CN110029121A - 一种铜绿假单胞菌CRISPRi***的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铜绿假单胞菌CRISPRi***的构建方法，该方法包括选择一个可诱导的穿梭质粒，将CRISPRi‑dCas9基因***到穿梭质粒中，依据铜绿假单胞菌的必需基因和非必需基因，设计相应的sgRNA表达序列，最后将sgRNA表达序列***至上述重组质粒中即得CRISPRi***。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌CRISPRi***的构建 方法。
背景技术
铜绿假单胞菌是烧伤感染的重要病原菌铜绿假单胞菌，是烧、创伤患者局 部感染和全身感染的常见病原菌。根据中国细菌耐药检测网2016年调查公布 的数据，铜绿假单胞菌在临床中所有的分离病原菌中排5位，占了8.66％。在 烧伤病房中，铜绿假单胞菌在所有病原菌中的构成比更高，达到18-43.6％。 在很多烧伤病房，尤其是烧伤ICU病房中，铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌交 替处于检出率最高的致病菌。铜绿假单胞菌相比鲍曼不动杆菌携带更多的毒 力因子。除了荚膜、内毒素外，铜绿假单胞菌还携带III型分泌***，可以 分泌ExoU和ExoS等毒力蛋白。铜绿假单胞菌可引起局部感染，包括皮肤、皮 下组织、骨、耳、眼、尿路、心脏瓣膜和术区感染，还可引起全身性感染。铜 绿假单胞菌感染不仅会导致烧伤患者创面加深，植皮失败，还可引起烧伤全身 感染和脓毒休克，是导致患者死亡的重要病原菌。雪上加霜的是，铜绿假单胞 菌的耐药也日益严峻。中国细菌耐药检测网2016年数据指出，在中国分离的 铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为28.7％。经调查也发现，在烧伤病房铜绿 假单胞菌的耐药更加严峻，对亚胺培南和美罗培南的耐药率都达到了65％以上。同时多重耐药铜绿假单胞菌和泛耐药铜绿假单胞菌的检出率也很高。多重耐药 菌(Multidrug-resistant，MDR)在临床上的分离率为54.59％，而泛耐药菌 株(ExtensivelyDrug Resistant，XDR)在临床中的分离率达到21.42％。 泛耐药铜绿假单胞菌是指仅对1～2种潜在有抗不动杆菌活性的药物[主要指 多黏菌素)敏感的菌株。泛耐药铜绿假单胞菌的出现严重威胁烧伤患者的生命 安全，向人类敲响了警钟。
目前临床上可用的铜绿假单胞菌感染的抗生素有β内酰胺类、碳青霉烯 类、氨基糖苷类、喹诺酮类和黏菌素(中国大陆地区不可用)等。以上抗生素 的靶点集中在青霉素结合蛋白、30S亚基16S rRNA和DNA回旋酶等细菌的必 需基因。细菌的必需基因是开发抗生素的重要靶点，目前临床上使用的抗生素 都是靶向细菌必需基因的。因此，亟需对铜绿假单胞菌的必需基因进行深入研 究，以寻找更多潜在的抗生素靶点。
目前文献报道铜绿假单胞菌的必需基因数量在300-400个左右，不同的 菌株，或不同的培养条件，用不同的方法得到必需基因的数量略有差异。尽管 铜绿假单胞菌的必需基因数目和种类已基本明确，但是很多必需基因的功能仍 缺乏研究，在铜绿假单胞菌PAO1中有46个必需基因功能未知。对铜绿假 单胞菌必需基因的功能进行深入研究，能够帮助寻找新的抗生素作用靶点，应 对日益严峻的耐药问题。传统的细菌必需基因的功能研究方法包含：1、干扰 RNA(RNAi)，通过siRNA调控必需基因的表达。2、通过替换的方法，现在基 因组中其他位置***一个可诱导的相同基因，再敲除原位点的基因。以上两种 方法的优点在于技术成熟，缺点在于操作过程复杂，不易用于高通量研究。 CRISPR interference(CRISPRi)技术是近年来用于研究基因功能的一个高 效有力的手段。
CRISPR-Cas9是目前应用最广泛的CRISPR***，除了被用于在细胞系、 干细胞和诱导多功能干细胞水平上快速高效的编辑原核细胞和真核细胞的基 因外，还在很多其他领域被广泛使用。比如，利用失活的CRISPR-Cas9蛋白(简 称dCas9蛋白)结合使用特异性引导RNA，可以达到特异性调控某一基因表达 水平的目的。目前，高覆盖量的sgRNA库已经诞生，可以覆盖到细胞的每一个 基因，再通过正负筛选的方法，筛选到感兴趣的通路或基因，这一技术大大拓 展了科学家研究功能基因组学的方法。很多病毒或毒力因子的靶点和重要信号 通路经过这种方法被识别出来。同样是利用失活的Cas9技术，使其在sgRNA 引导下结合细菌必需基因从而阻断其转录过程，而不切断DNA，这样可以抑制 某些必需基因的表达，在细菌水平上研究一些必需基因。
CRISPR-Cas是细菌的获得性免疫***，通过特异性识别并剪切噬菌体或 质粒的特定序列进而清除外源性核酸的感染。CRISPR-Cas***能够特异性的 识别并剪切双链DNA，这一特性被开发用于细菌和细胞的基因编辑。CRISPR-Cas ***存在于45％细菌和87％古细菌中。根据cas蛋白的数目不同，CRISPR-Cas 目前可以分为2大类即class l andclass 2类。CRISPR-Cas9***属于第2 类II型CRISPR-Cas***，是目前用于真核细胞和原核细胞的基因编辑应用 最广泛、最具代表性的CRISPR-Cas***。CRISPR-Cas9***除了用于基因 编辑，还可以用于基因表达调控，如CRISPR activation(CRISPRa)和 CRISPR-Cas9interference(CRISPRi)。其原理如下：Cas9蛋白剪切双链DNA 依赖两个核酸酶结构域：HNH域和RuvC域。突变HNH结构域和RuvC域中 各一个氨基酸位点(D10A and H841A)，使得突变后的Cas9蛋白失去了剪切 DNA的能力，即dCas9(nuclease-deactivated Cas9)，dCas9虽然失去了剪切 DNA的能力，但是仍能够在sgRNA的引导下结合到靶序列。
发明内容
本发明提供一种铜绿假单胞菌CRISPRi***的构建方法并对其应用进行 探讨，包括以下4个步骤：
1)选择并酶切可诱导的穿梭质粒PHERDB20，将dCas9(CRISPR-dCas9的简称， 以下本文皆同)基因***至PHERDB20穿梭质粒中的***糖启动子下游(酶切连 接的方法)；首先成功构建PHERDB20-dCas9重组质粒
2)依据文献报道铜绿假单胞菌的必需基因和/或非必需基因，基于特德原则， 选取合适的sgRNA序列，通过吉布森克隆的方法***上述重组质粒 PHERDB20-dCas9中，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒。
备选方案：直接合成sgRNA的表达序列(启动子+20nt靶序列+handle结构 +终止子)，通过酶切(合成时两端设计EcoRI/KpnI或XbaI/SalI酶切位点)连 接的方法，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，即为CRISPRi***。
3)选取不同的必需基因，对构建的CRISPRi***进行验证。
4)基于构建的CRISPRi***筛选潜在的抗生素作用靶点
上述本发明的方法，在选取sgRNA靶向序列，基于三个重要原则：a)所 述表达序列的正链上有CCN的序列，b)所述表达序列的序列长度约为20nt， 并且靠近ATG区(转录起始密码子)，和c)所述表达序列的序列有特异性。
上述本发明的方法，所述铜绿假单胞菌优选为PAO1菌株，所述PAO1菌株 已确认的必要基因至少有352个，所述已知功能的必需基因，其代表性为prtR， 其对应的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列中第bp14-16位核苷 酸是PAM序列，而第bp17-36位核苷酸为靶标序列。
上述本发明的方法将PAO1菌株的必要基因的至少352对gRNA序列引物通 过Gibson组装，分别克隆至pHERD20T-dCas9质粒中，构建CRISPRi文库。 所述构建的CRISPRi文库为pHERD20T-dCas9-gRNA001至 pHERD20T-dCas9-gRNA352。
上述本发明的方法，所述未知功能的必需基因，其代表性为PA0715，其 对应的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，序列中第bp13-15核苷酸是 PAM序列，而第bp16-40核苷酸为靶标序列。
在一具体实施方案中，本发明的在铜绿假单胞菌中构建CRISPR-dCas9 ***的方法，将上述设计的gRNA***到CRISPR-dCas9***，构建 CRISPRi文库，验证CRISPRi文库的效率。包括以下步骤：
1)以pHERD20T穿梭质粒为骨架，将dCas9基因克隆至pHERD20T 的***糖启动子下游，构建pHERD20T-dCas9，具体过程如下：
a)以AddGene中质粒为模版，设计p-dCas9上下引物对，PCR扩增dCas9 基因，纯化、回收DNA片段，
b)酶切pHERD20T质粒，将dCas9的DNA基因片段连接至pHERD20T 质粒中(***糖启动子下游的多克隆位点处)，抗性平板(氨苄)筛选重组 子，构建pHERD20T-dCas9，测序验证；
2)以代表性的prtR基因(抑制脓菌素分泌基因)为例，鉴定铜绿假单 胞菌中CRISPRi的抑制效率，具体过程如下：
a)根据已确定的prtR的序列，基于“三原则”选取prtR的gRNA靶向序 列，设计互补引物P-prtR-up和P-prtR-down，b)通过Gibson组装的方法， 将prtR的gRNA靶向序列***到pHERD20T-dCas9质粒中，筛选重组子，构 建pHERD20T-dCas9-prtR，测序验证；
3)合成352个必要基因对应的352对gRNA序列引物，通过Gibson组 装，克隆至pHERD20T-dCas9质粒中，构建CRISPRi文库即： pHERD20T-dCas9-gRNA001至pHERD20T-dCas9-gRNA352。每个 pHERD20T-dCas9-gRNA均进行测序验证。
在另一具体实施方案中，本发明的方法，包括：①直接将dCas9基因插 入PAO1染色体中，构建PAOl-dCas9基因敲入菌株(dCas9基因可*** 糖诱导表达)；②将352对gRNA序列***至穿梭质粒Pucp24中。③重组 质粒Pucp24-gRNA352转入PAO1-dCas9菌株里。
本发明的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi***或文库在筛选潜在的抗 生素作用靶点的用途，所述抗生素为治疗铜绿假单胞菌的抗生素，以及绿假单 胞菌CRISPRi***用于研究铜绿假单胞菌的必需基因功能的用途，以及在调控 和抑制铜绿假单胞菌的必需基因表达的用途。
本发明的CRISPRi***或文库筛选抗生素作用靶点的过程如下：
运用本发明的方法，根据铜绿假单胞菌PAO1的必需基因设计对应的sgRNA 表达序列，将各sgRNA序列克隆到CRISPR-dCAS9***中，建立必需基因的 CRISPRi文库(即铜绿假单胞菌各必需基因CRISPRi***的集合)。验证CRISPRi ***抑制必需基因表达的效率，对必需基因进行高能量表型研究，形态学检测： 如菌落、生长、动力、生物膜等参数，从筛选出抗生素作用靶点。具体筛选流 程见图7。
本发明的CRISPRi***用于研究细菌必需基因具有以下几个优点：1)操 作简便，只需要设计好sgRNA的序列，通过常规分子克隆在1周内可以构建完 成一个靶基因的CRISPRi***；2)可进行高通量研究，通过设计不同基因的 sgRNA序列，可进行多个基因的调控；3)效率高，可诱导控制。
附图说明
图1 CRISPR-dCas9***成功转入铜绿假单胞菌PAO1中的电泳图；
图2 CRISPR-dCas9***成功转入铜绿假单胞菌PAK中的电泳图；
图3.必需基因PA0715的抑制可以促进PAO1绿脓菌素的分泌；
图4.不同浓度诱导CRISPR-dCas9-sgRNAprtR对PAO1细菌生长的影响。
具体实施方式
以下实施例以铜绿假单胞菌PAO1的一个必需基因prtR为代表，介绍 CRISPRi***和CRISPRi文库的具体构建方法，以及验证方法。但不以此限制 本发明的CRISPRi***仅限于prtR基因，可扩展到铜绿假单胞菌其它必需基 因或非必需基因CRISPRi***的构建。
试剂与材料
实施例1CRISPRi***的构建
1、选择和处理穿梭质粒
经过设计和筛选，选择穿梭质粒PHERDB20T作为表达载体。
PHERDB20T是由佛罗里达学大学医学院分子遗传与微生物学教研室 Schweizer教授赠送，该质粒为氨苄青霉素抗性，具有在大肠杆菌和铜绿假单 胞菌中复制的能力，同时带有一个***糖诱导的启动子，而且质粒上还带有 一段质粒接合转移识别的序列。
2、PCR扩增dCas9基因
1)引物如下：
pdCas9-bsaI-R:(EcoRI)cgcGAATTCgagaccTTAGTCACCTCCTAGCTGAC
pdCas9-bsaI-F:(EcoRI)tccggtctcGAATTCGATGGATAAGAAATACTCAAT
模板为pdCas9-bacteria(Addgene编号为44249)
2)PCR扩增dCas9基因，以pdCas9-bacteria为模板，pdCas9-bsaI-R和 pdCas9-bsaI-F为引物，扩增dCas9基因，反应条件如下：
3)PCR反应条件：
Step1：95℃预变性5min。
Step2：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次。
Step3：72℃延伸10min。
4)PCR产物胶回收：配制1％的琼脂糖胶，50ul全部上样，60V电泳60 分钟，根据marker，用刀片切下所需要的条带，用Promega的胶回收试剂盒 回收DNA。大致步骤如下：根据切离下的胶的重量(1mg对应3ul DNA binding buffer)加入DNA binding buffer，60℃孵育10分钟，可适当混匀两次以加 速胶溶解。含有DNA的胶溶解液转移至DNA吸附柱中，离心后用wash buffer 洗涤两次，最后用20ul的ddH2O洗脱DNA。
5)dCas9的酶切和回收
酶切反应条件：
配制0.8％的琼脂糖胶，15ul全部上样，60V电泳60分钟，根据marker， 用刀片切下所需要的条带，用Promega的胶回收试剂盒回收DNA。大致步骤如 下：根据切离下的胶的重量(1mg对应3ul DNA binding buffer)加入DNA binding buffer，60℃孵育10分钟，可适当混匀两次以加速胶溶解。含有DNA 的胶溶解液转移至DNA吸附柱中，离心后用wash buffer洗涤两次，最后用 6ul的去离子水洗脱DNA，即得dCas9基因。
3、质粒PHERDB20T与dCas9的连接
经过验证正确的质粒，用于下一步连接dCas9片段，由于dCas9片段两端 是用BsaI识别的EcoRI粘性末端，两端均是EcoRI粘性末端，因此连接后需 要进一步挑选***方向正确的质粒。
1)PHERDB20T的单酶切
37℃酶切3小时，1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带片段。
3)PHERDB20T与dCas9的连接
dCas9粘性片段是前面PCR扩增得到后用BsaI单切出来的，可以直接从 -20℃取出做连接
PHERDB20T与dCas9的连接
反应条件：
16℃连接过夜。
4、PHERDB20-dCas9重组质粒的构建
1)将连接产物转化大肠杆菌。取连接液5-10ul，各自加入50ul大肠杆 菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30分钟，热激90秒，冰浴2分钟，加入 1ml预热的LB，37℃复苏1个小时，涂氨苄青霉素的平板。37℃培养过夜。
2)PCR扩增
挑取平板上的单菌落用通用引物进行菌落PCR扩增(引物：pHerDB20T-F:GATGGAGTGAAACGATGGCG；pHerDB20T-R:ACGTTGTAAAACGACGGCCA)。
扩增条件：
PCR反应条件：
Step1：95℃预变性5min。
Step2：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸240s，循环30次。
Step3：72℃延伸10min。
配制2％的琼脂糖胶，电泳检测。
3)选取阳性菌落接种于3ml的LB培养基中，37℃培养过夜。次日抽提质 粒，具体步骤见Promega质粒抽提试剂盒，最终用50ulddH2O洗脱，得到。
4)质粒测序验证，获得PHERDB20-dCas9重组质粒。
5、PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒(CRISPRi***)的构建
1)设计合成sgRNA的序列。根据铜绿假单胞菌PAO1的一个已知功能必需 基因prtR和1一个未知功能的必需基因PA0715，设计对应的sgRNA的序列 (prtR-sgRNA如SEQ IDNO.1所示和PA0715-sgRNA如SEQ ID NO.2)，通过 常规方法基因合成sgRNA基因质粒，两端设计酶切位点EcoRI/KpnI， XbaI/SalI。
2)双酶切获得sgRNA片段
取设计合成的sgRNA基因质粒做酶切，分别用EcoRI/KpnI，XbaI/SalI 做双酶切，切出prtR和PA0715的sgRNA片段，切胶，以备后续和dCas9 (CRISPRi-dCas9)一起连接到穿梭质粒上。
获得prtR的sgRNA片段的酶切反应条件如下：
37℃酶切3小时，1.5％琼脂糖凝胶电泳。
获得PA0715-sgRNA片段的酶切反应条件如下：
37℃酶切3小时，1.5％琼脂糖凝胶电泳。
3)胶回收目的DNA片段：将上步酶切出的prtR和PA0715的sgRNA片段， 使用胶回收试剂盒，切150bp左右的DNA条带，进行回收，步骤如下：
A，取一个EP管，标记名称，称量重量；
B，低压电泳后，切取目的大小条带的DNA片段，每次冲洗或更换刀片以 避免DNA污染。将含有DNA的胶放入EP管中，再次称重；
C，计算胶的净重，按照100mg：100ul的比例，加入DNA结合溶液，55℃ -60℃溶解10分钟，待胶彻底溶解(溶解过程中可振荡两次以加速溶解，上柱 前确保胶已完全溶解)；
D，将胶溶解液转移至DNA吸附柱中，10000g离心30秒(可将胶溶解液 再次加入DNA吸附柱中离心)；
E，取200ul的wash buffer洗两次DNA结合柱，最后一次13000g离心2 分钟后，取出DNA结合柱室温挥发5分钟(让乙醇彻底挥发，已减低对下游实 验的影响)；
F，最终用10ul的去离子水洗脱DNA，取1ul电泳检测浓度，-20℃保存， 备用。
通过上述方法回收得到prtR-sgRNA和PA0715-sgRNA。
4)质粒PHERDB20-dCas9与sgRNA的连接
1)连接反应条件：
16℃连接过夜，得到PHERDB20-dCas9-sgRNA连接产物。
将连接产物转化大肠杆菌
2)取连接液5-10ul，各自加入50ul大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰 上孵育30分钟，热激90秒，冰浴2分钟，加入1ml预热的LB，37℃复苏1 个小时，涂氨苄青霉素的平板。37℃培养过夜。
3)PCR扩增，质粒测序验证，获得PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒 连接产物即为铜绿假单胞菌CRISPRi***，PHERDB20T-dCas9-PA0715或者 PHERDB20T-dCas9-PrtR，可以分别靶向抑制PA0715和PrtR必需基因。
实施例2铜绿假单胞菌CRISPRi文库的构建
参照实施例1的方法，合成PAO1菌株352个必要基因对应的352对gRNA 序列引物，通过Gibson组装，克隆至pHERD20T-dCas9质粒中，构建成352个 已确认的必要基因的CRISPRi***，这些CRISPRi***集合即是CRISPRi文库 即：pHERD20T-dCas9-gRNA001至pHERD20T-dCas9-gRNA352。每个
pHERD20T-dCas9-gRNA均进行测序验证。
实施例3利用实施例2构建铜绿假单胞菌的其它必需基因的CRISPRi***和 文库，通过该***或文库对铜绿假单胞菌PAO1的必需基因进行功能研究。
1、首先观察，PHERDB20T-dCas9-prtR和PHERDB20T-dCas9-PA0715对铜绿假 单胞菌生长状态的影响
1.1质粒PHERDB20T-dCas9-prtR-sgRNA和PHERDB20T-dCas9-PA0715-sgRNA
转入铜绿假单胞菌
1)三线法从液氮中复苏PAO1和PAK细菌，37℃培养过夜；
2)从平板中挑取单菌落，在液体LB培养基中培养过夜；
3)次日，取1.5ml加入EP管中，16000g离心1min；
4)去除上清，菌体用300mM的蔗糖洗涤三次；
5)去除上清后，菌体最终用200ul的同浓度的蔗糖重悬，每管分装50ul；
6)从酒精中取出电击杯，彻底吹干，紫外灯下照射数分钟，备用；
7)向50ul感受态中，加入1ul的质粒DNA，枪头轻轻吹打混匀，室温放 置2min；
8)转入电击杯中，调整电转仪参数，电压为2.5kV，电击后迅速加入1ml 的普通培养基，37℃培养1小时；
9)10倍倍比稀释法计算转化效率，同时取10ul涂在氨苄青霉素平板以得 到成功的转化子。
1.2质粒PHERDB20T-dCas9-prtR和PHERDB20T-dCas9-PA0715对铜绿假单胞菌 生长状态的影响
1)同前述的方法，将1ul的PHERDB20T-dCas9-prtR和 PHERDB20T-dCas9-PA0715电击转入铜绿假单胞菌中，取100ul的溶液涂羧苄 青霉素平板；
2)次日从平板上挑取转化子单克隆，在液体LB培养基中培养至OD600为1.0 左右；
3)取100ul的菌液，10倍稀释法稀释，从稀释液中取3ul液体分别滴在 含有0.02％***糖和1％葡萄糖的平板上；
4)次日观察细菌在不同平板上长出的菌量是否一致。
2.其次，观察携带PHERDB20T-dCas9-prtR***的重组质粒对铜绿假单胞菌转 化效率的影响
2.1PHERDB20T-dCas9-prtR对铜绿假单胞菌PAO1转化效率的影响
结果见图1，图1的结果展示CRISPRi-Cas9***成功转入铜绿假单胞菌 PAO1中。
如图4A所示，在0.02％的***糖的诱导下，携带CRISPRi-Cas9***的 重组质粒(PHERDB20T-dCas9-prtR sgRNA)对细菌的转化效率有显著的影响， 上面一排为不含有dCas9，仅含有sgRNA片段的重组质粒，下面一排为含有完 整CRISPRi-Cas9***的质粒。在培养平板上加入1％的葡萄糖来抑制***糖 启动子的表达，进而抑制dCas9的本底表达。加入葡萄糖之后，细菌的转化效 率又明显的恢复。与仅有sgRNA的质粒相比，其转化效率也未见显著差异。
2.2PHERDB20T-dCas9-prtR对铜绿假单胞菌PAK转化效率的影响
图2的结果展示携带有CRISPRi-Cas9***的重组质粒电转至PAK菌株中， 同样发现PHERDB20T-dCas9-prtR sgRNA可以显著抑制PAK的转化效率。葡萄 糖同样可以逆转这种抑制效应。
3.PA0715抑制可以促进PAO1绿色色素的分泌
同前述的方法，我们又选择了一个功能未知的必需基因，PA0715。当PA0715 基因被CRISPRi抑制后铜绿假单胞菌菌落大小未见明显改变，但是在***糖的 诱导下，细菌在液体培养基中的生长同样出现了明显的延迟，表现与prtR基因 被抑制类似。不同的地方在于，PA0715被抑制后，绿色色素(推测是pyocyanin， 正在做进一步验证)的分泌明显升高(见图3)。
4 CRISPR-dCas9-sgRNAprtR不同浓度诱导结果
进一步，检测了不同浓度***糖对CRISPRi***的诱导效率。如下图4 所示，不同浓度***糖诱导CRISPR-dCas9-sgRNAprtR对PAO1细菌生长的影响 不同，总体上呈现浓度依赖趋势。当***糖浓度为0.1％和0.05％时，细菌基本 无法生长。当***糖浓度低于0.025％时，浓度越低，CRISPR-dCas9-sgRNAprtR 对PAO1的抑制作用越弱。
上述结果表明，铜绿假单胞菌中建立的CRISPRi***是可控的，可以通过调 整诱导剂浓度实现靶基因不同程度的抑制。
本发明使用CRISPR-Cas9技术，通过抑制细菌的prtR基因的表达，来达 到控制细菌的目的。与直接使用CRISPR***清除基因相比，本技术的优点在 于不会对细菌基因组造成遗传学的改变。在前期的研究中，虽然使用CRISPR ***可以高效地清除细菌，但是存在一个问题，即便其可以使细菌的数量降低 103数量级，仍有千分之一或万分之一的细菌通过修复被切断的基因的方法成 功存活下来。对于这一少部分突变的细菌，其耐药和毒力是否有明显降低并没 有深入的研究。而使用CRISPR***特异性抑制某一基因的表达，仅仅是在转 录水平上的调节，依靠失活的Cas9蛋白(即dCas9蛋白)和sgRNA共同结合 到特异性基因区域，阻滞转录复合体的形成或延伸而阻断其转录过程。这种技 术并没有剪切细菌的基因组，没有增加其突变的概率。但是这一技术与直接使 用CRISPR***清除基因相比，其靶基因的选择往往要求更高。直接使用CRISPR ***清除基因不仅通过耐药基因或毒力基因等达到清除细菌的目的，还可以通 过靶向细菌的任意基因以达到清除细菌的目的。而使用CRISPRi(CRISPR interference)***需要靶标细菌生长必需的基因，通过抑制这些必需基因 (essential gene)的表达，将细菌降低至一定的数量，然后可以结合抗生素 治疗达到清除细菌的目的。这样可以降低细菌面临的压力和产生突变的概率。
以上实施例只是列举代表性铜绿假单胞菌必需基因PrtR和非必需基因 PA0715的CRISPRi***的构建及其对铜绿假单胞菌生长抑制效果试验，依照 实施例1的方法构建铜绿假单胞菌余下的必需基因和非必需基因的CRISPRi系 统，建成铜绿假单胞菌必需基因CRISPRi文库。在不偏离本发明的精神实质下 作一些简单的改变和变通也属于本发明的范围。
序列表
<110> 遵义医学院附属医院
<120> 一种铜绿假单胞菌CRISPRi***的构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggacaaga gcacccagat cccgcccgac agcttcgccg ctcgcctcaa gcaggccatg 60
gcgatgcgca acctgaagca ggaaaccctc gccgaagcgg caggggtttc gcagaacacc 120
attcacaagc tgacctcggg caaggcccag agcacccgca agctgatcga gatcgcggcg 180
gccctgggcg tctcgccggt ctggctgcag accggcgaag gcgctccagc cgcgcgcagt 240
gccgtgtccg tggccgatgg cagcccattg gtgctggaac cgctgcatcc gtgggacagc 300
gacacaccgc tggacgaaga cgaagtggaa ctgccgctgt acaaggaagt ggagatgtcc 360
gccggcgccg gacgcactgc ggtgcgcgag atagaggggc gcaagctgcg tttttcctac 420
gccacgctgc gtgcctcggg cgtcgatccg tcggcggcga tctgcgccca actcaccggc 480
aacagcatgg aaccgctgat catggatggc tccaccatcg gcgtggacac cgccaccacc 540
catatcaccg atggcgagat ctacgccctc gaacatgacg gcatgctgcg ggtgaagttc 600
gtctatcgcc tgcccggcgg cggcattcgc ctgcgcagct tcaaccgcga ggaatatccg 660
gacgaggagt actcgccgga ggacatgcgc agccgccaga tcagcatgat cggttgggtc 720
ttctggtggt ccaccgtacg ccaccggcgc ggcccgtccc tggtgcggtg a 771
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagaaga gacctttaga agatcttttt tttgcgatgt acagagggaa gcagagtttc 60
gaacactttg ccaattgctc tgtcgaaggt ttatatgagc cggtgatggt gaatggacga 120
ctcgtatata aaaccgataa ggatctgcgt gcgtatcatc ggtttctaaa taaattcttg 180
tttgaaaggc ttcctgttgt 200
Claims (10)
1.一种铜绿假单胞菌CRISPRi***的构建方法，包括以下步骤：
1)选择并酶切可诱导的穿梭质粒PHERDB20，通过酶切连接法将dCas9基因***至PHERDB20穿梭质粒中的***糖启动子下游，构建PHERDB20-dCas9重组质粒；
2)依据文献报道铜绿假单胞菌的必需基因和/或非必需基因，基于特德原则，为每条基因选取合适的sgRNA序列，通过吉布森克隆法***步骤1)的PHERDB20-dCas9重组质粒中，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，或者以启动子+20nt靶序列+handle结构+终止子直接合成sgRNA的表达序列，通过酶切-连接法，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，完成CRISPRi***的构建；
3)选取不同的必需基因，对构建的CRISPRi***进行验证，任选的
4)基于构建的CRISPRi***筛选潜在的抗生素作用靶点。
2.如权利要求1所述的方法，所述sgRNA表达序列，其特征在于:a)所述表达序列的正连上有CCN的序列，b)所述表达序列的序列长度约为20nt，并且靠近ATG区(转录起始密码子)，和c)所述表达序列的序列有特异性。
3.如权利要求1所述的方法，所述铜绿假单胞菌为PAO1菌株。
4.如权利要求3所述的方法，PAO1菌株已确认的必要基因至少有352个。。
5.如权利要求1所述的方法，步骤1)和2)中所述的切酶为为EcoRI/KpnI或XbaI/SalI。
6.如权利要求4所述的方法,将PAO1菌株的必要基因的至少352对gRNA序列引物通过Gibson组装，分别克隆至pHERD20T-dCas9质粒中，构建CRISPRi文库。
7.如权利要求6所述的方法，所述构建的CRISPRi文库为pHERD20T-dCas9-gRNA001至pHERD20T-dCas9-gRNA352。
8.权利要求1或6的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi***或文库在寻找治疗铜绿假单胞菌的抗生素靶点的用途。
9.权利要求1或6的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi***或文库用于筛选铜绿假单胞菌的必需基因功能的用途。
10.权利要求1或6的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi***或文库用于调控和抑制铜绿假单胞菌必需基因表达的用途。
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- 2019-04-17 CN CN201910307818.0A patent/CN110029121A/zh active Pending
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