KR20160118506A

KR20160118506A - 맨드라미추출물을 포함하는 어류 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20160118506A
Application number: KR1020150046721A
Authority: KR
Inventors: 문치웅; 최태진
Original assignee: 구을리주식회사; 문치웅
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2016-10-12

Abstract

본 발명은 맨드라미(Celosia cristata)의 추출물을 함유한 어류 바이러스 예방용 약학 조성물로서, 맨드라미의 줄기와 뿌리에서 열수 추출하여 감압 증류하여 수득한 맨드라미 추출물을 무(Raphanus sativus)의 뿌리 추출물을 부형제로 하여 약학 조성물을 제조하여, 어류 1마리당 2.5~10 ㎍를 투여함으로써 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 등의 예방 및 치료를 위한 맨드라미 추출물을 함유한 어류의 바이러스 감염 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

맨드라미추출물을 포함하는 어류 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition Comprising an Extract of Celosia for Preventing and Treating Fish Disease Caused by Virues}

본 발명은 맨드라미추출물을 포함하는 어류 바이러스의 예방 및 치료를 위한 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 맨드라미(Celosia cristata)의 줄기와 뿌리에서 열수 추출하여 감압 증류하여, 무(Raphanus sativus)의 뿌리 추출물을 부형제로 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 맨드라미 추출물을 포함하는 어류의 바이러스 감염 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

최근 수산양식산업에서 바이러스에 의한 질병 발생으로 대량 폐사가 빈번하게 발생하여 많은 경제적 손실을 발생시키고 있지만 적절한 예방 및 치료를 위한 대응책을 찾지 못하여 매년 반복적으로 피해가 발생하고 있으며, 그 피해 규모는 점점 커지고 있는 추세에 있다.

특히, 우리나라 해산 양식어의 큰 비중을 차지하고 있는 넙치는 가자미목 넙치과에 속하는 바닷물고기로, 양식으로만 연간 4만톤 이상이 생산되고 있으나, 최근 양식어장에서 각종 질병으로 폐사하는 넙치가 늘고 있다. 2013년 제주도 내 351곳의 육상 양식장에서 생산한 넙치 2만2997t 가운데 30.1%인 6928톤이 각종 질병으로 폐사해 피해액만 529억원에 이르는 것으로 추정된다.

폐사 원인은 2000년대 중반까지만 해도 에드워드, 연쇄구균 등의 세균성이 질병이 주를 이루었으나 2000년대 후반 들어 바이러스와 기생충에 의한 질병이 급속히 번지고 있는 추세이다. 최근에는 바이러스성 질병인 바이러스성 출혈성 패혈증(VHS), 기생충 질병인 스쿠티카증이 70%를 차지하고, 나머지는 에드워드, 연쇄구균 등 세균성 질병 때문으로 추정되고 있다.

특히, 넙치에 발생하는 질병은 2006년 이전까지는 바이러스성 출혈성 패혈증으로 죽는 넙치가 거의 발생하지 않았으나, 그 이후에는 바이러스성 출혈성 패혈증의 병증으로 폐사하는 넙치의 수가 증가하고 있으며, 제주특별자치도 해양수산지원연구소의 보고에 따르면, 바이러스성 출혈성 패혈증이 전체 바이러스 진단비율이 2007년에는 32%, 2008년에는 62%로 증가한 것으로 나타났다.

바이러스성 출혈성 패혈증(Viral haemorrhagic septicaemia; VHS, 이하 VHS)은 1949년 덴마크의 무지개송어 양식장에서 처음 발견되어 발병지가 있는 마을의 이름을 본떠 Egtved disease라 명명되었으며, 1962년 국제수역기구 전문위원회에서 바이러스성 출혈성 패혈증으로 다시 명명되었다.

VHS의 증상은 보통 급성(acute), 만성(chronic), 신경형의 3개의 유형이 있다. 급성형은 증상이 급속히 진행되고, 폐사율이 매우 높다. 감염된 병어는 체색이 어두워지고, 안구가 돌출되며 아가미, 안구, 가슴지느러미 기부 등에 출혈을 보인다. 만성형은 유행의 초기를 지났을 때 보이며 증상의 진행은 늦어지고 폐사율도 낮다. 감염된 어체는 체색이 흑화되고, 빈혈이 현저하며, 아가미는 거의 퇴색하면서 안구의 돌출이 현저하고, 복수가 차 있는 개체도 나타지만 어체의 출혈은 급성형같이 현저하지는 않다.

신경형은 유행의 끝에 보이는데 어체는 몸을 돌리는 운동을 하지 않고, 또는 한쪽으로 기울어져 유영하고, 돌진하기도 한다. 이처럼 이상한 행동과 복벽이 움츠려든 것처럼 보이는 것 외에는 건강한 개체들과 그다지 변함이 없다. 이러한 3형태는 엄격하게 구별할 수 있는 것은 아니고 중간단계의 것도 있으며 동일 질병어군에서도 3형이 혼재되어 있다.

넙치에서는 VHS 발병 시, 체색흑화, 복부팽만, 탈장 등이 가장 대표적으로 관찰되고, 해부 시 아가마 퇴색등이 관찰되며 복부에 맑은 복수가 차 있으며, 다른 바이러스성 질병과 달리 발병 시에도 섭이감소 등은 보이지 않고 먹이 섭이가 매우 양호한 특징을 보인다. 또한 발생초기나 잠복기에는 특별한 증상을 나타내지 않거나 체색흑화 이외의 별 증상이 없기도 하며 에드워드증과 육안으로 비슷하게 관찰되기도 한다. 그러나 일단 양어장에서 VHS가 발병되면 평균 35~90%에 이르는 양식어의 대량 폐사가 발생하므로 발병이 의심되는 양식어류는 정확한 진단이 필요하다.

VHS의 발병에는 어종, 어체의 크기, 영양상태, 양식 밀도, 수온,수질 등의 인자가 작용하지만 이중에서도 수온이 가장 중요한 환경요인이다. 계절에 무관하게 발병하기도 하나, 보통 수온이 상승하거나 혹은 수온 변동이 큰 봄철에 주로 발생한다. 넙치의 경우 9~13℃에서 주로 발생하며 12℃ 전후에서 폐사율이 높고 진행속도도 빠른 반면 수온이 15℃만 되어도 폐사율이 급격히 떨어지고 18℃로 수온이 상승하면 질병의 발생 현상을 관찰할 수 없게 된다. 즉 우리나라에서는 육상 수조식 양식방법에서는 11월 말부터 4~5월에 감염증상이 나타난다.

VHS는 1980년대 초반까지만 해도 유럽지역에서 주로 무지개 송어나 몇몇 담수어종에서 피해를 주는 바이러스로 알려졌었으나, 1988년 미국 서부 태평양 연안으로 회유하는 은연어와 왕연어에서 발견되면서 해산어에서도 감염되는 것으로 밝혀졌다. 현재는 넙치, 대구, 정어리, 명태와 무지개송어를 비롯한 약 50 여종의 해산어류와 담수어류에서 VHS의 감염이 확인었으며, 원인바이러스가 분리되고 있다.

VHS의 원인 바이러스(VHSV)는 Rhabdoviridae과 Novirhabdovirus속의 외막을 가진 단일가닥의 RNA 바이러스로, 180~240 ㎚의 크기를 가진 탄환형 바이러스이다.

진단방법으로는 세포배양법, 면역화학법, 분자생물학적 방법을 이용한 PCR 검출방법이 있다. 감수성이 있는 어류 세포주로는 BF-2, RTG-2, EPC, FHM, CHSE-214 등이 알려져 있으나, 해수 유래의 VHSV에 가장 감수성이 높은 세포주는 EPC로 알려져 있다.

이와 같은 VHS의 발생을 예방하는 방법은 주로 감염 경로를 차단하는 일차적인 방법이 주를 이루고 있다. 사육용수를 자외선 처리하거나 염소, 차아염소산, 또는 요오드포아 등과 같은 소독제로 소독하는 방법 등이다.

VHSV에 대한 백신연구는 포르말린 불활화 백신, 재조합 단백질 백신, 약독화 백신, DNA 백신 등의 연구는 꾸준히 되고 있으나 국내에서 아직 예방 및 치료용의 화학요법제는 상용화되지 못하고 있다.

독일에서 VHSV의 약독성 백신으로 무지개송어에 한정하여 실험적으로 사용한 보고가 있으며, 일본의 경우 어류 면역체계를 조절하는 teleostean interferon regulatory factor-1(IRF-1) 유전자를 이용한 재조합 DNA 백신을 이용하여 넙치에서 VHSV에 대한 저항성을 유도한 연구가 있었다. 또한 VHSV의 subunit 백신인 recombinant glycoprotein(VHSVg)와 이 유전자를 이용한 DNA 백신(pCMV-VHSg)에 대한 연구가 진행되었고 최근에는 synthetic double-stranded RNA인 polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))를 사용하여 넙치의 면역기능을 향상시켜 VHSV에 대한 저항성을 유도한 연구가 진행중이나 아직 상용화된 것은 없다.

한편, 우리나라는 동양전통의학의 오랜 경험을 바탕으로 축적된 한의학과 한약학의 천연물에 대한 풍부한 지적 자산을 가지고 있어서, 이를 식품, 기능성 제품 및 의약품 등에 다양하게 적용하고 있다. 한약재는 오랫동안 사람의 질병을 예방하고 치료해 온 친환경 소재이며, 천연물로서 가지는 특성으로 자연에서 분해되기 쉽고 독성이 적어서 화학물질의 독성효과를 완화시킬 수 있는 도움을 줄 수도 있다. 특히, 환경영향과 약제 잔류에 대한 우려가 끊이지 않으며, 기존 축산, 수산 현장에서 널리 활용되고 있었던 항생제를 비롯한 화학요법제가 여러 가지 공중보건학적 위해 요인으로 인해 국내외의 강력한 사용 규제에 직면하면서 천연 약용식물 및 한약재 사용은 어류질병 예방 연구에 있어 중요한 대안이 될 수 있다.

이러한 천연물 유래의 약용물질로 주목받는 식물 중 하나가 맨드라미이다. 맨드라미는 비름과 맨드라미속의 한해살이풀로 꽃이 닭볏을 닮았다 하여 '계관화'라고 불리기도 하며, 아시아, 아메리카, 서인도 제도의 열대 및 아열대지역이 원산이이며, 60여 종이 알려져 있다. 우리나라에는 둥근맨드라미(Celosia cristata), 깃털맨드라미(Celosia plumosa), 개맨드라미(Celosia argentea) 등과 이들의 교잡종이 자생하거나 재배되고 있다. 높이는 90cm정도까지 자라며 줄기는 전체에 털이 없이 곧고 단단하며 간혹 붉은색을 띤다. 꽃은 홍색, 황색, 또는 백색으로 7-10월에 피고, 열매는 달걀꼴로 꽃받침이 있고 옆으로 벌어진다.

본원 발명자의 선행 연구에 의하면 맨드라미 추출물이 사람과 가축의 바이러스 질환의 예방과 치료에 효과가 있으며, 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A virus), 뉴캣슬병 바이러스(newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스(infectious broncheitis virus), 조류 뉴모 바이러스(avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스(coxsakie virus), 세망내피증 바이러스(reticuloendotheliosis virus), 오제스키 바이러스(aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스(adeno virus)의 증식 억제 및 살바이러스 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

대한민국 등록특허 10-0881035호에서는 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A virus)등의 감염 세포주를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험 에서 바이러스 증식 억제 및 살바이러스에 의한 항바이러스 효과있어, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발되는 인간 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용할 수 있는 맨드라미 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 개시하고 있다. 대한민국 공개특허 10-2014-0135488호에서는 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유하는 맨드라미 꽃 추출물을 천연 항산화 물질로 이용함으로써, 산화적 스트레스로 인한 세포 손상을 방지할 뿐만 아니라 활성산소에 의해 생성되는 산화물에 기인하여 발생하는 질환을 치료 및 예방하는 효과가 있는 맨드라미 꽃 추출물을 유효성분으로 하는 항산화 활성 효과를 갖는 조성물을 개시하고 있다. 대한민국 공개특허 10-2009-0077303호에서는 약물처리나 DNA 백신 처리 등을 하지 않고도 양식 온도의 조절을 통해 넙치의 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)에 대한 감염을 예방하는 방법을 제공할 수 있어 넙치의 생산성 향상에 기여할 수 있는 방법으로, 넙치의 양식을 위한 수온이 18~22℃로 유지되도록 조절함으로써 넙치의 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus: VHSV)에의 감염을 예방하는 방법 및 시스템을 개시하고 있다. 그러나 상기 발명들은 본 발명에서 개시하고 있는 맨드라미(Celosia cristata)의 줄기와 뿌리에서 열수 추출하여 감압 증류하여 무(Raphanus sativus)의 뿌리 추출물을 부형제로 사용하여 제조한 것을 특징으로 하는 맨드라미 추출물을 포함하는 어류의 바이러스 감염 예방용 약학 조성물과는 그 구성 및 효과에서 차이를 보인다.

본 발명은 최근 넙치를 비롯한 담수 및 해산어 양식장에서 발병하여 대량폐사를 일으켜 양식장에 막대한 손실을 입히고 있으나, 아직 그 예방과 치료법이 완전하게 확립되어 있지 않은 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 맨드라미(Celosia cristata)의 줄기와 뿌리에서 열수 추출하여 감압 증류하여 수득한 맨드라미 추출물을 무(Raphanus sativus)의 뿌리 추출물을 부형제로 하여 약학 조성물을 제조하고, 넙치 등의 양식어의 사료에 첨가하여 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 및 치료를 위한 맨드라미 추출물을 함유한 어류의 바이러스 감염 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 맨드라미 추출물을 함유한 어류 바이러스 예방용 약학 조성물은 우리나라에서 재배가 쉽고 수득이 용이한 맨드라미를 사용하여 넙치 등의 양식어의 사료에 첨가하여 급이함으로써 양식어의 체내에 면역 반응 유전자의 발현을 유도하고, 감염 바이러스 증식을 억제할 수 있다. 따라서 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 비롯한 어류 바이러스의 감염 억제 및 치료에 용이하게 사용할 수 있다.

도 1은 맨드라미 추출물이 EPC 세포주의 세포 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. (A) 부형제를 농도별(0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10.0 ㎎/㎖)로 첨가한 EPC 세포주의 세포활성 (B) 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 농도별로 첨가한 EPC 세포주의 세포활성
도 2는 맨드라미 추출물이 VHSV에 의한 EPC cell lysis에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. (A) 부형제를 첨가한 EPC 세포주의 VHSV에 의한 cell lysis (B) 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 첨가한 EPC 세포주의 VHSV에 의한 cell lysis
도 3은 VHSV에 의한 EPC cell lysis에 농도별 맨드라미 추출물의 효과를 나타낸 그래프이다. (A) PBS를 농도별로 처리한 EPC 세포주의 VHSV에 의한 cell lysis (B) 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 농도별로 처리한 EPC 세포주의 VHSV에 의한 cell lysis
도 4는 맨드라미 추출물이 VHSV 감염 EPC 세포주의 CPE(Cytophatic effect)에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. (A) 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 EPC 세포주에 먼저 처리하고 VHSV를 감염시킨 후의 CPE (B) EPC 세포주에 VHSV를 감염시킨 후 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리한 후의 CPE
도 5는 맨드라미 추출물이 VHSV 감염 EPC 세포주의 생장에 미치는 영향을 보여주는 Plaque Assay 사진이다. (A) 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 10 ㎍/㎖을 처리한 VHSV 감염 EPC 세포주의 Plaque Assay (B) PBS 처리한 VHSV 감염 EPC 세포주의 Plaque Assay
도 6은 맨드라미 추출물이 EPC 세포주를 감염시킨 VHSV의 증가곡선에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 맨드라미 추출물이 EPC 세포주의 Mx gene의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 PBS 처리구(Control)와 처리시간을 달리한 맨드라미 추출물이 VHSV 감염된 EPC 세포주에서 Mx gene의 RT-PCR 결과물의 전기영동 사진이다. (B)는 PBS 처리구(Control)와 처리시간을 달리한 맨드라미 추출물이 VHSV 감염된 EPC 세포주에서 Mx gene의 RT-PCR 결과물의 상대적인 발현정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 맨드라미 추출물이 넙치의 면역유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위한 넙치의 사진이다. (a) 면역 유도된 넙치 (b) (a)의 넙치를 RT-PCR을 위하여 간, 신장, 비장을 수득하는 모습
도 9는 맨드라미 추출물이 넙치의 면역반응 유전자에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 경구 투여한 넙치의 TLR2 및 TLR7 gene의 RT-PCR 결과물의 전기영동 사진이다. (B)는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 경구 투여한 넙치에서 Mx, TLR7, TLR2 및 ISG15 gene)의 상대적 별현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 의한 맨드라미 추출물을 함유한 약학조성물이 넙치의 VHS 감염에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

VHS 발병 어류는 체색흑화, 복부팽만, 탈장 등의 증상을 나타내며 안구돌출, 아가미, 안구, 가슴지느러미 기부 등의 출혈을 보이다가 대량 폐사로 이어진다. 그러나 다른 바이러스성 질병과 달리 발병 시에도 섭이감소 등은 보이지 않고 먹이 섭이가 매우 양호한 특징을 보이기 때문에 약제를 사료에 첨가하는 것으로 VHS의 예방과 치료 방법으로 접근할 수 있다. 또한 본원 발명자의 기존 연구를 토대로 바이러스에 의한 병증에 효과를 갖는 것으로 기대되는 맨드라미(Celosia crista)의 추출물의 VHSV에 대한 효과를 확인하면서 본 발명을 완성하였다. 이하 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명한다.

A. 맨드라미 추출물을 함유한 조성물의 세포안정성 및 in vitro 활성 조사

A.1.맨드라미 추출물을 함유한 조성물의 세포독성 조사

A.1.1. 맨드라미와 부형제의 추출물 수득

본 발명의 in vitro 및 in vivo 실험에 사용한 천연물 유래 추출물은 채집한 맨드라미(Celosia crista)의 줄기와 뿌리를 음건한 후 파쇄하여 95℃에서 8시간 열수 추출한 다음, 감압 증류와 동결 건조과정을 거쳐 고체화된 시료를 사용하였다. 또한 본 발명에서는 무(Raphanus sativus)의 뿌리를 부형제로 사용하였으며, 무 뿌리의 추출물 또한 상기와 같은 방법으로 추출하였다.

A.1.2. EPC 세포주의 준비

본 발명에서 사용한 EPC(Epithelioma papulsum cyprini cell line)은 부경대학교 어병학과 기생충학 실험실에서 분양 받았으며, 배양배지는 Sigma-Aldrich사의 L-15 medium (Leibovitz)와 Gibco사의 FBS (fetal bovine serum)와 Gibco사의 Pen Strep (Penicillin Streptomycin)을 사용하였다. 세포배양시 10% FBS 사용하였다. SPL사의 cell culture flask 25 cm²에 2 × 10⁶cells/flask가 되도록 세포를 28℃에서 배양하였다. cell 분리시 Gibco사의 0.25% Trysin-EDTA (1×)을 사용하였다.

A.1.3. 맨드라미 추출물의 EPC 세포주에 대한 세포독성여부의 확인

양식 어류의 대량 폐사를 일으키는 VHSV의 예방 및 감염 억제를 위한 천연물 유래 친환경 제제의 EPC cell 처리시 cell cytotoxicity를 알아보기 위해 WST-1 cell Proliferation Assay system을 하였다. Cell viability assay에는 DOGEN사의 Cell Viability, Proliferation & Cytotoxicity Assay kit인 EZ-Cytox를 사용하였다.

먼저 96well plate에 최종 배양액이 100 ㎕/well 되도록 세포를 배양하였다. 이때 세포농도는 1×10⁵cells/well이고 28℃에서 24시간 배양하였다. 세포배양이 끝난 후 남아있는 배양액을 aspirator를 이용해 제거하였으며, 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 맨드라미 추출물의 농도가 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10.0 ㎎/㎖이 되도록 하여 최종 100 ㎕/well 되도록 처리하였다. 이를 28℃에서 24시간 배양 후, 배양액을 제거하고 1well당 L-15배지 100 ㎕에 Premix WST-1을 10 ㎕씩 더하였다. 이를 28℃에서 3-4시간 반응한 후 460nm에서 ELISA reader를 이용하여 샘플의 흡광도를 측정한 다음, 맨드라미 추출물을 첨가하지 않은 대조구에 대한 상대적인 세포 활성을 계산하였다.

도 1은 맨드라미 추출물이 EPC 세포주의 세포 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 1에서 보는 바와 같이 부형제 또는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 농도별(0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10.0 ㎎/㎖)로 EPC 세포주에 첨가한 결과, 부형제((A) Diluting agent) 또는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리구((B) Mixture of SR22:diuting agent) 모두에서 5 ㎎/㎖까지 반수치사량이 나타나지 않았다. 또한 부형제만 처리된 처리구보다 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물에서 세포 생존능력이 더욱 뛰어남을 알 수 있었다(도 1).

A.2. 맨드라미 추출물의 VHSV 감염 억제 확인

VHSV의 감염 억제를 위한 맨드라미 추출물의 효과와 적정 농도를 알아보기 위해 실험 수행하였다. VHS virus는 부경대학교 어병학과 기생충학 실험실에서 분양받았다. 실험에 사용된 VHS virus strain은 Wt VHSV KJ2008을 사용하였으며, virus stock은 4×10⁷pfu/㎖였다. 6well plate에 1×10⁶cells/well이 되도록 EPC cell을 배양하였다. 세포배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 부형제 또는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리구를 5, 10, 15 ㎍/㎖의 농도로 최종 배양액이 2 ㎖/well이 되도록 28℃에서 4일간 배양하였다. 바이러스 접종 전 14~24시간 15℃에서 배양한 후, 배양액을 제거하고 2% FBS배지를 2 ㎖첨가하였다. Wt VHSV KJ2008을 MOI 0.1이 되도록 2% FBS배지에 희석한 후, 100 ul/well 접종하였다. 이를 15℃에서 배양하며 현미경으로 관찰을 하였다.

도 2는 맨드라미 추출물이 VHSV에 의한 EPC cell lysis에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 부형제를 첨가한 EPC 세포주에서 VHSV에 의하여 cell lysis가 일어난 것을 볼 수 있다. 그러나 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 첨가한 EPC 세포주의 경우, VHSV에 의한 cell lysis가 현저히 억제된 것을 관찰할 수 있다.

도 3은 VHSV에 의한 EPC cell lysis에 농도별 맨드라미 추출물의 효과를 나타낸 그래프이다. (A)는 PBS를 농도별로 처리한 대조구인 EPC 세포주의 VHSV에 의한 cell lysis를 나타내며, (B)는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 농도별로 처리한 EPC 세포주의 VHSV에 의한 cell lysis를 나타낸 사진이다. 도 3에서 보는 바와 같이 PBS만을 처리한 대조구(A)에 비하여 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물을 처리한 처리구에서 cell lysis 속도가 현저히 더딤을 알 수 있었으며, 특히 10 ㎍/㎖의 농도에서 가장 높은 세포 생존능력을 확인할 수 있었다(도 3).

A.3. 맨드라미 추출물의 VHSV 감염 억제 작용 경로 확인

VHSV의 감염을 억제하는 맨드라미 추출물의 작동경로를 탐색하기 위한 실험을 수행하였다. 실험구 A에서는 배양된 EPC cell에 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 10 ㎍/㎖ 처리 후 VHSV를 MOI 0.01의 농도로접종하여 15℃에서 배양하며 관찰을 하였다(Extracts first). 실험구 B에서는 6well plate에 EPC cell 1×10⁶cells/well을 28℃에서 배양한 후, VHSV를 MOI 0.01의 농도로 접종한 다음, 15℃에서 2시간 배양한 후 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 10 ㎍/㎖를 처리한 다음(Virus first), 현미경으로 관찰하였다.

도 4는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물이 VHSV 감염 EPC 세포주의 CPE(Cytophatic effect)에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 EPC 세포주에 먼저 처리하고 VHSV를 감염시킨 실험구 (A)의 경우 CPE를 확인할 수 없었다. 반면에 VHSV를 같은 농도로 처리한 후 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리하였을 경우에는 CPE를 확인할 수 있었다.

A.4. 맨드라미 추출물이 VHSV 감염 세포의 성장곡선에 미치는 효과 확인

맨드라미 추출물을 이용하여 Virus의 억제를 확인하기 위해 먼저 6well plate에 EPC cell 1×10⁶cells/well을 28℃에서 배양한 후 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물 10 ㎍/㎖을 추가하였다. 음성 대조군으로 PBS를 처리하여 진행하였다. 3일 후 2% FBS 배지로 교체한 후, Wt VHSV를 MOI 0.1의 농도로 처리하여 감염 1에서 5일 후 상등액을 취하여 plaque assay를 진행하였다. 10진 희석법으로 희석된 상등액 sample을 EPC cell에 접종 2시간 후 중층 배지(0.7% agar)를 분주하여 7일 동안 15℃에서 배양한 후 Crystal violet 염색을 통해 PFU를 확인하였다.

도 5는 맨드라미 추출물이 VHSV 감염 EPC 세포주의 생장에 미치는 영향을 보여주는 Plaque Assay 사진이다. (A)는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 10 ㎍/㎖을 처리한 VHSV 감염 EPC 세포주의 Plaque Assay를 나타내는 사진이며, (B) PBS 처리한 VHSV 감염 EPC 세포주의 Plaque Assay를 나타낸 사진이다. 도 4에서 보는 바와 같이 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 10 ㎍/㎖ 처리한 처리구에서 Plaque의 형성이 현저히 감소한 것을 볼 수 있다.

도 6은 이 EPC 세포주를 감염시킨 VHSV의 증가곡선에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 그래프에서 보는 바와 같이, 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물을 처리한 처리구에서 VHSV 감염된 세포에서 감염 3일 후 Virus titer는 6.3×10⁶pfu/㎖인 반면, 대조구의 Virus titer는 8.6×10⁶pfu/㎖였다. 또한 감염 4일 후 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물을 처리한 처리구에서 virus titer는 5.8×10⁶pfu/㎖였으나, 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물을 처리하지 않은 대조구의 경우 Virus titer는 2.1×10⁷pfu/㎖였다. 감염 5일후의 처리구와 대조구의 Virus titer는 각각 4.7×10⁶pfu/㎖와 2.7×10⁷pfu/㎖였다. 이를 통해 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물을 처리한 경우, 처리하지 않은 대조구에 비해 상당한 Virus replication의 억제를 확인 하였다.

A.5. 맨드라미 추출물이 EPC 세포주의 면역반응유전자 발현에 미치는 영향

맨드라미 추출물의 VHSV의 억제 작용 기작을 알아보기 위하여 배양된 EPC cell에 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물 처리시간을 다르게 하여 처리한 후 VHSV를 감염시켜 EPC cell에서의 면역관련 유전자 발현정도를 확인하였다.

이를 위하여 배양된 EPC cell에 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물 10 ㎍/㎖을 추가한 다음, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 배양한 후, VHSV 0.1의 농도로 감염시켰다. 배양 후, EPC cell에서 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. EPC 세포주의 mRNA는 Dynabeads mRNA DIRECTtmKIT(ambion)를 이용하여 추출하였고, 이를 SuperScriptㄾVILO™ cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하여 PCR을 통해 어류에서 type 1 interferon response의 marker로 사용되는 Mx gene의 발현을 확인하였다.

PCR은 Prime Taq DNA Polymerase (GeNet Bio)를 이용하였으며, Mx Primer는 GeneBank number EF635410.1를 이용하여 제작하였으며, 서열은 5'-gtccaagccctggaaaaaga-3'(sense), 5'-cgggaagctcctttcctcta-3' (anti-sense)로 제작 하였다. β-actin은 internal control로 GenBank no M24113.1을 바탕으로 5'-caattactgggcagccttca-3' (sense), 5'-caattactgggcagccttca-3' (anti-sense)로 제작하였다. PCR은 95℃에서 2분 반응 후, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응을 30회 실시한 후 72℃에서 10분간 반응하였다.

도 7은 맨드라미 추출물이 EPC 세포주의 Mx gene의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 PBS 처리구(Control)와 처리시간을 달리한 맨드라미 추출물이 VHSV 감염된 EPC 세포주에서 Mx gene의 RT-PCR 결과물의 전기영동 사진이고, (B)는 이들 Mx gene의 RT-PCR 결과물의 상대적인 발현정도를 나타낸 그래프이다.

맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리한 EPC 세포주에서 Mx gene의 발현은 PBS만 처리한 대조구에서 보다 처리 시간이 증가함에 따라 현저하게 발현되는 것을 확인하였다. 또한 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리 4일 후 가장 높은 Mx gene 발현을 확인 하였고, 이후 감소하는 것을 알 수 있었다.

B. 맨드라미 추출물의 넙치에서의 면역유전자 발현과 바이러스 질병 억제 효과

B.1. 맨드라미 추출물이 넙치에서의 면역유전자 발현에 미치는 효과

맨드라미 추출물이 어류의 바이러스성 질병에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30g의 넙치를 이용하여 천연추출물을 다른 농도 및 다른 시간을 처리하였을 때의 면역유전자 발현을 확인하였다.

도 8은 맨드라미 추출물이 VHSV 감염 넙치의 면역유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 VHSV를 감염시킨 넙치의 사진이다. 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물 2.5, 5, 10 ㎍/fish을 경구 투여한 후, 24, 48, 72시간 후 넙치의 간, 신장, 비장을 추출하여 Total RNA를 분리하였다.

파쇄된 조직에 TRIzol(Invitrogen)을 더한 후, chloroform을 첨가한 다음, 12,000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 tube에 옮긴 후, isopropyl alcohol을 더하고 12,000g에서 10분 동안 원심분리한 후, pellet은 75% ethanol로 washing하고 10,000g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 20㎕의 RNase-free water에 pellet을 녹였다. 추출된 RNA sample을 SuperScriptㄾVILO™ cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)로 cDNA 합성을 하고 PCR을 진행하였다. 면역 유전자 확인을 위해 사용된 PCR primer는 표 1과 같이 제작하였으며, 맨드라미 추출물(SR22)과 부형제 혼합물 처리 시 type 1 IFN response(Mx, ISG15)와 innate immune response (TLR2, TLR7)의 발현 효과를 확인하였다.

면역 유전자 확인을 위해 사용된 PCR primer

Primer	GeneBank acc.no	Product length	Sense primer	Antisense primer	Tm
TLR7	HQ845984a	97	cctgggaaatctggaagaac	tttgagggaggagaaactgc	62
TLR2	AB109393	120	gctacatctgcgactctcct	cacagggacacgaacaaatc	58
MX	AB110446.1	399	aacagccaaggcaaagattg	aatgtccagctcctccttca	60
ISG15	AB519717.1	295	gaagcagctcatccagcaga	cctctgctgactctccgtca	55
β-actin	HQ386788.1	199	tttccctccattgttggtcg	tacaacgagctgagagtcgc	55

도 9는 맨드라미 추출물이 넙치의 면역반응 유전자에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 경구 투여한 넙치의 TLR2 및 TLR7 gene의 RT-PCR 결과물의 전기영동 사진이며, (B)는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 경구 투여한 넙치에서 Mx, TLR7, TLR2 및 ISG15 gene)의 상대적 별현량을 나타낸 그래프이다. 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리한 넙치의 간(L), 신장(K), 비장(S) 모두에서 바이러스 특이적인 면역 반응의 marker인 Mx와 ISG 15가 증가한 것을 확인하였으며, 선천 면역의 marker인 TLR2와 TLR7의 확연한 증가를 확인하였다.

또한 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리 24, 48, 72시간 모두에서 증가를 확인 할 수 있었고, 2.5 ㎍/fish의 농도로 처리 시 가장 높은 TLR2와 TLR7의 증가를 확인 하였다.

B.2. 맨드라미 추출물의 넙치에서의 VHS 발병 억제 효과

평균 체중 9g의 넙치를 이용하여 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리 시 VHSV 발병의 억제 효과가 있는지 알아보는 실험을 수행하였다. 본 실험은 표 2와 같이 10마리씩 3가지 그룹으로 나누어 3번 반복 실험하였다.

발병의 억제 효과가 실험 그룹

Group	oral administration	VHSV
1	100 ㎕ of SR22:Dilutant Mixture	50ul of L-15
2	100 ㎕ of PBS	50ul of VHSV
3	100 ㎕ of SR22:Dilutant Mixture	50ul of VHSV

먼저, 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 2.5 ㎍/fish을 100㎕ 경구 투여 48시간 후, L-15배지를 근육주사 하였고, PBS 100㎕ 경구 투여 48시간 후, Virus (10²pfu/㎖)를 주사하였으며, 마지막으로 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 2.5 ㎍/fish를 100㎕ 경구 투여 48시간 후, Virus (10²pfu/㎖)를 주사하였다. 생존률은 감염 2주 후 측정하였다.

넙치에서 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리에 따른 바이러스성 출혈성 패혈증 발생 억제를 확인하기 위해 3가지 Group으로 나누어 실험을 진행하였다. Group1은 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리한 후, VHSV를 감염시키지 않았으며, Group2는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리하지 않고 VHSV를 감염시켰고, Group3는 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리한 후 VHSV를 감염시켰다.

도 10은 본 발명에 의한 맨드라미 추출물을 함유한 약학조성물이 넙치의 VHS 감염에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 감염 13일 후부터 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리된 Group3에서 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리하지 않은 Group2와 비교하여 Motrality가 감소하는 것을확인 하였다. 감염 17일 후 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물 처리하지 않은 Group2에서 100% 폐사를 확인 하였고, Group3에서 60%의 폐사를 확인하였다. 따라서, 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 처리함으로써 넙치에서 바이러스성 출혈성 패혈증의 발병 억제를 확인 할 수 있었다.

C. 조성물을 이용한 감염예방용 약품제조

본 발명의 조성물을 양식어로 투여를 용이하게 하기 위하여 정제, 캡슐제, 연질 캡슐제, 과립제, 액제 형태로 제조할 수 있으며, 사료 첨가제로 사용될 수 있다. 또한 상기 조성물이 0.01 내지 99.9중량%로 포함되도록 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경피제, 좌제 또는 멸균 주사용 액으로 제형화하여 제조할 수 있다.

멸균주사액의 경우, 상기 약학조성물이 0.01 내지 99.9중량%로 포함하도록 하고 정제수, 포도당액 또는 식염수를 99.9 내지 0.01 중량%를 혼합하여 제조 가능하다. 캡슐제의 경우, 상기 약학조성물을 동결건조하여 0.01 내지 99.9중량%로 포함하도록 하고, 비타민제, 칼슘제을 99.9 내지 0.01 중량%를 혼합하여 제조 가능하다.

상기 제조된 약학조성물의 1일당 투여량은 상기 추출물이 10 내지 1000mg/kg 체중 포함되는 함량으로 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 0.01 내지 99.9중량%로 포함하는 사료첨가제로도 제조 가능하다.

이상과 같이 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물을 EPC 세포주에 처리한 후, VHSV를 감염시킨 결과, VHSV의 증식을 유의하게 억제하는 것을 확인하였으며, 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물의 농도가 10 /일 때 가장 효과가 좋았다. 이때 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물은 VHSV 감염 전에 처리하는 것이 감염 후 처리에서 보다 뛰어난 효과를 얻을 수 있었다.

또한 맨드라미 추출물과 부형제 혼합물이 처리된 세포에서 면역 유전자인 Mx가 강하게 발현되며, 넙치 적용실험에서도 Mx, TLR2 및 TLR7유전자의 발현이 간, 신장 및 비장에서 유의하게 증가함을 확인하였으며, 넙치의 VHSV 감염 후 생존률을 증가시키는 것을 확인하여, 본 발명에 따른 맨드라미 추출물이 VHSV의 감염 예방에 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 맨드라미 추출물을 함유한 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방용 약학 조성물은 우리나라에서 재배가 쉽고 입수가 용이한 맨드라미의 추출물을 이용하여 대량폐사를 일으켜 양식사업에 막대한 피해를 입히고 있는 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방에 효과를 나타내어 경제적 손실을 저감시킬 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims

맨드라미(Celosia cristata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 예방 및 치료용 약학 조성물
제1항에 있어서, 상기 맨드라미 추출물은 맨드라미의 줄기와 뿌리에서 열수 추출하여 감압 증류한 것을 특징으로 하는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 예방 및 치료용 약학 조성물
제1항에 있어서, 상기 맨드라미 추출물은 부형제와 혼합하여 이루어지며 상기 부형제는 무(Raphanus sativus)의 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 예방 및 치료용 약학 조성물
제1항에 있어서, 상기 조성물은 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 경피제, 또는 멸균 주사용 액으로 제형화된 것을 특징으로 하는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 예방 및 치료용 약학 조성물
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물은 2.5~10 ㎍/fish의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 감염 예방 및 치료용 약학 조성물