KR20150023711A - 항-pcsk9 항체, 제제, 투여, 및 사용 방법 - Google Patents

항-pcsk9 항체, 제제, 투여, 및 사용 방법 Download PDF

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KR20150023711A
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얀 유
세실리아 푸이 치 츄
다니엘 케이. 키르호퍼
앤드류 피터슨
가네쉬 에이. 콜룸맘
모니카 콩 벨트란
폴 모란
웨이 리
잰시 람
린 루이스
에이더 휘
휘트모어 팅글리
존 더글라스 데이비스
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Abstract

본 발명은 항-PCSK9 항체, 제제, 투여 요법, 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-PCSK9 항체, 제제, 투여, 및 사용 방법 {ANTI-PCSK9 ANTIBODIES, FORMULATIONS, DOSING, AND METHODS OF USE}
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/660,605, 및 2013년 3월 14일에 출원된 61/786,280을 우선권 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항-PCSK9 항체, 항체 제제, 투여 요법, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9)는 전구단백질 컨버타제의 포유동물 서브틸리신 패밀리의 구성원이다. PCSK9는 혈류에서 순환하는 저밀도 지단백질 (LDL) 입자의 수준을 제어함으로써 콜레스테롤 대사에서 결정적인 역할을 수행한다. PCSK9의 상승된 수준은 간 내 LDL-수용체 수준을 감소시켜 혈장 내 LDL-콜레스테롤 수준을 높이는 것으로 나타났고, 관상 동맥 질환에 대한 감수성을 증가시켰다. (문헌 [Peterson et al., J Lipid Res. 49(7):1595-9 (2008)]). 따라서, PCSK9의 활성을 억제하거나 또는 길항하는 PCSK9의 요법-기반 길항제를 생산하는 것이 매우 이로울 것이며, PCSK9의 상응하는 역할이 다양한 치료 조건에서 작용한다.
본 발명은 부분적으로 PCSK9에 대한 다양한 항체에 기초한다. PCSK9는 중요하고 이로운 치료 표적으로 제시되며, 본 발명은 PCSK9의 발현 및/또는 활성과 연관된 병리학적 상태를 표적화하는데 사용하기 위한 치료제 및 진단제로서의 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 PCSK9와 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다:
(i) GFTFX1X2X3X4IH (서열 28) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T임)를 포함하는 HVR-H1;
(ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
(iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
(iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
(v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기 6개의 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다:
(i) GFTFX1X2X3X4IH (서열 28) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T임)를 포함하는 HVR-H1;
(ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
(iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
(iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
(v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다:
(i) GFTFX1X2X3X4IX5 (서열 45) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T이고; X5는 H 또는 N임)를 포함하는 HVR-H1;
(ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
(iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
(iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
(v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기 6개의 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다:
(i) GFTFX1X2X3X4IX5 (서열 45) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T이고; X5는 H 또는 N임)를 포함하는 HVR-H1;
(ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
(iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
(iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
(v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다:
(i) GFTFX1X2X3X4IX5 (서열 45) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T이고; X5는 H 또는 N임)를 포함하는 HVR-H1;
(ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
(iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
(iv) RASQDVSTAVA (서열 7)를 포함하는 HVR-L1;
(v) SASFLYS (서열 8)를 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 하기 6개의 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다:
(i) GFTFX1X2X3X4IX5 (서열 45) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T이고; X5는 H 또는 N임)를 포함하는 HVR-H1;
(ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
(iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
(iv) RASQDVSTAVA (서열 7)를 포함하는 HVR-L1;
(v) SASFLYS (서열 8)를 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
한 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
한 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는
(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 (a) 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 27 또는 서열 43의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; 또는 (b) 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 34 또는 서열 44의 아미노산 서열 에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 27 또는 서열 43의 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 34 또는 서열 44의 VL 서열을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 15의 VH 서열 및 서열 18의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 27의 VH 서열 및 서열 44의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 15의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 27의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 27의 VH 서열 및 서열 20의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 16의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 43의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 17의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 27의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열 17의 VH 서열 및 서열 34의 VL 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 항체 단편이 제공되고, 여기서 항체는 PCSK9의 단편 내부에서 에피토프와 결합한다. 특정 실시양태에서, PCSK9 또는 그의 단편에 결합하는 항체 또는 항체 단편이 제공되고, 여기서 항체는 서열 24의 인간 PCSK9 아미노산 서열의 아미노산 376 내지 379를 포함하는 PCSK9의 단편 내부에서 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 D238을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 A239를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 D238 및 A239를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 E366을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 D367을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 E366 및 D367을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 H391을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 E366, D367 및 H391을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 A239 및 H391을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 A239, A341, E366, D367 및 H391 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 A239, A341, E366, D367 및 H391 근처의 잔기 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의, (i) R194 및 E195로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, (ii) D238 및 A239로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, (iii) A341 및 Q342로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, 및 (iv) E366, D367, I369, S376, T377, C378, F379, S381 및 H391로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 하기 잔기: R194, E195, D238, A239, A341, Q342, E366, D367, I369, S376, T377, C378, F379, S381 및 H391 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 모두를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열이다. 한 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편이다.
한 측면에서, 임의의 상기 항-PCSK9 항체를 코딩하는 핵산이 제공된다. 한 실시양태에서, 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 또 다른 실시양태에에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 방법은 항체를 코딩하는 핵산을 발현하기에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것, 및 항체를 단리시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포로부터 항-PCSK9 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 약 100 내지 약 225 mg/mL의 항-PCSK9 항체, 약 180 내지 약 220 mM의 아르기닌 숙시네이트, 약 0.01% 내지 약 0.03%의 폴리소르베이트, 및 약 5.2 내지 약 6.2의 pH를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 항-PCSK9 항체 또는 항체 단편은 약 150 mg/mL이고, 조성물 중 아르기닌 숙시네이트는 약 200 mM이고, 조성물 중 폴리소르베이트 20은 약 0.02%이고, pH는 약 5.5이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피하 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 조성물의 점도는 25℃에서 약 10 cP 미만이다. 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체는 조성물로 제제화될 수 있다.
한 측면에서, 약 150 내지 약 225 mg/mL의 항-PCSK9 항체, 약 10 내지 약 30 mM의 히스티딘 아세테이트, 약 150 내지 약 170 mM의 아르기닌 아세테이트, 약 0.01% 내지 약 0.03%의 폴리소르베이트, 및 약 5.8 내지 약 6.2의 pH를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 항-PCSK9 항체 또는 항체 단편은 약 200 mg/mL이고, 조성물 중 히스티딘 아세테이트는 약 20 mM이고, 조성물 중 아르기닌 아세테이트는 약 160 mM이고, 조성물 중 폴리소르베이트 20은 약 0.02%이고, pH는 약 6.0이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피하 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 조성물의 점도는 25℃에서 약 10 cP 미만이다. 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체는 조성물로 제제화될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 기재된 항-PCSK9 항체 또는 항-PCSK9 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 피하 투여 장치가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 장치는 개체에게 항체의 약 200 내지 약 1200 mg 범위의 균일 용량을 전달하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 장치는 사전-충전된 시린지 (예를 들어, 0.5-mL, 1-mL, 1.25-mL, 1.5-mL, 1.75-mL, 2-mL, 2.25-mL 또는 2.5-mL 시린지)이다. 특정 실시양태에서, 장치는 1-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 1.5-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 2-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 2.25-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 2.5-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다.
한 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 LDL-수용체 (LDLR)에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 LDL-콜레스테롤의 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 어느 하나의 항-PCSK9 항체를 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈청 LDL-콜레스테롤 수준을 낮추는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 어느 하나의 항-PCSK9 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 상승된 수준의 LDL-콜레스테롤과 연관된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 콜레스테롤 관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 고려되는 콜레스테롤 관련 장애의 예시적이고 비제한적인 목록은 본원에서 "조성물 및 방법" 하에 제공된다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 관련 장애는 고콜레스테롤혈증이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 어느 하나의 항-PCSK9 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 아테롬성동맥경화증 및/또는 심혈관 질환을 예방하고/거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 어느 하나의 항-PCSK9 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 재발성 심혈관 사건의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 PCSK9 활성의 제거, 억제 또는 감소에 의해 향상되거나, 개선되거나, 억제되거나 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 스타틴의 사용을 통해 치료가능하거나 또는 예방가능한 질환 또는 장애는 또한 본원에 기재된 어느 하나의 항-PCSK9 항체를 사용하여 치료될 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 합성의 예방 또는 증가된 LDLR 발현으로부터 이익을 얻을 수 있는 장애 또는 질환은 또한 본원에 기재된 어느 하나의 항-PCSK9 항체를 사용하여 치료될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다, 1개월마다, 2개월마다 또는 3개월마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 1개월마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2개월마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 3개월마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다, 1개월마다, 2개월마다 또는 3개월마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 1개월마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2개월마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 3개월마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 10주마다 또는 12주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 6주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 10주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 12주마다 용량 당 200 mg, 220 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg 또는 1200 mg으로 피하 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 10주마다 또는 12주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 6주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 10주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 12주마다 용량 당 200-1200 mg, 200-1000 mg, 200-800 mg, 200-600 mg, 200-400 mg, 400-1200 mg, 400-1000 mg, 400-800 mg, 400-600 mg, 600-1200 mg, 600-1000 mg, 600-800 mg, 800-1200 mg, 800-1000 mg, 800-900 mg, 750-850 mg, 750-800 mg, 775-825 mg, 350-450 mg, 375-425 mg 또는 375-400 mg으로 피하 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 600 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 800 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 10주마다 용량 당 800 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 12주마다 용량 당 800 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 760 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 10주마다 용량 당 760 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 12주마다 용량 당 760 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 용량 당 400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 12주마다 용량 당 400 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 용량 당 380 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 380 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 12주마다 용량 당 380 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 2주마다 용량 당 220 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 용량 당 220 mg으로 피하 투여된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 용량 당 220 mg으로 피하 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체를 제공받는 대상체는 LDL-c 수준에 대해 모니터링되고, 그의 수준이 25 또는 15 mg/dL 아래로 떨어진다면, 그의 용량은 용량 및/또는 투여 빈도를 조정함으로써 초기 용량의 대략 50% 또는 25% 아래로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 8주마다 800 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 8주마다 200 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 8주마다 800 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 8주마다 200 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 8주마다 760 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 8주마다 200 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 8주마다 760 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 8주마다 200 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 8주마다 760 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 8주마다 190 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 8주마다 760 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 8주마다 190 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 4주마다 400 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 4주마다 100 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 4주마다 400 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 4주마다 100 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 4주마다 380 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 4주마다 100 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다. 본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체에게 4주마다 380 mg의 항-PCSK9 항체의 초기 용량이 투여되고, 대상체의 LDL-c 수준은 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에 모니터링되고, 용량은 4주마다 100 mg의 항-PCSK9 항체로 조정된다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 피하 용량은 피하 투여 장치를 이용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 장치는 사전-충전된 시린지 (예를 들어, 0.5-mL, 1-mL, 1.25-mL, 1.5-mL, 1.75-mL, 2-mL, 2.25-mL 또는 2.5-mL 시린지)이다. 특정 실시양태에서, 장치는 1-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 1.5-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 2-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 2.25-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 2.5-mL 사전-충전된 시린지이고, 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 1개 초과의 시린지, 예를 들어 1개의 시린지, 2개의 시린지, 3개의 시린지 또는 4개의 시린지를 사용하여 총 균일 용량을 얻을 수 있다. 대안적 실시양태에서, 고부피의 일회용 피하 주입 장치를 이용하여 총 균일 용량, 예를 들어 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL 또는 10 mL를 투여할 수 있는 용량을 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 8주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 8주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 3개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 10주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 10주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 3개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 12주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 12주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 3개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 800 mg이고, 이는 8주마다 200 mg/mL의 항-PCSK9 항체 4 mL를 함유하는 고부피의 일회용 피하 주입 장치를 사용하여 투여된다.
특정 실시양태에서, 용량은 760 mg이고, 이는 8주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 760 mg이고, 이는 10주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 760 mg이고, 이는 12주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다.
특정 실시양태에서, 용량은 600 mg이고, 이는 8주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 600 mg이고, 이는 12주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다.
특정 실시양태에서, 용량은 400 mg이고, 이는 4주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 1개의 2.5 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 400 mg이고, 이는 4주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 2개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 용량은 380 mg이고, 이는 4주마다 200 mg/mL 농도의 항-PCSK9 항체를 함유하는 1개의 2.25 mL 시린지를 사용하여 투여된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 유효량의 제2 의약을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항-PCSK9 항체는 제1 의약이다. 한 실시양태에서, 제2 의약은 LDLR 단백질의 수준을 상승시킨다. 또 다른 실시양태에서, 제2 의약은 LDL-콜레스테롤의 수준을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 제2 의약은 스타틴을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 스타틴은 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 제2 의약은 HDL-콜레스테롤의 수준을 상승시킨다. 특정 실시양태에서, 대상체 또는 개체는 인간이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) PCSK9 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기재된 항-PCSK9 항체와 접촉시키는 것; 및 (b) 항-PCSK9 항체와 PCSK9 단백질 사이의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, PCSK9 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 PCSK9 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 검출가능하게 표지된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 그의 임의의 조합은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 및 모든 항-PCSK9 항체, 방법 및 용도에 적용된다.
도 1은 항-PCSK9 항체의 중쇄 HVR 서열, H1 (나타나는 순서대로 각각 서열 1, 1, 1, 1, 1, 2, 42, 3, 3, 1), H2 (모두 서열 4로 개시됨), 및 H3 (모두 서열 5로 개시됨), 및 경쇄 HVR 서열, L1 (나타나는 순서대로 각각 서열 6, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7, 7 및 7), L2 (나타나는 순서대로 각각 서열 26, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8 및 8) 및 L3 (나타나는 순서대로 각각 서열 9, 9, 10, 10, 11, 12, 12, 13, 33 및 14)을 보여준다.
도 2a-b는 항-PCSK9 항체의 (a) 중쇄 가변 도메인 (나타나는 순서대로 각각 서열 15, 27, 15, 27, 27, 16, 43, 17, 17 및 27) 및 (b) 경쇄 가변 도메인 (나타나는 순서대로 각각 서열 18, 44, 19, 19, 20, 21, 21, 22, 34 및 23)의 아미노산 서열을 보여준다. 위치는 카바트에 따라 넘버링되고 초가변 영역은 박스로 표시된다.
도 3a-d는 (a) 인간 PCSK9, (b) 뮤린 PCSK9, (c) 시노 PCSK9 및 래트 PCSK9, 및 (d) 레서스 PCSK9에 대한 항-PCSK9 항체 (IgG)의 해리 상수를 보여준다.
도 4. 항-PCSK9 항체는 경쟁 결합 ELISA에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제한다. 블랭크 (항체 없음; 개방 사각형) 및 대조 항체 (개방 원)는 점선으로 나타낸다. 항-PCSK9 항체는 실선으로 나타낸다. 항-PCSK9 항체의 IC50 값은 표에 제시된다.
도 5. 상이한 농도의 항-PCSK9 항체를 15 μg/ml PCSK9와 인큐베이션하고 HepG2 세포에 4시간 동안 첨가하였다. 세포를 표면 LDLR의 FACS 분석을 위해 처리하였다. 데이터는 항-PCSK9 항체가 LDLR 하향조절을 효과적으로 예방하는 것을 나타낸다. 양성 대조군은 PCSK9로 처리하지 않은 세포이다.
도 6. 30 μg의 PCSK9가 1시간 동안 마우스 간에서의 LDLR 수준을 유의하게 하향조절한다는 것을 보여주는 항-LDLR 항체의 웨스턴 블롯.
도 7. 모든 5개의 항-PCSK9 항체가 마우스 간에서의 LDLR 하향조절을 방지한다는 것을 보여주는 항-LDLR 항체의 웨스턴 블롯. 하부 이뮤노블롯은 처리군 당 4개 간의 풀이다 (각각의 간으로부터 10 μg의 단백질).
도 8은 단일 I.V. 주사 후에 C57JBL/6 마우스의 혈청 내의 항-PCSK9 항체 농도를 보여준다. 투여 군 0.5 mg/kg; 5 mg/kg; 및 20 mg/kg (n=3)의 평균 농도가 제시된다.
도 9는 5 mg/kg 항-PCSK9 항체의 단일 I.V. 주사 후에 C57JBL/6 WT 및 PCSK9-/- 마우스의 혈청 내의 항-PCSK9 항체 농도의 비교를 보여준다. 각 투여 군의 평균 농도기 제시된다 (n=3).
도 10은 단일 I.V. 주사 후에 개별 시노몰구스 원숭이의 혈청 내의 항-PCSK9 항체 농도를 보여준다. 3개의 투여 군에는 5 mg/kg; 20 mg/kg; 및 60 mg/kg이 포함된다.
도 11은 단일 I.V. 주사 후에 시노몰구스 원숭이의 혈청 내의 항-PCSK9 항체 농도를 보여준다. 투여 군 5 mg/kg, 20 mg/kg 및 60 mg/kg (n=3)의 평균 농도가 제시된다.
도 12는 대조군 (Crtl) 또는 항-PCSK9 항체의 단일 용량 (10mg/kg 체중)으로 처리된 마우스로부터의 혈청 내의 총 콜레스테롤 수준을 보여준다. 콜레스테롤 수준은 도면에 지시된 바와 같이 상이한 날짜에 측정하였다.
도 13은 대조군 또는 항-PCSK9 항체의 단일 용량 (10mg/kg 체중)으로 처리된 마우스로부터의 혈청 내의 총 콜레스테롤 수준을 보여준다.
도 14는 코호트 A-J를 포함하는 I상 시험 설계의 개략도를 보여준다. 각각의 코호트는 활성제로 치료된 6명의 환자 및 위약으로 치료된 2명의 환자를 포함하였다 (코호트 당 전체 8명의 환자 및 80명의 전체 환자).
도 15는 연구 코호트 A-J에 대한 약동학 데이터를 보여준다. 단일 용량 코호트 A-E 및 J로부터의 결과는 좌측 패널에 제시되고, 다중 용량 코호트 F-I로부터의 결과는 우측 패널에 제시된다. 적색 화살표는 약물 투여 타이밍을 보여준다.
도 16은 단일 용량 코호트에 대한 LDL-c (mg/dL) 수준의 기준선으로부터의 평균 절대 변화를 보여준다.
도 17은 단일 용량 코호트에 대한 LDL-c 수준의 기준선에서의 평균 퍼센트 변화를 보여준다.
도 18은 다중 용량 코호트에 대한 LDL-c (mg/dL) 수준의 기준선으로부터의 평균 절대 변화를 보여준다.
도 19는 다중 용량 코호트에 대한 LDL-c 수준의 기준선에서의 평균 퍼센트 변화를 보여준다.
도 20은 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% PS20, pH 5.5의 제제 중 단백질 농도의 함수로서 항-PCSK9의 점도를 보여준다.
도 21은 대조군 및 2cc 유리 바이알에 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 (PS20)을 함유하는 교반된 항-PCSK9 샘플에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) (좌측 패널) 및 탁도 (우측 패널) 분석을 보여준다.
도 22는 펩티드 맵핑에 의해 다양한 조건 하에 항-PCSK9 내의 메티오닌 및 트립토판 잔기의 산화를 보여준다.
도 23은 펩티드 맵핑에 의해 다양한 조건 하에 항-PCSK9의 CDR 내에 있는 및 이에 인접한 메티오닌 및 트립토판 잔기의 산화를 보여준다.
도 24는 pH 5.0 내지 6.5 (200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% PS20, pH 5.0-6.0, 또는 20 mM 히스티딘 HCL, 160 mM 아르기닌 HCl, 0.02% PS20, pH 6.5)의 200 mg/mL 항-PCSK9에 대한 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) (좌측 패널) 및 SEC (우측 패널) pH 비율 프로파일을 보여준다.
도 25는 HCl (20 mM 히스티딘 HCl, 160 mM 아르기닌 HCl, 0.02% PS20, pH 6.0 중 200 mg/mL 항-PCSK9) 및 아세테이트 (20 mM 히스티딘 아세테이트, 160 mM 아르기닌 아세테이트, 0.02% PS20, pH 6.0 중 200 mg/mL 항-PCSK9) 제제에서 동결 저장 동안 항-PCSK9에 대한 SEC에 의한 퍼센트 주요 피크 (좌측 패널) 및 퍼센트 고분자량 종 (HMWS) (우측 패널) 데이터를 보여준다.
도 26은 40℃ 저장에서 1개월 후에 CE-SDS (상부), SEC (중앙) 및 IEC (하부)에 의해 pH 6.0의 200 mg/mL 항-PCSK9에 대한 반대-이온 효과를 보여준다.
도 27은 시험의 각각의 아암에서 연구 용량 코호트, 항-PCSK9 항체 용량 요법 및 환자 수의 개관을 포함하는 II상 임상 시험의 연구 설계를 보여준다.
도 28은 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서의 평균 약동학 (+/- 표준 편차) (좌측 패널) 및 평균 총 PCSK9 (+/- 표준 오차) (우측 패널)를 보여준다.
도 29는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 관찰된 직접적 LDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다.
도 30은 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 관찰된 직접적 LDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다.
도 31은 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 관찰된 총 콜레스테롤의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다.
도 32는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 관찰된 총 콜레스테롤의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다.
도 33은 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 비-HDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다.
도 34는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 비-HDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다.
도 35는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 아포지단백질 B의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다.
도 36은 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받는 환자에서 아포지단백질 B의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다.
도 37a는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 후에 1회 이상의 방문 동안 15 mg/dL 이하의 직접적 LDL-c 값을 갖는 환자의 비율을 보여주고, 도 37b는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 후에 1회 이상의 방문 동안 25 mg/dL 이하의 직접적 LDL-c 값을 갖는 환자의 비율을 결정하기 위해 수행된 실험의 결과를 보여준다.
본원에 기재되거나 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고 있으며, 예를 들어 하기 문헌에 기재된 광범위하게 이용되는 방법론과 같은 종래의 방법론을 이용하여 통상의 기술자에 의해 통상적으로 사용되고 있다: 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 통상의 기술자에게 본원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개를 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전체내용이 참조로 포함된다.
본 명세서를 해석하려는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우에는 언제라도, 단수형으로 사용된 용어는 또한 복수형도 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 목적으로만 사용되는 것이며, 이는 제한하기 위한 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 하기 열거된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 모순되는 경우에는 하기 열거된 정의가 우선한다.
본 명세서 및 특허청구범위에 걸쳐서, 이뮤노글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] (명백하게 본원에 참조로 포함됨)에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
본원의 목적을 위해 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-PCSK9 항체", "항-PCSK9", "PCSK9 항체" 및 "PCSK9에 결합하는 항체"는 항체가 PCSK9을 표적화하는데 있어 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 PCSK9에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-PCSK9 단백질에 대한 항-PCSK9 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 PCSK9에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, PCSK9에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 다른 종으로부터의 PCSK9 사이에 보존된 PCSK9의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 PCSK9에 결합된 항-PCSK9 항체 Fab 단편의 결정 구조에 기초하여 결정된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능의 억제 또는 저해 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
"Fab" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 신장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 하기 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 단단히 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인 이량체로 이루어진다. 단일-쇄 Fv (scFv) 종에서는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 유연한 펩티드 링커에 의해 공유 연결되어 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있다. 이러한 배위에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 갖는다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "고콜레스테롤혈증"은 콜레스테롤 수준이 바람직한 수준을 초과하여 상승된 상태를 언급한다. 특정 실시양태에서, LDL-콜레스테롤 수준은 바람직한 수준을 초과하여 상승된다. 특정 실시양태에서, 혈청 LDL-콜레스테롤 수준은 바람직한 수준을 초과하여 상승된다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)].) VH 내의 CDR1을 제외하고는, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-PCSK9 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제" 또는 "제약 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "전구단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 유형 9", "PCSK9" 또는 "NARC-1"은 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 PCSK9를 지칭한다. 이 용어는 "전장" 비프로세싱된 PCSK9 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 PCSK9 또는 그의 임의의 단편을 포괄한다. 이 용어는 또한 PCSK9의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "PCSK9 활성" 또는 PCSK9의 "생물학적 활성"은 PCSK9의 임의의 생물학적 효과를 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9 활성은 기질 또는 수용체와 상호작용하거나 그에 결합하는 PCSK9의 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 LDL-수용체 (LDLR)에 결합하는 PCSK9의 능력이다. 특정 실시양태에서, PCSK9는 LDLR에 결합하여 이와 관련된 반응을 촉매화한다. 특정 실시양태에서, PCSK9 활성은 LDLR의 유용성을 줄이거나 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 대상체에서 LDL의 양을 증가시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 대상체에서 LDL에 결합할 수 있는 LDLR의 양을 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 LDL에 결합할 수 있는 LDLR의 양을 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 PCSK9 신호전달로부터 발생한 임의의 생물학적 활성을 포함한다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 지연시키는데 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 언급대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 이러한 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는 것", 이들로 "이루어진 것" 및 이들로 "본질적으로 이루어진 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
II . 조성물 및 방법
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로 항-PCSK9 항체를 사용하여 얻은 실험 및 임상 결과에 기초한다. 얻은 결과는 항-PCSK9 항체를 사용한 PCSK9의 생물학적 활성의 차단이 LDLR 감소의 방지로 이어진다는 것을 나타낸다. 또한, 결과는 항-PCSK9 항체의 투여가 대상체에서 총 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시킨다는 것을 입증한다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 PCSK9 항체는 PCSK9와 연관된 병리학적 상태, 예를 들어 콜레스테롤 관련 장애의 표적화에 사용하기 위한 중요한 치료제 및 진단제를 제공한다.
특정 실시양태에서, "콜레스테롤 관련 장애"는 하기 중 어느 하나 이상을 포함한다: 고콜레스테롤혈증, 심장 질환, 대사 증후군, 당뇨병, 관상동맥 심장 질환, 졸중, 심혈관 질환, 알츠하이머병, 및 일반적으로 예를 들어 상승된 총 혈청 콜레스테롤, 상승된 LDL, 상승된 트리글리세리드, 상승된 VLDL, 및/또는 저 HDL로 나타날 수 있는 이상지혈증. 항-PCSK9 항체를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제와 조합하여 사용하여 치료될 수 있는 원발성 및 속발성 이상지혈증의 일부 비제한적 예는 대사 증후군, 당뇨병, 가족성 복합 고지혈증, 가족성 고트리글리세리드혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 (이형접합 고콜레스테롤혈증, 동형접합 고콜레스테롤혈증, 가족성 결함 아포리포단백질 B-100 포함); 다유전자 고콜레스테롤혈증; 잔유물 제거 질환, 간 리파제 결핍; 식이 무분별, 갑상선기능저하증, 에스트로겐 및 프로게스틴 요법, 베타-차단제, 및 티아지드 이뇨제를 포함하는 약물 중 임의의 것에 대해 속발성인 이상지혈증; 신증후군, 만성 신부전, 쿠싱 증후군, 원발성 담즙성 간경변증, 글리코겐 축적 질환, 간세포암, 담즙정체, 말단비대증, 인슐린종, 단독성 성장 호르몬 결핍, 및 알콜-유도된 고트리글리세리드혈증을 포함한다. 본원에 기재된 항-PCSK9 항체는 또한 아테롬성동맥경화성 질환, 예컨대 예를 들어 관상동맥 심장 질환, 관상 동맥 질환, 말초 동맥 질환, 졸중 (허혈성 및 출혈성), 협심증, 또는 뇌혈관 질환 및 급성 관상동맥 증후군, 심근경색을 예방하거나 치료하는데 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PCSK9 항체는 비치명적 심장 발작, 치명적 및 비-치명적 졸중, 특정 유형의 심장 수술, 심부전으로 인한 입원, 심장 질환을 앓는 환자의 흉통, 및/또는 심혈관 사건 (확립된 심장 질환, 예컨대 이전의 심장 발작, 이전의 심장 수술, 및/또는 동맥 경화의 증거를 나타내는 흉통으로 인함)의 위험을 감소시키는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PCSK9 항체 및 방법은 재발성 심혈관 사건의 위험을 감소시키는데 사용될 수 있다.
A. 예시적인 항- PCSK9 항체
한 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 PCSK9 활성을 조정한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PCSK9 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 6개의 HVR을 포함하는 항-PCSK9 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 5로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 상기 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-PCSK9 항체는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 27 또는 서열 43의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 27 또는 서열 43에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PCSK9 항체는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 27 또는 서열 43의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 34 또는 서열 44의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-PCSK9 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 34 또는 서열 44에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환되고/거나, 삽입되고/거나, 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PCSK9 항체는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 34 또는 서열 44의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-PCSK9 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 15 및 서열 18의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 27 및 서열 44의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 15 및 서열 19의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 27 및 서열 19의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 27 및 서열 20의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 16 및 서열 21의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 43 및 서열 21의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 17 및 서열 22의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 27 및 서열 23의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 17 및 서열 34의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함).
또 다른 측면에서, 항-PCSK9 항체는 서열 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 35에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PCSK9 항체 중쇄는 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 27 또는 서열 43의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, 중쇄는 (a) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 항-PCSK9 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 경쇄 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 36에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-PCSK9 항체 경쇄는 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 34 또는 서열 44의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, 경쇄는 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 중쇄 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 경쇄를 포함하는 항-PCSK9 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 35는 C-말단에서 1 또는 2개의 아미노산에 의해 말단절단되고, 예를 들어 이는 K451, 또는 G450 및 K451을 함유하지 않는다. 특정 실시양태에서, 서열 35 내의 P449가 아미드화된다.
항체 508.20.33b 중쇄 아미노산 서열 (서열 35):
Figure pct00001
항체 508.20.33b 경쇄 아미노산 서열 (서열 36):
Figure pct00002
특정 실시양태에서, 서열 35는 C-말단에서 1 또는 2개의 아미노산에 의해 말단절단되고, 예를 들어 이는 K451, 또는 G450 및 K451을 함유하지 않는다 (예를 들어, 중쇄는 서열 35의 아미노산 1-449 또는 서열 35의 아미노산 1-450을 포함함). 특정 실시양태에서, 서열 35 내의 P449가 아미드화된다.
특정 실시양태에서, 기능적 에피토프는 조합 알라닌 스캐닝에 의해 맵핑될 수 있다. 상기 과정, 조합 알라닌-스캐닝 전략은 항-PCSK9 항체와 상호작용하는데 필수적인 PCSK9 단백질 내의 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 입체형태적이고, PCSK9에 결합된 항-PCSK9 항체 Fab 단편의 결정 구조는 에피토프를 확인하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 15의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 27의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 27의 VH 서열 및 서열 20의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 16의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 43의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 17의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 27의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 17의 VH 서열 및 서열 34의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 중 어느 하나와 경쟁적으로 인간 PCSK9에 결합하는 항-PCSK9 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 경쟁적 결합은 ELISA 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 15의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 27의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 27의 VH 서열 및 서열 20의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 16의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 43의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 17의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 27의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 17의 VH 서열 및 서열 34의 VL 서열을 포함하는 항-PCSK9 항체와 경쟁적으로 PCSK9에 결합하는 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 PCSK9의 단편의 내부에서 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 24의 인간 PCSK9 아미노산 서열의 아미노산 376 내지 379를 포함하는 PCSK9의 단편 내부에서 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 D238을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 A239를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 D238 및 A239를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 E366을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 D367을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 E366 및 D367을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 H391을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 E366, D367 및 H391을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 A239 및 H391을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 A239, A341, E366, D367 및 H391 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 A239, A341, E366, D367 및 H391 근처의 잔기 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의, (i) R194 및 E195로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, (ii) D238 및 A239로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, (iii) A341 및 Q342로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, 및 (iv) E366, D367, I369, S376, T377, C378, F379, S381 및 H391로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 하기 잔기: R194, E195, D238, A239, A341, Q342, E366, D367, I369, S376, T377, C378, F379, S381 및 H391 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 모든 잔기를 포함한다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-PCSK9 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-PCSK9 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 회합률이 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 회합률은 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 관련 기술분야의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 PCSK9에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 PCSK9의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 PCSK9을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 PCSK9 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 A에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 A에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
[표 A]
Figure pct00003
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 관련 기술분야에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
본원에 기재된 항-PCSK9 항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PCSK9 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 중쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 핵산은 서열 38 또는 서열 39의 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 핵산은 서열 40 또는 서열 41의 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 중쇄 가변 영역 및 항-PCSK9 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 38 또는 서열 39의 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산은 서열 40 또는 서열 41의 핵산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 중쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 핵산은 서열 38 또는 39를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 핵산은 서열 40 또는 41을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 중쇄를 코딩하는 핵산은 서열 38을 포함하고, 경쇄를 코딩하는 핵산은 서열 40을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 핵산이 제공되며, 여기서 중쇄를 코딩하는 핵산은 서열 39를 포함하고, 경쇄를 코딩하는 핵산은 서열 41을 포함한다.
항체 508.20.33b 전장 중쇄 핵산 서열 (서열 38)
Figure pct00004
항체 508.20.33b 중쇄 가변 영역 핵산 서열 (서열 39)
Figure pct00005
항체 508.20.33b 전장 경쇄 핵산 서열 (서열 40)
Figure pct00006
항체 508.20.33b 경쇄 가변 영역 핵산 서열 (서열 41)
Figure pct00007
추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-PCSK9 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는 항-PCSK9 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-PCSK9 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본원에 제공된 항-PCSK9 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
한 측면에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체를 그의 PCSK9 결합 활성에 대해, 예를 들어 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 시험하였다. 다수의 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어 고체 상의 직접 또는 간접 방사성면역검정 (RIA), 고체 상의 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (예를 들어, 문헌 [Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 92:242-253] 참조); 고체 상의 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어, 문헌 [Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조), 고체 상의 직접 표지된 검정, 고체 상의 직접 표지된 샌드위치 검정 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체 상의 직접 표지 RIA (예를 들어, 문헌 [Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고체 상의 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어, 문헌 [Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82])를 항-PCSK9 항체가 또 다른 것과 경쟁하는지 결정하기 위해 사용할 수 있다. 일반적으로, 이같은 분석은 이들 비표지된 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정한다. 일반적으로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질 (경쟁 항원 결합 단백질)은 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 및 입체 장애가 일어나도록 참조 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁 결합을 측정하는 방법에 관한 추가의 상세는 본원의 실시예에서 제공된다. 통상적으로, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 이는 참조 항원 결합 단백질의 공통 항원에 대한 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 또는 그 초과만큼 억제 (예를 들어, 감소) 할 것이다. 특정 실시양태에서, 결합은 적어도 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 초과만큼 억제된다.
본 발명의 한 측면에서, 경쟁 검정을 PCSK9에 대한 결합에 대해 항-PCSK9 항체 508.20.04a, 508.20.04b, 508.20.06, 508.20.28a, 508.20.28b, 508.20.33a, 508.20.33b 또는 508.20.84와 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 항-PCSK9 항체 508.20.04a, 508.20.04b, 508.20.06, 508.20.28a, 508.20.28b, 508.20.33a, 508.20.33b 및/또는 508.20.84에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 PCSK9를 PCSK9에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 항-PCSK9 항체 508.20.04a, 508.20.04b, 508.20.06, 508.20.28a, 508.20.28b, 508.20.33a, 508.20.33b 또는 508.20.84) 및 PCSK9에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 PCSK9를 제1 표지된 항체는 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. PCSK9에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정된 PCSK9와 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정된 PCSK9와 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 PCSK9에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
2. 활성 검정
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 그의 항-PCSK9 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 항-PCSK9 항체의 생물학적 활성은 PCSK9의 하나 이상의 생물학적 활성을 예를 들어, 차단, 길항, 억제, 간섭, 조정 및/또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 인간 PCSK9에 결합하고, LDLR과의 상호작용을 방지한다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 인간 PCSK9에 특이적으로 결합하고/거나 LDLR에 대한 인간 PCSK9의 결합을 적어도 약 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, 또는 그 초과만큼 실질적으로 억제한다 (예를 들어, 시험관내 경쟁 결합 검정에서 결합 측정에 의함). 특정 실시양태에서, 본 발명은 PCSK9에 특이적으로 결합하고, 본원에 개시된 HepG2 세포에서의 LDLR 하향조절 검정을 이용하여 시험관내에서 측정된 경우에 LDLR 수준에 대한 PCSK9-매개 효과를 길항하는 단리된 항-PCSK9 항체를 제공한다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-PCSK9 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이에 제한되지는 않은 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-PCSK9 항체는 생물학적 샘플에서 PCSK9의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 기원의 혈액, 혈청 또는 다른 액체 샘플이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-PCSK9 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 PCSK9의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플에서 PCSK9 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, PCSK9는 인간 PCSK9이다. 특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체와 생물학적 샘플을 PCSK9에 대한 항-PCSK9 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것, 및 항-PCSK9 항체와 PCSK9 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 예를 들어 PCSK9 또는 LDL-콜레스테롤이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-PCSK9 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 하기 중 어느 하나 이상을 포함하는 콜레스테롤 관련 장애 ("혈청 콜레스테롤 관련 장애" 포함)를 포함한다: 고콜레스테롤혈증, 심장 질환, 대사 증후군, 당뇨병, 관상동맥 심장 질환, 졸중, 심혈관 질환, 알츠하이머병, 및 일반적으로 예를 들어 상승된 총 혈청 콜레스테롤, 상승된 LDL, 상승된 트리글리세리드, 상승된 초저밀도 지단백질 (VLDL), 및/또는 저 HDL에 의해 나타날 수 있는 이상지혈증. 한 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 아테롬성동맥경화증, 심혈관 질환 (CVD) 또는 관상동맥 심장 질환의 하나 이상의 증상을 개체에서 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 아테롬성동맥경화증, CVD 또는 관상동맥 심장 질환의 하나 이상의 증상을 대상체에서 치료하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 유효량의 항-PCSK9 항체를 제공한다. 본 발명은 개체에서 고콜레스테롤혈증, 및/또는 이상지질혈증, 아테롬성동맥경화증, CVD 또는 관상동맥 심장 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서, 세포외 또는 순환 PCSK9에 길항하는 유효량의 항-PCSK9 항체의 용도를 추가로 제공한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-PCSK9 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
F. 제약 제제
본 발명은 또한 항-PCSK9 항체, 및 항-PCSK9 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (제약 제제 포함)을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 PCSK9에 결합하는 하나 이상의 항체, 또는 PCSK9에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 적합한 담체, 예컨대 제약상 허용되는 부형제 (완충제 포함)를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체의 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 제약상 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원에서 제제는 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 스타틴을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 약 100 내지 약 225 mg/mL의 항-PCSK9 항체, 약 180 내지 약 220 mM의 아르기닌 숙시네이트, 약 0.01% 내지 약 0.03%의 폴리소르베이트, 및 약 5.2 내지 약 5.8의 pH를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피하 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 조성물의 점도는 25℃에서 약 25 cP 미만, 25℃에서 약 20 cP 미만, 25℃에서 약 15 cP 미만, 25℃에서 약 12 cP 미만, 또는 25℃에서 약 10 cP 미만이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 또는 적어도 6개월 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 0.5-mL, 1-mL, 1.25-mL, 1.5-mL, 1.75-mL, 2-mL, 2.25-mL 또는 2.5-mL 사전-충전된 시린지에 있다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 항체는 약 110, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220 및 225 mg/mL (임의의 이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 아르기닌 숙시네이트는 약 180, 185, 190, 200, 210 및 220 mM (임의의 이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80)는 약 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025% 및 0.03% (임의의 이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 5.0, 5.2, 5.4, 5.5, 5.6, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 및 6.2 (임의의 이들 값 사이의 pH 포함)의 pH를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 항-PCSK9 항체는 약 150 mg/mL이고, 조성물 중 아르기닌 숙시네이트는 약 200 mM이고, 조성물 중 폴리소르베이트 20은 약 0.02%이고, pH는 약 5.5이다.
한 측면에서, 본 발명은 약 150 내지 약 225 mg/mL의 항-PCSK9 항체, 약 10 내지 약 30 mM의 히스티딘 아세테이트, 약 150 내지 약 170 mM의 아르기닌 아세테이트, 약 0.01% 내지 약 0.03%의 폴리소르베이트, 및 약 5.8 내지 약 6.2의 pH를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 피하 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 조성물의 점도는 25℃에서 약 25 cP 미만, 25℃에서 약 20 cP 미만, 25℃에서 약 15 cP 미만, 25℃에서 약 12 cP 미만 또는 25℃에서 약 10 cP 미만이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월 또는 적어도 6개월 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 0.5-mL, 1-mL, 1.25-mL, 1.5-mL, 1.75-mL, 2-mL, 2.25-mL 또는 2.5-mL 사전-충전된 시린지에 있다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 항체는 약 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220 및 225 mg/mL (임의의 이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 히스티딘 아세테이트는 약 10, 15, 20, 25 및 30 mM (이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 아르기닌 아세테이트는 약 150, 155, 160, 165 및 170 mM (임의의 이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80)는 약 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025% 및 0.03% (임의의 이들 농도 사이의 농도 포함)이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 및 6.2 (임의의 이들 값 사이의 pH 포함)의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 항-PCSK9 항체는 약 200 mg/mL이고, 조성물 중 히스티딘 아세테이트는 약 20 mM이고, 조성물 중 아르기닌 아세테이트는 약 160 mM이고, 조성물 중 폴리소르베이트 20은 약 0.02%이고, pH는 약 6.0이다.
또한, 개체에게 항체의 200 mg 내지 1200 mg 범위의 균일 용량을 전달하기 위한, 본원에 기재된 조성물 중에 항-PCSK9 항체를 함유하는 피하 투여 장치가 제공된다. 1회 투여에 사용되는 완전한 용량은 하나 이상의 장치에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 장치 중 항체의 농도는 약 200 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 장치는 사전-충전된 시린지 (예를 들어, 0.5-mL 시린지, 1-mL 시린지, 1.25-mL 시린지, 1.5-mL 시린지, 1.75-mL 시린지, 2-mL 시린지, 2.25-mL 시린지, 또는 2.5-mL 시린지) 또는 고부피의 일회용 피하 주입 장치 (예를 들어, 1-10 mL, 2-8 mL, 3-6 mL, 4-5 mL, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mL 전달용)이다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-PCSK9 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-PCSK9 항체가 제공된다. 또 다른 측면에서, 콜레스테롤 관련 장애와 연관된 상태를 치료하는데 사용하기 위한 항-PCSK9 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상승된 수준의 LDL-콜레스테롤과 연관된 상태를 치료하는데 사용하기 위한 항-PCSK9 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 항-PCSK9 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 투여하는 것을 포함하는 상승된 수준의 LDL-콜레스테롤과 연관된 상태를 갖는 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 용도는 개체에게 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 스타틴을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키는데 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 혈청 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시키는데 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 LDLR의 가용성을 증가시키는데 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는데 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 투여하여 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키는 것을 포함하는 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 투여하여 혈청 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시키는 것을 포함하는 개체에서 혈청 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법에 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 투여하여 LDLR의 가용성을 증가시키는 것을 포함하는 개체에서 LDLR의 가용성을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 투여하여 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 것을 포함하는 개체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-PCSK9 항체를 제공한다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따른 "개체" 또는 "대상체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에 있어서 항-PCSK9 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 콜레스테롤 관련 장애의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 관련 장애는 고콜레스테롤혈증이다. 또 다른 실시양태에서, 의약은 고콜레스테롤혈증을 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 고콜레스테롤혈증을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 치료되는 장애는 PCSK9 활성의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선, 완화, 억제 또는 예방되는 임의의 질환 또는 상태이다. 특정 실시양태에서, 스타틴의 사용을 통해 일반적으로 다룰 수 있는 (치료가능한 또는 예방가능한) 질환 또는 장애가 또한 치료될 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 합성 또는 증가된 LDLR 발현의 예방으로부터 이익을 얻을 수 있는 장애 또는 질환은 또한 본 발명의 항-PCSK9 항체에 의해 치료될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 및 본 발명의 치료 방법에 의해 치료가능한 개체는 LDL 성분채집술에 대해 적응증을 갖는 개체, PCSK9-활성화 돌연변이 (기능 획득 돌연변이, "GOF")를 갖는 개체, 이종접합 가족성 고콜레스테롤혈증 (heFH)을 갖는 개체, 원발성 고콜레스테롤혈증을 갖는 스타틴 비내성 또는 스타틴 비조절인 개체, 및 고콜레스테롤혈증이 발병할 위험이 있는, 예방적으로 치료될 수 있는 개체를 포함한다. 다른 적응증은 속발성 원인, 예컨대 제2형 당뇨병, 담즙정체성 간 질환 (원발성 담즙성 간경변증), 신증후군, 갑상선기능저하증, 비만, 및 아테롬성동맥경화증 및 심혈관 질환의 예방 및 치료와 연관된 이상지혈증을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-PCSK9 항체 및 치료 방법에 의해 치료가능한 개체는 90-250 mg/dL의 LDL-c 수준 및 관상동맥 심장 질환 (CHD) 또는 CHD 위험 등가상태 (실시예 12에 상세하게 기재된 바와 같음)를 갖는 개체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 관상동맥 심장 질환을 앓고 있는 개체에게 항-PCSK9 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 관상동맥 심장 질환을 갖는 개체는 기록된 심근경색의 병력을 갖는다. 특정 실시양태에서, 관상동맥 심장 질환을 갖는 개체는 이전의 관상 동맥 재혈관화 절차 (예를 들어, 경피 관상동맥 개입 또는 관상 동맥 우회로 이식)를 받은 적이 있는 개체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 관상동맥 심장 질환을 갖는 개체는 ≥ 50% 직경 협착을 갖는 적어도 하나의 관상동맥 아테롬성동맥경화성 병변을 갖는 개체를 지칭한다 (예를 들어, 침습적 관상동맥 혈관조영 또는 심장 컴퓨터 단층촬영 관상동맥 혈관조영을 포함하여 관상동맥 혈관조영에 의해 결정됨).
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 CHD 위험 등가상태를 갖는 개체에게 항-PCSK9 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, CHD 위험 등가상태를 갖는 개체는 하나 이상의 형태의 임상적 아테롬성동맥경화성 질환, 예컨대 예를 들어 말초 동맥 질환 (예를 들어, 발목/상완 혈압 지수 < 0.85, 이전의 경피 또는 외과적 말초 동맥 재혈관화 절차, 말초 동맥 질환으로 인한 하지의 이전의 비-외상성 절단, 또는 이전의 혈관 영상화 상의 ≥ 50% 직경 협착), 경동맥 질환 (예를 들어, ≥ 50% 직경 협착을 갖는 경동맥 아테롬성동맥경화성 병변 또는 이전의 피부 또는 외과적 경동맥 재혈관화 절차), 이전의 허혈성 졸중 또는 복부 대동맥류를 갖는 개체이다. 특정 실시양태에서, CHD 위험 등가상태를 갖는 개체는 제II형 당뇨병을 갖는 개체이다. 특정 실시양태에서, CHD 위험 등가상태를 갖는 개체는 기관 손상 (예를 들어, 망막병증, 신경병증, 또는 미세알부민뇨를 포함하는 신병증)과 연결된 제I형 당뇨병을 갖는 개체이다. 특정 실시양태에서, CHD 위험 등가상태를 갖는 개체는 중간 정도 내지 중증의 만성 신장 질환을 갖는 개체다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 항-PCSK9 항체를 하기 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다: 연령 (남성의 경우에 ≥ 45세 또는 여성의 경우에 ≥ 55세), 흡연 (1개월내), 고혈압 (수축기 혈압 ≥ 140 mmHg, 확장기 혈압 ≥ 90 mmHg, 또는 항고혈압제 사용), 저 HDL 콜레스테롤 (< 40 mg/dL), 또는 조기 CHD의 가족력.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 용도는 추가로 개체에게 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 스타틴을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 아테롬성동맥경화증 및/또는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 재발성 심혈관 사건의 위험을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 대상체에서 HDL-콜레스테롤의 수준을 상승시키기 위한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-PCSK9 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-PCSK9 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 스타틴을 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 LDLR의 수준을 상승시킨다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 LDL-콜레스테롤 저하 약물, 예컨대 스타틴, 예를 들어 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 비토린(VYTORIN)®, 아드비코르(ADVICOR)® 또는 심코르(SIMCOR)®이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 HDL-콜레스테롤 상승 약물이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항-PCSK9 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항-PCSK9 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg 내지 10mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 균일-고정 투여 요법이 개체에게 항-PCSK9 항체를 투여하는데 이용된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예시적인 균일-고정 투여량은 항-PCSK9 항체의 10 내지 1200 mg 범위일 수 있다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 10 mg 내지 약 1000 mg의 범위일 것이다. 항체의 또 다른 예시적인 투여량은 약 100 mg 내지 약 600 mg의 범위일 것이다. 항체의 또 다른 예시적인 투여량은 약 200 mg 내지 약 800 mg의 범위일 것이다. 항체의 또 다른 예시적인 투여량은 약 350 mg 내지 약 400 mg의 범위일 것이다. 항체의 또 다른 예시적인 투여량은 약 750 mg 내지 약 800 mg의 범위일 것이다. 특정 실시양태에서, 150 mg, 200 mg, 220 mg, 300 mg, 380 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 760 mg, 800 mg, 1000 mg, 1140 mg, 또는 1200 mg의 항-PCSK9 항체가 개체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 균일 용량의 항-PCSK9 항체가 2주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 10주마다 또는 12주마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 균일 용량의 항-PCSK9 항체가 2주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 10주마다 또는 12주마다 1회보다 더 빈번하지 않게 투여된다. 특정 실시양태에서, 균일 용량의 항-PCSK9 항체가 1개월마다, 1.5개월마다, 2개월마다, 2.5개월마다 또는 3개월마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 균일 용량의 항-PCSK9 항체가 1개월마다, 1.5개월마다, 2개월마다, 2.5개월마다 또는 3개월마다 1회보다 더 빈번하지 않게 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 피하로 투여된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
특정 실시양태에서, 투여될 균일한 고정된 피하 용량은 5 mL, 4.5 mL, 4 mL, 3.8 mL, 3.5 mL, 3 mL, 2.5 mL, 2 mL, 1.9 mL, 1.5 mL 또는 1 mL 이하의 부피로 제공된다. 특정 실시양태에서, 균일한 고정된 피하 용량은 4 mL 이하의 총 부피 중 800 mg이다. 특정 실시양태에서, 균일한 고정된 피하 용량은 3.8 mL 이하의 총 부피 중 760 mg이다. 특정 실시양태에서, 균일한 고정된 피하 용량은 3 mL 이하의 총 부피 중 600 mg이다. 특정 실시양태에서, 균일한 고정된 피하 용량은 2 mL 이하의 총 부피 중 400 mg이다. 특정 실시양태에서, 균일한 고정된 피하 용량은 1.9 mL 이하의 총 부피 중 380 mg이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60% 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60% 감소되고, 최종 투여 후 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월 또는 3개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 1주, 약 10일 또는 약 2주 내에 기준선으로부터 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60% 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 1주, 약 10일 또는 약 2주 내에 기준선으로부터 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60% 감소되고, 최종 투여 후 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월 또는 3개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소되고, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주 또는 적어도 약 1.5개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여로부터 약 1주 내에 적어도 약 45% 감소되고, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주 또는 적어도 약 1.5개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소되고, 적어도 약 4주 또는 적어도 약 1개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여로부터 약 10일 내에 적어도 약 50% 감소되고, 적어도 약 4주 또는 적어도 약 1개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소되고, 적어도 약 8주 또는 적어도 약 2개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여로부터 약 10일 내에 적어도 약 50% 감소되고, 적어도 약 8주 또는 적어도 약 2개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소되고, 적어도 약 2주 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 2주 내에 적어도 약 55% 감소되고, 적어도 약 2주 동안 감소된 수준으로 유지된다. 본원에 사용된 개체에서의 "기준선" 수준 (예컨대, LDL-콜레스테롤 수준에 대한 기준선 수준)은 개체에게 본원에 기재된 항-PCSK9 항체를 투여하기 전의 수준을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준선은 항-PCSK9 항체를 투여하기 전에 수득한 2개 이상의 측정값의 평균일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 60 mg/dL, 적어도 약 70 mg/dL, 적어도 약 75 mg/dL, 적어도 약 80 mg/dL 또는 적어도 약 90 mg/dL 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 60 mg/dL, 적어도 약 70 mg/dL, 적어도 약 75 mg/dL, 적어도 약 80 mg/dL 또는 적어도 약 90 mg/dL 감소되고, 최종 투여 후 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월 또는 3개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 1주, 약 10일 또는 약 2주 내에 기준선으로부터 적어도 약 60 mg/dL, 적어도 약 70 mg/dL, 적어도 약 75 mg/dL, 적어도 약 80 mg/dL 또는 적어도 약 90 mg/dL 감소된다. 일부 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 1주, 약 10일 또는 약 2주 내에 기준선으로부터 적어도 약 60 mg/dL, 적어도 약 70 mg/dL, 적어도 약 75 mg/dL, 적어도 약 80 mg/dL 또는 적어도 약 90 mg/dL 감소되고, 최종 투여 후 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월 또는 3개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 60 mg/dL 또는 70 mg/dL 감소되고, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주 또는 적어도 약 1.5개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 1주 내에 적어도 약 60 mg/dL 또는 70 mg/dL 감소되고, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주 또는 적어도 약 1.5개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 80 mg/dL 감소되고, 적어도 약 4주 또는 적어도 약 1개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여로부터 약 10일 내에 적어도 약 80 mg/dL 감소되고, 적어도 약 4주 또는 적어도 약 1개월 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 적어도 약 90 mg/dL 감소되고, 적어도 약 2주 동안 감소된 수준으로 유지된다. 특정 실시양태에서, 기재된 방법에 의해 치료된 개체에서 LDL-콜레스테롤 수준은 초기 투여의 약 2주 내에 적어도 약 90 mg/dL 감소되고, 적어도 약 2주 동안 감소된 수준으로 유지된다.
특정 실시양태에서, LDL-콜레스테롤 수준의 감소는 투여 사이에서 특정 범위 내로 유지된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 45%의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 40% 또는 45% 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 50%의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 40%, 45% 또는 50% 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 55%의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 40%, 45%, 50% 또는 55% 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선으로부터 적어도 약 60%의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 초과하여 증가하지 않는다.
특정 실시양태에서, LDL-콜레스테롤 수준의 감소는 투여 사이에서 특정 범위 내로 유지된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선 아래로 적어도 약 60 mg/dL, 적어도 약 70 mg/dL, 적어도 약 75 mg/dL, 적어도 약 80 mg/dL 또는 적어도 약 90 mg/dL의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 55 mg/dL, 60 mg/dL, 65 mg/dL, 70 mg/dL, 75 mg/dL, 80 mg/dL 또는 90 mg/dL 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선 아래로 적어도 약 60 mg/dL의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 55 mg/dL 또는 60 mg/dL 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선 아래로 적어도 약 70 mg/dL의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 55 mg/dL, 60 mg/dL, 65 mg/dL 또는 70 mg/dL 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선 아래로 적어도 약 75 mg/dL의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 55 mg/dL, 60 mg/dL, 65 mg/dL, 70 mg/dL 또는 75 mg/dL 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선 아래로 적어도 약 80 mg/dL의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 55 mg/dL, 60 mg/dL, 65 mg/dL, 70 mg/dL, 75 mg/dL 또는 80 mg/dL 초과하여 증가하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체의 용량의 투여시에, LDL-콜레스테롤 수준은 기준선 아래로 적어도 약 90 mg/dL의 최저점으로 감소되고, 항-PCSK9 항체의 다음 투여 전에 기준선 아래로 약 55 mg/dL, 60 mg/dL, 65 mg/dL, 70 mg/dL, 75 mg/dL, 80 mg/dL 또는 90 mg/dL 초과하여 증가하지 않는다.
한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 대상체에게 8주마다 800 mg의 용량으로 투여되며, 여기서 대상체에서의 LDL-콜레스테롤의 수준은 10일 내에 기준선 아래로 적어도 50% 감소되며, 다음 투여 전에 기준선 아래로 40% 또는 45% 초과하여 증가하지 않는다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 대상체에게 8주마다 760 mg의 용량으로 투여되며, 여기서 대상체에서의 LDL-콜레스테롤의 수준은 14일 내에 기준선 아래로 적어도 45% 감소되며, 다음 투여 전에 기준선 아래로 35% 또는 40% 초과하여 증가하지 않는다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 대상체에게 4주마다 400 mg의 용량으로 투여되며, 여기서 대상체에서의 LDL-콜레스테롤의 수준은 10일 내에 기준선 아래로 적어도 50% 감소되며, 다음 투여 전에 기준선 아래로 45% 또는 50% 초과하여 증가하지 않는다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 대상체에게 4주마다 380 mg의 용량으로 투여되며, 여기서 대상체에서의 LDL-콜레스테롤의 수준은 10일 내에 기준선 아래로 적어도 50% 감소되며, 다음 투여 전에 기준선 아래로 45% 또는 50% 초과하여 증가하지 않는다.
특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체를 제공받는 대상체는 LDL-c 수준에 대해 모니터링되며, 그의 수준이 25 또는 15 mg/dL 아래로 떨어진 경우에, 그의 용량은 투여되는 항체의 전체 양을 투여되는 초기 용량의 대략 50% 또는 25%로 감소시키고 주사 빈도는 동일하게 유지하거나, 투여되는 항체의 전체 양은 동일하게 유지하나 빈도를 2배 또는 4배 감소시키거나 (예를 들어, 4주마다 1회에서 8주마다 또는 16마다 1회로 감소시킴), 또는 이를 조합하여 (예를 들어, 용량을 감소시키고 투여 빈도를 변화시킴) 초기 용량의 대략 50% 또는 25%로 하향 조정된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 800 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여된다. 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 또는 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 400 mg, 16주마다 400 mg, 8주마다 380 mg, 16주마다 380 mg, 8주마다 200 mg, 4주마다 200 mg, 8주마다 190 mg, 4주마다 190 mg, 16주마다 또는 4개월마다 760 mg, 또는 24주마다 또는 6개월마다 760 mg, 또는 16주마다 또는 4개월마다 800 mg, 또는 24주마다 또는 6개월마다 800 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 800 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 200 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 800 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 200 mg의 용량으로 전환된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 760 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여된다. 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 또는 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 380 mg, 16주마다 380 mg, 4주마다 200 mg, 8주마다 200 mg, 8주마다 190 mg, 4주마다 190 mg, 16주마다 또는 4개월마다 760 mg, 또는 24주마다 또는 6개월마다 760 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 760 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 190 mg 또는 200 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 8주마다 760 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 190 mg 또는 200 mg의 용량으로 전환된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여된다. 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 또는 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 200 mg, 8주마다 200 mg, 4주마다 100 mg, 8주마다 400 mg, 16주마다 또는 3개월마다 400 mg, 2주마다 50 mg, 또는 2주마다 25 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 100 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 100 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 200 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 200 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 50 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 50 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 25 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 400 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 25 mg의 용량으로 전환된다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여된다. 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 또는 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 200 mg, 8주마다 200 mg, 4주마다 190 mg, 4주마다 100 mg, 4주마다 90 mg, 8주마다 380 mg, 16주마다 또는 3개월마다 380 mg, 2주마다 50 mg, 또는 2주마다 25 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 100 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 100 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 200 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 200 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 190 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 8주마다 190 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 50 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 4주마다 50 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 25 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 25 mg의 용량으로 전환된다. 한 실시양태에서, 항-PCSK9 항체는 4주마다 380 mg의 초기 용량으로 대상체에게 투여되고, 대상체는 모니터링되며, 대상체의 LDL-c 수준이 15 mg/dL 아래로 떨어지는 경우에, 대상체는 2주마다 25 mg의 용량으로 전환된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-PCSK9 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조품 및 키트
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품 또는 키트가 제공된다. 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 항-PCSK9 항체 또는 조성물 중 하나 이상을 함유하는 용기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥 주사액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항-PCSK9 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품 또는 키트는 (a) 그 내부에, 본 발명의 항-PCSK9 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 용기는 제2 치료제를 포함하며, 여기서 제2 치료제는 "스타틴" 부류의 콜레스테롤-저하 약물이다. 특정 실시양태에서, 스타틴은 아토르바스타틴 (예를 들어, 리피토르(LIPITOR)® 또는 토르바스트), 플루바스타틴 (예를 들어, 레스콜(LESCOL)®), 로바스타틴 (예를 들어, 메바코르(MEVACOR)®, 알토코르(ALTOCOR)™, 또는 알토프레브(ALTOPREV)®), 메바스타틴 (피타바스타틴 (예를 들어, 리발로(LIVALO)® 또는 피타바(PITAVA)®), 프라바스타틴 (예를 들어, 프라바콜(PRAVACHOL)®, 셀렉틴(SELEKTINE)®, 리포스타트(LIPOSTAT)®), 로수바스타틴 (예를 들어, 크레스토르(CRESTOR)®), 심바스타틴 (예를 들어, 조코르(ZOCOR)®, 리펙스(LIPEX)®), 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어 비토린®, 아드비코르® 또는 심코르®이고/거나 이들을 포함한다.
본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품 또는 키트는, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조품 또는 키트는 항-PCSK9 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III . 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1: 항- PCSK9 항체의 생성
잔기 번호는 카바트 (문헌 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])에 따른다.
항- PCSK9 항체를 확인하기 위한 라이브러리 분류 및 스크리닝
내부에서 생성된 비오티닐화 인간 PCSK9를 라이브러리 분류를 위한 항원으로서 사용하였다. 파지 라이브러리를 비오티닐화 PCSK9에 대해 용액 상 중에서 5개 라운드로 분류하였다. 분류의 제1 라운드에서, 20μg/mL의 비오티닐화 PCSK9를 파지 차단 완충제 PBST (포스페이트-완충 염수 (PBS) 및 1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% (v/v) 트윈® 20)로 사전-차단된 항체 파지 라이브러리 VH (예를 들어, 문헌 [Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004] 참조) 및 VH/VL (문헌 [Liang et al., JMB. 366: 815-829, 2007] 참조)에 첨가하고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 다음날 120μl의 PBST/BSA를 사전-흡수된 디나비즈(DYNABEADS)® 마이원(MyOne)™ 스트렙타비딘 T1 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 각각의 라이브러리에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 PBT (0.05% 트윈® 20을 갖는 PBS)로 3회 세척하고, 결합된 파지를 1mL 50mM HCl 및 500mM NaCl로 30분 동안 용리하고, 400μL의 1 M 트리스 염기 (pH7.5)로 중화시켰다. 회수된 파지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 후속 선택 라운드 동안, 항체 파지의 비오티닐화 PCSK9와의 인큐베이션을 2-3시간으로 감소시키고, 파지 결합된 항원을 30분 동안 뉴트라비딘-코팅되거나 (카탈로그 #89890, 10μg/ml, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 매사추세츠주 월섬) 또는 스트렙타비딘-코팅된 (카탈로그 #21125, 10μg/ml, 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 눈크 96 웰 맥시소르프(Maxisorp)™ 이뮤노플레이트 상에 포획하였다. 플레이트 세척의 엄격도를 점차 증가시켰다.
5개 라운드의 패닝 후에, 유의한 풍부화가 관찰되었다. 96개의 클론을 각각 VH 및 VH/VL 라이브러리 분류로부터 선택하여 이들이 인간 PCSK9에 특이적으로 결합하는지 결정하였다. 이들 클론의 가변 영역을 PCR 서열분석하여 특유의 서열 클론을 확인하였다. 인간 PCSK9에 배경의 적어도 5x 초과로 결합하는 특유한 파지 항체를 선택하고, 시험관내 세포 검정에서의 평가를 위해 전장 IgG로 재포맷하였다.
개별 클론의 VL 및 VH 영역을 LPG3 및 LPG4 벡터로 각각 클로닝하고, 포유동물 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 칼럼을 정제하여 관심 클론을 IgG에 대해 재포맷시켰다.
VH 라이브러리 유래의 클론의 친화도 개선을 위한 라이브러리의 구축
모든 CDR-L3 위치에서의 정지 코돈 (TAA)을 함유하고, M13 박테리오파지의 표면 상에 1가 Fab를 디스플레이하는 파지미드 pW0703 (파지미드 pV0350-2b로부터 유래됨 (문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)])은 친화도 성숙을 위한 VH 라이브러리로부터의 관심 클론의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 이식하기 위한 라이브러리 주형으로서의 역할을 하였다. 하드 및 소프트 무작위화 전략 둘 다를 친화도 성숙에 이용하였다. 하드 무작위화의 경우에, 3개의 경쇄 CDR의 선택된 위치를 갖는 1개의 경쇄 라이브러리를 천연 인간 항체를 모방하도록 설계된 아미노산을 사용하여 무작위화하고, 설계된 DNA 축중성은 문헌 [Lee et al. (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))]에 기재된 바와 같다. 소프트 무작위화의 경우에, CDR-L3의 위치 91-96, CDR-H1의 위치 30-33, 35, CDR-H2의 위치 50, 52, 53-54, 56 및 58, CDR-H3의 위치 95-100, 100A 및 100C에서의 잔기를 표적화하고; CDR 루프의 3개의 상이한 조합, H1/L3, H2/L3 및 H3/L3을 무작위화를 위해 선택하였다. 선택된 위치에서 대략 50%의 돌연변이율을 도입하는 소프트 무작위화 조건을 달성하기 위해, 돌연변이유발 DNA를 야생형 뉴클레오티드를 선호하는 염기의 70-10-10-10 혼합물을 사용하여 합성하였다 (문헌 [Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)]).
친화도 개선을 생성하기 위한 파지 분류 전략
친화도 개선 선택을 위해, 파지 라이브러리를 증가하는 엄격도를 갖는 5개 라운드의 용액 분류에 적용시켰다. 용액 분류의 제1 라운드에서, 파지 유입물의 1% BSA 및 0.05% 트윈® 20 중의 3 O.D./ml를 1% 슈퍼블록(SUPERBLOCK)® (피어스 바이오테크놀로지) 및 0.05% 트윈® 20을 함유하는 100μl 완충제 중 100 nM 비오티닐화 PCSK9 (농도는 모 클론 파지 IC50 값을 기반으로 함)와 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 1% 슈퍼블록®으로 추가로 10X 희석하고, 100μl/웰을 30분 동안 실온에서 부드럽게 진탕시키면서 뉴트라비딘-코팅된 웰 (10μg/ml)에 적용하였다. 웰을 PBS-0.05% 트윈® 20으로 10회 세척하였다. 배경 결합을 결정하기 위해, 파지를 함유하는 대조 웰을 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포획하였다. 결합된 파지를 150μl/웰 50mM HCl, 500mM KCl로 30분 동안 용리하고, 후속적으로 50μl/웰의 1M 트리스 pH8에 의해 중화시키고, 적정하고, 다음 라운드를 위해 증폭시켰다. 용액 분류의 추가 4개 라운드를 선택 엄격도를 증가시키면서 함께 수행하였다. 처음 몇 번의 라운드는 100nM에서 1nM으로 비오티닐화 표적 단백질 농도를 감소시킴으로써 회합률을 선택하기 위한 것이었으며, 마지막 2개 라운드는 과량의 비-비오티닐화 표적 단백질 (300 내지 1000배 초과)을 첨가함으로써 실온에서 더 약한 결합제와 경쟁하기 위한 해리율을 선택하기 위한 것이었다.
고처리량 친화도 스크리닝 ELISA (단일 스팟 경쟁)
콜로니를 스크리닝의 제5 라운드로부터 피킹하였다. 콜로니를 96-웰 플레이트 (팔콘(Falcon)) 중 50 μg/ml 카르베니실린 및 1E10/ml KO7을 갖는 150 μl/웰의 2YT 배지에서 밤새 37℃에서 성장시켰다. 동일한 플레이트로부터, XL-1 감염된 모 파지의 콜로니를 대조군으로 피킹하였다. 96-웰 눈크 맥시소르프™ 플레이트를 PBS 중 뉴트라비딘 (10μg/ml) 100μl/웰로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 150μl의 1% BSA 및 0.05% 트윈® 20으로 1시간 동안 차단하였다.
35μl의 파지 상청액을 15nM PCSK9를 갖거나 또는 갖지 않는 35μl의 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정) 완충제 (0.5% BSA, 0.05% 트윈® 20을 갖는 PBS)로 희석하고, 1시간 동안 실온에서 F 플레이트 (눈크) 중에서 인큐베이션되도록 하였다. 이어서, 35μl의 3μg/ml 비오티닐화-PCSK9를 각 웰에 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 95μl의 혼합물을 뉴트라비딘 코팅된 플레이트에 나란히 전달하였다. 플레이트를 15분 동안 비오티닐화-PCSK9 결합된 파지의 플레이트로의 포획이 허용되도록 부드럽게 진탕시켰다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈® 20으로 10회 세척하였다. 결합을 ELISA 완충제 중 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체 (1:2500)를 첨가함으로써 정량하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈® 20으로 10회 세척하였다. 다음에, 웰에 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H2O2) (키르케가드-페리 래보러토리즈(Kirkegaard-Perry Laboratories) (메릴랜드주 게이더스버그)) 100μl/웰을 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 100μl 0.1M 인산 (H3PO4)을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 각 웰 중의 황색의 O.D. (광학 밀도)를 결정하였다. O.D. 감소 (%)를 다음 식에 의해 계산하였다:
OD450nm 감소 (%) = [(경쟁자를 갖는 웰의 OD450nm) / (경쟁자를 갖지 않는 웰의 OD450nm)]*100
모 파지의 웰의 OD450nm 감소 (%) (100%)와 비교하여, 50%보다 낮은 OD450nm 감소 (%)를 갖는 클론을 서열 분석을 위해 피킹하였다. 특유한 클론을 파지 제조를 위해 선택하여 모 클론 (클론 508.20b)과의 비교에 의해 PCSK9에 대한 결합 친화도 (파지 IC50)를 결정하였다. 이어서, 가장 친화도-개선된 클론 (508.20.04b, 508.20.06, 508.20.28b, 508.20.33b 및 508.20.84)을 항체 생산 및 추가의 비아코어 결합 동역학적 분석 및 다른 시험관내 또는 생체내 검정을 위해 인간 IgG1로 재포맷시켰다. 도 1 및 2를 참조한다.
실시예 2: 비아코어에 의한 항- PCSK9 항체의 특성화
항-PCSK9 항체의 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명 (SRP)에 의해 비아코어™-3000 기기를 사용하여 측정하였다. 항-PCSK9 인간 항체를 대략 200 반응 단위 (RU)를 달성하기 위해 CM5 바이오센서 칩 상에 코팅된 마우스 항-인간 Fc 항체 (카탈로그 # BR-1008-39, 지이 헬스케어(GE Healthcare), 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 포획하였다. 동역학적 측정을 위해, 인간, 뮤린, 레서스 및 시노 PCSK9 (제넨테크, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)의 2배 연속 희석액 (500nM에서 0.245nM)을 PBT 완충제 (0.05% 트윈® 20을 갖는 PBS) 중에 25℃에서 30μl/분의 유량으로 주사하였다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)를 비 koff/kon으로 계산하였다. 도 3을 참조한다.
실시예 3: LDLR - PCSK9 결합 검정
경쟁 결합 ELISA를 LDLR에 대한 인간 PCSK9 결합의 차단에 있어서 항-PCSK9 항체의 활성을 조사하기 위해 수행하였다. 간략하게, 1 μg/mL의 가용성 인간 LDLR 세포외 도메인 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)을 384-웰 맥시소르프™ 플레이트 (날진(NALGENE)® 눈크™ 인터내셔널, 뉴욕주 로체스터) 상에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 0.25 μg/mL의 비오티닐화 인간 PCSK9를 상이한 농도의 항-PCSK9 항체와 사전-혼합하고, 대조 항체를 플레이트에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 코팅된 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 스트렙타비딘-HRP (지이 헬스케어) 및 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMBE-1000, 모스, 인크.(Moss, Inc.), 메릴랜드주 파사데나)을 첨가함으로써 검출하였다. 결합 결과 (OD)를 항체 농도에 대해 플롯팅하고, IC50 값을 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 소프트웨어를 이용하여 생성하였다. 도 4를 참조한다.
실시예 4: 항체는 HepG2 세포 상에서 LDLR 하향조절을 방지한다
HepG2 세포를 1 x 105개로 48-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 배지를 10% 지단백질 결핍 혈청 (LPDS, 메릴랜드주 프레데릭)으로 변경하였다. 다음날, 15 μg/ml PCSK9 플러스/마이너스 항-PCSK9 항체를 세포에 4시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 세포를 PBS로 세정하고, 2.5 mM EDTA를 사용하여 분리하였다. 세포를 1:20 항-LDLR (프로젠 바이오테크닉(Progen Biotechnik), 독일 하이델베르크)과 15분 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, 1:200 염소 항-마우스의 알렉사플루오르(ALEXAFLUOR)® 488 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)과 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, PBS 플러스 10 μg/ml 아이오딘화프로피듐에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 이중 레이져 유동 세포측정기 (팩스캔(FACScan)™, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 뉴저지주 프랭클린 레이크스)로 분석하였다. 데이터는 모든 5개의 항-PCSK9 항체 (508.20.04b, 508.20.06, 508.20.28b, 508.20.33b 및 508.20.84)가 LDLR의 하향조절을 방지한다고 제안한다. 도 5를 참조한다.
실시예 5: 마우스 간에서의 LDLR 하향조절
정상 C57/BL6 마우스 (찰스 리버(Charles River), 매사추세츠주 윌밍톤)를 3, 30 또는 60 μg의 PCSK9로 I.V. 투여에 의해 처리하였다. 제조업체의 지침에 따라 칼바이오켐(Calbiochem) (뉴저지주 깁스타운)으로부터의 프로테오익스트랙트(PROTEOEXTRACT)® 천연 막 단백질 추출 키트를 사용하여, 각 마우스로부터의 간을 PCSK9 I.V. 투여 후 15분, 1시간 또는 4시간에서 수확하고, 단백질을 추출하였다. 대조군으로서, 5마리의 마우스를 비히클 단독으로 처리하고, 8 μg의 각각의 간 용해물을 분석을 위해 모았다. 용해물을 SDS-PAGE에 의해 8% 트리스-gly 겔 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 상에서 분석하였다. 단백질을 아이블롯(IBLOT)® (인비트로젠)을 사용하여 니트로셀룰로스 막에 전달하였다. 막을 5% 무지방 유액으로 1시간 동안 차단하고, 이어서 1:500 항-LDLR (압캠(Abcam), 매사추세츠주 캠브리지)과 5% 무지방 유액 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 막을 TBS-T로 3회 세척하고, 1:5000 항-토끼 HRP (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이)와 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS-T로 3회 세척하였다. 단백질을 ECL-플러스(ECL-Plus) (지이 헬스케어)를 사용하여 시각화하고, XAR 필름 (코닥(KODAK)®, 뉴욕주 로체스터)에 노출시켰다. 밤새 노출 후, 막을 TBS-T로 세척하고, 1:500 항-트랜스페린 수용체 항체 (인비트로젠)와 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS-T로 세척하고, 1:5000 항-마우스 HRP (지이 헬스케어)와 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS-T로 세척하고, ECL-플러스로 시각화하였다. 항-LDLR 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 30 μg의 PCSK9가 1시간 동안 마우스 간에서 LDLR 수준을 유의하게 하향조절하였다는 것을 보여준다. 도 6을 참조한다.
실시예 6: 항체는 간 LDLR 하향조절을 방지한다
정상 C57/BL6 (찰스 리버) 마우스를 비히클 또는 5 mg/kg 항-PCSK9 항체로 30 μg PCSK9로의 처리 24시간 전에 1시간 동안 주사하였다. 각 마우스로부터의 간을 제조업체의 지침에 따라 프로테오익스트랙트® 천연 막 단백질 추출 키트 (칼바이오켐)를 사용하여 수확하였다. 용해물을 8% 비스-트리스 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질을 아이블롯® (인비트로젠)을 사용하여 니트로셀룰로스 막에 전달하였다. 막을 5% 무지방 유액으로 1시간 동안 차단하고, 이어서 1:500 항-LDLR (압캠)과 5% 무지방 유액 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 막을 TBS-T로 3회 세척하고, 1:5000 항-토끼 HRP (지이 헬스케어)와 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS-T로 3회 세척하였다. 단백질을 ECL-플러스 (지이 헬스케어)를 사용하여 시각화하고, XAR 필름 (코닥®)에 노출시켰다. 항-LDLR 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 모든 5개의 항-PCSK9 항체 (508.20.84, 508.20.33b, 508.20.04b, 508.20.28b, 508.20.06)는 마우스 간에서 LDLR 하향조절을 방지하였다는 것을 보여준다. 도 7을 참조한다.
실시예 7: 항- PCSK9 항체의 약동학
마우스 PK 연구 샘플에서의 항-PCSK9 항체 농도를 항-인간 IgG Fc ELISA를 사용하여 결정하였다. 간략하게, 당나귀 항-인간 IgG Fc (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 검정 플레이트를 코팅하기 위해 사용하고, 염소 항-인간 IgG Fc HRP 접합체 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 검출 항체로서 사용하였다. 검정은 0.31 - 20 ng/mL의 검정 범위를 갖는 최대 10%의 마우스 혈청 매트릭스에서 항-PCSK9 항체를 측정할 수 있었다. 도 8 및 9를 참조한다.
시노몰구스 원숭이 PK 연구 샘플에서의 혈청 항-PCSK9 항체 농도를 항-PCSK9 항체 ELISA에 의해 포획체로서 재조합 인간 PCSK9 (제넨테크, 인크. 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) 및 검출 항체로서 염소 항-인간 IgG (H+L) HRP를 사용하여 결정하였다. 검정은 0.313-50 ng/mL의 검정 범위를 갖는 최대 2%의 시노몰구스 원숭이의 혈청 매트릭스에서 항-PCSK9 항체를 측정할 수 있었다. 도 10 및 11을 참조한다.
실시예 8: 항체는 마우스에서 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시킨다
8주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)로부터 상업적으로 구입하였다. 마우스를 실험 개시 전에 1주 동안 대기실에서 사육하였다. 모든 마우스를 마취 하에 사전-채혈하고, 마우스로부터의 총 콜레스테롤 수준을 인피니티(INFINITY)™ 콜레스테롤 시약 (피셔 디아그노스틱스(Fisher Diagnostics), 버지니아주 미들타운)을 사용하여 결정하였다. 동일한 수준의 평균 콜레스테롤 수준을 갖는 마우스를 6개의 상이한 군으로 무작위화하였다. 모든 마우스는 대조 항체 또는 항-PCSK9 항체의 10mg/kg 체중의 단일 용량을 투여받았다. 마우스를 제3일, 제7일, 제10일 및 제15일에서 채혈하고, 혈청 총 콜레스테롤 수준을 인피니티™ 콜레스테롤 시약 (피셔 디아그노스틱스, 버지니아주 미들타운)을 사용하여 결정하였다.
모든 5개의 항-PCSK9 항체 (508.20.04b, 508.20.06, 508.20.28b, 508.20.33b, 508.20.84)는 10mg/kg의 단일 용량이 투여된 경우에 총 콜레스테롤 수준의 감소를 나타내었다. 항-PCSK9 항체의 투여는 대조 항체를 제공받은 마우스와 비교한 경우에 제3일에 및 제10일까지 총 콜레스테롤 수준의 유의한 감소를 발생시켰다. 도 12를 참조한다.
실시예 9: 스타틴 유효성의 증진
이 실험은 항-PCSK9 항체 및 스타틴의 조합은 항-PCSK9 항체 단독 또는 스타틴 단독 처리와 비교하여 총 콜레스테롤 수준의 더 큰 감소를 발생시킨다는 것을 입증한다. 예를 들어, 도 13을 참조한다. 8주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 잭슨 래보러토리로부터 구입하였다. 마우스를 2개의 상이한 군으로 분류하였다. 비-스타틴 마우스는 대조 식이를 투여받은 반면, 스타틴 군은 식이 중의 0.2%의 로바스타틴을 항체 투여 전에 2주 동안 투여받았다 (바이오서브(Bioserve), 뉴저지주 프렌치타운). 모든 마우스를 사전-채혈하고, 마우스를 동일한 평균 콜레스테롤 수준을 기반으로 무작위화하였다. 마우스를 제3일에 채혈하고, 총 콜레스테롤 수준을 인피니티™ 콜레스테롤 시약 (피셔 디아그노스틱스, 버지니아주 미들타운)을 사용하여 검정하였다.
항-PCSK9 항체는 유의한 콜레스테롤 저하 효과를 나타내었다. 스타틴 단독 치료는 비-스타틴 군과 비교하여 총 콜레스테롤 수준의 중간 정도의 감소를 발생시켰다. 스타틴 플러스 항-PCSK9 항체의 조합은 항-PCSK9 단독과 비교하여 총 콜레스테롤 수준의 추가의 감소를 발생시켰다. 도 13을 참조한다.
실시예 10: 항- PCSK9 항체의 Fab 단편에 결합된 PCSK9 의 X선 결정 구조
단백질 정제 및 결정화
10 L 이. 콜라이 발현으로부터의 210 g의 동결된 세포 페이스트를 1 L의 용리 완충제 (PBS/25mM EDTA/1mM PMSF)에서 해동시켰다. 세포를 티슈마이저(Tissuemizer) (30초)에 의해 파괴하고, 생성된 슬러리를 마이크로플루이다이저를 통해 2회 통과시켰다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 정화된 용리액 (한 번에 250 mL)을 단백질 G 칼럼 (카탈로그#17-0618-05, 지이 헬스케어) 상에 5 mL/분으로 로딩하였다. 이어서, 칼럼을 100 mL의 용리 완충제로 세척한 후에 항-PCSK9 항체의 결합된 Fab 단편을 150 mL의 용리 완충제 (0.58% 아세트산)로 용리시켰다. 25 mL 분획을 용리 동안 수집하였다. 항-PCSK9 항체의 Fab 단편을 함유하는 분획을 SDS PAGE 분석 후에 모았다.
5 mL의 예비패킹된 SPHP 칼럼 (지이 헬스케어, 카탈로그# 17-1152-01)을 50ml의 완충제 A (20mM MES pH5.5)로 평형화시켰다. 이전 단계로부터의 모은 분획을 칼럼 상에 3 mL/분으로 로딩하였다. 칼럼을 완충제 A로 기준선으로 세척하였다. 결합된 Fab 단편을 20 칼럼 부피의 0%에서 100% 완충제 B로의 구배를 사용하여 완충제 B (20mM MES pH 5.5, 1M NaCl)로 용리하였다. 2 mL 분획을 용리 동안 수집하였다. 단백질을 함유하는 분획 (SDS-PAGE를 이용하여 결정됨)을 모으고, 5 mL로 농축시킨 후에 사이징(sizing) 완충제 (20 mM 헤페스 7.2, 150 mM NaCl)로 사전-평형화된 320 mL S75 겔 여과 칼럼 상에 로딩하였다. 사이징 완충제는 2 mL 분획을 수집하면서 연속적으로 1.5 mL/분으로 220분 동안 전개시켰다. 피크 분획 (A280)을 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.
히스티딘 (His)8 C-말단 태그 (서열 32)를 함유하는 인간 PCSK9 (진뱅크(Genbank) EF692496) 상보적 데옥시리보핵산 (cDNA)을 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 갖는 포유동물 발현 벡터 (pRK5) 내에 삽입하였다. 단백질을 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현시키고, 조건화 배지로부터 니켈-니트릴로트리아세틱-아가로스 칼럼 (퀴아젠(Qiagen)) 상에서 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하고, 이어서 세파크릴(SEPHACRYL)® S-200 칼럼 (지이 헬스케어) 상에서 겔 여과를 수행하였다. 정제된 단백질의 올바른 질량을 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 확인하고, 아미노산 서열의 정확도를 N-말단 서열분석에 의해 확인하였다.
항-PCSK9 항체의 정제된 Fab 단편 및 6.9 mg의 PCSK9 단백질을 2배 몰 과량의 Fab 단편과 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 5 mL로 농축시켰다. 이어서, 농축된 혼합물을 사이징 완충제로 사전-평형화된 슈퍼덱스(Superdex) 200 크기 배제 칼럼 (카탈로그# 17-1071-01, 지이 헬스케어) 상에 로딩하였다. 사이징 완충제는 2 mL 분획을 수집하면서 연속적으로 1.5 mL/분으로 220분 동안 전개시켰다. PCSK9 및 항-PCSK9 항체의 Fab 단편 둘 다를 함유하는 피크 분획 (A280) (SDS-PAGE)을 모으고, 20 mg/mL로 농축시켰다. 이어서, 농축된 복합체를 결정화 시험을 확립하기 위해 사용하였다. 초기 결정을 pH 7의 1.3 M 칼륨/나트륨 포스페이트를 함유하는 단백질 및 저장소 사이의 1:1 혼합물로부터 시팅 드롭(sitting drop)을 이용하여 형성하였다. 결정체를 변화하는 단백질:저장소 비율에 의해 행잉 드롭(hanging drop)에서 최적화하였다. 선택된 결정체를 25% 글리세롤로 보충된 모액으로 처리하고, 액체 질소 내에 보존하였다.
항- PCSK9 항체 복합체의 PCSK9 : Fab 단편의 구조 결정
약 3.5 Å 해상도로 연장된 회절 데이터를 싱크로트론 빔라인 SSRL 7-1에서 수집하고, 공간 군 I222에서 통합되고 스케일링되었다. 대략적인 상을 PCSK9의 이전에 보고된 구조 (문헌 [Hampton et al., PNAS 104:14609-9 (2007)], pdb 등록 코드 2QTW) 및 항체 Fv 단편의 이전에 보고된 구조 (문헌 [Eigenbrot et al., J Mol Biol 229:969-95 (1993)], pdb 등록 코드 1FVC)를 사용하여 분자 대체의 방법에 의해 수득하였다. 항-PCSK9 항체의 Fab 단편의 불변 영역을 부분적 정밀화가 상을 개선시킨 후 이전에 보고된 상동 구조 (문헌 [Eigenbrot et al. 상기 문헌], pdb 등록 코드 1FVD)의 부분을 사용하여 강체로서 위치시켰다. 최종 정밀화된 구조는 25 & 30%의 결정학적 R-값을 가졌다. 데이터 수집 및 정밀화 통계는 하기 표 1에 나타낸다.
Figure pct00008
X선 구조로부터의 PCSK9 상의 에피토프의 결정
4 Å 기준을 분자 분석 프로그램 PyMOL을 사용하여 적용하였다. 항-PCSK9 항체의 Fab 단편의 임의의 부분의 4 Å 내의 PCSK9 잔기를 에피토프로서 결정하였다. 분석을 기반으로 하여, 에피토프는 하기 잔기 중 하나 이상을 포함한다: 인간 PCSK9의 R194, E195, D238, A239, A341, Q342, E366, D367, I369, S376, T377, C378, F379, S381 및 H391.
실시예 11: 인간 임상 시험, 단일 및 다중 상승적 용량
무작위화된 이중-맹검의 위약-제어된 단일 및 다중 용량 연구를 수행하여 상승된 혈청 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-c) 농도로 건강한 지원자에게 피하 (SC) 주사에 의해 투여된 연구 약물 (서열 35를 갖는 중쇄 및 서열 36을 갖는 경쇄를 갖는 인간 IgG1로 재포맷된 YW508.20.33b)의 단일 및 다중 (4주마다) 용량의 안전성 및 허용성을 주로 평가하였다. 상승된 혈청 LDL-c 농도 (130-220 mg/dL)를 갖는 80명의 건강한 성인 지원자 (남성 및 여성)를 각각 8명의 대상체를 함유하는 10개의 코호트로 무작위화하였다. 각 코호트의 대상체를 무작위화하여 연구 약물 또는 위약 (코호트 당 6명 활성 및 2명 위약 대상체)을 제공하였다.
코호트에 도 14 및 표 2에 제시된 바와 같이 투여하였다. 모든 용량은 전형적으로 복부 또는 대퇴부에 시린지를 사용하여 피하로 투여하였다. 약물 제품을 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% 폴리소르베이트 20, pH 5.5 중 150 mg/mL 항체로서 제제화하였다. 다중 용량 코호트의 경우에, 연구 약물을 연속 4주 동안 1주에 1회 투여하였다. 스타틴 코호트 (H 및 I)에는 처음에 아토르바스타틴을 20 mg으로 적어도 7일 동안 1일에 1회 경구로 투여한 후에, 안전성 및 내약성 평가를 수행하였다. 20 mg 용량이 내약성이 우수하다면, 용량을 일일 40 mg으로 증가시키고, 제1일에 연구 약물의 개시 전에 최소 21일 동안 계속하였다. 코호트 H 및 I의 대상체에게 제35일까지 (제35일 포함) 아토르바스타틴 (일일 40 mg PO)을 계속 제공하였다. 직접적 LDL-c 수준이 연구 동안 임의의 지점에서 25 mg/dL 아래로 떨어진 임의의 대상체는 치료를 중단하였다.
Figure pct00009
대상체는 연구 약물의 개시 후에 8 내지 16주 동안 빈번하게 안전성, PK 및 PD 평가를 받았다. 하기 데이터를 평가하였다: 안전성 결과 (유해 사례, 혈액학, 임상 화학 및 요분석에서의 이상, 및 항-치료 항체의 발생), 약동학 (PK) 프로파일 (Cmax, 총 혈청 겉보기 클리어런스 (CL/F), 분포의 겉보기 부피 (V/F), 총 노출 (AUC), tmax, t1 /2, 및 용량 비례성 (AUC에 기초함) 포함), 약역학 결과 (단일 용량 코호트에서는 제15일 및 다중 용량 코호트에서는 제36일에서 LDL-c의 기준선으로부터의 퍼센트 및 절대 감소), 및 총 콜레스테롤, LDL-c, HDL-c, 비-HDL-c, 트리글리세리드 및 지질 입자 하위분획의 시간 경과에 따른 기준선으로부터의 퍼센트 및 절대 변화.
연구로부터의 초기 결과는 유해 사례의 약물-관련된, 임상적으로 유의한 패턴을 확인하지 않았다. 심각하거나 또는 심한 유해 사례, 유해 사례에서의 중단, 및 용량-제한 독성은 나타나지 않았다. 시험된 용량은 최대 허용되는 용량을 정의하지 않는다. 2가지 중간 정도의 유해 사례가 보고되었다: 1명의 두통 (10-mg 단일 용량 코호트에서 연구 약물-치료된 대상체) 및 1명의 요골 골절 (600-mg 단일 용량 코호트에서 연구 약물-치료된 대상체). 모두 다중 용량 코호트에 있으며 수반되는 아토르바스타틴을 사용하여 치료되는 5명의 연구 약물-치료된 대상체는 LDL-c 수준이 25 mg/dL의 프로토콜-명시된 역치 아래이기 때문에 연구 약물 요법을 중단하였다. 이들 대상체에서 연관된 유해 사례는 나타나지 않았다.
도 15 (좌측 패널)에 나타난 바와 같이, 연구 약물의 경우에 10-600 mg의 노출에서 용량 관련된 증가가 존재하였다. PK의 차이는 스타틴 처리된 및 비처리된 군 사이에서 관찰되지 않았다 (도 15, 우측 패널). 5.94 ug/mL의 Km에서의 연구 약물의 포화가능한 클리어런스가 존재하였다.
도 16-19 및 표 3 및 4에 나타난 바와 같이, 연구 약물은 단독으로 및 스타틴과 조합하여 건강한 지원자에서 임상적으로 의미있는 LDL-c 감소를 발생시켰다. 약역학 (PD) 데이터는 10 mg 단일 용량 코호트를 제외하고 모든 코호트에서 통계적으로 유의한 LDL-c의 용량-의존성 감소를 보여주었다. LDL-c는 160-170 mg/dL의 평균 기준선 LDL-c로부터 최고 용량 군 (단일 용량 코호트에서 300-800 mg)에서 80-90 mg/dL 감소하였다. LDL-c 수준의 유사한 감소가 아토르바스타틴 (코호트 H 및 I) 및 비-스타틴 코호트 사이에서 보였다 (코호트 F 및 G) (도 18 및 19 및 표 3 및 4 참조). 코호트 I 및 G (제10일) 및 F 및 H (제36일) 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않다. 도 16 및 17에 나타난 바와 같이, 용량 ≥ 300 mg에서, 최대 LDL-c 효과는 포화상태인 것으로 보이지만 효과의 지속기간은 연장된다. 데이터는 매월 또는 덜 빈번한 투여를 뒷받침한다.
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실시예 12: 관상동맥 심장 질환 ( CHD )을 갖거나 또는 CHD 의 위험이 높은 환자에서의 인간 임상 시험
연구 약물 (서열 35를 갖는 중쇄 및 서열 36을 갖는 경쇄를 갖는 인간 IgG1로 재포맷된 YW508.20.33b)의 무작위화된 이중-맹검의 위약-제어된 연구는 90-250 mg/dL의 LDL-c 수준 및 관상동맥 심장 질환 (CHD) 또는 CHD 위험 등가상태를 갖는 환자에서 상위 치료 기준 (SOC) 스타틴에 대한 연구 약물의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 수행될 것이다. 90-250 mg/dL의 혈청 LDL-c 농도 및 CHD 또는 CHD 위험 등가상태를 갖는 대략 224명의 환자 (성인 남성 및 여성)는 하기 표 5에 제시된 바와 같이 연구 약물이 투여될 5개의 연구 아암 또는 위약 아암 중 하나로 무작위화될 것이다. 모든 용량은 시린지를 사용하여 피하로 투여될 것이다. 약물 제품은 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% 폴리소르베이트 20, pH 5.5 중 150 mg/mL 항체로 제제화된다.
Figure pct00012
연구는 스크리닝 (0-4주), 조정 (0-6주, 필요한 경우), 치료 (24주; 1-169일) 및 추적 (12주)을 위한 연속적 기간을 포함할 것이다. 추적 기간의 말기에서의 연구 완료 방문 (제253일)은 연구 약물의 최종 투여 16주후 (제141일)에 일어날 것이다. 모든 환자는 치료 할당에 관계없이 스타틴이 불내성이지 않는 한 스타틴을 포함한 SOC 치료를 받을 것이다. 모든 환자는 이들이 조정 기간 동안 및 등록시에 제공받았던 것과 동일한 용량에서 치료 및 추적 기간 전반에 걸쳐 SOC 스타틴 요법을 지속적으로 받을 것이다. 다른 처방 및 비처방 (OTC) 지질-변형 요법은 허용되지 않는다. 스크리닝 시점에 안정한 용량의 SOC 스타틴 요법 (또는 스타틴 없음 및 2가지 이상의 스타틴의 기록된 불내성을 가짐)을 받고 적어도 4주 (또는 피브레이트의 경우에 6주) 동안 다른 지질-변형 요법을 받지 않은 환자는 조정 기간을 필요로 하지 않을 것이다.
환자는 제169일에 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 절대 변화에 기초하여 효능을 결정하기 위해 모니터링될 것이다. 또한, 환자는 각각의 아암에 대해 그 아암에 대한 최저점에서 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 절대 변화; 연속적 LDL-c 측정 사이의 주수에 의해 칭량된, 제169일까지의 각각의 아암에 대한 LDL-c의 변화 (절대 및 퍼센트 변화)의 시간 경과에 따른 평균 값; 각각의 아암에 대한 제169일 및 최저점에서의 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 퍼센트 변화; 모든 다른 지정된 시점에서의 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 퍼센트 및 절대 변화; 및 각각의 아암에 대한 제169일 및 최저점에서의 총 콜레스테롤, 비-HDL-c 및 아포지단백질 B의 기준선으로부터의 퍼센트 및 절대 변화를 포함하는 2차 효능 결과를 결정하기 위해 모니터링될 것이다. 최종적으로, 환자는 또한 유해 사례의 발생, 특성 및 중증도; 연구 약물 투여 동안 및 그 후에 활력 징후, 신체 소견 및 임상 실험실 결과의 변화의 발생 및 특성; 및 연구 약물에 대해 지시된 항-치료 항체의 발생을 포함하여 안전성에 대해 모니터링될 것이다.
저 LDL-c 값의 안전성을 맹검, 탐색적 방식으로 정기적으로 평가하였다. < 15 mg/dL의 2개의 연속적 LDL-c 값을 갖는 환자에게는 연구 약물을 제공하지 않을 것이다. 이는 유해 사례로 간주되지 않을 것이다. 이러한 환자는 대신 이들 환자를 최저 투여량 (8주마다 200 mg)으로 전환시킨 후에 LDL-c가 ≥ 50 mg/dL로 증가할 때까지 맹검 방식으로 위약을 사용하여 치료될 것이다. 모든 용량의 활성 약물 또는 위약은 연구 약물 투여 스케줄에 따라, 즉 오직 제1일, 제29일 (± 2일), 제57일 (± 2일), 제85일 (± 2일), 제113일 (± 4일) 및 제141일 (± 4일)에 제공될 것이다.
1차 효능 결과 척도는 제169일에서의 LDL-c의 기준선으로부터의 변화이다. 기준선 LDL-c는 연구 약물의 첫번째 투여 전에 수집된 마지막 2회의 측정치의 평균으로서 정의된다. 연구 약물 용량 사이 및 각각의 연구 약물 용량 및 위약 사이의 치료 비교는 공분산 분석 (ANCOVA)에 기초할 것이며, 이는 2가지 공변량: 기준선 LDL-c 농도 (< 120 mg/dL, ≥ 120 mg/dL) 및 당뇨병 상태 (예, 아니오)를 조정하는 선형 회귀 모델을 통해 수행될 것이다. ANCOVA 모델로부터 신뢰 구간 뿐만 아니라 최소-제곱 추정값을 사용하여 연구 결과의 해석을 도울 것이다.
적격성 기준은 유럽 심장 학회 (ESC)/유럽 아테롬성동맥경화증 학회 (EAS) 및 국립 콜레스테롤 교육 프로그램 성인 치료 패널 III (NCEP ATP III) 지질-저하 가이드라인에서의 위험 기준을 기반으로 높은 심혈관 및 CHD 위험을 갖는 환자의 집단을 규정한다. 이러한 연구는 이들 가이드라인에 따라 70 mg/dL의 치료 표적 LDL-c 수준에 적격인 환자, 그러나 SOC가 불충분하거나 또는 스타틴이 불내성이기 때문에 SOC 스타틴 요법에도 불구하고 이러한 목적에 다다르지 못한 환자의 등록을 돕는다. 이러한 환자는 추가의 안전하고 효과적인 LDL-c-저하 요법을 필요로 한다.
CHD는 기록된 심근경색 병력, 이전의 관상동맥 재혈관화 절차 (경피 관상동맥 개입 또는 관상 동맥 우회로 이식), 또는 ≥ 50% 직경 협착을 갖는 적어도 하나의 관상동맥 아테롬성동맥경화성 병변을 입증한 이전의 관상동맥 혈관조영 (침습적 관상동맥 혈관조영 또는 심장 컴퓨터 단층촬영 관상동맥 혈관조영)을 지칭한다.
CHD 위험-등가 상태는 다음 중 적어도 하나이다:
1. 하나 이상의 형태의 임상적 아테롬성동맥경화성 질환:
a. 말초 동맥 질환 (이전에 기록된 발목/상완 혈압 지수 < 0.85, 이전의 경피 또는 외과적 말초 동맥 재혈관화 절차, 말초 동맥 질환으로 인한 하지의 이전의 비-외상성 절단, 또는 이전의 혈관 영상화 상의 ≥ 50% 직경 협착),
b. 경동맥 질환 (영상화 상에서 ≥ 50% 직경 협착을 갖는 이전에 기록된 경동맥 아테롬성동맥경화성 병변 또는 이전의 피부 또는 외과적 경동맥 재혈관화 절차),
c. 연구자의 견해에서 심장 기원의 색전증 (예를 들어, 심방 세동, 판막성 질환 또는 좌심실 벽성 혈전증)으로 인한 것이 아닌, CT 또는 MRI 뇌 영상화에 의해 기록된 이전의 허혈성 졸중, 또는
d. 이전에 외과적 또는 혈관내 복구가 있었던 복부 대동맥류.
2. 제2형 당뇨병,
3. 표적 기관 손상 (연구자에 의해 결정된 바와 같은, 망막병증, 신경병증, 또는 미세알부민뇨를 포함하는 신병증)을 갖는 제1형 당뇨병,
4. 중간 정도 내지 중증의 만성 신장 질환 (스크리닝 실험실을 포함하여 적어도 3개월에 걸친 적어도 3회의 측정 상에서 신질환에서의 식이 변형(Modification of Diet in Renal diseases) 방정식을 이용하여 15-60 mL/분/1.73 m2의 추정된 사구체 여과율에 의해 명시됨), 또는
5. 하기 열거된 CHD 위험 인자 및 CHD 사건 ≥ 20%의 절대 10-년 위험 (프레이밍햄(Framingham) 위험 스코어의 국립 콜레스테롤 교육 프로그램 성인 치료 패널 III 가이드라인 변형에 의해 결정된 바와 같음) 또는 첫번째 치명적 아테롬성동맥경화성 사건 ≥ 10%의 10-년 위험 (전신 관상동맥 위험 평가 시스템에 의해 결정됨) 중 2가지 이상:
a. 남성의 경우에 ≥ 45세 또는 여성의 경우에 ≥ 55세의 연령,
b. 최근 흡연 (1개월 이내),
c. 고혈압 (스크리닝 수축기 혈압 ≥ 140 mmHg, 확장기 혈압 ≥ 90 mmHg, 또는 고혈압을 치료하기 위한 항고혈압제 의약의 사용)
d. 저 HDL 콜레스테롤 (< 40 mg/dL), 또는
e. 조기 CHD의 가족력 (남성 일차친척 < 55세 또는 여성 일차친척 < 65세에서의 심근경색 또는 관상동맥 재혈관화).
치료 기준 스타틴 요법은 하기 조건 중 하나를 만족시키는 요법을 지칭한다: (1) 고용량 심바스타틴 (일일 40 mg), 아토르바스타틴 (일일 40-80 mg), 또는 로수바스타틴 (일일 20-40 mg), (2) 저용량 심바스타틴, 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 및 고용량의 해당 스타틴 또는 임의의 용량의 또 다른 스타틴의 기록된 불내성, (3) 다른 스타틴 (임의의 용량) 및 심바스타틴, 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 (임의의 용량)의 기록된 불내성, 또는 (4) 스타틴 없음 및 적어도 2가지 스타틴 (임의의 스타틴, 임의의 용량)의 기록된 불내성.
당뇨병 상태는 환자 의료 기록 또는 병력, 또는 스크리닝 실험실 시험 결과에 따라 하기 중 어느 하나의 존재에 기초하여 결정될 것이다: (1) HbA1c > 6.5%, (2) 공복 혈장 글루코스 ≥ 126 mg/dL (7.0 mmol/L), (3) 경구 글루코스 내약성 시험 (이 시험은 물에 용해된 75 g 무수 글루코스 당량을 함유하는 글루코스 부하를 사용하여 세계 보건 기구에 의해 기재된 바와 같이 수행해야 함) 동안 이전 2시간의 혈장 글루코스 ≥ 200 mg/dL (11.1 mmol/L), 또는 (4) 현재 당뇨병 진단을 위해 경구 또는 주사가능한 요법이 진행 중임.
실시예 13: 안정한, 고농도 항체 제제의 개발
초기 임상 연구 (실시예 11 및 12 참조)를 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 5.5 중 150 mg/mL 항체로 제제화된 항-PCSK9 항체의 제제 (서열 35를 갖는 중쇄 및 서열 36을 갖는 경쇄를 갖는 인간 IgG1로 재포맷된 YW508.20.33b)를 사용하여 수행하였다. 그러나, 보다 높은 단백질 농도 (≥200 mg/mL) 및 증가된 안정성을 갖는 제제가 매월 또는 보다 적은 빈도로 전달될 수 있는 보다 높은 피하 용량의 투여를 용이하게 하는데 바람직하였다.
항- PCSK9 제제의 점도
200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% (w/v) PS20, pH 5.5 항-PCSK9 제제의 점도를 다양한 단백질 농도에서 평가하였다. 각 단백질 농도에서, 점도를 5, 15, 25 및 40℃에서 레오미터 (안톤 파르 피지카 MCR 501(Anton Paar Physica MCR 501))를 이용하여 1000 1/s의 전단 속도로 측정하였다.
점도는 약물 용액의 피하 투여에 중요한 파라미터이다. 시린지를 사용하는 피하 전달의 경우에 바람직한 점도 한계는 주위 온도에서 <10 cP이다. 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% (w/v) PS20, pH 5.5 중 100 내지 300 mg/mL에서의 항-PCSK9의 점도가 표 6에 제시된다. 항-PCSK9의 경우에, 점도는 단백질 농도 및 온도 의존성이다. 단백질 농도가 증가할수록, 점도가 또한 증가한다. 그러나, 각 농도에서, 점도는 온도 증가에 의해 낮아질 수 있다. 단백질 농도를 200 mg/mL 초과로 증가시킴으로써, 항-PCSK9의 점도가 기하급수적으로 증가하였다 (도 20). 따라서, 200 mg/mL에서의 항-PCSK9를 표적 농도로 선택하였다.
Figure pct00013
교반 연구
교반 연구를 수행하여 200 mM 아르기닌 숙시네이트, pH 5.5 중 150 mg/mL의 항-PCSK9의 응집을 방지하거나 또는 최소화하는데 요구되는 계면활성제의 최소량을 평가하였다. 폴리소르베이트 20 (PS20)을 제제에 첨가하여 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 및 0.1% (w/v)의 농도를 달성하였다. 모든 샘플을 멸균 여과하고, 0.5 mL의 각 샘플을 2-cc 유리 바이알에 채웠다. 샘플을 50 사이클/분으로 글라스-콜(Glas-Col) 벤치탑 진탕기를 이용하여 교반하면서 실온 (RT)에서 24시간 동안 샘플을 11 cm 변위시켰다. 상응하는 배위의 적절한 샘플 대조군 (진탕시키지 않음)을 진탕기의 동일한 부근에 배치하였다. 모든 샘플을 크기 배제 크로마토그래 (SEC) 및 340-360 nm 흡광도 (abs)에서의 UV 측정에 의한 탁도에 의해 분석하였다.
결과는 도 21에 제시된다. 제제 중에 PS20가 없는 경우에, 24시간 교반 샘플 (실온에서)은 진탕시키지 않은 대조 바이알과 비교한 경우에 명백한 시각적 변화를 나타내었다. 교반 샘플은 탁도가 증가하여 유백색 외양을 나타내었고 SEC 주요 피크는 6% 감소하였다. ≥0.01% PS20를 제제에 첨가한 경우에, 바이알 중의 대조군 (교반하지 않음) 및 교반 샘플 사이에서 SEC 및 탁도 측정에 의한 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 0.01% PS20의 사용이 200 mg/mL의 항-PCSK9의 교반-유도된 응집체 형성을 방지하는데 충분하였다는 것을 시사한다. 그러나, 제품 저장 동안 계면활성제의 잠재적 분해를 설명하기 위해 0.02% PS20의 농도를 표적 농도로 선택하였다.
항- PCSK9 제제의 산화 전위
항-PCSK9의 산화를 트립신-펩티드 맵에 의해 결정하고, 산화의 부위(들)를 LC-MS에 의해 특성화하였다. 항-PCSK9의 산화는 상승된 온도, 광 및 산화제, 예컨대 과산화수소 및 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드 (AAPH)에 의해 유도하였다. 산화 샘플을 제조하기 위한 분해 조건은 표 7에 요약된다. 이들 산화된 항-PCSK9 샘플은 또한 실시예 3에 기재된 바와 같이 저밀도 지단백질 수용체 도메인 Fc (LDLRD-Fc) 융합 단백질에 대한 PCSK9 결합을 억제하는 그의 능력을 측정함으로써 산화로 인해 가능한 효력 손실에 대해 평가하였다.
펩티드 맵핑을 위해, 샘플을 1M 디티오트레이톨로 환원시키고, 2.9 M 아이오도아세트아미드로 알킬화시키고, 완충제 교환 후에 소화시켰다. 트립신은 1:25의 효소 대 단백질 비를 이용하는 37℃에서의 1.5시간 소화에 사용하였다. 소화를 10% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 최종 pH 2-3까지 켄칭하였다. 생성된 펩티드 소화 혼합물을 LTQ 오비트랩(Orbitrap) XL을 사용하는 질량 분광측정법 (LC-MS)에 의한 검출과 함께 역상 액체 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 펩티드 맵은 55℃에서 유지되는 페노메넥스 쥬피터(Phenomenex Jupiter) C18 칼럼 (5 μm, 2x250 mm, 300Å)과 함께 0.25 mL/분에서 160분에 걸친 0-40%의 선형 구배를 이용하였다. 이동상 A 및 B는 각각 물 중 0.1% TFA 및 아세토니트릴 중 0.09% TFA로 이루어진다. 펩티드를 또한 MS 분석 전에 214 및 280 nm abs에서 검출하였다. LC-MS 데이터를 마스코트(Mascot) 소프트웨어에 의해 프로세싱하여 항-PCSK9의 펩티드 및 각각의 산화 부위를 확인하였다. 샘플 중 산화의 양은 Trp 및 Met가 다중 산화 생성물 및/또는 산화 상태를 생산하므로 "부위 당 전체 산화" 또는 누적 산화로 표시하였다.
메티오닌 (Met/M) 및 트립토판 (Trp/W)은 단백질 약물 제품에서 용이하게 산화되는 2개의 공통적인 아미노산 잔기이다. 중쇄의 상보성-결정 영역 (CDR) III에 위치한 W99 및 M108 및 CDR에 인접한 3개의 Trp 잔기 (W36, W111 및 W486)는 항-PCSK9의 잠재적 산화 부위이다. 이러한 아미노산 잔기의 산화는 CDR에 대한 그의 인접성으로 인해 약물 효력의 손실을 발생시킬 수 있다. 분해된 샘플의 펩티드 맵핑 분석은 항-PCSK9의 산화가 Fc 부분의 M256, M362, M432 및 M455 잔기에서 주로 일어난다는 것을 밝혀내었다 (도 22). 항-PCSK9가 광 (실내광 또는 UV) 및 산화제, 예컨대 H2O2 및 AAPH에 노출시킴으로서 분해된 경우에, CDR 내부/인접한 곳의 Met 또는 Trp 잔기에 대한 부위 당 산화의 상대적 양은 3% 미만으로 효력에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 23). 따라서, 항-PCSK9는 산화에 쉽게 영향을 받지 않는 것으로 간주되며, 단백질 제제에서 항산화제의 사용은 필요하지 않다.
Figure pct00014
pH 프로파일 및 부형제 연구
항-PCSK9에 대한 제제 pH 및 부형제의 효과를 200 mg/mL의 단백질 농도에서 평가하였다. 완충제 종으로서의 아르기닌 숙시네이트, 히스티딘 HCl 또는 히스티딘 아세테이트 및 가용화제로서의 아르기닌 HCl 또는 아르기닌 아세테이트를 함유하는 제제 중 5.0 내지 6.5의 pH 범위를 40℃에서의 가속된 안정성 (표 9 참조) 및 5℃ 및 25℃에서의 점도 (표 8 참조)에 대해 평가하였다. 하기 검정을 평가: SEC, 이온-교환 크로마토그래피 (IEC), 모세관 전기영동-나트륨 도데실 술페이트 (CE-SDS) 및 효력에 이용하였다. 총 7개의 제제를 평가하였다.
IEC를 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 상에서 수행하였으며, 0.9 mL/분의 유량으로 50분 내에 이동상 A (20 mM 헤페스, pH 7.9) 및 1%-34% 이동상 B (20 mM 헤페스, 100 mM NaCl, pH 7.9)의 구배를 사용하는 디오넥스 프로팩(Dionex ProPac)™ WCX-10 칼럼 (4 x 250 mm)을 이용하였다. 칼럼을 35℃에서 유지하였다. 샘플 로드는 40 μg이었으며, 분리는 280nm abs에서 모니터링하였다.
pH 의 효과
200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% PS20 중 200 mg/mL의 항-PCSK9의 안정성에 대한 pH의 효과를 pH 5.0, 5.5 및 6.0으로부터 평가하였다. SEC, IEC 및 CE-SDS에 의해 분석된 바와 같이, 제제 pH를 5.0에서 6.0으로 증가시키면 40℃에서 1개월 후에 항-PCSK9의 안정성이 증가하였다. pH 5.0 및 5.5와 비교하여, pH 6.0의 제제는 IEC에 의해 결정된 바와 같이 보다 덜 산성 및 염기성인 피크 제제였다. pH 6.0의 제제는 또한 SEC에 의해 결정된 바와 같이 고분자량 종 (HMWS)이 감소하고, SEC 및 CE-SDS 둘 다에 의해 결정된 바와 같이 저분자량 종이 감소하였다. pH 6.5의 제제의 경우에, 항-PCSK9를 20 mM 히스티딘 HCl, 160 mM 아르기닌 HCl 및 0.02% PS20 중 200 mg/mL로 제제화하였다. pH 5.0 내지 6.5의 모든 제제에 대한 40℃에서의 항-PCSK9의 분해율은 표 9에 제시되고, IEC 및 SEC에서의 pH 비율 프로파일은 도 24에 제시된다. pH 비율 프로파일 및 분해율에 기초하여, 표적 pH 6.0을 선택하였다.
Figure pct00015
완충제 종의 효과
pH 6.0의 200 mg/mL 항-PCSK9의 가속된 안정성에 대한 완충제 종의 효과를 하기 3가지 완충제 시스템: (1) 160 mM 아르기닌 숙시네이트, (2) 20 mM 히스티딘 HCl 및 160 mM 아르기닌 HCl, 및 (3) 20 mM 히스티딘 아세테이트 및 160 mM 아르기닌 아세테이트를 함유하는 제제에서 평가하였다. 3가지 제제는 모두 0.02% PS20을 함유하였다. 40℃에서 1개월 후에, 항-PCSK9는 3가지 완충제 시스템 사이에서 대등한 CE-SDS 프로파일을 가졌다 (도 26, 상부 패널). 히스티딘 HCl/아르기닌 HCI 및 히스티딘 아세테이트/아르기닌 아세테이트 완충제 시스템 사이에서 SEC에 의해 관찰된 차이는 없었던 반면, 아르기닌 숙시네이트 완충제의 사용은 HMWS 피크를 약간 증가시켰다 (도 26, 중앙 패널). IEC 분석에 의해, 제제 중 히스티딘 HCI/아르기닌 HCl 완충제 시스템의 사용은 히스티딘 아세테이트/아르기닌 아세테이트 완충제 시스템 및 아르기닌 숙시네이트 완충제와 비교한 경우에 보다 덜 산성인 피크 제제를 나타내었다 (도 26, 하부 패널). 그러나, SEC, IEC 및 CE-SDS에 의해 결정된 40℃에서의 항-PCSK9의 전반적 분해율은 pH 6.0의 모든 3가지 완충제 시스템에서 대등하다 (표 9).
Figure pct00016
1 mL 시린지에서 2가지 제제 (히스티딘 HCl, pH 6.0 및 히스티딘 아세테이트, pH 6.0) 중 항-PCSK9의 안정성을 또한 평가하였다.
5℃에서, 양쪽 제제는 최대 6개월 동안 안정하였다 (표 10 및 11). 가속 및 응력 조건에서, 산성 변이체의 형성 및 응집은 액체 제제 중의 항-PCSK9에 대한 주요 분해 경로이다. 30℃/65% 상대 습도 (RH) 및 40℃/75%RH에서, 단백질은 IEC에 의해 결정된 바와 같이 pH 6.0에서 히스티딘 아세테이트 중에서보다 히스티딘 HCl 중에서 보다 빠르게 분해되었다 (표 11). 동일한 저장 조건 하에 각 제제에서는 SEC 및 CE-SDS에 의해 응집율의 차이가 관찰되지 않았다 (표 12). 최대 6개월 동안 5℃에서 저장된 경우에 양쪽 선도 제제에서 산화의 증가가 관찰되지 않았다. 30℃/65% RH에서 6개월 후의 양쪽 제제에서 Fc 부분에서의 Met256의 산화가 약간 증가 (~2%)하였으나, 다른 Met 및 Trp 잔기의 산화 증가는 관찰되지 않았다. 효력의 손실은 5℃ 및 30℃/65%RH에서 최대 6개월 동안 각 제제에서 관찰되지 않았다. 2.25 mL 시린지를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
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동결 안정성
항-PCSK9를 200 mg/mL에서 하기 2가지 제제로 제제화하였다: (1) 20 mM 히스티딘 HCl, 160 mM 아르기닌 HCl, 0.02% PS20, pH 6.0; 및 (2) 20 mM 히스티딘 아세테이트, 160 mM 아르기닌 아세테이트, 0.02% PS20, pH 6.0. 각각의 제제에서, 20 mL의 약물 용액을 25-cc 316L 스테인레스 스틸 미니캔에 채웠다. 이어서, 모든 미니캔을 안정성 분석을 위해 최대 6개월 동안 -20℃에 두었다.
-20℃에서 최대 6개월 동안 양쪽 제제에서 IEC, CE-SDS 및 효력에 의해 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 응집체는 동일한 저장 조건 하에 히스티딘 아세테이트 제제에서 응집체가 단지 0.5% 증가한 것에 비교하였을 때 6개월의 동결 저장 후에 히스티딘 HCl에서 1.4% 증가하였다 (도 25 참조). 동결 저장 조건 하에 히스티딘 HCl 제제에서의 보다 빠른 응집 속도로 인해, 히스티딘 아세테이트 제제가 바람직한 완충제로 선택되었다.
동결 안정성에 대한 수크로스의 효과
수크로스를 동결 저장 동안 항-PCSK9의 안정화에 대한 그의 효과를 평가하였다. LCGC10 카트리지가 장착된 실험실-규모 밀리포어(Millipore) 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템을 이용하여, 항-PCSK9를 하기 2가지 수크로스-함유 제제: (1) 20 mM 히스티딘 HCl, 130 mM 아르기닌 HCl, 60 mM 수크로스, 0.02% PS20 (w/v), pH 6.0 중 200 mg/mL 항-PCSK9; 및 (2) 20 mM 히스티딘 아세테이트, 100 mM 아르기닌 아세테이트, 60 mM 수크로스, 0.02% PS20 (w/v), pH 6.0 중 200 mg/mL 항-PCSK9에서 시험하였다. 2가지 제제 중 항-PCSK9의 샘플을 최대 3개월 동안 -20℃에 넣고, 응집에 대해 SEC에 의해 분석하였다.
수크로스 (60 mM)의 첨가는 히스티딘 아세테이트 제제에서 PCSK9의 응집을 감소시키는데 효과가 없었으나, 히스티틴 HCl 제제에서의 응집을 -20℃에서 3개월에 걸쳐 0.7% 느리게 하는 것을 도왔다. 그러나, 수크로스의 첨가는 또한 양쪽 제제에서 25℃에서의 점도를 7-8 cP로부터 11-13 cP로 증가시켰으며, 이는 피하 제제에 바람직하지 않았다. 따라서, 수크로스는 제제를 위한 안정화제로 선택되지 않았다.
상기 기재된 결과에 기초하여, 20 mM 히스티딘 아세테이트, 160 mM 아르기닌 아세테이트, 0.02% PS20 (w/v), pH 6.0 중 200 mg/mL 항-PCSK9로 이루어진 액체 제제를 선택하였다. 이러한 제제는 저장 동안 2-8℃ 및 -20℃에서 최적의 안정성을 가졌으며, pH 5.5의 초기 제제와 비교하였을 때 개선된 안정성을 가졌다.
실시예 14: 관상동맥 심장 질환 ( CHD )을 갖거나 또는 CHD 의 위험이 높은 환 자에서의 인간 임상 시험
이러한 실시예는 II상 임상 연구를 기재하고, 도 27-37은 12주에 적어도 50%의 환자에 대한 중간 결과를 보여준다. 연구에는 연구 약물로 치료하는 183명의 환자 및 위약으로 치료하는 64명의 환자를 포함하여 248명의 환자가 등록하였다. 1명의 환자가 첫번째 치료 전에 탈락하였고, 13명의 환자가 연구 제85일 전에 치료를 중단하였다. 234명의 환자가 연구 중 적어도 12주를 완료하였다.
연구 약물 (서열 35를 갖는 중쇄 및 서열 36을 갖는 경쇄를 갖는 인간 IgG1로 재포맷된 YW508.20.33b)의 ~3:1 무작위화된 이중-맹검의 위약-제어된 연구를 수행하여 90-250 mg/dL의 공복 혈청 LDL-c (직접적) 수준 및 관상동맥 심장 질환 (CHD) 또는 CHD 위험 등가상태를 갖는 환자에서 상위 치료 기준 (SOC) 스타틴에 대한 연구 약물의 안정성 및 효능을 평가하였다. 추가의 적격성 기준은 체중 ≥ 45 kg (100 lb); 체질량 지수 18-37 kg/m2; 18 내지 80세의 연령을 포함하였다. 무작위화는 LDL-c > 120 mg/dL 및 당뇨병 상태에 의해 계층화되었다.
이러한 II상 임상 연구에 대한 적격성 기준은 유럽 심장 학회 (ESC)/유럽 아테롬성동맥경화증 학회 (EAS) 및 국립 콜레스테롤 교육 프로그램 성인 치료 패널 III (NCEP ATP III) 지질-저하 가이드라인에서의 위험 기준을 기반으로 높은 심혈관 및 CHD 위험을 갖는 환자의 집단을 규정하였다. 이러한 연구는 이들 가이드라인에 따라 70 mg/dL의 치료 표적 LDL-c 수준에 적격인 환자, 그러나 SOC가 불충분하거나 또는 스타틴이 불내성이기 때문에 SOC 스타틴 요법에도 불구하고 이러한 목적에 다다르지 못한 환자를 등록시켰다.
간략하게, CHD는 기록된 심근경색 병력, 이전의 관상동맥 재혈관화 절차 (경피 관상동맥 개입 또는 관상 동맥 우회로 이식), 또는 ≥ 50% 직경 협착을 갖는 적어도 하나의 관상동맥 아테롬성동맥경화성 병변을 입증한 이전의 관상동맥 혈관조영 (침습적 관상동맥 혈관조영 또는 심장 컴퓨터 단층촬영 관상동맥 혈관조영)을 지칭한다.
CHD 위험-등가 상태를 갖는 환자는 다음 중 적어도 하나를 갖는다:
1. 하나 이상의 형태의 임상적 아테롬성동맥경화성 질환:
a. 말초 동맥 질환 (이전에 기록된 발목/상완 혈압 지수 < 0.85, 이전의 경피 또는 외과적 말초 동맥 재혈관화 절차, 말초 동맥 질환으로 인한 하지의 이전의 비-외상성 절단, 또는 이전의 혈관 영상화 상의 ≥ 50% 직경 협착),
b. 경동맥 질환 (영상화 상에서 ≥ 50% 직경 협착을 갖는 이전에 기록된 경동맥 아테롬성동맥경화성 병변 또는 이전의 피부 또는 외과적 경동맥 재혈관화 절차),
c. 연구자의 견해에서 심장 기원의 색전증 (예를 들어, 심방 세동, 판막성 질환 또는 좌심실 벽성 혈전증)으로 인한 것이 아닌, CT 또는 MRI 뇌 영상화에 의해 기록된 이전의 허혈성 졸중, 또는
d. 이전에 외과적 또는 혈관내 복구가 있었던 복부 대동맥류.
2. 제2형 당뇨병,
3. 표적 기관 손상 (연구자에 의해 결정된 바와 같은, 망막병증, 신경병증, 또는 미세알부민뇨를 포함하는 신병증)을 갖는 제1형 당뇨병,
4. 중간 정도 내지 중증의 만성 신장 질환 (스크리닝 실험실을 포함하여 적어도 3개월에 걸친 적어도 3회의 측정 상에서 신질환에서의 식이 변형 방정식을 이용하여 15-60 mL/분/1.73 m2의 추정된 사구체 여과율에 의해 명시됨), 또는
5. 하기 열거된 CHD 위험 인자 및 CHD 사건 ≥ 20%의 절대 10-년 위험 (프레이밍햄 위험 스코어의 국립 콜레스테롤 교육 프로그램 성인 치료 패널 III 가이드라인 변형에 의해 결정된 바와 같음) 또는 첫번째 치명적 아테롬성동맥경화성 사건 ≥ 10%의 10-년 위험 (전신 관상동맥 위험 평가 시스템에 의해 결정됨) 중 2가지 이상:
a. 남성의 경우에 ≥ 45세 또는 여성의 경우에 ≥ 55세의 연령,
b. 최근 흡연 (1개월 이내),
c. 고혈압 (스크리닝 수축기 혈압 ≥ 140 mmHg, 확장기 혈압 ≥ 90 mmHg, 또는 고혈압을 치료하기 위한 항고혈압제 의약의 사용)
d. 저 HDL 콜레스테롤 (< 40 mg/dL), 또는
e. 조기 CHD의 가족력 (남성 일차친척 < 55세 또는 여성 일차친척 < 65세에서의 심근경색 또는 관상동맥 재혈관화).
당뇨병 상태는 환자 의료 기록 또는 병력, 또는 스크리닝 실험실 시험 결과에 따라 하기 중 어느 하나의 존재에 기초하여 결정하였다: (1) HbA1c > 6.5%, (2) 공복 혈장 글루코스 ≥ 126 mg/dL (7.0 mmol/L), (3) 경구 글루코스 내약성 시험 (이 시험은 물에 용해된 75 g 무수 글루코스 당량을 함유하는 글루코스 부하를 사용하여 세계 보건 기구에 의해 기재된 바와 같이 수행해야 함) 동안 이전 2시간의 혈장 글루코스 ≥ 200 mg/dL (11.1 mmol/L), 또는 (4) 현재 당뇨병 진단을 위해 경구 또는 주사가능한 요법이 진행 중임.
배제 기준은 다음을 포함하였다: 계획된 관상동맥, 경동맥 또는 말초 동맥 재혈관화 절차 또는 연구 동안의 수술; 3개월 또는 스크리닝 내에 프로토콜에 열거된 바와 같은 방치된 임상적으로 유의한 의학적 질환; 임의의 후천성 또는 선천성 면역억제; 각막 이식 이외의 임의의 기관 이식; 연구자의 판단에서 기대 수명 <2년; 공복 혈청 트리글리세리드 수준 >= 400 mg/dL; 1년의 스크리닝에서 알콜중독 또는 약물 중독의 병력; 3개월의 스크리닝에서 불법 약물의 사용; 임신 또는 매우 효과적인 피임의 사용 의사가 없음; 아나필락시스 또는 아나필락시스성 반응의 병력.
90-250 mg/dL의 혈청 LDL-c 농도 및 CHD 또는 CHD 위험 등가상태를 갖는 248명의 환자 (성인 남성 및 여성)를 5개의 연구 아암 중 1개로 무작위화하고, 연구 약물 또는 위약 아암 (아암 F)을 투여하였다. 제1 연구 아암 (아암 A)의 환자에게 400 mg의 항-PCSK9 항체를 4주마다 투여하고; 제2 연구 아암 (아암 B)의 환자에게 200 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 투여하고; 제3 연구 아암 (아암 C)의 환자에게 400 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 투여하고; 제4 연구 아암 (아암 D)의 환자에게 800 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 투여하고; 제5 연구 아암 (아암 E)의 환자에게 800 mg의 항-PCSK9 항체를 12주마다 투여하였다. 연구 용량 코호트, 연구 약물 용량 요법, 및 아암 당 환자의 수의 개관이 도 27에 제공된다. 모든 용량은 시린지를 사용하여 피하로 투여하였다. 약물 제품을 200 mM 아르기닌 숙시네이트, 0.02% 폴리소르베이트 20, pH 5.5 중 150 mg/mL 항체로 제제화하였다.
연구에서 환자의 인구통계가 하기 표 13에 제시되며, 이는 아암에 의한 차이가 없음을 나타낸다. 환자의 기준선 특성은 하기 표 14에 제시되며, 이는 아암에 의한 차이가 없음을 나타낸다.
Figure pct00020
Figure pct00021
도 27에 나타난 바와 같이, 연구는 스크리닝 (0-4주), 조정 (0-6주, 필요한 경우), 치료 (24주; 1-169일) 및 추적 (12주)을 위한 연속적 기간을 포함한다. 추적 기간의 말기에서의 연구 완료 방문 (제253일)은 연구 약물의 최종 투여 16주후 (제141일)에 일어난다. 모든 환자는 치료 할당에 관계없이 스타틴이 불내성이지 않는 한 스타틴을 포함한 치료 기준 (SOC) 요법을 받았다. SOC 스타틴 요법은 하기 조건 중 하나를 만족시키는 요법을 지칭한다: (1) 고용량 심바스타틴 (일일 40 mg), 아토르바스타틴 (일일 40-80 mg), 또는 로수바스타틴 (일일 20-40 mg), (2) 저용량 심바스타틴, 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 및 고용량의 해당 스타틴 또는 임의의 용량의 또 다른 스타틴의 기록된 불내성, (3) 다른 스타틴 (임의의 용량) 및 심바스타틴, 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴 (임의의 용량)의 기록된 불내성, 또는 (4) 스타틴 없음 및 적어도 2가지 스타틴 (임의의 스타틴, 임의의 용량)의 기록된 불내성. 모든 환자는 이들이 조정 기간 동안 및 등록시에 제공받았던 것과 동일한 용량에서 치료 및 추적 기간 전반에 걸쳐 SOC 스타틴 요법을 지속적으로 받았다. 다른 처방 및 비처방 (OTC) 지질-변형 요법 (예를 들어, 적색 효모 벼, 오메가-3 지방산 보충물 등)은 허용되지 않는다. 스크리닝 시점에 안정한 용량의 SOC 스타틴 요법 (또는 스타틴 없음 및 2가지 이상의 스타틴의 기록된 불내성을 가짐)을 받고 적어도 4주 (또는 피브레이트의 경우에 6주) 동안 다른 지질-변형 요법을 받지 않은 환자는 조정 기간을 필요로 하지 않는다.
모든 용량의 활성 약물 또는 위약은 연구 약물 투여 스케줄에 따라, 즉 오직 제1일, 제29일 (± 2일), 제57일 (± 2일), 제85일 (± 2일), 제113일 (± 4일) 및 제141일 (± 4일)에 제공된다. 도 28을 참조한다. 환자는 제169일에 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 절대 변화에 기초하여 효능을 결정하기 위해 모니터링된다. 또한, 환자는 각각의 아암에 대해 그 아암에 대한 최저점에서 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 절대 변화; 연속적 LDL-c 측정 사이의 주수에 의해 칭량된, 제169일까지의 각각의 아암에 대한 LDL-c의 변화 (절대 및 퍼센트 변화)의 시간 경과에 따른 평균 값; 각각의 아암에 대한 제169일 및 최저점에서의 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 퍼센트 변화; 모든 다른 지정된 시점에서의 LDL-c 농도의 기준선으로부터의 퍼센트 및 절대 변화; 및 각각의 아암에 대한 제169일 및 최저점에서의 총 콜레스테롤, 비-HDL-c 및 아포지단백질 B의 기준선으로부터의 퍼센트 및 절대 변화를 포함하는 2차 효능 결과를 결정하기 위해 모니터링된다.
1차 효능 결과 척도는 제169일에서의 LDL-c의 기준선으로부터의 변화를 포함한다. 기준선 LDL-c는 연구 약물의 첫번째 투여 전에 수집된 마지막 2회의 측정치의 평균으로서 정의된다. 연구 약물 용량 사이 및 각각의 연구 약물 용량 및 위약 사이의 치료 비교는 공분산 분석 (ANCOVA)에 기초하였으며, 이는 2가지 공변량: 기준선 LDL-c 농도 (< 120 mg/dL, ≥ 120 mg/dL) 및 당뇨병 상태 (예, 아니오)를 조정하는 선형 회귀 모델을 통해 수행하였다. ANCOVA 모델로부터 신뢰 구간 뿐만 아니라 최소-제곱 추정값을 사용하여 연구 결과의 해석을 도왔다. 2차 효능 결과 척도는 최저점 및 모든 시점에서의 LDL-c의 절대 변화; 주 당 LDLc의 변화의 칭량된 평균; 제169일, 최저점 및 모든 방문에서 LDL-c의 기준선으로부터의 퍼센트 변화; 제169일 및 최저점에서 총 콜레스테롤, 비-HDL-c 및 아포지단백질 B의 절대 및 퍼센트 변화를 포함한다.
하기 표 15는 12주의 치료 후의 환자 분포를 보여준다.
Figure pct00022
이러한 연구의 중간 데이터는 하기 표 16 및 도 28-36에 요약된다.
Figure pct00023
도 28은 평균 약동학 (+/- 표준 편차) (좌측 패널) 및 평균 총 PCSK9 (예를 들어, 약물-결합된 및 유리 PCSK9 둘 다) (+/- 표준 오차) (우측 패널)를 제공한다.
도 29는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 환자에서 관찰된 직접적 LDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다. 도 30은 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 환자에서 관찰된 직접적 LDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다. 400 mg의 항-PCSK9 항체를 4주마다 제공받은 환자 및 800 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 제공받은 환자는 직접적 LDL-c의 최고 감소를 나타내었다. 이러한 효과는 치료 1주 내에 관찰되었다. 800 mg의 항-PCSK9 항체를 12주마다 제공받은 환자는 직접적 LDL-c의 최저 감소를 나타내었다.
도 31은 이 연구에 참여한 환자에서 관찰된 총 콜레스테롤의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다. 도 32는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 환자에서 관찰된 총 콜레스테롤의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다. 400 mg의 항-PCSK9 항체를 4주마다 제공받은 환자 및 800 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 제공받은 환자는 총 콜레스테롤의 최고 감소를 나타내었다. 이러한 효과는 치료 1주 내에 관찰되었다. 800 mg의 항-PCSK9 항체를 12주마다 제공받은 환자는 총 콜레스테롤의 최저 감소를 나타내었다.
도 33은 이 연구에 참여한 환자에서 비-HDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다. 도 34는 이 연구에 참여한 환자에서 비-HDL 콜레스테롤의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다. 400 mg의 항-PCSK9 항체를 4주마다 제공받은 환자 및 800 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 제공받은 환자는 비-HDL 콜레스테롤의 최고 감소를 나타내었다. 이러한 효과는 치료 1주 내에 관찰되었다. 800 mg의 항-PCSK9 항체를 12주마다 제공받은 환자는 비-HDL 콜레스테롤의 최저 감소를 나타내었다.
도 35는 이 연구에 참여한 환자에서 아포지단백질 B의 기준선으로부터의 절대 변화를 보여준다. 도 36은 연구에 참여한 환자에서 아포지단백질 B의 기준선으로부터의 상대 변화를 보여준다. 400 mg의 항-PCSK9 항체를 4주마다 제공받은 환자 및 800 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 제공받은 환자는 아포지단백질 B의 최고 감소를 나타내었다. 이러한 효과는 치료 1주 내에 관찰되었다. 800 mg의 항-PCSK9 항체를 12주마다 제공받은 환자는 아포지단백질 B의 최저 감소를 나타내었다.
연구 약물의 효능에 관한 결론은 여기서 요약된다. 최저점 및 AUC에서 제85일에 LDL-c의 최고 용량-의존성 감소가 400 mg의 항-PCSK9 항체를 4주마다 제공받은 환자 및 800 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 제공받은 환자에서 관찰되었다. 제85일 분석에 기초한 LDL-c의 최소 용량-의존성 감소가 800 mg의 항-PCSK9 항체를 12주마다 제공받은 환자에서 관찰되었다. 최저점 및 AUC 분석에 기초한 LDL-c의 최소 용량-의존성 감소가 200 mg의 항-PCSK9 항체를 8주마다 제공받은 환자에서 관찰되었다. 감소는 치료 1주 내에 분명하였다. 총 콜레스테롤, 비-HDL-c 및 아포지단백질-B의 용량-의존성 감소가 제85일 및 최저점에서 관찰되었고, 감소는 또한 치료 1주 내에 분명하였다.
최종적으로, 환자를 또한 유해 사례의 발생, 특성 및 중증도; 연구 약물 투여 동안 및 그 후에 활력 징후, 신체 소견 및 임상 실험실 결과의 변화의 발생 및 특성; 및 연구 약물에 대해 지시된 항-치료 항체의 발생을 포함하여 안전성에 대해 모니터링하였다.
저 LDL-c 값의 안전성을 맹검, 탐색적 방식으로 정기적으로 평가하였다. 도 37a는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 후에 1회 이상의 방문 동안 15 mg/dL 이하의 직접적 LDL-c 값을 갖는 환자의 비율을 보여주고, 도 37b는 항-PCSK9 항체 또는 위약을 제공받은 후에 1회 이상의 방문 동안 25 mg/dL 이하의 직접적 LDL-c 값을 갖는 환자의 비율을 보여준다. LDL-c ≤ 15 mg/dL 또는 LDL-c ≤ 25 mg/dL을 갖는 최고 비율의 환자에게 400 mg의 약물을 4주마다 제공하거나 또는 800 mg의 약물을 8주마다 제공하였다. LDL-c ≤ 25 mg/dL을 갖는 최저 비율의 환자에게 200 mg의 약물을 8주마다 제공하였다. < 15 mg/dL의 2개의 연속적 LDL-c 값을 갖는 환자에게는 연구 약물을 제공하지 않았다. 이는 유해 사례로 간주되지 않았다. 이러한 환자는 대신 이들 환자를 최저 투여량 (8주마다 200 mg)으로 전환시킨 후에 LDL-c가 ≥ 50 mg/dL로 증가할 때까지 맹검 방식으로 위약을 사용하여 치료하였다.
연구 약물의 안정성에 관한 결론은 여기서 요약된다. 간략하게, 항-PCSK9 항체는 안정한 용량의 스타틴을 제공받고 있거나 또는 스타틴-불내성이며 CHD 또는 CHD 위험 등가상태로 진단된, 상승된 기준선 LDL-c (90-250 mg/dL)를 갖는 37-80세 연령의 환자에서 내약성이 우수하였다. 주사-부위 반응은 연구 약물 (25%) 대 위약 (9%)을 제공받고 있는 환자 사이에서 보다 통상적이었다. 오직 2가지 주사-부위 반응이 중간 정도였으며 (1개의 위약, 1개의 연구 약물), 나머지는 중증도가 경미하였다. 연구 약물-치료된 및 위약-치료된 환자 사이에서 치료-유발 사건의 다른 임상적으로 유의한 불균형은 관찰되지 않았다. 실험실 이상에서 임상적으로 관련된 불균형이 관찰되지 않았다. 안전성 신호가 결정되지 않았다. 사망은 보고되지 않았으며, 새로운 안전성 관심사도 관찰되지 않았다. 안전성 실험실 결과에서 패턴이 검출되지 않았다.
상기 본 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전체내용이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. F. HOFFMANN-LA ROCHE AG WU, Yan CHIU, Cecilia Pui Chi KIRCHHOFER, Daniel K. PETERSON, Andrew KOLUMAM, Ganesh A. BELTRAN, Monica Kong MORAN, Paul LI, Wei LAM, Xanthe LUIS, Lin HUI, Ada TINGLEY, Whittemore DAVIS, John Douglas BUDHA, Nageshwar R. <120> ANTI-PCSK9 ANTIBODIES, FORMULATIONS, DOSING, AND METHODS OF USE <130> 146392014540 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 61/660,605 <151> 2012-06-15 <150> US 61/786,280 <151> 2013-03-14 <160> 45 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr Ala Ile His 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Gly Phe Thr Phe Thr Arg His Thr Ile His 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr Ala Ile His 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Arg Ile Ser Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 12 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VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Phe or Ser <400> 30 Ser Ala Ser Xaa Leu Tyr Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Pro, Arg or Thr <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Ala, Ile, Ser or Thr <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = Leu, Pro or Gln <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = Ala, His, Pro or Ser <400> 31 Gln Gln Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 32 His His His His His His His His 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 33 Gln Gln Ala Tyr Pro Ala Leu His Thr 1 5 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Pro Ala Leu His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ile Gly Ser Arg Glu Leu Tyr Ile Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 36 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Pro Ala Leu His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Pro, Arg or Thr <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Ala, Ile, Ser or Thr <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = Leu, Pro or Gln <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = Ala, His, Pro or Ser <400> 37 Gln Gln Ala Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 38 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 gaagttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttctct agtactgcta ttcactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgctagg atttctcctg ctaacggtaa tactaactat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgttggatc 300 gggtcccggg agctgtacat tatggactac tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc 360 tcggcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg actgtgccct ctagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 39 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 gaagttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttctct agtactgcta ttcactgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgctagg atttctcctg ctaacggtaa tactaactat 180 gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgttggatc 300 gggtcccggg agctgtacat tatggactac tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc 360 tcg 363 <210> 40 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgtcc actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gtagcggttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa gcctatccgg ccctacacac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 41 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgtcc actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gtagcggttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa gcctatccgg ccctacacac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acga 324 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 42 Gly Phe Thr Phe Thr Arg His Thr Ile Asn 1 5 10 <210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Arg His 20 25 30 Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ile Gly Ser Arg Glu Leu Tyr Ile Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = Ser or Thr <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = Gly, Arg or Ser <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = His, Thr or Tyr <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = Ala or Thr <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = His or Asn <400> 45 Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa 1 5 10

Claims (101)

  1. 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열:
    (i) GFTFX1X2X3X4IH (서열 28) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T임)를 포함하는 HVR-H1;
    (ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
    (iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
    (iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
    (v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
    (vi) QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-PCSK9 항체.
  2. 제1항에 있어서, (a) 서열 1, 서열 2 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    (1) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 서열 17의 VH 서열을 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 서열 34의 VL 서열을 포함하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 서열 17의 VH 서열 및 서열 34의 VL 서열을 포함하는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편인 항체.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  14. 제1항에 있어서, (i) 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (ii) 서열 35의 아미노산 1-450을 포함하는 중쇄 및 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, (iii) 서열 35의 아미노산 1-449를 포함하는 중쇄 및 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 (iv) (i), (ii) 또는 (iii) 중 어느 하나의 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 서열 35의 P449는 아미드화된 것인 항체.
  15. (a) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-PCSK9 항체.
  16. 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-PCSK9 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  18. 제17항의 핵산을 포함하는 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  20. 제18항 또는 제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 원핵 세포인 숙주 세포.
  22. 제20항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  23. 항-PCSK9 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 제20항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항-PCSK9 항체를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 숙주 세포에 의해 생산된 항-PCSK9 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 항-PCSK9 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 제20항의 숙주 세포를 배양하는 것 및 숙주 세포에 의해 생산된 항-PCSK9 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 항-PCSK9 항체.
  26. 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  27. 150 내지 225 mg/mL의 항-PCSK9 항체, 10 내지 30 mM의 히스티딘 아세테이트, 150 내지 170 mM의 아르기닌 아세테이트, 0.01% 내지 0.03%의 폴리소르베이트, 및 5.8 내지 6.2의 pH를 포함하는 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 조성물 중 항-PCSK9 항체 또는 항체 단편이 200 mg/mL이고, 조성물 중 히스티딘 아세테이트가 20 mM이고, 조성물 중 아르기닌 아세테이트가 160 mM이고, 조성물 중 폴리소르베이트 20이 0.02%이고, pH가 6.0인 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 피하 투여에 적합한 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 점도가 25℃에서 10 cP 미만인 조성물.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체가
    (i) GFTFX1X2X3X4IH (서열 28) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T임)를 포함하는 HVR-H1;
    (ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
    (iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
    (iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
    (v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
    (vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  32. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체가 하기 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열:
    (i) GFTFX1X2X3X4IH (서열 28) (여기서, X1은 S 또는 T이고; X2는 G, R 또는 S이고; X3은 H, T 또는 Y이고; X4는 A 또는 T임)를 포함하는 HVR-H1;
    (ii) RISPANGNTNYADSVKG (서열 4)를 포함하는 HVR-H2;
    (iii) WIGSRELYIMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3;
    (iv) RASQDVSX1AVA (서열 29) (여기서, X1은 S 또는 T임)를 포함하는 HVR-L1;
    (v) SASX1LYS (서열 30) (여기서, X1은 F 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; 및
    (vi) QQSYX1X2X3X4T (서열 31) 또는 QQAYX1X2X3X4T (서열 37) (여기서, X1은 P, R 또는 T이고; X2는 A, I, S 또는 T이고; X3은 L, P 또는 Q이고; X4는 A, H, P 또는 S임)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 항체가 (a) 서열 1, 서열 2 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 항체가 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 항체가 (a) 서열 6 또는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것인 조성물.
  36. 제32항에 있어서, 항체가
    (1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 조성물.
  37. 제32항에 있어서, 항체가
    (1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 조성물.
  38. 제32항에 있어서, 항체가
    (1) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 조성물.
  39. 제32항에 있어서, 항체가
    (1) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 조성물.
  40. 제32항에 있어서, 항체가
    (1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 조성물.
  41. 제32항에 있어서, 항체가
    (1) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (2) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (3) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (4) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (5) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (6) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 조성물.
  42. 제32항에 있어서, 항체가 서열 15, 서열 27, 서열 16 또는 서열 17의 VH 서열을 포함하는 것인 조성물.
  43. 제32항에 있어서, 항체가 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23 또는 서열 34의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  44. 제32항에 있어서, 항체가 서열 15의 VH 서열 및 서열 18의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  45. 제32항에 있어서, 항체가 서열 15의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  46. 제32항에 있어서, 항체가 서열 27의 VH 서열 및 서열 20의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  47. 제32항에 있어서, 항체가 서열 16의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  48. 제32항에 있어서, 항체가 서열 17의 VH 서열 및 서열 22의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  49. 제32항에 있어서, 항체가 서열 27의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  50. 제32항에 있어서, 항체가 서열 17의 VH 서열 및 서열 34의 VL 서열을 포함하는 것인 조성물.
  51. 개체에게 항체의 200 내지 1200 mg 범위의 균일 용량을 전달하기 위한, 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는 피하 투여 장치.
  52. 제51항에 있어서, 사전-충전된 시린지인 장치.
  53. 제51항에 있어서, 1-mL 사전-충전된 시린지이며, 여기서 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 200 mg/mL인 장치.
  54. 제51항에 있어서, 2.25-mL 사전-충전된 시린지이며, 여기서 사전-충전된 시린지 중 항체 농도는 200 mg/mL인 장치.
  55. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법.
  56. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하는 방법.
  57. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하는 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 4주마다, 6주마다, 8주마다, 10주마다 또는 12주마다 용량 당 200 mg, 380 mg, 400 mg, 600 mg, 760 mg, 또는 800 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 200 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 380 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  61. 제58항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 400 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  62. 제58항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 600 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  63. 제58항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 760 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  64. 제58항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 800 mg으로 피하 투여하는 것인 방법.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 4주마다 투여하는 것인 방법.
  66. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 6주마다 투여하는 것인 방법.
  67. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 8주마다 투여하는 것인 방법.
  68. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 10주마다 투여하는 것인 방법.
  69. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PCSK9 항체를 12주마다 투여하는 것인 방법.
  70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 유효량의 제2 의약을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항-PCSK9 항체는 제1 의약인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 제2 의약이 LDLR의 수준을 상승시키는 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 제2 의약이 LDL-콜레스테롤의 수준을 감소시키는 것인 방법.
  73. 제70항에 있어서, 제2 의약이 스타틴을 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 스타틴이 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제70항에 있어서, 제2 의약이 HDL-콜레스테롤의 수준을 상승시키는 것인 방법.
  76. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 방법.
  77. 대상체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg으로 피하 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법.
  78. 제67항에 있어서, LDL-콜레스테롤 수준이 기준선으로부터 적어도 45% 감소되고, 최종 투여 후 적어도 1개월 동안 감소된 수준으로 유지되는 것인 방법.
  79. 대상체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg으로 피하 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하는 방법.
  80. 대상체에게 유효량의 항-PCSK9 항체를 4주마다 또는 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg으로 피하 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하는 방법.
  81. 제1항 내지 제16항 및 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 항-PCSK9 항체 또는 조성물.
  82. 제1항 내지 제16항 및 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하기 위한 항-PCSK9 항체 또는 조성물.
  83. 제1항 내지 제16항 및 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 항-PCSK9 항체 또는 조성물.
  84. 제1항 내지 제16항 및 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하기 위한 항-PCSK9 항체 또는 조성물.
  85. 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량.
  86. 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하기 위한, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량.
  87. 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량.
  88. 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  89. 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하기 위한, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  90. 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  91. 대상체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하기 위한, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  92. 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량의 용도.
  93. 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하기 위한, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량의 용도.
  94. 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량의 용도.
  95. 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  96. 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  97. 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  98. 대상체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하기 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제16항 및 제25항 중 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  99. 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량의 용도.
  100. 대상체에서 콜레스테롤 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량의 용도.
  101. 대상체에서 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 4주마다 내지 12주마다 또는 1개월마다 내지 3개월마다 용량 당 400 mg 내지 1000 mg의 투여에 사용되는 항-PCSK9 항체의 피하 투여량의 용도.
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