JP6930834B2 - H1プロモーターを用いるcrisprガイドrnaの発現のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本願は、2014年6月16日に出願された米国仮出願第62/012,802号の利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本出願は、配列表を含有する。配列表は、「111232-00401_ST25.txt」と称するASCIIテキストファイルとして、EFS−Webを介する電子媒体により提出された。配列表は、14,827バイトのサイズであり、2015年6月2日に作成された。配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
cas(CRISPR関連:CRISPR−associated)遺伝子と併せたCRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)は、細菌内および古細菌内の侵入性外来核酸に対する獲得性抵抗性をもたらす後天性免疫系を含む(Barrangouら(2007年)、Science、315巻:1709〜12頁)。CRISPRは、スペーサーと呼ばれる、同様のサイズの、固有の可変的DNA配列であって、ファージDNAまたはプラスミドDNAに由来することが多いDNA配列を介在させた、一連の短い保存的リピート配列からなる(Barrangouら(2007年)、Science、315巻:1709〜12頁;Bolotinら(2005年)、Microbiology、151巻:2551〜61頁;Mojicaら(2005年)、J. Mol. Evol.、60巻:174〜82頁)。CRISPR−Cas系は、CRISPR領域中に挿入され、マッチする配列を保有するファージおよびプラスミドへのその後の曝露に対する免疫をもたらす、外来DNA(スペーサー)の短い断片を獲得することにより機能する(Barrangouら(2007年)、Science、315巻:1709〜12頁;Brounsら(2008年)、Science、321巻:960〜64頁)。外来核酸のcrRNA媒介型サイレンシングを可能とするのは、このCRISPR−Cas干渉/免疫である(HorvathおよびBarrangou(2010年)、Science、327巻:167〜70頁;Deveauら(2010年)、Annu. Rev. Microbiol.、64巻:475〜93頁;MarraffiniおよびSontheimer(2010年)、Nat. Rev. Genet.、11巻:181〜90頁;Bhayaら(2011年)、Annu. Rev. Genet.、45巻:273〜97頁;Wiedenheftら(2012年)、Nature、482巻:331〜338頁)。
本発明の実施は、そうでないことが指示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある従来の技法であって、細胞生物学、細胞の培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸(例えば、DNA)技術、免疫学、およびRNA干渉(RNAi)の技法を援用することが典型的であろう。これらの技法のうちのいくつかについての非限定的な記載は、以下の刊行物:Ausubel, F.ら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols in Immunology、Current Protocols in Protein Science、およびCurrent Protocols in Cell Biology、2008年12月現在の版では、全てJohn Wiley & Sons、N.Y.;Sambrook、RussellおよびSambrook、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、2001年;Harlow, EおよびLane, D.、Antibodies - A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1988年;Freshney, R. I.、「Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique」、第5版、John Wiley & Sons、Hoboken、N.J.、2005年において見出される。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、第11版、McGraw Hill、2005年、Katzung, B.(編)、Basic and Clinical Pharmacology、McGraw-Hill/Appleton & Lange、第10版(2006年)、または第11版(2009年7月)において見出される。遺伝子および遺伝障害に関する非限定的な情報は、McKusick, V. A.、Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders、Baltimore: Johns Hopkins University Press、1998年(第12版)、または2010年5月1日現在、World Wide Web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/で入手可能である、より近年のオンラインデータベース:Online Mendelian Inheritance in Man、OMIM(商標)、McKusick−Nathans Institute of Genetic Medicine、Johns Hopkins University(Baltimore、Md.)およびNational Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine(Bethesda、Md.)、ならびにWorld Wide Web:http://omia.angis.org.au/contact.shtmlで入手可能である、動物種(ヒトおよびマウス以外)における遺伝子、遺伝性障害、および形質についてのデータベースである、Online Mendelian Inheritance in Animals(OMIA)において見出される。本明細書で言及される、全ての特許、特許出願、および他の刊行物(例えば、学術論文、書籍、ウェブサイト、およびデータベース)は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書と組み込まれる参考文献のうちのいずれかとの間で利益相反が生じる場合は、本明細書(組み込まれる参考文献に基づきうる、その任意の修正を含む)により裁定するものとする。本明細書では、そうでないことが指示されない限りにおいて、当技術分野で許容される、用語の標準的な意味を使用する。本明細書では、多様な用語について、標準的な略号を使用する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
非自然発生のCRISPR−Cas系であって、前記系は、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、前記gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;
b)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む1または複数のベクターを含み、
構成要素(a)および(b)が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、系。
(項目2)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN 19 NGG、GN 19 NGG、CN 19 NGG、またはTN 19 NGGを含む、項目1に記載の系。
(項目3)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目1に記載の系。
(項目4)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目1に記載の系。
(項目5)
前記細胞が、真核細胞である、項目1に記載の系。
(項目6)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目5に記載の系。
(項目7)
前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、項目5に記載の系。
(項目8)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目1に記載の系。
(項目9)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目1に記載の系。
(項目10)
前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングされている、項目1に記載の系。
(項目11)
細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、前記系が、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、前記gRNAが、前記DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、H1プロモーターと;
b)前記細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む1または複数のベクターを含み、
構成要素(a)および(b)が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、方法。
(項目12)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN 19 NGG、GN 19 NGG、CN 19 NGG、またはTN 19 NGGを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目11に記載の方法。
(項目15)
前記細胞が、真核細胞である、項目11に記載の方法。
(項目16)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記細胞が、網膜光受容体細胞である、項目15に記載の方法。
(項目18)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目11に記載の方法。
(項目19)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目11に記載の方法。
(項目20)
前記系を、前記細胞中に、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を使用して導入する、項目11に記載の方法。
(項目21)
双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、前記双方向性H1プロモーターが、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと;
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系。
(項目22)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN 19 NGG、GN 19 NGG、CN 19 NGG、またはTN 19 NGGを含む、項目21に記載の系。
(項目23)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目21に記載の系。
(項目24)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目21に記載の系。
(項目25)
前記細胞が、真核細胞である、項目21に記載の系。
(項目26)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目25に記載の系。
(項目27)
前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、項目25に記載の系。
(項目28)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目21に記載の系。
(項目29)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目21に記載の系。
(項目30)
前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングされる、項目21に記載の系。
(項目31)
細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、前記双方向性H1プロモーターが、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記gRNAが、前記DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと;
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記細胞内の前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、方法。
(項目32)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN 19 NGG、GN 19 NGG、CN 19 NGG、またはTN 19 NGGを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目31に記載の方法。
(項目35)
前記細胞が、真核細胞である、項目31に記載の方法。
(項目36)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目31に記載の方法。
(項目39)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目31に記載の方法。
(項目40)
前記系を、前記細胞中に、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を使用して導入する、項目31に記載の方法。
(項目41)
アプタマー調節型リボザイムであって、前記アプタマー調節型リボザイムは、
a)触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスI、ヘリックスII、およびヘリックスIIIの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、前記ヘリックスIIの二重鎖領域および前記ヘリックスIIIの二重鎖領域の各々が、前記触媒性コアの反対側にループ領域を含み、前記ヘリックスIIの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと;
b)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、前記gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードし、前記ヌクレオチド配列が、5’末端および3’末端を含み、前記ヌクレオチド配列の前記5’末端が、前記ヘリックスIIIの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列と
を含み、
ここで、前記リボザイムが、前記ヌクレオチド配列の前記5’末端と、前記ヘリックスIIIの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、前記リガンドの前記アプタマーへの結合により、前記リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、前記gRNAが放出される、アプタマー調節型リボザイム。
(項目42)
前記リガンドが、テオフィリンである、項目41に記載のアプタマー調節型リボザイム。
(項目43)
(a)RNAに転写されると、項目41に記載のアプタマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と;
(b)細胞内の前記RNAの転写を調節する、1または複数の転写調節配列と
を含む発現構築物。
(項目44)
項目43に記載の発現構築物を含む真核細胞。
(項目45)
細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、
前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、
前記方法が、項目43に記載の発現構築物を前記細胞中に導入するステップと、前記リボザイムの活性を変更する量で前記細胞を前記リガンドと接触させるステップと、を含む方法。
(項目46)
前記細胞が、真核細胞である、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記細胞が、被験体内にある、項目45に記載の方法。
(項目48)
被験体が、ヒトである、項目45に記載の方法。
(項目49)
前記リガンドが、テオフィリンである、項目45に記載の方法。
(項目50)
眼の神経変性疾患を処置することを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、
(a)非自然発生のCRISPR−Cas系を用意するステップであって、前記CRISPR−Cas系は、
i)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、前記gRNAが、前記被験体の細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;
ii)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む1または複数のベクターを含み、
ここで、構成要素(i)および(ii)が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップと;
(b)前記被験体に有効量の前記系を投与するステップと
を含む方法。
(項目51)
網膜光受容体細胞の機能不全および/または死が、前記被験体において観察されている、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記眼の神経変性疾患が、緑内障、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記眼の神経変性疾患が、色素性網膜炎(RP)である、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記細胞が、網膜光受容体細胞である、項目50に記載の方法。
(項目55)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目50に記載の方法。
(項目56)
前記H1プロモーターが、双方向性である、項目50に記載の方法。
(項目57)
前記被験体に投与するステップの前に、前記系を、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングする、項目50に記載の方法。
(項目58)
前記被験体に投与するステップを、網膜下注射により行う、項目50に記載の方法。
(項目59)
前記被験体が、ヒトである、項目50に記載の方法。
(項目60)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目50に記載の方法。
(項目61)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN 19 NGG、GN 19 NGG、CN 19 NGG、またはTN 19 NGGを含む、項目50に記載の方法。
(項目62)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内での発現についてコドンが最適化されている、項目50に記載の方法。
(項目63)
項目43に記載の発現構築物および前記リガンドを、前記リボザイムの活性を変更する量で投与するステップをさらに含む、項目50に記載の方法。
(項目64)
前記リガンドが、テオフィリンである、項目63に記載の方法。
これより、本明細書の以下では、本明細書で開示される主題について、付属の図を参照しながら、より完全に記載するが、そこでは、本明細書で開示される主題の全てではなく、一部の実施形態が示される。同じ番号は、本明細書を通して、同じエレメントを指す。本明細書で開示される主題は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で記される実施形態に限定されるものとみなされるべきではなく、それどころか、これらの実施形態は、本開示が、関連法規の要件を満たすように提供される。実際、本明細書で開示される主題が関する技術分野の当業者であって、前出の記載および関連する図において提示される教示の利益を有する当業者は、本明細書に記される、本明細書で開示される主題の多くの改変、および他の実施形態に想到するであろう。したがって、本明細書で開示される主題は、開示される具体的実施形態に限定されるものではなく、改変、および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図するものであることを理解されたい。
A.組成物
一部の実施形態では、本明細書で開示される主題はまた、細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、方法が、細胞中に、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、gRNAが、DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、H1プロモーターと;b)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む1または複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、構成要素(a)および(b)が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断して、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系を導入するステップを含む方法も提供する。
本明細書で開示される主題はまた、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態を処置するための方法も提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される主題は、それを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、(a)i)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、gRNAが、被験体の細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;ii)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む1または複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、構成要素(i)および(ii)が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断して、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系を用意するステップと;(b)被験体に有効量の系を投与するステップとを含む方法を提供する。
本明細書では、特殊な用語を援用するが、それらは、総称的意味および記載的意味だけで使用されるものであり、限定を目的とするものではない。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本明細書で記載される主題が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
方法
プラスミドの構築:H1 gRNA発現構築物(下記の表1、2、および3を参照されたい)を作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアセンブルして、76bpのgRNA足場およびpol III終結シグナルと融合させたH1プロモーターを創出した。H1プロモーターとgRNA足場との間に、BamHI部位を組み込んで、ターゲティング配列の挿入を可能とした。次いで、H1::gRNA足場::pol IIIターミネーター配列を、pCR4−Blunt(Invitrogen、Carlsbad、CA)中にTOPOクローニングし、シークェンシングおよび検証した。結果として得られるベクターは、リバース配向性である(下記を参照されたい)。本研究で使用される多様なgRNAを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、2ステップ増幅用のPhusion Flash DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)を使用してPCRにより増幅し、その後、2倍容量の25%のPEGおよび1.5MのNaClと混合した、Carboxylate−Modified Sera−Mag Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific)を使用して、精製した。次いで、精製されたPCR産物を、H2O中に再懸濁させ、NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量化した。gRNA発現構築物は、U6発現のための、AflIIで消化するプラスミド(#41824、Addgene、Cambridge MA)、またはH1発現のための、直前で記載したBamHIによるプラスミドの消化について若干改変した、Gibson Assembly(New England Biolabs、Ipswich、MA)(Gibsonら(2009年)、Nature Methods、6巻:343〜345頁)を使用して作出した。総反応容量は、20μlから2μlに低減された。
を使用して計算した。
CRISPR/Cas9ターゲティングの現時点での限界を拡張するために、U6 pol IIIではなく、H1 pol IIIを、代替的なプロモーターとして使用しうるのかどうかについて調べた(Baerら(1990年)、Nucleic Acids Res.、18巻:97〜103頁)。H1は、プリン(ヌクレオチドR)のいずれかを+1位置に配置した転写物を発現させうるため、S.pyogenes Cas9を伴い、AN19NGGおよびGN19NGG部位の両方における切断を可能とすることにより、CRISPRターゲティング空間を拡大しうることが仮定された(図1A)。H1から発現させるgRNAによる部位特異的切断を実証するため、H7ヒト胚性幹細胞系(hESC;図1B)内のAAVS−1遺伝子座において統合されたGFP標的遺伝子の、CRISPR媒介型切断を測定するレポーターアッセイを開発した(Hockemeyerら(2009年)、Nat. Biotechnol.、27巻:851〜857頁)。エラープローン非相同末端結合(NHEJ)の頻度に代わる代理指標として、コード配列の妨害に起因するGFP蛍光の喪失を測定した(GFP蛍光を妨害しないインフレームの突然変異またはインデルは、検出されないので、アッセイが、NHEJを過小評価することは注目に値する)(図1Bおよび図1C)。H7細胞を、等モル比のCas9発現プラスミドおよびgRNA発現プラスミドで電気穿孔し、コロニー形成の後で、細胞を、GFP蛍光について視覚化した。陰性対照の電気穿孔とは対照的に、U6プロモーターおよびH1プロモーターからの、全ての被験gRNA構築物は、ターゲティングされた突然変異を経た細胞内のGFPシグナルのモザイク喪失を示した(図1Cおよび不図示のデータ)。核染色による総細胞数の定量化は、フローサイトメトリーによる、GFP蛍光についての、細胞ベースの解析を可能とした。GFP蛍光の喪失により実証される通り、100%の構築物が、NHEJを結果としてもたらしたが、効率の範囲は、U6構築物およびH1構築物の両方で異なった(図1C、右および不図示のデータ)。U6プロモーターまたはH1プロモーターからgRNAを発現させることにより、これは、GFP遺伝子の突然変異誘発が、GN19NGGまたはAN19NGG部位のそれぞれにおいて生じうることを実証する。
CRISPRターゲティング空間の増大およびオフターゲット効果の潜在的可能性の低減は、ゲノムの操作について、広範な含意を有する。ターゲティング空間を増大させるためには、S.thermophilus(NNAGAAW)およびN.meningitides(NNNNGATT)における通り、代替的なCas9タンパク質の使用も有効であることが示されているが、これまでに報告されている、他のII型系のPAMによる制限は、厳密な要件を有し、したがって、単独で使用される場合、ターゲティングに利用可能な配列空間を低減する(データは示さないが、Congら(2013年)、Science、339巻:819〜823頁;Houら(2013年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、110巻(39号):15644〜9頁)。これに対し、H1プロモーターの使用によるgRNAの発現の改変は、任意のCas9タンパク質によるターゲティングレパートリーを大幅に拡大することが予測されるであろう。植物では、U6プロモーターが、5’グアノシンヌクレオチドに制限されているのに対し、コメに由来するU3プロモーターは、5’アデノシンヌクレオチドに制約されている。近年示唆されている通り、両方のプロモーターの使用は、植物ゲノム内のCRISPR部位の頻度を拡大しうるであろう(Shanら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:686〜688頁)。単一のプロモーター系を介して、脊椎動物ゲノム内のAN19NGG部位およびGN19NGG部位をターゲティングするのに、H1プロモーターの使用だけを利用しうることは簡便である。ひいては、これを援用して、現行のCas9変異体および部位の制限を変更した将来のCas9変異体のいずれのターゲティング空間も拡大することができる。
図10A、図10B、図10C、図10D、および図10Eは、Cas9タンパク質およびガイドRNAを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのH1プロモーターの使用を示す。双方向性H1プロモーターは、左へのpol II転写物としてのCas9(マイナス鎖)、および右へのpol III転写物としてのガイドRNA(プラス鎖)を発現させることが示されている。発現カセットの全体は、およそ4.4kbである(図10A)。双方向性H1構築物からのCRISPR媒介型切断を方向付ける能力について調べるために、eGFPをターゲティングするgRNAを使用する双方向性構築物を、プラスミド中にクローニングし、GFPを発現させるヒト幹細胞内で発現させた(図10B)。GFPの喪失が目視により検出された(図10C;中パネル、矢じり形)ことから、発現構築物による発現およびGFPのターゲティングの成功が指し示される。CRISPRターゲティングの成功はまた、レーン2および3における2つのバンドの存在を伴うSurveyorアッセイを介しても示された(図10D)。約4.75bのコンパクトターゲティングカセットを作出するのにH1プロモーターを使用する双方向性CRISPR構築物は、アデノ随伴ウイルスのパッケージング範囲内にある(図10E)。SV40ターミネーターは、橙色で示され、構築物は、ウイルスの産生に要請されるITR(inverted terminal repeat)配列で挟まれている。
プラスミドの構築:H1双方向性構築物を作出するために、ヒトコドンが最適化されたCas9遺伝子と、SV40ターミネーターとを、pol II転写物が内因性で見出される(マイナス鎖)、230bpのH1プロモーター(配列番号54)と融合させた。H1プロモーターとgRNA足場との間に、AvrII部位を操作して、ターゲティング配列の挿入を可能とした。次いで、SV40[rev]::hcas9[rev]::H1::gRNA足場::pol IIIターミネーター配列を、NdeI/XbaIによる消化物である、pUC19ベクター中にクローニングした。本研究で使用される多様なgRNAを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、2ステップ増幅用のPhusion Flash DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)を使用してPCRにより増幅し、その後、2倍容量の25%のPEGおよび1.5MのNaClと混合した、Carboxylate−Modified Sera−Mag Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific)を使用して、精製した。次いで、精製されたPCR産物を、H2O中に再懸濁させ、NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量化した。gRNA発現構築物は、若干改変した、Gibson Assembly(New England Biolabs、Ipswich、MA)(Gibsonら(2009年)、Nature Methods、6巻:343〜345頁)を使用して作出した。総反応容量は、20μlから2μlに低減された。
を使用して計算した。
図11A、図11B、および図11Cは、ガイドRNAの5’末端を作出するハンマーヘッド型リボザイムを示す。5’側シス型ハンマーヘッド型リボザイム(配列番号49)およびgRNA(配列番号50)を、図11Aに描示する。ハンマーヘッド型リボザイムの配列を指し示し、触媒作用に重要なヌクレオチドを指し示す(極めて重要なヌクレオチドを赤色、重要なヌクレオチドを橙色で)。切断の場所を、矢印で指し示す。リボザイムにより切断される(下)と、結果として得られるgRNAは、新たに形成された5’側位置におけるヌクレオチドに制約されずに放出される。ハンマーヘッド−gRNAを発現させることが示されている構築物を、図11Bに示す。一般に、U6、H1、またはT7などのpol IIIプロモーターであるプロモーターを使用して、5’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムを発現させることができ、これは、自己切断の後で、gRNAを放出するであろう。2つの遺伝子座のターゲティングを、図11Cに、Surveyorアッセイ(HH1+CGG PAM配列=配列番号51;HH2+AGG PAM配列=配列番号52)、5’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムによる切断(矢印)の成功と共に示す。
プラスミドの構築:U6プロモーター、H1プロモーター、またはT7プロモーターにより駆動される5’側シス型ハンマーヘッド型構築物を作出するために、ハンマーヘッド型配列(GTACGTTTCCTCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTTCGGTGCGTC;配列番号53)を、プロモーターの下流であり、かつ、gRNA標的および足場の上流に置いた。ヘリックスIを形成するために、gRNA標的配列と相補的な10ヌクレオチドを、ハンマーヘッド型配列の5’側に置き、次いで、これを、gRNA内で見出される相補的な配列に結合させた(図12)。本研究で使用される多様なgRNAを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、2ステップ増幅用のPhusion Flash DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)を使用してPCRにより増幅し、その後、2倍容量の25%のPEGおよび1.5MのNaClと混合した、Carboxylate−Modified Sera−Mag Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific)を使用して、精製した。次いで、精製されたPCR産物を、H2O中に再懸濁させ、NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量化した。gRNA発現構築物は、若干改変した、Gibson Assembly(New England Biolabs、Ipswich、MA)(Gibsonら(2009年)、Nature Methods、6巻:343〜345頁)を使用して作出した。総反応容量は、20μlから2μlに低減された。
を使用して計算した。
概要
色素性網膜炎(RP)とは、網膜光受容体細胞(杆体および錐体)の機能不全および死が、視覚喪失をもたらし、潜在的に、失明をもたらす、遺伝性網膜変性疾患である。RPには、常染色体劣性の遺伝形態および常染色体優性の遺伝形態の両方(それぞれ、ARRPおよびADRP)が存在する。ARRPでは、疾患の一因となる遺伝子のいずれのコピーにも(大半の遺伝子では、遺伝子の一方のコピーは、母親から受け継がれ、他方のコピーは、父親から受け継がれる)突然変異が見られる。ARRPと関連する疾患原因突然変異は一般に、関与遺伝子の機能の喪失をもたらす、すなわち、網膜変性は、その正常な機能を果たす関与遺伝子の能力の喪失に起因する。このような症例では、少なくとも理論的には、適切な処置を開発するのに行う必要がある(喪失した遺伝子機能を置きかえる必要がある)ことが明白である。この手法の洗練された例は、レーバー先天性黒内障(LCA)について進行中のヒト処置研究であり、この研究では、疾患を引き起こす欠損性RPE65遺伝子の機能を置きかえるのに、アデノ随伴ウイルス(AAV)による遺伝子治療が使用されている。
gRNAの転写を方向付け、利用可能なCRISPR遺伝子ターゲティング空間をほぼ倍化することを可能とするのに、従来使用されたU6プロモーターではなく、H1プロモーターが使用されている(Ranganathanら(2014年)、Nature Communications、5巻、4516頁)。とりわけ、オフターゲットの切出しへの傾向の低下が検出されたことから、H1プロモーターは、治療手法により好適であることが示唆される。これらの研究では、内因性H1RNA遺伝子とゲノム内で近接するタンパク質コード遺伝子(PARP−2)の存在が注目された(Baerら(1990年)、Nucleic Acids Research、18巻、97〜103頁;Myslinskiら(2001年)、Nucleic Acids Research、29巻、2502〜2509頁)。H1RNA(pol III RNA転写物)の始点と、PARP−2遺伝子(pol II転写物)の始点との間の配列は、230bp(図13)であることから、この比較的小さな配列は、コンパクト双方向性プロモーターとして機能しうることが指し示される。これは、pol II転写物およびpol III転写物の両方を方向付けうる、哺乳動物ゲノム内で唯一の双方向性プロモーター配列であり、両方のCRISPR構成要素を、単一のAAV中にパッケージングする場合のサイズのハードルを克服するのに使用しうると考えられる。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本明細書で開示される主題が関する技術分野の当業者のレベルを指し示す。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各個別の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では、多数の特許出願、特許、および他の参考文献が言及されるが、このような参考文献は、これらの文献のうちのいずれかが、当技術分野における共通の一般的な知見の部分を形成することの容認を構成しないことが理解されるであろう。
Claims (30)
- 双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、前記双方向性H1プロモーターが、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと;
b)RNA依存性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記RNA依存性ヌクレアーゼをDNA分子に向け、ここで、前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングされる、CRISPR−Cas系。 - 前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、請求項1に記載の系。
- 前記RNA依存性ヌクレアーゼは、Cas9タンパク質である、請求項1に記載の系。
- 前記RNA依存性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、請求項1に記載の系。
- 前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、請求項3に記載の系。
- 前記細胞が、真核細胞である、請求項1に記載の系。
- 前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項6に記載の系。
- 前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項6に記載の系。
- 前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、請求項1に記載の系。
- 前記RNA依存性ヌクレアーゼは、前記DNA分子を切断し、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、請求項9に記載の系。
- 前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項10に記載の系。
- 前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、請求項10に記載の系。
- 細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更するin vitro方法であって、前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、前記双方向性H1プロモーターが、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記gRNAが、前記DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと;
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記細胞内の前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更し、ここで、前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングされる、方法。 - 前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、請求項13に記載の方法。
- 前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が、真核細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項13に記載の方法。
- 前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、請求項13に記載の方法。
- アプタマー調節型リボザイムであって、前記アプタマー調節型リボザイムは、
a)触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスI、ヘリックスII、およびヘリックスIIIの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、前記ヘリックスIIの二重鎖領域および前記ヘリックスIIIの二重鎖領域の各々が、前記触媒性コアの反対側にループ領域を含み、前記ヘリックスIIの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと;
b)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、前記gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードし、前記ヌクレオチド配列が、5’末端および3’末端を含み、前記ヌクレオチド配列の前記5’末端が、前記ヘリックスIIIの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列と
を含み、
ここで、前記リボザイムが、前記ヌクレオチド配列の前記5’末端と、前記ヘリックスIIIの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、前記リガンドの前記アプタマーへの結合により、前記リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、前記gRNAが放出される、アプタマー調節型リボザイム。 - 前記リガンドが、テオフィリンである、請求項22に記載のアプタマー調節型リボザイム。
- (a)RNAに転写されると、請求項22に記載のアプタマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と;
(b)細胞内の前記RNAの転写を調節する、1または複数の転写調節配列と
を含む発現構築物。 - 請求項24に記載の発現構築物を含む真核細胞。
- 細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更するin vitro方法であって、
前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、
前記方法が、請求項24に記載の発現構築物を前記細胞中に導入するステップと、前記リボザイムの活性を変更する量で前記細胞を前記リガンドと接触させるステップと、を含む方法。 - 前記細胞が、真核細胞である、請求項26に記載の方法。
- 前記リガンドが、テオフィリンである、請求項26に記載の方法。
- 被験体における眼の神経変性疾患を処置するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の系。
- 被験体における眼の神経変性疾患を処置するための薬学的組成物であって、請求項22または23に記載のアプタマー調節型リボザイムを含む薬学的組成物。
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