CN101544976B - 双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体。双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体是在出发载体的多克隆位点***如下DNA分子的重组表达载体：自5’末端依次含有EcoRI酶识别序列、NoS终止子、SacI酶识别序列、kpnI酶识别序列、红色荧光蛋白基因、SmalI酶识别序列、BamHI酶识别序列、XbalI酶识别序列、双向启动子、XholI酶识别序列、SpeI酶识别序列、绿色荧光蛋白、HindIII酶识别序列、HpaI酶识别序列、SalI酶识别序列、NoS终止子和Clal酶识别序列；所述双向启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第5917-6834位。本发明的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体具备通过直接酶切连接简单操作就可以用于融合功能基因的目的。

Description

双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体

技术领域

本发明涉及双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体。

背景技术

含有两个或两个以上基因的转化载体在基因治疗以及获得优良性状转基因体应用中起着重要的作用。常见的表达一个以上基因的转基因载体包括多个启动子，内部核糖体进入位点元件(IRES)，拼接信号和融合蛋白。但使用多个启动子可能会存在两个启动子之间的相互作用、启动子沉默、载体重排或删除等问题。

双向启动子能够调节两个下游的基因而受到极大的关注。通常，以头对头方式排列的两个基因，它们转录起始位点之间约有小于1000bp的核苷酸，这种基因内部小于1kb长的核苷酸区域，两侧都含有转录起始位点TSS(基因正链一边有TSS，基因负链一边也有TSS)定义为双向启动子。双向启动子可以被简单地看成是两个单向启动子共用同一个基因组空间。双向启动子在低等生物大肠杆菌、青霉菌、曲霉菌、埃希氏菌、锥体虫以及高等生物植物、动物、人类中都有发现和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体。

本发明所提供的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体是在出发载体的多克隆位点***如下DNA分子的重组表达载体：

自5’末端依次含有EcoRI酶识别序列、NoS终止子、SacI酶识别序列、kpnI酶识别序列、红色荧光蛋白基因、SmalI酶识别序列、BamHI酶识别序列、XbalI酶识别序列、双向启动子、XholI酶识别序列、SpeI酶识别序列、绿色荧光蛋白、HindIII酶识别序列、HpaI酶识别序列、SalI酶识别序列、NoS终止子和Clal酶识别序列；所述双向启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第5917-6834位。

所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第4536-7858位。

所述出发载体可以为各种从商业途径获得的表达载体，如酵母表达载体、植物表达载体或大肠杆菌表达载体等。所述重组表达载体的核苷酸序列可为序列表中的序列1。

所述DNA分子也属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子、所述重组表达载体的转基因细胞或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体具备通过直接酶切连接简单操作就可以用于融合功能基因的目的。

本发明的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体侵染烟草，获得转基因烟草植株，经过验证，两个方向的荧光报告基因gfp和DsRed得以表达，说明该载体双向启动子具有两个方向的转录活性，可以将外源基因通过酶切位点替换掉任意一个报告基因，从而便捷地进行重组表达载体构建，构建的重组表达载体能够同时表达目的蛋白和荧光蛋白，便于筛选。

附图说明

图1为AD的PCR电泳图。

图2为pBD-AD-930酶切鉴定图。

图3为通用型植物双向启动子表达载体图谱。

图4为转基因烟草和对照中GFP和dsRed的表达结果。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、构建通用型植物双向启动子表达载体

构建通用型植物双向启动子表达载体

在pBI121载体基础上，用gfp基因换掉gus基因得到的p131质粒，以p131质粒为模板，D1、D2为引物PCR扩增Pmini至终止子的一段序列：

D1：5’-AAGCTTGGTACCCCTTCGCAAGACCCTTC-3’，

D2：5’-GAAGCTTGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG-3’。

PCR扩增条件为：预变性94℃ 5mins；94℃ 30s，67℃ 30s，72℃ 1min，25循环；72℃ 10mins；4℃保存。

将PCR产物回收，与pMD18 T-Vector连接，构建克隆载体pT-MGN，在LB培养基上进行蓝白斑筛选。挑取几个白斑培养，提取质粒，HindIII酶切初步验证后，并送公司测序。HindIII酶切克隆载体pT-MGN再用，回收1.3kb目的片段，与HindIII酶切的pBI121质粒进行连接，构建双向双报告基因的植物二元表达载体pBDGG。

设计引物a、b、c和d，它们的核苷酸序列如下：

a：5’-GGTCTAGACTCGAGAGGAGGGTCGACGTCCGCAAAAATCACCAGTC-3’；

b：5’-GTGACCATGATTACGCCAGGGTTGTCACTGGATTTTGG-3’；

c：5’-GCCAAAATCCAGTGACAACCCTGGCGTAATCATGGTCA-3’；

d：5’-GGATCGATGGTTTCATTGGTGACG-3’。

其中，引物a中带有XbalI、XholI、SalI和noster的识别序列；

引物b中含有突变的HindIII位点(aggcct→agggtt)；

引物c与引物b是反向互补的两条引物；

引物d中含有Clal酶识别序列。

以a和b为引物，以载体pBDGG为模板，PCR扩增，得到的PCR产物命名为AB；

反应体系为：总体积100μl，模板100ng、引物a15pmol、引物b15pmol、10×PCR缓冲液10μl、10×dNTP 10μl、Taq酶2.5U，其余为灭菌水。

以c和d为引物，以载体pBDGG为模板PCR扩增，得到的PCR产物命名为CD。

反应体系为：总体积100μl，模板100ng、引物c15pmol、引物d15pmol、10×PCR缓冲液10μl、10×dNTP 10μl、Taq酶2.5U，其余为灭菌水。

AB和CD等量混和做模板，以a和d为引物PCR扩增，得到PCR产物命名为AD。

反应体系为：总体积100μl，模板100ng、引物c15pmol、引物d15pmol、10×PCR缓冲液10μl、10×dNTP 10μl、Taq酶2.5U，其余为灭菌水。

上述PCR反应程序：94℃ 5min，退火温度分别为65℃、63℃、61℃、59℃、57℃、55℃和72℃，共30个循环，最后延伸10min。

AD的电泳结果如图2所示，图2中，M1：100bp DNA Laber、2和3：PCR产物AD、M2：15000分子量标准。

经XbaI和ClaI双酶切的AD和与同样双酶切的载体pBDGG连接，构建重组载体pBD-AD。

EcoRI和SacI双酶切载体pBDGG，回收2839bp的片段，与同样双酶切的载体pUC18连接，构建重组载体pUC-E-S。XbaI和XhoI双酶切pUC-E-S，回收930bp的片段，与同样双酶切的pET30a连接，构建重组载体pET-930。

将重组载体pET-930用KpnI，HindIII双切后，用乙醇沉淀回收，用T4 DNAPolymerase和Klenow Fragment处理，即消掉此2个酶切位点。

KpnI，HindIII双酶切体系100ul：质粒pET-930 110ug，KpnI 5ul，HindIII 3ul，10×M buffer 10ul，其余为灭菌水。37℃，3小时。向双酶切后体系中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃，20min，12000rpm，离心10min，弃上清，再用70％乙醇漂洗沉淀后风干。将沉淀后的DNA用T4DNApolymerase处理，25ul酶切体系如下：DNA 4ug，10×T4 DNApolymerase buffer2.5ul，0.1％BSA 2.5ul，2.5mM dNTP2.5ul，T4 DNApolymerase 0.3ul其余为灭菌水。37℃，5min，苯酚/氯仿处理，乙醇沉淀回收，再用T4连接酶连接，转化JM109感受态，提取质粒。质粒用HindIII酶切，再用Klenow Fragment处理，25ul体系如下：质粒500ng，10×buffer2.5ul，dNTP终浓度0.1mM，klenow fragment 0.5U，灭菌水补至25ul，，37℃，15min。苯酚/氯仿处理，乙醇沉淀回收，再用T4连接酶连接，转化JM109感受态，提取质粒。

P1：GCCCGGGATGAAGCTTGCCTCCTCCGA(含有SmaI识别序列)；

P2：GGGAGCTCGGTACCCTAGGTTAGTGGTGGTGGTG(含有KpnI和SacI识别序列)；

P3：GGCTCGAGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGG(含有XhoI和SpeI识别序列)；

P4：GGGTCGACGTTAACAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC(含有HindIII、HpaI和SalI识别序列)。

以pDsRed2-C1(CLOTECH，USA)为模板，引物P1、P2用来扩增红色荧光基因dsRed；

PCR反应程序为：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环。

以pEGFP-N1(CLOTECH，USA)为模板，引物P3、P4用来扩增绿色荧光基因gfp。

PCR反应程序为：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环。

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，玻璃奶回收试剂盒回收的PCR产物，分别与pMD18-T载体连接，构建重组载体T-GFP和T-dsRed。

SacI和SmaI双酶切T-dsRed，回收735bp的片段，与同样双酶切的载体pBD-AD连接，得到载体pBD-AD-Red；XbalI和XholI双酶切pET-930，回收930bp的片段，并***载体T-GFP，连接构建载体T-GFP-930；XbaI和SalI双酶切切T-GFP-930和pBD-AD-Red，回收1726bp和12903bp的片段，将它们连接得到通用型植物双向启动子表达载体，其载体图谱如图3所示。

2)通用型双向启动子表达载体转化烟草

将通用型植物双向启动子表达载体电击转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，加入1ml YEB液体培养基28℃培养3小时，取200μl涂YEB抗性平板(卡那霉素50mg/l，利福平50mg/l)，28℃培养，获得的重组农杆菌用于烟草转化。方法参照《植物基因工程》。获得的转基因烟草用荧光显微镜(OLYMPUS BX-61)检测绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达。以野生型烟草作为对照。

荧光显微镜结果如图4，在转基因烟草中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白都有表达。说明本发明的通用型双向启动子表达载体能使外源基因在植物中表达。

图4中A：对照；B：转基因烟草。

序列表

<110>北京林业大学

<120>双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体

<160>1

<210>1

<211>14629

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

TGAGCGTCGC AAAGGCGCTC GGTCTTGCCT TGCTCGTCGG TGATGTACTT CACCAGCTCC    60

GCGAAGTCGC TCTTCTTGAT GGAGCGCATG GGGACGTGCT TGGCAATCAC GCGCACCCCC    120

CGGCCGTTTT AGCGGCTAAA AAAGTCATGG CTCTGCCCTC GGGCGGACCA CGCCCATCAT    180

GACCTTGCCA AGCTCGTCCT GCTTCTCTTC GATCTTCGCC AGCAGGGCGA GGATCGTGGC    240

ATCACCGAAC CGCGCCGTGC GCGGGTCGTC GGTGAGCCAG AGTTTCAGCA GGCCGCCCAG    300

GCGGCCCAGG TCGCCATTGA TGCGGGCCAG CTCGCGGACG TGCTCATAGT CCACGACGCC    360

CGTGATTTTG TAGCCCTGGC CGACGGCCAG CAGGTAGGCC GACAGGCTCA TGCCGGCCGC    420

CGCCGCCTTT TCCTCAATCG CTCTTCGTTC GTCTGGAAGG CAGTACACCT TGATAGGTGG    480

GCTGCCCTTC CTGGTTGGCT TGGTTTCATC AGCCATCCGC TTGCCCTCAT CTGTTACGCC    540

GGCGGTAGCC GGCCAGCCTC GCAGAGCAGG ATTCCCGTTG AGCACCGCCA GGTGCGAATA    600

AGGGACAGTG AAGAAGGAAC ACCCGCTCGC GGGTGGGCCT ACTTCACCTA TCCTGCCCGG    660

CTGACGCCGT TGGATACACC AAGGAAAGTC TACACGAACC CTTTGGCAAA ATCCTGTATA    720

TCGTGCGAAA AAGGATGGAT ATACCGAAAA AATCGCTATA ATGACCCCGA AGCAGGGTTA    780

TGCAGCGGAA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG    840

GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT    900

ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG    960

GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT    1020

GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA    1080

TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT    1140

CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCAGA AGGCCGCCAG AGAGGCCGAG CGCGGCCGTG    1200

AGGCTTGGAC GCTAGGGCAG GGCATGAAAA AGCCCGTAGC GGGCTGCTAC GGGCGTCTGA    1260

CGCGGTGGAA AGGGGGAGGG GATGTTGTCT ACATGGCTCT GCTGTAGTGA GTGGGTTGCG    1320

CTCCGGCAGC GGTCCTGATC AATCGTCACC CTTTCTCGGT CCTTCAACGT TCCTGACAAC    1380

GAGCCTCCTT TTCGCCAATC CATCGACAAT CACCGCGAGT CCCTGCTCGA ACGCTGCGTC    1440

CGGACCGGCT TCGTCGAAGG CGTCTATCGC GGCCCGCAAC AGCGGCGAGA GCGGAGCCTG    1500

TTCAACGGTG CCGCCGCGCT CGCCGGCATC GCTGTCGCCG GCCTGCTCCT CAAGCACGGC    1560

CCCAACAGTG AAGTAGCTGA TTGTCATCAG CGCATTGACG GCGTCCCCGG CCGAAAAACC    1620

CGCCTCGCAG AGGAAGCGAA GCTGCGCGTC GGCCGTTTCC ATCTGCGGTG CGCCCGGTCG    1680

CGTGCCGGCA TGGATGCGCG CGCCATCGCG GTAGGCGAGC AGCGCCTGCC TGAAGCTGCG    1740

GGCATTCCCG ATCAGAAATG AGCGCCAGTC GTCGTCGGCT CTCGGCACCG AATGCGTATG    1800

ATTCTCCGCC AGCATGGCTT CGGCCAGTGC GTCGAGCAGC GCCCGCTTGT TCCTGAAGTG    1860

CCAGTAAAGC GCCGGCTGCT GAACCCCCAA CCGTTCCGCC AGTTTGCGTG TCGTCAGACC    1920

GTCTACGCCG ACCTCGTTCA ACAGGTCCAG GGCGGCACGG ATCACTGTAT TCGGCTGCAA    1980

CTTTGTCATG CTTGACACTT TATCACTGAT AAACATAATA TGTCCACCAA CTTATCAGTG    2040

ATAAAGAATC CGCGCGTTCA ATCGGACCAG CGGAGGCTGG TCCGGAGGCC AGACGTGAAA    2100

CCCAACATAC CCCTGATCGT AATTCTGAGC ACTGTCGCGC TCGACGCTGT CGGCATCGGC    2160

CTGATTATGC CGGTGCTGCC GGGCCTCCTG CGCGATCTGG TTCACTCGAA CGACGTCACC    2220

GCCCACTATG GCATTCTGCT GGCGCTGTAT GCGTTGGTGC AATTTGCCTG CGCACCTGTG    2280

CTGGGCGCGC TGTCGGATCG TTTCGGGCGG CGGCCAATCT TGCTCGTCTC GCTGGCCGGC    2340

GCCAGATCTG GGGAACCCTG TGGTTGGCAT GCACATACAA ATGGACGAAC GGATAAACCT    2400

TTTCACGCCC TTTTAAATAT CCGATTATTC TAATAAACGC TCTTTTCTCT TAGGTTTACC    2460

CGCCAATATA TCCTGTCAAA CACTGATAGT TTAAACTGAA GGCGGGAAAC GACAATCTGA    2520

TCATGAGCGG AGAATTAAGG GAGTCACGTT ATGACCCCCG CCGATGACGC GGGACAAGCC    2580

GTTTTACGTT TGGAACTGAC AGAACCGCAA CGTTGAAGGA GCCACTCAGC CGCGGGTTTC    2640

TGGAGTTTAA TGAGCTAAGC ACATACGTCA GAAACCATTA TTGCGCGTTC AAAAGTCGCC    2700

TAAGGTCACT ATCAGCTAGC AAATATTTCT TGTCAAAAAT GCTCCACTGA CGTTCCATAA    2760

ATTCCCCTCG GTATCCAATT AGAGTCTCAT ATTCACTCTC AATCCAAATA ATCTGCACCG    2820

GATCTGGATC GTTTCGCATG ATTGAACAAG ATGGATTGCA CGCAGGTTCT CCGGCCGCTT    2880

GGGTGGAGAG GCTATTCGGC TATGACTGGG CACAACAGAC AATCGGCTGC TCTGATGCCG    2940

CCGTGTTCCG GCTGTCAGCG CAGGGGCGCC CGGTTCTTTT TGTCAAGACC GACCTGTCCG    3000

GTGCCCTGAA TGAACTGCAG GACGAGGCAG CGCGGCTATC GTGGCTGGCC ACGACGGGCG    3060

TTCCTTGCGC AGCTGTGCTC GACGTTGTCA CTGAAGCGGG AAGGGACTGG CTGCTATTGG    3120

GCGAAGTGCC GGGGCAGGAT CTCCTGTCAT CTCACCTTGC TCCTGCCGAG AAAGTATCCA    3180

TCATGGCTGA TGCAATGCGG CGGCTGCATA CGCTTGATCC GGCTACCTGC CCATTCGACC    3240

ACCAAGCGAA ACATCGCATC GAGCGAGCAC GTACTCGGAT GGAAGCCGGT CTTGTCGATC    3300

AGGATGATCT GGACGAAGAG CATCAGGGGC TCGCGCCAGC CGAACTGTTC GCCAGGCTCA    3360

AGGCGCGCAT GCCCGACGGC GATGATCTCG TCGTGACCCA TGGCGATGCC TGCTTGCCGA    3420

ATATCATGGT GGAAAATGGC CGCTTTTCTG GATTCATCGA CTGTGGCCGG CTGGGTGTGG    3480

CGGACCGCTA TCAGGACATA GCGTTGGCTA CCCGTGATAT TGCTGAAGAG CTTGGCGGCG    3540

AATGGGCTGA CCGCTTCCTC GTGCTTTACG GTATCGCCGC TCCCGATTCG CAGCGCATCG    3600

CCTTCTATCG CCTTCTTGAC GAGTTCTTCT GAGCGGGACT CTGGGGTTCG AAATGACCGA    3660

CCAAGCGACG CCCAACCTGC CATCACGAGA TTTCGATTCC ACCGCCGCCT TCTATGAAAG    3720

GTTGGGCTTC GGAATCGTTT TCCGGGACGC CGGCTGGATG ATCCTCCAGC GCGGGGATCT    3780

CATGCTGGAG TTCTTCGCCC ACGGGATCTC TGCGGAACAG GCGGTCGAAG GTGCCGATAT    3840

CATTACGACA GCAACGGCCG ACAAGCACAA CGCCACGATC CTGAGCGACA ATATGATCGG    3900

GCCCGGCGTC CACATCAACG GCGTCGGCGG CGACTGCCCA GGCAAGACCG AGATGCACCG    3960

CGATATCTTG CTGCGTTCGG ATATTTTCGT GGAGTTCCCG CCACAGACCC GGATGATCCC    4020

CGATCGTTCA AACATTTGGC AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC    4080

GATGATTATC ATATAATTTC TGTTGAATTA CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG    4140

CATGACGTTA TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT ACATTTAATA    4200

CGCGATAGAA AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA TTATCGCGCG CGGTGTCATC    4260

TATGTTACTA GATCGGGCCT CCTGTCAATG CTGGCGGCGG CTCTGGTGGT GGTTCTGGTG    4320

GCGGCTCTGA GGGTGGTGGC TCTGAGGGTG GCGGTTCTGA GGGTGGCGGC TCTGAGGGAG    4380

GCGGTTCCGG TGGTGGCTCT GGTTCCGGTG ATTTTGATTA TGAAAAGATG GCAAACGCTA    4440

ATAAGGGGGC TATGACCGAA AATGCCGATG AAAACGCGCT ACAGTCTGAC GCTAAAGGCA    4500

AACTTGATTC TGTCGCTACT GATTACGGTG CTGCTATCGA TGGTTTCATT GGTGACGTTT    4560

CCGGCCTTGC TAATGGTAAT GGTGCTACTG GTGATTTTGC TGGCTCTAAT TCCCAAATGG    4620

CTCAAGTCGG TGACGGTGAT AATTCACCTT TAATGAATAA TTTCCGTCAA TATTTACCTT    4680

CCCTCCCTCA ATCGGTTGAA TGTCGCCCTT TTGTCTTTGG CCCAATACGC AAACCGCCTC    4740

TCCCCGCGCG TTGGCCGATT CATTAATGCA GCTGGCACGA CAGGTTTCCC GACTGGAAAG    4800

CGGGCAGTGA GCGCAACGCA ATTAATGTGA GTTAGCTCAC TCATTAGGCA CCCCAGGCTT    4860

TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA    4920

CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGCCA GGGTTGTCAC TGGATTTTGG TTTTAGGAAT    4980

TAGAAATTTT ATTGATAGAA GTATTTTACA AATACAAATA CATACTAAGG GTTTCTTATA    5040

TGCTCAACAC ATGAGCGAAA CCCTATAAGA ACCCTAATTC CCTTATCTGG GAACTACTCA    5100

CACATTATTC TGGAGAAAAA TAGAGAGAGA TAGATTTGTA GAGAGAGACT GGTGATTTTT    5160

GCGGACGTCG ACGTTAACAA GCTTTTACTT GTACAGCTCG TCCATGCCGA GAGTGATCCC    5220

GGCGGCGGTC ACGAACTCCA GCAGGACCAT GTGATCGCGC TTCTCGTTGG GGTCTTTGCT    5280

CAGGGCGGAC TGGGTGCTCA GGTAGTGGTT GTCGGGCAGC AGCACGGGGC CGTCGCCGAT    5340

GGGGGTGTTC TGCTGGTAGT GGTCGGCGAG CTGCACGCTG CCGTCCTCGA TGTTGTGGCG    5400

GATCTTGAAG TTCACCTTGA TGCCGTTCTT CTGCTTGTCG GCCATGATAT AGACGTTGTG    5460

GCTGTTGTAG TTGTACTCCA GCTTGTGCCC CAGGATGTTG CCGTCCTCCT TGAAGTCGAT    5520

GCCCTTCAGC TCGATGCGGT TCACCAGGGT GTCGCCCTCG AACTTCACCT CGGCGCGGGT    5580

CTTGTAGTTG CCGTCGTCCT TGAAGAAGAT GGTGCGCTCC TGGACGTAGC CTTCGGGCAT    5640

GGCGGACTTG AAGAAGTCGT GCTGCTTCAT GTGGTCGGGG TAGCGGCTGA AGCACTGCAC    5700

GCCGTAGGTC AGGGTGGTCA CGAGGGTGGG CCAGGGCACG GGCAGCTTGC CGGTGGTGCA    5760

GATGAACTTC AGGGTCAGCT TGCCGTAGGT GGCATCGCCC TCGCCCTCGC CGGACACGCT    5820

GAACTTGTGG CCGTTTACGT CGCCGTCCAG CTCGACCAGG ATGGGCACCA CCCCGGTGAA    5880

CAGCTCCTCG CCCTTGCTCA CCATACTAGT CTCGAGGTCC TCTCCAAATG AAATGAACTT    5940

CCTTATATAG AGGAAGGGTC TTGCGAAGGG CAAGCTAGCT TGCATGCCTG CAGGTCCCCA    6000

GATTAGCCTT TTCAATTTCA GAAAGAATGC TAACCCACAG ATGGTTAGAG AGGCTTACGC    6060

AGCAGGTCTC ATCAAGACGA TCTACCCGAG CAATAATCTC CAGGAAATCA AATACCTTCC    6120

CAAGAAGGTT AAAGATGCAG TCAAAAGATT CAGGACTAAC TGCATCAAGA ACACAGAGAA    6180

AGATATATTT CTCAAGATCA GAAGTACTAT TCCAGTATGG ACGATTCAAG GCTTGCTTCA    6240

CAAACCAAGG CAAGTAATAG AGATTGGAGT CTCTAAAAAG GTAGTTCCCA CTGAATCAAA    6300

GGCCATGGAG TCAAAGATTC AAATAGAGGA CCTAACAGAA CTCGCCGTAA AGACTGGCGA    6360

ACAGTTCATA CAGAGTCTCT TACGACTCAA TGACAAGAAG AAAATCTTCG TCAACATGGT    6420

GGAGCACGAC ACACTTGTCT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG    6480

GGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC    6540

AGCTATCTGT CACTTTATTG TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT ACAAATGCCA    6600

TCATTGCGAT AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA    6660

TGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA    6720

GCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC    6780

TTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGAA CACGGGGGAC    6840

TCTAGAGGAT CCCCCGGGAT GAAGCTTGCC TCCTCCGAGA ACGTCATCAC CGAGTTCATG    6900

CGCTTCAAGG TGCGCATGGA GGGCACCGTG AACGGCCACG AGTTCGAGAT CGAGGGCGAG    6960

GGCGAGGGCC GCCCCTACGA GGGCCACAAC ACCGTGAAGC TGAAGGTGAC CAAGGGCGGC    7020

CCCCTGCCCT TCGCCTGGGA CATCCTGTCC CCCCAGTTCC AGTACGGCTC CAAGGTGTAC    7080

GTGAAGCACC CCGCCGACAT CCCCGACTAC AAGAAGCTGT CCTTCCCCGA GGGCTTCAAG    7140

TGGGAGCGCG TGATGAACTT CGAGGACGGC GGCGTGGCGA CCGTGACCCA GGACTCCTCC    7200

CTGCAGGACG GCTGCTTCAT CTACAAGGTG AAGTTCATCG GCGTGAACTT CCCCTCCGAC    7260

GGCCCCGTGA TGCAGAAGAA GACCATGGGC TGGGAGGCCT CCACCGAGCG CCTGTACCCC    7320

CGCGACGGCG TGCTGAAGGG CGAGACCCAC AAGGCCCTGA AGCTGAAGGA CGGCGGCCAC    7380

TACCTGGTGG AGTTCAAGTC CATCTACATG GCCAAGAAGC CCGTGCAGCT GCCCGGCTAC    7440

TACTACGTGG ACGCCAAGCT GGACATCACC TCCCACAACG AGGACTACAC CATCGTGGAG    7500

CAGTACGAGC GCACCGAGGG CCGCCACCAC CTGTTCCTGA GATCTCGAGC ACCACCACCA    7560

CCACCACTAA CCTAGGGTAC CGAGCTCGAA TTTCCCCGAT CGTTCAAACA TTTGGCAATA    7620

AAGTTTCTTA AGATTGAATC CTGTTGCCGG TCTTGCGATG ATTATCATAT AATTTCTGTT    7680

GAATTACGTT AAGCATGTAA TAATTAACAT GTAATGCATG ACGTTATTTA TGAGATGGGT    7740

TTTTATGATT AGAGTCCCGC AATTATACAT TTAATACGCG ATAGAAAACA AAATATAGCG    7800

CGCAAACTAG GATAAATTAT CGCGCGCGGT GTCATCTATG TTACTAGATC GGGAATTCAC    7860

TGGCCGTCGT TTTACAACGT CGTGACTGGG AAAACCCTGG CGTTACCCAA CTTAATCGCC    7920

TTGCAGCACA TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC    7980

CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT    8040

CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC TTTAGGGTTC    8100

CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTTGGGTGA TGGTTCACGT    8160

AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT    8220

AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGG CTATTCTTTT    8280

GATTTATAAG GGATTTTGCC GATTTCGGAA CCACCATCAA ACAGGATTTT CGCCTGCTGG    8340

GGCAAACCAG CGTGGACCGC TTGCTGCAAC TCTCTCAGGG CCAGGCGGTG AAGGGCAATC    8400

AGCTGTTGCC CGTCTCACTG GTGAAAAGAA AAACCACCCC AGTACATTAA AAACGTCCGC    8460

AATGTGTTAT TAAGTTGTCT AAGCGTCAAT TTGTTTACAC CACAATATAT CCTGCCACCA    8520

GCCAGCCAAC AGCTCCCCGA CCGGCAGCTC GGCACAAAAT CACCACTCGA TACAGGCAGC    8580

CCATCAGTCC GGGACGGCGT CAGCGGGAGA GCCGTTGTAA GGCGGCAGAC TTTGCTCATG    8640

TTACCGATGC TATTCGGAAG AACGGCAACT AAGCTGCCGG GTTTGAAACA CGGATGATCT    8700

CGCGGAGGGT AGCATGTTGA TTGTAACGAT GACAGAGCGT TGCTGCCTGT GATCAAATAT    8760

CATCTCCCTC GCAGAGATCC GAATTATCAG CCTTCTTATT CATTTCTCGC TTAACCGTGA    8820

CAGGCTGTCG ATCTTGAGAA CTATGCCGAC ATAATAGGAA ATCGCTGGAT AAAGCCGCTG    8880

AGGAAGCTGA GTGGCGCTAT TTCTTTAGAA GTGAACGTTG ACGATATCAA CTCCCCTATC    8940

CATTGCTCAC CGAATGGTAC AGGTCGGGGA CCCGAAGTTC CGACTGTCGG CCTGATGCAT    9000

CCCCGGCTGA TCGACCCCAG ATCTGGGGCT GAGAAAGCCC AGTAAGGAAA CAACTGTAGG    9060

TTCGAGTCGC GAGATCCCCC GGAACCAAAG GAAGTAGGTT AAACCCGCTC CGATCAGGCC    9120

GAGCCACGCC AGGCCGAGAA CATTGGTTCC TGTAGGCATC GGGATTGGCG GATCAAACAC    9180

TAAAGCTACT GGAACGAGCA GAAGTCCTCC GGCCGCCAGT TGCCAGGCGG TAAAGGTGAG    9240

CAGAGGCACG GGAGGTTGCC ACTTGCGGGT CAGCACGGTT CCGAACGCCA TGGAAACCGC    9300

CCCCGCCAGG CCCGCTGCGA CGCCGACAGG ATCTAGCGCT GCGTTTGGTG TCAACACCAA    9360

CAGCGCCACG CCCGCAGTTC CGCAAATAGC CCCCAGGACC GCCATCAATC GTATCGGGCT    9420

ACCTAGCAGA GCGGCAGAGA TGAACACGAC CATCAGCGGC TGCACAGCGC CTACCGTCGC    9480

CGCGACCCCG CCCGGCAGGC GGTAGACCGA AATAAACAAC AAGCTCCAGA ATAGCGAAAT    9540

ATTAAGTGCG CCGAGGATGA AGATGCGCAT CCACCAGATT CCCGTTGGAA TCTGTCGGAC    9600

GATCATCACG AGCAATAAAC CCGCCGGCAA CGCCCGCAGC AGCATACCGG CGACCCCTCG    9660

GCCTCGCTGT TCGGGCTCCA CGAAAACGCC GGACAGATGC GCCTTGTGAG CGTCCTTGGG    9720

GCCGTCCTCC TGTTTGAAGA CCGACAGCCC AATGATCTCG CCGTCGATGT AGGCGCCGAA    9780

TGCCACGGCA TCTCGCAACC GTTCAGCGAA CGCCTCCATG GGCTTTTTCT CCTCGTGCTC    9840

GTAAACGGAC CCGAACATCT CTGGAGCTTT CTTCAGGGCC GACAATCGGA TCTCGCGGAA    9900

ATCCTGCACG TCGGCCGCTC CAAGCCGTCG AATCTGAGCC TTAATCACAA TTGTCAATTT    9960

TAATCCTCTG TTTATCGGCA GTTCGTAGAG CGCGCCGTGC GTCCCGAGCG ATACTGAGCG  10020

AAGCAAGTGC GTCGAGCAGT GCCCGCTTGT TCCTGAAATG CCAGTAAAGC GCTGGCTGCT  10080

GAACCCCCAG CCGGAACTGA CCCCACAAGG CCCTAGCGTT TGCAATGCAC CAGGTCATCA  10140

TTGACCCAGG CGTGTTCCAC CAGGCCGCTG CCTCGCAACT CTTCGCAGGC TTCGCCGACC  10200

TGCTCGCGCC ACTTCTTCAC GCGGGTGGAA TCCGATCCGC ACATGAGGCG GAAGGTTTCC  10260

AGCTTGAGCG GGTACGGCTC CCGGTGCGAG CTGAAATAGT CGAACATCCG TCGGGCCGTC  10320

GGCGACAGCT TGCGGTACTT CTCCCATATG AATTTCGTGT AGTGGTCGCC AGCAAACAGC  10380

ACGACGATTT CCTCGTCGAT CAGGACCTGG CAACGGGACG TTTTCTTGCC ACGGTCCAGG  10440

ACGCGGAAGC GGTGCAGCAG CGACACCGAT TCCAGGTGCC CAACGCGGTC GGACGTGAAG  10500

CCCATCGCCG TCGCCTGTAG GCGCGACAGG CATTCCTCGG CCTTCGTGTA ATACCGGCCA  10560

TTGATCGACC AGCCCAGGTC CTGGCAAAGC TCGTAGAACG TGAAGGTGAT CGGCTCGCCG  10620

ATAGGGGTGC GCTTCGCGTA CTCCAACACC TGCTGCCACA CCAGTTCGTC ATCGTCGGCC  10680

CGCAGCTCGA CGCCGGTGTA GGTGATCTTC ACGTCCTTGT TGACGTGGAA AATGACCTTG  10740

TTTTGCAGCG CCTCGCGCGG GATTTTCTTG TTGCGCGTGG TGAACAGGGC AGAGCGGGCC  10800

GTGTCGTTTG GCATCGCTCG CATCGTGTCC GGCCACGGCG CAATATCGAA CAAGGAAAGC  10860

TGCATTTCCT TGATCTGCTG CTTCGTGTGT TTCAGCAACG CGGCCTGCTT GGCCTCGCTG  10920

ACCTGTTTTG CCAGGTCCTC GCCGGCGGTT TTTCGCTTCT TGGTCGTCAT AGTTCCTCGC  10980

GTGTCGATGG TCATCGACTT CGCCAAACCT GCCGCCTCCT GTTCGAGACG ACGCGAACGC  11040

TCCACGGCGG CCGATGGCGC GGGCAGGGCA GGGGGAGCCA GTTGCACGCT GTCGCGCTCG  11100

ATCTTGGCCG TAGCTTGCTG GACCATCGAG CCGACGGACT GGAAGGTTTC GCGGGGCGCA  11160

CGCATGACGG TGCGGCTTGC GATGGTTTCG GCATCCTCGG CGGAAAACCC CGCGTCGATC  11220

AGTTCTTGCC TGTATGCCTT CCGGTCAAAC GTCCGATTCA TTCACCCTCC TTGCGGGATT  11280

GCCCCGACTC ACGCCGGGGC AATGTGCCCT TATTCCTGAT TTGACCCGCC TGGTGCCTTG  11340

GTGTCCAGAT AATCCACCTT ATCGGCAATG AAGTCGGTCC CGTAGACCGT CTGGCCGTCC  11400

TTCTCGTACT TGGTATTCCG AATCTTGCCC TGCACGAATA CCAGCGACCC CTTGCCCAAA  11460

TACTTGCCGT GGGCCTCGGC CTGAGAGCCA AAACACTTGA TGCGGAAGAA GTCGGTGCGC  11520

TCCTGCTTGT CGCCGGCATC GTTGCGCCAC ATCTAGGTAC TAAAACAATT CATCCAGTAA  11580

AATATAATAT TTTATTTTCT CCCAATCAGG CTTGATCCCC AGTAAGTCAA AAAATAGCTC  11640

GACATACTGT TCTTCCCCGA TATCCTCCCT GATCGACCGG ACGCAGAAGG CAATGTCATA  11700

CCACTTGTCC GCCCTGCCGC TTCTCCCAAG ATCAATAAAG CCACTTACTT TGCCATCTTT  11760

CACAAAGATG TTGCTGTCTC CCAGGTCGCC GTGGGAAAAG ACAAGTTCCT CTTCGGGCTT  11820

TTCCGTCTTT AAAAAATCAT ACAGCTCGCG CGGATCTTTA AATGGAGTGT CTTCTTCCCA  11880

GTTTTCGCAA TCCACATCGG CCAGATCGTT ATTCAGTAAG TAATCCAATT CGGCTAAGCG  11940

GCTGTCTAAG CTATTCGTAT AGGGACAATC CGATATGTCG ATGGAGTGAA AGAGCCTGAT  12000

GCACTCCGCA TACAGCTCGA TAATCTTTTC AGGGCTTTGT TCATCTTCAT ACTCTTCCGA  12060

GCAAAGGACG CCATCGGCCT CACTCATGAG CAGATTGCTC CAGCCATCAT GCCGTTCAAA  12120

GTGCAGGACC TTTGGAACAG GCAGCTTTCC TTCCAGCCAT AGCATCATGT CCTTTTCCCG  12180

TTCCACATCA TAGGTGGTCC CTTTATACCG GCTGTCCGTC ATTTTTAAAT ATAGGTTTTC  12240

ATTTTCTCCC ACCAGCTTAT ATACCTTAGC AGGAGACATT CCTTCCGTAT CTTTTACGCA  12300

GCGGTATTTT TCGATCAGTT TTTTCAATTC CGGTGATATT CTCATTTTAG CCATTTATTA  12360

TTTCCTTCCT CTTTTCTACA GTATTTAAAG ATACCCCAAG AAGCTAATTA TAACAAGACG  12420

AACTCCAATT CACTGTTCCT TGCATTCTAA AACCTTAAAT ACCAGAAAAC AGCTTTTTCA  12480

AAGTTGTTTT CAAAGTTGGC GTATAACATA GTATCGACGG AGCCGATTTT GAAACCACAA  12540

TTATGGGTGA TGCTGCCAAC TTACTGATTT AGTGTATGAT GGTGTTTTTG AGGTGCTCCA  12600

GTGGCTTCTG TGTCTATCAG CTGTCCCTCC TGTTCAGCTA CTGACGGGGT GGTGCGTAAC  12660

GGCAAAAGCA CCGCCGGACA TCAGCGCTAT CTCTGCTCTC ACTGCCGTAA AACATGGCAA  12720

CTGCAGTTCA CTTACACCGC TTCTCAACCC GGTACGCACC AGAAAATCAT TGATATGGCC  12780

ATGAATGGCG TTGGATGCCG GGCAACAGCC CGCATTATGG GCGTTGGCCT CAACACGATT  12840

TTACGTCACT TAAAAAACTC AGGCCGCAGT CGGTAACCTC GCGCATACAG CCGGGCAGTG  12900

ACGTCATCGT CTGCGCGGAA ATGGACGAAC AGTGGGGCTA TGTCGGGGCT AAATCGCGCC  12960

AGCGCTGGCT GTTTTACGCG TATGACAGTC TCCGGAAGAC GGTTGTTGCG CACGTATTCG  13020

GTGAACGCAC TATGGCGACG CTGGGGCGTC TTATGAGCCT GCTGTCACCC TTTGACGTGG  13080

TGATATGGAT GACGGATGGC TGGCCGCTGT ATGAATCCCG CCTGAAGGGA AAGCTGCACG  13140

TAATCAGCAA GCGATATACG CAGCGAATTG AGCGGCATAA CCTGAATCTG AGGCAGCACC  13200

TGGCACGGCT GGGACGGAAG TCGCTGTCGT TCTCAAAATC GGTGGAGCTG CATGACAAAG  13260

TCATCGGGCA TTATCTGAAC ATAAAACACT ATCAATAAGT TGGAGTCATT ACCCAATTAT  13320

GATAGAATTT ACAAGCTATA AGGTTATTGT CCTGGGTTTC AAGCATTAGT CCATGCAAGT  13380

TTTTATGCTT TGCCCATTCT ATAGATATAT TGATAAGCGC GCTGCCTATG CCTTGCCCCC  13440

TGAAATCCTT ACATACGGCG ATATCTTCTA TATAAAAGAT ATATTATCTT ATCAGTATTG  13500

TCAATATATT CAAGGCAATC TGCCTCCTCA TCCTCTTCAT CCTCTTCGTC TTGGTAGCTT  13560

TTTAAATATG GCGCTTCATA GAGTAATTCT GTAAAGGTCC AATTCTCGTT TTCATACCTC  13620

GGTATAATCT TACCTATCAC CTCAAATGGT TCGCTGGGTT TATCGCACCC CCGAACACGA  13680

GCACGGCACC CGCGACCACT ATGCCAAGAA TGCCCAAGGT AAAAATTGCC GGCCCCGCCA  13740

TGAAGTCCGT GAATGCCCCG ACGGCCGAAG TGAAGGGCAG GCCGCCACCC AGGCCGCCGC  13800

CCTCACTGCC CGGCACCTGG TCGCTGAATG TCGATGCCAG CACCTGCGGC ACGTCAATGC  13860

TTCCGGGCGT CGCGCTCGGG CTGATCGCCC ATCCCGTTAC TGCCCCGATC CCGGCAATGG  13920

CAAGGACTGC CAGCGCTGCC ATTTTTGGGG TGAGGCCGTT CGCGGCCGAG GGGCGCAGCC  13980

CCTGGGGGGA TGGGAGGCCC GCGTTAGCGG GCCGGGAGGG TTCGAGAAGG GGGGGCACCC  14040

CCCTTCGGCG TGCGCGGTCA CGCGCACAGG GCGCAGCCCT GGTTAAAAAC AAGGTTTATA  14100

AATATTGGTT TAAAAGCAGG TTAAAAGACA GGTTAGCGGT GGCCGAAAAA CGGGCGGAAA  14160

CCCTTGCAAA TGCTGGATTT TCTGCCTGTG GACAGCCCCT CAAATGTCAA TAGGTGCGCC  14220

CCTCATCTGT CAGCACTCTG CCCCTCAAGT GTCAAGGATC GCGCCCCTCA TCTGTCAGTA  14280

GTCGCGCCCC TCAAGTGTCA ATACCGCAGG GCACTTATCC CCAGGCTTGT CCACATCATC  14340

TGTGGGAAAC TCGCGTAAAA TCAGGCGTTT TCGCCGATTT GCGAGGCTGG CCAGCTCCAC  14400

GTCGCCGGCC GAAATCGAGC CTGCCCCTCA TCTGTCAACG CCGCGCCGGG TGAGTCGGCC  14460

CCTCAAGTGT CAACGTCCGC CCCTCATCTG TCAGTGAGGG CCAAGTTTTC CGCGAGGTAT  14520

CCACAACGCC GGCGGCCGCG GTGTCTCGCA CACGGCTTCG ACGGCGTTTC TGGCGCGTTT  14580

GCAGGGCCAT AGACGGCCGC CAGCCCAGCG GCGAGGGCAA CCAGCCCGG              14629

Claims (8)

1.一种DNA分子，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1自5’末端第4536-7858位。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1。

4.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞。

5.含有权利要求2或3所述重组表达载体的转基因细胞。

6.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

7.含有权利要求2或3所述重组表达载体的重组菌。

8.权利要求2或3所述重组表达载体在外源蛋白表达中的应用。

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