "직접적으로 커플링된"은 앱타머의 부재하에 활성 리보자임 구조와 비교하여 루프는 루프의 2개의 잔기 사이의 단지 하나의 백본 포스포디에스테르 결합에서 차단되며, 백본 포스포디에스테르 결합은 앱타머의 5' 및 3' 말단으로의 포스포디에스테르 결합으로 대체된다. 활성 형태의 앱타머-조절된 리보자임에서, 정보 전달 도메인의 5' 및 3' 잔기는 달리 방해된 루프의 구조를 보존하기 위해, 서로에 대해 쌍을 이루는 것을 기반으로 하여 듀플렉스 영역을 형성한다.
본원에서 "리간드" 또는 "분석물" 또는 문법적 동의어는 검출될 임의의 분자 또는 화합물로서 본원에 기술된 바와 같이 설계되고/거나 선택될 앱타머와 상호작용할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 지칭함을 의미한다. 적합한 리간드 또는 분석물은 비제한적으로, 농약 (pesticide), 살충제, 독소, 치료용 및 남용 약물, 호르몬, 항생제, 항체, 유기 물질 등을 포함하는 환경 또는 임상 화학 물질, 오염 물질 또는 생체분자와 같은 작은 화학 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 생체분자는 비제한적으로, 단백질 (효소, 면역글로불린 및 당단백질을 포함), 핵산, 지질, 렉틴, 탄수화물, 호르몬, 전체 세포 (원핵 (예컨대, 병원성 박테리아) 및 진핵 세포 포함, 포유동물 종양 세포 포함), 바이러스, 포자 등을 포함한다. 단백질인 예시적 분석물은 비제한적으로, 효소; 약물; 세포; 항체; 항원; 세포막 항원 및 수용체 (신경, 호르몬, 영양소 및 세포 표면 수용체) 또는 이들의 천연 리간드를 포함한다.
해머헤드 리보자임 (hRz)은 포스포디에스테르 결합의 트랜스 또는 시스 절단에서 견딜 수 있는 RNA 모티프이다. cis-작용 해머헤드 리보자임 (chRz)은 2개의 RNA 생성물을 생성하기 위해 자체 백본의 자가-절단을 겪은 촉매 RNA이다. cis-작용 해머헤드 리보자임은 3개의 염기-쌍 스템 및 절단에 요구되는 잔기의 고도로 보존된 코어를 함유한다. 절단 반응은 동일한 잔기의 3' 탄소에 부착된 인 원자상의 촉매 부위 시토신의 2' 하이드록실 옥시젠의 공격에 의해 진행된다. 이는 당 포스페이트 백본을 파괴하고 2', 3' 사이클릭 포스페이트를 생성한다.
자가-절단 반응에 필요한 최소한의 해머헤드 서열은 대략 13개의 보존되거나 불변인 "코어" 뉴클레오티드를 포함하며, 그 대부분은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 관여하지 않는다. 코어 영역은 일반적으로 표준 왓슨-크릭 염기-쌍으로 구성되며 서열과 관련하여 달리 제한되지 않는 스템 I, II 및 III에 측면 인접한다.
트랜스-작용 해머헤드 리보자임 (thRz)의 절단 특이성은 리보자임의 혼성화 암(arm)에 의해 제어되며, 이는 상보적인 방식으로 기질과 어닐링되고 절단하기 쉬운 포스포디에스테르 결합을 직접 절단한다. 이러한 활성은 절단 삼중항의 세 번째 뉴클레오티드 뒤에 발생하도록 특정하게 유도된다.
본원에 기재된 내용은 앱타머-조절된 트랜스-작용 해머헤드 리보자임 및 앱타머-조절된 시스-액팅 해머헤드 리보자임을 제공한다. 해당 앱타머-조절된 thRz 및 chRz는 다양한 리간드에 반응할 수 있도록 쉽게 조작될 수 있는 다양한 종류의 리보자임이며 많은 응용 분야에서 유용하다. 예를 들어, 앱타머-조절된 thRz 및 chRz는 리간드-의존적 방식으로 표적화된 유전자의 활성을 조절하도록 설계될 수 있으며, 따라서 내인성 또는 이종성 유전자의 발현을 조절하는데 유용하다.
리보자임 도메인 (또한 본원에서 이펙터 도메인)은 chRZ의 경우 자체-절단을 겪기 위한 또는 thRZ의 경우 표적 서열을 절단하기 위한 이의 활성 수준 (예를 들어, 반응 속도)에 의해 규정되는 적어도 2개의 입체구조 상태인 "오프" 상태 및 "온" 상태를 가질 수 있다. 본원에 기재된 내용의 이펙터 도메인은 앱타머 도메인에 대한 리간드 결합에 반응하여 이들의 "온" 및 "오프" 입체구조 상태 간에서 전환될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 내용의 앱타머-조절된 리보자임은 리간드 결합에 반응하여 활성이 "온" 및 "오프"로 전환되는 스위치로서 작용한다. 특정 구체예에서, 리보자임 도메인의 기능은 리간드의 존재 또는 부재에 대해 완전히 의존적이거나, 앱타머 도메인에 결합가능한 리간드의 농도에 더욱 많은 용량-반응 유사 의존성을 나타낼 수 있다.
앱타머가 결합하는 리간드의 선택 및 따라서 이에 의해 조절되는 리보자임은 방대하다. 특정 예에서, 리간드는 2500 amu 미만의 분자량을 갖는 소분자이다. 단지 예로서 펩티드, 유기 소분자 (약물 및 특정 대사산물 및 중간체, 보조인자 등을 포함) 및 금속 이온을 포함하는 천연 또는 비-천연 발생 분자가 존재할 수 있다. 앱타머에 결합하는 예시적 리간드는 비제한적으로, 소분자 예컨대, 약물, 대사산물, 중간체, 보조인자, 전이상태 유사체, 이온, 금속, 핵산 및 독소를 포함한다. 앱타머는 또한, 단백질, 펩티드, 핵산, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체 및 세포 표면 예컨대, 세포 벽 및 세포 막을 포함하는 천연 및 합성 폴리머에 결합할 수 있다. 전형적으로 RNA인 앱타머로의 리간드 결합은 정보 전달 도메인을 갖는 염기-쌍을 변화시키며 이는 리보자임 도메인의 구조적 변화로서 이어지고 포스포디에스테르 결합의 절단 (표적 서열의 자가-절단 또는 절단)을 중개하는 이의 능력을 변경시킨다. 따라서, 리간드 결합은 예를 들어, 유전자 불활성화, 전사, 번역을 매개하거나 표적 유전자 또는 mRNA의 정상 활성을 방해하는 이펙터 도메인의 능력에 영향을 미친다.
앱타머는 가장 전형적으로 표적 분자의 결합에 대한 시험관내 선택에 의해 얻어진다. 그러나, 생체 내에서의 앱타머의 선택도 가능하다. 앱타머는 환경에서 의도된 표적 분자와 복합체를 형성할 수 있는 특이적 결합 영역을 가지며, 동일한 환경에서 다른 물질은 핵산에 복합되지 않는다. 결합의 특이성은 일반적으로 환경에서의 다른 물질 또는 비관련 분자에 대한 앱타머의 해리 상수와 비교하여 이의 리간드에 대한 앱타머의 비교 해리 상수 (Kd)로 규정된다. 리간드는 비관련 물질에 대한 친화도 보다 더 큰 친화도로 앱타머에 결합하는 것이다. 전형적으로, 앱타머의 리간드와 관련하여 앱타머에 대한 Kd는 환경에서 비관련 물질 또는 수반되는 물질과의 앱타머에 대한 Kd 보다 적어도 약 10-배 작을 것이다. 보다 더욱 바람직하게는, Kd는 적어도 약 50-배 미만, 보다 바람직하게는, 적어도 약 100-배 미만, 및 가장 바람직하게는, 적어도 약 200-배 미만일 것이다. 앱타머는 전형적으로 약 10 내지 약 300개 뉴클레오티드 길이일 것이다. 더욱 일반적으로, 앱타머는 약 30 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이일 것이다.
다양한 분자에 결합하는 앱타머가 용이하게 제조된다. 이들 분자 각각은 본원에 기재된 내용의 방법을 이용하여 관련된 리보자임의 조절제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 폴리펩티드, 세포 표면상의 표적 특징부, 이온, 금속, 염, 당류는 모두 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하기에 적합한 것으로 입증되었다. 예를 들어, Hoechst 33258과 같은 유기 염료는 생체외 앱타머 선택을 위한 표적 리간드로서 성공적으로 사용되었다 (Werstuck and Green (1998) Science 282: 296-298). 도파민, 테오필린, 설포르호다민 B, 및 셀로비오스와 같은 다른 유기 소분자도 앱타머의 분리에서 리간드로 사용되었다. 또한, 카나마이신 A, 리비도마이신, 토브라마이신, 네오마이신 B, 비오마이신, 클로르암페니콜 및 스트렙토마이신과 같은 항생제에 대한 앱타머가 분리되었다. 소분자를 인식하는 앱타머에 대한 검토는 문헌 [Famulok (1999) Science 9: 324-9]를 참조하시오.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 내용의 앱타머-조절된 리보자임 중 앱타머의 리간드는 세포-투과성의 유기 소분자이다. 번역에 일반적인 억제 효과를 갖지 않는 유기 소분자가 리간드로서 바람직하다. 이러한 소분자는 바람직하게는, 또한 번역의 요망되는 억제 수준을 달성하기에 충분한 생체 내 지속성을 나타낸다. 분자는 또한, 예를 들어, 경구 투여 후 생체이용 가능한 것들을 동정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 본원에 기재된 내용의 특정 구체예에서, 리간드는 비독성이다. 리간드는 선택적으로 예를 들어, 스테로이드를 포함하는 약물일 수 있다. 그러나, 유전자 발현을 조정하는 방법 중 일부에서, 리간드는 약리학적으로 비활성인 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 리간드는 세포 내에서 그의 존재가 질병 또는 병리학적 병태를 나타내는 폴리펩티드이다. 기타 구체예에서, 앱타머에 대한 리간드는 클로르암페니콜과 같은 항생제이다. 대안적 구체예에서, 앱타머의 리간드는 Hoeschst 염료 33258과 같은 유기 염료이다. 여전히 또 다른 구체예에서, 리간드는 금속 이온일 수 있다. 특정 구체예에서, 앱타머-조절된 핵산의 앱타머 도메인은 카페인에 대한 결합에 반응한다.
통상적으로, SELEX로서 알려진 공지된 생체내 또는 시험관내 (가장 통상적으로는, 시험관내) 선택 기술을 이용하여 특정 리간드에 결합시키기 위해 앱타머가 개발된다 (Ellington et al. (1990) Nature 346, 818-22; and Tuerk et al. (1990) Science 249, 505-10). 앱타머를 제조하는 방법이 또한 예를 들어, 미국 특허 번호 5,582,981; PCT 공개 번호 WO 00/20040; 미국 특허 번호 5,270,163; Lorsch and Szostak (1994) Biochemistry 33:973; Mannironi et al. (1997) Biochemistry 36:9726; Blind (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:3606-3610; Huizenga and Szostak (1995) Biochemistry 34:656-665; PCT 공개 번호 WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국 특허 번호 5,756,291에 기술되어 있다.
일반적으로, 그들의 가장 기본적인 형태에서, 앱타머를 확인하기 위한 시험관내 선택 기술은 먼저 무작위화되거나 돌연변이된 적어도 일부 영역을 함유하는 요망되는 길이의 올리고뉴클레오티드의 큰 풀(pool)을 제조하는 것을 포함한다. 예를 들어, 앱타머 선택을 위한 일반적인 올리고뉴클레오티드 풀은 PCR 프라이머의 결합에 유용한 규정된 서열의 약 15-25개 뉴클레오티드 길이 영역의 양쪽 말단에 측면 인접한 20-100개의 무작위화된 뉴클레오티드의 영역을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 풀은 표준 PCR 기술을 이용하여 증폭되며, 그러나 선택된 핵산 서열의 충실하고 효율적인 증폭을 가능하게 하는 임의의 수단이 사용될 수 있다. 그런 다음 DNA 풀은 시험 관내에서 전사되어 RNA 전사물을 생성한다. 그 후, RNA 전사물은 친화성 크로마토그래피로 처리될 수 있으며, 그러나 또 다른 분자 (예를 들어, 단백질 또는 임의의 표적 분자)에 특이적으로 결합하는 이들의 능력을 기반으로 하여 핵산의 선택을 허용하는 임의의 프로토콜이 이용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 전사물은 가장 일반적으로 컬럼을 통과하거나 자성 비드 또는 표적 리간드가 고정화된 기타 유사물과 접촉된다. 리간드에 결합하는 풀 내의 RNA 분자는 칼럼 또는 비드 상에 유지되는 반면, 비결합 서열은 씻겨진다. 이어서, 리간드에 결합하는 RNA 분자는 역전사되고 PCR에 의해 다시 증폭된다 (보통 용출 후). 이어서, 선택된 풀 서열은 동일한 유형의 선택의 또 다른 라운드를 거치게 된다. 전형적으로, 풀 서열은 총 약 3-10회 반복 라운드의 선택 절차를 거친다. 이어서, cDNA는 표준 절차를 이용하여 증폭되고, 클로닝되고 시퀀싱되어 표적 리간드에 대한 앱타머로서 작용할 수 있는 RNA 분자의 서열을 확인한다. 일단 앱타머 서열이 성공적으로 확인되면, 돌연변이 유발된 앱타머 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 시작하여 추가적인 선택 라운드를 수행함으로써 앱토머는 추가로 최적화될 수 있다. 본원에 기재된 내용에서 사용하기 위해, 앱타머는 바람직하게는, 정상 생리 조건을 모방하는 염 농도 및 온도의 존재하에 리간드 결합에 대해 선택된다.
앱타머가 아직 이용가능한지의 여부를 참고하지 않고 적합한 리간드를 일반적으로 선택할 수 있다. 대부분의 경우, 당업자에 의해 선택되는 리간드에 결합하는 앱타머가 획득될 수 있다. 시험관내 선택 과정의 독특한 특성은, 어떤 유형의 구조가 요망되는 리간드에 결합할 수 있는지에 대한 종래 지식이 완전히 부족하더라도 요망되는 리간드에 결합하는 적합한 앱타머의 분리에 가능하게 한다.
본원에 기재된 내용에 사용하기에 적합한 앱타머에 있어서, 리간드에 대한 앱타머의 결합 친화도가 충분히 강해야 하며, 이의 리간드에 결합될 때 앱타머에 의해 형성된 구조는 본원에 기재된 내용의 앱타머-조절된 리보자임을 "온" 및 "오프" 상태 사이에서 전환시키거나 앱타머-조절된 리보자임의 기능 수준을 조정하기에 상당히 충분해야 한다.
앱타머 및 결합된 리간드에 대한 결합 상수는 바람직하게는, 리간드의 투여시 수득된 리간드의 농도에서 리간드가 앱타머에 결합하고 요망되는 효과를 갖게 하는 기능을 하는 값이다. 생체 내 사용을 위해, 예를 들어, 결합 상수는 혈청 또는 다른 조직에서 달성될 수 있는 리간드 농도보다 훨씬 낮은 농도에서 결합이 발생하게 해야 한다. 바람직하게는, 생체 내 사용에 필요한 리간드 농도는 또한, 유기체에 바람직하지 못한 영향을 줄 수있는 농도보다 낮다.
따라서, 특정 구체예는 하나 이상의 사전-선택되거나 사전-결정된 리간드에 대해 반응성인 앱타머 또는 앱타머 도메인을 설계하고 선택하는 방법을 제공한다. 본 앱타머-조절된 리보자임은 또한, 이들의 스위칭 행동이 리간드 결합에 대해 다소 반응적이도록 "조정"될 수 있다. 앱타머-조절된 리보자임은 또한, 앱타머 도메인의 결합 친화도가 이의 리간드에 다소 민감성을 띠도록 "조정"될 수 있다. 예를 들어, 앱타머-조절된 리보자임에서 분자내 듀플렉스 형성 및 다른 2° 및 3° 구조의 열역학적 특성은, 앱타머 도메인이 다소 리간드 결합되기 쉽게 변형될 수 있으며, 즉, 예컨대, 해리 상수 (Kd) 또는 기타 동역학적 변수 (예컨대, Kon 및 Koff 속도)에서 드러날 수 있다. 대안적으로, 리보자임 도메인에서 알로스테릭 변화는, 리보자임 도메인의 2°및 3°구조에 영향을 줄 수 있는 혼성화 및 기타 분자내 상호작용에서 변형시 리간드 결합에 대해 다소 반응적일 수 있다. 핵산 구조의 열역학적 특성을 변형시키기 위한 앞으로의 공학 전략은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 증가된 상보적 핵산 쌍은 리보자임 도메인 또는 앱타머 도메인의 안정성을 증가시킬 수 있다.
III. 신경변성 질환을 치료하는 방법
본원에 기재된 내용은 또한, 신경변성 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 내용은 안구 신경변성 질환을 이러한 질환의 치료가 필요한 대상체에서 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) i) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 대상체의 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및 ii) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 성분 (i) 및 (ii)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DAN 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하고, (b) 유효량의 시스템을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
"신경변성 질환, 장애 또는 병태"는 뉴런 또는 망막 광수용체 세포와 같은 다른 신경 세포의 변성 또는 기능 장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태 (신경병증 포함)를 의미한다. 신경변성 질환, 장애 또는 병태는, 뉴런의 감소된 기능 또는 기능 장애, 또는 뉴론 또는 기타 신경 세포의 손실이 발생할 수 있는 임의의 질환, 장애 또는 병태일 수 있다.
이러한 질환, 장애 또는 병태는 비제한적으로 예컨대, 녹내장 및 신경계의 신경변성 질환, 장애 또는 병태, 또는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 혀인두 신경통, 벨 마비 (Bell 's Palsy), 중증근무력증, 근육 퇴행위축, 진행성 근 위축증, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 거짓숨뇌마비, 진행숨뇌마비, 척수근위축증, 유전성 근위축증, 추간원판 장애, 자궁목 형성이상, 신경총 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 파킨슨증후군 (Parkinson's-plus diseases), 다계통 위축증, 진행성 핵성 마비, 피질 기저핵 변성, 루이소체 치매 (dementia with Lewy bodies), 전두측두치매, 탈수초성 질환, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 프리온병, 크로이츠펠트-야콥 병, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군 (GSS), 치명적인 가족력 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌증 (BSE), 피크병, 간질 및 AIDS 치매 복합과 관련된 신경변성 질환, 장애 또는 병태를 포함한다.
예컨대, 신경계의 기타 신경변성 질환, 장애 또는 병태, 또는 알코올 중독, 알렉산더 병, 알퍼스병, 모세혈관 확장증, 바텐병 (스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병으로도 알려짐), 카나반병, 코카인 증후군, 당뇨병성 신경병증, 전두측두엽 퇴행, HIV-관련 치매, 케네디병, 크라베병, 신경볼레리오시스, 마카도-조셉병 (척수소뇌성실조증 타입 3), 습식 또는 건식 황반병성, 니만 피크병, 펠리자우스-메르스바허병, 광수용체 퇴행성 질환, 예컨대, 망막색소변성증 및 관련 질환, 레프섬병, 샌드호프병, 실더병, 악성빈혈로의 이차 척수의 아급성연합변성(subacute combined degeneration of spinal cord secondary to pernicious anemia), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병 (또한, 배튼병으로도 알려짐), 척수소뇌성 운동실조증 (다양한 특징을 갖는 다중 타입), 스틸-리차드슨-올스제위스키병, 및 척수로와 관련된 신경변성 질환, 장애 또는 병태.
안구-관련 신경변성의 예로는 비제한적으로, 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반변성 (AMD), 습식 또는 건식 AMD와 관련된 광수용체 변성, 기타 망막 변성 예컨대, 망막 색소침착 (RP), 시신경 조영제, 시신경 병증 및 시신경염, 예컨대, 다발성 경화증으로 인한 시신경염을 포함한다. 일부 구체예에서, 안구 신경변성 질환은 녹내장, 망막 변성 및 연령-관련 황반 변성으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 안구 신경변성 질환은 망막 색소변성 (RP)이다.
본원에 기재된 내용에 따라 예방 또는 치료될 수 있는 상이한 유형의 녹내장의 비제한적인 예는 원발성 녹내장 (원발성 개방-각 녹내장, 만성 개방-각 녹내장, 만성 단순 녹내장 및 녹내장 심플렉스라고도 공지됨), 저안압 녹내장, 원발성 폐쇄-각 녹내장 (원발성 폐쇄-각 녹내장, 협우-각 녹내장, 동공-차단 녹내장 및 급성 울혈성 녹내장), 극성 폐쇄-각 녹내장, 만성 폐쇄-각 녹내장, 간헐적 폐쇄-각 녹내장, 만성 개방-각 폐쇄 녹내장, 색소 녹내장, 비늘 녹내장 (거짓박리 녹내장 또는 수정체낭 녹내장으로도 공지됨), 발육이상 녹내장 (예를 들어, 원발성 선청성 녹내장 및 영아 녹내장), 이차 녹내장 (예를 들어, 염증 녹내장 (예를 들어, 포도막염 및 푹스홍채이색모양체염)), 수정체 녹내장 (예를 들어, 성숙 백내장을 갖는 폐쇄-각 녹내장, 수정체 피막의 파열에 대해 이차적인 수정체과민증 녹내장, 수정체독성 메쉬워크 차단으로 인한 수정체 용해 녹내장, 및 수정체 부분 탈구), 안내 출혈에 이차적인 녹내장 (예를 들어, 앞방출혈 및 용혈녹내장, 또한 적혈구파괴성 녹내장으로도 알려짐), 외상 녹내장 (예를 들어, 앞방각후퇴 녹내장, 전방각 상의 외상성 침체, 수술후 녹내장, 무수정체동공차단, 및 섬모체 차단 녹내장), 신생혈관 녹내장, 약물-유도된 녹내장 (예를 들어, 코르티코스테로이드 유도된 녹내장 및 알파-키모트립신 녹내장), 독성 녹내장 및 안구내 종양 관련 녹내장, 망막 박리, 안구의 중증 화학 화상, 및 홍채 위축을 포함한다. 특정 구체예에서, 신경변성 질환, 장애 또는 병태는 과도한 혈관신생과 관련되지 않은 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 신생 혈관 녹내장이 아닌 녹내장이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장애"는 일반적으로, 확인된 표적, 또는 경로 중 하나에 대한 유효량의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 치료될 수 있는 임의의 질환, 장애 또는 병태를 포함하는, 확인된 표적 또는 경로 중 하나에 대한 화합물로의 치료가 유익한 임의의 병태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"은 이러한 용어가 적용되는 질환, 장애 또는 병태, 또는 이러한 질환, 장애 또는 병태 (예를 들어, 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사를 초래하는 질환 또는 장애)의 하나 이상의 증상 또는 징후의 진행의 반전, 완화, 억제, 및상기 질환, 장애 또는 병태, 또는 상기 증상 또는 징후의 가능성의 예방 또는 감소를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사를 감소시킨다. 예를 들어, 치료는 치료를 받기 전의 대상체 또는 치료를 받지 않은 대상체에서 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사와 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과만큼 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사를 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는 대상체에서 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사를 완전히 억제한다. 본원에 사용된 바와 같은 "망막 광수용체 세포"는 광변조할 수 있는 망막에서 발견된 특정화된 유형의 뉴론이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 유전자 생성물은 로돕신이다.
일부 구체예에서, 시스템은 대상체로의 투여 전 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된다. 일부 구체예에서, 대상체로의 투여는 망막하 주입에 의해 발생한다. 치료, 투여 또는 요법은 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 연속 치료, 투여 또는 요법은 1일 이상의 치료 중단 없이 적어도 매일의 치료를 의미한다. 간헐적인 치료 또는 투여, 또는 간헐적 방식으로의 치료 또는 투여는 연속적이지 않고 그보다는 주기적인 치료를 의미한다. 본원에 기재된 방법에 따른 치료는 질환, 장애 또는 병태로부터의 완전한 완화 또는 치유, 또는 질환, 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상의 부분적 개선을 유도할 수 있으며, 이는 일시적 또는 영구적일 수 있다. 용어 "치료"는 또한 예방, 치료 및 치유를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 유익한 또는 요망되는 결과를 달성하기에 충분한 제제의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 치료되는 대상 및 질병 상태, 대상의 체중 및 연령, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 용어는 또한 본원에 기재된 이미징 방법 중 임의의 한 방법에 의해 검출하기 위한 이미지를 제공할 투여량에 적용된다. 특정 투여량은 선택된 특정 제제, 후속되는 투여 계획, 다른 화합물과 병용 투여 여부, 투여 시점, 이미지화될 조직, 및 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 상호교환적으로 사용된다. 이들의 많은 구체예에서 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이며, 그러나 본원에 기술된 방법은 용어 "대상체"에 포함되는 것으로 의도되는 모든 척추동물 종과 관련하여 효과적인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, "대상체"는 의학적 목적 예컨대, 병태 또는 질환 발병의 예방을 위한 예방학적 치료 또는 존재하는 병태 또는 질환의 치료를 위한 인간 대상체, 또는 의학적, 수의학적 목적 또는 개발 목적의 동물 대상체를 포함할 수 있다. 적합한 동물 대상체는 비제한적으로, 영장류 예를 들어, 인간, 원숭이, 유인원 및 기타 등등; 소 예를 들어, 캐틀(cattle), 황소 및 기타 등등; 오바인 (ovine) 예를 들어, 양 및 기타 등등; 염소 예를 들어, 고트 및 기타 등등; 돼지 예를 들어, 피그, 호그 및 기타 등등; 말 예를 들어, 호스, 당나귀, 얼룩말 및 기타 등등; 야생 고양이 및 집고양이를 포함하는 고양잇과 동물; 도그를 포함하는 개; 토끼, 허 (hare) 및 기타 등등을 포함하는 토끼목; 및 마우스, 래트 및 기타 등등을 포함하는 설치류를 포함하는 포유동물을 포함한다. 동물은 유전자전이 동물일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 비제한적으로, 태아, 신생아, 영아, 청소년 및 성인 대상체를 포함하는 인간이다. 또한, "대상체"는 병태 또는 질환에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 환자를 포함할 수 있다.
IV. 일반적 정의
특정 용어가 본원에 사용되지만, 이들은 제한적인 목적이 아닌 단지 일반적이고 서술적인 의미로 사용된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본원에 기재된 내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
오랜 특허법 협약에 따라, 단수 형태의 용어는 청구범위를 포함하여 본 출원에 사용될 때 "하나 이상"을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "대상체"에 대한 언급은 문맥이 명백히 상반되지 않는 한 복수의 대상체 (예를 들어, 복수의 대상체) 및 기타 등등을 포함한다.
본 명세서 및 청구범위에 걸쳐서, 용어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 문맥에 달리 요구되는 경우를 제외하고는 비-배타적인 의미로 사용된다. 마찬가지로, 용어 "포함하다" 및 이의 문법적 변형은, 목록에 있는 항목의 열가는 기재된 목록을 대체하거나 이에 부가될 수 있는 기타 유사 항목을 배제하지 않는 비제한적인 것으로 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적에 있어서, 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 양, 크기, 치수, 비율, 형상, 제형, 파라미터, 백분율, 변수, 정량, 특징 및 기타 수치값을 표현하는 모든 수는, 용어 "약"이 값, 양 또는 범위를 명시적으로 나타내지 않는다 하더라도 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반되게 지시되지 않는 한, 다음의 명세서 및 첨부된 청구 범위에 제시된 수치 변수는 정확하지 않으며 정확할 필요는 없지만, 허용 오차, 환산 계수, 반올림, 측정 에러 및 기타 등등, 및 본원에 기재된 내용에 의해 획득하고자 하는 요망되는 특성에 따라 당업자에게 공지된 다른 인자들을 반영하는, 원하는 값의 근사치 및/또는 이보다 더 크거나 작을 수 있다. 예를 들어, 값을 언급 할 때 용어 "약"은 지정된 양으로부터 일부 구체예에서는 ± 100%, 일부 구체예에서는 ± 50%, 일부 구체예에서는 ± 20%, 일부 구체예에서는 ± 10%, 일부 구체예에서는 ± 5%, 일부 구체예에서는 ± 1%, 일부 구체예에서는 ± 0.5%, 및 일부 구체예에서는 ± 0.1%의 변화를 포함하는 것으로 의미할 수 있으며, 이러한 변화는 기재된 방법을 수행하거나 기재된 조성물을 사용하는데 적절하다.
또한, 용어 "약"은 하나 이상의 숫자 또는 수치 범위와 관련하여 사용되는 경우, 범위 내의 모든 수를 포함하여 그러한 모든 수를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 제시된 수치 값의 상측 및 하측 경계를 확장함으로써 상기 범위를 수정한다. 종점에 의한 수치 범위의 기재는 이러한 범위에 포함된 이의 분수 (예를 들어, 1 내지 5의 기재는 1, 2, 3, 4 및 5는 물론 이의 소수, 예를 들어, 1.5, 2.25, 3.75, 4.1, 및 기타 등등을 포함함) 및 이러한 범위내의 임의의 범위를 포함하는 모든 수 예를 들어, 정수를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 내용의 대표적인 구체예를 실시하기 위해 당업자에게 지침을 제공하기 위해 포함되었다. 본 기재내용 및 당해 기술의 일반적인 수준의 견지에서, 당업자는 하기 실시예가 단지 예시인 것으로 의도되며, 많은 변경, 변형 및 변화가 본원에 기재된 내용의 범위를 벗어나지 않으면서 예시될 수 있음을 이해할 수 있다. 하기 합성 설명 및 특정 실시예는 단지 예시의 목적으로 의도되었으며, 다른 방법에 의해 본 발명의 화합물을 제조하는 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
방법
플라스미드 작제: H1 gRNA-발현 작제물 (하기 표 1, 2 및 3 참조)을 생성하기 위해, 중첩 올리고뉴클레오티드를 조립하여 76bp gRNA 스캐폴드 및 pol III 종결 신호에 융합된 H1 프로모터를 생성하였다. H1 프로모터 및 gRNA 스캐폴드 사이에 BamHI 부위를 혼입하여 표적화 서열의 삽입을 허용하였다. 이어서 H1::gRNA 스캐폴드::pol III 종결인자 서열을 pCR4-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 TOPO 클로닝하고 시퀀싱하고 확인하였다; 생성 벡터는 역 방향이다 (아래 참조). 본 연구에 사용되는 다양한 gRNA를 생성하기 위해, 중첩 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 2-단계 증폭 Phusion Flash DNA 중합 효소 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 PCR로 증폭하고, 후속하여 2X 부피 25% PEG 및 1.5M NaCl과 혼합된 카르복실레이트-변형된 세라-Mag 마그네틱 비즈 (Carboxylated-Modified Sera-Mag Magnetic Bead) (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정제하였다. 이어서 정제된 PCR 생성물을 H2O에 재현탁시키고 NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량하였다. U6 발현을 위한 AflII 분해된 플라스미드 (#41824, Addgene, Cambridge MA) 또는 H1 발현을 위한 단지 기술된 BamHI 분해 플라스미드에 대해 약간의 변형을 가한 gRNA-발현 작제물을 Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson et al. (2009) Nature Methods 6:343-345)을 사용하여 생성하였다. 총 반응 부피는 20μl에서 2μl로 감소되었다.
세포 배양: mTeSR1 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)에서 성장 인자 감소된 Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 상의 클론 증식에 의해 hESC 라인 H7 및 IMR-90 iPS 세포 (WiCell, Madison WI)를 이전에 기술된 프로토콜 (Walker et al. (2010) Nat. Commun. 1:71; Maruotti et al. (2013) Stem Cells Translational Medicine 2: 341-354)에 따라 10% CO2/5% O2 인큐베이터에서 유지시켰다. 계대 배양을 위해, hESC 콜로니를 먼저 mTesR1에서 5μM 블렙비스타틴(blebbistatin) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)과 함께 인큐베이션한 다음, Accutase (Sigma-Aldrich)로 5-10분 처리한 후 수집하였다. 세포 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 완만하게 분해하고 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 그 후, hPSC를 블렙비스타틴을 갖는 mTeSR1에 재현탁시키고 대략 1,000-1,500 세포/cm2로 플레이팅하였다. 계대 배양 2일 후, 배지를 mTeSR1 (블렙비스타틴 비함유)으로 대체하고 매일 교체하였다.
인간 배아 신장 (HEK) 세포주 293T (Life Technologies, Grand Island, NY)를 10% 소태아 혈청(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) 및 2mM GlutaMAX (Invitrogen) (Invitrogen)가 보충된 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM)에서 5% CO2/20% O2와 37℃에서 유지하였다.
H7 세포의 유전자 표적화: hESC 세포를 전기천공 24시간 전에 10μM Rho 키나제 억제제 (DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA)에서 배양하였다. 전기천공을 제조사의 지시에 따라 Neon 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 간략하게는, 전기천공일에, hESC를, 콜로니를 채취할 때까지 Accutase (Sigma-Aldrich)로 1-2분 동안 분해시켰다. 중요하게는, 콜로니은 단일 세포 현탁액으로 해리되지 않았다. 콜로니 수거 후, 습식 펠렛을 얼음 위에서 15분 동안 유지한 다음, 유전자 표적화 플라스미드를 함유하는 전기천공 완충액에 재현탁시켰다. 전기천공 파라미터는 다음과 같다: 전압: 1400 ms; 간격: 30 ms; 1 펄스. 전기천공 후, 세포 콜로니를 10 μm Rho 키나제 억제제를 함유하는 mTeSR1 매질로 서서히 옮기고, 이어서 20분 동안 실온에서 유지시킨 후 Matrigel-코팅된 접시에 플레이팅시키고 추가로 배양하였다.
클론에 의해 유도된 콜로니의 분석을 위해, 전기천공된 hESC를 준포화상태로 성장시키고, 이전 단락에 기재된 바와 같이 계대 배양하고 35mm 접시 당 500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 후속하여, 단일 콜로니를 수동 채취에 의해 분리하고 추가로 배양하였다.
293T 세포 형질감염을 위해, 형질감염 24 시간 전에 ~ 100,000 세포/웰을 24-웰 플레이트 (Falcon, Corning, NY)에 시딩하였다. 세포를 제조사의 권장 프로토콜에 따라 리포펙타민 LTX 플러스 시약 (Lipofectamine LTX Plus Reagent) (Invitrogen)을 사용하여 4중으로 형질감염시켰다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 있어서, 400ng의 Cas9 플라스미드 및 200ng의 gRNA 플라스미드를 0.5μl의 Plus 시약 및 1.5μl의 리포펙타민 LTX 시약과 혼합하였다.
상시적으로 발현된 GFP ESC 라인의 생성: H7 인간 ESC 라인 (WiCell)을 Matrigel 기질상의 mTeSR1 (Stem Cell Technologies) 배지에서 유지시켰다. 세포 계대배양 전에, 세포를 블렙비스타틴으로의 간단한 전-처리로 처리하여 (> 5 분) 세포 생존력을 높이고, Accutase로 7분 동안 처리하고, 단일 세포 현탁액으로 분쇄하고, 동일한 용적의 mTesR로 켄칭시키고, 5분 동안 80xg로 펠렛화시키고 블렙비스타틴을 함유하는 mTesR 중에 재현탁시켰다. 1x106 세포를 펠렛화하고, 배지를 조심스럽게 제거하고, 세포를 10-15분 동안 얼음 위에 두었다. R-완충액 중에 AAVS1 세이프-하버(safe-harbor) 로커스에 대한 상동부를 함유하는 10μg의 AAV-CAGGSEGFP 도너 벡터 (#22212, Addgene), + 각 5μg의 hAAVS1 1R + L TALEN (#35431 및 35432, Addgene) (Hockemeyer et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27: 851-857; Sanjana et al. (2012) Nature Protocols 7: 171-192)를 하기 파라미터에 따라 Neon Transfection System (Life Technologies)을 사용하여 100μl 팁-타입으로 전기천공하였다: 1500V, 20ms 펄스 및 1 펄스. 이어서, 세포를 1ml의 배지에 완만하게 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 mTeSR 및 5μM 블렙비스타틴을 함유하는 Matrigel-코팅된 35mm 접시에 플레이팅하였다. 2일 후, 세포를 1x104의 밀도로 시딩한 후, 안정한 클론 서브라인을 형광 장착된 Nikon TS100 형광 현미경을 사용하여 수동으로 선택하였다.
게놈 변형에 대한 서베이어 검정 및 시퀀싱 분석: 서베이어 분석에 있어서, 게놈 DNA를, QuickExtract 용액 (Epicentre, Madison, WI) 중에 세포를 재현탁시키고, 65℃에서 15분 동안 이어서, 98℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 추출하였다. DNA 세정 및 농축기 (DNA Clean and Concentrator) (Zymo Research, Irvine, CA)를 사용하여 추출 용액을 세정하고 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였다. CRISPR 표적 부위를 둘러싼 게놈 영역을 100ng의 게놈 DNA로부터 Phusion DNA 중합효소 (New England Biolabs)를 사용하여 증폭시켰다. 다수의 독립적인 PCR 반응물을 모으고, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen MinElute Spin Column을 사용하여 정제하였다 (Qiagen, Valencia, CA). 12.5mM Tris-HCl (pH 8.8), 62.5mM KCl 및 1.875mM MgCl2에서 400ng의 PCR 생성물을 함유하는 8μl 용적을 변성시키고 서서히 리어닐링시켜 헤테로듀플렉스가 형성되게 하였다: 95℃에서 10분, -1.0℃/초로 95℃에서 85℃로 감소, 85℃에서 1초, -1.0℃/초로 85℃에서 75℃로 감소, 75℃에서 1초, -1.0℃/초로 75℃에서 65℃로 감소, 65℃에서 1초, -1.0℃/초로 65℃에서 55℃로 감소, 55℃에서 1초, -1.0℃/초로 55℃에서 45℃로 감소, 45℃에서 1초, -1.0℃/초로 45℃에서 35℃로 감소, 35℃에서 1초, -1.0℃/초로 35℃에서 25℃로 감소, 및 이어서 4℃에서 유지. 1μl의 서베이어 인핸서(Surveyor Enhancer) 및 1μl의 서베이어 뉴클레아제(Surveyor Nuclease) (Transgenomic, Omaha, NE)를 각 반응물에 첨가하고, 42℃에서 60분 동안 인큐베이션 한 후, 1μl의 정지 용액을 반응물에 첨가하였다. 2100 Bioanalyzer에서 DNA 1000 칩 (Agilent, Santa Clara, CA)을 사용하여 1μl의 반응물을 정량하였다. 겔 분석을 위해, 2μl의 6X 로딩 완충액 (New England Biolabs)을 나머지 반응물에 첨가하고 에티듐 브로마이드를 함유하는 3% 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 겔을 Gel Logic 200 Imaging System (Kodak, Rochester, NY)에서 시각화하고, ImageJ v.1.46을 사용하여 정량하였다. NHEJ 빈도는 2항 유도 방정식을 사용하여 계산하였다:
유전자 변형% =
Figure pct00001
여기에서, "a" 및 "b"의 값은 배경 감산 후 절단된 단편의 통합된 영역에 해당하며, "c"는 배경 감산 후 비-절단된 PCR 생성물의 통합된 영역에 해당한다 (Guschin et al. (2010) Methods in Molecular Biology 649: 247-256).
유동 세포측정: 블렙비스타틴 처리 후, 준포화 hESC 콜로니를 Accutase 처리로 수거하고, 단일 세포 현탁액으로 해리시키고 펠렛화하였다. 그런 다음 세포를 Vybrant DyeCycle 루비 착색제 (Invitrogen)를 함유하는 생세포 용액 (Live Cell Solution) (Invitrogen)에 재현탁하고 Accuri C6 유동 세포 측정기 (BD Biosciences)로 분석하였다.
정량적 실시간 qPCR: 293T 세포를 형질감염 24시간 전에 12-웰 플레이트 (Falcon)에 250,000 세포/웰로 시딩하였다. 각 웰에 0ng, 31.25ng, 62.5ng, 125ng, 250ng 또는 500ng의 6개 적정 용량의 gRNA 플라스미드와 제조사의 권장 프로토콜에 따른 리포펙타민 LTX와 Plus Reagent (Invitrogen)를 사용하여 세포를 3중으로 형질감염시켰다. 48시간 형질감염 후, RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 사용하여 총 RNA를 분리하고 Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo)를 사용하여 정제하였다. 전체 RNA 500ng을 잔류 게놈 DNA 오염물을 제거하기 위해 dsDNase (ArticZymes, Plymouth Meeting, PA USA)로 처리하고, 제조사의 권고에 따라 Superscript III 역전사 효소 (Invitrogen)를 사용하여 20 μl 반응물에서 역전사시켰다. 각 반응에 있어서, 0.1μM의 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 각 반응물을 프라이밍하였다; gRNA 스캐폴드-
CTTCGATGTCGACTCGAGTCAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO:1), U6 snRNA-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG (SEQ ID NO:2). 밑줄친 스캐폴드 서열은 전사물 안정성을 위해 첨가된 앵커 서열을 나타낸다. 각각의 qPCR 반응을 250nM의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상기로부터의 RT 반응 생성물의 1μl의 1:15 희석물을 함유하는 SsoAdvanced ™ Universal SYBR®Green Supermix (Biorad)를 사용하여 10ul 부피로 Biorad CFX 96 실시간 PCR 기계에서 수행하였다. 95℃ 변성, 54℃ 어닐링 온도 및 60℃ 연장 단계로 40 사이클 동안 반응을 수행하였다. 하기 프라이머는 각각 가이드 RNA 및 참조 유전자를 검출하는데 사용되었다: F1-
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA (SEQ ID NO:3) 및 가이드RNAscaffrev-
AAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO:4) 및 U6snRNAF-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT (SEQ ID NO:5) 및 U6snRNARev- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC (SEQ ID NO:6). Biorad의 통합 CFX 관리자 소프트웨어를 사용하여 각 가이드 RNA 샘플 및 s.e.m에 대한 상대적 표준화 발현을 계산하였다.
생물정보: 인간 게놈의 모든 잠재적인 CRISPR 부위를 결정하기 위해, 커스텀 Perl 스크립트(custom Perl script)를 사용하여 23-mer CRISPR 서열 부위 GN19NGG 또는 AN19NGG의 두 가닥 모두와 중복 출현을 조사하였다. 평균 및 중간 거리 값을 계산하기 위해, 먼저 예측된 CRISPR 절단 부위를 PAM 서열의 세 번째 염기와 네 번째 염기 업스트림 사이에서 발생하는 것으로 규정하였다. 서열을 분류한 후, 게놈 내의 모든 인접한 gRNA 간의 거리를 계산하였다. 이러한 데이터를 R에 불러와서 평균 및 중앙 통계 값을 계산하고 데이터를 플롯팅하였다. 평균 밀도를 계산하기 위해, 게놈에 걸쳐 gRNA 절단 부위를 제거하고 발생 빈도를 계산하였다. 이러한 데이터는 ggplot2 패키지 또는 Circos를 사용하여 R에서 플롯팅하여 원형 플롯을 생성시켰다 (Krzywinski et al. (2009) Genome Research 19: 1639-1645). 인간 게놈 또는 질환 로커스에서의 발생을 계산하기 위해, BEDTools 유틸리티 IntersectBED (Quinlan and Hall (2010) Bioinformatics 26:841-842)를 사용하여 UCSC Genome Browser로부터 검색된 RefSeq BED 파일 또는 OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD), 2013)으로부터의 BED 파일과의 중복 발생을 파악하였다. 본 연구에 사용된 게놈은 인간 (hg19), 마우스 (mm10), 래트 (rn5), 소 (bosTau7), 닭 (galGal4), 지브라피쉬 (dr7), 드로소필라 (dm3), C.엘레강스 (ce10), 및 S. 세레비시애(sacCer3)이다.
표 1. gRNA 표적화 서열 및 특성 - eGFP 좌표, gRNA 프로모터, 5' 뉴클레오티드, 표적 가닥, PAM 모티프, GC 함량, Tm 및 열역학적 안정성을 나타내는 eGFP 표적화 작제물
작제물 프로모터 5' 뉴클레오티드 가닥 PAM GC *
(%) 		Tm *
(℃) 		3' 안정성 (kcal / mol )
( ΔG )**
GFP_213-191 U6 G - GGG 65 68.0 7.9
GFP_a214-192 H1 A - AGG 65 66.0 7.6
GFP_219-197 U6 G - AGG 65 69.4 11.1
GFP_285-307 U6 G + AGG 55 63.8 7.0
GFP_a292-314 H1 A + CGG 45 57.3 8.1
GFP_315-293 U6 G - TGG 55 62.8 6.7
GFP_360-382 U6 G + AGG 60 67.0 8.2
GFP_361-383 U6 G + GGG 55 64.8 7.0
GFP_583-561 U6 G - GGG 80 78.9 8.6
GFP_a584-562 H1 A - GGG 75 76.9 9.8
GFP_612-590 U6 G - CGG 55 57.6 6.4
GFP_a676_698 H1 A + CGG 70 72.5 6.1
GFP_705_683 U6 G - CGG 60 63.0 7.8
* 20 bp 표적 서열에 기초하여 계산
** 예측된 DNA:DNA 혼성화 값에 기초한 5개 3' 뉴클레오티드에 대해 계산
표 2. gRNA 표적화 서열 및 특성 - gRNA 프로모터, 5' 뉴클레오티드, 표적화 가닥, PAM 모티프, GC 함량, Tm 및 열역학적 안정성을 나타내는 AAVS-1 표적화 서열
작제물 프로모터 5' 뉴클레오티드 가닥 PAM GC *
(%) 		Tm *
(℃) 		3' 안정성 (kcal / mol )
( ΔG )**
AAVS1-g1 U6 G + GGG 70 67.3 6.7
AAVS1-g2 U6 G + TGG 65 64.7 7.8
AAVS1-g3 U6 G - GGG 60 65.5 10.9
AAVS1-a1 H1 A - CGG 45 54.3 6.0
AAVS1-a2 H1 A - TGG 60 65.5 12.4
AAVS1-a3 H1 A - CGG 45 55.3 8.2
표 3. gRNA 표적화 서열 및 특성 - eGFP를 표적으로 하는 20개 염기 gRNA 작제물의 서열
작제물 CRISPR 표적 SEQ ID NO:
GFP_213-191 5'GCACTGCACGCCGTAGGTCA-3' 7
GFP_a214-192 5'-AGCACTGCACGCCGTAGGTC-3' 8
GFP_219-197 5'-GCTGAAGCACTGCACGCCGT-3' 9
GFP_285-307 5'-GGGCGCACCATCTTCTTCA-3' 10
GFP_a292-314 5'-ACCATCTTCTTCAAGGACGA-3' 11
GFP_315-293 5'-GCCGTCGTCCTTGAAGAAGA-3' 12
GFP_360-382 5'-GGTGAACCGCATCGAGCTGA-3' 13
GFP_361-383 5'-GTGAACCGCATCGAGCTGAA-3' 14
GFP_583-561 5'-GCACGGGGCCGTCGCCGATG-3' 15
GFP_a584-562 5'-AGCACGGGGCCGTCGCCGAT-3' 16
GFP_612-590 5'-GGTGCTCAGGTAGTGGTTGT-3' 17
GFP_a676_698 5'-ACCGCCGCCGGGATCACTCT-3' 18
GFP_705_683 5'-GTCCATGCCGAGAGTGATCC-3' 19
결과
CRISPR/Cas9 표적화의 현재 한계를 확장시키기 위해, U6 대신에, H1 pol III가 대안적인 프로모터로서 사용될 수 있는지의 여부를 시험하였다 (Baer et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:97-103). H1은 +1 위치에서 퓨린 (뉴클레오티드 R)을 갖는 전사물을 발현할 수 있기 때문에, S. 피오게네스 Cas9와 함께 CRISPR 표적화 공간이 AN19NGG 및 GN19NGG 부위 둘 모두에서 절단을 허용함으로써 확장될 수 있다고 가정하였다 (도 1a). H1 발현된 gRNA에 의한 부위-특이적 절단을 입증하기 위해, H7 인간 배아 줄기 세포주 (hESC; 도 1b)에서 AAVS-1 로커스에 통합된 GFP 표적 유전자의 CRISPR-매개 절단을 측정하기 위한 리포터 검정을 개발하였다 (Hockemeyer et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857). 코딩 서열 파괴로 인한 GFP 형광의 손실을, 에러가 발생하기 쉬운 비-상동성 말단 연합 (NHEJ) 빈도에 대한 프록시 (proxy)로서 측정하였다; 특히, 이러한 검정은, GFP 형광을 방해하지 않는 인-프레임 돌연변이 또는 인델은 검출되지 않을 것이므로 NHEJ를 과소평가할 것이다(도 1b 및 도 1c). H7 세포를 균등 비율의 Cas9 및 gRNA 발현 플라스미드로 전기천공시키고, 세포를 콜로니 형성 후 GFP 형광에 대해 시각화하였다. 네거티브 대조군 전기천공과 대조적으로, 시험된 U6 및 H1 프로모터로부터의 모든 gRNA 작제물은 표적화된 돌연변이를 겪는 세포에서 GFP 신호의 모자이크 손실을 보였다 (도 1c 및 데이터는 나타내지 않음). 핵 착색제를 이용한 총 세포 수의 정량화는 유동 세포측정에 의해 GFP 형광의 세포-기반 분석을 가능하게 한다. GFP 형광의 손실에 의해 입증된 바와 같이, 작제물 100%가 NHEJ를 유도하였으나, U6 및 H1 작제물 둘 모두에 대한 효율 범위는 다양하였다 (도 1c, 우측 및 데이터는 나타내지 않음). U6 또는 H1 프로모터로부터 gRNA를 발현시킴으로써, 이는 GFP 유전자의 돌연변이 유발이 GN19NGG 또는 AN19NGG 부위에서 각각 일어날 수 있음을 입증한다.
또 다른 세포주를 사용하여 이러한 결과를 확인하고 확대하기 위해, 동일한 로커스에서 GFP를 발현하는 GFP 발현 HEK-293 세포주를, 상기와 같이 동일한 gRNA 작제물을 사용하여 표적화하였다. 서베이어 분석 (Qiu et al. (2004) BioTechniques 36:702-707)에 의해, 프로모터 타입 및 표적화 위치에 의해 변화되는 편집 효율 범위를 검출되었다 (도 1d 및 도 2). 변형되지 않은 IMR90.4 유도된 다능성 세포 (hiPSCs)를 사용함으로써, PPP1R12C 유전자의 인트론 영역 내부에서 AAVS-1 로커스를 표적으로 하여 내인성 유전자를 변형시키는 능력이 또한 확인되었다. H1 및 U6 추진된 gRNA로부터의 표적화된 절단이 서베이어 검정에 의해 측정할 경우 필적하는 효율을 갖는 것으로 관찰되었다 (도 3a, 도 3b 및 도 3c).
표적화 공간의 가능한 증가를 측정하기 위해, 인간 게놈에서 이용가능한 CRISPR 부위를 평가하기 위해 생물정보학적 분석을 수행하였다. AN19NGG 부위는 GN19NGG 부위와 거의 동일한 빈도로 발생하는 것으로 예측될 수 있지만, 이들은 실제로는 15% 더 많이 일반적인 것으로 밝혀졌다 (도 4a, 도 4b, 도 4c, 도 4d, 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 도 5e 및 도 5f); 따라서 GN19NGG에서 RN19NGG로 특이성 변화는 이용가능한 부위의 수를 두 배 넘게 늘린다 (대략 115% 증가). 몇 가지 (chr16, chr17, chr19, chr20 및 chr22)를 제외하고, AN19NGG 부위는 각 크로모좀에서 GN19NGG 부위 보다 높은 빈도로 존재한다. 평균 게놈-전체 표적화 밀도를 비교하기 위해, 게놈 내의 인접한 CRISPR 부위 간의 평균 거리를 GN19NGG (59bp), AN19NGG (47bp) 및 RN19NGG 부위 (26bp)에 대해 계산하였다 (도 4B). 또한, AN19NGG 부위는 인간 게놈에서 표적화의 관련 영역에서 더욱 풍부해졌다. 인간 게놈에서 AN19NGG 부위의 20% 증가 및 OMIM 데이터베이스로부터 획득한 질병 로커스의 21% 증가가 밝혀졌다 (도 4c). 인간 게놈으로부터의 1165 miRNA 유전자를 또한 조사하였으며, 이들 유전자 중 221개가 하나 이상의 AN19NGG 부위를 통해 표적화될 수 있지만 GN19NGG 부위를 통해서는 표적화될 수 없음이 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). 상동성 재조합의 효율이 절단 부위로부터의 거리 증가와 부정적으로 관련된다면, H1 프로모터의 사용에 의한 CRISPR 표적화 부위의 증가는 보다 정확한 게놈 표적화 및 돌연변이 보정을 용이하게 한다 (Ran et al. (2013) Cell 6: 1380-1389).
CRISPR 기술이 다수의 모델 유기체에 걸친 게놈 공학에 점점 더 많이 이용되기 때문에, 다른 게놈에서의 H1 프로모터 사용의 잠재적 영향을 측정하였다. 이러한 분석은 H1 프로모터에서 높은 게놈 보존성을 갖는 5개의 다른 척추동물 (마우스; 래트; 닭; 소; 및 지브라피쉬) 게놈에서 수행하였다. 모든 경우에, GN19NGG 부위에 비해 AN19NGG 수가 더 높은 것으로 밝혀졌다: +9% 소; +14% 닭; +19% 래트; +21% 마우스; 및 +32% 지브라피쉬 (도 4c). 이러한 보급에 대한 한 설명은 더 높은 AT 함량으로 인한 것일 수 있다 (도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 6d, 도 6e 및 도 6f). 인간 게놈에서, GN19NGG 및 AN19NGG 부위 발생을 AT 함량으로 표준화하면 빈도가 균등함(parity)에 근접하게 되나, 이는 모든 게놈에 대해서 적용되는 것은 아니다 (도 6a 및 도 6f). 그럼에도 불구하고, 이는 인간 게놈 및 유사하게는 테스트된 모든 다른 게놈에서 현재 이용가능한 CRISPR 표적화 공간을 두 배 넘게 늘리는 H1 프로모터의 사용 유용성을 입증하였다.
다음으로, H1 프로모터 작제물을 이용한 내인성 유전자에서 AN19NGG 부위를 표적화하는 능력을 입증하였다. H7 세포를 사용하여, MERTK 로커스의 두 번째 엑손인, 망막 색소 상피와 대식 세포에서 식균 작용과 관련되고, 돌연변이된 경우, 망막 변성을 초래하는 유전자를 표적화하였다 (D'Cruz et al. (2000) Human Molecular Genetics 9:645-651) (도 7a 및 도 7b). 전체 표적화 효율을 평가하기 위해, DNA를 전기천공된 세포 군집으로부터 수거하고, 서베이어 검정을 수행하였다. 표적 부위를 둘러싼 영역은 두 개의 독립적인 PCR 반응으로 증폭하고, 9.5% 및 9.7%의 인델 빈도가 계산되었다 (도 7b). 그 다음, 42개의 무작위로 선택된 클론을 분리하고 서베이어 분석에 의해 돌연변이에 대해 평가하였다 (데이터는 나타내지 않음). 시퀀싱은, 7/42 (16.7%)가 표적 PAM 부위의 3 - 4개 뉴클레오티드 업스트림 내에서 클러스터링되는 돌연변이를 가지고 있음을 보여주었다. 6/7 클론은 독특한 돌연변이 (1개의 클론이 중복됨)를 가지며, 이들 중 3개는 웨스턴 블롯 분석 (도 7c 및 도 7d)에 의해 확인된 예측 null MERTK 대립유전자를 초래하는 이중-대립형 프레임-이동 돌연변이였다. 종합하여 볼 때, 이러한 결과는 내인성 로커스에 위치한 AN19NGG 부위를 효과적으로 표적으로 하는 능력을 입증한다.
CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 오프-표적 돌연변이의 발생에 대한 관심이 증가하였기 때문에, 전술한 GFP gRNA 작제물을 모델 시스템으로 사용하여 H1 프로모터의 사용이 어떻게 오프-표적화에 영향을 줄 수 있는지를 조사하였다. 서베이어 분석을 이용하여 오프-표적 부위일 것으로 생물정보학적으로 예측되는 3개의 게놈 로커스를 조사하였다 (GFP_11-33, GFP_219-197, 및 GFP_315-293). 이들 작제물 중 2개 (GFP_219-197, 및 GFP_315-293)는 GN19NGG 표적 부위이며, 두 프로모터 모두로의 발현을 허용한다. 하나 (GFP_11-33)의 AN19NGG 부위는 5'-G 뉴클레오티드를 부가함으로써 U6 프로모터로부터 발현되었다. 조사된 3개의 모든 오프-표적 로커스에서, 임의의 오프-표적 절단은 검출 불가능하였다 (데이터는 나타내지 않음). 그러나, 검출가능한 오프-표적의 결핍은 GFP gRNA 표적의 초기 선택으부터 발생할 수 있으며, 여기에서 부위는 다른 게놈 로커스에 대한 낮은 상동성을 기반으로 하여 선택되었다. 이와 같이, 높은 수준의 오프-표적 히트를 유도하는 것으로 특정하게 공지된 표적화 부위에서 H1 및 U6 프로모터로부터의 gRNA 발현을 비교하기 위해 보다 엄격한 자극을 가하는 것으로 판단되었다 (Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:822-826; Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(9):839-43; Cho et al. (2014) Genome Research 24:132-141). 또한, H1 프로모터의 5' 뉴클레오티드 유연성은 U6 프로모터와 H1 프로모터 사이의 GN19NGG 부위를 표적으로 하는 동일한 gRNA의 직접 비교를 허용하였다. 푸(Fu) 등 (2013)으로부터 이전에 보고된 2개의 부위를 평가하였다: VEGFA 부위 1 (T1) 및 VEGFA 부위 3 (T3) (표 4, 도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d) ((Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:822-826; Cho et al. (2014) Genome Research 24:132-141). 증가된 gRNA 및 Cas9 농도는 증가된 오프-표적 히트를 유도하는 것으로 나타났기 때문에 ((Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:822-826; Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(9):839-43; Hsu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(9):827-32), H1 프로모터로부터의 더 낮은 gRNA 발현 수준 (Boden et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:5033-5038; An et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy 14:494-504; Makinen et al. (2006) The Journal of Gene Medicine 8:433-44)이 또한 오프-표적 효과를 감소시킬 수 있는 것으로 판단되었다. qRT-PCR을 사용하여, H1 및 U6 프로모터로부터의 VEGFA T1 gRNA의 상대적 수준을 평가하였으며, 이는 H1 프로모터로부터 예상되는 감소된 수준의 발현을 확인시켜줬다 (도 8a). VEGFA T1 부위에 있어서, 온-표적 로커스에서 절단 효율은 물론 4개의 오프-표적 로커스를 평가하였다. U6 프로모터와 비교하여, 온-표적 로커스에서의 절단은 비교가능하거나 약간 감소되었다; 그러나, 시험된 오프-표적 로커스에서 더욱 엄격하게 H1 프로모터 발현된 gRNA가 감지되었으며 더 큰 특이성을 나타낸다 (오프-표적 1: 8% vs. 25%; 오프-표적 2: 검출불가능 vs. 20%; 및 오프-표적 4: 9% vs. 26%) (표 4, 표 8a, 표 8b, 표 8c 및 표 8d). VEGFA T3 부위에서, 2개의 프로모터 작제물 (26%) 사이의 균등한 표적화가 검출되었지만, H1 프로모터에 의해 더 낮은 수준의 오프-표적 절단이 다시 관찰되었다 (표 4, 도 8a, 도 8b, 도 8c ,도 8d). H1 및 U6 프로모터 발현 gRNA에 대한 추가 연구가 수행되어야하지만, 데이터는 가능하게는, H1 발현된 gRNA로부터의 더 큰 특이성을 제시한다.
H1 프로모터 접근법을 사용하는 추가적인 오프-표적화 관련 이점은 잠재적인 오프-표적 효과를 완화하기 위해 D10A Cas9 돌연변이체와의 공동작용 오프셋 닉킹(offset nicking)을 사용하는 최근에 기술된 유망한 접근법과 관련있다 ((Ran et al. (2013) Cell 6:1380-1389; Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(9):833-8). 이러한 접근법은 대략 20bp의 절단 부위 내에서 반대 가닥 상에 배향된 2개의 측면 인접한 CRISPR 부위를 식별해야하기 때문에 엄격한 표적화 요건을 갖는다 (Ran et al. (2013) Cell 154 (6):1380-9). H1 프로모터를 사용하여 제공된 추가적인 표적화 밀도는 적합한 측면 인접 부위의 확인을 도울 것으로 예상된다.
시험관내 및 생체내에서 S. 피오게네스 Cas9 표적화를 위한 증거 축적은 Cas9:gRNA 인식이 전체 20개 염기쌍 표적화 부위에 걸쳐 확장됨을 나타낸다. 첫 번째, 시험관내에서 gRNA 특이성에 대한 > 1012개의 별개의 변이체 시험에서, 한 연구는 +1 뉴클레오티드가 표적 인식에서 역할을 수행함을 발견하였다. 게다가, 이러한 데이터로부터의 위치 특이성 계산은 5' 뉴클레오티드가 이의 3' 이웃보다 표적 인식에서 더 큰 역할을 한다는 것을 보여주며, 이는 CRISPR 특이성에 대한 "시드" 모델이 PAM-근위 뉴클레오티드의 기여를 매우 단순화할 수 있음을 나타낸다(Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(9):839-4328). 두 번째로, 전사 억제를 위한 CRISPR 시스템을 다른 목적에 맞게 만드는 CRISPR 간섭 (CRISPRi)과 같은 대안적 용도는, 심각하게 절충된 억제의 gRNA에서의 5' 절두 및 미스매칭된 뉴클레오티드를 이용한 5' 연장 - 예컨대, U6 발현에 있어서 미스매칭된 G 염기 - 이 또한, 억제 효율을 감소시킴을 발견하였으며, 이는 길이 (20 nt) 및 5' 뉴클레오티드 컨텍스트 둘 모두가 적절한 Cas9 표적화에 중요함을 시사한다 (Ran et al. (2013) Cell 154(6):1380-9; Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(9):833-8; Larson et al. (2013) Nature Protocols 8:2180-2196; Qi et al. (2013) Cell 152:1173-1183; Shan et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:686-688). 마지막으로, 결정 구조 데이터는, gRNA의 5' 뉴클레오티드 및 표적 DNA의 3' 말단과 중요한 접촉이 이루어짐에 따라 Cas9에서 5' 뉴클레오티드의 실험 데이터 및 중요성을 추가로 지지한다 (Jinek et al. (2014) Science 343:6176); Nishimasu et al. (2014) Cell 156:935-949).
확장된 표적 공간에 있어서, 대안적 Cas9 단백질의 사용은 N. 메닌지티데스 및 S. 서모필루스에서와 같이 효과적인 것으로 입증되었다 (Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110(39):15644-9; Esvelt et al. (2013) Nature Methods 10(11):1116-21). 그러나, 이러한 대체 단백질의 잠재성에도 불구하고, 보고된 다른 타입 II 시스템으로부터의 PAM 제한은 더 엄격한 요건을 가지고 있다 (데이터는 나타내지 않음; Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110(39):15644-9). 대조적으로, H1 프로모터의 사용에 의한 변형된 gRNA 발현은 PAM 차이와 무관하게 임의의 Cas9 단백질을 이용한 표적화 레퍼토리를 크게 확장시킬 것으로 예상된다. 오르솔로지 Cas9 단백질에 대한 각각의 gRNA 표적 (N. 메닌지티디스에 있어서 AN23NNNNGATT vs. GN23NNNNGATT 및 S. 서모필루스에 있어서 AN17NNAGAAW vs. N17NNAGAAW)을 정량화했을 때, 5'-A 뉴클레오티드를 갖는 gRNA 부위에서 64% 및 69% 증가가 밝혀졌으며, 이는 대안적 Cas9 단백질을 갖는 H1 프로모터의 사용을 통해 표적화 공간의 심지어 더 큰 연장을 나타낸다 (표 5). 식물에서 제시된 바와 같이, 상이한 프로모터의 사용은 CRISPR 부위의 빈도를 늘릴 수 있다. U6 프로모터가 5' 구아노신 뉴클레오티드로 제한되는 반면에, 벼의 U3 프로모터는 5' 아데노신 뉴클레오티드로 제한되어, 표적화 공간을 확장시키기 위해 상이한 시스템에서 상이한 프로모터에 대한 요구가 더욱 강조된다 (Shan et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:686-688). 편리하게는, H1 프로모터의 단독 사용은 단일 프로모터 시스템을 통해 AN19NGG 및 GN19NGG 부위 (및 가능하게는, CN19NGG 또는 TN19NGG 부위 (Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-448)를 표적화하는데 활용될 수 있다 (도 9a 및 도 9b). 이어서 이는 변형된 부위 제한을 갖는 현재 및 향후의 Cas9 변이체 둘 모두의 표적화 공간을 확장시키는데 사용될 수 있다.
신중한 부위 선택, 개선된 Cas9 변이체, 최적화된 gRNA 구조, 또는 추가적인 보조인자를 통한 개선된 CRISPR 표적화를 이용하여, 표적화 서열에 걸친 특이성의 증가가 아마도 발생할 것이며, 5' 뉴클레오티드의 정체(identity)가 더욱 중요하게 된다. 연구 도구로서, 이는 교란 돌연변이를 최소화하면서 게놈의 보다 큰 조작을 가능하게 할 것이며, 향후 임상 적용을 위해, 높은-정확도 표적 인식과 결부된 높은 표적화 밀도는 안전하고 효과적인 요법을 제공하는데 있어 중요할 것이다.
표 4. U6 또는 H1 발현된 gRNA에 의해 온-표적 및 오프-표적 부위에서 유도된 인델 빈도
표적 프로모터 전장 표적 인델 돌연변이 빈도 (%) Seq ID NO:
VEGFA-T1 U6 GGGTGGGGGGAGTTTGCTCCtGG 24 20
VEGFA-T1 H1 GGGTGGGGGGAGTTTGCTCCtGG 16 20
OT1-3 U6 GGATGGAGGGAGTTTGCTCCtGG 25 21
OT1-3 H1 GGATGGAGGGAGTTTGCTCCtGG 8 21
OT1-4 U6 GGGAGGGTGGAGTTTGCTCCtGG 20 22
OT1-4 H1 GGGAGGGTGGAGTTTGCTCCtGG 미검출 22
OT1-6 U6 CGGGGGAGGGAGTTTGCTCCtGG 미검출 23
OT1-6 H1 CGGGGGAGGGAGTTTGCTCCtGG 미검출 23
OT1-11 U6 GGGGAGGGGAAGTTTGCTCCtGG 26 24
OT1-11 H1 GGGGAGGGGAAGTTTGCTCCtGG 9 24
VEGFA-T3 U6 GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGtGG 26 25
VEGFA-T3 H1 GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGtGG 26 25
OT3-1 U6 GGTGAGTGAGTGTGTGTGTGaGG 20 26
OT3-2 H1 AGTGAGTGAGTGTGTGTGTGaGG 13 27
OT3-4 U6 GCTGAGTGAGTGTATGCGTGtGG 16 28
OT3-4 H1 GCTGAGTGAGTGTATGCGTGtGG 11 28
OT3-18 U6 TGTGGGTGAGTGTGTGCGTGaGG 미검출 29
OT3-18 H1 TGTGGGTGAGTGTGTGCGTGaGG 미검출 29
표 5. 인간 게놈에서 대안적 Cas9 표적화 부위의 생물정보학적 분석. 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하는 열은 Cas9 종의 기원, CRISPR 표적 부위, 마스킹되지 않은 인간 게놈에서의 발생 빈도 및 반복-마스킹된 인간 게놈에서의 발생 빈도를 나타낸다. 퍼센트 증가는 적정 값 옆에 굵게 나타냈다.
Cas9 표적 부위 빈도 ( 마스킹되지 않음) 빈도 ( 마스킹됨 )
S. 피오게네스 GN19NGG 69,041,571 33,076,776
AN19NGG 81,077,137 (17%) 37,795,743 (14%)
N. 메닌지티스 GN23NNNNGATT 4,055,280 3,227,027
AN23NNNNGATT 6,942,105 (71%) 1,966,548 (64%)
T. 서모필루스 GN17NNAGAAW 5,400,222 2,723,164
AN17NNAGAAW 10,383,453 (92%) 4,593,021 (69%)
논의
CRISPR 표적화 공간을 넓히고 오프-표적 효과의 잠재력을 줄이는 것은 게놈 공학에 광범위한 영향을 미친다. 확장된 표적 공간에 있어서, 대안적인 Cas9 단백질의 사용은 S. 서모필루스 (NNAGAAW) 및 N. 메닌지티데스 (NNNNGATT)에서와 같이 효과적인 것으로 밝혀졌으나, 지금까지 보고된 기타 타입 II 시스템으로부터의 PAM 제한은 더욱 엄격한 요건을 가지며, 따라서 단독으로 사용될 경우 표적화에 이용가능한 서열 공간을 축소시킨다 (데이터는 나타내지 않음, Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110(39):15644-9). 대조적으로, H1 프로모터의 사용에 의한 변형된 gRNA 발현은 임의의 Cas9 단백질을 사용한 표적화 레퍼토리를 크게 확장시킬 것으로 예상된다. 식물에서, U6 프로모터는 5' 구아노신 뉴클레오티드로 제한되지만, 벼로부터의 U3 프로모터는 5' 아데노신 뉴클레오티드로 제한된다. 최근 제안된 것처럼, 두 프로모터 모두의 사용은 식물 게놈에서 CRISPR 부위의 빈도를 증가시킬 수 있다 (Shan et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 686-688). 편리하게는, H1 프로모터의 단독 사용은 단일 프로모터 시스템을 통해 척추동물 게놈에서 AN19NGG 및 GN19NGG 부위를 표적으로 하는데 활용될 수 있다. 이어서 이는 변형된 부위 제한을 갖는 현재 및 향후의 Cas9 변이체 둘 모두의 표적화 공간을 확장시키는데 사용될 수 있다.
ZFN 또는 TALEN 기술과 유사하게, 잠재적인 오프-표적 효과를 완화하기 위한 하나의 접근법은 Cas9 돌연변이체 (D10A)와 공동작용하는 오프셋 닉킹을 이용하는 것일 수 있다 (Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9):833-8 Ran et al. (2013) Cell 154 (6):1380-9). 이는 반대 가닥의 2개의 측면 인접한 CRISPR 부위의 확인을 필요로 하며, AN19NGG 부위에 의해 제공된 추가적인 표적화 밀도가 이러한 접근법을 확대시킬 것으로 예상된다. U6 프로모터에 추가된 이점은 또한 가짜 절단을 감소시키는 것일 수 있다; 몇몇 그룹은, 증가된 gRNA와 Cas9 농도가 오프-표적 돌연변이에 대한 성향의 증가와 관련이 있는 것으로 보고하였기 때문에 (Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9):839-43; Hsu et al. (2013) Nat. Biotechnol., 31 (9):827-32, Fu et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9):822-6), H1 프로모터에 의해 제공되는 더 낮은 수준의 발현은 감소된 오프-표적 절단을 유도할 수 있다. 또한, 패타냐크 (Pattanayak) 등은, Cas9:gRNA 인식이 전체 20개 염기쌍 표적화 부위에 걸쳐 연장됨을 보고하였다 (Pattanayak et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31 (9):839-43). gRNA 특이성에 대한 > 1012개의 별개의 변이체 시험에서, 저자들은 +1 뉴클레오티드가 표적 인식에 기여한다는 것을 발견하였으며, 이는 CRISPR 특이성에 대한 "시드" 모델 (PAM-근위 뉴클레오티드)이 매우 단순화되었음을 나타낸다. 신중한 부위 선택, 개선된 Cas9 변이체, 최적화된 gRNA 구조, 또는 추가적인 보조인자를 통한 개선된 CRISPR 표적화를 이용하여, 23bp 표적화 서열에 걸친 특이성의 증가가 아마도 발생할 것이며, 5' 뉴클레오티드의 정체가 더욱 중요하게 된다. 연구 도구로서, 이는 교란 돌연변이를 최소화하면서 게놈의 보다 큰 조작을 가능하게 할 것이며, 향후 임상 적용을 위해, 높은-정확도 표적 인식과 결부된 높은 표적화 밀도는 안전하고 효과적인 요법을 제공하는데 있어 중요할 것이다.
실시예 2
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d, 및 도 10e는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 동시에 발현시키기 위해 양방향성 프로모터로서 H1 프로모터의 사용을 보여준다. 좌측 (마이너스 가닥)을 향한 pol II 전사물로서 Cas9 및 우측 (플러스 가닥)을 향한 pol III 전사물로서 가이드 RNA를 발현시키는 양방향성 H1 프로모터가 도시된다. 전체 발현 카세트는 약 4.4kb이다(도 10a). 도 10b는 양방향성 H1 작제물로부터 CRISPR-매개된 절단을 유도하는 능력을 시험하기 위해 사용된 작제물을 나타낸다. eGFP를 표적화하는 gRNA를 사용하는 양방향성 작제물을 플라스미드 내로 클로닝시키고, GFP를 발현시키는 인간 줄기 세포에서 발현시켰다. GFP의 손실은 시각적으로 검출되며 (중간 패널, 화살촉), 이는 발현 작제물로 인한 GFP의 성공적인 발현 및 표적화를 나타낸다 (도 10c). 성공적인 CRISPR 표적화는 또한, 레인 2 및 3에서 2개의 밴드의 존재로 서베이어 검정을 통해 도시된다 (도 10d). 아데노-관련 바이러스의 패키징 범위 내에 있는 ~ 4.75b의 컴팩트 표적화 카세트를 생성하기 위해 H1 프로모터를 사용한 양방향성 CRISPR 작제물은 도 10e에 도시된다. SV40 종결인자는 주황색으로 표시되며, 작제물은 바이러스 생성에 필요한 반전 말단 반복부 (ITR) 서열에 측면 인접한다.
방법
플라스미드 작제 : H1 양방향 작제물을 생성하기 위해, 인간 코돈 최적화된 Cas9 유전자 및 SV40 종결인자를, pol II 전사물이 내인성으로 발견되는 (마이너스 가닥) 230bp H1 프로모터 (SEQ ID NO: 54)에 융합시켰다. H1 프로모터와 gRNA 스캐폴드 사이에, AvrII 부위를, 표적화 서열의 삽입을 허용하도록 조작하였다. 그 후, SV40[rev]::hcas9[rev]::H1::gRNA 스캐폴드::pol III 종결인자 서열을 NdeI/XbaI 분해 pUC19 벡터로 클로닝하였다. 본 연구에 사용되는 다양한 gRNA를 생성하기 위해, 중첩 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 2-단계 증폭 Phusion Flash DNA 중합 효소 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 PCR로 증폭하고, 후속하여 2X 부피 25% PEG 및 1.5M NaCl과 혼합된 카르복실레이트-변형된 세라-Mag 마그네틱 비즈 (Carboxylated-Modified Sera-Mag Magnetic Bead) (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정제하였다. 이어서 정제된 PCR 생성물을 H2O에 재현탁시키고 NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량하였다. 약간의 변형을 가한 gRNA-발현 작제물을 Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson et al. (2009) Nature Methods 6:343-345)을 사용하여 생성하였다. 총 반응 부피는 20μl에서 2μl로 감소되었다.
세포 배양: mTeSR1 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)에서 성장 인자 감소된 Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 상의 클론 증식에 의해 hESC 라인 H7 및 IMR-90 iPS 세포 (WiCell, Madison WI)를 이전에 기술된 프로토콜 (Walker et al. (2010) Nat. Commun. 1:71; Maruotti et al. (2013) Stem Cells Translational Medicine 2: 341-354)에 따라 10% CO2/5% O2 인큐베이터에서 유지시켰다. 계대 배양을 위해, hESC 콜로니를 먼저 mTesR1에서 5μM 블렙비스타틴(blebbistatin) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)과 함께 인큐베이션한 다음, Accutase (Sigma-Aldrich)로 5-10분 처리한 후 수집하였다. 세포 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 완만하게 분해하고 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 그 후, hPSC를 블렙비스타틴을 갖는 mTeSR1에 재현탁시키고 대략 1,000-1,500 세포/cm2로 플레이팅하였다. 계대 배양 2일 후, 배지를 mTeSR1 (블렙비스타틴 비함유)으로 대체하고 매일 교체하였다.
인간 배아 신장 (HEK) 세포주 293T (Life Technologies, Grand Island, NY)를 10% 소태아 혈청(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) 및 2mM GlutaMAX (Invitrogen) (Invitrogen)가 보충된 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM)에서 5% CO2/20% O2와 37℃에서 유지하였다.
H7 세포의 유전자 표적화: hESC 세포를 전기천공 24시간 전에 10μM Rho 키나제 억제제 (DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA)에서 배양하였다. 전기천공을 제조사의 지시에 따라 Neon 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 간략하게는, 전기천공일에, hESC를, 콜로니를 채취할 때까지 Accutase (Sigma-Aldrich)로 1-2분 동안 분해시켰다. 중요하게는, 콜로니은 단일 세포 현탁액으로 해리되지 않았다. 콜로니 수거 후, 습식 펠렛을 얼음 위에서 15분 동안 유지한 다음, 유전자 표적화 플라스미드를 함유하는 전기천공 완충액에 재현탁시켰다. 전기천공 파라미터는 다음과 같다: 전압: 1400 ms; 간격: 30 ms; 1 펄스. 전기천공 후, 세포 콜로니를 10 μm Rho 키나제 억제제를 함유하는 mTeSR1 매질로 서서히 옮기고, 이어서 20분 동안 실온에서 유지시킨 후 Matrigel-코팅된 접시에 플레이팅시키고 추가로 배양하였다.
클론에 의해 유도된 콜로니의 분석을 위해, 전기천공된 hESC를 준포화상태로 성장시키고, 이전 단락에 기재된 바와 같이 계대 배양하고 35mm 접시 당 500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 후속하여, 단일 콜로니를 수동 채취에 의해 분리하고 추가로 배양하였다.
상시적으로 발현된 GFP ESC 라인의 생성: H7 인간 ESC 라인 (WiCell)을 Matrigel 기질상의 mTeSR1 (Stem Cell Technologies) 배지에서 유지시켰다. 세포 계대배양 전에, 세포를 블렙비스타틴으로의 간단한 전-처리로 처리하여 (> 5 분) 세포 생존력을 높이고, Accutase로 7분 동안 처리하고, 단일 세포 현탁액으로 분쇄하고, 동일한 용적의 mTesR로 켄칭시키고, 5분 동안 80xg로 펠렛화시키고 블렙비스타틴을 함유하는 mTesR 중에 재현탁시켰다. 1x106 세포를 펠렛화하고, 배지를 조심스럽게 제거하고, 세포를 10-15분 동안 얼음 위에 두었다. R-완충액 중에 AAVS1 세이프-하버(safe-harbor) 로커스에 대한 상동부를 함유하는 10μg의 AAV-CAGGSEGFP 도너 벡터 (#22212, Addgene), + 각 5μg의 hAAVS1 1R + L TALEN (#35431 및 35432, Addgene) (Hockemeyer et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27: 851-857; Sanjana et al. (2012) Nature Protocols 7: 171-192)를 하기 파라미터에 따라 Neon Transfection System (Life Technologies)을 사용하여 100μl 팁-타입으로 전기천공하였다: 1500V, 20ms 펄스 및 1 펄스. 이어서, 세포를 1ml의 배지에 완만하게 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 mTeSR 및 5μM 블렙비스타틴을 함유하는 Matrigel-코팅된 35mm 접시에 플레이팅하였다. 2일 후, 세포를 1x104의 밀도로 시딩한 후, 안정한 클론 서브라인을 형광 장착된 Nikon TS100 형광 현미경을 사용하여 수동으로 선택하였다.
게놈 변형에 대한 서베이어 검정 및 시퀀싱 분석: 서베이어 분석에 있어서, 게놈 DNA를, QuickExtract 용액 (Epicentre, Madison, WI) 중에 세포를 재현탁시키고, 65℃에서 15분 동안 이어서, 98℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 추출하였다. DNA 세정 및 농축기 (DNA Clean and Concentrator) (Zymo Research, Irvine, CA)를 사용하여 추출 용액을 세정하고 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였다. CRISPR 표적 부위를 둘러싼 게놈 영역을 100ng의 게놈 DNA로부터 Phusion DNA 중합효소 (New England Biolabs)를 사용하여 증폭시켰다. 다수의 독립적인 PCR 반응물을 모으고, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen MinElute Spin Column을 사용하여 정제하였다 (Qiagen, Valencia, CA). 12.5mM Tris-HCl (pH 8.8), 62.5mM KCl 및 1.875mM MgCl2에서 400ng의 PCR 생성물을 함유하는 8μl 용적을 변성시키고 서서히 리어닐링시켜 헤테로듀플렉스가 형성되게 하였다: 95℃에서 10분, -1.0℃/초로 95℃에서 85℃로 감소, 85℃에서 1초, -1.0℃/초로 85℃에서 75℃로 감소, 75℃에서 1초, -1.0℃/초로 75℃에서 65℃로 감소, 65℃에서 1초, -1.0℃/초로 65℃에서 55℃로 감소, 55℃에서 1초, -1.0℃/초로 55℃에서 45℃로 감소, 45℃에서 1초, -1.0℃/초로 45℃에서 35℃로 감소, 35℃에서 1초, -1.0℃/초로 35℃에서 25℃로 감소, 및 이어서 4℃에서 유지. 1μl의 서베이어 인핸서(Surveyor Enhancer) 및 1μl의 서베이어 뉴클레아제(Surveyor Nuclease) (Transgenomic, Omaha, NE)를 각 반응물에 첨가하고, 42℃에서 60분 동안 인큐베이션 한 후, 1μl의 정지 용액을 반응물에 첨가하였다. 2100 Bioanalyzer에서 DNA 1000 칩 (Agilent, Santa Clara, CA)을 사용하여 1μl의 반응물을 정량하였다. 겔 분석을 위해, 2μl의 6X 로딩 완충액 (New England Biolabs)을 나머지 반응물에 첨가하고 에티듐 브로마이드를 함유하는 3% 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 겔을 Gel Logic 200 Imaging System (Kodak, Rochester, NY)에서 시각화하고, ImageJ v.1.46을 사용하여 정량하였다. NHEJ 빈도는 2항 유도 방정식을 사용하여 계산하였다:
유전자 변형% =
Figure pct00002
여기에서, "a" 및 "b"의 값은 배경 감산 후 절단된 단편의 통합된 영역에 해당하며, "c"는 배경 감산 후 비-절단된 PCR 생성물의 통합된 영역에 해당한다 (Guschin et al. (2010) Methods in Molecular Biology 649: 247-256).
실시예 3.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 가이드 RNA의 5' 말단을 생성하기 위한 해머헤드 리보 자임 (Hammerhead Ribozyme)을 도시한다. 5' 시스-해머헤드 리보자임 (SEQ ID NO: 49) 및 gRNA (SEQ ID NO: 50)의 도해가 도 11a에 도시된다. 해머헤드 리보자임의 서열이 표시되고, 촉매 작용에 중요한 뉴클레오티드가 표시된다 (적색은 매우 중요함, 주황색은 중요함). 절단 위치는 화살표로 표시된다. 리보자임 절단시 (하부), 생성된 gRNA는 새로 형성된 5' 위치에서의 어떠한 뉴클레오티드에 대한 제약 없이 방출된다. 해머헤드-gRNA를 발현하는 작제물은 도 11b에 도시된다. 프로모터 일반적으로, U6, H1 또는 T7과 같은 pol III 프로모터는 5' 시스-해머헤드 리보자임을 발현하는데 이용될 수 있으며, 이는 자가-절단 후 gRNA를 방출시킬 것이다. 2개의 로커스의 표적화는 서베이어 검정 (HH1 + CGG PAM 서열 = SEQ ID NO: 51; HH2 + AGG PAM 서열 = SEQ ID NO: 52)으로 나타냈으며, 5' 시스-해머헤드 리보자임에 의해 성공적인 절단 (화살표)을 갖는다 (도 11c).
도 12는 특이적 앱타머의 존재하에 gRNA를 처리하기 위해 앱타자임을 사용하는 조절가능한 CRISPR 작제물을 보여준다. 특히, 도 12는 gRNA의 5' (청색)인 테오필린 앱타자임을 형성하는 해머헤드 리보자임의 헬릭스 II에 융합된 테오필린 앱타머 (주황색)를 도시한다. 테오필린의 결합은 헬릭스 II를 안정화시키고 이어서 해머헤드 자가-절단을 허용하고 gRNA를 자유롭게 한다. Cas9와 함께 gRNA는 현재 CRISPR 시스템에 의한 절단을 표적으로 할 수 있다.
방법
플라스미드 작제: U6, H1 또는 T7 프로모터에 의해 추진된 5' 시스-해머헤드 작제물을 생성하기 위해, 해머헤드 서열 (GTACGTTTCCTCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTTCGGTGCGTC; SEQ ID NO: 53)을 프로모터의 다운스트림, 및 gRNA 표적 및 스캐폴드의 업스트림에 위치시켰다. 헬릭스 I을 형성하기 위해, gRNA 표적 서열에 상보적인 10개 뉴클레오티드를 해머헤드 서열의 5'에 위치시키고, 이어서 이를 gRNA에서 발견되는 상보적인 서열에 결합시켰다 (도 12). 본 연구에 사용되는 다양한 gRNA를 생성하기 위해, 중첩 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 2-단계 증폭 Phusion Flash DNA 중합 효소 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 PCR로 증폭하고, 후속하여 2X 부피 25% PEG 및 1.5M NaCl과 혼합된 카르복실레이트-변형된 세라-Mag 마그네틱 비즈 (Carboxylated-Modified Sera-Mag Magnetic Bead) (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정제하였다. 이어서 정제된 PCR 생성물을 H2O에 재현탁시키고 NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량하였다. 약간의 변형을 가한 gRNA-발현 작제물을 Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson et al. (2009) Nature Methods 6:343-345)을 사용하여 생성하였다. 총 반응 부피는 20μl에서 2μl로 감소되었다.
세포 배양: mTeSR1 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)에서 성장 인자 감소된 Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 상의 클론 증식에 의해 hESC 라인 H7 및 IMR-90 iPS 세포 (WiCell, Madison WI)를 이전에 기술된 프로토콜 (Walker et al. (2010) Nat. Commun. 1:71; Maruotti et al. (2013) Stem Cells Translational Medicine 2: 341-354)에 따라 10% CO2/5% O2 인큐베이터에서 유지시켰다. 계대 배양을 위해, hESC 콜로니를 먼저 mTesR1에서 5μM 블렙비스타틴(blebbistatin) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)과 함께 인큐베이션한 다음, Accutase (Sigma-Aldrich)로 5-10분 처리한 후 수집하였다. 세포 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 완만하게 분해하고 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 그 후, hPSC를 블렙비스타틴을 갖는 mTeSR1에 재현탁시키고 대략 1,000-1,500 세포/cm2로 플레이팅하였다. 계대 배양 2일 후, 배지를 mTeSR1 (블렙비스타틴 비함유)으로 대체하고 매일 교체하였다.
인간 배아 신장 (HEK) 세포주 293T (Life Technologies, Grand Island, NY)를 10% 소태아 혈청(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) 및 2mM GlutaMAX (Invitrogen) (Invitrogen)가 보충된 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM)에서 5% CO2/20% O2와 37℃에서 유지하였다.
H7 세포의 유전자 표적화: hESC 세포를 전기천공 24시간 전에 10μM Rho 키나제 억제제 (DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA)에서 배양하였다. 전기천공을 제조사의 지시에 따라 Neon 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 간략하게는, 전기천공일에, hESC를, 콜로니를 채취할 때까지 Accutase (Sigma-Aldrich)로 1-2분 동안 분해시켰다. 중요하게는, 콜로니은 단일 세포 현탁액으로 해리되지 않았다. 콜로니 수거 후, 습식 펠렛을 얼음 위에서 15분 동안 유지한 다음, 유전자 표적화 플라스미드를 함유하는 전기천공 완충액에 재현탁시켰다. 전기천공 파라미터는 다음과 같다: 전압: 1400 ms; 간격: 30 ms; 1 펄스. 전기천공 후, 세포 콜로니를 10 μm Rho 키나제 억제제를 함유하는 mTeSR1 매질로 서서히 옮기고, 이어서 20분 동안 실온에서 유지시킨 후 Matrigel-코팅된 접시에 플레이팅시키고 추가로 배양하였다.
클론에 의해 유도된 콜로니의 분석을 위해, 전기천공된 hESC를 준포화상태로 성장시키고, 이전 단락에 기재된 바와 같이 계대 배양하고 35mm 접시 당 500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 후속하여, 단일 콜로니를 수동 채취에 의해 분리하고 추가로 배양하였다.
상시적으로 발현된 GFP ESC 라인의 생성: H7 인간 ESC 라인 (WiCell)을 Matrigel 기질상의 mTeSR1 (Stem Cell Technologies) 배지에서 유지시켰다. 세포 계대배양 전에, 세포를 블렙비스타틴으로의 간단한 전-처리로 처리하여 (> 5 분) 세포 생존력을 높이고, Accutase로 7분 동안 처리하고, 단일 세포 현탁액으로 분쇄하고, 동일한 용적의 mTesR로 켄칭시키고, 5분 동안 80xg로 펠렛화시키고 블렙비스타틴을 함유하는 mTesR 중에 재현탁시켰다. 1x106 세포를 펠렛화하고, 배지를 조심스럽게 제거하고, 세포를 10-15분 동안 얼음 위에 두었다. R-완충액 중에 AAVS1 세이프-하버(safe-harbor) 로커스에 대한 상동부를 함유하는 10μg의 AAV-CAGGSEGFP 도너 벡터 (#22212, Addgene), + 각 5μg의 hAAVS1 1R + L TALEN (#35431 및 35432, Addgene) (Hockemeyer et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27: 851-857; Sanjana et al. (2012) Nature Protocols 7: 171-192)를 하기 파라미터에 따라 Neon Transfection System (Life Technologies)을 사용하여 100μl 팁-타입으로 전기천공하였다: 1500V, 20ms 펄스 및 1 펄스. 이어서, 세포를 1ml의 배지에 완만하게 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 이어서 mTeSR 및 5μM 블렙비스타틴을 함유하는 Matrigel-코팅된 35mm 접시에 플레이팅하였다. 2일 후, 세포를 1x104의 밀도로 시딩한 후, 안정한 클론 서브라인을 형광 장착된 Nikon TS100 형광 현미경을 사용하여 수동으로 선택하였다.
게놈 변형에 대한 서베이어 검정 및 시퀀싱 분석: 서베이어 분석에 있어서, 게놈 DNA를, QuickExtract 용액 (Epicentre, Madison, WI) 중에 세포를 재현탁시키고, 65℃에서 15분 동안 이어서, 98℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 추출하였다. DNA 세정 및 농축기 (DNA Clean and Concentrator) (Zymo Research, Irvine, CA)를 사용하여 추출 용액을 세정하고 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였다. CRISPR 표적 부위를 둘러싼 게놈 영역을 100ng의 게놈 DNA로부터 Phusion DNA 중합효소 (New England Biolabs)를 사용하여 증폭시켰다. 다수의 독립적인 PCR 반응물을 모으고, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen MinElute Spin Column을 사용하여 정제하였다 (Qiagen, Valencia, CA). 12.5mM Tris-HCl (pH 8.8), 62.5mM KCl 및 1.875mM MgCl2에서 400ng의 PCR 생성물을 함유하는 8μl 용적을 변성시키고 서서히 리어닐링시켜 헤테로듀플렉스가 형성되게 하였다: 95℃에서 10분, -1.0℃/초로 95℃에서 85℃로 감소, 85℃에서 1초, -1.0℃/초로 85℃에서 75℃로 감소, 75℃에서 1초, -1.0℃/초로 75℃에서 65℃로 감소, 65℃에서 1초, -1.0℃/초로 65℃에서 55℃로 감소, 55℃에서 1초, -1.0℃/초로 55℃에서 45℃로 감소, 45℃에서 1초, -1.0℃/초로 45℃에서 35℃로 감소, 35℃에서 1초, -1.0℃/초로 35℃에서 25℃로 감소, 및 이어서 4℃에서 유지. 1μl의 서베이어 인핸서(Surveyor Enhancer) 및 1μl의 서베이어 뉴클레아제(Surveyor Nuclease) (Transgenomic, Omaha, NE)를 각 반응물에 첨가하고, 42℃에서 60분 동안 인큐베이션 한 후, 1μl의 정지 용액을 반응물에 첨가하였다. 2100 Bioanalyzer에서 DNA 1000 칩 (Agilent, Santa Clara, CA)을 사용하여 1μl의 반응물을 정량하였다. 겔 분석을 위해, 2μl의 6X 로딩 완충액 (New England Biolabs)을 나머지 반응물에 첨가하고 에티듐 브로마이드를 함유하는 3% 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 겔을 Gel Logic 200 Imaging System (Kodak, Rochester, NY)에서 시각화하고, ImageJ v.1.46을 사용하여 정량하였다. NHEJ 빈도는 2항 유도 방정식을 사용하여 계산하였다:
유전자 변형% =
Figure pct00003
여기에서, "a" 및 "b"의 값은 배경 감산 후 절단된 단편의 통합된 영역에 해당하며, "c"는 배경 감산 후 비-절단된 PCR 생성물의 통합된 영역에 해당한다 (Guschin et al. (2010) Methods in Molecular Biology 649: 247-256).
실시예 4
개요
망막 색소변성 (RP)은 망막 광수용체 세포(간상체 및 추상체)의 기능장애 및 사멸이 시력 상실 및 잠재적으로 실명으로 이어지는 유전적 망막 변성 질환이다. RP의 상염색체 열성 및 상염색체 우성 유전형 둘 모두가 존재한다 (각각 ARRP 및 ADRP). ARRP에서 질환의 원인이 되는 유전자의 둘 모두의 복사체에 돌연변이가 존재한다 (대부분의 유전자의 경우, 유전자의 한 복사체는 어머니로부터 유전되고, 다른 하나는 아버지로부터 유전된다). ARRP와 관련된 질환 유발 돌연변이는 일반적으로 관여된 유전자의 기능 손실을 발생시키고, 즉 망막 변성은 그 정상 기능을 수행하기 위해 관여된 유전자의 능력 손실 때문일 수 있다. 그러한 경우에, 적어도 이론적으로, 적절한 치료제를 개발하기 위해 무엇을 해야할 지는 매우 분명하다 - 손실된 유전자 기능을 대체할 필요가 있다. 이러한 접근법의 우수한 예는 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 의한 유전자 치료가 질환을 초래하는 결함성 RPE65 유전자의 기능을 대체하기 위해 사용되고 있는 레베르 선천 흑암시 (LCA)에 대해 진행 중인 인간 치료 연구이다.
ADRP에서, ARRP와 다르게, 질환-유발 유전자의 2개 복사체 중 하나만이 돌연변이된다. 대부분의 경우에, 단일 돌연변이된 이러한 유전자는 망막 변성을 일으키지 않는데, 그 이유는 이것이 손실된 기능을 갖기 때문이고; 오히려, 이것은 돌연변이가 간상체 및/또는 추상체 광수용체 세포에 독성이거나 유해한 기능인 새로운 기능을 획득한 유전자-생성물의 생산으로 이어지기 때문에 질환을 초래한다. 이러한 상황은 기능성 유전자의 도입이 충분하지 않으므로 유전자 대체 전략을 더욱 복잡하게 만든다; 효과적인 요법은 독성 돌연변이를 지닌 유전자로부터 생성된 "나쁜" 유전자-생성물의 발현을 없애기 위한 접근법을 개발할 것과 유전학자들이 "야생형" (WT) 유전자라고 부르는 유전자의 돌연변이되지 않은 복사체의 기능을 유지할 것 둘 모두를 필요로 한다.
현재, ADRP에 대한 FDA-승인된 치료제는 존재하지 않는다. 진행 중인 실험실 및 동물 조사 연구의 대부분은 2-단계 접근법을 취한다: 1) 유전자의 돌연변이된 복사체 및 WT 복사체 둘 모두의 기능 제거, 및 이어서 2) 일반적으로 AAV-매개된 유전자 요법을 통해, 내인성 WT 유전자를 파괴하는 제1 단계에 이용된 요법에 내성이 있는 WT 유전자의 새로운 "강화된(hardened)" 형태의 도입.
본원에 기재된 내용은 살아 있는 유기체의 게놈 정보를 정확하게 표적 편집하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 활용한 전략인 ADRP 치료를 위한 신규한 전략을 제공하며, 즉, 이는 유전자의 치료적 조절을 허용한다. 여기에 기재된 방법은 질환-유발 유전자의 돌연변이된 복사체를 특이적으로 변경시키기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용함으로써, 이것이 WT 유전자의 발현에 영향을 미치지 않으면서, 이의 독성 유전자 생성물을 발현시키지 않게 한다. 예를 들어, ADRP와 관련된 로돕신 유전자의 돌연변이체 형태 (P23H)를 특이적으로 표적화하여, 이의 서열을 변화시킴으로써, 이것이 더 이상 독성 유전자 생성물을 발현시키지 않도록 할 수 있다. 일부 구체예에서, CRISPR/Cas9 성분은 단일 AAV 바이러스 입자 내에서 눈으로 전달된다. 이 시스템은 ADRP의 P23H 로돕신 마우스 돌연변이체 모델에서 시험된다. 이러한 연구는 ADRP의 치료를 위해 망막 세포의 맞춤 유전자 공학에 기반한 유전자 요법의 새로운 접근법을 검증한다. 본원에 기재된 내용은 ADRP의 다양한 형태 뿐 아니라 다른 상염색체 우성으로 유전된 망막 이영양증에 이용가능하다.
특정 목표
상염색체 우성 형태의 망막 색소변성 (ADRP)은 RP의 모든 병증의 대략 30-40%를 구성하고, ADRP 환자 중에서 가장 일반적으로 돌연변이된 RP-관련 유전자는 간상체 시각 색소 로돕신을 엔코딩하는 유전자이다 (Dryja et al. (1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja et al. (1990) Nature 343, 364-366). 본원에 기재된 내용은 RNA 가이딩된 Cas9 엔도뉴클레아제가 맞춤형 소형 가이드 RNA (gRNA)와 함께 이용되어 돌연변이체 로돕신 대립유전자를 표적화하고 절단하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술 (Doudna & Charpentier (2014) Science 346, 1258096; Hsu et al. (2014) Cell 157, 1262-1278)을 이용하여 ADRP를 치료하는 접근법을 제공한다. 에러가 발생하기 쉬운 비-상동성 말단 결합 (NHEJ)은 정상적인 대립유전자에 영향을 주지 않으며, 돌연변이체 대립유전자의 발현을 특이적으로 녹아웃시킨다. 필요한 성분은 포유동물 간상체에서 보고된 성능을 지닌 AAV 혈청형인 단일 AAV5에 의해 광수용체로 전달될 수 있다. 로돕신의 야생형 수준의 50%의 발현만 발생하더라도, 동물 데이터는 이것이 임상적으로 유용한 간상체 기능을 제공하기에 충분하다고 제안한다 (Liang et al. The Journal of Biological Chemistry 279, 48189-48196).
질병 돌연변이의 CRISPR 표적화가, 마우스 및 다른 동물 연구를 통해, 시험관내 및 생체내에서 효과적인 것으로 나타났으나, 현재의 모든 접근법은 대부분 전달의 제약으로 인해 여전히 임상적 사용과 거리가 있다. AAV 벡터는 안구 유전자 요법에서 가장 빈번하게 사용되는 바이러스 벡터이다 (Dalkara & Sahel (2014) Comptes Rendus Biologies 337, 185-192; Day et al. (2014) Advances in Experimental Medicine and Biology 801, 687-693; Willett & Bennett (2013) Frontiers in Immunology 4, 261; Dinculescu et al. (2005) Human Gene Therapy 16, 649-663). 여러 특징은 AAV를 매력적인 선택으로 만든다: 바이러스는 비병원성이고, 이것은 분열하고 분열하지 않는 세포 둘 모두를 감염시키며, 발현은 오랜 기간 동안 지속될 수 있고, 이것은 특히 임상 시험에서 안전성, 효능 및 독성의 일반적인 결여의 이력에서 주목할 만하다. 추가로, 유리체강내 주사 후 광수용체 세포를 표적화하는데 효과적인 변이체 AAV 혈청형 및 프로모터의 조합물이 개발 중이다. 그러나, 현재의 상태에서 이러한 벡터는 면역 반응을 촉발시키고, 인간-크기의 눈에서 광수용체에 대한 효율적인 범망막 친화성이 부족하기 때문에 (Kotterman et al. (2015) Gene therapy 22, 116-126; Mowat et al. (2014) Gene Therapy 21, 96-105; Dalkara et al. (2013) Science Translational Medicine 5, 189ra176), 망막하 주사에 의해 투여되는 AAV5 벡터의 이미 잘 특성화된 사용에 초점이 맞춰질 것이다.
AAV 게놈은, 비록 이러한 제한을 가하면 감소된 패키징 효율 및 결실된 삽입물을 발생시키지만, 최대 5.2 kb의 재조합 DNA를 지니도록 변형될 수 있는 4.7kb 단일 가닥 DNA 분자이다 (Berns et al. (1986) Fundamental Virology, ed B.N. Fields and Knipe, D.M., 545-562 Raven Press). 일반적으로 사용되는 Cas9 단백질 (4.1kb) 자체를 엔코딩하는 유전자의 크기가 크기 때문에, 단일 바이러스 벡터를 통한 발현에 필요한 프로모터, 종결인자 및 바이러스 반전 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함하는 gRNA에 의한 전달은 현재 이러한 AAV 패키징 용량에 의해 제한된다. 실제로, 활성 CRISPR 복합체의 재구성은 단일 형질도입보다 덜 효율적인 공-형질 도입을 필요로 한다. 추가로, 이것은 잠재적으로 보다 큰 면역 반응 및 관련 독성을 유도할 수 있는 보다 큰 바이러스 용량을 필요로 한다. 또한, 인간 임상에서 제2 바이러스 벡터의 전달은 FDA 승인을 위한 추가적인 도전으로 이어질 가능성이 있다.
CRISPR/Cas9 기술의 개발은 유전자 편집 분야에 변혁을 일으켰다. 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)와 같은 게놈-편집 기술의 초기 방법은 표적화된 게놈 변형을 발생시키고 질병 돌연변이를 정밀하게 교정할 잠재력을 제공하는 능력을 부여하였다. 이러한 기술은 효과적이지만, ZFN 및 TALEN 쌍 모두 주어진 DNA 표적 부위에 대한 크고 고유한 인지 단백질을 합성해야 하므로 실행의 한계에 의해 제약이 있다. 많은 그룹이 최근에 이러한 주요 제한사항을 우회하는 공학처리된 타입 II CRISPR/Cas9 시스템의 사용을 통한 고-효율 게놈 편집을 보고하였다 (Jinek et al. (2012) Science 337, 816-821; Cong et al. (2013) Science 339, 819-823; Mali et al. (2013) Science 339, 823-826). CRISPR/Cas9 시스템은 서열-특이적 DNA에 대한 Cas9 뉴클레아제를 표적으로 하는 가이드 RNA (gRNA)로 구성된다. CRISPR/Cas9 게놈 편집이 ZFN 및 TALEN에 의해 요구되는 뉴클레아제 내의 DNA 결합 도메인의 독특한 조합보다는 게놈 표적화를 위한 짧은 합성 gRNA에 의존적이므로, ZFN 및 TALEN 발현에 필요한 작제물을 제조하는데 드는 시간 소모적이고 고된 작업이 생략된다. CRISPR/Cas9 시스템을 위한 작제물을 생성하는 것은 단순하고 빠르며, 표적은 다중화될 수 있다. CRISPR 시스템에 의한 절단은 20-뉴클레오티드 DNA 서열에 대한 gRNA의 상보적인 염기쌍 형성 및 표적 부위의 3'측에서 발견된 짧은 뉴클레오티드 모티프인 필요한 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 요구한다. 이론적으로, CRISPR 기술을 사용하여 게놈에서 임의의 고유한 N20-PAM 서열을 표적화할 수 있다. 현재, 가장 덜 제한적이고 가장 일반적으로 사용되는 Cas9 단백질은 서열 NGG를 인지하는 S. 피오게네스(S. pyogenes)에서 유래된 것이므로, CRISPR 표적화 서열은 N20NGG이다. NGG 서열에서 축퇴성 N은, 20개 뉴클레오티드 (N20)의 고유한 서열이 주어지는 경우, Cas9가 대립유전자의 정확한 표적화에 문제가 될 수 있는 N20 AGG, N20 TGG, N20 CGG, 및 N20 GGG를 동등하게 절단할 것을 의미한다.
생체내 로돕신 유전자 표적화를 위해, 필요한 CRISPR/Cas9 이펙터 분자는 적절하게 공학처리된 AAV5 벡터의 망막하 투여에 의해 간상체 세포에 전달된다. 혈청형 5 벡터는 비인간 영장류 (Mancuso et al. (2009) Nature 461, 784-787) 및 개 (Beltran et al. (2012) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 2132-2137) 둘 모두의 광수용체를 형질도입하는데 있어서 매우 효율적이고 망막 요법을 매개할 수 있음이 밝혀졌다. 비록 캡시드 변형된 AAV 벡터가 마우스의 유리체로부터 광수용체로 침투할 수 있으나 (Petrs-Silva et al. (2011) Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy 19, 293-301), 지금까지 이들은 개 또는 비인간 영장류에서 유사하게 침투할 수 없었다 (비공개된 관찰).
AAV를 통해 Cas9 및 가이드 RNA를 전달하는데 있어서 중요한 도전과제는 두 성분 모두를 발현하는데 필요한 DNA가 AAV의 패키징 한계를 초과하여, 대략 4.7-4.9 kb인 한편, 통상적인 방법에 의해 Cas9 및 gRNA를 발현하는데 필요한 DNA는 5 kb를 초과한다는 것이다 (프로모터, 약 500bp; spCas9, 4,140bp; Pol II 종결인자, 약 250bp; U6 프로모터, 약 315bp; 및 gRNA, 약 100bp). 문헌[Swiech et al. (2015, Nature Biotechnology 33, 102-106)]은 2-벡터 접근법을 이용하여 이러한 도전과제를 해결하였다: Cas9를 전달하기 위한 하나의 AAV 벡터 및 gRNA의 전달을 위한 또 다른 AAV 벡터. 그러나, 이 연구의 이중 AAV 접근법은 망막 세포에서는 발현되나 간상체에서는 발현되지 않는, 특히 작은 프로모터인 뮤린 Mecp2 프로모터를 이용하였다 (Song et al. (2014) Epigenetics & chromatin 7, 17; Jain et al. (2010) Pediatric Neurology 43, 35-40). 따라서, 고안된 이러한 시스템은 ADRP의 대부분의 병증에 적합하지 않을 것이다. 본원에 기재된 내용은 효율을 증가시키고, 광수용체를 특이적으로 표적화하고, 바이러스 로딩 전달로부터 잠재적인 독성을 감소시키는 망막 유전자 편집을 위한 단일 벡터 접근법을 제공한다.
결과
H1 프로모터는, 오히려 보다 전통적으로 사용되는 U6 프로모터보다, gRNA 전사를 유도하는데 사용되어 왔고, 이용가능한 CRISPR 유전자 표적화 공간을 대략 두 배로 늘릴 수 있다 (Ranganathan et al. (2014) Nature Communications 5, 4516). 특히, 오프-표적 절단에 대한 낮은 경향이 검출되었는데, 이는 H1 프로모터가 치료적 접근법에 더욱 유리함을 시사한다. 이러한 연구 동안, 내인성 H1RNA 유전자에 가까운 근접 게놈에서 단백질-코딩 유전자 (PARP-2)의 존재가 주목되었다 (Baer et al. (1990) Nucleic Acids Research 18, 97-103; Myslinski et al. (2001) Nucleic Acids Research 29, 2502-2509). H1RNA의 시작부 (pol III RNA 전사체) 및 PARP-2 유전자 (pol II 전사체) 사이의 서열은 230bp이며 (도 13), 이는 상대적으로 작은 이러한 서열이 소형 양방향 프로모터로서 기능할 수 있음을 나타낸다. 이것은 pol II 및 pol III 전사체 둘 모두를 유도할 수 있고 둘 모두의 CRISPR 성분을 단일 AAV로 패키징하는 크기 장애를 극복하는데 사용될 수 있는 포유동물 게놈에서 유일한 양방향 프로모터 서열인 것으로 여겨진다.
이중 Cas9/gRNA 발현을 위한 양방향 pol II/III 프로모터로서 H1의 사용을 개발하기 위해, 이의 poll III 활성이 이미 잘 특성규명되어 있기 때문에, eGFP 리포터 작제물은 이의 pol II 활성을 더 잘 최적화하기 위해 생성되었다 (도 14). 인간 (HEK293) 및 마우스 세포 (NIH3T3)에서의 초기 결과는 약하지만, 명백하게 검출가능한 GFP 형광성을 나타내었는데, 이는 H1 프로모터가 비록 약할지라도 pol II 발현을 유도할 수 있었음을 나타낸다. 이러한 GFP 리포터 시스템을 이용하여, 시스템에서 3개의 가변 성분: 프로모터 서열, 5'UTR, 및 종결인자 서열을 평가함에 의해 프로모터의 소형화를 유지하면서 pol II 발현을 증가시켰다. 상이한 유기체로부터의 H1 프로모터 서열의 시험은 마우스 (176 bp) 및 래트 (207 bp) 둘 모두의 서열이 인간 H1 프로모터보다 강한 GFP 발현을 유도할 수 있음을 나타내었다 (각각 약 7 및 약 6배 높음). 그러나, 생체내에서 인간 세포와 함께 사용하기 위한 시스템을 도출하는 것이 목표이기 때문에, 가능한 경우 인간 프로모터 서열이 이용되었다. 상이한 종결인자 서열을 평가하기 위해, 7개의 상이한 서열을 시험하였고 SV40 (240 bp) 종결인자 및 49 bp 합성 폴리(A) 서열 (SPA) (Levitt et al. (1989) Genes & Development 3, 1019-1025) 둘 모두가 GFP 발현에 기능적인 것으로 밝혀졌다. 리포터 발현을 개선시키기 위해 5'UTR의 변형을 통해 번역 효율을 최적화하는 동안, 베타-글로빈 5'UTR 서열로부터 취해진 50 bp 서열의 삽입이 리포터 발현을 현저하게 개선시킬 수 있음이 발견되었다. 이러한 개념과 일관되게, 강한 Kozak 서열을 엔코딩하는 9개 염기의 단순 삽입 (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15, 8125-8148)(5'-GCCGCCACC-3')은 이들 수준의 근사치를 내는데 충분하였다 (도 15).
이러한 GFP-기반 최적화 실험으로부터 얻은 정보에 기반하여, Cas9 단백질 및 표적화 gRNA를 동시에 발현시키는 인간 H1 프로모터 서열을 이용하여 표적화 작제물을 생성하였다. 세포에서 절단을 지시하는 이러한 양방향 작제물의 능력을 시험하기 위해, NIH3T3 세포를 표준 2개 플라스미드 접근법 (pCAAGS:Cas9 및 H1:gRNA), 또는 둘 모두의 성분을 발현시키는 단일-플라스미드 시스템으로 전기천공시켰다. 마우스 게놈의 두 상이한 로커스가 표적화되었다. 전기천공한 지 48시간 후, 게놈 DNA를 회수하고, T7 Endo I (T7EI) 검정 (Ran et al. (2013) Nature protocols 8, 2281-2308)을 수행하여 게놈 변형의 수준을 정량하였다. 더욱 전통적인 서베이어 검정보다 오히려 T7EI 검정이 사용되었는데, 그 이유는 이것이 결실을 검출하는데 더 민감하다고 보고되었기 때문이다 (Vouillot et al. (2015) G3). CRISPR 절단은 충분히 AAV의 패키징 용량 내에서 약 4.7 kb의 소형 양방향 시스템을 사용하여 이러한 두 로커스에 효과적으로 표적화 될 수 있음이 밝혀졌다 (도 16a 및 도 16b). 인간 세포에서의 이러한 표적화 전략의 이용가능성 및 타당성을 추가로 보여주는 인간 H7 배아 줄기 세포주에서 Cas9 표적화에 대한 데이터가 존재한다. 인간 서열 대신 마우스 H1 프로모터, 및 SPA 종결인자 서열 대신 SV40 종결인자를 이용하여, 표적화 작제물의 크기는 이론적으로 200 bp만큼 더 감소할 수 있다. 이러한 서열 감소는 보다 효율적인 패키징을 가능하게 하거나, 잠재적으로 Cas9 시스템의 발현을 부스팅, 감소, 및 심지어 조절할 수 있는 서열 변형; 잠재적인 오프-표적 효과를 감소시키는데 중요할 수 있는 변형을 위한 추가 공간을 제공할 수 있었다. AAV 헬퍼-비함유 시스템 (Agilent)으로부터의 ITR 함유 벡터로 용이하게 클로닝될 수 있는 인접한 NotI 부위와 함께, Gibson 클로닝 방법 (NEB)을 이용한 간단한 표적 삽입을 허용하는 고유한 제한 부위를 지닌 양방향 플라스미드가 생성되었다.
Cas9 및 gRNA 프로모터의 설계 및 최적화, RNA 처리, 및 단일 AAV 벡터 시스템으로부터 효과적으로 발현되어 적절한 GMP -유사 전임상 벡터를 생성할 수 있도록 하는 구조적 엘리먼트.
Cas9 및 gRNA의 발현을 동시에 유도하기 위한 양방향 H1 프로모터의 조합, 및 최적화 노력을 통해, AAV 패키징 용량 아래로 CRISPR 전달 크기를 감소시킴에 있어서 이미 상당한 진전이 있었다. 대안적 프로모터 서열, 5'/3' UTR 변형, 및 상이한 gRNA로부터의 다양한 조합은 표적화 효율의 잠재적인 스펙트럼을 시험하기 위한 툴키트를 제공한다.
일단 작제물이 크기, 발현, 및 절단 효율의 측면에서 더욱 최적화되면, 이들은 시험관내 및 생체내에서 시험용 AAV 벡터를 생성하는데 이용될 수 있다. 최적화 연구에 이용되는 작제물은 AAV 생산을 위해 ITR 함유 벡터 플라스미드로의 클로닝을 허용하는 인접한 NotI 부위와 함께, 간단한 표적 삽입을 허용하는 고유한 제한 부위를 함유한다. 세포 배양 및 마우스 연구를 위한 높은 역가의 GMP-유사 전임상 AAV5 벡터는 헬퍼-비함유, 플라스미드 형질감염 방법을 이용하여, 독립적인 벡터 생산 시설에서 생성되고, 이전에 개발된 기술 (본 발명자들이 개발하였다 (Dryja et al. (1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja et al. (1990) Nature 343, 364-366)에 의해 정제될 수 있다. 각 바이러스 제조물은 최종 벡터에서 WT 아데노바이러스 및 복제-능력이 있는 AAV 오염을 제거하는 pDG 미니-Ad 플라스미드 DNA 헬퍼 시스템을 이용하여 생산될 수 있다. 벡터는 아이오딕사놀 구배 원심분리에 이어 Q-컬럼 FPLC 크로마토그래피에 의해 정제된다. AAV 벡터 원액의 GMP-유사 순도를 확립하기 위해, 각각의 벡터는 순도, 바이오버든(bioburden), 멸균성, DNA 함유 입자 역가, 감염 역가, 입자-대-감염율 및 복제-능력이 있는 AAV에 의한 잠재적인 오염의 평가를 포함하는 물리적 및 생물학적 검정의 표준화된 배터리로 처리될 수 있다.
지금까지 H1 프로모터에 의한 연구가 낮은 수준의 오프-표적 효과를 나타내었으나 (Ranganathan et al. (2014) Nature Communications 5, 4516), 작제물은 궁극적인 임상적 사용의 목적으로 개발되고 있기 때문에, 이들은 잠재적인 오프-표적 활성에 대해 신중하게 모니터되어야 한다 (Wu et al. (2014) Quantitative Biology 2, 59-70). 이를 위해, 몇 가지 보완적인 접근법이 추구될 수 있다. 생물정보학 접근법을 사용하여, 인간 및 마우스 게놈의 모든 잠재적인 CRISPR 부위는 23-mer CRISPR 서열 부위의 가닥 및 중첩 발생 둘 모두를 검색하도록 작성된 맞춤 Perl 스크립트를 이용하여 결정되었다 (Ranganathan et al., manuscript in preparation, 2015). 예를 들어, 인간 게놈에서, 반복 서열을 여과한 후 137,409,562 CRISPR 부위의 초기 세트가 확인되었다. 그 후 각 부위는 3' 또는 PAM 말단쪽으로 편향된 23-염기 서열의 고유함(uniqueness)에 기반하여 값을 할당하는 맞춤 알고리즘에 따라 점수가 매겨졌다 (시드 영역)(Jinek et al. (2012) Science 337: 816-821). 마지막으로, Bowtie (Langmead et al. (2009) Genome Biology 10, R25)를 이용하여 오프-표적 효과를 나타내는 각 부위의 경향을 계산함으로써 표적화 서열을 통틀어 3개 이하의 염기 미스매치를 허용하도록 각 CRISPR 사이트를 다시 게놈에 대해 재정렬하였다. 계산상 예측된 오프-표적을 이용하여, 각 gRNA는 임의의 거짓 표적화에 대해 시험될 수 있다. 예측된 잠재적인 오프-표적 부위에 인접한 PCR 프라이머는 그 후 T7EI 검정으로 절단 효능에 대해 시험될 수 있는 게놈 서열을 증폭시키는데 이용될 수 있다. 이것은 시험관내 및 생체내 둘 모두의 최적화 실험에 대한 표적화 정확도의 모니터링을 가능하게 할 것이다. 비록 5% 미만이 허용될 것이나, 0.5% 미만의 오프-표적 절단이 목표일 것이다.
초점은 표준 Cas9 표적화였지만, 대안적인 PAM 서열 표적화를 포함하는 대안적인 접근법이 또한 고려된다. Cas9는 표준 NGG 서열 외에 NAG를 갖는 PAM 모티프를 표적화하는 것이 보고되었다 (Hsu et al. (2013) Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.2647). 추가적인 표적화 부위를 제공할 수 있는, 인간 서열의 2개의 CRISPR 서열 및 그 P23H 돌연변이와 중첩된 마우스 게놈의 3개의 표적화 서열이 확인되었다. NAG PAM 부위가 NGG 부위보다 덜 효율적으로 표적화될 것으로 예상되지만 (Zhang et al. (2014) Scientific Reports 4, 5405), 이는 작제물이 유의한 오프-표적 효과를 갖는다고 판단되는 경우 유용할 수 있는, 투여량을 적정하는 메커니즘을 제공할 수 있다. NAG PAM 부위를 이용한 5개 서열이 Gibson 어셈블리 (NEB)를 사용하여 초기에 pH1v126으로 클로닝될 수 있다. 2개의 인간 서열은 Cas9 플라스미드에 의해 293 세포로 공-형질감염 (Lipofectamine 3000)될 수 있는 반면, 마우스 플라스미드는 Cas9 플라스미드에 의해 NIH3T3 세포로 전기천공 (Invitrogen, Neon)될 수 있다. gRNA 활성을 검출하기 위해, 정준 NGG 뿐만 아니라 비-정준 NAG 부위 사이의 Cas9 절단 부위에서 NHEJ에 의해 도입된 indel 돌연변이의 비율을 정량할 수 있다.
P23H 대립유전자의 발현을 특이적으로 억제하기 위해 Cas9의 뉴클레아제-죽은 형태(dCas9)를 활용하는 CRISPRi로 알려진 대안적인 치료적 접근법이 또한 이용될 수 있다 (Qi et al. (2013) Cell 152, 1173-1183; Gilbert et al. (2013) Cell 154, 442-451; Larson et al. (2013) Nature Protocols 8, 2180-2196; Fuller et al. (2014) Advances in Experimental Medicine and Biology 801, 773-781). 절단을 유도하는 대신, dCas9는 DNA 서열에 단단히 결합된 채로 남아 있고, 활발히 전사된 유전자 내부에서 표적화될 때, 입체 장애 메커니즘을 통한 pol II 진행의 억제는 효율적인 전사 억제로 이어질 수 있다. DNA 파손을 유도하지 않고 P23H의 치료적 억제를 달성하고, 항시적 AAV 발현을 제공함으로써, 전사 억제제의 AAV5 전달은 유전자 요법 및 규제 장애의 관점 둘 모두로부터 유리할 수 있었다. CRISPRi에 의한 전사 억제는 로돕신의 대립유전자-특이적 발현을 측정하기 위해 qRT-PCR을 사용하여 최적화될 수 있다.
P23H 마우스로부터의 일차 광수용체 배양액을 이용하여 시험관내 돌연변이체 로돕신 대립유전자의 발현을 절단하고 녹아웃시키기 위해 개발된 AAV5 벡터의 능력 검증.
일차 마우스 광수용체 세포 배양액은 동물 연구로 진행되기 전에 시험관내에서 표적화 작제물을 검증하는데 이용될 수 있다. 출생후 2-10일된 동물을 이용하여 표적화 검정을 위한 세포를 분리하기 위해 마우스 망막을 수거하고 분리하였다. 인간 (h) Rho:GFP 마우스의 작제물을 시험 (Chan et al. (2004) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 9109-9114)하여 로돕신 표적화를 더욱 최적화할 수 있다. hRho-GFP 녹인(knock-in) 마우스는 마우스 로돕신 개방형 해독틀로 녹킹된(knocked) 인간 로돕신-GFP 융합물을 함유한다 (도 17). 부분적으로 인간화된 이 마우스는 광수용체 세포에서 인간 특이적 서열의 표적화를 허용한다. 인간 rho 서열은 표적화될 수 있고, 그 후 광수용체로부터 GFP의 손실이 정량될 수 있다. 비록 로돕신이 표적화되지만, GFP 리포터가 인 프레임(in frame)으로 융합되므로, 형광의 손실은 업스트림 표적 부위에서 에러가 발생하기 쉬운 NHEJ에 대한 편리한 프록시의 역할을 한다. 망막 세포 전기 천공에 의해, 10-20%의 형질감염 효율이 일상적으로 달성되며, CRISPR 변형된 세포 집단을 풍부하게 하기 위해, 형질감염된 집단은 Cas9 형광 리포터의 세기에 기반하여 분류될 수 있다. Cas9 활성을 손상시키지 않으며 형광 활성을 모니터할 수 있는 다양한 P2A:리포터 단백질과 융합된 여러 Cas9 작제물이 생성되었다. Rho:GFP 마우스의 망막 배양액을 이용하여, Cas9:P2A:mCherry 리포터 및 표적화 gRNA가 전기천공될 수 있다. 그 후, 24시간의 배양 후, 이중-양성 세포를 선별하여, 형질감염된 광수용체를 풍부하게 할 수 있다. 48시간 후, 세포를 QuickExtract 완충제 (Epicentre)에 재현탁시켜 게놈 DNA를 회수할 수 있고, T7EI 검정에 의해 게놈 변형에 대해 검정하였다. 유사하게, 로돕신 돌연변이의 표적화는 P23H 마우스로부터의 일차 광수용체 배양액을 이용하여 확인될 수 있다. 심지어 낮은 수준의 형질감염 (10%)에서도, 게놈 편집은, 초기 결과와 일관되게, 작제물의 표적화 효율이 10% 초과인 경우, T7EI 검정을 이용하여 검출될 수 있다. 추가로, AAV5 벡터의 사용은 상당히 높은 형질도입 효율을 가져야 한다.
온-표적 및 오프-표적 부위의 고해상도 및 고감도 부위-특이적 딥 시퀀싱 분석도 수행될 것이다. CRISPR 표적 부위 및 예측된 오프-표적 부위에 인접한 게놈 서열은 고-충실도 중합효소 (NEB, Phusion)를 이용하여 15 사이클 동안 증폭된 다음, DNA 세정 & 농축기-5 (Zymo)를 이용하여 정제될 수 있다. 정제된 PCR 생성물은 Illumina P5 어댑터 및 샘플-특이적 바코드를 부착하기 위해 5 사이클 동안 증폭되고, 다시 정제된 다음, SYBR 녹색 형광에 의해 정량되고, BioAnalyzer 상에서 분석되고, 최종적으로 MiSeq 퍼스널 시퀀서로 시퀀싱 전에 등몰 비로 풀링될 수 있다. 시퀀싱 데이터를 분석하기 위해, 300bp의 페어드-엔드(paired-end) MiSeq 리드(reads)를 Illumina MiSeq Reporter 소프트웨어를 이용하여 역-다중화시킨 다음, 원시 리드의 어댑터 및 품질 트리밍이 이어질 것이다. 정렬은 야생형 서열에 대한 모든 리드에 대해 수행될 것이고 NHEJ 빈도는 다음에 의해 계산될 것이다: 100 x (인델 리드의 수 / 인델 리드의 수 + WT 리드의 수).
P23H 마우스에 망막하 주사 후 생체내에서 돌연변이체 로돕신 대립유전자를 절단하고 발현을 녹아웃시키기 위한 SA2로부터의 개선된 벡터의 능력 검증.
다음 단계는 마우스에서 P23H로 로돕신 돌연변이의 생체내 표적화를 입증하는 것일 것이다. 생물정보학 연구로부터, 높은 점수를 받은 CRISPR 표적화 부위는 마우스 P23 코돈과 중첩되는 것이 확인되었다. 형태 N20NGG의 CRISPR 부위는 역 가닥 상에 있다: 5'-AGTACTGTGGGTACTCGAAGGGG-3' (PAM 밑줄). P23H 돌연변이는 CCC 프롤린 코돈을 CAC 히스티딘 코돈으로 변경시키는 C→A 전위이다. 불행히도, CRISPR 부위 내 마우스 P23H 돌연변이의 위치는 NGG PAM 모티프의 N에 해당되는데, 이는 표적 부위에서 bp 동일성으로부터 자유로운 유일한 위치이다. 이는 P23H 서열에 대해 유도된 CRISPR이 야생형 및 P23H 서열을 구별할 수 없고, 이에 따라 표적화가 둘 모두의 대립유전자를 절단할 것으로 예상됨을 의미하므로, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 발생에 기반한 대안적인 접근법이 개발되었다.
인간 게놈에서 보고된 약 1700만개의 SNP (단일 염기 변이, 인델, STR, MNP 등 포함)(180bp마다 약 1개)가 존재하고, 이 변이는 개인맞춤형 게놈 의학의 맥락에서 대단히 중요하다. 천연 유전 변이를 활용하는 것은 마우스 모델에서 P23H 로돕신 대립유전자를 특이적으로 표적화하는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 미래의 게놈 공학 및 치료 접근법에 더욱더 관련될 수 있는 개념 증명 접근법을 입증한다고 추론되었다. Castaneus (Cast) 마우스는 C57BL/6J 서열과 상이한 로돕신 유전자의 프롤린 23 코돈 내에 SNP를 함유하는 것이 발견되었고, C57BL/6J 유전적 배경 상의 P23H 돌연변이체 마우스가 분석을 위해 수득되었다. SNP는 P23H에서 원인적 C→A 전위에 바로 인접하며, 이는 야생형 로돕신 대립유전자를 표적화하지 않고 우성 P23H 대립유전자의 표적화를 위한 접근법을 제공한다. P23H 돌연변이에 대한 배경이 C57BL/6J이기 때문에, 한 세대의 Cast/P23H 번식 후에, CRISPR 표적화가능한 로돕신 P23H 대립유전자, 및 단단하게 연결된 SNP의 차이로 인해, gRNA 표적의 "시드" 영역에서 위치 20에 있는 단일 미스매치만큼 상이한 야생형, CRISPR 내성 로돕신 대립유전자 둘 모두를 함유하는 이형접합 마우스를 수득하였다 (도 18a, 도 18b, 및 도 18c).
전략의 타당성을 검증하기 위해, P23H 돌연변이체 대립유전자에 존재하는 것인 C57BL/6J 프롤린 23 코돈 서열, 또는 이형접합 P23H/Cast 동물의 WT 로돕신 대립유전자에 존재할 서열인 Cast 마우스의 프롤린 23 코돈 서열을 표적화하는 H1 양방향 작제물을 생성하였다. NIH3T3 세포 (C57BL/6J SNP 함유)를 둘 모두의 작제물로 독립적으로 전기천공시키고, 게놈 DNA를 분리한 다음, T7EI 검정을 수행하여 게놈 변형의 수준을 정량하였다. 특이적 로돕신 표적화가 관찰되었다: C57BL/6J (즉, P23H) 유도된 작제물만이 현저한 절단을 가져왔고, 게놈 변형의 수준은 50%에 근접한데, 이는 전체 전기천공 효율이 80% 이하인 경우 표적화 잠재력이 과소평가된 것일 수 있다 (도 19). 로돕신 표적화 부위, 및 소형 양방향 작제물에 의해 절단을 유도하는 능력을 검증하는 것 외에, 이 결과는, 단일 염기 미스매치를 함유하는 Cast 로돕신 서열에 기반한 gRNA처럼, SNP/돌연변이체 서열에서 특이적으로 발생하는 시험관내 절단이 검출가능한 Cas9 절단을 생성하지 못했음을 입증하였다.
CRISPR 표적화의 제한 요인은 효과적인 전달인 것으로 일반적으로 고려되며, AAV5-매개된 전달은, 심지어 큰 눈에서도, 광수용체의 대다수를 형질도입할 수 있는 것으로 나타났다. 이 높은 형질도입률, 형질도입된 세포 중 50% 이상에서 발생하는 유전자 편집, 및 NHEJ 사건의 2/3가 인 프레임으로 이동 돌연변이를 발생시킴을 감안할 때, P23H 대립유전자의 발현의 녹아웃은 간상체의 대다수에서, 추가 최적화와 함께 상당한 복수의 간상체에서 달성되어야 한다. 이러한 수준의 표적화는 간상체의 직접 보존 및 추상체 생존에 대한 이차 효과 둘 모두를 통해, 광수용체 생존을 지지하고 합리적으로 좋은 수준의 시력을 유지하기에 충분해야 한다고 연구들은 시사한다 (Leveillard et al. (2004) Nature Genetics 36, 755-759; Leveillard & Sahel (2010) Science Translational Medicine 2, 26ps16; Sahel et al. (2013) Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie 251, 1669-1677). 최적화된 바이러스는 종래에 기재된 대로 P15에 10마리 마우스의 한쪽 눈에 망막하 주사될 수 있다 (Mao et al. (2012) Advances in Experimental Medicine and Biology 723, 199-205; Mao et al. (2012) Human Gene Therapy 23, 356-366; Mao et al. (2011) Human Gene Therapy 22, 567-575). 치료된 눈 vs 파트너 대조 눈의 ERG 및 SDOCT (Bioptigen) 분석은 치료한 지 2, 6, 및 12주 후에 수행될 수 있다. 12주에 치료된 눈에서 기능적 및 구조적 개선이 관찰된다고 가정하면, 장기간의 수명 연구가 이어질 것이다. 조직학적 분석은 희생시 수행될 수 있을 것이고, 이는 ONL 두께, 스파이더그램 및 외부 세그먼트에서의 적절한 국소화 및 로돕신 수준에 대한 웨스턴 블롯팅을 위한 면역조직학적 로돕신 검정을 포함할 것이다.
AAV5/CRISPR 치료의 오프-표적 효과가 평가될 수 있다. 전체 게놈 시퀀싱은 오프-표적 돌연변이의 평가에 있어 가장 덜 편향된 방법이며, 표적 부위를 확인하는데 이상적일 것이다. AAV 처리되고 처리되지 않은 눈으로부터의 마우스 망막은 회수 및 분리될 수 있고 게놈 DNA는 DNeasy Blood & Tissue 키트 (Qiagen)에 의해 추출되고 DNA는 Covaris AFA로 전단될 수 있다. DNA 단편은 말단-복구되고, A-테일링되고, Illumina 바코딩된 시퀀싱 어댑터에 라이게이션될 수 있다. 라이게이션된 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 바코딩된 전체-게놈 시퀀싱 라이브러리를 생성하고 HiSeq 플랫폼 (Illumina) 상에서 15x의 평균 범위로 시퀀싱할 수 있다. 그 후 시퀀싱 리드를 디폴트 파라미터를 갖는 'mem'모드 ( 'bwa mem')로 Burrows-Wheeler Aligner를 이용하여 인간 참조 게놈 (hg19/GRCh37)에 대해 정렬할 수 있다. 모든 CRISPR 절단 사건이 고유한 돌연변이를 발생시키므로, DNA 이중-가닥 파손 부위는 동일한 신규 돌연변이를 초래하지 않을 것으로 가정한다. 따라서, 다수의 샘플이 공유하는 모든 변이체를 폐기하는 것은 이후 생물정보학 분석에서의 필터링을 가능하게 할 것이다.
참고문헌
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 여기에 기재된 주제가 속하는 분야에서의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 각각의 개별적인 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌이 참조로서 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 언급한 것처럼 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다. 비록 많은 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌이 본원에 언급되었으나, 그러한 언급이 이러한 임의의 문서가 당 분야의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정이 되는 것은 아님이 이해될 것이다.
전술한 주제가 이해의 명료성을 위해 예시 및 실시예로서 일부 상세하게 기재되었으나, 특정 변경 및 변형이 첨부된 청구범위의 범위 내에서 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Zack, Donald Ranganathan, Vinod <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE EXPRESSION OF CRISPR GUIDE RNAS USING THE H1 PROMOTER <130> 111232-00401.P12924-02 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 cttcgatgtc gactcgagtc aaaaagcacc gactcggtgc cac 43 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 aaaatatgga acgcttcacg aatttg 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gttttagagc tagaaatagc aagttaa 27 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 aagcaccgac tcggtgccac 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ctcgcttcgg cagcacatat act 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 acgcttcacg aatttgcgtg tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting 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15 gcacggggcc gtcgccgatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 16 agcacggggc cgtcgccgat 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 17 ggtgctcagg tagtggttgt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 18 accgccgccg ggatcactct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 19 gtccatgccg agagtgatcc 20 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 20 gggtgggggg agtttgctcc tgg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 21 ggatggaggg agtttgctcc tgg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 22 gggagggtgg agtttgctcc tgg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 23 cgggggaggg agtttgctcc tgg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 24 ggggagggga agtttgctcc tgg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 25 ggtgagtgag tgtgtgcgtg tgg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 26 ggtgagtgag tgtgtgtgtg agg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 27 agtgagtgag tgtgtgtgtg agg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 28 gctgagtgag tgtatgcgtg tgg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <400> 29 tgtgggtgag tgtgtgcgtg agg 23 <210> 30 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA targeting sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(20) <223> n is a, c, g, or u <400> 30 annnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96 <210> 31 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> junction region of AAVS1 locus <400> 31 gcctctggcc cactgtttcc ccttcccagg caggtcctgc tttctctgac ctgcattctc 60 tcccctgggc ctgt 74 <210> 32 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 cagcctggaa gaccacatac aggaaacgta gccattcccc aggtgacctc tgtcgaatca 60 aag 63 <210> 33 <211> 74 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 acccagcctg gaagaccaca tacaggaaac gtagccattc cccaggtgac ctctgtcgaa 60 tcaaagcccc tacc 74 <210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delta 12 mutation of AN19NGG region of MERTK gene <400> 34 acccagcctg gaagaccaca tacaggaaac gtagtgacct ctgtcgaatc aaagccccta 60 cc 62 <210> 35 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delta 1 mutation of AN19NGG region of MERTK gene <400> 35 acccagcctg gaagaccaca tacaggaaac gtagccattc ccaggtgacc tctgtcgaat 60 caaagcccct acc 73 <210> 36 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delta 2, +2 mutation of AN19NGG region of MERTK gene <400> 36 acccagcctg gaagaccaca tacaggaaac gtagccattc gacaggtgac ctctgtcgaa 60 tcaaagcccc tacc 74 <210> 37 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delta 6 mutation of AN19NGG region of MERTK gene <400> 37 acccagcctg gaagaccaca tacaggaaac gtagcccagg tgacctctgt cgaatcaaag 60 cccctacc 68 <210> 38 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> delta 7 mutation of AN19NGG region of MERTK gene <400> 38 acccagcctg gaagaccaca tacaggaaac gtagccaggt gacctctgtc gaatcaaagc 60 ccctacc 67 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gtgctcgctt 60 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 acgaaacacc gnnnnnnnnn 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 acgaaacacc annnngnnnn 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 acgaaacacc cnngnnnnnn 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 acgaaacacc tnnngnnnnn 20 <210> 44 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 tctttggatt tgggaatctt ataagttctt atgagaccac tctttcccat aggggcgga 59 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (11)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 45 actctttccg nnnnnnnnn 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 actctttccc annnnnnnnn 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 actctttccc cnnnnnnnnn 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 promoter and gRNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (12)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 actctttccc tnnnnnnnnn 20 <210> 49 <211> 143 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme <220> <221> misc_feature <222> (1)..(143) <223> n is a, u, c, or g <400> 49 nnnnnnnnnn cugaugaguc cgugaggacg aaacgaggaa acucgucnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu uaucaacuug 120 aaaaaguggc accgagucgg ugc 143 <210> 50 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme <220> <221> misc_feature <222> (1)..(96) <223> n is a, u, c, or g <400> 50 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target site for hammerhead ribozyme <400> 51 ctcacctcta cgccagagcg cgg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target site for hammerhead ribozyme <400> 52 aggaaacgta gccattcccc agg 23 <210> 53 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hammerhead sequence <400> 53 gtacgtttcc tctgatgagt cccaaatagg acgaaacgcg cttcggtgcg tc 52 <210> 54 <211> 230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 sequence <400> 54 ggaattcgaa cgctgacgtc atcaacccgc tccaaggaat cgcgggccca gtgtcactag 60 gcgggaacac ccagcgcgcg tgcgccctgg caggaagatg gctgtgaggg acaggggagt 120 ggcgccctgc aatatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat 180 gtctttggat ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actttttccc 230 <210> 55 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme <220> <221> misc_feature <222> (1)..(82) <223> n is a, u, c, or g <400> 55 nnnnnnnnnn cugaugagau accagccgaa aggcccuugg cagugaaacg aggaaacucg 60 ucnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 82 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 agccccttcg agcagccgca gtactac 27 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 57 agccacttcg agcagccgca gtactac 27 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 58 agccctttcg agcagccgca gtactac 27 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Ser Pro Phe Glu Gln Pro Gln Tyr Tyr 1 5

Claims (64)

  1. a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA가 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및
    b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서,
    성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 표적 서열이 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함하는 시스템.
  3. 제 1항에 있어서, Cas9 단백질이 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈인 시스템.
  4. 제 1항에 있어서, Cas9 단백질이 타입-II Cas9 단백질인 시스템.
  5. 제 1항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 시스템.
  6. 제 5항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 또는 인간 세포인 시스템.
  7. 제 5항에 있어서, 진핵 세포가 망막 광수용체 세포인 시스템.
  8. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물이 로돕신인 시스템.
  9. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된 시스템.
  10. 제 1항에 있어서, 시스템이 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된 시스템.
  11. 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 세포에서 하나 이상의 유잔자 생성물의 발현을 변형시키는 방법으로서, 방법은
    a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA가 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, H1 프로모터; 및
    b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서,
    성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 세포 내로 도입시키는 것을 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 표적 서열이 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, Cas9 단백질이 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈인 방법.
  14. 제 11항에 있어서, Cas9 단백질이 타입-II Cas9 단백질인 방법.
  15. 제 11항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 또는 인간 세포인 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 세포가 망막 광수용체 세포인 방법.
  18. 제 11항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물이 로돕신인 방법.
  19. 제 11항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소되는 방법.
  20. 제 11항에 있어서, 시스템이 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자를 사용하여 세포 내로 도입되는 방법.
  21. 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 양방향 H1 프로모터는
    a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 한 방향으로 전사를 제공하는 조정 요소로서, gRNA가 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, 조정 요소; 및
    b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 반대 방향으로 전사를 제공하는 조정 요소를 포함하며,
    gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템.
  22. 제 21항에 있어서, 표적 서열이 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함하는 시스템.
  23. 제 21항에 있어서, Cas9 단백질이 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈인 시스템.
  24. 제 21항에 있어서, Cas9 단백질이 타입-II Cas9 단백질인 시스템.
  25. 제 21항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 시스템.
  26. 제 25항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 또는 인간 세포인 시스템.
  27. 제 25항에 있어서, 진핵 세포가 망막 광수용체 세포인 시스템.
  28. 제 21항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물이 로돕신인 시스템.
  29. 제 21항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소된 시스템.
  30. 제 21항에 있어서, 시스템이 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징된 시스템.
  31. 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법으로서,
    방법은 세포 내로 양방향 H1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입시키는 것을 포함하며, 여기에서 양방향 H1 프로모터는
    a) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 한 방향으로 전사를 제공하는 조정 요소로서, gRNA가 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되는, 조정 요소; 및
    b) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 반대 방향으로 전사를 제공하는 조정 요소를 포함하며,
    gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 표적 서열이 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함하는 방법.
  33. 제 31항에 있어서, Cas9 단백질이 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈인 방법.
  34. 제 31항에 있어서, Cas9 단백질이 타입-II Cas9 단백질인 방법.
  35. 제 31항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 또는 인간 세포인 방법.
  37. 제 35항에 있어서, 진핵 세포가 망막 광수용체 세포인 방법.
  38. 제 31항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물이 로돕신인 방법.
  39. 제 31항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물의 발현이 감소되는 방법.
  40. 제 31항에 있어서, 시스템이 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자를 사용하여 세포 내로 도입되는 방법.
  41. a) 촉매 코어 및 이로부터 연장된 헬릭스 I, 헬릭스 II, 및 헬릭스 III 듀플렉스 영역을 포함하는 시스-작용 해머헤드 리보자임으로서, 헬릭스 II 듀플렉스 영역 및 헬릭스 III 듀플렉스 영역 각각은 촉매 코어 반대의 루프 영역을 포함하며, 헬릭스 II 듀플렉스 영역은 리간드에 결합하는 앱타머를 포함하는, 시스-작용 해머헤드 리보자임;
    b) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, gRNA는 진핵 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 진핵 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하며, 뉴클레오티드 서열은 5' 말단 및 3' 말단을 포함하며, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단이 헬릭스 III 듀플렉스 영역에 직접 커플링된, 뉴클레오티드 서열을 포함하는
    앱타머-조절된 리보자임으로서;
    리간드의 앱타머로의 결합이 리보자임에서 입체형태적 변화를 유도하여 리보자임이 뉴클레오티드 서열의 5' 말단과 헬릭스 III 듀플렉스 영역 사이에서 자가-절단되고 gRNA가 방출되는, 앱타머-조절된 리보자임.
  42. 제 41항에 있어서, 리간드가 테오필린인 앱타머-조절된 리보자임.
  43. (a) RNA로 전사되는 경우, 제 41항의 앱타머-조절된 리보자임을 생성하는 코딩 서열; 및
    (b) 세포에서 RNA의 전사를 조절하는 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는 발현 작제물.
  44. 제 43항의 발현 작제물을 포함하는 진핵 세포.
  45. 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA 분자를 포함하는 세포에서 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는 방법으로서, 방법은 세포 내로 제 43항의 발현 작제물을 도입시키고, 리보자임의 활성을 변화시키는 양의 리간드와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 방법.
  47. 제 45항에 있어서, 세포가 대상체의 세포인 방법.
  48. 제 45항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  49. 제 45항에 있어서, 리간드가 테오필린인 방법.
  50. 안구 신경변성 질환을 이러한 질환의 치료가 필요한 대상체에서 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) i) CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA (gRNA)를 엔코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 H1 프로모터로서, gRNA는 대상체의 세포에서 DNA 분자의 표적 서열과 혼성화되고, DNA 분자는 세포에서 발현된 하나 이상의 유전자 생성물을 엔코딩하는, H1 프로모터; 및
    ii) Cas9 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 세포에서 작동가능한 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서,
    성분 (i) 및 (ii)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치하며, gRNA는 표적 서열을 표적으로 하고 이와 혼성화되며, Cas9 단백질은 DNA 분자를 절단하여 하나 이상의 유전자 생성물의 발현을 변형시키는, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하고,
    (b) 유효량의 시스템을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 망막 광수용체 세포의 기능장애 및/또는 치사가 대상체에서 관찰된 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 안구 신경변성 질환이 녹내장, 망막 변성 및 연령-관련 황반 변성으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  53. 제 50항에 있어서, 안구 신경변성 질환이 망막 색소변성 (RP)인 방법.
  54. 제 50항에 있어서, 세포가 망막 광수용체 세포인 방법.
  55. 제 50항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물이 로돕신인 방법.
  56. 제 50항에 있어서, H1 프로모터가 양방향성인 방법.
  57. 제 50항에 있어서, 시스템이 대상체로의 투여 전 단일 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자 내로 패키징되는 방법.
  58. 제 50항에 있어서, 대상체로의 투여가 망막하 주입에 의해 발생되는 방법.
  59. 제 50항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  60. 제 50항에 있어서, Cas9 단백질이 타입-II Cas9 단백질인 방법.
  61. 제 50항에 있어서, 표적 서열이 뉴클레오티드 서열 AN19NGG, GN19NGG, CN19NGG, 또는 TN19NGG를 포함하는 방법.
  62. 제 50항에 있어서, Cas9 단백질이 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈인 방법.
  63. 제 50항에 있어서, 리보자임의 활성을 변화시키는 양의 리간드와 제 43항의 발현 작제물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 리간드가 테오필린인 방법.
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