KR20140135193A

KR20140135193A - 히스티딘 공학처리된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-사람 동물

Info

Publication number: KR20140135193A
Application number: KR1020147025407A
Authority: KR
Inventors: 존 맥훠터; 린 맥도날드; 앤드류 제이 머피
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2014-11-25
Also published as: IL282452B; EP2883449A1; PT2825036T; PT2883449T; CN104302169B; EP2883449B1; EP2825036B1; ES2849349T3; HUE037659T2; RU2014141537A; IL272357A; PL2825036T3; CN107827979A; CN107840890A; WO2013138680A4; EP3348140A3; HRP20181228T1; EP3808175A1; EP3348140A2; US9334334B2

Abstract

본원에는 면역될 때 항원에 pH 의존적으로 결합할 수 있는 항체 레퍼토리를 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공된다. 또한 본원에는 비-사람 동물의 생식선에서 단일한 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자로부터 유도된 단일한 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자는 적어도 하나의 비-히스티딘 코드화 코돈의 히스티딘 코드화 코돈으로의 치환을 포함한다. 또한 본원에는 히스티딘-함유 보편적 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 비-사람 동물의 제조방법이 제공된다.

Description

히스티딘 공학처리된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-사람 동물{HISTIDINE ENGINEERED LIGHT CHAIN ANTIBODIES AND GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS FOR GENERATING THE SAME}

관련된 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2012년 3월 16일에 출원된 미국 임시 출원 61/611,950호 및 2012년 12월 13일에 출원된 미국 임시 출원 61/736,930호의 U.S.C. §119(e) 35에 따르는 유익을 청구한다.

기술분야

본 출원에는 pH 의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 쥐)이 제공된다. 또한 비-사람 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열에 대한 변형을 제조하는 방법이 제공되는데, 이때 변형은 상보성 결정 영역(CDR) 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 코드화하는 경쇄 가변 영역 유전자, 예컨대 뉴클레오티드 내의 잔기의 돌연변이생성을 포함하여서 항원에 대해 pH 의존성 결합을 나타내는 경쇄 도메인을 포함하는 항체의 생체 내 발현을 촉진한다. 또한 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항체의 제조 방법도 제공된다.

항체는 전형적으로 단일이량체 중쇄 성분을 포함하는데, 이때 각각의 중쇄 단량체는 동일한 경쇄와 결합된다. 이종이량체 중쇄 성분을 가지는 항체(예컨대 이중특이성 항체)는 치료 항체로서 바람직하다. 그러나 이중특이성 항체의 각각의 중쇄와 만족스럽게 결합할 수 있는 적당한 경쇄 성분을 가지는 이중특이성 항체를 만드는 것은 문제가 많은 것으로 증명되었다.

한 접근법으로, 경쇄는 모든 경쇄 가변 도메인에 대한 용법 통계자료를 조사하고, 사람 항체에서 가장 빈번하게 사용된 경쇄를 확인하며, 그 경쇄를 상이한 특이성의 두 개의 중쇄와 짝을 이루게 함으로써 선택될 수 있을 것이다.

다른 접근법으로, 경쇄는 파지 디스플레이 라이브러리(예컨대 사람 경쇄 가변 영역 서열, 예를 들면 사람 scFv 라이브러리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리)를 관찰하고, 가장 통상적으로 사용된 경쇄 가변 영역을 그 라이브러리로부터 선택함으로써 선택될 수 있을 것이다. 그런 다음 경쇄는 관심의 두 개의 상이한 중쇄에 대해 시험될 수 있다.

또 다른 접근법으로, 경쇄는 프로브로서 관심의 두 중쇄의 중쇄 가변 서열을 사용하여 경쇄 가변 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 분석함으로써 선택될 수 있을 것이다. 두 개의 중쇄 가변 서열과 결합하는 경쇄는 그 중쇄에 대한 경쇄로서 선택될 수 있을 것이다.

또 다른 접근법으로, 후보 경쇄는 중쇄의 동족 경쇄와 배열될 수 있고, 변형은 두 중쇄의 동족 경쇄에 대해 공통적인 서열 특성을 더 밀접하게 매치시키기 위해 경쇄에 만들어진다. 만약 면역원성의 변화가 면역화에 필요하다면, 변형은 바람직하게는 공지된 사람 경쇄 서열에 존재하는 서열을 초래하고, 그로써 단백질 가수분해 프로세싱은 면역원성의 가능성을 평가하기 위하여 해당 기술분야에 공지되어 있는 매개변수와 방법(즉 가상 환경뿐 아니라 습식 분석)을 토대로 T 세포 에피토프를 생성하는 것으로 보이지는 않는다.

상기 접근법들은 모두 많은 선행 규제들, 예컨대 서열 동일성, 특이한 예비-선택된 중쇄와의 결합 능력 등을 포함하는 시험관 내 방법에 의존한다. 따라서 시험관 내 조건을 조작하는 것에 의존하지 않고, 대신 통상적인 경쇄를 포함하는 사람 에피토프-결합 단백질을 제조하기 위한 생물학적으로 보다 민감한 접근법을 사용하는 조성물 및 방법에 대한 요구가 해당 기술분야에 있다.

또한, 치료 항체, 예컨대 이중특이성 치료 항체는 그것들이 때로 원하는 효능을 이루기 위하여 고용량을 필요로 하는 점에서 약간의 제한을 가진다. 이것은 부분적으로는 항체-항원 복합체가 엔도솜 안에 내재화되고, 표적-중재된 소멸로 불리는 과정에서 리소좀성 분해에 대한 표적이 된다는 사실에 기인한다. 그러므로 해당 기술분야에는 보다 효과적인 항체 재순환, 예컨대 이중특이성 항체 재순환을 유도하고, 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성을 손상시키지 않으면서 엔도솜 구획에서 항체-항원 복합체의 해리를 촉진함으로써 항체의 분해를 방지하는 방법 및 조성물에 대한 요구가 존재한다.

한 측면으로, 중성 pH에서 표적 항원에 결합하지만 산성 pH(예컨대 pH 5.0 내지 6.0)에서 동일한 항원의 감소된 결합을 나타내는 항체 또는 항체 가변 도메인을 생성하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 그 생물학적 시스템은 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형을 포함하는 재배열된 경쇄 서열(예컨대 재배열된 V-J)을 가지는 비-사람 동물, 예컨대 설치류(예를 들면 마우스 또는 쥐)를 포함한다. 다양한 측면에서, 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형은 경쇄 CDR3 코돈에 있다. 다양한 측면에서, 비-사람 동물은 사람 또는 인간화된 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 다양한 측면으로, 비-사람 동물은 내인성 비-사람 중쇄 가변 유전자 절편의 하나 또는 그 이상의 사람 중쇄 V_H, D_H 및 J_H 절편으로의 대체를 포함하며, 이때 사람 절편은 비-사람 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 다양한 측면에서, 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기에 대한 치환을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 보편적인 경쇄를 가지는 비-사람 동물이 제공된다. 다양한 측면에서 이들 히스티딘-변형된 보편적 경쇄 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 마우스)은 히스티딘-보편적 경쇄 마우스, 히스티딘-ULC 마우스 또는 HULC 마우스로 언급된다.

그러므로 한 측면으로, 본원에는 그것의 생식선에 사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 가변 영역 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 비-사람 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다.

한 구체예에서, 동물은 추가로 그것의 생식선에 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 비-사람 중쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있다.

한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 상보성 결정 영역(CDR)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 구체예에서, 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈의 치환이다. 한 측면으로, 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 포함된 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다. 다른 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다.

한 측면으로, 본원에 기술된 비-사람 동물은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기(t_1/2)의 감소를 나타내는 항체에 대해 풍부해진 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 t_1/2의 감소는 약 30배 또는 그 이상이다.

한 구체예에서, 동물은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열에서 치환된 적어도 하나의 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환을 가지는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다. 한 구체예에서, 동물은 체세포성 과돌연변이에도 불구하고, 발현된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환을 보유하는 항체를 발현한다.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 포유류이다. 한 구체예에서, 포유류는 설치류, 예컨대 쥐 또는 마우스이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이다. 그러므로 한 측면으로, 본원에는 또한 그것의 생식선에 사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하고 있는 유전자 변형된 마우스가 제공되며, 이때 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다.

한 구체예에서, 마우스의 생식선에 있는 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 쥐 또는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다.

추가의 구체예에서, 마우스는 또한 그것의 생식선에 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 한 측면으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 쥐 또는 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있다.

한 측면으로, 마우스는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는데, 그 치환은 CDR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있다. 한 구체예에서, 치환은 CDR3 코돈에서, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈에서 일어난다. 한 구체예에서, 마우스의 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는데, 예를 들면 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 그런 대체는 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 대체하기 위해 디자인된다. 다른 구체예에서, 그런 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 대체하기 위해 디자인된다.

다른 구체예에서, 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 그런 대체는 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 대체하도록 디자인된다. 다른 구체예에서, 그런 대체는 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 대체하도록 디자인된다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 마우스는 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기(t_1/2)의 감소를 나타내는 항체에 대해 풍부해진 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 t_1/2의 감소는 약 30배 또는 그 이상이다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 마우스는 관심의 항원에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는데, 이때 모든 항체는 (a) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 동일한 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및 (b) 사람 중쇄 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 유도된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다.

또한 본원에는 사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 비-사람 유전자좌, 예컨대 마우스 유전자좌가 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 유전자좌는 비-사람 동물의 생식선에 포함된다. 한 구체예에서, 유전자좌는 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된, 예컨대 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함한다. 유전자좌에 존재하는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도되는 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 유전자좌에 존재하는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도되는 다른 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 비-사람 유전자좌는 유전자 변형된 비-사람 동물을 제조하기 위하여 아래에서 설명되는 방법을 사용하여 생성될 수 있다.

또 다른 측면으로, 본원에는 그것의 생식선에 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-사람 동물의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 비-사람 동물의 게놈을 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 절편을 결실시키거나 비-기능성이 되도록 변형시키고, 그 게놈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 위치시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 그런 방법은 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체에 대해 풍부해진 B 세포 집단을 포함하는 유전자 변형딘 비-사람 동물을 유발한다. 한 구체예에서, 게놈에 위치한 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20, 예컨대 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 그러므로 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도되는 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도되는 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다.

다른 측면으로, 본원에는 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 (a) 본원에 기술된 마우스를 제조하고(예컨대 사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 그것의 재배열된 경쇄 가변 영역 서열에 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함하는 마우스), (b) 그 마우스를 관심의 항원으로 면역시키며, (c) 관심의 항원에 중성 pH에서 원하는 친화성으로 결합하는 한편 산성 pH에서는 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 그 방법은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t_1/2를 나타내는 항체의 생성을 유발한다. 한 구체예에서, 방법은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소한 해리성 반감기(t_1/2)를 나타내는 항체의 생성을 유발한다.

다른 측면으로, 본원에는 관심의 항원에 pH-의존성 결합을 나타내는 항체를 제조하는 추가의 방법이 제공된다. 그런 한 가지 방법은 (a) 원하는 친화성으로 관심의 항원에 결합하는 첫 번째 항체를 선택하고, (b) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 첫 번째 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열을 변형시키며, (c) 첫 번째 항체의 면역글로불린 중쇄 및 변형된 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, (d) 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 원하는 친화성을 보유하는 한편 산성 pH에서 관심의 항원에 대한 감소된 결합을 나타내는, 세포에서 발현된 두 번째 항체를 선택하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 첫 번째 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열은 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 항체는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하는 비-사람 동물, 예컨대 마우스에서 생성되고, 면역글로불린 경쇄의 변형은 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 영역에서 이루어진다. 한 구체예에서, 첫 번째 항체는 추가로 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편의 레퍼토리로부터 유도된 면역글로불린 중쇄 서열을 포함하는 비-사람 동물, 예컨대 마우스에서 생성된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도되는 경우에, 첫 번째 항체의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 변형은 CDR3 코돈의 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 이루어진다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도되는 경우에, 첫 번째 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열의 변형은 CDR3 코돈의 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 이루어진다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소한 해리성 반감기(t_1/2)를 나타내는 항체를 유발한다. 한 구체예에서, 항체의 제조 방법은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t_1/2를 나타낸다.

본원에 기술된 어떠한 구체예 및 측면이든지 다르게 표시되거나 맥락으로부터 벗어나지 않는 한, 상호 결합하여 사용될 수 있다. 다른 구체예들도 다음의 설명으로부터 당업자들에게 명백해질 것이다.

도 1은 다양한 항원-특이적 항체(A 내지 K 항체)로부터의 사람 Vκ1-39-유도된 경쇄의 아미노산 배열을 도시한다. 각각의 경쇄 서열 내에 위치한 히스티딘(H) 잔기는 진하게 표시된다. 다양한 경쇄 영역(프레임워크 및 CDR)은 배열 위에 표시된다.
도 2는 돌연변이생성에 의하여 사람 Vκ1-39-유도된 경쇄의 CDR3 영역에 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기의 조합 및 위치를 도시한다. 돌연변이생성을 통하여 도입된 히스티딘 잔기와 해당하는 핵산 잔기는 진하게 표시된다. 아미노산 위치(105, 106 등)는 Lefranc et al. (2003) Dev. Copm. Immunol. 27:55-77에 기술된 독특한 넘버링을 토대로 하고, www.imgt.org 상에서도 볼 수 있다.
도 3은 5개(1 내지 5)의 상이한 중쇄 및 CDR3의 표시된 위치(Y축 참조)에서 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기를 가지는 Vκ1-39-유도된 경쇄를 코드화하는 핵산으로 형질전환된 CHO 세포의 상층액에서 검출된, ng/mL로 표시되는 항체 발현의 수준을 도시한다.
도 4는 CHO 세포 상층액에서 히스티딘 공학처리된 경쇄를 함유하는 선택된 항원-특이적 사람 항체의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 5a 내지 도 5e는 중성(7.4) 및 산성(5.75) pH에서 다양한 히스티딘 공학처리된 경쇄와 짝을 이룬 항원-특이적 항체로부터 선택된 중쇄(1 내지 5)에 대한 결합 동역학을 나타낸다. k_a, k_d, k_D 및 t_1/2를 포함한 다양한 동역학적 매개변수가 도시된다. NB=결합 없음.
도 6은 표시된 중쇄(2, 3 및 6)와 짝을 이룬 원래의 보편적 경쇄 또는 히스티딘-변형된 보편적 경쇄를 포함하는 항체에 대한 동역학적 매개변수(K_D 및 t_1/2)를 도시한다. 히스티딘 치환은 여러 항체에서 강력한 pH 의존성을 유도한다. 히스티딘 치환은 CDR3에서 서열 ₁₀₅QQSYSTP₁₁₁(SEQ ID NO:3)을 ₁₀₅HHSYSTH₁₁₁(SEQ ID NO:5)로 반전시키기 위하여 이루어졌다. NB=검출할만한 결합 없음(KD>10마이크로몰).
도 7은 재배열된 사람 Vκ1-39/Jκ5 경쇄 서열의 CDR3에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위해 사용된 선택된 돌연변이생성 프라이머의 서열 및 특성(%GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 도시한다. 서열 목록에서 사용된 이들 프라이머에 대한 SEQ ID NO는 아래의 표에 포함된다. F=전방 프라이머, R=역프라이머.
도 8a 내지 도 8b는 변형된 사람 경쇄를 함유하는 항체를 발현하는 유전자 변형된 마우스를 제조하기 위하여 Vκ1-39/Jκ5 가변 영역으로부터 유도된 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 서열로 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위한 표적화 벡터의 구성을 위한 일반적인 전략을 도시한다. 도 8c 내지 도 8d는 ES 세포 안으로의 ULC-H105/106/108/111 치환과 그것으로부터 이형접합성 마우스를 생성하기 위한 표적화 벡터의 도입을 도시하는 한편; 도 8e 내지 도 8f는 ES 세포 안으로의 ULC-H106/108/111 치환과 그것으로부터 이형접합성 마우스를 생성하기 위한 표적화 벡터의 도입을 도시한다. 도면은 규모화하여 도시되지 않는다. 다른 표시가 없는 한, 진한 도형과 실선은 마우스 서열을 나타내고, 하얀 도형과 이중선은 사람 서열을 나타낸다.
도 9는 히스티딘 보편적 경쇄(HULC)(4개의 His 치환 포함-HULC 1927 마우스; 3개의 His 치환 포함-HULC 1930 마우스)와 두 번째 출혈시 야생형 동물에 대한 이형접합성 마우스로부터의 면역원에 대한 항혈청을 도시한다.
도 10은 총 항원 포지티브 클론의 수 및 이형접합성 HULC(1927 대 1930) 및 WT 마우스로부터의 하이브리도마 융합으로부터 얻어진 pH 민감성 항원을 나타내는 항원 포지티브 클론의 수를 비교한다. 도면은 각 마우스 유형에 대하여 두 마리씩의 마우스에 대한 데이터를 포함한다("마우스 1" 및 "마우스 2").
도 11a 내지 도 11c는 각각의 이형접합성 HULC 또는 WT 마우스 중 어느 하나로부터의 단클론성 항체(AA, BB, CC, DD, HH, GG, NN 및 OO)가 중성 pH(pH 7.4)에서 면역원과 결합하도록 허용되고 이어서 해리 단계를 위해 7.4 또는 6.0의 어느 하나의 pH를 가지는 완충액에 시프트되는 표면 플라스몬 공명 결합 실험으로부터의 센서그램을 도시한다. 각 그래프에서 개별적인 라인은 각각의 항체의 상이한 농도에서 결합 반응을 나타낸다. 모든 실험은 25℃에서 수행되었다. 해리성 반감기 값(t_1/2)은 각각의 센서그램 위에 표시되고, t_1/2의 배수 변화는 각 센서그램의 우측에 포함된다. 항체 AA, BB, SS, DD, HH 및 GG는 His-치환된 경쇄를 사용하여 이형접합성 HULC 1927 마우스로부터 유래하였고, NN은 WT 경쇄를 사용하여 이형접합성 HULC 1927 마우스로부터 유래하였으며, OO는 WT 마우스로부터 유래한다(명확한 것은 표 4 참조).
도 12는 돌연변이생성에 의해 사람 Vκ3-20-유도된 경쇄의 CDR3 영역에 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기의 위차를 도시한다. 돌연변이생성을 통해 도입된 히스티딘 잔기와 해당하는 핵산 잔기는 진하게 표시된다. 아미노산 위치(105, 106 등)는 Lefranc et al. (2003) Dev. Copm. Immunol. 27:55-77에 기술된 독특한 넘버링을 토대로 하고, www.imgt.org 상에서도 볼 수 있다.
도 13은 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ1 경쇄 서열의 CDR3에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위해 사용된 선택된 돌연변이생성 프라이머의 서열 및 특성(%GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 도시한다. 서열 목록에서 사용된 이들 프라이머에 대한 SEQ ID NO는 아래의 표에 포함된다. F=전방 프라이머, R=역프라이머.
도 14a 내지 도 14b는 변형된 사람 경쇄를 함유하는 항체를 발현하는 유전자 변형된 마우스를 제조하기 위하여 Vκ3-20/Jκ1 경쇄 가변 영역으로부터 유도된 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 서열에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위한 표적화 벡터의 구성을 위하 일반적인 전략을 도시한다. 도 14c는 ES 세포 안에 ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H 치환을 위한 표적화 벡터의 도입과 그것으로부터 이형접합성 마우스의 생성을 도시하고; 한편 도 14d는 ES 세포 안에 ULC-Q105H/Q106H/S109H 치환을 위한 표적화 벡터의 도입과 그것으로부터 이형접합성 마우스의 생성을 도시한다. 다이아그램은 규모화하여 도시되지 않는다. 다르게 표시되지 않는 한, 진한 도형 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 하얀 도형 및 이중선은 사람 서열을 나타낸다.

정의

본 발명은 그것의 게놈에, 예컨대 생식선에 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 사람 항체 분자를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(들), 예컨대 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항체를 코드화하는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물(예컨대 마우스, 쥐, 토끼, 햄스터 등); 그것을 포함하는 배(embryo), 세포 및 조직; 및 그것의 사용 방법이 제공된다. 다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 및 구절은 명백하게 반대로 표시되거나 명백하게 그 용어 또는 구절이 사용되는 맥락으로부터 벗어나지 않는 한, 해당 기술분야에서 그 용어 및 구절이 획득한 의미를 포함한다.

용어 "항체"는 본원에서 사용되는 것과 같이, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 네 개의 폴리펩티드 사슬, 즉 두 개의 무거운(H) 사슬과 두 개의 가벼운(L) 사슬을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인과 중쇄 불변 영역(C_H)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, 즉 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 또 다시 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 과가변성 영역과 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존되고 사이사이 끼어 있는 영역으로 나누어질 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 세 개의 CDR과 네 개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수 있다). 용어 "고친화성" 항체는 그것의 표적 에피토프와 관련하여 약 10^-9M 또는 그 이하(예컨대 약 1×10^-9M, 1×10^-10M, 1×10^-11M 또는 약 1×10^-12M)의 K_D를 가지는 항체를 말한다. 한 구체예에서, K_D는 표면 플라스몬 공명, 예컨대 BIACORE^TM에 의해 측정되고; 다른 구체예에서, K_D는 ELISA에 의해 측정된다.

구절 "이중특이성 항체"는 선택적으로 둘 또는 그 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 두 개의 동일하지 않은 중쇄를 포함하는데, 각각의 중쇄는 상이한 에피토프 - 두 개의 상이한 분자 중 어느 하나(예컨대 두 개의 상이한 면역원 상의 상이한 에피토프) 또는 동일한 분자 상(예컨대 동일한 면역원 상의 상이한 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 만약 이중특이성 항체가 선택적으로 두 개의 상이한 에피토프(첫 번째 에피토프와 두 번째 에피토프)에 결합할 수 있다면, 첫 번째 에피토프에 대한 첫 번째 중쇄의 친화성은 일반적으로 두 번째 에피토프에 대한 첫 번째 중쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4 또는 그 이상의 차수의 크기만큼 낮을 것이고, 그 역도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 특이적으로 결합된 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에 있을 것이다(예컨대 동일하거나 상이한 단백질). 그런 이중특이성 항체의 예를 들면 종양 항원에 대해 특이한 첫 번째 중쇄 및 세포독성 마커, 예컨대 Fc 수용체(예컨대 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등) 또는 T 세포 마커(예컨대 CD3, CD28 등)에 대해 특이한 두 번째 중쇄를 가지는 이중특이성 항체가 있다. 나아가, 두 번째 중쇄 가변 도메인은 상이한 원하는 특이성을 가지는 중쇄 가변 도메인으로 치환될 수 있다. 예를 들어 종양 항원에 대해 특이한 첫 번째 중쇄와 독소에 대해 특이한 두 번째 중쇄를 가지는 이중특이성 항체는 종양 세포에 독소(예컨대 사포린, 빈카 알카로이드 등)를 전달하기 위해 짝을 이룰 수 있다. 다른 예시적인 이중특이성 항체로는 활성화 수용체(예컨대 B 세포 수용체, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαRI, T 세포 수용체 등)에 대해 특이한 첫 번째 중쇄 및 억제 수용체(예컨대 FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a 등)에 대해 특이한 두 번째 중쇄를 가지는 것들을 포함한다. 그런 이중특이성 항체는 세포 활성화(예컨대 알레르기 및 천식)와 관련된 치료 조건을 위해 구성될 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들면 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄를 조합시킴으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄 가변 서열을 코드화하는 핵산 서열은 동일 또는 상이한 중쇄 불변 영역을 코드화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 그런 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체는 각각 세 개의 중쇄 CDR과, 이어서 (N-말단에서 C-말단 방향으로) C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인 및 C_H3 도메인을 가지는 두 개의 중쇄, 및 에피토프-결합 특이성을 부여하지는 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 에피토프-결합 영역에 의해 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 하나 또는 두 개 전부의 에피토프에 하나 또는 두 개 전부의 중쇄를 결합시킬 수 있는 면역글로불린 경쇄를 가진다.

용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적당한 모든 세포를 포함한다. 세포는 원핵 및 진핵 세포(단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포(예컨대 대장균, 바실루스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예컨대 맥주효모균, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 세포 융합물, 예컨대 하이브리도마 또는 콰드로마를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐 또는 마우스 세포이다. 어떤 구체예에서, 세포는 진핵세포이고 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예컨대 CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예컨대 COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60(예컨대 BHK21), Jurkat, Daudi, A431(상피성), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT 1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 셀라인. 어떤 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예컨대 PER.C6^TM 세포)를 포함한다.

구절 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 정상적으로(즉 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자(예컨대 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에 있는 두 개의 프레임워크 영역 사이에서 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들면 생식선 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해 코드화될 수 있고, 예컨대 단순한(naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 코드화될 수 있다. CDR은 체세포성 돌연변이될 수 있고(예컨대 동물의 생식선에 코드화된 서열로부터 달라진다), 인간화될 수 있으며, 및/또는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실로 변형될 수 있다. 어떤 상황에서는(예컨대 CDR3에 대해), CDR은 연속적이지 않지만(예컨대 재배열되지 않은 핵산 서열에서), 예컨대 서열의 스플라이싱 또는 연결(예컨대 중쇄 CDR3를 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열에서 연속적인 둘 또는 그 이상의 서열(예컨대 생식선 서열)에 의해 코드화될 수 있다.

용어 "보존성"은 보존성 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용될 때, 유사한 화학적 특성(예컨대 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 R 기를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 아미노산 잔기가 치환되는 것을 포함한다. 일반적으로 보존성 아미노산 치환은 실질적으로는 단백질의 관심의 기능적 특성, 예를 들면 가변 영역이 원하는 친화성으로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 가지는 측쇄를 가지는 아미노산 그룹의 실례로는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 쓰레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아마이드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄를 들 수 있다. 보존성 아미노산 치환기로는 예를 들면 발린/로이신/이소로이신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파테이트 및 아스파라긴/글루타민이 있다. 어떤 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 예를 들면 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 사용되는 것과 같이, 알라닌으로 단백질의 어떠한 천연 잔기를 치환하는 것일 수 있다. 어떤 구체예에서, 문헌에 개시된 PAM250 로그-유사성 매트릭스(Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45)에서 포지티브 값을 가지는 보존성 아미노산 치환이 만들어진다. 어떤 구체예에서, 치환은 치환이 PAM250 로그-유사성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가지는 적당하게 보존성인 치환이다.

어떤 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 잔기 위치는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 다르다. 어떤 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 그것의 기능성 단편(예컨대 B 세포로부터의 발현 및 분비를 가능하게 하는 단편)에서 잔기 위치는 그것의 아미노산 서열이 본원에서 열거된 경쇄와 동일하지는 않지만, 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 상이하다.

구절 "에피토프-결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR를 가지고 있고 선택적으로 에피토프를 인지할 수 있는, 예컨대 약 1 마이크로몰 또는 그 이하의 K_D(예컨대 약 1×10^-6M, 1×10^-7M, 1×10^-8M, 1×10^-9M, 1×10^-10M, 1×10^-11M 또는 약 1×10^-12M인 K_D)로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료적 에피토프-결합 단백질(예컨대 치료적 항체)은 자주 나노몰 또는 피코몰 범위의 K_D를 필요로 한다.

구절 "기능성 단편"은 발현되고, 분비되며, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 K_D로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인지는 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위의 K_D를 가지는 것을 포함한다.

면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식선"은 자손에게 계대될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.

구절 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하여, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 다르게 명시되지 않는 한 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄 단편은 CDR, CDR과 FR 및 그것들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 다음에 (N-말단으로부터 C-말단 쪽으로), C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인 및 C_H3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능성 단편은 에피토프를 특이적으로 인지할 수 있고(예컨대 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 K_D로 에피토프를 인지할 수 있는), 세포로부터 발현되고 분비될 수 있으며, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 일반적으로 생식선에 존재하는 V_H, D_H 및 J_H 절편의 레퍼토리로부터 유도된 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하는 가변 영역 유전자 서열에 의해 코드화된다. 다양한 유기체에 대하여 V, D 및 J 중쇄 절편에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스, www.imgt.org에서 찾아볼 수 있다.

용어 "동일성"은 서열과 관련하여 사용될 때, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 해당 기술분야에 공지되어 있는 많은 상이한 알고리즘에 의해 측정된 것과 같은 동일성을 포함한다. 본원에서 기술되는 어떤 구체예에서, 동일성은 10.0의 오픈 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 사용하는 ClustalW v.1.83(slow) 배열을 사용하고, Gonnet 유사성 매트릭스(MACVECTOR^TM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 측정된다. 서열의 동일성과 관련하여 비교되는 서열의 길이는 특정 서열에 따라 좌우되겠지만, 경쇄 불변 도메인의 경우 길이는 자체-결합되어 규준적인 경쇄 불변 도메인을 형성할 수 있는, 예컨대 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트를 형성할 수 있고 사람 또는 마우스의 적어도 하나의 C_H1 도메인과 상호작용할 수 있는 경쇄 불변 도메인으로 접히기에 충분한 길이의 서열을 함유하여야 한다. C_H1 도메인의 경우, 서열의 길이는 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트를 형성할 수 있고 사람 또는 마우스의 적어도 하나의 경쇄 불변 도메인과 상호작용할 수 있는 C_H1 도메인으로 접히기에 충분한 길이의 서열을 함유하여야 한다.

구절 "면역글로불린 분자"는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 상이하며, 경쇄는 동일하거나 상이할 수 있다.

구절 "경쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 다르게 명시되지 않는 한 사람 카파 및 람다 경쇄 및 VpreB, 및 대체 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 전형적으로, 다르게 명시되지 않는 한 세 개의 경쇄 CDR과 네 개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로 전체 길이의 경쇄는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 일반적으로 생식선에 존재하는 경쇄 V 및 J 유전자 절편의 레퍼토리로부터 유도된 V_L 및 J_L 절편을 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 코드화된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 경쇄 절편에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스, www.imgt.org에서 찾아볼 수 있다. 경쇄는 예를 들면 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 첫 번째 또는 두 번째 에피토프 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합하고 그것들을 인지함으로써 중쇄와 결합하고, 인지하거나 또는 보조하는 것들을 포함한다. 통상적이거나 보편적인 경쇄는 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자로부터 유도된 것들을 포함하고, 그것들의 체세포성 돌연변이된(예컨대 친화성 성숙된) 버전을 포함한다.

구절 "마이크로몰 범위"는 1 내지 999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되고; 구절 "나노몰 범위"는 1 내지 999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되며; 구절 "피코몰 범위"는 1 내지 999 피코몰"을 의미하는 것으로 의도된다.

구절 "체세포성 돌연변이된"은 본원에서 사용되는 것과 같이, 부류간 스위칭을 진행하는 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함하는데, 이때 부류간 스위칭된 B 세포의 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열(예컨대 중쇄 가변 도메인을 코드화하거나 또는 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 뉴크레오티드 서열)은 예를 들면 부류간 스위칭이 진행되지 않은 B 세포와 부류간 스위칭이 진행된 B 세포 사이의 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열의 차이와 같이, 부류간 스위칭 전의 B 세포의 핵산 서열과 동일하지 않다. "체세포성 돌연변이된"은 친화성-성숙되지 않은 B 세포의 해당하는 면역글로불린 가변 영역 서열(즉 생식 세포의 게놈 서열)에 동일하지 않은 친화성-성숙된 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함한다. 구절 "체세포성 돌연변이된"은 또한 관심의 에피토프에 대한 B 세포의 노출 후에 B 세포로부터의 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 언급을 포함하는데, 이때 핵산 서열은 관심의 에피토프에 대한 B 세포의 노출 전의 해당하는 핵산 서열과는 다르다. 구절 "체세포성 돌연변이된"은 또한 면역원 도전에 대한 반응으로 사람 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 가지는 동물, 예컨대 마우스에서 생성된, 그리고 그런 동물에서 고유하게 작동하는 선택 과정으로부터 유발된 항체로부터의 서열을 말한다.

핵산 서열과 관련하여 용어 "재배열되지 않은"은 동물 세포의 생식선에 존재하는 핵산 서열을 포함한다.

구절 "가변 도메인"은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로(다른 표시가 없는 한) 순서대로 다음의 아미노산 영역: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4를 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 성분들이 그것들의 의도된 방식으로 작동가능하게 연결되어 기능하게 되는 관계를 말한다. 한 가지 경우에, 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절을 보유하기 위하여 조절 서열(예컨대 프로모터, 인핸서, 침묵 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 가지 경우에, 면역글로불린 가변 영역(또는 V(D)J 절편)의 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 서열 안으로의 서열 사이에 적절한 재조합이 가능하도록 면역글로불린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

용어 "대체"는 유전자 대체와 관련하여, 내인성 유전자 유전자좌에 외인성 유전자 물질을 놓고, 그로써 내인성 유전자의 전부 또는 부분을 이종상동성 또는 상동성 핵산 서열로 대체하는 것을 말한다.

예를 들어 기능성 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "기능성"은 천연 단백질과 정상적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에 기능성 면역글로불린 유전자 절편은 재배열된 면역글로불린 유전자 서열을 생성하기 위해 재생적으로 재배열할 수 있는 가변 유전자 절편을 포함할 수 있다.

"중성 pH"는 약 7.0과 약 8.0 사이의 pH, 예컨대 약 7.0과 약 7.4 사이의 pH, 예를 들면 약 7.2와 약 7.4 사이의 pH, 예컨대 생리적 pH를 포함한다. "산성 pH"는 6.0 또는 그 이하의 pH, 예컨대 약 5.0과 약 6.0 사이의 pH, 약 5.75와 약 6.0 사이의 pH, 예를 들면 엔도솜 또는 리소좀 구획의 pH를 포함한다.

면역글로불린 경쇄 유전자에 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기

본 발명자들은 pH 의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 비-사람 동물이 경쇄의 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 위치에서 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 변형을 만듦으로써 제조될 수 있다는 것을 발견하였다. 비-사람 동물의 생식선에 변형을 만들어서 동물이 항체의 CDR에서 히스티딘을 발현하도록 하는 방법이 기술된다. 특히 마우스의 생식선의 면역글로불린 경쇄 가변 서열에 변형을 만드는 방법이 기술된다. 예를 들어 경쇄의 가변 영역 서열은 전형적으로 가변 영역 서열을 따라 체세포성 과돌연변이를 나타내고, 어떤 경우에는 그런 돌연변이가 히스티딘 잔기의 치환을 유발할 수 있다(도 1 참조). 그런 돌연변이는 항원 결합에 기여하는 가변 도메인 영역인 상보성 결정 영역(CDR)에서도 일어날 수 있다. 어떤 경우에는 그런 돌연변이는 pH-의존성 항원 결합, 예컨대 중성 pH에서의 항원 결합에 비교하여 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 나타내는 항체를 유발할 수 있다. 그런 pH-의존성 항원 결합은 그것으로 인해 세포 외부에서 항원에 항체가 결합하는 것이 가능해지고, 엔도솜으로 내재화될 때 항원이 방출되어 표적-중재된 소멸을 피하면서 표면으로 되돌아가서 또 다른 항원에 결합하도록 재순환되기 때문에 바람직하다. 이런 효과를 이루기 위하여 pH-의존성 결합 특성을 항-IL-6R 항체에 공학적으로 도입하기 위하여 무작위 his-주사 돌연변이생성을 사용함으로써 히스티딘 잔기를 도입하기 위한 접근법은 보고된 바 있다(US 2011/0111406 A1). 그러나 항체 잔기의 무작위 돌연변이생성은 항원에 대한 항체의 감소된 친화성을 유발할 수 있다. 항체 서열에 히스티딘 치환을 발현하도록 유전자 변형된 비-사람 동물은 관심의 항원에 대한 반응으로, 히스티딘 변형(들)으로 인해 또한 pH-의존성 항원 결합을 나타낼 고친화성 항체를 생성하는 것이 가능해진다.

그러므로 다양한 구체예에서, 본원에는 pH-의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 동물을 유발하는 변형을 포함하는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 쥐)이 제공된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(어떤 경우에는 "히스티딘 치환", "히스티딘 코돈 치환" 등으로도 언급될 수 있다)을 포함하는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열(예컨대 V_L 및/또는 J_L 절편 서열)의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 사람 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR; 예컨대 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)에 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 CDR3 코돈에 있다. 한 구체예에서, 경쇄는 κ경쇄이다. 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 포함하는 면역글로불린 경쇄, 예컨대 경쇄 CDR, 예를 들면 경쇄 CDR를 발현한다. 다른 구체예에서, 경쇄는 λ경쇄이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 κ 및 λ경쇄에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다.

히스티딘 잔기는 두 개의 상이한 코돈, CAT와 CAC(데옥시리보핵산 잔기)에 의해 코드화된다. 그러므로 비-히스티딘 코돈은 CAT 또는 CAC로 치환될 수 있다. 치환은 그것의 생식선 형태(즉 비-체세포성 돌연변이 상태)에서 히스티딘 잔기를 코드화하지 않는 코돈에서 공학적으로 처리된다.

한 구체예에서, 경쇄는 보편적 경쇄(또한 통상적인 경쇄로도 언급된다)이다. 미국 특허 출원 13/022,759, 13/093,156, 13/412,936 및 13/488,628(미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 및 2013/0045492)에 기술되어 있는 것과 같이, 다수의 중쇄에 대해 통상적인 경쇄를 선택하는 비-사람 동물(예컨대 마우스)이 실제로 활용된다. 다양한 구체예에서, 통상적인 경쇄만을 포함하는 비-사람 동물에서 발현된 항체는 동일한 또는 실질적으로 동일한 경쇄와 결합하고 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 특히 이중특이성 항체를 만들 때 유용하다. 예를 들어 그런 동물은 특이적으로 첫 번째 에피토프에 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해 첫 번째 면역원으로 면역될 수 있다. 동물(또는 유전적으로 동일한 동물)은 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위하여 두 번째 면역원으로 면역될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클론될 수 있고, 이중특이성 항체를 제조하기 위하여 세포에서 동일한 중쇄 불변 영역 및 동일한 경쇄(예컨대 통상적인 경쇄)와 함께 발현될 수 있는데, 이때 이중특이성 항체의 중쇄 성분은 동일한 경쇄 성분과 결합하여 발현하는 동물에 의해 선택될 수 있다. 기술된 다양한 구체예에서, 유전자 공학처리된 마우스의 가변 영역은 사람 가변 영역이다.

그러므로, 중쇄의 보다 다양한 패밀리, 이를테면 그것의 사람 가변 영역이 생식선 서열과는 동떨어진 중쇄, 예컨대 친화성 성숙된 또는 체세포성 돌연변이된 가변 영역과 적절하게 짝을 이룰 면역글로불린 경쇄를 생성할 수 있는 마우스가 공학적으로 제조될 수 있다. 다양한 구체예에서, 마우스는 사람 경쇄 가변 도메인이 체세포성 돌연변이를 포함하는 사람 중쇄 가변 도메인과 짝을 이루게 하고, 그로써 고친화성 결합 단백질로의 경로가 사람 치료제로서 사용하기에 적당하게 되도록 고안된다.

유기체 내에서 길고 복잡한 항체 선택 과정을 거쳐 유전자 공학제조된 마우스는 다양하게 수집된 사람 중쇄 가변 도메인을 제한된 수의 사람 경쇄 옵션과 짝을 이루는 데 있어 생물학적으로 적절한 선택을 하게 된다. 이것을 이루기 위하여, 마우스는 광범위한 다양한 사람 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 사람 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 공학처리된다. 면역원으로 도전받을 때, 마우스는 그것의 레퍼토리에서 크게 또는 수 또는 경쇄 옵션에 단독으로 제한되는, 면역원에 대한 항체를 발생시키기 위해 그것의 레퍼토리에서 해결의 수를 최대화시킨다. 다양한 구체예에서, 이것은 마우스가 그럼에도 불구하고 상대적으로 매우 다양한 사람 중쇄 가변 도메인, 이를테면 특히 체세포성 돌연변이된 사람 중쇄 가변 도메인과 부합하게 될 경쇄 가변 도메인의 적절하고 부합하는 체세포성 돌연변이를 이루는 것을 허용하는 것을 포함한다.

미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 및 2013/0045492에 기술되어 있는 공학적으로 제조된 통상적인 경쇄 마우스는 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션, 예컨대 2 이하의 V_L 절편 또는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함한 통상적인 또는 보편적인 경쇄 "ULC"를 코드화하는 핵산 서열을 포함하였다. 그런 제한된 레퍼토리를 이루기 위하여, 마우스는 천연 마우스 경쇄 가변 도메인을 만들거나 재배열하는 능력이 비기능성 또는 실질적으로 비기능성이 되도록 공학적으로 처리되었다. 한 측면으로, 이것은 예를 들면 마우스의 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 결실시킴으로써 이루어졌다. 앞서 기술된 것과 같이, 내인성 마우스 유전자좌는 그런 다음, 외인성 사람 가변 영역 유전자 절편이 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 유전자와 조합되어 재배열된 역 키메릭 경쇄 유전자(사람 가변, 마우스 불변)를 형성할 수 있는 방식으로, 내인성 마우스 경쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된, 선택된 적절한 외인성 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편에 의해 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 체세포성 돌연변이될 수 있다. 다양한 구체예에서, 체세포성 돌연변이를 획득하기 위해 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하기 위해 적절한 인핸서(들)이 마우스에 보유된다. 한 측면으로, 내인성 마우스 κ경쇄 유전자 절편을 사람 κ경쇄 유전자 절편으로 대체하기 위해 마우스 κ경쇄 유전자좌를 변형시킬 때, 마우스 κ 인트로닉 인핸서 및 마우스 κ3' 인핸서가 기능적으로 유지되거나 또는 파괴되지 않는다.

그러므로 다양한 역 키메릭(사람 가변, 마우스 불변) 중쇄와 결합된 제한된 레퍼토리의 역 키메릭(사람 가변, 마우스 불변) 경쇄를 발현하는 유전자 공학처리된 마우스가 제공되었다. 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편은 결실되고 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 단일한(또는 2개의) 재배열된 사람 경쇄 영역으로 대체된다. 재배열된 사람 경쇄 영역의 체세포성 과돌연변이를 최대화하기 위한 구체예에서, 마우스 κ 인트로닉 인핸서 및 마우스 κ 3' 인핸서가 유지된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 또한 비기능성 λ 경쇄 유전자좌, 또는 그것의 결실 또는 유전자좌가 λ 경쇄를 만들 수 없도록 만드는 결실을 포함한다.

보편적인 경쇄 마우스는 V_H, D_H 및 J_H 절편의 다양한 레퍼토리를 포함하고 있는 다양한 레퍼토리의 중쇄 가변 영역 서열을 활용할 수 없는 다양한 항원에 대한 반응으로 항체를 생성하였다. 그런 유전자 공학처리된 ULC 마우스에서 생성된 항체는 이중특이성 치료 항체를 디자인하는 데 유용하다; 그러나 어떠한 다른 항체와 같이, 각각의 이중특이성 항체는 그것의 혈장 내에서의 반감기 동안 오직 하나의 표적에만 결합할 수 있고; 항체는 엔도솜 안에 내재화되어 리소좀 분해의 표적이 된다. 연구 결과들은 MHC-부류-I-유사 Fcγ 수용체 FcRn이 면역글로불린을 분류하는 엔도솜으로부터 세포 표면으로 재순환시킴으로써 리소좀 분해로부터 면역글로불린을 구할 수 있음을 보여주었다(Simister and Mostov (1989) An Fc receptor structually related to MHC class I antigens. Nature 337:184-187). 상기에서 설명된 것과 같이, 항체 재순환의 효율을 개선하기 위하여, 항체 서열에 대한 추가의 변형, 예컨대 산성 pH(예컨대 엔도솜의 pH)에서 감소된 항원 결합을 유발하는 변형을 만드는 한편, 중성 pH(예컨대 혈액과 같은 신체 체액의 pH)에서 항체-항원 친화성과 특이성을 보유하는 것이 유익하다. 보편적 경쇄 서열에서 비-히스티딘 잔기에 대해 히스티딘 잔기가 치환되어 있는, 본원에서 기술된 비-사람 동물이 유익한데, 왜냐하면 그것들은 pH-의존성 결합, 예컨대 중성 pH에 비해 산성 pH에서 항원에 대한 감소된 결합을 나타내는 보편적 경쇄 방식을 토대로 하여 고친화성 항체를 생성할 수 있기 때문이다.

그러므로 한 구체예에서, 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 사람 경쇄 가변 유전자 절편의 제한된 레퍼토리로부터의 제한된 레퍼토리의 사람 경쇄 가변 영역, 또는 단일한 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 쥐)이 본원에 제공되는데, 이때 사람 경쇄 가변 영역(들)은 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 적어도 하나의 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, 단일한 경쇄를 발현하는(또는 두 개의 경쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는) 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자(또는 두 개의 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자)를 형성하도록 재배열하는 단일한 재배열되지 않은 사람 경쇄 가변 영역 유전자 절편(또는 두 개의 사람 경쇄 가변 영역 유저자 절편)을 포함하도록 유전자 공학처리된 비-사람 동물이 제공되는데, 이때 경쇄 가변 영역 유전자(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 이들 히스티딘-치환된 경쇄 가변 영역 유전자(들)에 의해 코드화된 재배열된 사람 경쇄 가변 도메인은 동물에 의해 선택된 다수의 친화성-성숙된 사람 중쇄와 짝을 이룰 수 있고, 이때 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다양한 구체예에서 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 적어도 하나의 치환은, 동족의 중쇄와 함께 발현될 때 pH-의존성 방식으로 그것의 항원에 결합하는 재배열된 사람 경쇄를 유발한다.

제한된 레퍼토리의 사람 경쇄 가변 도메인, 또는 단일한 사람 경쇄 가변 도메인을 제한된 레퍼토리의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 발현하는 유전자 공학처리된 동물이 제공되는데, 이때 가변 영역 유전자 서열은 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 적어도 하나의 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 단일 경쇄의 가변 영역을 발현하는(또는 두 개의 가변 영역 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는) 단일한 V/J 사람 경쇄 서열(또는 두 개의 V/J 서열)을 포함하도록 유전자 공학처리된 동물이 제공된다. 한 측면으로, 가변 서열을 포함하는 경쇄는 동물에 의해 클론적으로 선택된 다수의 친화성-성숙된 사람 중쇄와 짝을 이룰 수 있고, 이때 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체는 그것의 항원(들)에 pH-의존성 방식으로 결합한다. 한 구체예에서, 단일한 V/J 사람 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된다. 한 구체예에서, 두 개의 V/J 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1이다. 한 구체예에서, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열은 재배열된 V/J 서열이다.

한 측면으로, 사람 J_L 유전자 절편(하나 또는 다수의 J_L 절편으로부터 선택됨)과 재배열될 수 있고 면역글로불린 경쇄의 사람 가변 도메인을 코드화할 수 있는 단일한 사람 면역글로불린 경쇄 V_L 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공되는데, 이때 단일한 사람 면역글로불린 경쇄 V_L 유전자 절편 및/또는 사람 J_L 유전자 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 다른 측면으로, 둘 이하의 사람 V_L 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이것들은 각각 사람 J_L 유전자 절편(하나 또는 다수의 J_L 절편으로부터 선택됨)과 재배열될 수 있고 면역글로불린 경쇄의 사람 가변 도메인을 코드화할 수 있으며, 이때 둘 이하의 V_L 유전자 절편 및/또는 J_L 유전자 절편의 각각은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다.

본원에는 또한 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 사람 V_L 및 J_L 서열을 포함하는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 측면으로, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 사람 생식선 V_L 및 J_L 유전자 서열로부터 유도되지만, 히스티딘 치환(들)에 대해서는 그렇지 않다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄는 사람 면역글로불린 κ사슬이다. 그러므로 한 구체예에서, 사람 V_L 유전자 서열은 Vκ1-39 및 Vκ3-20으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 재배열된 Vκ1-39/J 또는 Vκ3-20/J 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 J_L 유전자 서열은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5로부터 선택된다. 한 구체예에서, 사람 J_L 서열은 Jκ1 및 Jκ5로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1으로부터 선택된다(예컨대 그러나 히스티딘 치환(들)에 대해서는 그렇지 않다). 대체 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄는 사람 λ사슬이다.

한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환은 경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환은 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 또는 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 특정 구체예에서, 치환은 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다.

한 측면으로, 치환은 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3 코돈에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환이다. 한 구체예에서, 그 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈의 치환이다. 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 Vκ1-39Jκ5 가변 영역인 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 CDR3를 코드화하는 면역글로불린 경쇄 유전자 서열의 위치에서의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 106에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 108에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 108에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 108에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 또 다른 구체예에서, 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 히스티딘-치환된 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 도 2의 서열 배열에 도시되고 SEQ ID NO:4 내지 33에 표시된다. 야생형 CDR3 핵산 및 아미노산 서열(도 2에 도시됨)은 각각 SEQ ID N):2와 3에 표시된다.

단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 Vκ3-20Jκ1 가변 영역인 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 CDR3 영역을 코드화하는 면역글로불린 경쇄 유전자 서열의 위치에서의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 106에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 107에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 107에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 107에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 또 다른 구체예에서, 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 히스티딘-치환된 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 도 12의 서열 배열에 도시되고 SEQ ID NO:76 내지 79에 표시된다. 야생형 CDR3 핵산 및 아미노산 서열(도 12에 도시됨)은 각각 SEQ ID N):74와 75에 표시된다.

아미노산 위치(105, 106 등)는 Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77에 기술된 독특한 넘버링을 토대로 하고, 또한 www.imgt.org 상에서도 볼 수 있다.

한 구체예에서, 사람 V_L 유전자 절편은 사람 또는 비-사람 리더 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 리더 서열은 비-사람 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 비-사람 리더 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 리더 서열은 재배열되지 않은 사람 V_L 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 리더 서열은 재배열된 사람 V_L/J_L 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러므로 한 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스틴 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역 유전자 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 작동가능하게 연결된다.

한 구체예에서, V_L 유전자 절편은 면역글로불린 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터 서열은 사람 프로모터 서열이다. 특정 구체예에서, 사람 면역글로불린 프로모터는 사람 Vκ3-15 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열되지 않은 사람 V_L 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열된 사람 V_L/J_L 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러므로 한 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스틴 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역 유전자 서열은 사람 Vκ3-15 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 경쇄 유전자좌는 5'(V_L 유전자 절편의 전사 방향과 관련하여)의 옆에 사람 면역글로불린 프로모터와 3' 옆에 사람 J_L 절편과 재배열되고 내인성 비-사람 경쇄 불변 영역(C_L)을 포함하는 역 키메릭 경쇄의 가변 도메인을 코드화하는 사람 V_L 유전자 절편이 있는 리더 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, V_L 및 J_L 유전자 절편은 비-사람 Vκ 유전자좌에 있고, 비-사람 C_L은 비-사람 Cκ(예컨대 마우스 Cκ)에 있다. 한 특정 구체예에서, 가변 영역 서열은 비-사람 불변 영역 서열, 예컨대 비-사람 Cκ 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 경쇄 유전자좌는 5'(V_L 유전자 절편의 전사 방향과 관련하여)의 옆에 사람 면역글로불린 프로모터와 3' 옆에 재배열된 사람 가변 영역 서열(V_L/J_L 서열)을 포함하고 내인성 비-사람 경쇄 불변 영역(C_L)을 포함하는 역 키메릭 경쇄의 가변 도메인을 코드화하는 리더 서열을 포함한다. 특정 구체예에서,재배열된 사람 V_L/J_L 서열은 비-사람 카파(κ) 유전자좌에 있고, 비-사람 C_L은 비-사람 Cκ에 있다. 한 특정 구체예에서, 재배열된 사람 가변 영역 서열은 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열, 예컨대 비-사람 Cκ 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-사람 서열이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이고 Cκ 유전자 서열은 마우스 Cκ 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 내인성 비-사람(예컨대 마우스) 면역글로불린 경쇄 유전자좌(κ 유전자좌)에 있다. 유전자좌의 예시적인 구체예는 도 8c, 도 8e, 도 14c 및 도 14d에 도시된다.

한 구체예에서, 유전자 번형된 비-사람 동물은 마우스이고, 마우스의 가변 영역 유전자좌는 κ경쇄 유전자좌이며, κ경쇄 유전자좌는 마우스 κ 인트로닉 인핸서, 마우스 κ3' 인핸서 또는 인트로닉 인핸서와 3' 인핸서 둘 다를 포함한다.

한 구체예에서, 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 쥐 또는 마우스)은 비기능성 면역글로불린 람다(λ) 경쇄 유전자좌를 포함한다. 특정 구체예에서, λ 경쇄 유전자좌는 유전자좌의 하나 또는 그 이상의 서열의 결실을 포함하는데, 그 하나 또는 그 이상의 결실은 λ 경쇄 유전자좌를 경쇄 유전자를 형성하기 위해 재배열하지 못하도록 만든다. 다른 구체예에서, λ 경쇄 유전자좌의 모든 또는 실질적으로 모든 V_L 유전자 절편이 결실된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 쥐 또는 마우스)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 재배열되지 않은 기능성 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 예컨대 재배열되지 않은 내인성 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되고 히스티딘-치환된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 재배열되지 않은 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 대체한다.

한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 사람 가변 영역 서열로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 만든다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 사람 가변 영역 서열으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 가변 도메인과, 비-사람 Cκ 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 λ경쇄를 발현하지 않는다.

해당 기술분야의 숙련자는 비록 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환(들)이 체세포성 과돌연변이로 인해 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역안으로 유전자 공학적으로 도입되긴 하지만, 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 모든 항체가 공학적으로 처리된 위치(들)에 히스티딘 잔기(들)을 은닉하지 않을 것임을 인지할 것이다. 그러나, 비-사람 동물에서 광범위한 레퍼토리의 항체의 생성은 생체 내에서 관심의 항원에 대해 고친화성을 나타내는 한편 생식선안에 도입된 히스티딘 변형을 보유하고, 그로써 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항원-특이적 항체의 생성에 대한 선택을 허용할 것이다.

그러므로 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 동물은 그것의 가변 영역 유전자 안으로 도입된 체세포성 돌연변이된 경쇄 가변 도메인에 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물은 또한 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편 서열을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편 서열은 사람 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편 서열이고, 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 사람 중쇄 가변 영역이다. 한 구체예에서, 사람 V_H, D_H 및 J_H 유전자 절편 서열은 비-사람 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-사람 중쇄 불변 영역 서열이다. 한 구체예에서, 사람 중쇄 유전자 절편 서열은 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있다. 한 구체예에서, 비-사람 동물에 포함된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열은 또한 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함한다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 비-사람 동물은 비-사람 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 사람 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 비-사람 동물은 C_H1 서열, 힌지 서열, C_H2 서열, C_H3 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 비-사람 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 C_H1 서열, 힌지 서열, C_H2 서열, C_H3 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.

동물이 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 구체예에서, 동물의 생식선의 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 비-사람 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다. 특정 구체예에서, 동물의 생식선에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 비-사람 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-사람 경쇄 V 및 J 절편 서열을 대체한다.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 내인성 V_H 유전자 절편의 하나 또는 그 이상의 사람 V_H 유전자 절편으로의 대체를 포함하는데, 이때 사람 V_H 유전자 절편은 비-사람 C_H 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어서 비-사람 동물이 사람 V_H 유전자 절편을 재배열하고, 사람 V_H 도메인과 비-사람 C_H를 포함하는 역 키메릭 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 90 내지 100%의 재배열되지 않은 비-사람 V_H 유전자 절편이 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든(예컨대 90 내지 100%) 내인성 비-사람 V_H 유전자 절편은 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 19, 적어도 39 또는 적어도 80 또는 81의 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 일어난다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 또는 적어도 43개의 기능성 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 일어난다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 모든 비-사람 D_H 및 J_H 절편의 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 D_H 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 J_H 절편으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 모든 비-사람 D_H 및 J_H 절편의 모든 재배열되지 않은 사람 D_H 절편 및 모든 재배열되지 않은 사람 J_H 절편으로의 대체를 포함한다.

그것의 게놈, 예컨대 생식선에, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환 및 다양한 레퍼토리의 재배열되지 않은 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편을 가지는, 제한된 레퍼토리의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 예컨대 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역(예컨대 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1)을 포함하고 있는 비-사람 동물, 예컨대 마우스는 재배열되지 않은 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편의 다양한 과돌연변이로부터 유도된 중쇄 가변 영역 서열에 의해 코드화된 항원 결합 단백질을 생성할 수 있는데, 이때 중쇄 가변 서열에 존재하는 V_H, D_H 및 J_H 절편은 동물의 게놈에 존재하는 모든 또는 실질적으로 모든 기능성 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편으로부터 유도된다. 본원에서 기술된(즉 다양한 기능성 사람 V, D 및 J 절편의 조합으로부터 유도된) 유전자 변형된 동물의 세포, 예컨대 B 세포에서 발현된 중쇄 가변 도메인 서열에 대한 다양한 활용가능한 가능성은 미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/192300 및 2013/0045492에 기술된다. 다양한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 비-사람 동물의 생식선에 포함된다.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 하나 또는 둘 다의 하나의 복사물을 포함한다. 다른 구체예에서, 비-사람 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 하나 또는 둘 다의 두 개의 복사물을 포함한다. 그러므로 비-사람 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 하나 또는 둘 다에 대해 동형접합성이거나 이형접합성일 수 있다.

그들의 게놈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는(예컨대 경쇄의 CDR3에) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열(예컨대 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열)을 포함하고 있는 유전자 변형된 비-사람 동물 외에, 본원에는 하나 또는 그 이상의 히스티딘 코돈(들)이 첨가된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있어서, 발현된 가변 도메인이 만약 체세포성 과돌연변이가 일어나지 않는다면 히스티딘일 추가의 아미노산(들)을 발현하는 유전자 변형된 비-사람 동물이 제공된다.

본원에서 기술된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 유전자 변형된 비-사람 동물은 마우스, 쥐, 토끼, 돼지, 소(예컨대 젖소, 황소, 물소), 양, 사슴, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예컨대 마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적당한 유전자 변형가능한 ES 세포를 쉽게 구할 수 없는 비-사람 동물인 경우에 본원에 기술된 것과 다른 방법들이 유전자 변형을 포함하는 비-사람 동물을 제조하기 위하여 사용된다. 그러한 방법으로는 예를 들면 비-ES 세포 게놈(예컨대 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형시키고, 변형된 게놈을 적당한 세포, 예컨대 난모세포에 전달하기 위해 핵전달을 사용하며, 변형된 세포(예컨대 변형된 난모세포)를 배(embryo)를 형성하기에 적당한 조건 하에서 비-사람 동물에 잉태시키는 것을 포함한다.

한 측면으로, 비-사람 동물은 포유류이다. 한 측면으로, 비-사람 동물은 작은 포유류, 예컨대 다이포도이데아 또는 뮤로이데아 슈퍼패밀리의 포유류이다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 쥐 및 햄스터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 설치류는 뮤로이데아 슈퍼패밀리로부터 선택된다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 동물은 칼로마이시다에(예컨대 마우스-유사 햄스터), 크리세티다에(예컨대 햄스터, 신세계 쥐 및 마우스, 들쥐), 뮤리다에(트루 마우스 및 쥐, 게르빌루스 쥐, 아프리카 가시쥐 및 크레스트 쥐), 네소마이다에(클라이밍 마우스, 락 마우스, 꼬리가 달린 쥐, 마다가스카라 쥐 및 마우스), 플라타칸토마이다에(예컨대 가시가 있는 동면쥐류) 및 스팔라시다에(예컨대 두더지, 대나무 쥐 및 조코)로부터 선택된 패밀리로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 쥐(뮤리다에 패밀리), 게르빌루스 쥐, 아프리카 가시쥐 및 크레스트 쥐로부터 선택된다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 뮤리다에 패밀리의 구성원으로부터 유래한다. 한 구체예에서, 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스와 쥐로부터 선택된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이다.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C58BL 계통의 마우스이다. 다른 구체예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예컨대 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/ScEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2로 이루어진 군으로부터 선택된 129 계통이다(예컨대 Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). 특정 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합이다. 다른 특정 구체예에서, 마우스는 상기언급된 129 계통끼리의 혼합, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합이다. 특정 구체예에서, 혼합의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 다른 구체예에서, 마우스는 BALB 계통, 예컨대 BALB/c 계통이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 BALB 계통과 다른 상기 언급된 계통의 혼합이다.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 쥐이다. 한 구체예에서, 쥐는 위스타 쥐, LEA 계통, 스프라그 도울리 계통, 피셔 계통, F344, F6 및 검은 아구터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 쥐 계통은 위스타, LEA, 스프라그 도울리, 피셔, F344, F6 및 검은 아구터로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 또는 그 이상의 계통의 혼합이다.

그러므로 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-사람 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-사람 동물은 쥐 또는 마우스이다. 한 구체예에서, 동물은 마우스이다. 그러므로, 한 구체예에서, 본원에는 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 사람 V_L 및 J_L 유전자 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고 있는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 적어도 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열되지 않은 기능성 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다(예컨대 재배열되지 않은 기능성 V 및 J 유전자 절편 서열이 결핍되어 있다). 한 구체예에서, 히스티딘 코돈의 치환(들)이 포함된 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 Vκ1-39/Jκ 또는 Vκ3-20/Jκ 가변 영역이다. 한 구체예에서, J 절편 서열은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5로부터 선택된다. J 절편 서열은 Jκ1 또는 Jκ5이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR3 영역을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있다. 한 구체예에서, 재배열된 가변 영역 서열이 Vκ1-39/Kκ5인 경우, 히스티딘 치환(들)은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 발현되도록 디자인된다. 다른 구체예에서, 재배열된 가변 영역 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열인 경우, 히스티딘 치환(들)은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 발현되도록 디자인된다. 한 구체예에서, 치환된 히스티딘 코돈(들)을 가지는 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 내인성 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열(예컨대 Cκ 유전자 서열)에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 마우스는 추가로 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들)을 포함하는 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열과 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열은 마우스의 생식선에 포함된다.

또한 본원에는 본원에서 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물, 예컨대 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터가 제공된다. 한 측면으로, 벡터의 5'과 3' 마우스 상동성 아암의 서열과 관련하여 전사 방향으로 5'에서 3' 방향으로, 5' 마우스 상동성 아암, 사람 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 사람 또는 마우스 리더 서열, 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 사람 가변 영역 및 3' 마우스 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다. 한 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 5'에 및 마우스 Cκ 유전자 가까이에 존재하는 인핸서 서열과 관련하여 서열 5'에 벡터를 표적화한다. 다른 구체예에서, 표적화 벡터는 5' 마우스 상동성 아암과 이어서 양옆에 재조합 부위가 있는 선택 카세트, 사람 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 사람 또는 마우스 리더 서열, 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 사람 가변 영역과, 이어서 마우스 인핸서 및 불변 영역(Cκ) 서열을 포함하는 3' 마우스 상동성 아암을 포함한다.

선택 카세트는 관심의 구성물이 통합되어 있는 세포(예컨대 ES 세포)의 선택을 용이하게 하기 위해 표적화 구성물 안에 도입된 뉴클레오티드 서열이다. 많은 적당한 선택 카세트가 해당 기술분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 선택 카세트는 특정 항생물질(예컨대 Neo, Hyg, Pur, CM, Spec 등)의 존재하에 포지티브 선택을 가능하게 한다. 또한 선택 카세트는 양옆에 재조합 부위가 있을 수 있는데, 그것은 재조합 효소로 처리될 때 선택 카세트의 결실을 가능하게 한다. 통상적으로 사용되는 제한 부위는 Cre와 Flp 효소에 의해 인지되는 loxP와 Frt이지만, 다른 것들도 해당 기술분야에 알려져 있다.

한 구체예에서, 프로모터는 사람 면역글로불린 가변 영역 유전자 절편 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 사람 Vκ3-15 프로모터이다. 한 구체예에서, 리더 서열은 마우스 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 리더 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열이다. 표적화 벡터의 예시적인 구체예는 도 8b와 도 14b에 제시된다.

한 측면으로 상기에서 기술된 것과 같은 표적화 벡터가 제공되지만, 5' 마우스 상동성 아암 대신 사람 또는 마우스 프로모터가 부위-특정 재조합효소 인지 부위(SRRS)와 함께 5' 옆에 있고, 3' 마우스 상동성 아암 대신 사람 V_L 영역이 SRRS와 함께 3' 옆에 있다.

또한 본원에는 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 쥐)을 제조하는 방법이 제공된다. 한 측면으로, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물의 제조방법은 VELOCIGENE® 기술을 사용하여, 실시예에서 기술되는 것과 같이, 구성물을 ES 세포 안에 도입시키고, 표적화된 ES 세포를 VELOCIMOUSE® 기술을 사용하여 마우스 배 안에 도입시키는 표적화 벡터를 활용한다. 히스티딘 변형은 다양한 분자 생물학 기법, 예컨대 부위 특정 돌연변이생성 또는 새로운 DNA 합성을 사용하여 표적화 벡터 안에 도입될 수 있다. 유전자 표적화가 완료되면, 유전자 변형된 비-사람 동물의 ES 세포가 선별되어 관심의 외인성 뉴클레오티드 서열의 성공적인 통합 또는 외인성 폴리펩티드의 발현이 확인된다. 많은 기법들이 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는데, 예를 들면 (그것들에 한정되는 것은 아니지만) 서던 블롯팅, 긴 PCR, 정량적 PCT(예컨대 TAQMAN®을 사용하는 실시간 PCR), 형광 제자리 혼성화, 노던 블롯팅, 유동세포 분석, 웨스턴 분석, 면역세포 화학, 면역조직학 등을 포함한다. 한 실시예에서, 관심의 유전자 변형을 포함하고 있는 비-사람 동물(예컨대 마우스)은 문헌(Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659)에서 기술된 대립유전자 분석의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및/또는 사람 대립유전자의 획득에 대해 선별됨으로써 확인될 수 있다. 유전자 변형된 동물에서 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 확인하는 다른 분석은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.

그러므로 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-사람 동물의 제조 방법은 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열(사람 V_L 및 J_L 유전자 절편을 포함한다)로 대체하는 것을 포함하고, 이때 사람 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR 영역, 예컨대 CDR3 영역을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물의 제조 방법은 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 사람 V_L 및 J_L 유전자 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열로 대체하는 것을 포함하는데, 이때 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 CDR 코돈에 있다. 한 구체예에서, 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈(들)의 치환이다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 Vκ1-39/Jκ5 및 Vκ3-20/Jκ1로부터 선택된 사람 생식선 재배열된 경쇄 가변 영역 서열을 토대로 한다. 그러므로 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ1-39Jκ5로부터 유도된 경우, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ3-20κ1로부터 유도된 경우, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다.

다른 구체예에서, 본원에 기술된 비-사람 동물(즉 본원에 기술된 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는)의 제조 방법은 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는 비-기능성 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 절편을 결실시키거나 비-기능성으로 만들기 위하여 비-사람 동물의 게놈을 변형시키고, 게놈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 위치시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 관심의 항원에 대해 pH 의존성 결합을 나타내는 항체에 대해 풍부해진 B 세포 집단을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물을 유발한다.

어떤 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물의 제조 방법은 상기에서 설명된 것과 같이, 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열이 사람 V_H, D_H 및 J_H 서열의 각각 또는 레퍼토리의 적어도 하나를 포함하고 있는 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열로 대체되어 있는 동물에서 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로이 치환(들)을 포함하고 있는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열로 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 대체하는 것과 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열로의 대체를 포함하고 있는 비-사람 동물을 제조하기 위하여, 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 대체를 포함하는 동물은 중쇄 가변 영역 유전자 서열의 대체를 포함하는 동물로 사육된다.

본 발명자들은 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형을 포함하는 보편적 경쇄, 예컨대 사람 보편적 경쇄(예컨대 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로부터 유도된 경쇄)를 포함하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체를 발현하는 유전자 공학처리된 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예를 들면 쥐 또는 마우스)을 제공하는데, 이때 항원-결합 단백질은 표적 항원의 pH-의존성 항원 결합을 나타낸다. 동물은 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하도록 유전자 공학처리된다. 다양한 구체예에서, 경쇄 CDR3는 클러스터로 2, 3 또는 4 또는 그 이상의 히스티딘 잔기를 포함한다.

한 구체예에서, 본원에는 야생형 동물에 비교하여 면역글로불린 경쇄, 예컨대 면역글로불린 가변 도메인, 예를 들면 면역글로불린 CDR에 증대된 히스티딘 존재를 특징으로 하는 B 세포 집단을 포함하는 유전자 공학처리된 비-사람 동물(예컨대 마우스 또는 쥐)이 제공된다.

한 구체예에서, 본원에는 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 코돈 변형의 결과로서 히스티딘 잔기(들)를 발현하는 항원-특이적 항체 집단을 포함하고 표적 항원의 pH-의존성 결합을 나타내는 유전자 공학제조된 비-사람 동물이 제공된다. 한 구체예에서, 이들 동물은 항체, 예컨대 항원-특이적 항체에 대해 풍부해지고, 본원에 기술된 면역글로불린 경쇄 가변 영역에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하지 않은 동물에서 생성된 항원-특이적 항체의 집단에 비교하여 pH-의존성 결합 특성(예컨대 산성 pH 대 중성 pH에서 감소된 해리성 반감기(t_1/2))을 나타내는 B 세포 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역에 히스티딘 치환을 포함하는 유사한 동물에 비교하여 본원에서 기술된 유전자 공학제조된 동물에서 생성된 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타내는 항원-특이적 항체의 풍부화는 약 2배 이상, 예컨대 약 5배 이상, 예를 들면 약 10배 이상 더 크다. 그러므로 본 발명의 유전자 변형된 동물은 개선된 항체 재순환 특성을 가지는 항체에 대해 풍부해지는데, 그런 항체는 표적-중재된 소멸을 감소시키기 위해서뿐 아니라 그러한 생체 내 생성된 항체 형식을 토대로 개발된 치료적 항원-결합 단백질의 용량 및/또는 투약 빈도를 감소시키기 위해서 바람직하다.

그러므로 본원에는 본원에서 기술된 유전자 변형된 비-시람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질이 제공되는데, 그 항원-결합 단백질은 pH-의존성 항원 결합을 나타낸다. 한 구체예에서 항원-결합 단백질은 항체, 예컨대 항원-특이적 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 생식선 유전자 서열에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈이 히스티딘 코돈에 대해 치환되어 있고, 항체가 그것의 발현된 사람 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유하고 있는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 사람 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 사람 경쇄 가변 도메인을 포함하는데, 이때 단일한 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항체는 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하는데, 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 어떤 구체예에서, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 치환은 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 세 개의 비-히스티딘 코돈의 세 개의 히스티딘 코돈으로의 치환이고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 세 개의 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 치환은 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 네 개의 비-히스티딘 코돈의 세 개의 히스티딘 코돈으로의 치환이고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 세 개 또는 네 개의 히스티딘 치환을 보유한다.

한 구체예에서, 항체의 경쇄는 추가로 비-사람 경쇄 불변 영역 아미노산 서열, 예컨대 내인성 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 또한 본원에서 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 항체, 예컨대 항원-특이적 항체는 사람 중쇄 V, D 및 J 절편의 재배열로부터 유도된 사람 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 사람 중쇄 V, D 및 J 절편은 내인성 비-사람 중쇄 유전자좌에 존재하는 사람 중쇄 절편의 레퍼토리, 예컨대 적어도 하나의 기능성 V, 적어도 하나의 기능성 D 및 적어도 하나의 기능성 J 절편, 예를 들면 거의 완전한 레퍼토리의 기능성 사람 V, D 및 J 절편으로부터 선택될 수 있다. 사람 중쇄 가변 절편의 예시적인 가능한 재배열은 IMGT 데이터베이스의 기능성 사람 V, D 및 J 절편의 목록으로부터, 및 미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192309 및 2013/0045492로부터 얻을 수 있다. 나아가 한 구체예에서, 항체의 중쇄는 비-사람 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 예컨대 내인성 비-사람 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 불변 영역은 C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 IgG, IgE, IgD, IgM 또는 IgA 아이소타입이다.

그러므로, 한 구체예에서, 본원에는 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 결합 단백질이 제공되며, 그 결합 단백질은 (a) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 사람 Vκ1-39Jκ5 재배열로부터 유도된 경쇄 가변 도메인, 이때 경쇄는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유하고, 및 (b) 비-사람, 예컨대 마우스 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 경쇄를 포함하는데, 이때 경쇄는 (a) 동물에 존재하는 사람 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 선택된 사람 V, D 및 J 절편의 재배열로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 및 (b) 비-사람, 예컨대 마우스 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 사람 V, D 및 J 절편의 레퍼토리는 적어도 하나의 기능성 V, 적어도 하나의 기능성 D 및 적어도 하나의 기능성 J 절편, 예컨대 기능성 사람 V, D 및 J 절편의 거의 완전한 레퍼토리를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 내인성 중쇄 및 경쇄 불변 영역이다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 체세포성 돌연변이된 도메인이다. 한 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 어떤 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타낸다.

다른 구체예에서, 본원에는 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 결합 단백질이 제공되며, 그 결합 단백질은 (a) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 사람 Vκ3-20Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄 가변 도메인, 이때 경쇄는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유하고, 및 (b) 비-사람, 예컨대 마우스 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 경쇄를 포함하는데, 이때 경쇄는 (a) 동물에 존재하는 사람 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 선택된 사람 V, D 및 J 절편의 재배열로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 및 (b) 비-사람, 예컨대 마우스 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 사람 V, D 및 J 절편의 레퍼토리는 적어도 하나의 기능성 V, 적어도 하나의 기능성 D 및 적어도 하나의 기능성 J 절편, 예컨대 기능성 사람 V, D 및 J 절편의 거의 완전한 레퍼토리를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 내인성 중쇄 및 경쇄 불변 영역이다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 체세포성 돌연변이된 도메인이다. 한 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 어떤 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타낸다.

한 구체예에서, 본원에는 또한 그것의 생식선에 히스티딘-변형된 사람 경쇄 가변 영역 서열, 예컨대 본원에 기술된 히스티딘-변형된 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 본원에 기술된 항원-결합 단백질을 발현하는, 본원에 기술된 유전자 변형된 동물의 B 세포가 제공된다. 한 구체예에서, B 세포에서 발현된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 생식선에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하고, pH-의존성 항원-결합 특성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, B 세포에서 발현된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 생식선 안에 도입된 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 잔기를 보유하고, pH-의존성 항원-결합 특성을 나타낸다.

다양한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자-변형된 비-사람 동물은 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열, 예컨대 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(또는 히스티딘 코돈의 생식선 서열 안으로의 첨가)을 포함하는 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열(예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 서열)을 포함한다. 이들 첨가 또는 치환은 그것들의 항원에 대해 pH 의존성 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질에 대해 풍부해진 B 세포 집단을 포함하는 비-사람 동물을 유발한다. 한 구체예에서, 항원 자극에 대한 반응으로 본원에 기술된 비-사람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 pH 의존성 항원 결합을 나타내는 한편, 혈액과 같은 체액의 중성 pH, 예컨대 약 7.0 내지 약 8.0의 pH, 예를 들면 약 7.0 내지 약 7.4의 pH, 예컨대 약 7.2 내지 약 7.4의 pH에서 항원에 대해 고친화성을 나타낸다. 한 구체예에서, 중성 pH에서 해리 상수(K_D)로서 표시되는 항원-결합 단백질의 그것의 항원에 대한 친화성은 10^-6M 미만, 예컨대 10^-8M 미만, 예컨대 10^-9M 미만, 예컨대 10^-10M 미만, 예컨대 10^-11M 미만, 예컨대 10^-12M 미만이다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 중성 pH에 비교하여 산성 pH(예컨대 6.0 또는 그 이하의 pH, 예컨대 약 5.0 내지 약 6.0의 pH, 약 5.75 내지 약 6.0의 pH, 예컨대 엔도솜 또는 리소좀 구획의 pH)에서 그것의 항원에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 산성 pH에서 항원에 해한 결합을 나타내지 않는 반면, 중성 pH에서는 항원에 대한 결합을 보유한다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질은 중성 pH에서의 항원-결합 단백질의 해리성 반감기(t_1/2)에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기(t_1/2)의 감소를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 이하의 t_1/2를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 1분 또는 그 이하의 t_1/2를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 2분 또는 그 이하의 t_1/2를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 1분 또는 그 이하의 t_1/2를 나타낸다.

동역학적 매개변수, 예컨대 평형 해리 상수(K _D) 및 해리성 반감기(t_1/2)는 다음 식과 같이 동역학 속도 상수로부터 계산될 수 있다: K _D(M)=k _d/k _a; 및 t_1/2(분)=ln2/(60*k _d).

한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 FcRn 분자에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 상기에서 기술된 것과 같이, FcRn은 산성 pH에서 면역글로불린에 결합할 수 있고 그것들을 표면으로 되돌려보낼 수 있는, 엔도솜 구획 내부에 존재하는 수용체이다. 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 항체 분자를 선별하는 것은 다음의 세 가지 유익한 매개변수를 가지는 항체에 대한 독특한 선택의 기회를 제공한다: 항원에 대한 높은 친화성, pH-의존성 항원 결합(산성 pH에서는 보다 더 약하게 항원에 결합한다) 및 FcRn에 대한 증가된 결합.

한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물은, 생성되고, 치료제 안에 재구성될 때, 그것의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 히스티딘 변형(들)을 포함하지 않은 비-사람 동물에서 동일한 항원에 대한 반응으로 생성된 동등한 B 세포 집단을 능가하는 치료적 용량으로 대상에게 투여될 때 증가된 혈청 반감기를 나타내는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체에 대해 풍부해지는, 항원에 대한 반응인 B 세포 집단을 포함한다. 그러므로 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 관심의 항원에 대한 반응으로 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 치료제 안에 재구성될 때, 그것의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 히스티딘 변형(들)을 포함하지 않는 비-사람 동물에서 동일한 항원에 대한 반응으로 생성된 항원-결합 단백질(치료제 안에 재구성되고 동일한 치료 용량으로 투여될 때)의 혈청 반감기를 능가하는 치료제 용량으로 대상에게 투여될 때 증가된 혈청 반감기를 나타낸다. 어떤 구체예에서, 혈청 반감기의 증가는 약 2배, 예컨대 약 5배, 예컨대 약 10배, 예컨대 약 15배, 예컨대 약 20배 또는 그 이상이다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같이 비-사람으로부터 유도된 다능성, 유도된 다능성 또는 분화전능성 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 배 줄기(ES) 세포이다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물로부터 유도된 조직이 제공된다. 한 구체예에서, 조직은 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유도된다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물로부터 유도된 핵이 제공된다. 한 구체예에서, 핵은 B 세포가 아닌 2배체 세포로부터 유래한다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같이 비-사람 동물(예컨대 설치류, 예컨대 마우스 또는 쥐)로부터 분리된 비-사람 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 림프구이다. 한 구체예에서, 림프구는 B 세포이다. 한 구체예에서, B 세포는 사람 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인과; 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 재배열된 사람 Vκ1-39/J 서열, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 재배열된 사람 Vκ3-20/J 서열 및 그것들의 조합으로부터 유도된 경쇄를 포함하고 추가로 히스티딘에 대해 생식선에 코드화된 적어도 하나의 아미노산의 치환을 포함하는 키메릭 중쇄를 발현하며, 이때 중쇄 가변 도메인은 비-사람 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 비-사람 또는 사람 불변 영역에 융합된다.

한 측면으로, 하이브리도마가 제공되는데, 그 하이브리도마는 본원에서 기술된 것과 같은 비-사람 동물의 B 세포로 제조된다. 특정 구체예에서, B 세포는 관심의 에피토프를 포함하는 면역원으로 면역된 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유래하며, B 세포는 관심의 에피토프에 결합하는 결합 단백질을 발현하고, 결합 단백질은 체세포성 돌연변이된 사람 가변 중쇄 도메인과 마우스 C_H를 가지며, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 유도된 사람 가변 경쇄 도메인 및 마우스 C_L을 가지고, 이때 사람 경쇄 도메인은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다.

또한 본원에 기술된 비-사람 동물에서 생성된 항원-결합 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예컨대 PERC.6^TM 세포)로부터 선택된다.

한 측면으로, 비-사람 배(embryo)가 제공되는데, 그 배는 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물로부터 유도된 공여 ES 세포를 포함한다.

본원에 기술된 비-사람 동물은 CDR3에 히스티딘을 가지는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기에 유용하다. 히스티딘을 CDR3에 넣는 동물은 일반적으로 항체의 제조에 유용하고, 특히 중성 pH 주변에서 충분한 친화성으로 표적에 결합하지만 산성 pH에서는 동일한 표적에 결합하지 않거나 더 약하게 결합하는 항체를 개발하는 데에 유용하다.

비-사람 동물은 예컨대 CDR3에 히스티딘을 포함하는 사람 면역글로불린 가변 도메인에 의해 그것의 표적에 결합하는 사람 치료적 결합 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있는 항체의 가변 영역을 생성하는 데 유용하다. 더 낮은 pH에서의 변경된 결합은 어떤 상황에서는 더 빠른 전환을 허용하는데, 왜냐하면 치료제는 세포 표면의 표적에 결합하고, 엔도솜에 내재화되며, 더 쉽게 또는 더 신속하게 엔도솜의 표적으로부터 해리되어서, 치료제가 재순환되어 표적의 또 다른 분자(예컨대 다른 세포 상의 또는 동일한 세포 상의)에 결합할 수 있게 되기 때문이다. 어떤 상황에서는 이것은 더 낮은 용량으로 치료제를 투약하거나 덜 빈번하게 치료제를 투약하는 능력을 유발할 것이다. 이것은 특히 안전성 또는 독성의 이유로 빈번하게 투여하거나, 또는 특정 단위용량 이상으로 투여하는 것이 바람직하지 않은 경우에 유용하다. 그 결과로서, 항체 치료제의 혈청 반감기는 대상에게 투여될 때 증가될 것이다.

비-사람 동물, 예컨대 설치류, 예컨대 마우스 또는 쥐는 하나 또는 그 이상의 히스티딘을 그 안에 포함하는 CDR3를 가지는 항체 가변 영역을 나타내는 동물에서 B 세포의 수를 증가시키기 위한 방법에 유용하다. 비-사람 동물은 pH-의존성 항원 결합을 나타낼 항체 서열을 생성하는 데 유용하다. 비-사람 동물은 단일 면역화로부터 유발되는 항체 서열의 더 많은 수를 생성하는 데 유용한데, 이때 항체는 pH-의존성 항원 결합을 나타낼 것이다.

항원-결합 단백질 및 그것의 제조 방법

한 측면으로, 본원에는 또한 본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물로부터, 해당 기술분야에 사용된 표준 방법들을 사용하여, pH-의존성 항원 결합을 나타내는 사람 항원-결합 단백질, 예컨대 항체의 제조 방법이 제공된다.

항체를 제조하는 여러 가지 기법들이 기술되어 있다. 예를 들어 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같이 마우스에서 키메릭 항체가 제조된다. 항체는 면역된 마우스의 B 세포로부터 직접 분리되거나(예컨대 U.S. 2007/0280945A1) 및/또는 면역된 마우스의 B 세포는 하이브리도마를 제조하기 위하여 사용될 수 있다(Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497). 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물로부터의 항체(사람 중쇄 및/또는 경쇄)를 코드화하는 DNA는 종래 기법들을 사용하여 쉽게 분리되고 서열화된다. 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물로부터 유도된 하이브리도마 및/또는 B 세포는 그런 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면 DNA는 발현 벡터에 도입될 수 있고, 그런 다음 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하는 숙주 세포 안에 형질전환되어 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 얻을 수 있다. DNA는 또한 예를 들면 비-사람 서열 대신 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대해 코딩 서열을 치환함으로써 변형될 수 있다. 그러므로 일단 원하는 특징, 예컨대 친화성, 에피토프, pH-의존성 항원 결합 등을 가지는 항체의 핵산 서열이 결정되면, 비-사람 불변 영역 유전자 서열은 원하는 사람 불변 영역 서열로 대체되어 비-IgM 아이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 함유하는 전체 사람 항체가 생성된다.

그러므로 한 구체예에서, 본원에는 본원에 기술된 것과 같은 비-사람 동물(예컨대 마우스)을 제조하고, 마우스를 관심의 항원으로 면역시켜서 비-사람 동물이 항원에 대한 면역 반응을 시작하도록 허용하며, 비-사람 동물에서 pH 의존성 항원 결합 특성을 나타내는, 예컨대 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 약한 결합을 나타내는 항원-특이적 항체를 선택하는 것으로 이루어지는, pH-의존성 항원 결합 특성을 나타내는 항체의 제조 방법이 제공된다.

또한 본원에는 다중-특이성 항원 결합 단백질, 예컨대 이중특이성 항원-결합 단백질의 제조 방법이 제공된다. 이것들은 높은 친화성으로 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 분자이다. 본 발명의 장점은 각각이 단일한 경쇄에 결합할 적당하게 높은 결합(예컨대 친화성 성숙된) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함한다. 또한 본 발명의 장점은 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 다중-특이성, 예컨대 이중특이성 항원-결합 단백질을 생성하는 능력을 포함한다.

이중특이성 항체의 이중 성질(즉 하나의 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적이거나 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다, 예컨대 Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244) 때문에, 이중특이성 항체는 치료 용도에 많은 유용한 장점을 제공한다. 예를 들어 이중특이성 항체는 재지시된 세포독성(예컨대 종양 세포를 사멸하기 위한)에 대해, 백신 보조제로서, 혈전에 혈전 용해제를 전달하기 위하여, 표적 부위(예컨대 종양)에서 효소 활성화된 선구약물을 전환시키기 위하여, 감염성 질병을 치료하기 위하여, 세포표면 수용체에 면역 복합체를 표적화하기 위하여, 또는 면역독소를 종양 세포에 전달하기 위하여 사용될 수 있다.

본원에 기술된 이중특이성 항체는 또한 여러 치료적 및 비-치료적 및/또는 진단적 분석 방법, 예컨대 효소 면역분석, 2-부위 면역분석, 여러 질병(예컨대 암)의 시험관 내 또는 생체 내 면역진단, 경합성 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석에 사용될 수 있다. 이중특이성 항체에 대한 다른 용도들은 당업자들에게 드러날 것이다.

재조합 세포 배양물로부터 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 여러 가지 기법들이 보고되어 있다. 그러나 이중특이성 결합 단백질의 합성 및 발현은 부분적으로는 두 개의 상이한 중쇄와 결합하고 그것들을 발현할 수 있는 적당한 경쇄를 확인하는 것과 관련된 문제들로 인해, 그리고 부분적으로는 분리 문제로 인해 문제가 되어왔다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 성분들의 안정성/상호작용을 증가시킴으로써 관례적인 면역글로불린 구조를 유지하기 위해 특수한 변형(들)을 필요로 하지 않는 전체 길이의 이중특이성 항체의 장점을 제공한다. 다양한 구체예에서, 그런 변형(들)은 번잡하고 이중특이성 항체 기법의 개발 및 사람 질병에 대한 치료에 사용되는 그것들의 잠재적 사용에 대한 장애물로 작용하는 것으로 증명되었다. 그러므로 다양한 구체예에서, 다중 특이성의 첨가된 특성을 가지는 천연 면역글로불린 구조(즉 전체 길이)를 제공하는 것을 통하여 전체 길이의 이중특이성 항체는 이전의 이중특이성 단편들에 결핍되어 있던 그것들의 결정적인 이펙터 기능을 유지하고, 나아가 더 긴 반감기의 중요한 약물동력학적 매개변수를 증명하는 치료제를 제공한다.

본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 변형된 마우스가 그렇지 않은 경우 천연 과정들을 통하여, 하나 이상의 중쇄, 이를테면 체세포성 돌연변이된(예컨대 친화성 성숙된) 중쇄를 포함한 중쇄와 결합하여 그것을 발현할 수 있는 적당한 경쇄를 선택하는 것을 가능하게 하는데, 이때 경쇄는 추가로 그것의 pH-의존성 결합 특성을 항원-결합 단백질에 부여한다. 역 키메릭 중쇄를 가지는 친화성 성숙된 항체(즉 사람 가변 및 마우스 불변)를 발현하는, 본원에 기술된 것과 같은 면역된 마우스의 적당한 B 세포로부터의 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 적당한 사람 불변 영역 유전자 서열(예컨대 사람 IgG1)을 가지는 발현 벡터에서 확인되고 한 프레임으로 클론될 수 있다. 그러한 두 개의 구성물, 즉 각각의 구성물이 상이한 에피토프에 결합하는 사람 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 구성물이 제조될 수 있다. 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는, 사람 경쇄 가변 영역(예컨대 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1) 중 하나는 적당한 사람 경쇄 불변 영역 유전자(예컨대 사람 κ 불변 유전자)에 한 프레임으로 융합될 수 있다. 이들 세 개의 전체 사람 중쇄 및 경쇄 구성물은 적당한 세포에 발현을 위해 도입될 수 있다. 세포는 두 개의 주요 종을 발현할 것이다: 동일한 경쇄를 가지는 단일이량체 중쇄, 및 동일한 경쇄를 가지는 이종이량체 중쇄. 이들 주요 종의 용이한 분리를 가능하게 하기 위해 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정기를 생략하도록 변형되어, 그 결과 이종이량체 결합 단백질과는 다른 단일이량체 결합 단백질의 친화성이 유발된다. 이런 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 2010년 6월 25일에 USSN 12/832,838로 출원되고, "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format"의 제목으로 공개된 US 2010/0331527A1에 기술되어 있다. 일단 동일한 경쇄를 가지는 이종이량체 중쇄를 포함하는 종이 선택되면, 이 이중특이성 항원 결합 단백질은 그것의 pH-의존성 항원 결합 특성의 보유를 확인하기 위해 선별될 수 있다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 이때 사람 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 관심의 에피토프를 포함하는 항원으로 면역된 본원에 기술된 동물로부터 유도된다.

한 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 첫 번째 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단쪽으로 첫 번째 에피토프에 선택적으로 결합하는 첫 번째 에피토프-결합 영역과 이어서 IgG1, IgG2, IgG4 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 IgG의 첫 번째 C_H3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하고, 두 번째 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단 쪽으로 두 번째 에피토프에 선택적으로 결합하는 두 번째 에피토프-결합 영역과 이어서 IgG1, IgG2, IgG4 및 그것들의 조합으로부터 선택된 사람 IgG의 두 번째 C_H3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하며, 이때 두 번째 C_H3 영역은 단백질 A에 대한 두 번째 C_H3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다. 다양한 그런 변형은 예컨대 미국 출원 공개 번호 2010/0331527 및 2011/0195454에 기술되어 있다.

하나 이상의 에피토프에 결합하고 pH-의존성 에피토프 결합 특성을 나타내는 에피토프-결합 단백질을 제조하기 위한 한 가지 방법은 본 발명에 따르는 첫 번째 마우스를 관심의 첫 번째 에피토프를 포함하는 항원으로 면역시키는 것이고, 이때 마우스는 (1) 경쇄를 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 마우스 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 함유하지 않는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌를 함유하며, 그 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌는 마우스 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역이고, 재배열된 사람 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 사람 Vκ1-39Jκ5 및 사람 Vκ3-20Jκ1으로부터 선택되며, (2) 전체적으로 또는 부분적으로 사람 V_H 유전자 절편으로 대체된 내인성 마우스 V_H 유전자 절편을 포함함으로써 마우스에 의해 생성된 면역글로불린 중쇄가 단독으로 또는 실질적으로 사람 가변 도메인과 마우스 불변 도메인을 포함하는 중쇄가 된다. 그런 마우스는 면역될 때 두 개의 사람 경쇄 가변 도메인 중 단지 하나(예컨대 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 중 하나, 예컨대 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 포함하고 있음)를 포함하는 역 키메릭 항체를 생성할 것이다. 통상적으로, 생식선 서열 안에 도입된 치환된 히스티딘 잔기의 적어도 일부는 역 키메릭 항체에 보유될 것이다. 일단 B 세포가 관심의 에피토프에 결합하고 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타내는 항체를 발현하는 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 것으로 확인되면, 중쇄 가변 영역(및 임의로, 경쇄 가변 영역)의 뉴클레오티드 서열은 회복되고(예컨대 PCR에 의해), 발현 벡터 구성물 안에 적당한 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 한 프레임으로 클론될 수 있다. 이 과정은 두 번째 에피토프에 결합하는 두 번째 중쇄 가변 도메인을 확인하기 위해 반복될 수 있고, 두 번째 중쇄 가변 영역 유전자 서열은 회복되어 발현 벡터 안에 두 번째의 적당한 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 한 프레임으로 클론될 수 있다. 불변 영역 유전자 서열에 의해 코드화된 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 불변 도메인은 동일하거나 상이한 아이소타입일 수 있고, 면역글로불린 불변 도메인 중 하나(그러나 다른 것은 아님)는 본원에 또는 US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 변형될 수 있으며, 에피토프-결합 단백질은 적당한 세포에서 발현될 수 있고, US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 동종이량체 에피토프-결합 단백질에 비교하여 그것의 단백질 A에 대한 상이한 친화성을 토대로 분리될 수 있다.

그러므로 다양한 구체예에서, DNA의 분리와 원하는 특이성/친화성을 가지는 첫 번째 및 두 번째 사람 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 첫 번째 및 두 번째 핵산 서열, 및 사람 경쇄 도메인(본원에 기술된 것과 같이 비-사람 동물로부터 분리된 생식선 재배열된 서열 또는 경쇄 서열)을 코드화하고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 세 번째 핵산 서열의 선택에 이어서, 해당 기술분야에서 광범위하게 사용되는 재조합 기법을 사용하여 이중특이성 항체를 형성하기 위하여 분자들을 코드화하는 세 개의 핵산 서열이 발현된다. 때로 선택된 발현 시스템은 포유류 세포 발현 벡터 및 숙주를 포함하여서 이중특이성 항체가 적절하게 글리코실화된다(예컨대 글리코실화된 항체 도메인을 포함하는 이중특이성 항체의 경우에). 그러나 분자는 또한 원핵 발현 시스템에서도 생성될 수 있다. 정상적으로, 숙주 세포는 첫 번째 사람 중쇄 가변 도메인, 두 번째 사람 중새 가변 도메인 둘 다와, 사람 경쇄 도메인을 단일한 벡터 또는 독립적인 벡터 상에서 코드화하는 DNA로 형질전환될 것이다. 그러나 독립적인 발현 시스템에서 첫 번째 사람 중쇄 가변 도메인, 두 번째 사람 중쇄 가변 도메인 및 사람 경쇄 도메인(이중특이성 항체 성분들)을 발현하고, 시험관 내에서 발현된 폴리펩티드들을 결합시키는 것이 가능하다. 다양한 구체예에서, 사람 경쇄 도메인은 예컨대 CDR 코돈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환에 대해 생식선 서열로부터 유도된다. 다양한 구체예에서, 사람 경쇄 도메인은 경쇄 도메인의 경쇄 가변 서열 내에 하나 이하의, 2 이하의, 3 이하의, 4 이하의 또는 5 이하의 체세포성 과돌연변이를 포함한다. 어떤 구체예에서, 체세포성 과돌연변이는 경쇄 가변 영역의 생식선 서열 안에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 잔기의 존재를 변경시키지 않는다.

다양한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 두 개의 중쇄 및 단일한 사람 경쇄를 코드화하는 핵산(들)(예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA)은 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 및/또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 안에 삽입된다. 많은 벡터가 활용가능하고, 일반적으로는 그것들에 제한되는 것은 아니지만, 하나 또는 그 이상의 다음의 것들을 포함한다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 각각의 성분은 개별적으로 선택되거나 또는 선택된 숙주 세포 또는 실험적으로 결정된 다른 기준을 토대로 선택될 수 있다. 각 성분의 여러 실례들은 해당 기술분야에 공지되어 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인지되고 이중특이성 항체의 각각의 또는 모든 성분을 코드화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 강력한 숙주 세포에 의해 인지되는 대다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 이들 프로모터는 공급원 DNA로부터 제한 효소 소화에 의해 프로모터를 제거하고 분리된 프로모터 서열을 벡터에 삽입함으로써 이중특이성 항체-코드화 DNA에 작동가능하게 연결된다.

진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 다른 다세포 유기체로부터의 핵화 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 그런 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 임의로 3' 미번역 영역으로부터 활용될 수 있다. 이들 영역은 이중특이성 항체 성분을 코드화하는 mRNA의 미번역 부분에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 다양한 구체예에 적당한 발현 벡터로는 이중특이성 항체를 코드화하는 DNA의 포유류 세포에서의 일과성 발현을 제공하는 것들을 포함한다. 일반적으로 일과성 발현은 숙주 세포에서 효과적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함함으로써, 숙주 세포가 발현 벡터의 많은 복사물을 축적하고, 계속해서 발현 벡터에 의해 코드화된 원하는 폴리펩티드가 고수준으로 합성된다. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일과성 발현 시스템은 크론된 DNA에 의해 코드화된 폴리펩티드의 편리한 포지티브 확인뿐만 아니라, 첫 번째 또는 두 번째 사람 중쇄 가변 도메인의 동종이량체를 가지는 원래의 항체에 비교하여, 원하는 결합 특이성/친화성 또는 원하는 겔 이동 특징을 가지는 이중특이성 항체의 신속한 선별을 가능하게 한다.

다양한 구체예에서, 일단 이중특이성 항체의 성분을 코드화하는 DNA가 상기에서 기술된 것과 같은 원하는 벡터(들)에 조립되면, 그것들은 발현 및 회수를 위해 적당한 숙주 세포 안에 도입된다. 숙주세포를 형질전환시키는 것은 선택된 숙주 세포에 대해 적절한 해당 기술분야에서 공지되어 있는 표준 기법들(예컨대 일렉트로포레이션, 핵 마이크로주사, 박테리아 원형질의 무상세포, 또는 다가 양이온, 예컨대 폴리브렌, 폴리오르니틴과의 융합 등)을 사용하여 이루어질 수 있다.

다양한 구체예에서, 성분들을 함유하는 발현 벡터와 가장 잘 맞고 이중특이성 항체 종의 가장 효과적이고 선호할 수 있는 생성을 허용하는 숙주 세포가 선택된다. 발현을 위한 예시적인 숙주 세포로는 원핵 및 진핵 세포(단일한 세포 또는 다중 세포), 박테리아 세포(예컨대 대장균, 바실루스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예컨대 맥주효모균, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포 또는 세포 융합물, 예컨대 하이브리도마 또는 콰드로마를 포함한다. 다양한 구체예에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐 또는 마우스 세포이다. 다양한 구체예에서, 세포는 CHO(예컨대 CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예컨대 COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB8065, HL-60(예컨대 BHK21), Jurkat, Daudi, A431(상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 셀라인으로부터 선택된 진핵 세포이다. 다양한 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자를 포함하는데, 예를 들면바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예컨대 PER.C6^TM 세포)를 포함한다.

이중특이성 항체를 생성하기 위해 사용된 포유류 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 활용가능한 배지, 예컨대 Ham'S F10(Sigma), 최소 필수 배지((MEM), Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글스 배지((DMEM), Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적당하다. 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예컨대 HEPES), 뉴클레오시드(예컨대 아데노신 및 싸이미딘), 항생물질(예컨대 GENTAMYCIN^TM), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 규정됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원이 첨가될 수 있다. 어떠한 다른 첨가물이 또한 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 것과 같이 적절한 농도로 포함될 수 있다. 다양한 구체예에서, 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 앞서 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것들이고, 당업자들에게 명백해질 것이다.

이중특이성 항체는 배양 배지로부터 분비된 폴리펩티드로부터 회수될 수 있지만, 또한 분비 신호 없이 직접 생성될 때 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 만약 이중특이성 항체가 막-결합된다면, 적당한 계면활성제 용액(예컨대 트리톤-X 100)을 사용하여 막으로부터 방출될 수 있다.

적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 두 개의 사람 중쇄 및 단일한 사람 경쇄를 포함하고 있는 이중특이성 항체는 분리된 후에 그것의 항원 중 하나, 바람직하게는 둘 다에 대한 pH 의존성 결합을 나타내는 능력에 대해 선별된다. 중성 및 산성 pH에서 이중특이성 항체의 그것의 항원에 상이하게 결합하는 능력(예컨대 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 감소된 t_1/2를 증명하는 능력)은 해당 기술분야에서 활용되고 다음의 실시예에서 기술되는 다양한 기법, 예컨대 BIACORE^TM 분석에 의해 측정될 수 있다.

pH-의존성 항원 결합을 가지는 항원-결합 단백질의 추가의 제조 방법

본원에 기술된 유전자 변형된 비-사람 동물에서 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질을 제조하는 다양한 방법이 제공된다. 또한 시험관 내에서 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원 결합 단백질의 제조 방법에 제공된다. 그런 방법은 유전자 변형된 비-사람 동물에서 생체 내에서 항원-결합 단백질의 다양한 성분을 생성시키고, 그런 다음 그것들을 변형시킨 후 포유류 세포 배양물에서 발현된 단백질 복합체로서 유기체 외부에서 시험관 내로 재조립하는 것을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 제조 방법은 경쇄 가변 영역 V 및 J 절편의 제한된 레퍼토리, 예컨대 사람 경쇄 가변 영역 V 및 J 절편을 포함하는 마우스, "보편적 경쇄" 또는 "통상적인 경쇄" 마우스("ULC" 마우스), 예컨대 미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 및 2013/0045492에 기술되어 있는 마우스에서 생성된 항원-결합 단백질 서열, 예컨대 항체 서열을 활용한다. 한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 제조 방법은 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 마우스에서 생성된 항원 결합 단백질 서열을 활용한다. 한 구체예에서, 방법은 사람 Vκ1-39Jκ5 및 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 마우스에서 생성된 항원 결합 단백질을 활용한다.

한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체의 제조 방법은 관심의 항원에 결합하는(예컨대 원하는 친화성으로 관심의 항원에 결합하는) 첫 번째 항체를 선택하고, 첫 번째 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형시키며, 첫 번째 항체의 면역글로불린 중쇄 및 변형된 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 결합을 보유하고(예컨대 관심의 항원에 대한 원하는 친화성을 보유하고) 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는, 세포에서 발현된 두 번째 항체를 선택하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체의 제조 방법은, 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 가지는 면역글로불린 경쇄를 포함하며, 항체가 관심의 항원에 결합하는(예컨대 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는) 항체로부터 면역글로불린 중쇄를 선택하고(예컨대 비-사람 동물, 예를 들면 마우스, 예컨대 ULC 마우스로부터 얻고); 면역글로불린 경쇄의 핵산 서열을 변형시켜서 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 하며; 그것의 가변 도메인에 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 포함하고 있는 선택된 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 발현시키고; 그리고 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 결합을 보유하고(예컨대 관심의 항원에 대한 원하는 친화성을 보유하고) 한편으로 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 것을 포함한다. 다양한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄는 사람 중쇄 가변 유전자 절편(사람 V, D 및 J 절편)으로부터 유도된다.

한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체를 제조하는 방법은 (1) 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열과 재배열되지 않은 사람 중쇄 가변 유전자 절편(V, D 및 J 절편)의 레퍼토리를 포함하고 있는 비-사람 동물, 예컨대 마우스를 관심의 항원으로 면역시키고, 마우스가 상기 항원에 대한 면역 반응을 시작하도록 허용하며, (2) 비-사람 동물에서, 예컨대 마우스에서 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체를 선택하고, (3) 비-사람 동물로부터, 예컨대 마우스로부터 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체의 면역글로불린 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 분리하며, (4) 상기 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, (5) 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 함유하는 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형시키며, (6) 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체의 면역글로불린 중쇄 및 히스티딘 변형을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, 그리고 (7) 세포에서 발현된 항체가 중성 pH에서 항원에 대한 결합을 유지하는 한편 산성 pH에서 감소된 결합을 나타내는 지를 측정하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 세포에서 발현된 항체는 중성 pH에서 항원에 대한 원하는 친화성을 나타낸다. 다양한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄는 사람 중쇄 가변 유전자 절편(사람 V, D 및 J 절편)의 재배열로부터 유도된다.

한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 마우스는 예컨대 미국 출원 공개 번호 2011//0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 및 2013/0045492에 기술되어 있는 보편적 경쇄 또는 통상적인 경쇄 "ULC" 마우스이다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 사람 Vκ1-39Jκ5 및 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다.

한 구체예에서, 관심의 항원은 가용성 항원, 세포 표면 항원(예컨대 종양 항원) 및 세포 표면 수용체로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 세포 표면 수용체는 면역글로불린 수용체이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 수용체는 Fc 수용체이다.

한 구체예에서, 중성 pH에서 해리 상수(K_D)로서 표시되는 항원에 대한 항체의 원하는 친화성은 10^-6M 미만, 예컨대 10^-8M 미만, 예컨대 10^-9M 미만, 예컨대 10^-10M 미만, 예컨대 10^-11M 미만, 예컨대 10^-12M 미만이다.

상기에서 설명된 것과 같이, 한 구체예에서, ULC 마우스는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 서열을 포함하고, 항원에 대한 반응으로 항체를 발현하는데, 항원에 대한 항체의 친화성은 주로 그것들의 항체의 중쇄를 통해 중재된다. 이들 마우스는 항체의 사람 중쇄 가변 도메인을 코드화하도록 재배열되고 또한 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 서열로부터 유도된 경쇄를 포함하는 사람 중쇄 가변(V, D 및 J) 절편의 레퍼토리를 포함한다. 한 구체예에서, 이들 마우스는 항원에 노출될 때, 항원에 대한 친화성 및 특이성으로 항체를 생성하기 위하여 사람 중쇄 가변(V, D 및 J) 절편의 다양한 레퍼토리를 활용한다. 그러므로, 항원에 노출될 때 ULC 마우스에서 생성된 항체의 면역글로불린 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 또한 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열(예컨대 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열)로부터 유도된 면역글로불린 경쇄를 포함하는 원하는 결합 단백질을 생성하기 위하여 분리되고 활용될 수 있다.

ULC 마우스의 한 구체예에서, 90 내지 100%의 재배열되지 않은 비-사람 V_H 유전자 절편은 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든(예컨대 90 내지 100%) 내인성 비-사람 V_H 유전자 절편이 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 19, 적어도 30, 또는 적어도 80 또는 81개의 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 이루어진다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편 또는 적어도 43개의 기능성 재배열되지 않은 사람 V_H 유전자 절편으로 이루어진다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 모든 비-사람 D_H 및 J_H 절편의 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 D_H 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 J_H 절편으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 모든 비-사람 D_H 및 J_H 절편의 모든 재배열되지 않은 사람 D_H 절편 및 모든 재배열되지 않은 사람 J_H 절편으로의 대체를 포함한다. 그로써, ULC 마우스는 관심의 항원에 대한 반응으로 항체를 생성하기 위하여 다양한 레퍼토리의 사람 가변 영역 유전자 절편(V, D 및 J 절편)을 활용한다.

일단 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체의 중쇄가 결정되면, 중쇄의 뉴클레오티드 서열이 분리되고 서열화된다. 그 서열은 발현을 위해 적당한 숙주 세포, 예컨대 진핵 세포, 예를 들면 CHO 세포에 클론된다. 한 구체예에서, 사람 중쇄 불변 영역의 서열은 마우스(예컨대 ULC 마우스)로부터 분리된 사람 중쇄 가변 영역 서열의 하류에 클론된다.

한 구체예에서, pH-의존성 항원-결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질을 제조하는 것은 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열, 특히 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형시키는 것을 포함한다. 뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위한 다양한 기법들이 해당 기술분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 부위 특정 돌연변이생성이 있다. 또한 원하는 히스티딘 치환을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 새롭게 합성될 수 있다.

한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 히스티딘 잔기의 발현을 유발하는 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 치환(들)은 3 또는 4개의 히스티딘 잔기의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환(들)은 면역글로불린 경쇄 가변 영역에 있다. 한 구체예에서, 치환(들)은 CDR 코돈, 예컨대 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 있다. 한 구체예에서, 치환(들)은 CDR3 코돈에 있다.

한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 핵산 서열이 Vκ1-39Jκ5 유전자 서열을 포함하고, 치환(들)이 CDR3 코돈에 있는 경우, 치환은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 106에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 108에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 108에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 108에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 다양한 히스티딘 치환을 포함하는 Vκ1-39Jκ5 CDR3 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 2에 도시되고, 서열 목록에 포함된다.

한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 핵산 서열이 Vκ3-20Jκ1 유전자 서열을 포함하고, 치환(들)이 CDR3 코돈에 있는 경우, 치환은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 106에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 107에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 107에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 107에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106, 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 다양한 히스티딘 치환을 포함하는 Vκ3-20Jκ1 CDR3 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 12에 도시되고, 서열 목록에 포함된다.

일단 면역글로불린 경쇄, 예컨대 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인의 서열이 원하는 위치에서 히스티딘 잔기를 포함하도록 변형되면, 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 적당한 숙주 세포, 예컨대 진핵 세포, 예를 들면 CHO 세포에서 발현을 위한 벡터 안에 클론된다. 한 구체예에서, 사람 경쇄 불변 영역의 서열은 사람 가변 영역의 변형된 뉴클레오티드 서열의 하류에 클론된다.

한 구체예에서, 변형된 사람 면역글로불린 경쇄 및 선택된 사람 면역글로불린 중쇄를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 적당한 숙주 세포, 예컨대 진핵 세포, 예를 들면 CHO 세포에서 항원-결합 단백질을 생성하기 위해 공동-발현된다. 발현을 위해 사용될 수 있는 다양한 숙주 세포가 해당 기술분야에 공지되어 있고, 본 명세서를 통해 언급된다.

숙주 세포에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 세포 상층액에 분비될 수 있고, 그것은 적절한 발현 및 중성 pH에서 원래의 항원에 대한 친화성에 대해 선별된다. 항원-결합 단백질은 또한 세포 용해물로부터 회수되거나, 또는 만약 막에 결합되어 있다면 적당한 계면활성제(예컨대 트리톤-X)를 사용하여 막으로부터 방출될 수 있다. 원하는 특징을 가지는 항원-결합 단백질은 정제될 수 있다.

한 구체예에서, 히스티딘 변형(들)을 가지는 항원-결합 단백질은 히스티딘 변형(들)을 포함하지 않은 동일한(원래의) 항원-결합 단백질의 항원에 대한 친화성에 비교할만한 항원에 대한 친화성을 보유한다. 한 구체예에서, 중성 pH에서 해리 상수(K_D)로서 표시된 관심의 항원에 대한 히스티딘-변형된 항원-결합 단백질의 친화성은 10^-6M 미만, 예컨대 10^-8M 미만, 예컨대 10^-9M 미만, 예컨대 10^-10M 미만, 예컨대 10^-11M 미만, 예컨대 10^-12M 미만이다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 pH 의존성 항원 결합 특성을 나타낸다. 한 구체예에서, 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질은 히스티딘 변형을 포함하지 않은 동등한 항원-결합 단백질(동일한 아미노산 서열을 갖지만 히스티딘 변형이 없는 항원-결합 단백질)을 능가하는 증강된 pH-의존성 특성을 가지고 있다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 중성 pH에서 항원에 대한 결합을 보유하는(예컨대 중성 pH에서 항원에 대한 원하는 친화성을 보유한다) 한편, 산성 pH에서 감소된 결합을 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 산성 pH에서 항원에 대한 결합을 나타내지 않는 한편, 중성 pH에서 항원에 대한 결합을 보유한다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 중성 pH에서의 항원-결합 단백질의 해리성 반감기(t_1/2)에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소된 해리성 반감기(t_1/2)를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t_1/2를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 1분 미만의 t_1/2를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t_1/2를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 1분 미만의 t_1/2를 가진다.

한 구체예에서, 본원에 기술된 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 대상에 치료적 용량으로 투여될 때, 히스티딘 변형을 포함하지 않은 항원-결합 단백질(예컨대 히스티딘 변형을 포함하지 않은 원래의 항원-결합 단백질)의 동등한 치료적 용량이 투여될 때의 혈청 반감기에 비교하여 증가된 혈청 반감기를 나타낸다. 어떤 구체예에서, 본원에 기술된 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질의 용량의 투여시, 히스티딘 변형을 포함하지 않은 항원-결합 단백질의 동일한 용량의 투여시 혈청 반감기를 능가하는 혈청 반감기의 증가는 약 2배, 예컨대 약 5배, 예컨대 약 10배, 예컨대 약 15배, 예컨대 약 20배 또는 그 이상이다. 한 구체예에서, 혈청 반감기는 적어도 약 1일, 예컨대 적어도 약 2일, 예컨대 적어도 약 7일, 예컨대 적어도 약 14일, 예컨대 적어도 약 30일, 예컨대 적어도 약 60일이다.

상기에서 기술된 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 시험관 내 제조 방법 외에, 본원에는 또한 상기 방법에 의해 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체가 제공된다. 또한 상기 방법은 마우스에서 통상적인(보편적인) 경쇄에 결합하는 두 개의 상이한 사람 면역글로불린 중쇄를 선택하고, 보편적 경쇄를 상기에서 기술된 것과 같은 히스티딘 치환을 포함하도록 변형시키며, 단일한 히스티딘-변형된 보편적 경쇄를 가지는 두 개의 사람 중쇄를 숙주 세포에서 공동 발현시킴으로써 다중-특이성, 예컨대 이중특이성 항원-결합 단백질을 생성하기 위해 활용될 수 있다. 상기에서 기술된 항원-결합 단백질을 생성하기 위한 다양한 단계는 이중특이성 항원-결합 단백질을 제조하는 방법에도 적용될 수 있다. 항원(들)에 대한 원하는 친화성 및 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 것으로 확인된 이중특이성 항원 결합 단백질은 정제될 수 있다. 그러므로 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 사람 가변 영역 유전자, 예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ5 가변 영역 유전자에 의해 코드화된 사람 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하고 있는 두 개의 사람 중쇄 및 단일한 사람 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.

또한 히스티딘 치환을 포함하고 있는 사람 면역글로불린 중쇄 및 사람 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질의 제조에 활용되는 구성물이 제공된다. 본원에 기술된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체를 발현하는 숙주 세포 또한 제공된다.

실시예

다음의 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법의 완전한 개시 및 설명을 해당 기술분야의 숙련자들에게 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하려고 의도하거나 아래의 실험이 전부이거나 유일하게 수행된 실험인 것을 나타내려고 의도한 것은 아니다. 사용된 수치(예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력이 기울여졌지만, 일부 실험적 에러와 편차는 해명될 것이다. 다른 표시가 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.

실시예 1. 항원-특이적 사람 경쇄에서 히스티딘 잔기의 확인

통상적 경쇄 마우스(예컨대 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 통상적 경쇄 마우스) 및 그런 마우스에서의 항원-특이적 항체의 제조는 미국 특허 출원 13/022,759, 13/093,156 및 13/412,936(각각 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409 및 2012/0192300)에 기술되어 있다. 간단히 설명하면, 재배열된 사람 생식선 경쇄 표적화 벡터를 VELOCIGENE® 기법(예컨대 미국 특허 6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조)을 사용하여 만들어서 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론을 변형시키고, 게놈 구성물을 단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 함유하도록 공학처리하여, 앞서 내인성 κ가변 및 연결용 유전자 절편을 결실시켜 놓은 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입하였다. 그런 다음 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이션하여, 재배열된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 영역을 발현하는 키메릭 마우스를 제조하기 위하여 변형된 ES 세포를 만들었다. 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배안에 도입하였다(예컨대 미국 특허 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived fromthe donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotype analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 공학적으로 도입된 사람 생식선 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 독립적으로 내포하는 VELOCIMICE®를 독특한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(Valenzuela et al., 상기 동일)을 변형시켜 사용하여 유전자형 분류에 의해 확인하였다.

공학적으로 도입된 사람 생식선 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스(ULC 마우스)를 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 대체되어 있는 마우스(US 6,596,541 참조; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceyticals, Inc.)로 사육하였다.

단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 함유하고 있는 VELOCIMMUNE® 마우스를 관심의 항원으로 도전하고, 보편적 경쇄를 포함하는 항체(예컨대 Vκ1-39Jκ5)를 분리하고 서열화하였다. 통상적인 Vκ1-39Jκ5 경쇄 마우스에서 생성된 항원-특이적 사람 항체로부터 선택된 경쇄(A 내지 K)의 아미노산 서열을 일렬 배열하였다. 항원-특이적 사람 항체의 선택된 번호에 대한 사람 Vκ1-39-유도된 경쇄의 CDR의 히스티딘 돌연변이를 확인하였다(도 1). 생식선 Vκ1-39Jκ5 가변 도메인의 부분 아미노산 서열을 배열 위에 도시하고 SEQ ID NO:1에 표시하며, 완전한 가변 도메인 아미노산 서열을 SEQ ID NO:80에 표시한다.

실시예 2. 히스티딘-치환된 사람 보편적 경쇄 항체의 공학적 제조 및 특성 확인

실시예 2.1. 생식선 사람 재배열된 경쇄 안으로의 히스티딘 잔기의 공학적 도입

히스티딘 잔기를, 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄의 Q105, Q106, Y108 및 P111 위치에 공학적으로 처리된 히스티딘 잔기를 도입하기 위하여 특이하게 디자인된 부위 특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄 안에 공학적으로 도입하였다. 부위 특정 돌연변이생성을 해당 기술분야에 공지되어 있는 분자 기법을 사용하여 수행하였다(예컨대 QuikChange II XL 부위 특정 돌연변이생성 키트, Agilent Technologies). 공학적으로 도입된 잔기의 CDR3 내 위치는 도 2에 도시하는데, 도 2에 도시된 히스티딘-치환된 CDR3의 핵산 서열은 SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에 표시된다(해당하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 및 33에 표시된다). 생식선 재배열된 Vκ1-39Jκ5 CDR3의 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 및 3에 각각 표시한다.

실시예 2.2. 히스티딘 공학처리된 경쇄의 구성 및 발현

실시예 2에 따라 만들어진 생식선 공학처리된 히스티딘 잔기를 함유하고 있는 사람 Vκ1-39-유도된 경쇄를 구성하고, CHO 세포에서의 발현을 분석하기 위하여 사람 세포 표면 수용체에 특이적인 다양한 사람 중쇄(1 내지 5로 표지함)와 짝을 이루었다. 히스티딘-치환된 Vκ1-39-유도된 경쇄와 짝을 이룬 사람 세포 표면 수용체에 특이적인 5개의 사람 중쇄를 단일한 재배열된 사람 경쇄(사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열된 경쇄; US2011/0195454A1 참조)를 가지는 마우스로부터 얻었다.

효소-결합 면역흡착 분석(ELISA): CHO 세포로부터의 항체 분비를, 표시된 히스티딘 변형을 포함하는 경쇄에 대하여 Fc ELISA를 사용하여 5개의 상이한 중쇄를 사용하여 검출하였다. 경쇄 및 중쇄 서열(변형을 위한)을 단일한 재배열 사람 경쇄(예컨대 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열된 경쇄; US2011/0195454A1 참조)를 가지는 마우스에서 제조하였다. 포획 항체는 염소 항-사람 IgG였고 검출 항체는 염소 항-사람 (Fc 감마-특이적)-HRP였다. 그 결과는 도 3에 도시한다. ULC+heavy: 특이한 중쇄 및 비변형 사람 Vκ1-39-유도된 경쇄. 도 3에 도시된 것과 같이, 발현은 거의 모든 돌연변이에서 검출되었다.

단백질 면역블롯. 히스티딘 공학처리된 경쇄와 짝을 이룬 항원-특이적 중쇄의 CHO 세포의 상층액 중에서의 발현을 추가로 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 샘플을 4 내지 12%의 트리스-글리신 겔 위에서 달리도록 하였다. 선택된 중쇄(중쇄 3)를 사용한 결과를 도 4에 도시한다. ULC는 재배열된 사람 Vκ1-39-유도된 경쇄를 말한다(상기 기술된 것과 같음).

실시예 2.3. 히스티딘 공학처리된 경쇄의 결합 친화성의 측정

선택된 항체 상층액에 대한 평형 해리 상수(K_D), 해리성 반감기(t_1/2) 및 다른 동역학적 매개변수를 BIACORE^TM T200 기구(GE Healthcare)를 사용하여 SPR(표면 플라스몬 공명)에 의하여 측정하였다. 동역학을 pH 7.4 및 pH 5.75에서 측정하였다. 그 결과를 도 5a 내지 도 5e에 도시한다.

중성 pH(pH 7.4) 및 산성 pH(pH 5.75)에서 면역원에 결합하는 항체의 동역학적 결합 특성(예컨대 k _a, k _d, K _D, t_1/2 등)에 대한 수치는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서(Biacore T200)를 사용하여 얻었다. Biacore CM5 센서 칩을 마우스 항-사람 Fc 항체로 유도체화하여 상층액으로부터의 항체를 포획하였다. 그런 다음 단일 농도(50nM)의 면역원을 30㎕/분의 유속으로 항체-포획된 표면 위로 주입하였다. 항체-항원 결합을 2.5분 동안 모니터한 후 포획된 항체로부터 항원의 해리를 8분 동안 모니터하였다. 동역학적 결합(ka) 및 해리(kd) 속도 상수를, Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 질량 수송 모델로 1:1 결합에 대한 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였다. 평형 해리 상수(K _D) 및 해리성 반감기(t_1/2)를 동역학적 속도 상수로부터 계산하였다: K _D(M)=k _d/k _a; 및 t_1/2(분)=ln2(60^* k _d ).

도 5에서 알 수 있는 것과 같이, 세포 표면 수용체에 대한 항체의 결합 분석에서, 항원-특이적 사람 중쇄와 짝을 이룬 히스티딘-변형된 통상 경쇄(Vκ1-39/Jκ5 경쇄의 히스티딘 변형된 CDR3)를 포함하는 5개의 항체 중 2개가 pH 7.4 및 pH 5.75에서 상이한 친화성으로 항원(예컨대 세포 표면 수용체)에 대한 결합을 나타냈다. pH 7.4에서의 결합을 보유하지만, pH 5.75에서 낮은 결합을 보이거나 검출할만한 결합이 없는 히스티딘 변형을 가지는 항체들이 바람직하다. pH 7.4에 비교하여 pH 5.75에서 감소된 t_1/2를 나타내는 히스티딘 변형을 가지는 항체가 바람직하다.

상이한 pH에서 히스티딘-변형된 통상 경쇄 및 3개의 항원-특이적 중쇄(2, 3 및 6으로 표지됨)를 포함하는 3개의 항체에 대한 항원 결합 데이터는 도 6에 추가로 요약한다. 이들 항체는 예컨대 pH 5.75에서 t_1/2의 감소 또는 검출된 결합이 없음에 의해 증명되는 것과 같이, pH 7.4에 비교하여 pH 5.75에서 항원 결합의 상당한 감소를 나타냈다.

실시예 3. 히스티딘-치환된 Vκ1-39Jκ5 보편적 경쇄를 포함하는 유전자 변형된 마우스의 공학적 제조 및 특성 확인

실시예 3.1. 재배열된 사람 경쇄 가변 영역에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위한 표적화 벡터의 구성

사람 경쇄의 CDR 영역에 공학적으로 처리된 히스티딘 잔기를 가지고 있는 재배열된 사람 경쇄 유전자를 함유하는 유전자 변형된 마우스를 해당 기술분야에 공지되어 있는 표준 분자 클로닝 기술에 의해 제조한 표적화 벡터를 사용하여 제조한다.

간단히 설명하면, 다양한 재배열된 사람 생식선 경쇄 표적화 벡터를, 단일한 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을 함유하도록 VELOCIGENE® 기법(예컨대 미국 특허 6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조)을 사용하여 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC) DNA를 변형시켜 만들어서, 앞서 내인성 κ가변 및 연결용 유전자 절편을 결실시켜 놓은 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입하였다. 재배열된 사람 생식선 경쇄 영역을, 경쇄의 서열 내 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 위치에서 생식선 서열의 각각의 위치에서 정상적으로 존재하지 않는 히스티딘 잔기를 코드화하도록 변형시킨다. 표적화 벡터를 마우스 배 줄기(ES) 세포 안에 일렉트로포레이션시켜서 제조하고 정량 PCR 분석(예컨대 TAQMAN^TM)을 사용하여 확인하였다.

구체적으로, 이들 표적화 벡터를 구성하기 위한 전략을 도 8a 내지 도 8f에 도시한다. pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+마우스 Vκ3-7 리더+사람 Vκ1-39Jκ5를 함유하고 있는 통상적인(보편적인) 경쇄 마우스("ULC 마우스", 예컨대 US2011/0195454A1에 기술됨)를 Q105, Q106, Y108 및 P111 또는 Q106, Y108 및 P111을 CDR3 영역의 히스티딘 잔기로 대체하기 위하여 도 7에 표시된(이 공학처리 단계에 대해서는 도 8a 참조) 부위-특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 부위 특정 돌연변이생성(QuickChange II XL 키트)에 의해 변형시켰다. 그 결과 생성된 벡터(H105/106/108/111 및 H106/108/111)를 추가로 변형시키고, 마우스 Igκ 불변 영역, 마우스 인핸서, 마우스 3' 상동성 아암 및 SPEC 카세트를 포함하고 있는 벡터 안에 결찰시켰다(도 8b). 추가의 변형은 5' 마우스 아암을 운반하고 Frt-Ub-NEO-Frt 카세트를 포함하고 있는 벡터 안으로의 결찰을 포함하였다(도 8b). 그 결과 생성된 표적화 벡터를 마우스 Igκ 가변 유전자좌(κ 가변 및 연결용 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하고 있는 ES 세포 안으로 일렉트로포레이션시켰다(도 8c 내지 도 8f).

포지티브 ES 세포 클론을 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입된 공학처리된 Vκ1-39Jκ5 경쇄에 특이적인 프로브를 사용하여 대립유전자 분석(Valenzuela et al.)을 변형시켜 사용함으로써 확인하였다. 분석에 사용한 프라이머와 프로브를 아래의 표 1에 제시하고, 서열 목록에 나타낸다; 프로브의 위치는 도 8c 내지 도 8f에 도시된다.

ES 세포 선별에 사용된 프라이머 및 프로브

프로브 명칭	분석	프로브 서열	5' 프라이머	3' 프라이머
Neo	GOA	TGGGCACAACAGACAATCGGCTG (SEQ ID NO:38)	GGTGGAGAGGCTATTCGGC (SEQ ID NO:39)	GAACACGGCGGCATCAG (SEQ ID NO:40)
ULC-m1	GOA	CCATTATGATGCTCCATGCCTCTCTGTTC (SEQ ID NO:41)	AGGTGAGGGTACAGATAAGTGTTATGAG (SEQ ID NO:42)	TGACAAATGCCCTAATTATAGTGATCA (SEQ ID NO:43)
1633h2 (Vk1-39Jk5- 특이적)	GOA	ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT (SEQ ID NO:44)	GGGCAAGTCAGAGCATTAGCA (SEQ ID NO:45)	TGCAAACTGGATGCAGCATAG (SEQ ID NO:46)
mIgKd2	보유	GGCCACATTCCATGGGTTC (SEQ ID NO:47)	GCAAACAAAAACCACTGGCC (SEQ ID NO:48)	CTGTTCCTCTAAAACTGGACTCCACAGTAAATGGAAA (SEQ ID NO:49)
mIgKp15	보유	GGGCACTGGATACGATGTATGG (SEQ ID NO:50)	CACAGCTTGTGCAGCCTCC (SEQ ID NO:51)	AGAAGAAGCCTGTACTACAGCATCCGTTTTACAGTCA (SEQ ID NO:52)

표적화 구성물에 의해 도입된 NEO 선택 카세트를, FLP를 발현하는 플라스미드로 ES 세포를 형질전환시킴으로써 결실시켰다(도 8c 및 도 8e). 임의로, 네오마이신 카세트를 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 사육함으로써 제거할 수 있다(예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유된다.

상기에서 기술된 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배에 도입하였다(예컨대 미국 특허 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotype analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 위치에 돌연변이된 히스티딘 잔기를 함유하는 공학처리된 사람 경쇄 유전자를 독립적으로 내포하고 있는 VELOCIMICE®를 상기 기술된 표적화된 ES 세포로부터 만들었다.

새끼를 유전형 분류하고 공학처리된 히스티딘-변형된 사람 경쇄에 대해 이형접합성인 새끼를 선택하여 발현된 항체의 경쇄의 발현 및 결합 능력의 특성을 확인하였다. 3개(H106/108/111; "1930") 또는 4개(H105/106/108/111; "1927")의 히스티딘 변형을 가지는 보편적 경쇄 유전자를 특이하게 포함하고 있는 마우스의 유전형 분류에 대한 프라이머 및 프로브는 아래의 표 2에 열거하고, 서열 목록에 나타낸다. 그것들의 보편적 경쇄에 히스티딘 변형을 함유하고 있는 마우스를 본원에서는 "HULC" 마우스(히스티딘 보편적 경쇄 마우스)로 언급한다.

유전형 분류에 사용된 프라이머 및 프로브

프로브 명칭	분석	프로브 서열	5' 프라이머	3' 프라이머
1927jxn3	GOA 1927 (4 His) 마우스-특이적	ACCATAGTCACAGTACCCA (SEQ ID NO: 53)	AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTT (SEQ ID NO:54)	CCCTTGGCCGAAGGTGAT (SEQ ID NO:55)
1930jxn3	GOA 1930 (3 His) 마우스-특이적	ATAGTCACAGTACCCATCC (SEQ ID NO: 56)	GTCTGCAACCTGAAGATTTTGC (SEQ ID NO:67)	CCCTTGGCCGAAGGTGAT (SEQ ID NO:58)

실시예 3.2. 히스티딘-치환된 보편적 경쇄를 가지는 마우스에서 항원에 대한 면역반응의 분석

세포 표면 수용체("항원 A")를 면역원으로서 사용하여 CDR3에 4개의 히스티딘 치환을 가지는 Vk1-39 및 Jk5를 활용하여 사전-배열된 사람 카파 경쇄의 발현에 대해 이형접합성(이하 "HULC 1927")이거나 CDR3에 3개의 히스티딘 치환을 가지는 Vk1-39 및 Jk5를 활용하여 사전-배열된 사람 카파 경쇄의 발현에 대해 이형접합성(이하 "HULC 1930")인 마우스, 또는 동종접합성 WT 마우스를 면역화하였다. 사전-면역 혈청을 면역화 개시 전에 마우스들로부터 수집하였다. 면역원을 초기 프라이밍 면역화를 위해 보조제(Invivogen)로서 10㎍의 CpG 올리고뉴클레오티드와 혼합된 2.35㎍의 단백질로 25㎕의 부피로 발바닥(f.p.)을 통해 투여하였다. 계속해서 마우스를 동일한 경로를 통해, 2.35㎍의 항원 A를 보조제로서 10㎍의 CpG 및 25㎍의 Adju-Phos(Brenntag)와 함께 제 3, 6, 11, 13, 17, 20일에 총 6회의 추가면역을 위해 부스팅하였다. 마우스를 4번째와 6번째의 추가면역 후에 각각 15일과 22일 후에 출혈시켰다. 마우스들의 항혈청을 항원 A에 대한 항체 역가에 대해 분석하였다.

면역원에 대한 항체 혈청 역가를 표준 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA를 수행하기 위하여, 96-웰 미세역가 플레이트(Thermo Scientific)를 2㎍/ml의 인산염-완충된 식염수(PBS, Irvine Scientific) 중의 항원 A로 4℃에서 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 0.05%의 트윈 20을 함유하고 있는 인산염-완충된 식염수(PBS-T, Sigma-Aldrich)로 플레이트 세척기(Molecular Devices)를 사용하여 4회 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS 중의 250㎕의 0.5% 소혈청 알부민(BSA, Sigma-Aldrich)으로 차단하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하였다. 면역된 마우스로부터의 혈청과 면역-전 혈청을 연속적으로 1:300 또는 1:1000에서 시작하여 0.5% BSA-PBS로 3-배 희석하여 차단된 플레이트에 이중으로 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막 2개의 웰을 블랭크로 남겨서 이차 항체 대조표준(바탕값 대조표준)으로서 사용하였다. 플레이트를 다시 PBS-T로 플레이트 세척기에서 4회 세척하였다. 그런 다음 염소 항-마우스 IgG-Fc-서양고추냉이 과산화효소(HRP) 포합된 이차 항체(Jackson Immunoresearch)를 1:5000/1:10,000 희석률로 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS-T로 8회 세척하고, 기질로서 TMB/H₂O₂를 사용하여 전개시켰다. 기질을 20분 동안 인큐베이션하고, 반응을 2N 황산(H₂SO₄, VWR, cat# BDH3500-1) 또는 1N 인산(JT Baker, Cat# 7664-38-2)을 사용하여 중단시켰다. 플레이트를 분광계(Victor, Perkin Elmer) 상에서 450nm에서 판독하였다. 항체 역가를 Graphpad PRISM 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터화하였다.

주입된 면역원에 대하여 마우스에서 유도된 면역반응을 항체 역가로서 표시하고, 그것을 가장 높은 혈청 희석률의 역수로 규정하고, 가장 높은 혈청 희석률에서 항원 결합 흡광도는 바탕값보다 2-배 더 높았다. 그러므로 수가 클수록 면역원에 대한 체액성 면역반응은 더 크다. 면역원에 대해 유도된 항체 역가는 HULC 마우스의 두 계통과 WT 마우스에서 매우 높았고, 계통 간에 관찰된 유의미한 차이는 없었다(도 9).

실시예 3.3. pH-민감성 단클론성 항체의 제조

면역원에 대한 원하는 면역반응이 HULC 마우스의 두 계통 및 WT 마우스에서 이루어졌을 때, 각 마우스 계통으로부터 비장 세포를 수득하고 마우스 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 제조하고, 그것을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 10일 동안 성장시킨 후, 각 하이브리도마 세포-함유 웰로부터의 상층액을 면역원-특이적 ELISA를 통해 선별하여 포지티브 항원 결합 샘플을 확인하였다. ELISA에 대해서는, 96 웰 미세 역가 플레이트를 1㎍/mL의 항-myc 다클론성 항체(Novus Biologicals, #NB600-34)로 밤새 4℃에서 코팅하여 myc-태그 항원을 고정시킨 후 PBS 중의 0.5%(w/v) BSA 용액으로 차단하였다. 플레이트를 세척하고, 항원 용액을 플레이트에 1㎍/mL의 농도로 첨가하여 코팅된 플레이트에 결합하도록 1시간 동안 실온에서 놓아두었다. 계속해서, 하이브리도마 웰로부터의 상층액을 웰에 1:50의 희석률로 첨가하고, 결합되도록 1시간 동안 실온에 놓아두었다. 플레이트 결합된 항체를 HRP에 포합된 항-마우스 IgG 다클론성 항체(Jackson Immunoresearch, #115-035-164)를 사용하여 검출하였다. TMB 기질을 플레이트에 첨가하고(BD Biosciences, #51-2606KC/51-2607KC), 비색 신호를 제조업체의 권장된 프로토콜을 따라 전개시켰다. 흡광도를 Victor Wallac 플레이트 판독기 상에서 450nm에서 기록하였다. 0.5보다 크거나 같은 OD를 가지는 것으로 규정된 항원 포지티브 샘플(기준선은 약 0.1의 OD를 가짐)에 대해 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서(Biacore 4000)를 사용하여 친화성 선별을 수행하였다.

중성 pH(pH 7.4) 및 산성 pH(pH 6.0)에서의 면역원에 대한 항체 결합에 대한 동역학적 결합 매개변수(예컨대 k _a, k _d, K _D, t_1/2 등)를 기록하였다. Biacore CM4 센서 칩을 다클론성 염소 항-마우스 Fc 항체로 유도체화하여 상층액으로부터의 항체를 포획하였다. 그런 다음 단일 농도(100nM)의 면역원을 항체-포획된 표면 위로 30㎕/분의 유속으로 주입하였다. 항체-항원 결합을 1.5분 동안 모니터한 후 포획된 항체로부터의 항원의 해리를 2.5분 동안 모니터하였다. 동역학적 결합(k _a) 및 해리(k _d ) 속도 상수를, Biacore 4000 Evaluation 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 질량 수송 모델로 1:1 결합에 대한 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였다. 평형 해리 상수(K _D) 및 해리성 반감기(t_1/2)를 동역학적 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다: K _D(M)=k _d/k _a; 및 t_1/2(분)=ln2(60^* k _d ). pH 7.4에서의 결합과 비교하여 pH 6.0에서 감소된 결합을 나타내는 샘플 세트(pH 민감성)뿐 아니라 pH 7.4와 pH 6.0 사이에서 유의미한 속도 변화를 나타내지 않는 대조표준 샘플 세트(pH 둔감성 대조표준)를 선택하여 클론에 의해 제조하였다. 도 25는 총 항원 포지티브의 수와 HULC 및 WT 마우스로부터의 pH-민감성 항원 결합을 나타내는 항원 포티지브의 수를 비교한 것을 도시한다.

항원 포지티브 중에서 두 개의 이형접합성 HULC 1927 마우스와 두 개의 HULC 1930으로부터 각각 분리된 18 및 7개의 클론과, WT 마우스로부터의 1개의 클론을 단클론으로 제조하였다. 단클론성 하이브리도마의 상층액에 대해 중성 및 낮은 pH 항원 해리 속도(오프-속도) 분석을 수행하였고, 세포 펠릿을 경쇄 가변 도메인 DNA 서열화에 대해 사용하였다.

실시예 3.4. Vκ1-39Jκ5-기초 히스티딘 보편적 경쇄 마우스의 CDR3 영역에서의 서열화 및 체세포성 과돌연변이

HULC 및 WT 마우스로부터의 단클론성 하이브리도마로부터의 세포 펠릿을 경쇄 가변 도메인 DNA 서열화를 위해 사용하였다. 26개의 클론으로부터 단클론을 만들고(상기 실시예 3.3 참조) 서열화를 수행하여, 15개가 HULC 또는 WT 마우스 경쇄(MM 및 NN, 표 4 참조)를 사용하는 것으로 확인하였다. 14개의 클론을 HULC 이형접합성 마우스(1927 또는 1930 마우스)로부터 유도하였고, 1개를 WT 마우스(OO, 표 4 참조)로부터 유도하였다.

HULC 이형접합성 마우스로부터 유도된 14개의 항원 포지티브 샘플 중에서, 12개의 단클론성 항체가 그것들의 해당하는 HULC 경쇄를 활용한 반면, 2개는 WT 마우스 경쇄를 활용하였다. HULC를 활용하는 항체들은 하나를 제외한 전부가 표 3에서 알 수 있는 것과 같이 도입된 히스티딘 돌연변이를 모두 보유하였다(이탤릭체로 표시된 항체). 클론 AA의 서열화로 2개의 상이한 HULC 서열이 생성되었는데, 그것은 아래의 표 3에 두 개의 엔트리에 의해 반영된다.

HULC 경쇄를 활용하는 클론으로부터의 경쇄 서열의 보존된 히스티딘 삽입 및 체세포성 과돌연변이의 수

		HULC를 활용하는 마우스로부터의 경쇄 서열
클론 명칭	마우스 계통	CDR3의 보존된 His 돌연변이의 수	프레임워크의 체세포성 과돌연변이의 수	CDR의 체세포성 과돌연변이의 수
AA (서열 1)	1927	4	3	0
AA (서열 2)	1927	4	1	1
BB	1927	4	3	3
CC	1927	4	0	0
DD	1927	3	1	1
EE	1927	4	2	2
FF	1927	4	0	1
GG	1927	4	1	1
HH	1927	4	2	0
II	1930	3	1	1
JJ	1930	3	4	5
KK	1930	3	1	2
LL	1930	3	1	0

실시예 3.5. Vκ1-39Jκ5-기초 히스티딘 보편적 경쇄 마우스에서 생성된 단클론성 항체의 pH-의존성 결합

추가로 HULC 및 WT 마우스로부터 분리된 단클론성 항체의 pH-의존성 결합 특성을 평가하기 위하여, 항체/항원 결합 단계를 중성 pH에서 관찰하고 항체/항원 해리 단계를 중성 또는 산성 pH에서 관찰하는 결합 실험을 수행하였다.

Biacore CM4 센서 칩을 다클론성 토끼 항-마우스 Fc 항체를 사용하여 유도체화하였다. 단클론성 항체 상층액이 항-마우스 Fc 센서 표면 위에 포획되었다. 두 개의 농도, 즉 50nM(이중으로) 및 16.7nM의 면역원을 단클론성 항체가 포획되어 있는 표면 위로 30㎕/분의 유속으로 주입하였다. 항체-항원 결합을 pH 7.4에서 4분 동안 모니터한 후, 포획된 단클론성 항체로부터 항원의 해리를 pH 7.4 또는 6.0에서 15분 동안 모니터하였다. 해리(k _d) 속도 상수를 Scrubber 버전 2.0 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였고, 그 결과를 표 6에 나타낸다. 해리성 반감기(t_1/2)를 다음: t_1/2(분)=(ln2/k _d)/60과 같이 해리 속도 상수로부터 계산하고, 그 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에서 다양한 pH 조건 하에서 열거한 여러 항체의 결합/해리 특성을 나타내는 센서그램을 도 11에 그래프로 도시한다. 각 그래프에서 개별적인 라인들은 각각의 항체의 상이한 농도에서의 결합 반응을 나타낸다. 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. 해리성 반감기(t_1/2)는 각각의 센서그램 위에 표시한다. 반응은 RU로 측정한다.

중성 및 낮은 pH에서 그것들의 면역원에 결합하는 단클론성 HULC 또는 WT 항체의 결합(k_d) 속도 상수 및 해리성 반감기(t_1/2)

		pH 7.4 결합/pH 7.4 해리				pH 7.4 결합/pH 6.0 해리				pH 6.0/pH7.4 비율
클론 명칭	사용된 경쇄	중성 mAb 포획	결합된 50nM 면역원 (RU)	k _d(1/s)	t_1/2 (분)	낮은 mab 포획	결합된 50nM 면역원 (RU)	k _d (1/s)	t_1/2 (분)	k _d	t_1/2
AA	HULC (1927)	129	70	5.60E-05	206	122	73	2.18E-04	53	3.9	0.3
BB	HULC (1927)	350	165	6.00E-04	19	378	185	2.20E-03	5	3.7	0.3
CC	HULC (1927)	611	251	2.03E-04	57	545	226	6.68E-03	2	33.0	0.03
DD	HULC (1927)	182	75	3.55E-04	33	168	74	6.44E-04	18	1.8	0.6
HH	HULC (1927)	268	92	1.36E-04	85	251	91	5.39E-04	21	4.0	0.3
GG	HULC (1927)	353	110	2.78E-04	42	328	102	8.97E-04	13	3.2	0.3
FF	HULC (1927)	334	202	4.79E-05	241	364	220	6.90E-05	167	1.4	0.7
EE	HULC (1927)	339	124	5.08E-04	23	299	120	4.66E-04	25	0.9	1.1
II	HULC (1930)	387	174	1.22E-04	95	334	147	2.14E-04	54	1.8	0.6
JJ	HULC (1930)	363	14	9.83E-04	12	333	12	5.30E-04	22	0.5	1.9
KK	HULC (1930)	490	303	7.41E-05	156	484	295	1.29E-04	90	1.7	0.6
LL	HULC (1930)	636	41	3.09E-04	37	597	36	5.77E-04	20	1.9	0.5
MM*	WT (1927 마우스)	245	6	NA	NA	203	6	NA	NA	NA	NA
NN	WT (1927 마우스)	394	231	5.26E-04	22	378	231	9.35E-04	12	1.8	0.6
OO	WT	413	89	2.94E-04	39	400	83	3.57E-04	32	1.2	0.8

* k _d와 t_1/2 값은 낮은 항원 결합 신호로 인해 측정할 수 없었다.

실시예 4. 히스티딘-치환된 Vκ3-20Jκ1 보편적 경쇄를 포함하는 유전자 변형된 마우스의 공학적 제조

통상적인 Vκ3-20Jκ1 경쇄를 포함하는 마우스를 예컨대 미국 특허 출원 13/022,759, 13/093,156, 13/412,936 및 13/488,628(각각 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 및 2013/0045492), 및 상기 실시예 1에 기술된 것과 같이 제조하였다. 생식선 보편적 Vκ3-20Jκ1 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:59에 표시한다.

히스티딘 치환을 Vκ3-20Jκ1 보편적 경쇄 표적화 벡터 안에 도입하고, Vκ1-39Jκ5 히스티딘 변형된 보편적 경쇄 마우스(HULC 1927 및 1930)에 대해 실시예 3에서 상술된 것과 유사한 전략을 사용하여 그 표적화 벡터로부터 마우스를 제조하였다.

간단히 설명하면, 히스티딘-변형된 Vκ3-20Jκ1 보편적 경쇄 표적화 벡터를 제조하기 위한 전략은 도 29a 내지 도 29d에 요약되어 있다. pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+마우스 Vκ3-7 리더+사람 Vκ3-20Jκ1을 함유하고 있는 통상적(보편적) 경쇄 마우스("ULC 마우스", 예컨대 US2011/0195454A1)를 제조하기 위해 사용된 플라스미드를 부위 특정 돌연변이생성(QuickChange Lightning 키트)에 의하여 Q105, Q106, Y107 및 S109 또는 Q105, Q106 및 S109(도 12의 배열 참조)를 CDR3의 히스티딘 잔기로 대체하기 위하여 도 28에 도시된 부위-특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 변형시켰다(이 공학처리 단계에 대해서는 도 14a 참조). 그 결과의 벡터(H105/106/107/109 및 H105/106/109)를 추가로 변형시키고 마우스 Igκ 불변 영역, 마우스 인핸서, 마우스 3' 상동성 아암 및 SPEC 카세트를 포함하는 벡터에 결찰시켰다(도 14b). 추가의 변형은 5' 마우스 아암을 운반하고 Frt-UB-NEO-Frt 카세트를 포함하고 있는 벡터 안으로의 결찰을 포함하였다(도 14b). 그 결과의 표적화 벡터를 마우스 Igκ 가변 유전자좌(κ 가변 및 연결용 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하는 ES 세포 안에 일렉트로포레이션시켰다(도 14c 내지 14d).

포지티브 ES 세포 클론을 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입된 공학처리된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하여 대립유전자 분석(Valenzuela et al.)을 변형시켜 사용함으로써 확인하였다. 분석에 사용한 프라이머와 프로브를 아래의 표 5에 제시하고, 서열 목록에 나타낸다; 프로브의 위치는 도 14c 내지 도 14d에 도시된다.

ES 세포 선별에 사용된 프라이머 및 프로브

프로브 명칭	분석	프로브 서열	5' 프라이머	3' 프라이머
Neo	GOA	TGGGCACAACAGACAATCGGCTG (SEQ ID NO:38)	GGTGGAGAGGCTATTCGGC (SEQ ID NO:39)	GAACACGGCGGCATCAG (SEQ ID NO:40)
ULC-m1	GOA	CCATTATGATGCTCCATGCCTCTCTGTTC (SEQ ID NO:41)	AGGTGAGGGTACAGATAAGTGTTATGAG (SEQ ID NO:42)	TGACAAATGCCCTAATTATAGTGATCA (SEQ ID NO:43)
1635h2 (Vk3-20Jk1 특이적)	GOA	AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG (SEQ ID NO:65)	TCCAGGCACCCTGTCTTTG (SEQ ID NO:66)	AAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT (SEQ ID NO:67)
mIgKd2	보유	GGCCACATTCCATGGGTTC (SEQ ID NO:47)	GCAAACAAAAACCACTGGCC (SEQ ID NO:48)	CTGTTCCTCTAAAACTGGACTCCACAGTAAATGGAAA (SEQ ID NO:49)
mIgKp15	보유	GGGCACTGGATACGATGTATGG (SEQ ID NO:50)	CACAGCTTGTGCAGCCTCC (SEQ ID NO:51)	AGAAGAAGCCTGTACTACAGCATCCGTTTTACAGTCA (SEQ ID NO:52)

표적화 구성물에 의해 도입된 NEO 선택 카세트는 FLP를 발현하는 플라스미드로 ES 세포를 형질전환시킴으로써 결실된다(도 14c 및 도 14d). 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 사육함으로써 제거될 수 있다(예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.

상기에서 기술된 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배에 도입하였다(예컨대 미국 특허 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotype analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 위치에 돌연변이된 히스티딘 잔기를 함유하는 공학처리된 사람 경쇄 유전자를 독립적으로 내포하고 있는 VELOCIMICE®를 상기 기술된 표적화된 ES 세포로부터 만들었다.

새끼를 유전형 분류하고 공학처리된 히스티딘-변형된 사람 경쇄에 대해 이형접합성인 새끼를 선택하여 발현된 항체의 경쇄의 발현 및 결합 능력의 특성을 확인하였다. 3개(H105/106/109; "6183") 또는 4개(H105/106/108/111; "6181")의 히스티딘 변형을 가지는 보편적 경쇄 유전자를 특이하게 포함하고 있는 마우스의 유전형 분류에 대한 프라이머 및 프로브는 표 6에 열거하고, 서열 목록에 나타낸다. 그것들의 보편적 경쇄에 히스티딘 변형을 함유하고 있는 마우스를 본원에서는 "HULC" 마우스(히스티딘 보편적 경쇄 마우스)로 언급한다.

유전형 분류에 사용된 프라이머 및 프로브

프로브 명칭	분석	프로브 서열	5' 프라이머	3' 프라이머
hVI494-1	GOA 6181 (4 His) 마우스-특이적	CTGTCATCACCATGG (SEQ ID NO:68)	GCAGACTGGAGCCTGAAGATTTT (SEQ ID NO:69)	CCGAACGTCCAAGGTGAGTG (SEQ ID NO:70)
hVI495-1	GOA 6183 (3 His) 마우스-특이적	TACTGTCATCACTATGG (SEQ ID NO:71)	GCAGACTGGAGCCTGAAGATTT (SEQ ID NO:72)	CCGAACGTCCAAGGTGAGTG (SEQ ID NO:73)

마우스를 관심의 항원으로 면역시키고, pH-의존성 결합을 가지는 항체를 생성하는 능력에 대해 시험한다.

실시예 5. 히스티딘-치환된 단일한 재배열된 사람 보편적 경쇄 마우스(HULC)를 포함하고 있는 마우스의 사육

이 실시예는 여러 다른 유전자 변형된 마우스가 다수의 유전자 변형된 면역글로불린 유전자좌를 은닉하고 있는 다수의 유전자 변형된 마우스 계통을 제조하기 위하여 본원에 기술된 HULC 마우스 중 어떠한 하나로 사육될 수 있다는 것을 설명한다.

내인성 Igλ 녹아웃(KO). 공학처리된 경쇄 유전자좌의 이용을 최대화하기 위하여, 상기 기술된 HULC 동물들(예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 히스티딘-치환된 보편적 경쇄를 포함함) 중 어느 것이든지 내인성 λ 경쇄 유전자좌가 결실되어 있는 다른 마우스로 사육될 수 있다. 이런 방식으로, 얻어진 자손은 그것의 유일한 경쇄로서, 상기 실시예 3 및 4에서 설명된 것과 같이, 재배열된 히스티딘-치환된 사람 생식선 경쇄 영역을 발현할 것이다. 사육은 해당 기술분야에 인지되어 있는 표준 기법에 의해 수행되고, 또는 다르게는 상업적인 사육자(예컨대 The Jackson Laboratory)에 의해 수행된다. 공학처리된 히스티딘-치환된 경쇄 유전자좌와 내인성 λ 경쇄 유전자좌의 결실을 내포하고 있는 마우스 계통을 독특한 경쇄 영역의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대해 선별한다.

인간화된 내인성 중쇄 유전자좌. 공학처리된 사람 생식선 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스(HULC 마우스)를 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 대체되어 있는 마우스와 교배시켰다(US 6,596,541; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® 마우스는 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동가능하게 연결된 사람 중쇄 가변 영역을 포함함으로써 마우스가 항원 자극에 대한 반응으로 사람 중쇄 가변 도메인과 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하게 되는 게놈을 포함한다.

내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자좌가 사람 중쇄 가변 영역 유전자좌로 대체되어 있고 히스티딘-치환된 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역을 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 내포하고 있는 마우스가 얻어진다. 히스티딘-치환된 단일한 사람 경쇄(HULC, 사람 경쇄 가변 도메인과 마우스 C_L)를 포함하는 체세포성 돌연변이된 중쇄(사람 중쇄 가변 도메인 및 마우스 C_H)를 함유하는 역 키메릭 항체는 관심의 항원으로 면역화할 때 얻어진다. 그런 마우스에서 생성된 pH-의존성 사람 항체는 해당 기술분야에 공지되어 있거나 상기 기술된 항체 분리 및 선별 방법을 사용하여 확인된다. 항체, 예컨대 pH-민감성 항체를 발현하는 B 세포의 가변 경쇄 및 중쇄 영역 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 전체 사람 항체는 적당한 발현 시스템에서 가변 중쇄 및 경쇄 영역 뉴클레오티드 서열을 각각 사람 C_H 및 C_L 뉴클레오티드 서열과 융합함으로써 만들어진다.

동등물

당업자들은 기본적인 실험 이상의 것을 사용하지 않아도 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예의 많은 동등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 그런 동등물은 다음의 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서를 통털어 인용된 모든 비-특허 문서, 특허 출원 및 특허의 전체 내용은 본원에 그것의 전체 내용을 참조함으로써 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same <130> 1260A-WO <150> 61/611,950 <151> 2012-03-16 <150> 61/736,930 <151> 2012-12-13 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 2 cag cag agc tac agc acc ccc 21 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT 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cat cac tat ggt cac tca cct 21 His His Tyr Gly His Ser Pro 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 His His Tyr Gly His Ser Pro 1 5 <210> 80 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 80 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 81 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 81 caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 50

Claims

사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 비-사람 동물로서,
상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 사람 V_L 및 J_L 절편 서열은 해당하는 사람 생식선 V_L 및 J_L 유전자 서열에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-사람 동물.
제 1항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 가변 영역 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 동물.
제 2항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 동물.
제 3항에 있어서, 상기 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 내인성 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 추가로 그것의 생식선에 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하고 있는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 동물.
제 5항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 동물.
제 6항에 있어서, 상기 비-사람 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 내인성 비-사람 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 상기 동물은 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 비-사람 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는 것을 특징으로 하는 동물.
제 5항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있는 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 히스티딘 코돈은 상보성 결정 영역 (CDR) 3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있는 것을 특징으로 하는 동물.
제 11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 히스티딘 코돈은 1, 2, 3 또는 4개의 CDR3 코돈(들)인 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 동물.
제 13항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 동물.
제 14항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물.
제 14항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 상기 동물은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소된 해리성 반감기(t_1/2)를 나타내는 항체에 대해 풍부해진 관심의 항원에 대해 반응하는 B 세포 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물.
제 17항에 있어서, 상기 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서의 해리성 반감기(t_1/2)의 감소는 약 30배 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 동물.
제 1항에 있어서, 상기 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 동물.
제 19항에 있어서, 상기 설치류는 쥐 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제 20항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제 1항에 있어서, 상기 동물은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 적어도 하나의 히스티딘 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 포함하고 있는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 동물.
사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 마우스로서,
상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 사람 V_L 및 J_L 절편 서열은 해당하는 사람 생식선 V_L 및 J_L 유전자 서열에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고,
상기 마우스는 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 마우스.
제 23항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 24항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 쥐 또는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 23항에 있어서, 추가로 그것의 생식선에 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하고 있는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 26항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 쥐 또는 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 서열인 것을 특징으로 하는 마우스.
제 23항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 26항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 23항에 있어서, 상기 적어도 하나의 히스티딘 코돈은 상보성 결정 영역(CDR) 3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 히스티딘 코돈은 1, 2, 3 또는 4개의 CDR3 코돈(들)인 것을 특징으로 하는 마우스.
제 23항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 사람 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 32항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 33항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 34항에 있어서, 상기 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 34항에 있어서, 상기 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 33항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 37항에 있어서, 상기 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 37항에 있어서, 상기 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
제 23항에 있어서, 상기 마우스는 관심의 항원에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하고, 이때 모든 항체는
해당하는 사람 생식선 V_L 및 J_L 유전자 서열에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하는 사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 동일한 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인과,
사람 중쇄 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 유도된 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
관심의 항원에 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법으로서, 상기 방법은
제 23항의 마우스를 제조하고;
관심의 항원으로 상기 마우스를 면역시키며; 그리고
중성 pH에서 원하는 친화성으로 관심의 항원에 결합하는 한편, 산성 pH에서 관심의 항원에 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 것으로 이루어지는 방법.
제 41항에 있어서, 상기 항체는 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 해리성 반감기(t_1/2)를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
관심의 항원에 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법으로서, 상기 방법은
사람 V_L 및 J_L 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함하고 있는 비-사람 동물에서 원하는 친화성으로 관심의 항원에 결합하는 첫 번째 항체를 생성하고,
단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 해당하는 사람 생식선 V_L 및 J_L 절편 서열에 의해 코드화되지 않는 히스티딘 코돈을 포함하도록 변형시키며,
첫 번째 항체의 면역글로불린 중쇄와 변형된 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, 및
중성 pH에서 관심의 항원에 대해 원하는 친화성을 보유하고 산성 pH에서 관심의 항원에 감소된 결합을 나타내는, 세포에서 발현된 두 번째 항체를 선택하는 것으로 이루어지는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 비-사람 동물에서 생성된 첫 번째 항체는 사람 V_H, D_H 및 J_H 절편의 레퍼토리로부터 유도된 면역글로불린 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ1-39/Jκ5 및 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ1-39/Jκ5이고, 변형은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 CDR3 코돈의 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ3-20/Jκ1이고, 변형은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 CDR3 코돈의 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 항체는 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기(t_1/2)의 감소를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 항체는 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 해리성 반감기(t_1/2)를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 비-사람 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함하는 비-사람 동물의 제조 방법으로서, 상기 방법은
면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 절편을 결실하거나 비-기능성으로 만들도록 비-사람 동물의 게놈을 변형시키고,
그 게놈에 해당하는 사람 생식선 VL 및 JL 절편 서열에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고 있는 사람 VL 및 JL 절편 서열을 포함하는 단일한 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 위치시키는 것으로 이루어지는 비-사람 동물의 제조 방법.
제 51항에 있어서, 상기 방법은 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체에 대해 풍부해진 B 세포의 집단을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 51항에 있어서, 상기 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 53항에 있어서, 상기 동물은 마우스 또는 쥐인 것을 특징으로 하는 방법.
제 51항에 있어서, 상기 단일한 재배열된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 사람 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, 적어도 하나의 히스티딘 코돈은 CDR3 코돈인 것을 특징으로 하는 방법.