KR100923884B1 - 항인플루엔자 바이러스 활성이 높은 오리나무 수피 또는줄기 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오리나무(Alnus japonica) 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 항인플루엔자 바이러스(anti-influenza virus) 활성이 높은 오리나무 수피 또는 줄기의 80~100% 에탄올 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 함유하는 항인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 오리나무 수피 또는 줄기 추출물은 정상세포에 대한 독성이 낮으며, 저농도로 투여했을 경우에도 항인플루엔자 바이러스 효과가 탁월하므로 이를 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 및 병증 개선을 위한 식품 또는 약학 조성물 등에 유용하다.

오리나무, 항바이러스, 조류인플루엔자 바이러스, 오르쏘믹소바이러스과(orthomixoviridae)

Description

항인플루엔자 바이러스 활성이 높은 오리나무 수피 또는 줄기 추출물의 제조방법{Method for Preparing Alnus japonica Bark or Stem Extracts Having High Anti-Influenza Viral activity}

본 발명은 오리나무(Alnus japonica) 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 항인플루엔자 바이러스(anti-influenza virus) 활성이 높은 오리나무 수피 또는 줄기의 80~100% 에탄올 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 함유하는 항인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다.

바이러스는 여러 가지 질환의 원인이 되는데, 특히, 축산업 분야에서도 문제되고 있는 바이러스 중, 대표적인 것이 조류인플루엔자 바이러스이다. 조류인플루엔자 바이러스는 오르쏘믹소바이러스과(orthomixoviridae)에 속하며, 주로 닭과 칠면조 등 가금류에 많은 해를 입힌다. 조류 인플루엔자 바이러스는 병원성(病原性)에 따라 고(高)병원성 · 약(弱)병원성 · 비(非)병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 3종류로 구분되며, 이 가운데 고병원성은 국제수역사무국(OIE)에서 리스트 A등 급으로, 한국에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다.

인플루엔자 바이러스는 매트릭스 단백질과 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성에 따라 A, B, C형 바이러스로 분류되며, 숙주세포 수용기 결합과 숙주세포막과 바이러스 엔벨롭의 융합을 도와 바이러스 감염을 초래하는 혈구응집단백질 (haemagglutinin, HA)과 증식 후, 바이러스가 세포로부터 출아될 때 중요한 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 항원구조의 차이에 따라 HA는 16종류, NA는 9종류의 아형(subtype)으로 분류된다. 이론적으로는 두 단백질의 조합에 의해 총 144 가지의 바이러스 아형이 존재할 수 있다.

감염은 조류의 분비물을 직접 접촉할 때 주로 일어나며, 비말(飛沫) · 물, 사람의 발, 사료 차, 기구, 장비, 알 겉면에 묻은 분변 등에 의해서도 전파가능하다. 증상은 감염된 바이러스의 병원성에 따라 다양하지만 대체로 호흡기 증상, 설사 및 급격한 산란율의 감소로 나타난다. 경우에 따라서는 볏 등 머리 부위에 청색증이 나타나기도 하고, 안면에 부종이 생기거나 깃털이 한 곳으로 모이는 현상이 나타나기도 한다. 폐사율도 병원성에 따라 0~100%로 다양한데, 뉴캐슬병 · 전염성 후두기관염 · 마이코플라스마 감염증 등과도 증상이 비슷하므로 정확한 진단이 필요하다.

고병원성 조류 인플루엔자는 1959~2003년까지 전 세계적으로 23회 발병한 바 있으나, 대부분 국지적인 발생으로 종식되었다. 2003년 12월 한국에서 발생한 H5N1 아형 고병원성 조류 인플루엔자는 일본, 중국, 태국, 베트남, 인도네시아 등 동남아시아 대부분의 국가와 유럽, 아프리카 등 30개국 이상에서 발병하여 범세계적인 발병양상을 보였다. 조류 인플루엔자 바이러스는 인간에게 직접 전염될 수 없다고 알려졌으나, 홍콩에서의 1997년 H5N1 인체 감염사례, 1999년 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스의 인체 분리 사례 및 2004년 캐나다에서 발생한 H7 조류 인플루엔자 바이러스의 인체 감염사례로 인해 조류 인플루엔자 바이러스의 공중보건학적 중요성이 날로 증가하고 있다. 세계보건기구(WHO)의 보고에 의하면 (http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2006_06_20/en/index.html), 2003년부터 2006년 6월 20일까지 10개국에서 228명이 H5N1 아형바이러스에 감염되었고, 이 중 130명이 사망한 것으로 확인되고 있다. 한국에서도 1996년 H9N2 아형 바이러스 감염에 의한 저병원성 조류 인플루엔자가 발생한 이후, 1999년 재발한 바가 있다.

조류 인플루엔자가 발생하면 대부분의 국가에서는 전수 도축 처분해야 하고, 이로 인해 발생국가에서는 양계산물을 수출할 수 없게 되므로 양계산업에 막대한 피해를 초래하며, 아울러, 인체 감염의 위험이 있는 경우에는 관광산업, 운송산업 등 산업전반으로 피해가 확산되므로 천문학적인 손실을 초래한다.

천연물은 인공을 가하지 않은 자연 그대로의 것을 의미하는데, GRAS (Generally Recognized As Safe)로 분류된 천연물들은 사용량이나 대상 식품을 규제받지 않고 국내에서는 천연첨가물로 분류되어 식품첨가물로도 사용된다. 외국에서는 특별한 제한없이 사용자의 뜻에 따라 자유롭게 이용할 수 있는 물질로 기능성이 탁월하여 건강식품과 의약품으로도 이용되고 있다.

한편, 오리나무(Alnus japonica)는 쌍떡잎식물 너도밤나무목 자작나무과의 낙엽교목으로, 흔히 오리목이라고 부른다. 한국 · 일본 · 중국 등에 분포하고, 습지 근처에서 자라며, 그 높이가 20m에 달하고, 나무껍질은 자갈색이며, 겨울눈은 달걀을 거꾸로 세운 모양의 긴 타원형으로 3개의 능선이 있고 자루가 있다. 잎은 어긋나고 타원형 · 바소꼴의 달걀 모양 또는 바소꼴이며 양면에 광택이 있고 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 3~4월에 피고 단성이며 미상꽃차례에 달린다. 수꽃은 수꽃이삭에 달리며 각 포에 3~4개씩 들어 있고 화피갈래조각과 수술은 4개씩이다. 과수(果穗)는 10월에 성숙되며 2~6개씩 달리고 긴 달걀 모양이며 솔방울같이 보인다.

오리나무 추출물과 관련된 종래 특허로는, 오리나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물(한국특허공개 제2003-0074500호) 및 오리나무 추출물과 녹차엽 추출물을 이용한 숙취해소건강음료의 제조방법(한국특허공개 제2006-0023093호) 등이 있다.

현재, 전세계적으로 항바이러스제를 개발하기 위해 막대한 노력을 기울이고 있는데, 인간면역결핍바이러스-1과 B형 간염 치료에 라미부딘(lamibudine), 헤르페스바이러스 감염증 치료에 갠시클로비르(gancyclovir), 호흡기합포체바이러스 (respiratory syncytial virus) 및 감염증에 주로 쓰이나 위급시 다양한 바이러스감염증에 사용되는 리바비린(ribavirin) 등이 허가되어 시판되고 있으며, 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 저해물질로서 인공합성된 자나미비르(zanamivir, RelenzaR)와 오셀타미비르(oseltamivir, TAMIFLU™)도 허가되어 시판중에 있다. 그러나 A형 인플루엔자 바이러스 치료를 위해 허가된 아만타딘(amantadine)과 유사물질인 리만타딘(rimantadine)은 내성 바이러스 출현과 부작용으로 최근에 그 사용범위가 축소되었으며, 최근 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스 중에서 오셀타 미비르에 대한 내성을 보이는 바이러스도 출현하여 다양한 항바이러스제 개발이 시급하다.

본 발명자들은 대한민국 특허 제10-0721703호 및 제10-0769050호에서 오리 나무 메탄올 추출물의 항바이러스 활성을 확인한 바가 있다. 그러나, 상기 특허들에서는 오리나무 추출물을 고농도로 투여했을 경우에만 항바이러스 활성을 나타내는 단점으로 인하여 그 이용에 한계가 발생한다.

이에 본 발명자들은 정상세포에 대해 독성이 낮고, 저농도로 투여했을 경우에도 인플루엔자 바이러스의 증식억제 효능이 뛰어난 천연 물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 국내산 오리나무(Alnus japonica) 수피 또는 줄기를 30~80℃에서 80~100% 에탄올로 추출한 추출물이 탁월한 항-인플루엔자 바이러스 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은, 높은 항인플루엔자 바이러스 활성을 나타내는 오리나무(Alnus japonica) 수피 또는 줄기 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 오리나무 수피 또는 줄기추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 오리나무 수피 또는 줄기 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 국내산 오리나무의 수피 또는 줄기를 80~100% 에탄올로 30~80℃에서 추출하는 단계; 및 (b) 상기 추출액을 회수하는 단계를 포함하는 항인플루엔자 바이러스 활성을 나타내는 오리나무(Alnus japonica) 수피 또는 줄기 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 오리나무 수피 또는 줄기 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 함유하는 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 오리나무 수피 또는 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스 및 조류 인플루엔자 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 KBNP-0028(기탁번호 KCTC 10866BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 오리나무 수피 또는 줄기 추출물은 정상세포인 장요막 세포(chorioallantoic cells)에 대한 독성이 낮으면서도, 저농도로 투여했을 경우에도 항바이러스 효과가 탁월하므로, 이를 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 및 치료에 효과적이고 안전하여 식품 또는 약학 조성물 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 국내산 오리나무의 수피 또는 줄기를 80~100% 에탄올로 30~80℃에서 추출하는 단계; 및 (b) 상기 추출액을 회수하는 단계를 포함하는 항인플루엔자 바이러스 활성을 나타내는 오리나무(Alnus japonica) 수피 또는 줄기 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 오리나무 수피 또는 줄기를 분말화한 후, 에탄올 또는 물을 가하여 열수추출, 냉침추출, 환류냉각추출 또는 초음파추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한 다음, 원심분리하여 오리나무 수피 또는 줄기 추출물을 수득하였다.

본 발명에서는 조류 인플루엔자 바이러스로 감염된 SPF 발육란에 오리나무 수피 또는 줄기 추출물 함유 조성물을 첨가하여 배양한 후, 평판 혈구응집 검사를 실시한 결과, 오리나무 수피 또는 줄기 추출물 함유 조성물이 낮은 투여농도에서도 우수한 항인플루엔자 바이러스 효과를 가진다는 것을 확인하였다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조된 오리나무 수피 또는 줄기 추출물을 유효 성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스 및 조류 인플루엔자 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 KBNP-0028(기탁번호 KCTC 10866BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 오리나무 수피 또는 줄기 추출물은 천연물질이므로 독성이 전혀 없어서 의약품으로 지속적으로 다량 사용할 수 있다.

본 발명의 오리나무 수피 또는 줄기 추출물을 포함하는 조성물은 이미 사용 되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 내지 200mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조된 오리나무 수피 또는 줄기 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 함유하는 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스 및 조류 인플루엔자 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 KBNP-0028(기탁번호 KCTC 10866BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강기능성식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.

본 발명에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명의 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '기능성 식품'이라 정의한다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.01~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 오리나무 추출물의 제조

1-1 : 추출용매 및 온도별 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 국내산 오리나무의 수피를 상온에서 24시간 동안 건조시키고 세절 및 파쇄하였다. 상기 세절 및 파쇄시킨 오리나무 절편 1kg에 95% 에탄올 10ℓ를 가하고, 각 40℃, 60℃ 및 80℃ 에서 8 시간 동안 환류추출하거나, 물 10ℓ를 가하고, 100℃에서 4 시간 동안 환류추출한 다음, 진공여과한 후, 상층액을 회수하여 오리나무의 유용성분을 용출하였다. 상기 용출된 성분을 진공에서 24시간 건조시켜, 오리나무 분말 100g을 얻었다. 이를 99.9%의 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 20mg/㎖이 되도록 용해하여 하기 실험에 사용하였다.

비교실험을 위해 대한민국 특허 제10-0721703호 및 제10-0769050호(오리나무 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물)의 실시예 1의 제조방법에 따라 제조된 오리나무 수피 추출물을 대조군으로 하여 실험하였다.

1-2 : 오리나무 원료별 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 국내산 오리나무의 수피, 줄기 및 중국 연변시장에서 구입한 중국산 오리나무의 수피를 상온에서 24시간 동안 건조시키고, 세절 및 파쇄하였다. 상기에서 세절 및 파쇄시킨 오리나무 절편 1kg에 각 80%, 95% 에탄올 10ℓ를 가하고, 40℃에서 환류추출한 다음, 진공여과한 후, 상층액을 회수하여 진공의 유용성분을 용출하였다. 상기 용출된 성분을 진공에서 24시간 건조시켜 100g의 오리나무 분말을 수득하였고, 이를 99.9%의 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 20mg/㎖이 되도록 용해하여 하기 실험에 사용하였다.

실시예 2: 오리나무 추출물의 항바이러스 효과 검사

2-1 : KBNP-0028의 제조

실험에 사용한 조류 인플루엔자 바이러스는 2000년 국내에서 분리된 A/chicken/Korea/SNU0028/2000(H9N2) 바이러스를 계태아에서 계대하여 클로닝한 증식성이 탁월한 KBNP-0028(특허출원번호 2006-0026591)을 사용하였다.

즉, SNU0028[A/chicken/Korea/SNU0028/00(H9N2); 국립수의과학검역원 분리 신고, 2005년 5월 9일]은 폐사 및 산란저하를 보이는 육용종계로부터 분리된 H9N2 아형의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스로, 상기 바이러스는 2000년 1월 28일 전라북도에 소재한 육용종계 농장에서 분리하였다. 그 분리 방법은, 감염계의 신장과 기관시료를 유제하여 인산완충용액에 부유하여 직경 0.45㎛의 여과지에 여과한 다음, 각 시료를 SPF 발육란(Sunrise Co., NY) 3개의 요막강(allantoic cavity)에 접종한 후, 37℃에 배양한 다음, 요막액(allantoic fluid)을 수확하였고, 상기 요막액 20㎕와 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)을 부화시킨 닭에서 추출한 0.1% 닭 적혈구 20㎕를 유리 평판에 점적 후, 혼합하여 평판혈구응집검사를 실시하였다.

그 결과, 신장과 기관 시료를 접종하여 얻은 요막액 모두 혈구응집괴를 형성하였고, H9N2 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR 및 염기서열 분석으로 바이러스를 동정(김민철, 2002 서울대학교 대학원 석사학위논문)하여 -70℃에서 보존하였으며, 이 중 기관 시료에서 분리된 바이러스를 실험에 사용하였다.

발육란 고생산성 백신주를 선발하기 위하여, 상기 분리된 SNU0028을 0.05 ~0.5 HAU/㎖ 농도로 인산완충용액으로 희석하여 200㎕의 양으로 10~11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하여 3일간 37℃에 배양하였다. 매일 오전과 오후에 검란을 통해 3일 전에 폐사한 발육란은 폐기하였다. 3일 동안 생존한 발육란은 4℃에서 12~24시간 보관한 다음, 요막액을 수확하여 각각에 대해 그 부피와 혈구응집역가를 측정하였으며, 양이 가장 많고 혈구응집역가가 높은 요막액을 동일한 방법으로 발육란에 접종하여 19대 계대하여 혈구응집역가가 높고, 요막액 수확량이 높아 생산성이 증가된 것을 분리하여 KBNP-0028라고 명명하고, 이를 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치하는 유전자 은행에 2005년 10월 26일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 10866BP).

2-2 : 종란 소편 배양

10~11일령의 SPF 종란(Sunrise Co., NY)의 난각을 70% 에탄올로 세척한 다음, 계태아와 모든 체액을 제거하였다. 난각의 내면에 부착된 융모 요막이 떨어지지 않도록 가로 약 8mm 세로 약 8mm의 크기로 잘라 24-웰 배양용기에 1개씩 넣었다. 배양 배지는 199 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)와 F10 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)를 1:1로 혼합한 다음, 소디움 바이카보네이트 0.075% 및 겐타마이신(gentamicin) 100㎍/㎖를 첨가하여 제조하였다.

상기 10~11일령의 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)에 상기 실시예 2-1에서 제조된 KBNP-0028 요막액 원액을 4~10배 희석하여 종란 소편의 융모 요막 면에 100㎕를 첨가한 후, 37℃에서 30분간 배양하여 바이러스를 감염시켰고, 상기 배양배지 1,000㎕를 첨가한 후, 상기 실시예 1-1 및 1-2의 오리나무 추출물을 농도별로 각 6개 웰에 첨가하였다. 상기 각각 농도의 오리나무 추출물이 첨가된 바이러스 감염액을 37℃에서 7일간 배양하였다.

2-3 : 항바이러스 효과 검사

상기 실시예 2-2의 37℃에서 7일간 배양한 각각의 농도의 오리나무 추출물이 첨가된 바이러스 감염액의 배양액을 채취하여 평판 혈구응집 검사를 실시하였다. 배양액 25㎕와 세척 닭 적혈구 (0.1%) 25㎕를 유리판 위에 동량 첨가하여 고르게 섞고, 유리판을 상하좌우로 움직여 2분 이내 혈구 응집괴의 형성유무로 바이러스의 증식유무를 확인하였다.

대조군		추출원료 및 용매	오리나무 추출액(㎍/㎖)
바이러스	무바이러스		400	200	100	50
6/6	0/6	80℃, 95% 에탄올	0/6	0/6	2/6	5/6
		60℃, 95% 에탄올	0/6	0/6	2/6	5/6
		40℃, 95% 에탄올	0/6	0/6	1/6	3/6
		100℃, 물	1/6	4/6	6/6	6/6
		99.9% 메탄올	0/6	2/6	6/6	-

그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군인 100℃ 물 추출물의 경우에는 400㎍/㎖ 농도에서는 6개의 실험군 중 1개의 혈구 응집괴가 형성되어 부분적인 항바이러스 효과를 보였으나, 100㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 농도에서는 6개의 실험군 중 6개 모두에 혈구 응집괴가 형성되어 바이러스 증식을 억제하지 못함을 알 수 있었다.

한편, 80℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물의 경우, 6개의 실험군 중 혈구 응집괴가 형성되는 것이 없어 200㎍/㎖ 농도까지는 완벽하게 바이러스의 증식을 억제하였고, 100㎍/㎖ 농도에서는 6개의 실험군 중 2개의 혈구 응집괴가 형성되어 부분적인 항바이러스 효과를 보였으며, 50㎍/㎖ 농도에서는 6개의 실험군 중 5개의 혈구 응집괴가 형성되어 항바이러스 효과가 미미함을 알 수 있었다. 60℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물의 경우, 80℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물의 경우와 동일한 실험값을 나타내었음을 확인하였다. 40℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물의 경우, 200㎍/㎖ 농도까지는 80℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물 및 60℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물의 경우와 동일한 실험값으로 6개의 실험군 중 혈구 응집괴가 형성되는 것이 없어 바이러스의 증식을 완벽하게 억제함을 확인하였고, 100㎍/㎖ 농도에서는 6개의 실험군 중 1개의 혈구 응집괴가 형성되었으며, 50㎍/㎖ 농도에서는 6개의 실험군 중 3개의 혈구 응집괴가 형성되어 낮은 농도에서도 높은 항바이러스 효과를 나타냄을 확인하였다.

100㎍/㎖의 농도를 기준으로 보았을 때, 용매별 항바이러스 활성은 40℃, 95% 에탄올 추출물 > 80℃, 95% 에탄올 추출물 및 60℃, 95% 에탄올 추출물 > 100℃, 물 추출물의 순으로 나타났다.

따라서, 항바이러스 조성물을 위한 오리나무 추출물로는 40℃에서 추출한 95% 에탄올 추출물이 가장 적합한 것으로 판단되었다.

바이러스 증식 억제효과가 가장 뛰어난 추출온도인 40℃에서 오리나무의 원료 및 추출용매에 따른 항바이러스 효과를 비교하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

대조군		추출원료 및 용매	오리나무 추출액(㎍/㎖)
바이러스	무바이러스		100	50	25	12.5
6/6	0/6	국내산 수피 80% 에탄올 추출물	2/6	4/6	6/6	6/6
		국내산 수피 95% 에탄올 추출물	1/6	3/6	4/6	5/6
		국내산 줄기 80% 에탄올 추출물	3/6	5/6	6/6	6/6
		국내산 줄기 95% 에탄올 추출물	1/6	3/6	6/6	6/6
		중국산 수피 80% 에탄올 추출물	1/6	4/6	6/6	6/6
		중국산 수피 95% 에탄올 추출물	1/6	5/6	6/6	6/6

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 오리나무의 부위별 항바이러스 활성으로는 국내산 수피 80% 에탄올 추출물 및 95% 에탄올 추출물이 국내산 오리나무 줄기 80% 에탄올 추출물 및 95% 에탄올 추출물보다 우수한 것으로 나타나 항바이러스 조성물을 위한 오리나무 추출물의 부위로는 수피가 적절함을 알 수 있었다.

원산지별로 비교하면, 수피 80% 에탄올 추출물의 경우, 중국산과 국내산의 활성이 유사한 것으로 나타났고, 수피 95% 에탄올 추출물의 경우, 국내산이 중국산보다 우수한 것으로 나타났으며, 국내산 수피 추출물의 추출용매별 활성을 비교하면, 80% 에탄올 추출물보다 95% 에탄올 추출물의 활성이 뛰어난 것으로 나타났다.

상기와 같은 실험값들을 종합적으로 미루어 보았을 때, 40℃에서 추출한 국내산 수피 95% 에탄올 추출물이 가장 우수한 항바이러스 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

본 발명의 오리나무 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

오리나무 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

오리나무 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

오리나무 추출물 20 mg

결정성 셀룰로오스 13.3 mg

락토오스 65.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.9 mg

통상의 캡슐제 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

오리나무 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2,974 mg

Na₂HPO₄ · 12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조 방법에 따라 1 앰플당(3㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5: 액제의 제조

오리나무 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조 방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색 병에 충전하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 다음의 단계를 포함하는 항인플루엔자 바이러스 활성을 나타내는 오리나무(Alnus japonica) 수피 추출물의 제조방법:

   (a) 오리나무의 수피를 약 95% 에탄올로 약 40℃에서 추출하는 단계; 및

   (b) 상기 추출액을 동일온도에서 진공농축 및 건조하여 회수하는 단계.
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