KR20160090495A

KR20160090495A - 항 인플루엔자 바이러스제

Info

Publication number: KR20160090495A
Application number: KR1020150010337A
Authority: KR
Inventors: 류형준
Original assignee: 류형준
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2016-08-01

Abstract

본 발명은 마누카꿀, 프로폴리스 및 자일리톨를 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제에 관한 것으로, 드링크제, 감기치료차, 비염스프레이, 감기예방비누, 감기예방세제 등에 적용될 수 있다.

Description

항 인플루엔자 바이러스제{ANTI-INFLUENZA VIRAL AGENT}

본 발명은 항 인플루엔자 바이러스제에 관한 것으로, 더 상세하게는 마누카꿀, 프로폴리스 및 자일리톨를 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스(influenza virus)는 오르토믹소비리대 과(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 호흡기에 염증을 유발시키며, 감염자의 기침 및 타액으로 공기중으로 직접 전달되거나 독감 환자의 접촉물 등에 의해 간접적으로도 타인에게 전염될 수 있는 전염력이 강한 바이러스이며, 바이러스의 혈청형은 A형, B형 및 C형으로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 인간에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 인간, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA)과 뉴라미니다제(Neuraminidase: NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류(HA형 16종과 NA형 9종)로 분류할 수 있다. HA 단백질은 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA 단백질은 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다. 근래, 세계적으로 유행하고 있는 신종 인플루엔자는 인체 인플루엔자A형으로서, 서브타입은 HA(hemagglutinin) 단백질이 1형(H1)이고 NA(neuraminidase) 단백질이 1형(N1)인

Influenza A(H1N1) 바이러스이다.

A형 인플루엔자 바이러스 치료제로, 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 저해 물질로서 인공합성된 자나미비르(zanamivir, 상표명 :레렌자(Relenza))와 오셀타미비르(oseltamivir, 상표명 : 타미플루(TAMIFLU))가 알려져 있다. 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 16종의 모든 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스와 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에도 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다. 따라서, 드링크(drink), 차(茶), 스프레이, 비누, 세제, 사료첨가제 등 형태로 사용할 수 있는 항 인플루엔자 바이러스제 개발이 다양하게 이루어지고 있다.

천연 물질 유래 항 인플루엔자 바이러스제의 예로, 한국등록특허 제10-1118230호에는 바나바, 산국 및 오레가노 중에서 하나 이상 선택되는 식물 추출물을 포함하는 항-인플루엔자바이러스 활성을 가지는 식물 추출물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1426888호에는 인삼 또는 홍삼 추출물, 사포닌 또는 산성다당체를 유효성분으로 포함하는 조류독감 바이러스 증식 억제 및 항-조류독감 바이러스 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0923884호에는 오리나무(Alnus japonica) 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1035463호에는 흑삼 뿌리로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1322851호에는 인동등, 황금, 생지황, 갈근, 감초 및 마늘의 혼합 추출물을 포함하는 조류독감 바이러스의 증식 억제용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1139376호에는 오렌지(Citrus spp.), 캣츠클로(Uncaria tomentosa), 베이베리(Myrica cerifera), 루타(Ruta graveolens), 에버라스팅(Helichrysum italicum), 린덴(Tilia cordata), 올스파이스(Pimenta officinalis), 카카오(Theobroma cacao), 모과(Chaenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 식물 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0104652호에는 딱지꽃 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1443510호에는 치커리(Cichorium intybus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1310033호에는 여우오줌풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0093975호에는 울금(Turmeric) 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1376231호에는 새싹보리 추출물을 유효성분으로하는 인플루엔자 바이러스의 예방 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0141178호에는 대파 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0115576호에는 왕호장의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0143115호에는 자일리톨과, 인삼 또는 홍삼 물 투석층, 인삼 또는 홍삼 전체 추출물, 인삼 또는 홍삼 다당체 및 인삼 또는 홍삼 사포닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2 이상을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 건강식품 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1334143호에는 폴리갈라 카렌시움(Polygala karensium) 추출물 및 이로부터 분리된 잔톤계 화합물을 함유하는 감기, 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 신종플루의 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0950445호에는 감초(Glycyrrhiza uralensis) 유래의 뉴라미니데이즈 효소(neuraminidase)를 저해하는 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 예방과 치료에 사용하는 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1177182호에는 약쑥 95%주정 추출물이 함유된 신종플루 바이러스와 조류인플루엔자 바이러스 불활화능제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1021830호에는 크레이스토카릭스 오페르쿠라투스의 유기용매 추출액 유래의 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1317318호에는 오배자(Galla Rhois)의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 억제 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0132407에는 판람근(Radix isatidis)으로부터 제조된 추출물 및 금은화(Flos Lonicerae)로부터 제조된 추출물을 포함하는인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 식물 추출물 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0295395호에는 나복자, 천련자, 금은화, 작약 및 천궁의 추출물을 포함하여 이루어지는 감기 예방 및 치료용 항바이러스성 약제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0295389호에는 모과, 덜 익은 유자 생강 및 후박의 추출물을 포함하는 항바이러스성약제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2003-0027133에는 블랙엘더베리 추출물을 주원료로하는 인풀루엔자 바이러스 감염 예방 약제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1165592호에는 라즈베리(Rubus idaeus), 스트로베리(Fragaria vesca), 블랙베리(Rubus fruticosus), 무화과(Ficus carica), 명아주(Chenopodium album), 아그리모니(Agrimonia eupatoria), 유칼립투스(Eucalyptus globulus), 복숭아(Prunus persica), 사과(Malus pumila), 바이올렛(Viola odorata), 쿠로모지(Lindera umbellata), 과라나(Paullinia cupana), 밀몽화(Buddleia officinalis), 닭의장풀(Commelina communis), 냉이(Capsella bursa-pastoris), 연명초(Rabdosia japonica), 와일드 스트로베리(Fragaria vesca), 허하운드(Marrubium vulgare), 마쉬말로우(Althaea officinalis), 질경이(Plantago asiatica), 레몬버베나(Aloysia triphylla), 서양톱풀(Achillea millefolium), 빙도의(Cetraria islandica), 산수국(Gynostemma pentaphyllum), 머위(Petasites japonicus)의 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1086811호에는 어성초, 오가피, 방풍 또는 시호의 추출물 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 추출물로 이루어지는 항 인플루엔자 바이러스 효과가 있는 천연 추출물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1011454호에는 고삼(Sophora flavescens) 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 테로카판계 화합물 및 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2010-0052656호는 조류인플렌자 바이러스 A/H5N1에 대한 뛰어난 항바이러스 활성물질로, 민족도리풀(Asarum sieboldii) 뿌리의 메탄올추출을 여과후 증류수에 현탁한 후 Chloroform으로 분리한 분획물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1203484호에는 한국산 겨우살이를 포함하는 조류독감 억제용 약학조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 사료에 있어서, 한국산 겨우살이를 포함하는 조류독감 억제용 약학조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제101115063호에는 초두구 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0041936호에는 붉나무 유래 화합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-1087759호에는 꾸지뽕나무 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성의 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1195120호에는 선복화 추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 감염 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제101189823호에는 폴리페놀성 화합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0055852호에는 플라보노이드를 유효성분으로 포함하는 바이러스 치료 또는 예방용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1135946호에는 연교추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 바이러스 감염예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1160743에는 음수투여제 또는 사료첨가제의 형태로 녹차를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자에 대한 항바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0040629호에는 은행 추출물을 포함하는 신종인플루엔자 Ａ（Ｈ１Ｎ１） 바이러스 감염의 예방용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제101373219에는 관동화 꽃, 행인 종자, 황기 뿌리 패장 식물체의 메탄올 추출 후 그 분획물로 된 인플루엔자 바이러스 H1N1에 대하여 항바이러스 활성을 가지는 약용 식물 추출물을 기재하고 있고 있고, 한국공개특허 제10-2012-0026851호에는 드리나리아속 식물 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0110381에는 흑인삼꽃봉오리 건조분말 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1164515에는 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향을 포함하는 생약을 유기용매로 추출한 생약 추출물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0030360호에는 홍삼을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 의사 증상과 상기도 감염 증상의 예방 및 개선을 위한 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1387353호에는 아이비엽 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1369100호에는 아이비엽 및 황련으로 구성된 복합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있다.

이들 항 인플루엔자 바이러스제들은 그 안전성이나 약효가 일부 검증되기도 하였지만, 인플루엔자 바이러스의 효과적인 예방 및 치료를 위하여 더 많은 천연물 유래 항 인플루엔자 바이러스제의 개발이 필요한 실정이다. 이에, 본 발명자는, 피부 보습 효과, 피부 진정 효과 및 항균 효과 등이 있는 것으로 알려져 있는 마누카꿀에, 프로폴리스와 자일로톨을 혼합하여 용매 추출할 때, 마누카꿀을 단독으로 사용할 때보다 항균력이 현저하게 커지고, 특히 인플루엔자 바이러스로 인한 질병 증상의 예방 또는 치료에 뛰어난 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 전문의약품이 아닌 인플루엔자 바이러스의 억제 및 치료에 효과 있는 천연물 복합제를 개발하는 데 있다.

본 발명은 상술한 과제 해결 수단으로, 마누카꿀, 프로폴리스 및 자일리톨의 혼합물에서 추출한 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제를 제공한다.

혼합물의 바람직한 조성 중량비는, 마누카 꿀 1~90%, 프로폴리스 1~90%, 자일리톨 1~90%이다.

혼합물로부터 추출물을 추출하는 바람직한 방법은, 물, 10~50% 에탄올 또는 95% 에탄올을 용매로 사용하는 용매 추출법이다.

물을 용매로 사용할 경우, 상기 혼합물과 물의 비율을 혼합물:물=1:10~30의 중량비율로 섞어서 압력추출기에서 100-120℃ 온도로 3-12시간 동안 추출하여 사용한다.

10~50% 에탄올을 용매로 사용할 경우, 상기 혼합물과 10-50%에탄올의 비율을 혼합물:10-50%에탄올=1:10~30의 중량비율로 섞어서 압력추출기에서 100~120℃ 온도로 3~12시간 동안 추출한다. 이후 에탄올의 성분을 제거하기 위하여 에탄올을 증발시키고 남은 여액을 사용한다.

95% 에탄올을 용매로 사용할 경우, 상기 혼합물과 95%에탄올의 비율을 혼합물:95%에탄올=1:10~30의 중량비율로 섞어서 상온에서 30~90일간 동안 추출하여 사용한다.

본 발명에 의하면, 감기로 인한 질병의 악화를 예방하거나 치료가 가능하다는 점을인 비트로(in vitro) 실험 및 동물 실험을 통해 확인하였다. 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제는, 세포 표면에 인플루엔자 바이러스에 대한 receptor를 가지는 MDCK cell에 본 발명을 상온에서 1시간 반응시킨 인플루엔자 바이러스를 infection시킨 후 plaque의 개수를 조사하여 인플루엔자 바이러스(H1N1)에 대한 억제능 테스트를 하는 plaque assay에서, 대조군(본 발명을 반응시키지 않은 군)에 비하여 plaque형성을 농도에 따라 97% ~ 66%까지 저해하는 것을 확인하였고, 인플루엔자 바이러스 표면 단백질인 HA(Hemagglutinin)와 결합할 수 있는 적혈구를 표적 세포로하여 본 발명이 인플루엔자 바이러스와 적혈구 간의 반응을 억제할 수 있는지를 알아보는 적혈구응집방해분석에서, 본 발명을 고 농도로 적용할 경우 인플루엔자 바이러스와 적혈구의 부착을 방해하는 것을 확인하였다. 또한, 마우스의 체중 변화율 테스트를 한 결과, 본 발명을 투입한 마우스는 바이러스 감염 후 본 발명을 투입하지 않은 마우스보다 더 빨리 체중 증가를 시작하여 더 빠른 속도로 원래의 체중에 근접하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제가 인플루엔자 바이러스 감염 후 증상의 완화 및 감염 기간의 단축 효과를 가짐을 알 수 있다.

본 발명은 드링크제, 감기치료차, 비염스프레이, 감기예방비누, 감기예방세제 등에 적용될 수 있다. 천연물 복합제인 경우 감기바이러스에 효과가 있을 시 여러 유사한 바이러스에 효과가 있는 것이 일반적이며, 이는 계속적인 실험을 통해서 밝혀낼 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제는 향후 개홍역치료차, 구제역치료용 사료혼합제, 조류독감차 등에도 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제를 농도를 달리하면서 인플루엔자 바이러스(N1N1)와 혼합하여 MDCK 셀에 투여할 경우 발생하는 Plaque 수를, 인플루엔자 바이러스만 투여한 경우 발생하는 Plaque 수와 대조하여, Plaque 발생 비율을 나타낸 도표이다.
도 2는 적혈구응집방해분석(Hemagglutination Inhibition Assay)시 인플루엔자 바이러스가 적혈구와 반응하거나, 반응이 억제되었을 때, 적혈구 침전 여부를 보여주는 도면이다.
도 3은 도 1은 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제를 농도를 달리하면서 인플루엔자 바이러스(N1N1)와 혼합하여 적혈구에 반응시키면서 적혈구 침전상태를 분석한 적혈구응집방해분석(Hemagglutination Inhibition Assay) 결과표이다.
도 4는 인플루엔자 바이러스에 감염된 타미플루 투여군, 본 발명 투여군 및 D/W 투여군의 체중 변화율 도표이다.

본 발명은 마누카꿀, 프로폴리스 및 자일리톨의 혼합물에서 추출한 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제를 제공한다.

꿀은 수천년 동안 음식으로 사용되었을 뿐만 아니라 의료용, 주로 항박테리아제로서 사용되어 왔다. 항박테리아 활성 물질의 주원인은 효소 글루코스 산화제에 의해 꿀 안에 생성된 과산화수소에 기인한다. 꿀은 명확한 항박테리아 효능이 있지만, 꿀의 항박테리아 효능은 실질적으로 꿀의 타입에 따라 변화한다. 꿀에 존재하는 화합물들의 대부분은 카르보하이드레이트, 효소, 방향족 산, 탄화수소, 직쇄 일가 및 이가 염기 산 및 물의 군에 포함된다. 꿀은 주로 당 글루코스(sugar glucose), 프럭토오스(fructose), 수크로오스(sucrose) 및 말토오스(maltose)로 구성되며, 다른 많은 올리고당(oligosaccharide)들을 더 포함한다. 벌에 의해 꿀에 첨가된 다른 물질은, 프로린(proline)이 가장 풍부하고 카탈라아제(catalase)가 미량 함유된 아미노산이다. 이러한 효소 카탈라아제는 과산화수소를 물과 산소로 분해한다. 옥탄데디오(octandedioic), 노난디오(nonanedioic), 데칸디오(decanedioic), 및 트랜스-2-데센디오(decenedioic)를 포함하는 이염기산(diacid)들도 꿀에 존재하는 것으로 보고되었다.

마누카 나무, 즉 렙토스퍼뭄 스코파리움(Leptospermum scoparium)는 뉴질랜드가 원산지이고, 신장이 6-8 m, 직경이 7-10 cm일 때까지 성장할 수 있으며, 이것은 지름이 10-12 mm인 꽃들을 가지며, 이들 꽃은 매우 강한 향기를 가지는 꿀을 생산하는 데 이를 마누카 꿀이라고 한다. 마누카 꿀은 건조한 피부에 보습효과를 줄 뿐만 아니라, 손상된 피부 진정과 헬리코박타균 등에 대한 항균 작용 등이 일반 꿀보다 훨씬 뛰어나다.

마누카 꿀은 일반적인 꿀의 항박테리아 활성 물질 이외에도 추가적으로 다량의 항박테리아 활성 물질을 가지고 있다. 이러한 추가 활성 물질은 비 과산화물 활성 물질로 알려져 있으며, 특유 마누카 요소(UMF:Unique Manuka Factor)로 불리고 있다. 마누카 꿀에 많은 양이 들어있는 이러한 비 과산화물 활성 물질은 몰삼투압농도(osmolarity), pH 및 글루코스 산화제 활성만으로는 설명될 수 없는, 보다 높은 레벨의 항박테리아 활성을 가진다. 마누카 꿀의 비 과산화물 활성 물질(UMF)을 규명하기 위한 많은 연구들이 있었으며, 이러한 추가 활성 물질의 원인이 된 분절을 규명하기 위한 시도가 이루어졌지만, 오랬 동안 많은 연구에도 불구하고 마누카 꿀(UMF)의 비 과산화물 성분은 단리되거나 규명되지 못했다. 근래에는, 과산화수소는 꿀의 유의미한 유일한 항박테리아 물질이고, 과산화수소는 꿀 또는 이들의 분절 중의 글루코스 산화제에 의해 발생되며, 프로폴리스-유도된 페놀계와 같은 다른 물질들은 과산화수소에 비해 중요하지 않고, 꿀 중의 과산화수소 레벨은 본질적으로 꿀 중의 식물 유도성 카탈라제의 양에 의해 결정되며, 마누카 꿀에는 식물 유도성 카탈라제가 다른 꿀에 비해 많다는 연구결과가 있다. 그러나, 이러한 연구결과 또한, 특유 마누카 요소(UMF)의 존재 또는 부존재에 대해 충분한 설명이나 증거가 되지 못하고 있다.

다만, 많은 연구에 의하여, 이러한 마누카 꿀 추가 활성 물질(UMF)이 열 및 광에 안정된 점과, 유기 용매, 예를 들어 에탄올 및 에테르에 용해될 수 있는 점과, 높은 당 농도에서 항균 능력이 더욱 활성화된다는 점 정도가 확인되었다. 본 발명은 마누카 꿀에 대해 밝혀진 이러한 성질들을 이용하여, 직접적인 항바이러스 효과나 항바이러스 효과를 증진시키는 면역증강효과를 밝혀내고, 이를 통해 인플루엔자 바이러스의 억제 및 치료에 효과 있는 새로운 천연물 복합제를 추출한다.

본 발명은 마누카 꿀로부터 항 인플루엔자 바이러스 효과를 도출하기 위하여, 벌통에서 추출한 항박테리아제인 프로폴리스와 5탄당인 자일리톨을 이용한다.

프로폴리스는, 나무의 검 삼출물(gum exudate)로부터 벌에 의해 수집된 수지성 재료로 벌통에서 항박테리아제로 사용된다. 지금까지, 고초균, 포도상구균, 백선균, 대장균, 트리코모나스균, 살모넬라균 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 꿀벌은 벌집의 틈이 난 곳에 프로폴리스를 발라 병균이나 바이러스로부터 스스로를 보호하고, 말벌이나 쥐와 같은 적의 침입을 막는다. 특히 여왕벌이 산란할 때에는 일벌이 산란장소를 소독할 때 사용해 청결하게 한다. 프로폴리스(propolis)는 치환된 벤조산, 시나미산 및 플라보노이드를 포함한다. 플라보노이드가 프로폴리스 중에서 항박테리아 기능을 하는 주요 물질이다. 항박테리아 활성 물질에 대한 원인이 된 것으로 규명된 플라보노이드는 갈랑긴(galangin), 피노셈브린(pinocembrin), 카페산 및 페룰산을 포함한다. 프로폴리스의 주요한 효능으로는 항균작용, 항염증작용, 진통작용, 면역증강작용, 항암작용, 항산화작용 등이 있다. 항염 효과를 내는 것은 사람의 몸에 염증을 일으키는 프로스타그란딘을 만들어내는 효소를 절반까지 줄이기 때문이다. 또 주요 성분인 플라보노이드가 활성산소를 없애기 때문에 항산화 효과가 있다. 항암 효과를 나타내는 케르세틴 등이 있어 암세포의 유전자가 복제되기 전에 차단하는 일도 한다.

본 발명은 상기 효과로 보아 프로폴리스에 직접적인 항바이러스작용이 있거나 항바이러스효과를 증진시키는 면역증강효과가 있는 것으로 예상하여 혼합물에 추가하였다.

자일리톨은 자작나무과(Betulaceae)에 속한 낙엽교목자작나무(학명:Betula platyphylla var. japonica Hara, 자작나무), 만주자작나무(학명:Betula platyphylla Sukatschev, 만주자작나무) 등의 껍질과 수액으로부터 추출한 5탄당(C₅H₁₂O₅. 분자량 152.15)이다. 본 발명은 추출물의 당 밀도를 높이기 위해서 자일리톨을 사용한다.

한의학에서는 자작나무는 껍질과 수액이 약효가 있는 것으로 알려져 왔다. 자작나무 껍질은, 한의서에 백화피, 화피, 화수피 등으로 불리며, 해열(解熱), 이수(利水), 해독(解毒), 소종(消腫) 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 감기로 인한 기관지염, 폐렴과 간염, 황달, 신장염, 방광염 등의 치료에 사용되어 왔다. 감기로 인한 기관지염이나 폐렴, 간염에 효과가 있는 것으로 감기나 간염의 경우는 바이러스성 질환일 경우가 대부분이므로 자작나무 껍질 또는 수액 추출물은 직접적인 항바이러스효과가 있거나 항바이러스효과를 증진시키는 면역증강효과가 있는 것으로 예상되었다. 자일리톨은 자작나무의 껍질 또는 수액에서 추출한 5탄당(C₅H₁₂O₅)으로, 혼합물에 포함시킬 경우 마누카 꿀의 항 인플루엔자 바이러스 효과를 극대화할 것으로 예상하였다. 자일리톨은 세균이 좋아하는 6탄당(C₆H₁₂O₆)이 아닌 5탄당(C₅H₁₂O₅)이고, 마누카 꿀의 항바이러스 성질은 당의 밀도가 높을수록 강하게 발현되기 때문이다.

상기에 언급된 마누카꿀, 프로폴리스, 자일리톨 3종의 물질은 오래 전부터 세균을 포함한 병원성 미생물에 의한 전염병의 치료에 사용되었다. 대부분 항균작용과 면역력 강화작용은 입증되었다, 또한 그러한 작용 중에는 직접적인 항 인플루엔자 바이러스 효과가 있거나 항 인플루엔자 바이러스효과를 증진시키는 면역증강효과가 있는 것으로 예상되고 이러한 3종의 약재를 혼합한 복합물로 항바이러스 효과를 입증하였다.

<약효 실험>

<세포 내 실험-in vitro>

본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제가 인플루엔자 바이러스(H1N1)의 감염을 방해하는지 여부와 인플루엔자 바이러스가 표적 세포로 부착을 억제하는지 여부를 MDCK cell을 이용한 Plaque assay(용균반검사), Hemagglutination assay(혈구응집반응검사법)를 통해 알아보았다.

1. 시료의 준비

마누카 꿀 100g, 프로폴리스 10g, 자일리톨 600g의 혼합물을 만들고, 상기 혼합물과 50%에탄올의 비율을 혼합물:50%에탄올=1:20의 중량비율로 섞어서 압력추출기에서 120℃ 온도로 8시간 동안 추출하였다. 이후 에탄올의 성분을 제거하기 위하여 에탄올을 증발시키고 남은 여액을 시료로 얻었다. 이렇게 얻은 시료를 14,000rpm/10min/4℃ 원심분리 후 0.22㎛ filtration으로 여과하여 4℃에서 보관 중인 것을 사용하였다.

2. 인플루엔자 바이러스의 준비

Human influenza virus A/PR/8/34(H1N1)은 10일령의 유정란에 접종 후, 37℃에서 48시간 배양한 것을 harvest하여 사용하였다.

3. MDCK cell의 준비

MDCK cell은 MEM media에 10% heat-inactivated FBS를 첨가하여 culture하였다.

3. Plaque Assay( 용균반검사 )

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제와 반응한 인플루엔자 바이러스가 세포의 감염 및 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서, 약 100PFU/ml의 인플루엔자 바이러스와 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제를 여러 농도(1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120, 1/10240)로 하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후의 인플루엔자 바이러스를 MDCK cell에 상온에서 45분간 adsorption (330 ㎕/well)시켰으며 45분 후 이를 제거하고 overlay medium(DMEM + 1% agarsoe + 10 ㎍/ml trypsin)을 분주하였다. Plate를 37℃에서 2~3일 배양 후 1% crystal violet으로 staining하여 형성한 plaque 개수를 측정하였다. 대조군(control)은 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제와 반응시키지 않은 인플루엔자 바이러스를 MDCK cell에 adsorption시킨 것으로, 여기서 생긴 plaque와 실험군에서 생긴 plaque의 갯수를 비교함으로써 각 탕약의 virus inhibition 효능을 알아보았다.

도 1은, 이와 같이 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제를 농도를 달리하면서 인플루엔자 바이러스(N1N1)와 혼합하여 MDCK 셀에 투여할 경우 발생하는 Plaque 수를, 인플루엔자 바이러스만 투여한 경우 발생하는 Plaque 수와 대조하여, Plaque 발생 비율을 나타낸 도표이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 대조군(x축에서 0으로 표시된 최 좌측 막대-항 인플루엔자 바이러스제 처리를 안한 것)에 비하여 실험군(x축에서, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120, 1/10240)은 고농도(1/10 ~ 1/80)에서 Plaque 수가 50%이상 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제는 인플루엔자 바이러스의 감염에 매우 효과적인 억제력이 있을 것을 확인하였다.

4. Hemagglutination Inhibition Assay(적혈구응집방해분석)

도 2에 도시된 바와 같이, 일반적으로 인플루엔자 바이러스는 표면의 단백질인 Hemagglutinin에 의하여 적혈구와 결합하게 되어 적혈구 침전이 발생하지 않지만 인플루엔자 바이러스가 적혈구에 결합 되지 못하면 적혈구는 뭉쳐서 침전하게 된다.

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제가, 인플루엔자 바이러스의 표적 세포로의 부착을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제를 25㎕ PBS로 2-fold serial dilution(희석배수: 2¹, 2², 2³, 2⁴, 2⁵, 2⁶, 2⁷) 하고 4HAU(Hemagglutination unit)의 인플루엔자 바이러스를 동일한 양으로 혼합하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그리고 1% chick RBC(Red Blood Cell)을 50㎕/well로 분주하여 30분간 상온에 방치한 후 RBC의 침전을 관찰하였다.

도 3은 도 1은 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제를 농도를 희석배수 2¹, 2², 2³, 2⁴, 2⁵, 2⁶, 2⁷로 달리하면서 인플루엔자 바이러스(N1N1)와 혼합하여 적혈구에 반응시키면서 적혈구 침전상태를 분석한 적혈구응집방해분석(Hemagglutination Inhibition Assay) 결과표이다. 인플루엔자 바이러스 표면 단백질인 HA(Hemagglutinin)은 표적 세포와 결합을 유도하며 이는 감염의 시작을 야기하고 질병성에 큰 영향력을 미친다. HA와 결합할 수 있는 적혈구를 표적 세포로하여 각 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제들이 인플루엔자 바이러스와 적혈구 간의 반응을 억제할 수 있는지를 알아본 결과, 본 발명을 적절한 농도(실험예에서는 2⁵)로 적용할 경우 인플루엔자 바이러스와 적혈구의 부착을 방해함을 확인하였다. 이는 양인이 직접적으로 바이러스가 표적 세포에 부착하는 것을 방해할 수 있음을 의미하는 것이다.

<동물 실험-마우스의 체중 변화율 조사>

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제의 세포 내 실험을 통해 인플루엔자 바이러스에 임상적 효과가 있을 것으로 추정하고, 동물모델로 실험을 진행하여 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제의 인플루엔자 바이러스 A(H1N1)에 대한 과학적 데이터 확보하였다.

1. 시료의 준비

위 세포 내 실험에서 얻은 시료를 10배 농축시켜 보관 시료(10X stock)로 만들어 보관하다가 이를 다시 3배 농축시켜 사용하였다.

2. 인플루엔자 바이러스의 준비

Human influenza virus A/PR/8/34(H1N1)을 10일령의 유정란에 접종 후, 37℃에서 48시간 배양한 것을 harvest하여 인플루엔자 바이러스를 준비하였다.

3. 마우스의 준비

동물 모델은 balb/c 6주령 female mouse를 사용하였다. 약 2일간의 적응 기간을 두고 시료의 투여를 함으로써 실험을 시작하였다.

4. 마우스의 체중 변화율 조사

마우스에 인플루엔자 바이러스를 0.2LD₅₀의 농도로 감염시킨 후 각 그룹의 체중 변화를 조사하였다.

각 그룹당 5마리씩의 마우스에 virus challenge 1일 전부터 실험군에는 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제를, Positive control 그룹(Tamiflu 투여군)에는 타미플루를, Negatve control 그룹(대조군)에는 증류수(D/W)를 투여하기 시작했다. 실험군에는 시료로 보유중인 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제 10X stock을 3배 농축시키고 그것을 100㎕/1회 투여하였다. Positive control 그룹(Tamiflu 투여군)에는 시료 Tamiflu를 10mg/kg/day로 투여하였다. Negative control 그룹(대조군)에는 시료 D/W를 회당 100㎕씩 투여하였다. 투여는 virus challenge -1 Day부터 오전과 오후에 한번씩 1일 2회로 경구 투여 하였다.

Virus challenge는 마우스에 zoletil(마취제)을 복강에 주사하여 마취시킨 후 influenza virus를 0.2LD₅₀의 농도로 intranasal challenge(비강 감염) 하였다. Tamiflu 투여는 virus challenge 후 8일까지 투여하였으며, 증류수(D/W)와 본 발명의 시료는 실험 종료일까지 투여를 계속 하였다.

무게 측정은 매일 아침 9~10시경에 1회로 하였으며 virus challenge 후 14일까지 관찰 후 실험을 종료하였다. 매일 몸무게를 측정하여 바이러스 감염 전의 무게를 기준으로 체중 변화율을 측정하였다.

도 4는, virus challenge 하루 전부터 D/W, Tamiflu, 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제를 각각의 그룹에 경구 투여 하고, 마우스에 비강을 통하여 influenza virus A/PR/8/34를 감염시킴으로써 각 시료의 항 인프루엔자 바이러스 효과를 조사한 체중 변화율 도표이다. 수치는 그룹당 5마리의 평균±SEM을 나타낸다.

도 4에 도시된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 감염 후 Tamiflu 투여군을 실험군과 대조군은, challege 5일 후부터 체중이 감소하였으며, 10일 후부터 실험군을 시작으로 회복이 관찰 되었다. 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제를 섭취시킨 실험군은 대조군과 비교하였을 때 체중 감소율도 현저하게 적었고, 회복의 시간도 매우 빨랐다.

아래 표 1은 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(H1N1)에 감염된 실험군과 대조군이 체중의 차이가 현저하게 관찰되는 virus challenge 후 9일차부터의 체중 변화율을 비교한 수치 표이다. 수치는 mean±SEM을 의미한다.

	Day 9	Day 10	Day 11	Day 12	Day 13	Day 14
대조군	77.28±1.55	73.94±1.97	75.49±3.87	78.06±5.30	81.97±7.51	85.33±8.02
실험군	85.12±1.16	85.67±3.21	88.51±4.71	91.50±4.68	91.66±3.69	97.73±3.33

그 결과 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제를 투여할 경우 14일째에는 Tamiflu 투여군에 근접하게 됨을 알 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스제의 섭취는 인플루엔자 바이러스 감염 후 증상의 완화 및 감염 기간의 단축 효과 유의미할 정도로 보여 주었다.

Claims

마누카꿀, 프로폴리스 및 자일리톨의 혼합물에서 추출한 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제.