KR20200072834A - 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어류의 면역화 확인용 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크, IgM 프라이머 세트에 관한 것으로서, 상기 프라이머 세트를 이용하여 약독화된 백신으로 면역화된 강도다리의 면역 상태를 용이하게 확인함으로써 강도다리 양식장에서 강도다리의 건강 상태에 대한 관리 및 확인을 기존보다 효율적으로 수행할 수 있게 되었다.
Description
본 발명은 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트에 관한 것이다.
강도다리(starry flounder/diamond back, Platichthys stellatus)는 가자미목 가자미과의 바닷물고기로서 몸길이는 40cm 정도이고 둥근 마름모꼴이다. 눈은 보통 몸의 왼쪽에 있다. 등지느러미, 뒷지느러미, 꼬리지느러미에 여러 개의 흑색 띠가 있다. 눈 있는 쪽 색깔은 짙은 갈색, 눈 없는 쪽은 연한 노란색을 띤다. 다른 가자밋과 어류와 다르게 눈의 위치는 넙치와 같은 위치에 몰려 있다. 수심 150m 내외의 연안역 저층에 서식하며, 종종 하천에 출현하기도 한다. 소형 갑각류, 연체류, 갯지렁이류 등을 먹는다. 2-3월에 강어귀에 알을 낳는다. 우리나라 동해 북부에 출현한다. 일본 북부, 오호츠크 해, 베링 해, 캘리포니아 남부 등지에 분포한다. 회, 건어물, 찜, 구이 등으로 이용한다.
강도다리는 넙치보다는 질병에 강한 어종으로 알려져 있기는 하지만 주로 양식을 통해 기르기 때문에 질병관리에 있어서 다양한 방법이 적용되어야 할 필요가 있다. 그러나 항생제나 화학약품 등의 남용보다는 강도다리 어종 자체의 면역력을 증진시키는 것이 필요하며, 이러한 면역력 증진이 된 상태를 확인해야 할 필요성 또한 대두되고 있다.
이에 본 발명자들은 약독화된 미생물을 균주에 투입하고 이를 Mucin 18, mucin-2-like, IgM 유전자 발현을 통해 확인하는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트;
서열번호 3 및 4의 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및,
서열번호 5 및 6의 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트;
로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 면역화 확인용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 어류는 강도다리인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 어류의 면역화 확인 방법을 제공한다.
상기 어류의 면역화 확인 방법은, 바람직하게는,
(제1단계) 강도다리에 면역원을 투여하는 단계; (제2단계) 면역원이 투여된 강도다리와 면역원이 비투여된 강도다리의 장을 각각 채취하여 mRNA(messenger Ribonucleic acid)를 추출하고 cDNA(complementary Deoxyribonucleic acid)를 합성하는 단계; (제3단계) 상기 cDNA와 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및, (제4단계) 면역원이 투여된 강도다리와 면역원이 비투여된 강도다리의 유전자 발현량을 비교하는 단계;;를 통해 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 각각의 프라이머 서열은 하기와 같다.
서열번호 1 (Mucin 18의 프라이머 F) : CTACTCTTTCCTCTACCAC
서열번호 2 (Mucin 18의 프라이머 R) : GAGGTCTTGTTTTCCTGATC
서열번호 3 (Mucin-2-like의 프라이머 F) : CTACTGTACCTGCAAGAG
서열번호 4 (Mucin-2-like의 프라이머 R) : GGATCCTGATAGTTTTGGAG
서열번호 5 (IgM의 프라이머 F) : CTACTCTTTCCTCTACCAC
서열번호 6 (IgM의 프라이머 R) : GTAGGCAATGGATCTGAC
또한 각 프라이머가 증폭하는 유전자의 Genebank No.는 다음과 같다.
Mucin 18 : XM_020088244.1
Mucin 2 like : XM_023422491.1
IgM : AF228579.1
본 발명에서 강도다리의 시료는 강도다리의 조직 어느 것이든지 사용가능하며, 어류의 조직, 세포, 혈액 등이 사용가능하며, 상기 조직 중에서 바람직하게는 장 조직을 사용하는 것이 좋다.
본 발명에서 강도다리의 면역화에 사용될 수 있는 면역원으로는 강도다리의 면역 증진을 위해 사용될 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 사용가능하나, 바람직하게는 Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi 인 것이 좋다. 상기 면역원으로 사용된 균주는 더 바람직하게는 포르말린을 처리하여 약독화된 상태인 것이 더 좋다.
상기 PCR은 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse transcript polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 한다.
상기 PCR이 실시간 RT-PCR일 경우, 형광 표지 인자로서 SYBR green이 추가될 수 있다.
본 발명의 방법에서 RNA로부터 cDNA를 합성할 때, 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 PCR을 수행하기 위해, MgCl2, Tag DNA 폴리머라아제, dNTPs 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 어류의 면역화 확인용 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크, IgM 프라이머 세트에 관한 것으로서, 상기 프라이머 세트를 이용하여 약독화된 백신으로 면역화된 강도다리의 면역 상태를 용이하게 확인함으로써 강도다리 양식장에서 강도다리의 건강 상태에 대한 관리 및 확인을 기존보다 효율적으로 수행할 수 있게 되었다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 어류의 면역화>
본 발명에 사용한 강도다리는 주사백신을 둥근모양의 비즈를 형성하여 급이하였다.
알긴산 0.5%(v/v) 수용액과 FKC(Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi)(1×108 cfu/ml)의 생리식염수(0.9%[w/v] NaCl) 용액을 1:1의 중량비로 혼합한 다음, 호스를 통해 정량펌프 (제조사 Gilson, 모델 : M312)에 투입하였다. 그 다음, 염화칼슘 0.5M 용액에 적하하여 비즈를 구성하였다. 이후 수온 18℃에서 강도다리에 초기 일주일은 1회(1알) 투여, 이후 2달에 3회 먹여 어류의 면역화를 유도하였다.
강도다리는 각 실험구마다 10마리씩 사용하였으며, 면역화 정도는 비즈를 먹인 강도다리를 해부하여 장 조직을 채취한 뒤 조직 샘플에서의 각 유전자 발현량을 비교하였다. 본 실험에 사용한 균주는 Streptococcus parauberis는 제주의 넙치양식장에서 Vibrio harveyi는 경북지역 D 수산에서 직접 분리한 균주였고 각 형태와 유전학적 특성을 분석하여 균주의 동정이 완료된 것을 사용하였다. FKC는 각각의 생균의 농도를 1×108 cfu/ml로 맞춘 뒤 0.2%(w/v) formalin 용액을 48시간 처리한 후 고체 영양배지에 다시 그어 colony를 형성하지 않은 것을 확인하여 모두 사멸하였음을 확인하고 난 후 비즈에 사용하였다. 포르말린 처리까지의 균주는 액체 영양배지에 배양된 상태로 처리되었고, 포르말린 용액의 용매로는 PBS(Phosphate Buffered Saline)를 사용하였다.
<실시예 2. 조직 적출과 RNA 분리 및 정제>
강도다리의 장 면역마커 발현여부를 확인하기 위해 강도다리의 조직을 해부 한 뒤 장 조직을 적출하여 면역 부분이 많이 발현될 것이라 판단되는 뒷부분의 1/3지점을 잘라 사용하였다. 장 조직은 적출 즉시 안에 내용물을 빼고 1.5㎖ e-tube에 Ribosaver를 넣고 조직이 손상되지 않게 보관하였다.
RNA 분리는 Gene ALL(주) 회사의 Hybrid-R RNA 분리 kit를 사용하여 진행하였다.
이를 보다 자세히 설명하면, 1.5㎖ e-tube에 Ribo Ex 700㎕를 분주하고 마쇄 pestle를 이용하여 조직을 잘 갈아주었다. 후에 chloroform을 200㎕씩 넣고 상층액의 phenol 성분을 없애기 위해 충분히 vortexing 해 주었다. 원심분리기를 이용하여 (12000g에 4℃, 15분) 상층액을 딴 뒤 RB1 수용액을 상층액 만큼 넣어주고, 상층액과 RB1용액을 잘 섞어 준 뒤 Spin columm에 한방울씩 떨어트려 원심분리를 진행하였다(10000g에 20℃, 1분). 이후에 SW1 수용액과 RNW 수용액을 이용하여 워싱을 하고 free-water를 50㎕ 씩 천천히 넣어 원심분리(1000g, 20℃, 1분)를 통해 RNA를 분리하였다.
<실시예 3. cDNA 합성>
CycleScript RT premix(bioneer)를 사용하여 cDNA 합성을 하는 rtPCR을 진행하였다.premix에 free-water를 18㎕ 씩 넣고 실시예 2에서 얻은 RNA를 2㎕ 씩 넣는다. vortexing 과정을 거친 뒤 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성 조건은 다음 표 1과 같다.
| cDNA 합성조건 | |||
| Step | Temp.(℃) | Time(sec) | Cycle |
| 1 | 20℃ | 30초 | 12 |
| 2 | 45℃ | 4분 | |
| 3 | 55℃ | 30초 | |
| 4 | 95℃ | 5분 | 1 |
이와 같은 방법으로 얻은 cDNA를 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 사용하여 DNA 농도를 측정한 후 200㎍/㎖로 농도를 맞추고 -20℃ 냉동고에 보존하여 사용하였다.
<실시예 4. 프라이머 합성>
본 발명에 사용된 Mucin 18, Mucin-2-like, IgM의 프라이머는 oligo primer로 합성하여 사용하였으며, 각각의 유전자 별 primer 염기서열 및 조건은 표 2와 같고, 각 유전자의 Genebank No.는 다음과 같다.
IgM : AF228579.1
Mucin 18 : XM_020088244.1
Mucin 2 like : XM_023422491.1
| Oligo NAME | Scale | Purifiction | sequence(5' --> 3') | 증폭산물의 DNA size(b.p.) |
|
| 1 | Mucin 18 | 25 nmole | BioRP | F : CTACTCTTTCCTCTACCAC R : GAGGTCTTGTTTTCCTGATC |
182 |
| 2 | Mucin-2-like | 25 nmole | BioRP | F : CTACTGTACCTGCAAGAG R : GGATCCTGATAGTTTTGGAG |
248 |
| 3 | IgM | 25 nmole | BioRP | F : CTACTCTTTCCTCTACCAC R : GTAGGCAATGGATCTGAC |
232 |
| 4 | beta Actin | 25 nmole | BioRP | F : CGTGCTGTCTTCCCATCCA R :TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG |
200 |
<실시예 5. 유전자의 중합효소연쇄반응(PCR) 및 전기영동>
강도다리의 cDNA를 각각 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR 하였다. PCR premix는 바이오니아 회사의 PyroHotstart Taq PCR premix를 사용하였다. Total volume 은 20㎕로 D.W 16㎕, cDNA 2㎕(200㎍/㎕) 각각의 Primer를 1 ㎕(10 pmole/㎕) 씩 사용하였다.
IgM, Mucin 18 primer의 PCR 조건은 표 3과 같고, Mucin 2 like primer의 PCR 조건은 표 4와 같다.
| IgM과 Mucin 18의 PCR 조건 | |||
| Step | Temp.(℃) | Time(min:sec) | Cycle |
| Pre-denaturation | 95 | 15:00 | 1 |
| Denaturation | 95 | 00:30 | 35 |
| Annealing | 55 | 00:45 | |
| Extension | 72 | 0:30 | |
| Final elongation | 72 | 07:00 | 1 |
| Mucin 2 like의 PCR 조건 | |||
| Step | Temp.(℃) | Time(min:sec) | Cycle |
| Pre-denaturation | 95 | 15:00 | 1 |
| Denaturation | 95 | 00:30 | 35 |
| Annealing | 52 | 00:45 | |
| Extension | 72 | 0:30 | |
| Final elongation | 72 | 07:00 | 1 |
증폭된 DNA 는 2% agarose gel 에서 전기영동을 이용해 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 어류 장의 면역 상태는 각 유전자의 면역화 전/후의 PCR 결과물 사진에서의 band의 intensity를 측정하여 발현 전의 fold 값을 1.0으로 하여 상대값으로 나타내었다.
| 조건 | 면역화 후의 유전자 발현 정도값 (fold) | |||
| β-actin | IgM | Mucin 18 | Mucin 2 like | |
| Streptococcus 비즈 투여군 | 1.0 | 3.5 | 3.3 | 2.7 |
| Vibrio harveyi 비즈 투여군 | 1.0 | 3.5 | 3.2 | 2.5 |
<실시예 6. 증폭된 염기서열의 확인>
PCR 증폭을 해 얻은 산물을 재 확인차 바이오니아(주)에 염기서열분석 의뢰하였다. 분석된 염기서열을 대상으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information) blast 검색결과를 통하여 각각의 서열이 각 유전자와 100% 일치함을 확인하였다.
서열번호 7 : Mucin 18 F
TGGAGGCTGTTTATCCAGAAAGCCAGCAGGGGGCAATGGTGTGATCATTGCAGTCCTCATTATCTGCCTCCTGCTGCTCGCCATCTTGGGGGCTGTGCTCTACTTCCTCTACAAAAAGGGCAAAATCTGTGGCCGATCAGGAAAACAAGACCTC
서열번호 8 : Mucin 18 R
CACAAGGGTTGCCTTTTTGTAGAGGAGTAGAGCACAGCCCCCAAGATGGCGAGCAGCAGGAGGCAGATAATGAGGACTGCAATGATCACACCATTGCCCCCTGCTGGCTTTTTCTGGATATCTGTTGCTCCTTTAACTGTGGTAGAGGAAAGAGTAGA
서열번호 9 : Mucin 2 like F
CCTTCAGCAGACACAATGTCCAGGAACTTGTATCATCTACGGGAGTGGTCACTACTCTACATTTGATGAGCAAACATATGCCTTTCAAGGAGATTGTGCCTACATTGCTGTCAAGAACAAGTGTGGCAATAAAACTGTAGAGCACAACTTTGGAATTATCACAGAGAATGTACCGTGCGGATCTACAGGCACCACCTGCTCCAAAATATCAGGATCCCA
서열번호 10 : Mucin 2 like R
GGATTCGAAATCGCACGGTACATTCTCTGTGATAATTCCAAAGTTGTGCTCTACAGTTTTATTGCCACACTTGTTCTTGACAGCAATGTAGGCACAATCTCCTTGAAAGGCATATGTTTGCTCATCAAATGTAGAGTAGTGACCACTCCCGTAGATGATACAAGTTCCTGGACATTTTTTGTCTGTGCATTCCCACTTTCCACTCTTGCAGGTACAGTAGA
서열번호 11 : IgM F
GGGCATTCTGCTTGTTGATGATGATTGACAACAGACGATTTCAATACCACAAACCCAATTAAAAACCATGAATCCTACTCGGCTTATGGCCAGTTATCAATCAGCCTCGACCAGTGGAAAGAAGCTGGCTCGGTGTACAGCTGCGTGGTTTACCACCAATCTCTGGATTCCAATACAAGAGCCATTGTCAGATCCATTGCCTAC
서열번호 12 : IgM-R
GGGCTGATGTATCAGAGATTGGTGGTAACCACGCAGCTGTACACCGAGCCAGCTTCTTTCCACTGGTCGAGGCTGATTGATAACTGGCCATAAGCCGAGTAGGATTCATGGTTTTTAATTGGGTTTGTGGTATTGAAATCGTCTGTTGTCAATTCATCATCAACAAGCCAAGAAACGAAAACCTCTTCAGGGGAGAAGTCTTTCCA
<실시예 7. 강도다리의 면역화 상태 확인>
실시예 1에서 FKC(Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi) 비즈가 투여된 강도다리가 면역화된 상태임을 확인하기 위해 FKC 투여 강도다리와 비투여군 강도다리의 질병 상태 및 폐사율을 확인하였다.
먼저 FKC(Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi) 비즈를 각각 실시예 1과 같이 강도다리에 먹여 면역화를 유도하였다.
면역화 유도군과 비즈 비투여군 강도다리의 질병은 전염력이 있는 Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi를 0.1㎖(1×108 cfu/㎖)씩 강도다리에 먹여 유도하였다(Streptococcus parauberis균은 약독화된 FKC(Streptococcus parauberis)를 먹인 군에 투여하는 방법을 실시함).
| 조건 | 비즈 비투여군 (%) | 비즈 투여군 (%) |
| Streptococcus parauberis에 대한 질병 유도군 |
80% | 35% |
| Vibrio harveyi에 대한 질병 유도군 |
70% | 30% |
상기 표 7을 참고하면, 질병 유도 후 1개월 후의 폐사율이 비즈 투여군에서 현저하게 줄어들어 면역화가 잘 되었음을 확인할 수 있다.
FKC(Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi) 투여로 인해 폐사율이 현저하게 줄어들었고, 이를 통해 본 발명에서 확인되는 Mucin 18, Mucin 2 like, IgM 유전자가 면역화를 통해 발현이 증가되는 유전자임을 확인할 수 있다.
한편, 이와 같은 면역화 과정은 실시예 1과 실시예 7에서 사용한 Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi 외에 다른 방법으로 분리된 Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi 또는, 기탁기관에 기탁된 표준 균주인 Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi를 사용할 때도 거의 유사하게 나타났다.
<110> JUNWON GBI Co., Ltd.
<120> Primer set Mucin 18, Mucin 2 like and IgM for detecting
immunization of fish
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Platichthys stellatus
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tggaggctgt ttatccagaa agccagcagg gggcaatggt gtgatcattg cagtcctcat 60
tatctgcctc ctgctgctcg ccatcttggg ggctgtgctc tacttcctct acaaaaaggg 120
caaaatctgt ggccgatcag gaaaacaaga cctc 154
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<220>
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acctcttcag gggagaagtc tttcca 206
Claims (6)
- 서열번호 1 및 2의 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트;
서열번호 3 및 4의 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및
서열번호 5 및 6의 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트;
로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 면역화 확인용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 어류는 강도다리인 것을 특징으로 하는 어류의 면역화 확인용 프라이머 세트. - 제1항의 프라이머 세트를 이용한 어류의 면역화 확인 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 어류의 면역화 확인 방법은, (제1단계) 강도다리에 면역원을 투여하는 단계;
(제2단계) 면역원이 투여된 강도다리와 면역원이 비여투된 강도다리의 장을 각각 채취하여 mRNA(messenger Ribonucleic acid)를 추출하고 cDNA(complementary Deoxyribonucleic acid)를 합성하는 단계;
(제3단계) 상기 cDNA와 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및,
(제4단계) 면역원이 투여된 강도다리와 면역원이 비투여된 강도다리의 유전자 발현량을 비교하는 단계;
를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 어류의 면역화 확인 방법. - 제4항에 있어서,
상기 PCR은 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 RT-PCR(Reverse transcript polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 어류의 면역화 확인 방법. - 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 어류의 면역화 확인 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180160868A KR102271052B1 (ko) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180160868A KR102271052B1 (ko) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200072834A true KR20200072834A (ko) | 2020-06-23 |
| KR102271052B1 KR102271052B1 (ko) | 2021-06-30 |
Family
ID=71137752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180160868A KR102271052B1 (ko) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | 어류의 면역화 확인용 뮤신 18, 뮤신 2 라이크 및 IgM 프라이머 세트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102271052B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012505193A (ja) * | 2008-10-10 | 2012-03-01 | プロベルテ ファーマ，エス．エー． | 水産養殖用経口投与免疫賦活剤 |
| KR20160118506A (ko) * | 2015-04-02 | 2016-10-12 | 구을리주식회사 | 맨드라미추출물을 포함하는 어류 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 |
| KR101789182B1 (ko) | 2016-06-30 | 2017-10-23 | 부산대학교 산학협력단 | 어류의 세균 감염 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 어류의 세균 감염 진단 방법 |
| KR20180106570A (ko) | 2017-03-21 | 2018-10-01 | 주식회사 코미팜 | 신규 스트렙토코커스 파라우베리스 균주의 방어 혈청형을 포함하는 강도다리 세균성 질병 예방용 불활성화 백신의 제조방법 및 투여방법 |
-
2018
- 2018-12-13 KR KR1020180160868A patent/KR102271052B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012505193A (ja) * | 2008-10-10 | 2012-03-01 | プロベルテ ファーマ，エス．エー． | 水産養殖用経口投与免疫賦活剤 |
| KR20160118506A (ko) * | 2015-04-02 | 2016-10-12 | 구을리주식회사 | 맨드라미추출물을 포함하는 어류 바이러스 감염 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 |
| KR101789182B1 (ko) | 2016-06-30 | 2017-10-23 | 부산대학교 산학협력단 | 어류의 세균 감염 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 어류의 세균 감염 진단 방법 |
| KR20180106570A (ko) | 2017-03-21 | 2018-10-01 | 주식회사 코미팜 | 신규 스트렙토코커스 파라우베리스 균주의 방어 혈청형을 포함하는 강도다리 세균성 질병 예방용 불활성화 백신의 제조방법 및 투여방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PLoS ONE, Volume 8, Issue 6, e65457* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102271052B1 (ko) | 2021-06-30 |
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