DE112010002931T5

DE112010002931T5 - Regulierung von Zinkmangel und Zinktoleranz bei Pflanzen

Info

Publication number: DE112010002931T5
Application number: DE112010002931T
Authority: DE
Inventors: Ana Gonçalves Leite de Assunçao; Martinus Gerardus Maria Aarts
Original assignee: Wageningen Universiteit
Current assignee: Wageningen Universiteit
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2012-08-30
Also published as: CA2767957A1; CN102498125A; US10870862B2; BR112012001075A2; US20120192309A1; WO2011008096A1; ES2658622T3; US20190106704A1; AU2010271586B2; CA2767957C; US10106810B2; EP2454277B1; AU2010271586A1; MX2012000731A; BR112012001075B1; EP2454277A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verändern der Kapazität einer Pflanze für die Anpassung an Veränderungen der Zinkkonzentration in der Umgebung, insbesondere des Bodens, umfassend Versehen der Pflanze mit einem Nukleotid gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder einem Orthologen davon. Solch ein Verfahren ist besonders nützlich zu Verringerung von Zn-Mangel oder um Zn in Pflanzen (übermäßig) zu akkumulieren für eine Bioremediation oder für eine Biofortifikation. Transgene Pflanzen mit diesen Proteinen werden ebenso offenbart.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Pflanzenbiotechnologie, insbesondere eine spezifische Modulierung der Sensitivität gegenüber Metallen bei Pflanzen, insbesondere gegenüber Zn. Insbesondere betrifft die Erfindung die Anpassung der Pflanze an Veränderungen bezüglich der Verfügbarkeit von Zn in der Umgebung.
Hintergrund der Erfindung
Zink ist für alle lebenden Organismen einschließlich Pflanzen ein essenzieller Mikronährstoff. Zink ist normalerweise nach Eisen (Fe) das am zweithäufigsten vorhandene Übergangsmetall in Organismen, und das einzige Metall, welches in allen sechs Enzymklassen (Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen) vertreten ist. Zinkbindungsstellen kommen auch bei einer großen Auswahl von anderen Proteinen, Membranlipiden und DNA/RNA-Molekülen vor. Die größte Klasse von Zn-bindenden Proteinen in Organismen sind die Zinkfinger-Domäne enthaltenden Proteine, welche als Transkriptionsregulator fungieren.
Zn liegt im Boden hauptsächlich in drei Fraktionen vor: (i) wasserlösliches Zn (einschließlich Zn²⁺ und lösliche organische Fraktionen), (ii) adsorbiertes und austauschbares Zn in der kolloidalen Fraktion (verbunden mit Tonpartikeln) und (iii) unlösliche Zn-Komplexe und Mineralien. Zink wird von Wurzeln, welche ihre Sprosse über das Xylem ernähren, aus der Bodenlösung hauptsächlich als Zn²⁺ aufgenommen, aber unter Umständen auch komplexiert mit organischen Liganden.
Wenn sie einem Mangel der Zinkversorgung gegenüberstehen, passen sich Pflanzen durch Verbesserung der Kapazität der Zinkaufnahme an. Es wird angenommen, dass Pflanzen die Zn-Homöostase kontrollieren unter Verwendung eines eng regulierten Netzwerks von Zinkstatussensoren und Signalgebern, welche die koordinierte Expression von Zn-Transportern kontrollieren, welche an der Zn-Aufnahme aus dem Boden, die Mobilisierung zwischen Organen und Geweben und die Sequestration innerhalb zellulärer Komponenten beteiligt sind (Clemens, S., 2001, Planta 212: 475–486).
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien durchgeführt, um die biochemischen Wege der Zn-Aufnahme und des Zn-Transports zu enträtseln. In diesen Studien wurde jedoch noch nicht herausgefunden, welche Proteine für die Zn-Aufnahme aus dem Boden verantwortlich sind (Palmer, C. M. und Guerinot, M. L., 2009, Nature Chem. Biol. 5: 333–340). Obwohl Kandidatengene für die erforderlichen Zn-Transporter identifiziert wurden, die sogenannten ZIP-Transporter ZIP1, ZIP2, ZIP3 und ZIP4 (Grotz, N. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7220–7224), scheinen mehr Proteine erforderlich zu sein, um das Phänomen der übermäßigen Zn-Akkumulation zu erklären, wie etwa die Schwermetalltransporter HMA2, 3 und 4 (Hanikenne et al., 2008, Nature 453: 391–395). Auch Nikotianamin, hergestellt durch die Nikotianaminsynthase (NAS) und der Zitrattransporter FRD3 (Durrett, T. P. et al., 2007, Plant Physiol. 144: 197–205) scheinen beim vaskulären Transport von Zink eine Rolle zu spielen. Beim Transport zwischen Geweben und Organen scheinen mehrere Proteine beteiligt zu sein. Mitglieder der YSL-Gruppe, einer Unterfamilie der Oligopeptidtransporter(OPT)-Familie der Transporter, sind Proteine, welche erwähnt wurden. Beim intrazellulären Transport von Zn scheinen die Proteine NRAMP, ZIP und ZIF beteiligt zu sein. Der Transport von Zn in die Vakuole wird durch MTPs (Metal-Toleranz-Proteine, auch als „cation diffuser facilitator” – CDF-Proteine bezeichnet) durchgeführt.
(Mangel an) Anpassung von Pflanzen an eine Veränderung der Konzentration von Zn in der Umgebung funktioniert auf beide Arten: Zinkmangel und Zinktoxizität. Neben dem Fe-Mangel ist der Zn-Mangel der am häufigsten auftretende Mikronährstoffmangel in der Landwirtschaft, welcher hauptsächlich Teile von Asien (Türkei und Naher Osten/Asien, Zentralasien, Süd- und Zentralchina), Sahel und Schwarzafrika und Australien betrifft. Da Pflanzen oft die Hauptnahrungsquelle für Mikronährstoffe für den menschlichen Verbrauch darstellen, leiden viele Menschen weltweit an Fe- und Zn-Mangel, da Pflanzen, insbesondere Getreide, bekanntermaßen einen geringen Gehalt an bioverfügbarem Fe und Zn aufweisen.
Einige Böden weisen keinen Mangel an Mineralien auf, sondern wurden mit großen Mengen an Schwermetallen kontaminiert, wie etwa Zn oder Cd. Zn-Toxizität ist in Getreide viel weniger weit verbreitet als ein Zn-Mangel. Jedoch werden Symptome der Toxizität normalerweise bei Zn-Konzentrationen von mehr als 300 mg Zn kg^–1 an den Blättern sichtbar. Es ist bekannt, dass manche Pflanzen auf Böden wachsen können, der eine hohe Zn-Konzentration aufweist, wie etwa Silene vulgaris, Thlaspi caerulescens, Arabidopsis halleri und Viola calaminaria (siehe auch Tabelle 3 in Broadley, M. R. et al., 2007, New Phytologist 173: 677–702). Es wurde vorgeschlagen, diese übermäßigen Zn-Akkumulatoren als Reinigungspflanzen („sanitation plant”) zu verwenden, um Zink aus dem Boden zu extrahieren, wobei das Metall in der Biomasse aufkonzentriert wird, welche geerntet, verbrannt und ordnungsgemäß entsorgt werden kann. Solch ein Verfahren, welches als Phytoremediation bekannt ist, ist gegenwärtig nicht attraktiv, da die bekannten übermäßig Metall akkumulierenden Pflanzen relativ klein sind und so nicht ausreichend Biomasse erzeugen, um eine hohe Kapazität der Metallextraktion zu erhalten.
Somit besteht nach wie vor ein Bedarf daran, die Anpassung von Pflanzen an Veränderungen der Zinkkonzentration in der Umgebung kontrollieren zu können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zum Verändern der Kapazität einer Pflanze für die Anpassung an Veränderungen der Zinkkonzentration in der Umgebung, insbesondere des Bodens, umfassend Versehen einer Pflanze mit einem Nukleotid, welches für ein bZIP19- und/oder bZIP23-Protein oder ein funktionelles Äquivalent davon codiert. Bevorzugt wird in einem solchen Verfahren die Toleranz gegenüber Zn-Mangel erhöht. In einer anderen Ausführungsform in einem solchen Verfahren ist die Pflanze imstande, Zink übermäßig zu akkumulieren. In einer weiteren Ausführungsform ist die Pflanze imstande, die Konzentration von Zink in essbaren Teilen zu erhöhen.
In den oben beschriebenen Verfahren wird die Pflanze bevorzugt mit einem Nukleotid versehen, welches für ein bZIP19-Protein codiert, und mit einem Nukleotid, welches für ein bZIP23-Protein codiert. Mehr bevorzugt wird die Pflanze zusätzlich mit einem oder mehreren Polynukleotiden versehen, welche für ein Protein codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schwermetalltransportern, bevorzugt HMA2, HMA3 oder HMA4, YSL-Proteinen, bevorzugt YSL, bevorzugt YSL1 oder YSL3, ZIP- oder IRT-Proteinen, ZIF-Proteinen, NAS-Proteinen, MRP-Proteinen, FRD3 und MTPs.
Die Erfindung betrifft weiter eine Pflanze, welche mit einem für ein bZIP19- und/oder ein bZIP23-Protein codierenden Polynukleotid transformiert ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren wie oben beschrieben oder eine Pflanze wie oben beschrieben, worin das Polynukleotid von Arabidopsis, mehr bevorzugt A. thaliana stammt.
Die Erfindung betrifft weiter eine Pflanze, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, worin die Pflanze bevorzugt ein bZIP19- und/oder ein bZIP23-Protein überexprimiert. Bevorzugt ist die Pflanze tolerant gegenüber Zn-Mangel. Alternativ ist die Pflanze ein übermäßiger Zn-Akkumulator und/oder weist eine erhöhte Menge an bioverfügbarem Zn in ihren essbaren Teilen auf.
Ein weiterer Teil der Erfindung ist ein Vefahren zur Phytoremediation, umfassend Anbauen einer erfindungsgemäßen Pflanze auf einem Baden, welcher mit Zn verschmutzt ist, Ernten der Pflanze und Entsorgen der Biomasse. Ein weiterer Teil der Erfindung ist ein Verfahren zur Biofortifikation, umfassend Anbauen einer erfindungsgemäßen Pflanze auf einem Boden, welcher mit Zn verschmutzt ist, Ernten der Pflanze und Entsorgen der Biomasse.
Ein weiterer Teil der Erfindung ist die Verwendung des bZIP19- und/oder bZIP-Proteins (der dafür codierenden Nukleotide) in den erfindungsgemäßen Verfahren und/oder zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Pflanzen.
Erklärung der Figuren
1: Aminosäuresequenzen der Proteine bZIP19, bZIP23 und bZIP24 von Arabidopsis thaliana. Die grün markierten Aminosäuren entsprechen der bZIP-Domäne. Die grau markierten Aminosäuren entsprechen zwei konservierten Motiven, welche reich an Histidinresten sind. Ein Stern oder Punkt unterhalb der angeordneten Sequenzen zeigt identische bzw. ähnliche Aminosäuren an.
2: Hefe-Ein-Hybrid-Köder („baits”) und Genexpression der F-Gruppe bZIP. (A) Schematisches Diagramm der Köder (A–G), welche zur Konstruktion der Reportervektoren im Hefe-Ein-Hybrid-Assay verwendet wurden. Die graue Box stellt das palindromische Motiv mit 10 bp dar. (B) Relative Transkriptmengen (RTL, „relative transcript level”) von bZIP19, bZIP23 und bZIP24 in 3 Wochen alten Arabidopsis-Setzlingen, angezogen in MS-Medium ohne (Zn-), mit 30 μM (Zn+) oder mit 300 μM ZnSO₄ (Zn++). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
3: Genexpression und Zinktransport des Arabidopsis ZIP4-Zinktransporters. (A) Relative Transkriptmengen (RTL) von ZIP4 in 3 Wochen alten Arabidopsis-Setzlingen, angezogen in MS-Medium, mit 30 μM ZnSO₄ (Zn+) oder ohne (Zn–). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. (B) Das Wachstum von zrt1zrt2 S. cerevisiae-Zellen, welche entweder den leeren Vektor tragen (zrt1zrt2 ∅) oder ZIP4 exprimieren (zrt1zrt2 ZIP4) wurde untersucht durch Punkte von Reihenverdünnungen von Zellen (OD₆₀₀ ist links angegeben) auf SD-URA-selektivem Medium mit 0,4 oder 0,8 mM ZnCl₂. (C) OD-Messungen bei den angegebenen Zeitintervallen von zrt1zrt2 ∅ und zrt1zrt2 ZIP4 auf SD-URA-selektivem flüssigen Medium mit 0,4 mM ZnCl₂. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
4: Die Doppel-T-DNA-Insertionsmutante m19m23 ist gegenüber Zinkmangel hypersensitiv. (A) Wirkung von Zinkmangel auf 3 Wochen alte Setzlinge von Arabidopsis (WT), bZIP19-T-DNA-Insertionsmutanten, m19, bZIP23-T-DNA-Insertionsmutanten, m23, und Doppel-T-DNA-Insertionsmutanten m19m23, angezogen in MS-Medium ohne (Zn–) und mit 30 μM ZnSO₄ (Zn+). (B) Wirkung der Zinkversorgung auf 4 Wochen alte Pflanzen von Arabidopsis (WT), m19, m23 und m19m23, angezogen in Hydrokulturen bei 0,05 μM (Zn–), 2 μM (Zn+) und 25 μM ZnSO₄ (Zn++). (C) Zinkkonzentration in mg kg^–1 Trockengewicht und Trockengewicht (DW) in g von Wurzeln (weiße Balken) und Sprossen (graue Balken) von 4 Wochen alten Pflanzen WT, m19, m23 und m19m23, angezogen in Hydrokultur bei 0,05 μM ZnSO₄ (Zn–). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, zeigen signifikante Unterschiede des Mittelwerts im Vergleich mit dem WT-Mittelwert an. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
5: (A) Schematische Zeichnung des bZIP19 Mutantenallels (m19) und des bZIP13 Mutantenallels (m23). Dreiecke zeigen T-DNA-Insertionen an. Weiße Boxen zeigen Exons an, graue Boxen zeigen Introns an, Linien zeigen 5' und 3' nicht translatierte Sequenzen an. (B) Relative Transkriptmengen (RTL) von bZIP19 (weiße Balken) und bZIP23 (graue Balken) in 3 Wochen alten Setzlingen von Arabidopsis-Wildtyp-Pflanzen (WT), homozygoten bZIP19-T-DNA-Insertionsmutanten (m19), homozygoten bZIP23-T-DNA-Insertionsmutanten (m23) und T-DNA-Insertionsdoppelmutanten (m19m23), angezogen in MS-Medium. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
6: Zinkkonzentration (mg kg^–1 Trockengewicht) und Trockengewicht (DW, in g) von Wurzeln (weiße Balken) und Sprossen (graue Balken) von 4 Wochen alten Wildtyp (WT), bZIP19(m19)- und bZIP23(m23)-Einzelmutanten und Doppelmutanten (m19m23), angezogen in Hydrokultur bei 2 μM ZnSO₄ (Zn+). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
7: Zinkkonzentration (mg kg^–1 Trockengewicht) und Trockengewicht (DW, in g) von Wurzeln (weiße Balken) und Sprossen (graue Balken) von 4 Wochen alten Wildtyp (WT), bZIP19(m19)- und bZIP23(m23)-Einzelmutanten und Doppelmutanten (m19m23), angezogen in Hydrokultur bei 25 μM ZnSO₄ (Zn+). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
8: Komplementationsstudie und Expressionsanalyse von mutmaßlichen Zielgenen. (A) Arabidopsis-Wildtyp-Pflanzen (WT), Doppel-T-DNA-Insertionsmutanten (m19m23) und Doppelmutanten, welche konstitutiv entweder bZIP19 (m19m23-OX19) oder bZIP23 (m19m23-OX23) exprimieren, angezogen für 4 Wochen in MS-Medium ohne (Zn–) und mit 30 μM ZnSO₄ (Zn+). (B) Relative Transkriptmengen (RTL) von ZIP4, ZIP1, ZIP3, ZIP5, ZIP9, ZIP12, IRT3 und ZIP2 in 3 Wochen alten Wildtypsetzlingen von Arabidopsis (WT) (weiße Balken) und m19m23-Doppelmutanten (graue Balken), angezogen in MS-Medium mit 30 μM ZnSO₄ (Zn+) oder ohne (Zn–). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
9: Sichtbare Phänotypen von OX 19 (# 19, 14, 15), OX 23 (# 16, 17, 18) und nicht transformierte Arabidopsis-Col-Pflanzen (WT), angezogen für 6 Wochen auf Hydrokulturmedium, zu welchem kein Zn zugegeben wurde (0 μM Zn), welche starke Zinkmangelsymptome ausbilden. Die Linien 19, 16 und 17 scheinen größere Rosetten und dunkelgrünere Blätter aufzuweisen, und zeigen im Vergleich zu WT eine geringere Sensitivität gegenüber Zinkmangel.
10: Vergleiche des Trockengewichts der Gesamtpflanze von OX 19 (# 19, 14, 15), OX 23 (# 16, 17, 18) und nicht transformierten Arabidopsis-Col-Pflanzen (WT), angezogen für 6 Wochen auf Hydrokulturmedium, zu welchem kein Zn zugegeben wurde (0 μM Zn) (A, linke Tafel); oder auf Hydrokulturmedium mit normalem Zn (2 mM Zn) (B, rechte Tafel). Nur bei der Behandlung mit wenig Zn, Linie # 16, wurde ein signifikanter Unterschied zu WT gefunden.
11: Zinkkonzentrationen von OX 19 (# 19, 14, 15), OX23 (#16, 17, 18) und nicht transformierten Arabidopsis-Col-Pflanzen (WT), angezogen für 6 Wochen auf Hydrokulturmedium, zu welchem kein Zn zugegeben wurde (0 μM Zn).
12: Sichtbare Phänotypen von pZIP4::bZIP19 (# 4, 5, 6, 7, 8, 9) und nicht transformierten Arabidopsis-Col-Pflanzen (# 1, 2, 3), angezogen für 3 Wochen auf Hydrokulturmedium, zu welchem kein Zn zugegeben wurde (0 μM Zn). Die Pflanzen zeigen noch keine Zn-Mangelsymptome. Obwohl zwischen den Linien eine gewisse Variation besteht aufgrund von Pflanzen, welche später als der Rest keimten, zeigen im Allgemeinen pZIP4::bZIP19-Pflanzen größere Rosettendurchmesser als nicht transformierte Pflanzen.
13: DNA-Sequenz und schematische Zeichnung des proZIP4::bZIP19-Konstrukts (pBG0072), das verwendet wurde, um transgene Arabidopsis zu erzeugen, welche die bZIP19-cDNA unter der Kontrolle des Zinkmangelresponsiven ZIP4-Promotors exprimiert.
Definitionen
Der Begriff „Gen” wird allgemein verwendet, um ein beliebiges Nukleinsäuresegment zu bezeichnen, welches mit einer biologischen Funktion verbunden ist. Somit umfassen Gene codierende Sequenzen und/oder die regulatorischen Sequenzen, welche für deren Expression erforderlich sind. Beispielsweise beziehen sich Gene auf ein Nukleinsäuresegment, welches mRNA oder funktionale RNA exprimiert oder ein spezifisches Protein codiert, und welches regulatorische Sequenzen umfasst. Gene umfassen auch nicht exprimierte DNA-Segmente, welche beispielsweise Erkennungssequenzen für andere Proteine bilden. Gene können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, einschließlich Klonieren aus einer Quelle von Interesse oder Synthetisieren mittels bekannten oder vorhergesagten Sequenzinformationen, und können Sequenzen umfassen, welche so gestaltet sind, dass sie gewünschte Parameter aufweisen.
Der Begriff „nativ” oder „Wildtyp”-Gen bezieht sich auf ein Gen, welches im Genom einer nicht transformierten Zelle vorliegt, d. h. in einer Zelle, welche keine bekannte Mutation aufweist. Der Begriff „nativ” oder „Wildtyp” soll allelische Varianten des Gens umfassen.
Ein „Markergen” codiert ein selektierbares oder Screening-fähiges Merkmal. Der Begriff „selektierbarer Marker” bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, welche ein metabolisches Merkmal codiert, das die Trennung von transgenen und nicht transgenen Organismen ermöglicht und sich meist auf die Bereitstellung einer Antibiotikaresistenz bezieht. Ein selektierbarer Marker ist beispielsweise der durch aph (npt) codierte Kanamycinresistenzmarker oder das hpt-Gen, das für die Hygromycinresistenz codierende Gen. Andere Selektionsmarker sind beispielsweise Reportergene wie etwa Chloramphenicol-Acetyltransferase, β-Galactosidase, Luziferase und das grün fluoreszierende Protein. Identifizierungsverfahren für die Produkte von Reportergenen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf enzymatische Assays und fluorimetrische Assays. Reportergene und Assays zum Nachweis ihrer Produkte sind im Fachgebiet allgemein bekannt und werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1987) und den entsprechenden periodischen Aktualisierungen beschrieben.
Der Begriff „chimäres Gen” bezieht sich auf ein beliebiges Gen, welches 1) Nukleotidsequenzen enthält, einschließlich regulatorischer und codierender Sequenzen, welche nicht zusammen in der Natur vorkommen oder 2) Nukleotidsequenzen enthält, welche Teile von Proteinen codieren, welche natürlicherweise nicht aneinander grenzen oder 3) Teile von Promotoren enthalten, welche natürlicherweise nicht aneinandergrenzen. Entsprechend kann ein chimäres Gen regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen umfassen, welche von unterschiedlichen Quellen stammen, oder kann regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen umfassen, welche von derselben Quelle stammen, aber auf eine andere Art angeordnet sind als sie in der Natur zu finden sind.
Ein „Transgen” bezieht sich auf ein Gen, das in das Genom durch Transformation eingebracht wurde und das bevorzugt stabil erhalten wird. Transgene können beispielsweise Gene umfassen, welche entweder heterolog oder homolog zu den Genen einer bestimmten zu transformierenden Pflanze sind. Außerdem können Transgene native Gene umfassen, welche in einen nicht nativen Organismus insertiert sind oder chimäre Gene. Der Begriff „endogenes Gen” bezieht sich auf ein natives Gen in seiner natürlichen Lokalisierung des Genoms eines Organismus. Ein „fremdes” Gen bezieht sich auf Gen, das normalerweise nicht im Wirtsorganismus zu finden ist, sondern welches durch Gentransfer eingebracht wurde.
Ein „Oligonucleotid”, beispielsweise zur Verwendung in Prüfungs- oder Amplifikationsreaktionen, kann etwa 30 oder weniger Nukleotide lang sein (z. B. 9, 12, 15, 18, 20, 21 oder 24, oder eine beliebige Zahl zwischen 9 und 30). Normalerweise besitzen spezifische Primer eine Länge von 14 Nukleotiden aufwärts. Für eine optimale Spezifität und Wirtschaftlichkeit können Primer mit 16 bis 24 Nukleotiden Länge bevorzugt werden. Fachleute sind versiert in der Gestaltung von Primern zur Verwendung in Verfahren wie etwa der PCR. Falls erforderlich, kann die Prüfung mit vollständigen Restriktionsfragmenten der hierin offenbarten Gene durchgeführt werden, welche hunderte oder sogar tausende Nukleotide lang sein können.
Die Begriffe „Protein”, „Peptid” und „Polypeptid” sind hierin austauschbar verwendet.
„Codierende Sequenz” bezieht sich auf eine Nukleotid(DNA oder RNA)-Sequenz, welche für eine spezifische Aminosäuresequenz codiert und schließt die nicht codierenden Sequenzen aus. Sie kann eine „nicht unterbrochene codierende Sequenz” darstellen, d. h. ohne ein Intron wie etwa in einer cDNA, oder sie kann ein oder mehrere Introns umfassen, gebunden durch geeignete Splice-Verbindungen. Ein „Intron” ist eine Sequenz von RNA, welche im primären Transkript enthalten ist, aber welche durch Spaltung und erneute Ligation der RNA innerhalb der Zelle beim Erzeugen der reifen mRNA, welche in ein Protein translatiert werden kann, entfernt wird. Auch die für diese Sequenz der RNA codierende DNA wird als „Intron” bezeichnet. „Exons” sind die codierenden Teile der DNA oder RNA-Sequenz, welche durch Introns voneinander getrennt sind.
„Regulatorische Sequenzen” beziehen sich auf Nukleotidsequenzen, welche stromaufwärts (5' nicht codierende Sequenzen), innerhalb oder stromabwärts (3' nicht codierende Sequenzen) einer codierenden Sequenz lokalisiert sind, und welche Transkription, RNA-Processing und Stabilität, oder die Translation der verbundenen codierenden Sequenz beeinflussen. Regulatorische Sequenzen umfassen Enhancer, Promotoren, Translations-Leadersequenzen, Introns und Polyadenylierungs-Signalsequenzen. Sie umfassen natürliche und synthetische Sequenzen ebenso wie Sequenzen, welche eine Kombination von synthetischen und natürlichen Sequenzen sein können. Wie oben angemerkt, ist der Begriff „geeignete regulatorische Sequenzen” nicht auf Promotoren beschränkt.
„Promotor” bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, normalerweise stromaufwärts (5') bezüglich der codierenden Sequenz, welche die Expression der codierenden Sequenz kontrolliert durch Bereitstellung der Erkennung für die RNA-Polymerase und andere Faktoren, die für eine korrekte Transkription erforderlich sind. „Promoter” umfasst einen Minimalpromoter, welcher eine kurze DNA-Sequenz ist, umfassend eine TATA-Box und andere Sequenzen, welche der Spezifizierung der Stelle der Transkriptionsinitiation dienen, zu welchen regulatorische Elemente zur Kontrolle der Expression zugefügt sind. „Promotor” bezieht sich auch auf eine Nukleotidsequenz, welche einen Minimalpromotor plus regulatorische Elemente umfasst, welche die Expression einer codierenden Sequenz oder funktionalen RNA kontrollieren kann. Diese Art von Promotorsequenz besteht aus proximalen und mehr distal stromaufwärts gelegenen Elementen, wobei die letztgenannten Elemente oft als Enhancer bezeichnet werden. Entsprechend ist ein „Enhancer” eine DNA-Sequenz, welche die Promotoraktivität stimulieren kann und ein innewohnendes Element des Promotors sein kann, oder ein heterologes Element, das zur Verstärkung des Niveaus oder der Gewebespezifität eines Promotors insertiert wird. Er kann in beide Orientierungen wirken (normal oder umgedreht) und kann sogar dann fungieren, wenn er entweder stromaufwärts oder stromabwärts des Promotors verschoben wird. Sowohl Enhancer als auch andere stromaufwärts gelegene Promotorelemente binden sequenzspezifisch DNA-bindende Proteine, welche deren Effekte vermitteln. Promotoren können vollständig von einem nativen Gen stammen oder können aus unterschiedlichen Elementen zusammengesetzt sein, welche aus unterschiedlichen, in der Natur zu findenden Promotoren stammen, oder können sogar aus synthetischen DNA-Segmenten bestehen. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen enthalten, welche an der Bindung von Proteinfaktoren beteiligt sind, welche die Effektivität der Transkriptionsinitiation als Reaktion auf physiologische Bedingungen oder Entwicklungsbedingungen steuern.
Die „Initiierungsstelle” ist die Position umgebend das erste Nukleotid, welches Teil der transkribierten Sequenz ist, welche auch als Position +1 bezeichnet wird. Im Hinblick auf diese Stelle werden alle anderen Sequenzen des Gens und der Kontrollregionen nummeriert. Stromabwärts gelegene Sequenzen (d. h. weitere proteincodierende Sequenzen in der 3'-Richtung) werden positiv benannt, während stromaufwärts gelegene Sequenzen (meistens die Kontrollregionen in der 5'-Richtung) negativ benannt werden.
„Konstitutive Expression” bezieht sich auf die Expression unter Verwendung eines konstitutiven Promotors.
„Konditionale” und „regulierte” Expression bezieht sich auf die Expression, welche durch einen regulierten Promotor gesteuert wird.
Ein „konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, welcher den offenen Leserahmen (ORF), welchen er kontrolliert, in allen oder nahezu allen Pflanzengeweben exprimieren kann, während allen oder nahezu allen Entwicklungsstadien der Pflanze.
Die Begriffe „offener Leserahmen” und „ORF” beziehen sich auf die Aminosäuresequenz, welche zwischen Translationsinitiation und Terminationscodons einer codierenden Sequenz codiert wird. Die Begriffe „Initiationscodon” und „Terminationscodon” beziehen sich auf eine Einheit von drei benachbarten Nukleotiden („Codon”) in einer codierenden Sequenz, welche die Initiation bzw. die Kettentermination der Proteinsynthese festlegen (mRNA-Translation).
Ein „regulierter Promotor” bezieht sich auf Promotoren, welche die Genexpression nicht konstitutiv regeln, sondern auf eine zeitlich und/oder räumlich regulierte Art und Weise, und umfasst sowohl gewebespezifische als auch induzierbare Promotoren. Er umfasst natürliche und synthetische Sequenzen ebenso wie Sequenzen, welche eine Kombination aus synthetischen und natürlichen Sequenzen darstellen können. Unterschiedliche Promotoren können die Expression eines Gens in unterschiedlichen Geweben oder Zelltypen, oder in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung oder als Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen regeln. Ständig werden neue Promotoren unterschiedlicher Typen gefunden, die bei Pflanzenzellen verwendbar sind, zahlreiche Beispiele sind zu finden in der Zusammenfassung von Okamuro, J. K. und Goldberg, R. B. (1989) Kapitel 1, „Regulation of Plant Gene Expression: General Principles" in Stumpf, P. K. und Conn, E. E. Eds., The Biochemistry of Plants: A comprehensive treatise. Academic Press, NY USA).
Ein „gewebespezifischer Promotor” bezieht sich auf regulierte Promotoren, welche nicht in allen Pflanzenzellen exprimiert werden, sondern nur in einem oder mehreren Zelltypen in spezifischen Organen (wie etwa Wurzeln, Stängel, Blätter oder Samen), spezifischen Geweben (wie etwa Embryo oder Keimblatt) oder spezifischen Zelltypen (wie etwa Blattparenchym oder Samenlagerzellen).
„Funktionsfähig verbunden” bezieht sich auf die Verbindung von Nukleinsäuresequenzen bei einem einzelnen Nukleinsäurefragment, so dass die Funktion des einen durch das andere beeinflusst wird. Beispielsweise ist eine regulatorische DNA-Sequenz „funktionsfähig verbunden mit oder „verbunden mit” einer DNA-Sequenz, welche für eine RNA oder ein Polypeptid codiert, wenn die zwei Sequenzen so angeordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz die Expression der codierenden DNA-Sequenz beeinflusst (d. h. dass die codierende Sequenz oder funktionale RNA sich unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors befindet). Codierende Sequenzen können in Sense- oder Antisense-Orientierung funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verbunden sein.
„Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines endogenen Gens, ORF oder Teils davon oder eines Transgens bei Pflanzen. Expression bezieht sich auf die Transkription und stabile Akkumulierung von Sense(mRNA)- oder funktionaler RNA. Expression kann sich auch auf die Produktion von Protein beziehen.
„Spezifische Expression” ist die Expression eines Genprodukts, welche auf ein oder wenige Pflanzengewebe (räumliche Limitierung) und/oder auf ein oder wenige Pflanzenentwicklungsstadien (zeitliche Limitierung) beschränkt ist. Es ist bekannt, dass kaum eine echte Spezifität existiert: Promotoren scheinen bevorzugt in einigen Geweben angeschaltet zu sein, während in anderen Geweben keine oder nur eine geringe Aktivität vorhanden sein kann. Dieses Phänomen ist als undichte Expression bekannt. Jedoch ist mit einer gewebespezifischen Expression in dieser Erfindung bevorzugt eine Expression in einem oder wenigen Pflanzengeweben gemeint.
Die Begriffe „heterologe DNA-Sequenz”, „exogenes DNA-Segment” und „heterologe Nukleinsäure” wie hierin verwendet beziehen sich jeweils auf eine Sequenz, welche aus einer Quelle stammt, die bezüglich der jeweiligen Wirtszelle fremd ist, oder wenn sie von der gleichen Quelle stammt, gegenüber der ursprünglichen Form modifiziert ist. Somit umfasst ein heterologes Gen in einer Wirtszelle ein Gen, welches bezüglich der jeweiligen Wirtszelle endogen ist, aber modifiziert wurde, beispielsweise durch die Verwendung von DNA-Shuffling. Die Begriffe umfassen auch nicht natürlich vorkommende multiple Kopien einer natürlich vorkommenden DNA-Sequenz. Somit beziehen sich die Begriffe auf ein DNA-Segment, welches fremd oder heterolog bezüglich der Zelle ist, oder homolog bezüglich der Zelle ist, aber in einer Position innerhalb der Wirtszellnukleinsäure, in welcher das Element normalerweise nicht zu finden ist. Exogene DNA-Segmente werden exprimiert, um exogene Polypeptide zu erhalten, Eine „homologe” DNA-Sequenz ist eine DNA-Sequenz, welche natürlicherweise mit einer Wirtszelle verbunden ist, in welche sie eingebracht wird.
„Homolog zu” im Zusammenhang mit einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenzidentität bezieht sich auf die Ähnlichkeit der Nukleotidsequenz von zwei Nukleinsäuremolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinmolekülen. Schätzungen einer solchen Homologie werden entweder durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bereitgestellt, wie im Fachgebiet allgemein bekannt ist (beschrieben in Haines und Higgins (Ed.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K.), oder durch den Vergleich der Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäuren oder Proteinen. Zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen sind homolog, wenn ihre Sequenzen eine Sequenzähnlichkeit von mehr als 60%, bevorzugt mehr als 70%, 80%, 85%, 90%, 95% oder sogar 98% aufweisen.
Der Begriff „im Wesentlichen ähnlich” bezieht sich auf Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, welche funktionale und/oder strukturelle Äquivalente von hierin offenbarten Sequenzen darstellen. Veränderte Nukleotidsequenzen, welche lediglich die Degeneration des genetischen Codes widerspiegeln, aber nichtsdestotrotz Aminosäuresequenzen codieren, welche mit einer bestimmten Aminosäuresequenz identisch sind, sind beispielsweise im Wesentlichen ähnlich mit den betreffenden Sequenzen. Außerdem sind Aminosäuresequenzen, welche zu einer bestimmten Sequenz im Wesentlichen ähnlich sind, diejenigen Sequenzen, worin eine gesamte Aminosäureidentität mindestens 65% oder mehr zu den betreffenden Sequenzen beträgt. Modifikationen, welche äquivalente Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen ergeben, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Außerdem erkennt der Fachmann, dass von dieser Erfindung umfasste äquivalente Nukleotidsequenzen auch durch ihre Fähigkeit zur Hybridisierung unter niedrigen, moderaten und/oder stringenten Bedingungen (z. B. 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) definiert werden können, bei den Nukleotidsequenzen, welche innerhalb des wörtlichen Umfangs der vorliegenden Ansprüche liegen.
Der Begriff „Transformation” bezieht sich auf den Transfer eines Nukleinsäurefragments in das Genom einer Wirtszelle, was ein genetisch stabiles Erbgut ergibt. Wirtszellen mit den transformierten Nukleinsäurefragmenten werden als „transgene” Zellen bezeichnet, und Organismen umfassend transgene Zellen werden als „transgene Organismen” bezeichnet. Beispiele für Verfahren zur Transformation von Pflanzen und Pflanzenzellen umfassen die durch Agrobacterium vermittelte Transformation (De Blaere et al., 1987), die Partikelbeschusstechnik (Klein et al., 1987, US-Patent Nr. 4,945,050 ), Mikroinjektion, CaPO₄-Präzipitation, Lipofektion (Liposomenfusion), die Verwendung einer Gene Gun und DNA-Vektortransporter (Wu et al., 1992). Aus transgenen Zellen können vollständige Pflanzen durch Verfahren regeneriert werden, welche dem Fachmann allgemein bekannt sind (siehe beispielsweise Fromm et al., 1990).
„Transformiert”, „transgen” und „rekombinant” beziehen sich auf einen Wirtsorganismus wie etwa ein Bakterium oder eine Pflanze, in welches ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingebracht wurde. Das heterologe Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom integriert sein, allgemein im Fachgebiet bekannt und offenbart in Sambrook et al., 1989. Siehe auch Innis et al., 1995 und Gelfand, 1995 und Innis und Gelfand, 1999. „Transformierte”, „transformante” und „transgene” Pflanzen oder Kalli haben den Transformationsprozess durchlaufen und enthalten integriert in ihr Chromosom ein fremdes Gen. Der Begriff „nicht transformiert” bezieht sich auf normale Pflanzen, welche den Transformationsprozess nicht durchlaufen haben.
„Transient transformiert” bezieht sich auf Zellen, in welche Transgene und fremde DNA eingebracht wurden (beispielsweise durch solche Verfahren wie die Agrobacterium-vermittelte Transformation oder biolistischer Beschuss), die aber nicht bezüglich einer stabile Erhaltung selektiert wurden.
„Stabil transformiert” bezieht sich auf Zellen, welche nach der Transformation auf einem Selektionsmedium selektiert und regeneriert wurden.
„Genetisch stabil” und „erblich” bezieht sich auf chromosomal integrierte genetische Elemente, welche in der Pflanze stabil erhalten werden und durch Nachkommen an die Folgegenerationen vererbt werden.
„Chromosomal integriert” bezieht sich auf die Integration eines Fremdgens oder DNA-Konstrukts in die Wirts-DNA durch kovalente Bindungen. Wenn Gene nicht „chromosomal integriert” sind, können sie „transient exprimiert” sein. Die transiente Expression eines Gens bezieht sich auf die Expression eines Gens, welches nicht in das Wirtschromosom integriert ist, sondern unabhängig fungiert, entweder als Teil eines autonom replizierenden Plasmids oder einer Expressionskassette, beispielsweise als Teil eines anderen biologischen Systems wie etwa eines Virus.
„Primärer Transformant” bezieht sich auf transgene Pflanzen, welche aus der gleichen genetischen Generation stammen wie das Gewebe, welches ursprünglich transformert wurde (d. h. seit der Transformation keine Meiose und Befruchtung durchlaufen haben).
„Sekundäre Transformanten” und die „T1-, T2-, T3- usw. Generationen” beziehen sich auf transgene Pflanzen, welche über einen oder mehrere meiotischen und Befruchtungszyklen von primären Transformanten stammen. Sie können durch Selbstbefruchtung von primären oder sekundären Transformanten oder von Kreuzungen von primären oder sekundären Transformanten mit anderen transformierten oder nicht transformierten Pflanzen stammen. Sekundäre Transformanten sind ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
„Genom” bezieht sich auf das vollständige genetische Material eines Organismus.
Der Begriff „Nukleinsäure” oder „Polynukleotid” bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon entweder in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form, zusammengesetzt aus Monomeren (Nukleotiden), welche einen Zucker, Phosphat und eine Base enthalten, welche entweder ein Purin oder Pyrimidin ist. Solange nicht ausdrücklich beschränkt, umfasst der Begriff Nukleinsäuren bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden, welche ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweisen und welche auf eine Art und Weise metabolisiert werden, welche ähnlich ist wie bei natürlich vorkommenden Nukleotiden. Solange nicht anders angegeben, umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz also implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z. B. degenerierte Codonsubstitutionen) und komplementäre Sequenzen ebenso wie die ausdrücklich angegebene Sequenz. Degenerierte Codonsubstitutionen können insbesondere erhalten werden durch Erzeugung von Sequenzen, worin die dritte Position eines oder mehrerer ausgewählter (oder aller) Codons durch gemischtbasige und/oder Desoxyinosinreste ersetzt ist (Batzer et al., 1991; Ghtsuka et al., 1995; Rossolini et al., 1994). Ein „Nukleinsäurefragment” ist ein Teil eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls. In höheren Pflanzen ist das genetische Material die Desoxyribonukleinsäure (DNA), während die Ribonukleinsäure (RNA) am Transfer in der DNA enthaltenen Information in Proteine beteiligt ist. Der Begriff „Nukleotidsequenz” bezieht sich auf ein Polymer von DNA oder RNA, welches einzeln- oder doppelsträngig sein kann, optional synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthalten kann, welche in DNA- oder RNA-Polymere integriert werden können. Die Begriffe „Nukleinsäure” oder „Nukleinsäuresequenz” können auch austauschbar verwendet werden mit Gen, cDNA, DNA und RNA, codiert durch ein Gen.
Die in den Aspekten der Erfindung verwendeten Nukleotidsequenzen umfassen sowohl die natürlich vorkommenden Sequenzen als auch mutante (variante) Formen. Solchen Varianten besitzen nach wie vor die gewünschte Aktivität, d. h. entweder Promotoraktivität oder die Aktivität des Produkts, codiert durch den offenen Leserahmen der nicht varianten Nukleotidsequenz.
Somit ist mit „Variante” eine im Wesentlichen ähnliche Sequenz gemeint. Bei Nukleotidsequenzen umfassend einen offenen Leserahmen umfassen Varianten diejenigen Sequenzen, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes die mit der Aminosäuresequenz des nativen Proteins identische Aminosäuresequenz codieren. Solche natürlich vorkommenden allelischen Varianten können identifiziert werden unter Verwendung von allgemein bekannten molekularbiologischen Verfahren, wie etwa beispielsweise die Polymerase-Kettenreakten (PCR) und Hybridisierungstechniken. Variante Nukleotidsequenzen umfassen auch synthetisch erzeugte Nukleotidsequenzen, wie etwa beispielsweise diejenigen, die unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese erzeugt werden, und bezüglich offener Leserahmen das native Protein codieren, ebenso wie diejenigen, welche ein Polypeptid mit Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zum nativen Protein aufweisen. Im Allgemeinen besitzen die Nukleotidsequenzvarianten der Erfindung mindestens 40, 50, 60 bis 70%, z. B. bevorzugt 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% bis 79%, im Allgemeinen mindestens 80%, z. B. 81% bis 84%, mindestens 85%, z. B. 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% bis 98% und 99% Nukleotidsequenzidentität bezüglich der nativen (Wildtyp- oder endogenen) Nukleotidsequenz.
Der Begriff „Nukleotidsequenzidentität” oder „Nukleotidsequenzhomologie” wie hierin verwendet, bezeichnet das Maß an Ähnlichkeit bzw. das Maß an Homologie zwischen zwei Polynukleotiden. Polynukleotide besitzen „identische” Sequenzen, wenn die Sequenz der Nukleotide in den zwei Sequenzen gleich ist. Polynukleotide besitzen „homologe” Sequenzen, wenn die Sequenz der Nukleotide in den zwei Sequenzen gleich ist bei einer Anordnung im Hinblick auf eine maximale Übereinstimmung. Ein Sequenzvergleich zwischen zwei oder mehreren Polynukleotiden wird im Allgemeinen durchgeführt durch einen Vergleich von Teilen der zwei Sequenzen über ein Vergleichsfenster, um lokale Bereiche der Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Das Vergleichsfenster weist im Allgemeinen etwa 20 bis 200 aufeinander folgende Nukleotide auf.
Der „Prozensatz der Identität” oder „Prozentsatz der Sequenzhomologie” für Polynukleotide, wie etwa 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 oder 100% Sequenzidentität oder Homologie kann durch Vergleichen von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt werden, worin der Anteil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster für die optimale Ausrichtung der zwei Sequenzen Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) im Vergleich mit der Referenzsequenz enthalten kann (welche keine Additionen oder Deletionen umfasst). Der Prozensatz wird berechnet durch: (a) Bestimmung der Anzahl der Positionen, worin bei beiden Sequenzen die identische Nukleinsäurebase auftaucht, was die Anzahl der übereinstimmenden Positionen ergibt; (b) Dividieren der Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster; und (c) Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozensatz der Sequenzhomologie zu erhalten. Eine optimale Anordnung der Sequenzen für einen Vergleich kann durch computergestützte Implementierungen von bekannten Algorithmen durchgeführt werden oder durch Sichtkontrolle. Leicht verfügbare Algorithmen zum Sequenzvergleich bzw. zur Anordnung mehrerer Sequenzen sind beispielsweise BLAST („Basic Local Alignment Search Tool”) (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997) und das Programm ClustalW, beide im Internet erhältlich. Andere geeignete Programme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf GAP, BestFit, PlotSimilarity und FASTA im Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA) (Devereux et al., 1984).
Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können für eine verbesserte Expression in Pflanzen von Interesse „optimiert” werden. Siehe beispielsweise EP 0359472 oder WO 91116432 . Auf diese Art und Weise können die offenen Leserahmen in Genen oder Genfragmenten unter Verwendung von in Pflanzen bevorzugten Codons synthetisiert werden. So können die Nukleotidsequenzen für eine Expression in einer beliebigen Pflanze optimiert werden.
Mit einem „varianten” Polypeptid ist ein Polypeptid gemeint, welches vom nativen Protein durch Deletion (sog. Trunkation) oder Addition von einem oder mehreren Aminosäuren am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Proteins, durch Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein oder durch Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgeleitet ist. Solche Varianten können sich beispielsweise aus einem genetischen Polymorphismus oder durch menschliche Manipulation ergeben. Verfahren für solche Manipulationen sind im Fachgebiet allgemein bekannt. In der Definition von varianten Polypeptiden sind auch „orthologe” Polypeptide (Orthologe) umfasst, welche Peptide sind, codiert durch Gene in unterschiedlichen Spezies, welche sich aus einem gemeinsamen Ahnengen durch Artbildung entwickelten. Normalerweise behalten Orthologe im Verlauf der Evolution die gleiche Funktion bei.
Somit können die Polypeptide auf verschiedene Möglichkeiten verändert werden, einschließlich Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Trunkationen und Insertionen. Verfahren für solche Manipulationen sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Konservative Substitutionen, wie etwa Austauschen einer Aminosäure durch eine andere mit gleichen Eigenschaften, sind bevorzugt. Individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, welche eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentanteil der Aminosäuren (normalerweise weniger als 5%, mehr bevorzugt weniger als 1%) in einer codierten Sequenz verändern, zufügen oder deletieren, sind „konservativ modifizierte Variationen”, wobei die Änderungen die Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure ergeben.
Eine „Expressionskassette” wie hierin verwendet bedeutet eine DNA-Sequenz, welche die Expression einer bestimmten Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle steuern kann, umfassend einen Promotor, funktionsfähig verknüpft mit der Nukleotidsequenz von Interesse, welche funktionsfähig mit Terminationssignalen verbunden ist. Sie umfasst normalerweise auch Sequenzen, welche für eine ordnungsgemäße Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Die codierende Region codiert normalerweise für ein Protein von Interesse, kann aber auch für eine funktionale RNA von Interesse codieren, beispielsweise eine Antisense-RNA oder eine nicht translatierte RNA, in Sense- oder Antisense-Richtung. Die Expressionskassette umfassend die Nukleotidsequenz von Interesse kann chimär sein, was bedeutet, dass mindestens einer der Bestandteile im Hinblick auf mindestens einen der anderen Bestandteile heterolog ist. Die Expressionskassette kann auch eine Kassette sein, welche natürlich vorkommt, aber in einer rekombinanten Form erhalten wird, welche für eine heterologe Expression verwendbar ist. Die Expression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann sich unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors befinden, welcher die Transkription nur initiiert, wenn die Wirtszelle einem bestimmten externen Stimulus ausgesetzt ist. Im Fall eines mehrzelligen Organismus kann der Promoter auch spezifisch für ein bestimmtes Gewebe oder Organ oder Entwicklungsstadium sein.
Der Begriff „Vektor” wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Konstruktion umfassend genetisches Material, welches zur Steuerung der Transformation einer Zielzelle gestaltet wurde. Ein Vektor enthält mehrere genetische Elemente, welche bezüglich der Position und Sequenz orientiert sind, d. h. funktionsfähig verknüpft mit anderen notwendigen Elementen, so dass die Nukleinsäure in einer Nukleinsäurekassette transkribiert werden kann und, falls erforderlich, in der transformierten Zelle translatiert werden kann. „Vektor” ist so definiert, dass er u. a. ein beliebiges Plasmid, Cosmid, einen Phagen oder einen binären Agrobacterium-Vektor in einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen linearen oder zirkulären Form umfasst, welcher selbst-transmissibel oder mobilisierbar sein kann oder nicht, und welcher einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt entweder durch Integration in das zelluläre Genom transformieren kann oder extrachromosomal existiert (z. B. als autonom replizierendes Plasmid mit einem Replikationsursprung). Insbesondere umfasst sind Shuttle-Vektoren, womit ein DNA-Vehikel gemeint ist, das natürlich oder durch die Gestaltung, in zwei unterschiedlichen Wirtsorganismen replizieren kann, welche ausgewählt sein können aus Actinomyceten und verwandten Spezies, Bakterien und Eukaryonten (z. B. höhere Pflanzen, Säuger, Hefe oder Pilzzellen). Bevorzugt befindet sich die Nukleinsäure im Vektor unter der Kontrolle von und ist funktionsfähig verknüpft mit einem geeigneten Promoter oder anderen regulatorischen Elementen für die Transkription in einer Wirtszelle wie etwa einer Mikrobe, z. B. einem Bakterium, oder einer Pflanzenzelle. Der Vektor kann ein bifunktionaler Expressionsvektor sein, welcher in mehreren Wirten funktioniert. Im Fall von genomischer DNA kann diese ihren eigenen Promoter oder andere regulatorische Elemente enthalten, und im Fall von cDNA kann dieser unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder anderen regulatorischen Elementen für eine Expression in der Wirtszelle geschehen.
„Klonierungsvektoren” enthalten normalerweise eine oder eine kleine Anzahl von Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen, an welchen fremde DNA-Sequenzen auf bestimmbare Art und Weise ohne Verlust einer wichtigen biologischen Funktion des Vektors insertiert werden können, ebenso wie ein Markergen, welches für die Verwendung bei der Identifikation und Selektion von Zellen geeignet ist, welche mit dem Klonierungsvektor transformiert wurden.
Eine „transgene Pflanze” ist eine Pflanze mit einer oder mehreren Pflanzenzellen, welche einen Expressionsvektor enthalten.
„Pflanzengewebe” umfasst differenzierte und nicht differenzierte Gewebe oder Pflanzen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Wurzeln, Stängel, Sprosse, Blätter, Pollen, Samen, Tumorgewebe und verschiedene Formen von Zellen und Kulturen wie etwa Einzelzellen, Protoplasten, Embryonen und Kallusgewebe. Das Pflanzengewebe kann in Pflanzen oder in Organen, Gewebe oder Zellkultur vorliegen.
Der Begriff „Pflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen beliebigen Pflanzentyp. Die Erfinder haben unten eine exemplarische Beschreibung einiger Pflanzen bereitgestellt, welche für die Erfindung verwendet werden können. Jedoch ist diese Liste nur für illustrative Zwecke bereitgestellt und ist nicht beschränkend, da Fachleute andere Pflanzentypen kennen, und in der Erfindung verwendet werden können.
Eine gängige Pflanzenklasse, welche in der Landwirtschaft verwertet wird, sind Gemüsepflanzen, einschließlich Artischoken, Kohlrabi, Rauke, Porree, Spargel, Salat (z. B. Kopfsalat, Blattsalat, Römersalat), Bok choy, Malanga, Brokkoli, Melonen (z. B. Zuckermelone, Wassermelone, Crenshaw-Melone, Honigmelone, Kantalupe-Melone), Rosenkohl, Kraut, Cardone, Karotten, Napakohl, Blumenkohl, Okra, Zwiebeln, Sellerie, Petersilie, Kichererbsen, Pastinaken, Chicorée, Chinakohl, Paprika, Kohl, Kartoffeln, Gurkenpflanzen (Speisekürbis, Gurken), Kürbisse, Kürbisgewächse, Radieschen, trockene Zwiebelknollen, Steckrüben, Auberginen, Schwarzwurzel, Eskariol, Schalotten, Endivie, Knoblauch, Spinat, Frühlingszwiebeln, Kürbis, Gemüse, Rüben (Zuckerrübe und Futterrübe), Süßkartoffeln, Mangold, Meerrettich, Tomaten, Grünkahl, Rüben und Gewürze.
Andere Pflanzentypen, welche häufig kommerziell genutzt werden, umfassen Früchte und Rebenfrüchte, wie etwa Äpfel, Aprikosen, Kirschen, Nektarinen, Pfirsiche, Birnen, Zwetschgen, Pflaumen, Quitten Mandeln, Kastanien, Haselnüsse, Pekannüsse, Pistazien, Walnüsse, Zitrusfrüchte, Blaubeeren, Boysenbeeren, Moosbeeren, Johannisbeeren, Loganbeeren, Himbeeren, Erdbeeren, Brombeeren, Trauben, Avocados, Bananen, Kiwi, Dattelpflaumen, Granatäpfel, Ananas, tropische Früchte, Melone, Mango, Papaya und Litschi.
Viele der am häufigsten angebauten Pflanzen sind Feldfrüchte wie etwa Nachtkerze, Wesenschaumkraut, Mais (Feld, süß, Popcorn), Hopfen, Jojoba, Erdnüsse, Reis, Färberdistel, Körner (Gerste, Hafer, Roggen, Weizen, etc.), Hirse, Tabak, Kapok, Leguminosenpflanzen (Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnuss, Rhizinusölpflanzen, Kakaobohnen, Erdnüsse), Faserpflanzen (Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Lauraceae (Zimt, Kampfer) oder Pflanzen wie etwa Kaffee, Zuckerrohr, Tee und natürliche Kautschukpflanzen.
Besonders bevorzugt in der vorliegenden Erfindung sind Pflanzen mit einer hohen Biomasse, wie etwa Pflanzen, welche auch bei der Biokraftstoffproduktion verwendet werden, wie etwa Miscanthus, Rutenhirse, Pappel, Eukalyptus, Kiefer, Weide, Silberahorn, Luzerne, Jatropha und Pongamia pinnata.
Eine andere ökonomisch bedeutsame Gruppe von Pflanzen sind Zierpflanzen. Beispiele für allgemein angebaute Zierpflanzen umfassen Alstroemeria (z. B. Alstroemeria brasiliensis), Aster, Azalee (z. B. Rhododendron sp.), Begonien (z. B. Begonia sp.), Glockenblume, Bougainvillea, Kaktus (z. B. Cactaceae schlumbergera truncata), Kamelie, Nelken (z. B. Dianthus caryophyllus), Chrysanthemen (z. B. Chrysanthemum sp.), Clematis (z. B. Clematis sp.), Hahnenkamm, Akelei, Veilchen (z. B. Cyclamen sp.), Narzissen (z. B. Narcissus sp.), Scheinzypresse, Freesie (z. B. Freesia refracta), Geranien, Gerbera, Gladiolen (z. B. Gladiolus sp.), Stechpalme, Hibiscus (z. B. Hibiscus rosasanensis), Hortensie (z. B. Macrophylla hydrangea), Wacholder, Lilien (z. B. Lilium sp.), Magnolie, Minirosen, Orchideen (z. B. Mitglieder der Familie Orchidaceae), Petunien (z. B. Petunia hybrida), Weihnachtsstern (z. B. Euphorbia pulcherima), Primeln, Rhododendron, Rosen (z. B. Rosa sp.), Löwenmäulchen (z. B. Anfirrhinum sp.), Stauden, Bäume wie etwa Forstbäume (Laubbäume und immergrüne Pflanzen wie etwa Koniferen) und Tulpen (z. B. Tulipa sp.).
Der Begriff „Pflanzenteil” wie hierin verwendet umfasst die Referenz auf Einzelzellen und Gewebe von Mikrosporen, Pollen, Samenanlagen, Blättern, Embryonen, Wurzeln, Wurzelspitzen, Antheren, Blüten, Früchte, Samen, Stängel, Sprossen, Schösslinge, Rhizome, Protoplasten, Kalli, meristematische Gewebe und dergleichen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „Nutzpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanze, welche geerntet wird oder ein Produkt liefert, welches geerntet werden kann.
Die Begriffe „Setzling” und „Pflänzchen” wie hierin verwendet, sind austauschbar und beziehen sich auf die junge Pflanze, angezogen aus einem Keim, Embryo oder einem keimenden Samen und umfassend im Allgemeinen alle beliebigen kleinen Pflanzen, welche gut entwickelte grüne Keimblätter und eine Wurzelausdehnung zeigen, und welche vermehrt werden, ehe sie an den endgültigen Ort verpflanzt werden, an dem sie reifen.
Der Begriff „Gewebekultur”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Kultur von Pflanzenzellen, worin die Zellen in einem Nährmedium unter kontrollierten Bedingungen vermehrt werden.
„Signifikanter Anstieg” ist ein Anstieg, welcher größer ist als die dem Messverfahren inhärente Fehlergrenze, bevorzugt ein Anstieg um etwa 10% bis 50%, oder sogar das Zweifache oder mehr.
„Signifikant weniger” bedeutet, dass die Abnahme größer ist als die dem Messverfahren inhärente Fehlergrenze, bevorzugt eine Abnahme um das Zweifache oder mehr.
Der Begriff „endogen” wie etwa in „endogen erzeugt bezieht sich auf die Produktion innerhalb einer Pflanze (Pflanzenzelle).
Der Begriff „Produktionsfläche” wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Ort, an dem Pflanzen angebaut werden und an dem Produkte in der Form von Pflanzen oder Pflanzenteilen für die Ernte erzeugt werden. Die Größe der Produktionsfläche wird im Allgemeinen als Quadratmeter oder Morgen Land ausgedruckt. Eine Produktionsfläche kann ein offenes Feld oder ein Gewächshaus sein.
Der Begriff „Biomasseproduktion”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Produktion von pflanzlichem organischen Material.
Der Begriff „Trockensubstanzgehalt”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Masseanteil (%), welcher verbleibt, nachdem der Wasseranteil (%) durch Trocknung entfernt wurde.
DNA-Sequenzen für die Transformation
Praktisch jede beliebige DNA-Zusammensetzung kann verwendet werden zur Übertragung an Empfängerpflanzenzellen, um schließlich fertile transgene Pflanzen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Beispielsweise können DNA-Segmente in der Form von Vektoren und Plasmiden, oder lineare DNA-Fragmente, welche in einigen Fällen nur das in der Pflanze zu exprimierende DNA-Element enthalten und dergleichen verwendet werden. Die Konstruktion von Vektoren, welche in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Gelvin et al., 1990). Vektoren einschließlich Plasmide, Cosmide, YACs („yeast artificial chromosomes”), BACs („bacterial artificial chromosomes”) und DNA-Segmente zur Verwendung bei der Transformation von Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen selbstverständlich die cDNA, das Gen oder die Gene, welche für Herstellung von Isopren in dem Transformanten erforderlich sind.
Der erfindungsgemäße Vektor kann in eine beliebige Pflanze eingebracht werden. Die einzubringenden Gene und Sequenzen können praktischerweise in Expressionskassetten verwendet werden zum Einführen und für die Expression in einer beliebigen Pflanze von Interesse. Solche Expressionskassetten umfassen eine Transkriptionsinitiationsregion (einen Promotor), verbunden mit dem Gen, welches das Isoprensynthasegen von Interesse codiert. Solch eine Expressionskassette wird bevorzugt mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen für eine Insertion bereitgestellt, damit sich das Gen von Interesse unter der transkriptionellen Regulation der regulatorischen Regionen befindet, wie etwa dem bestimmten Promotor. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten, welche für den einzelnen Wirtsorganismus geeignet sind.
Die Transkriptionskassette umfasst in der 5'-3'-Richtung der Transkription transkriptionelle und translationelle Initiationsregionen, eine DNA-Sequenz von Interesse und transkriptionelle und translationelle Terminationsregionen, welche in Pflanzen funktionsfähig sind.
Die Terminationsregion kann bezüglich der transkriptionellen Initiationsregion nativ sein, kann bezüglich der DNA von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen.
Geeignete Terminationsregionen sind erhältlich durch das Ti-Plasmid von A. tumefaciens, wie etwa die Terminationsregionen der Octopinsynthase und Nopalinsynthase. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141–144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891–7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res, 15: 9627–9639.
Methoden für die Konstruktion für die Pflanzentransformation sind im Fachgebiet beschrieben.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Pflanzen mit dem Nukleotid, welches für bZIP19 oder pZIP23 codiert, transformiert. Diese Gene können von Arabidopsis stammen. Alternativ können Orthologe von bZIP19 und bZIP23 verwendet werden, wie etwa diejenigen von Populus trichocarpa (PtrbZIP38 oder XM_002305485.1 und PtrbZIP39 oder XM_002313671.1); Reis (OsbZIP48 oder AK071639.1), Helianthus annuus (CD852649.1), Medicago truncatula (TA25329_3880), Solanum tuberosum (TA3333_3880), Glycine max (TA50226_3847; TA50224_3847), Sorghum bicolar (TA23717_4558), Zea mays (TA111061_4577; TA111059_4577; CO451643) oder Hordeum vulgare (TA45897_4513).
Die Aminosäuresequenzen der Proteine von Arabidopsis werden in 1 gezeigt, die Gene für diese Proteine können in den Gendatenbanken unter den Zugangsnummern At4g35040 oder NM_119670.4 (bZIP19) und At2g16770 oder NM_119670.4 (bZIP23). Die Sequenzen sind auch als SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 1 aufgelistet. Alle bZIP-Proteine enthalten eine charakteristische und hochkonservierte Basisdomäne, welche DNA bindet, und ein Leucinzipper-Dimerisierungsmotiv. bZIPs können Homo- und/oder Heterodimere bilden, welche DNA auf sequenzspezifische Art und Weise binden, und welche kurze palindromische oder pseudopalindromische Zielsequenzen binden können (Fyjii, Y. et al., 2000, Nature 7: 889–893). Pflanzen-bZIPs sind wichtig für die Regulierung der Pathogenabwehr, Umweltsignalgebung und Entwicklung, aber bislang wird etwa 2/3 der bZIP-Mitgliedern keine Funktion zugeordnet (Hakoby, M. et al., 2002, Trends Plant Sci. 7: 106–111). Unter diesen sind die bZIP19- und bZIP23-Gene. Sie gehören zur Gruppe F, eine von 10 Gruppen, in welche diese Familie unterteilt ist. Diese Gruppe enthält ein drittes Mitglied, bZIP24, welches in dem Hefe-Ein-Hybrid-Assay nicht identifiziert wurde. Die für bZIP19 und bZIP23 vorhergesagten Proteinsequenzen teilen 69% Aminosäuresequenzidentität, und nur 28 bzw. 32% mit bZIP24. Alle drei Mitglieder der F-Gruppe enthalten zwei charakteristische histidinreiche Motive (1).
Wie zu sehen ist, teilen bZIP19 und bZIP23 die bZIP-Domäne bei Aminosäure 79–110 (bZIP23) und Aminosäure 94–125 (bZIP19), und zwei histidinreiche Motive beim Aminosäure 36–48 und 51–60 (bZIP23) und Aminosäure 44–56 und 59–68 (bZIP19).
Obwohl es möglich ist, eine Überexpression entweder von bZIP19 oder von bZIP23 in einer Pflanze zu erhalten, durch Versehen einer solchen Pflanze mit den oben erwähnten Nukleotidsequenzen, ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung eine Pflanze, in welcher beide Proteine überexprimiert werden. Wie im experimentellen Teil erläutert wird, agieren die Gene redundant, wobei bZIP19 nur teilweise redundant ist. Die bZIP-Transkriptionsfaktoren agieren im Allgemeinen als Dimere. Ihre Redundanz deutet darauf hin, dass bZIP19 und bZIP23 als Homo(di)mere agieren, in Übereinstimmung mit früheren Vorhersagen (Deppmann, C. D. et al., 2006, Mol. Biol. Evol. 23: 1480–1492).
Eine Überexpression von bZIP19 und/oder bZIP23 kann erreicht werden durch Insertion von einer oder von mehr als einer zusätzlichen Kopie des ausgewählten Gens. Es ist keineswegs unbekannt bei Pflanzen und ihren Nachkommen, die ursprünglich mit einer oder mehr als einer zusätzlichen Kopie einer Nukleotidsequenz transformiert wurden, dass sie eine Überexpression aufweisen.
Das Erhalten eines ausreichenden Niveaus der Transgenexpression in den geeigneten Pflanzengeweben ist ein wichtiger Aspekt bei der Produktion von genetisch veränderten Anbaupflanzen. Die Expression von heterologen DNA-Sequenzen in einem Pflanzenwirt hängt von der Anwesenheit eines funktionsfähig verknüpften Promotors ab, welcher innerhalb des Pflanzenwirts funktionell ist. Die Auswahl der Promotorsequenz bestimmt, wann und wo innerhalb des Organismus die heterologe DNA-Sequenz exprimiert wird. Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in den Wurzeln exprimiert, wo Zn aus dem Boden aufgenommen und transportiert wird, und in anderen Zellen der Pflanze, welche gegenwärtig in den Transport und die Akkumulation von Zink involviert sind. Solche wurzelspezifischen Promotoren sind einem Fachmann allgemein bekannt und können ausgewählt werden aus RoID, RPL16A. Tub-1, ARSK1, PsMT_a ( WO 97/20057 ) und Atao1-Promotor (Møller, S. G. und McPherson, M. J., 1998, The Plant J., 13: 781–791), dem AAP6-Promotor (Okumoto, S. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 54338–54346), dem Tabak-RB7-Promotor (Yamamoto, Y. T. et al., 1991, Plant Cell 3: 371–382), dem Arabidopsis-ADH-Promotor (Mckendree, W. L. et al., 1992, Plant Mol. Biol. 19: 859–862), dem Arabidopsis-PHT1-Promotor (Koyama, T. et al., 2004, J. Biosci. Bioeng. 99: 38–42), dem Arabidopsis-pyk10-Promotor (Nitz, I. et al., 2001, Plant Sci. 161: 337–346), dem Peroxidasegen-Promotor (prxEa) aus Arabidopsis (Wanapu und Shinmyo, 1996, Ann. N.Y. Acad. Sci. 782: 107–114), dem Tomaten-SIREO-Promotor (Jones, M. O. et al., 2008, Funct. Plant Biol. 35: 1224–1233), dem Alfalfa-MsPRP2-Promotor (Winicov, I. et al.), den Reis-ZRP3- und ZRP4-Promotoren (Ref?), den Mais-RCc2- und Rcc3-Promotoren (Ref?), dem Erdbeer-FaRB7-Promotor (Vaughn, S. P. et al., 2006, J. Exp. Botany doi:10.1093/jxb/erl185), den in US 5,459,252 , US 5,837,876 , WO 97/005261 , WO 2001/53502 , WO 2001/044454 , WO 20061024291 und WO 2006/022467 offenbarten Promotoren. Alternativ können Promotoren von Genen verwendet werden, welche im Allgemeinen bei der Expression von bZIP19 oder bZIP23 gesteuert werden, beispielsweise die in Tabelle 3 aufgelisteten. Es wird angenommen, dass diese Promotoren besonders bevorzugt sind, da sie in den Zellen exprimiert werden, in denen die Proteine normalerweise agieren, und da sie in Gegenwart von Zn induziert werden und somit das Zn-Mangelsignal amplifizieren, wodurch eine frühere und besonders starke Reaktion bewirkt wird.
Obwohl bekannt ist, dass einige transgene Ansätze in der Tat die Anpassung von Pflanzen gegenüber Veränderungen der Zinkkonzentrationen in der Umgebung beeinflussen, sind alle diese Ansätze Versuche, um Pflanzen transgen im Hinblick auf Zinktransporterproteine zu machen (wie etwa ZAT, siehe van der Zaal, B. J., 1999, Plant Physiol. 119: 1047–1055; AtHMA4, siehe Verret, F. et al., 2004, FEBS Lett. 576: 306–312; und NAS, siehe Takahashi, M. et al., 2003, Plant Cell 15: 1263–1280). Die vorliegende Erfindung ist bestrebt, bei der Regulierung von Zink, Aufnahme, Transport und Lagerung in der Pflanze einzugreifen, durch Modulation der Expression von Genen, welche u. a. Regulatoren dieser Transportproteine sind. Somit greift die Erfindung in einer grundlegenderen Ebene ein, was den Vorteil besitzt, dass diese weniger durch Rückkoppelungsmechanismen und andere regulatorische Prozesse beeinflusst wird, welche in die Zinkverarbeitung involviert sind.
Obwohl im experimentellen Teil gezeigt wird, dass bZIP19 und bZIP23 bei der Kontrolle der Anpassung an Veränderungen des Zinkgehalts im Boden eine Hauptrolle spielen, und obwohl eine Transformation von Pflanzen mit einem oder beiden dieser Proteine bewirkt, dass die Pflanzen sich an einen Zinkmangel anpassen können oder als (übermäßige) Zn-Akkumulatoren agieren können, können diese Eigenschaften durch Überexpression zusätzlicher Proteine verstärkt werden, welche bekanntermaßen an der Zn-Homöostase beteiligt sind. Diese Proteine werden bevorzugt ausgewählt aus Schwermetalltransportern, bevorzugt HMA2, HMA3 oder HMA4, YSL-Proteinen, bevorzugt YSL, bevorzugt YSL1 oder YSL3, ZIP- oder IRT-Proteinen, ZIF-Proteinen, NAS-Proteinen, MRP-Proteinen, FRD3 und MTPs (Metalltransportproteine).
Wie in dieser Tabelle zu sehen ist, sind für diese Proteine codierende Gene für einen Fachmann verfügbar und die Transformation der Sequenzen, welche für diese Gene codieren, kann durch die hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Tabelle A. Proteine, die an der Zn-Aufnahme, dem Zn-Transport und der Zn-Lagerung beteiligt sind
Die (Über)expression von bZIP19 und/oder bZIP23 in Pflanzen zusammen mit einem oder mehreren der oben genannten Proteine ergibt Pflanzen, welche mehr Zink als normale Wildtyp-Pflanzen aufnehmen können oder schneller auf einen lokalen Mangel bei der Zinkversorgung reagieren können. Durch diese Eigenschaften sind solche Pflanze besonders geeignet, um auf Böden mit viel Zink zu wachsen und können somit als Phytoremediatoren agieren, welche den Boden von dem toxischen Metall reinigen, oder sie können auf Böden mit normalen Mengen oder wenig Zink wachsen, und trotzdem diätetisch ausreichende Mengen an Zink in ihren essbaren Teilen aufweisen, oder gegenüber Zinkmangel weniger sensitiv sein.
Vektoren zur Verwendung beim gewebespezifischen Einbringen von Genen in transgene Pflanzen umfassen normalerweise gewebespezifische Promotoren und können auch andere gewebespezifische Kontrollelemente wie etwa Enhancersequenzen umfassen.
Außerdem können zum intrazellulären Einbringen eines spezifischen Genprodukts in die Zellen einer transgenen Pflanze Vektoren konstruiert und verwendet werden. Dies wird im Allgemeinen erreicht durch Verbinden einer DNA-Sequenz, welche für eine Transit- oder Signalpeptidsequenz codiert, mit der codierenden Sequenz eines bestimmten Gens. Das resultierende Transit- oder Signalpeptid transportiert das Protein zu einem bestimmten intrazellulären bzw. extrazellullären Bestimmungsort, und wird dann nach der Translation entfernt. Transit- oder Signalpeptide wirken durch Erleichterung des Transports von Proteinen durch intrazelluläre Membranen, z. B. Vakuolen-, Vesikel-, Plastid- und Mitochondrien-Membranen, wogegen Signalpeptide Proteine durch die extrazellulläre Membran führen.
Ein besonderes Beispiel für eine solche Verwendung betrifft die Führung eines Proteins (Enzyms) zu einer bestimmten Organelle wie etwa der Vakuole anstatt zum Zytoplasma. Signalpeptide von Vakuolenproteinen wie etwa das N-terminale Propeptid (NTPP) des Süßkartoffelsporamins und das C-terminale Propeptid (CTPP) der Tabakchitinase können verwendet werden, um die Expression eines Proteins zur Vakuole zu richten.
Durch Erleichterung des Transports des Proteins in Kompartimente im Innern der Zelle können diese Transitpeptide die Akkumulation des Genprodukts erhöhen durch Schutz vor einer proteolytischen Degradation.
Herstellung und Charakterisierung von stabil transformierten Pflanzen
Pflanzenspezies können beispielsweise durch die DNA-vermittelte Transformation von Pflanzenzellprotoplasten und nachfolgende Regeneration der Pflanze aus den transformierten Protoplasten transformiert werden, mittels Verfahren, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind.
Ein beliebiges Pflanzengewebe, welches sich nachfolgend klonal vermehren kann, entweder durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert werden. Der Begriff „Organogenese” wie hierin verwendet, bedeutet einen Prozess, worin Sprosse und Wurzeln sich sequenziell aus meristematischen Zentren entwickeln; der Begriff „Embryogenese” wie hierin verwendet, bedeutet ein Verfahren, in welchem sich Sprosse und Wurzeln zusammen in einer abgestimmten Art und Weise entwickeln (nicht sequenziell), entweder aus somatischen Zellen oder aus Gameten. Das bestimmte ausgewählte Gewebe variiert in Abhängigkeit von den klonalen Vermehrungssystemen, die für die bestimmte zu transformierende Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele umfassen Blattstücke, Pollen, Embryonen, Keimblätter, Hypokotylen, Megagametophyten, Kallusgewebe, bestehendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristeme, Achselknospen und Wurzelmeristeme), und induziertes Meristemgewebe (z. B. Keimblattmeristem und Ultilan-Meristem).
Die erfindungsgemäßen Pflanzen können viele Formen aufweisen. Die Pflanzen können Chimären aus transformierten Zellen und nicht transformierten Zellen sein, die Pflanzen können klonale Transformanten sein (z. B. das alle Zellen transformiert sind und die Expressionskassette enthalten), die Pflanzen können Propfungen enthalten von transformierten und untransformierten Geweben (z. B. ein transformierter Wurzelstock gepfropft an einen nicht transformierten Steckling einer Zitrusspezies). Die transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie etwa durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungsverfahren. Beispielsweise können transformierte Pflanzen der ersten Generation (oder T1) mit sich selbst vermehrt werden und ergeben eine homozygote zweite Generation (oder T2) der transformierten Pflanzen, und die T2-Pflanzen können weiter durch klassische Züchtungsverfahren vermehrt werden. Ein dominanter selektierbarer Marker (wie etwa nptII) kann mit der Expressionskassette verbunden sein, um die Züchtung zu unterstützen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung eine transformierte (transgene) Pflanzenzelle in der Pflanze oder außerhalb der Pflanze bereit, einschließlich ein transformiertes Plastid oder eine andere Organelle, z. B. ein Nukleus, Mitochondrien oder einen Chloroplasten.
Die Transformation von Pflanzen kann mit einem einzelnen DNA-Molekül oder mehreren DNA-Molekülen durchgeführt werden (d. h. Co-Transformation), und beide dieser Verfahren sind geeignet für eine Verwendung mit den erfindungsgemäßen Expressionskassetten. Zahlreiche Transformationsvektoren sind für die Pflanzentransformation verfügbar, und die erfindungsgemäßer Expressionskassetten können in Verbindung mit einem beliebigen solchen Vektor verwendet werden. Die Auswahl des Vektors hängt von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielspezies für die Transformation ab.
Geeignete Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mikroinjektion (Crossway et al., 1986), Elektroporation (Riggs et al., 1986), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., 1988), den direkten Gentransfer (Paszkowski et al., 1984) und die ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen, die von Agracetus, Inc., Madison, Wis. And BioRad, Hercules, Calif. erhältlich sind (siehe z. B. Sanford et al., US-Patent Nr. 4,945,050 ; und McCabe et al., 1988). Siehe auch Weissinger et al., 1988; Sanford et al., 1987 (Zwiebel); Christau et al., 1988 (Soja); McCabe et al., 1988 (Soja); Datta et al., 1990 (Reis); Klein et al., 1988 (Mais); Klein et al., 1988 (Mais); Klein et al., 1988 (Mais); Fromm et al., 1990 (Mais); und Gordon-Kamm et al., 1990 (Mais); Svab et al., 1990 (Tabakchloroplasten); Koziel et al., 1993 (Mais); Shimamoto et al., 1989 (Reis); Christou et al., 1991 (Reis); EP-Patentanmeldung EP 0 332 581 (Knaulgrass und andere Pooideae); Vasil et al., 1993 (Weizen); Weeks et al., 1983 (Weizen). In einer Ausführungsform wird das Protoplastentransformationsverfahren für Mais angewendet (europäische Patentanmeldung EP 0 292 435 , US-Patent Nr. 5,350,689 ).
Es ist besonders bevorzugt, die binären Vektoren der Ti- und Ri-Plasmide von Agrobacterium spp. zu verwenden. Ti-Vektoren transformieren eine große Zahl an höheren Pflanzen, einschließlich monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, wie etwa Soja, Baumwolle, Raps, Tabak und Reis (Pacciotti et al., 1985; Byrne et al., 1987; Sukhapinda et al., 1987; Park et al., 1985; Hiei et al., 1984). Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv untersucht und ist ausführlich beschrieben ( EP 120516 , Hoekema, 1985; Knauf et al., 1983; und An et al., 1985). Für das Einbringen in Pflanzen können die erfindungsgemäßen chimären Gene in binäre Vektoren eingebracht werden, wie in den Beispielen beschrieben wird.
Es sind andere Transformationsverfahren für Fachleute verfügbar, wie etwa die direkte Aufnahme von fremden DNA-Konstrukten (siehe EP 0295959 ), Verfahren der Elektroporation (Fromm et al., 1986) oder Hochgeschwindigkeitspartikelbeschuss mit Metallpartikeln, die mit den Nukleinsäurekonstrukten beschichtet sind (Klein et al., 1987 und US-Patent Nr. 4,945,050 ). Wenn sie einmal transformiert sind, können die Zellen von Fachleuten regeneriert werden. Von besonderer Bedeutung sind die Verfahren zur Transformation von Fremdgenen in kommerziell bedeutsame Anbaupflanzen, wie etwa Raps (De Block et al., 1989), Sonnenblumen (Everett et al., 1987), Soja (McCabe et al., 1988; Hinchee et al., 1988; Chee et al., 1989; Christou et al., 1989; EP 301749 ), Reis (Hiei et al., 1994) und Getreide (Gordon Kamm et al., 1990; Fromm et al., 1990).
Fachleute verstehen, dass die Auswahl des Verfahrens von der Art der Pflanze abhängen kann, d. h. monokotyl oder dikotyl.
Agrobacterium tumefaciens-Zellen mit einem Vektor mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, worin der Vektor ein Ti-Plasmid umfasst, sind für die Verfahren zur Herstellung von transformierten Pflanzen nützlich. Pflanzenzellen werden wie oben beschrieben mit einem Agrobacterium tumefaciens infiziert, um eine transformierte Pflanzenzelle zu erzeugen, und dann wird eine Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle regeneriert. Es sind zahlreiche Vektorsysteme von Agrobacterium bekannt, welche bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Diese tragen normalerweise mindestens eine T-DNA-Randsequenz und umfassen Vektoren wie etwa pBINI9 (Bevan, 1984).
Verfahren unter Verwendung entweder einer Form des direkten Gentransfers oder des Agrobacterium-vermittelten Gentransfers werden normalerweise, aber nicht notwendigerweise mit einem selektierbaren Marker durchgeführt, welcher eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum (z. B. Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder einem Herbizid (z. B. Phosphinotricin) verleihen kann. Die Auswahl des selektierbaren Markers für die Pflanzentransformation ist jedoch nicht kritisch für die Erfindung.
Es werden allgemeine Verfahren zum Kultivieren von Pflanzengeweben bereitgestellt, beispielsweise durch Maki et al. (1993) und durch Phillips et al. (1988).
Nach der Transformation werden die transgenen Pflanzenzellen in einem geeigneten selektiven Medium für die Auswahl von transgenen Zellen platziert, welche dann zu Kallas auswachsen. Aus dem Kallus wachsen Sprosse und aus den Sprossen werden Pflänzchen gebildet durch Aufzucht in Bewurzelungsmedium. Der jeweilige verwendete Marker ermöglicht die Selektion von transformierten Zellen im Gegensatz zu Zellen ohne die eingebrachte DNA.
Um die Gegenwart der Transgene in transgenen Zellen und Pflanzen zu bestätigen, kann eine Vielzahl von Assays durchgeführt werden. Solche Assays umfassen beispielsweise „molekularbiologische” Assays, welche Fachleuten allgemein bekannt sind, wie etwa Southern Blotting und Northern Blotting, in-situ-Hybridisierung und Nukleinsäure-basierte Amplifizierungsverfahren wie etwa PCR oder RT-PCR; „biochemische” Assays, wie etwa den Nachweis des Vorliegens eines Proteinprodukts, z. B. durch immunologische Mittel (ELISAs und Western Blots) oder durch die enzymatische Funktion.
Die Erfindung stellt weiter eine transgene Pflanze bereit, transformiert mit einer Nukleotidsequenz, welche für ein bZIP19- oder ein bZIP23-Protein oder für beide codiert. Außerdem kann die Pflanze transgen sein bezüglich eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schwermetalltransportern, bevorzugt HMA2, HMA3 oder HMA4, YSL-Proteinen, bevorzugt YSL, bevorzugt YSL1 oder YSL3, ZIP- oder IRT-Proteinen, ZIF-Proteinen, NAS-Proteinen, MRP-Proteinen, FRD3 und MTPs.
Wie in den Beispielen gezeigt wird, sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen tolerant gegenüber Zn-Mangel, d. h. sie können sich an Umweltbedingungen anpassen, worin kein oder fast kein Zink im Substrat vorliegt, auf welchem die Pflanze wächst. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen ist der, dass sie Zn akkumulieren können. Das ist nicht nur ein Vorteil für eine Bioremediation, sondern in Fällen von Pflanzen, worin Zn in essbaren Teilen gelagert wird (wie etwa Blättern, Wurzeln, Rüben, Beeren oder Knollen), sind die Pflanzen geeignet für die Ernährung in Gegenden, in denen die Zn-Konzentration in der Nahrung für eine normale Ernährung nicht ausreichend ist. Diese Verwendung ist auch unter dem Namen „Biofortifikation” bekannt. Normalerweise ist das Zn in der Pflanze wenig bioverfügbar, da Teile davon mit Phytat oder Polyphenolen komplexiert sind. Somit sind in diesem Aspekt Pflanzen bevorzugt, welche geringe Mengen an Phytat und/oder Polyphenolen aufweisen.
Andererseits sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sehr nützlich unter Umständen, worin ein Überschuss an Zink im Substrat vorliegt. Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen können das Metall aufnehmen und in ihren Geweben und/oder ihrer Vakuole lagern. Auf diese Art können Pflanzen als Reinigungspflanzen verwendet werden, um Zink aus dem Boden zu extrahieren. Das Metall wird dann in der Pflanzenbiomasse konzentriert, welche geerntet und auf geeignete Art und Weise entsorgt werden kann. Dieses Verfahren, welches als Phytoremediation bekannt ist, ist besonders nützlich, wenn große Bodenflächen mit Zink kontaminiert sind (wie etwa im Fall der Nachbarschaft von Zinkminen). In einem solchen Fall ist die Phytoremediation ein kommerziell sehr attraktiver Weg zur Reinigung der Umgebung von dem überschüssigen Metall.
Ein weiterer Teil der Erfindung ist die Verwendung eines bZIP19- und/oder eines bZIP23-Proteins oder eines Orthologs davon, oder einer Nukleotidsequenz, codierend für solch ein Protein oder Ortholog, in den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren, und/oder zur Herstellung einer Pflanze wie oben beschrieben und deren Nachkommen.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, sollen aber keine Einschränkungen definieren oder den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken.
Beispiele
Beispiel 1 – Material und Methoden
Pflanzenwachstum
Der Arabidopsis-Okotyp Columbia (Col-0) wurde in allen Experimenten verwendet. Die Pflanzen wurden in Klimakammern angezogen mit 16 h Licht bei 22°C, 8 h bei 20°C, 120 μM Photonen m^–2s^–1 und 50% relativer Feuchtigkeit. Vor der Keimung hatten die Samen eine dreitägige Lagerungsbehandlung in einem kalten Raum bei 4°C im Dunkeln, um eine einheitliche Keimung zu fördern. Für die genetische Analyse und Transformation wurden Pflanzen in Töpfen mit Torf angezogen. Für die Platten-Assays wurden die Samen oberflächensterilisiert unter Verwendung einer Dampfphasen-Samensterilisation und auf Platten mit MS-Medium (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande), ergänzt mit 1% Saccharose und eingestellt auf pH 5,8 ausgesät. Das MS-Medium wurde entweder ohne Zink (Zn–), mit 30 μM ZnSO₄ (Zn+) oder mit 300 μM ZnSO₄ (Zn++) hergestellt. Für die in Hydrokulturen angezogenen Pflanzen wurden die Samen auf mit 0,55% Agar gefüllten Röhrchen ausgesät und auf einer modifizierten, halbstarken Hoagland-Nährlösung angezogen, hergestellt entweder mit 0,05 μM (Zn–), 2 μM ZnSO₄ (Zn+) oder 25 μM ZnSO₄ (Zn++). Das Hydrokultursystem bestand aus Behältern (46 × 31 × 8 cm) mit einer Kapazität von 8 l, mit einem nicht durchsichtigen 2 mm dicken Plastikdeckel mit Löchern für 9 × 5 mit Agar gefüllte Röhrchen. Die Nährlösung wurde einmal in der ersten Woche und zweimal in den darauffolgenden Wochen ausgetauscht.
Hefe-Komplementationsexperiment
Ein Volllängen-cDNA-Klon mit 1,3 kb entsprechend AtZIP4 (APD09D10R, Genbank-Zugangsnummer AV524735) wurde freundlicherweise durch das Kazuza DNA Research Institute (Kisarazu, Chiba, Japan) bereitgestellt. Der offene Leserahmen von ZIP4 wurde amplifiziert mit einer Proofreading-DNA-Polymerase (Pfu native; Stratagene, La Jolla, CA, USA) mit PCR-Bedingungen wie durch den Hersteller empfohlen und unter Verwendung der Primer 5'-GGGGACPAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAACTCTTGTTCCCATGATC-3' und
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATATTATTTGATTCTACAG-3', mit Gateway-Rekombinationstellen (unterstrichen). Das Fragment wurde durch in vitro-ortsgerichtete Rekombination in den Eintragsvektor pDONR207 (Invitrogen) kloniert für eine weitere Rekombination in den Hefeexpressionsvektor pFL613 (20). Das ATG-Startcodon der klonierten ZIP4-cDNA war im Leserahmen mit dem pFL613 ATG-Startcodon und ohne stromaufwärts liegende Stoppcodons. Das Konstrukt wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Es wurde eine Saccharomyces cerevisiae zrt1zrt2-Mutante, ZHY3, und deren parentaler Wildtyp-Stamm DY1457 verwendet (6). Die Hefezellen wurden auf einem synthetischen definierten flüssigen Medium (SD) angezogen, ergänzt mit auxotrophen Erfordernissen und 2% (w/v) Glucose. Beide Hefestämme wurden mit dem leeren pFL613-Vektor transformiert, und zrt1zrt2 wurde mit pFL613 mit AtZIP4 transformiert unter Verwendung eines Standard-Hefetransformationsverfahrens (21). Die zrt1zrt2-Komplementation wurde untersucht durch einen Tropfentest, durch Auftropfen von verdünnten Kulturen von einer einzelnen Kolonie jedes Transformanten auf selektive SD-URA-Agarplatten. Das Medium wurde Zink-begrenzt durch Zugabe von EDTA (1 mM) und Citrat (pH 4,2) (22) und ergänzt mit 0,4 (Zink-begrenztes Medium) oder 0,8 mM ZnCl₂. Fünf Kolonien jedes Transformanten wurden untersucht. Die zrt1zrt2-Komplementation wurde auch untersucht durch Messung der OD₆₀₀ in 5 ml-Kulturen des beschriebenen SD-URA-Mediums mit 0,4 mM ZnCl₂ beimpft mit 60 μl (0,8 mM ZnCl₂) Einzelkolonie-Über-Nacht-Vorkultur bei OD₆₀₀ = 1. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.
Konstruktion von Reportervektoren für Hefe-One-Hybrid
Die Köder-Sequenz („bait sequence”) in sechs Reportervektoren (A bis F) stellten durch PCR-amplifizierte Fragmente des ZIP4-Promotors dar. Diese Fragmente deckten den kompletten Promotor ab, beginnend bei –1049 bp stromaufwärts des Startcodons und hatten eine Überlappung zwischen den Fragmenten von 60 bis 80 bp. Die Fragmente wurden aus genomischer Arabidopsis-DNA unter Verwendung einer Proofreading-Polymerase (Pfu native; Stratagene, La Jolla, CA, USA) amplifiziert, mit PCR-Bedingungen wie vom Hersteller empfohlen und unter Verwendung von Primern mit 5'-Überhängen, die kompatibel mit EcoRI/SacI sind (Tabelle 1). Die Fragmente wurden in den pCR-Blunt-II-TOPO-Vektor (Invitrogen) zwischenkloniert nach den Empfehlungen des Herstellers. Der TOPO-Vektor mit jedem der Köder wurde mit EcoRI/SacI verdaut und das Köder-Fragment wurde aus dem Agarosegel extrahiert (Qiagen Gelextraktionskit). Der Köder des Reportervektors G bestand aus einem Trimer des folgenden Motivs: ATGTCGACAT/C. Es wurden zwei antiparallele Oligonukleotide synthetisiert, mit 5'-Überhängen, kompatibel mit EcoRI/SacI, wobei eines den Sense-Strang darstellt und das andere den kamplementären Antisense-Strang darstellt (Tabelle 1). Tabelle 1. Vorwärts- und Rückwärtsprimer, verwendet zur Amplifikation der Köder-Fragmente A–F des ZIP4-Promotors, und Sense- und Antisense-Komplementstränge, verwendet zur Synthese des Drei-Tandem-Repeats des Motivs ATGTCGACAT/C (G), welches als Köder-Fragment G verwendet wird.
0,1 μg jedes Oligonukleotidstrangs wurden in 10 μl 50 mM NaCl gemischt, durch Erhitzen bei 70°C für 5 min annealed, und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die verdauten, von der PCT stammenden Köder (A–F) und das annealte Oligonukleotid (G) wurden in pHISi kloniert, welcher zuvor mit EcoRI/SacI nach den Empfehlungen des Herstellers vedaut wurde. Jeder Reportervektor wurde durch Verdauungsanalyse und Sequenzierung bestätigt.
Hefe-Ein-Hybrid-Screening
Die cDNA-Expressionsbibiliothek wurde erzeugt mit mRNA aus Arabidopsis-Blütenständen, erhalten unter Verwendung eines mRNA-Reinigungskits (Amersham Bioscience). Nachfolgend wurde eine mit Gateway kompatible cDNA-Eingangsbibliothek konstruiert unter Verwendung des CloneMiner cDNA-Bibliothek-Konstruktionskits (Invitrogen, Carlsbad), Diese cDNA-Eingangsbibliothek besaß einen Titer von 5 × 10⁷ cfu ml^–1 und sie wurde in den pDEST22-Vektor (Invitrogen) transferiert durch eine LR-Rekombinationsreaktion nach dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll, was eine Expressionsbibiliothek mit einem Titer von 2 × 10⁶ cfu ml^–1 ergab. Die Reportervektoren wurden in den Hefestamm PJ69-4A eingebracht (James, P. et al., 1996, Genetics 144: 1425–1436). Für diesen Zweck wurden Hefezellen mit verdautem (XhoI) linearisierten pHISi-Reportervektor transformiert unter Verwendung eines Standard-Hefetransformationsverfahrens (Gietz, R. D. et al., 2002, Meth. Enzymol. 350: 87–96). Der leere pHISi-Vektor, verdaut und nicht verdaut, und ein nicht integrativer Reportervektor wurden als Kontrollen verwendet. Das Screening der cDNA-Expressionsbibliothek wurde durchgeführt nach dem „Large-Scale” Hefetransformationsprotokoll (PT3024-1; Clontech), was eine Transformationseffizienz von 5 bis 9 × 10⁵ cfu μg^–1 DNA ergab. Das Screening mit allen Reporterstämmen wurde durchgeführt auf Medium ohne His und in Gegenwart von 20 bis 40 mM 3-Aminotriazol (3AT, optimale Konzentration wurde für jeden Reporterstamm optimiert). Es gab insgesamt 18 positive Interaktionen (7 mit bZIP19 und 11 mit bZIP23) bei Verwendung der Reportervektoren E, F und G (2A). Positive Kolonien wurden ausgewählt und der cDNA-Klon des GAL4-AD-Bibliotheksvektors wurde isoliert und sequenziert.
Identifizierung von T-DNA-Insertionsmutanten
T-DNA-SALK-Linien wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC) erhalten. Die T-DNA wurde 18 bp stromaufwärts des bZIP19(At4g35040)-Startcodons in m19 (salk_144252) und 91 bp stromaufwärts des bZIP23(At2g16770)-Startcodons in m23 (salk_045200) insertiert. Die T-DNA-Insertionsereignisse wurden durch PCR-Analyse mit genspezifischen Primern von LP und RP bestätigt, wie beschrieben vom Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, und einem T-DNA-Randprimer LBa1. Homozygote Pflanzen jeder T-DNA-Insertion wurden ausgewählt. Um eine Doppel-T-DNA-Insertionsmutante, m19m23, zu erhalten, wurden die Nachkommen einer Kreuzung zwischen m19- und m23-Pflanzen durch PCR-Analyse ausgewählt im Hinblick auf Homozygotie für jedes T-DNA-Insert.
Quantitative RT-PCR-Analyse
Setzlinge des Arabidopsis-Wildtyps (wt) und T-DNA-Insertionsmutanten m19, m23 und m19m23, angezogen für 3 Wochen in MS-Medium entweder bei Zn–, Zn+ oder Zn++-Bedingungen, wurden geerntet. Setzlinge einer einzelnen Platte, pro Genotyp und pro Behandlung wurden vereinigt (6 bis 8 Setzlinge) und in flüssigem Stickstoff homogenisiert. Für jeden Genotyp und jede Behandlung wurden Setzlinge von 3 bis 4 unterschiedlichen Platten geerntet, welche unabhängige Experimente darstellen. Die Gesamt-RNA der Setzlinge wurde mit einem RNAeasy Pflanzen-RNA-Kit (Qiagen) extrahiert und mit DNAse behandelt, um alle genomische DNA zu eliminieren (Fermentas). Die Kits wurden nach den Instruktionen der Hersteller verwendet. Der erste Strang cDNA wurde aus 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung des iScript^TM cDNA-Synthese-Kits (Bio-Rad) synthetisiert. Genspezifische Primer für die quantitative RT-PCR wurden in Übereinstimmung mit der Datenbank-Genomsequenzinformation für Arabidopsis und unter Verwendung der Vektor-NTI-Software (Invitrogen) erstellt (Tabelle 2). Tabelle 2. Vorwärts- und Rückwärtsprimer, verwendet in der quantitativen RT-PCR zur Bestimmung der Transkriptexpression der ZIP4-, ZIP1-, ZIP3-, ZIP5-, ZIP9-, ZIP12-, IRT3-, ZIP2-, bZIP19-, bZIP23- und bZIP24-Gene.
Die Längen der Amplikons betrugen zwischen 150 und 240 bp und alle Primerkombinationen besaßen mindestens 85% Effizienz. Das Fehlen genomischer DNA wurde bestätigt mittels Durchführung einer Nicht-Amplifikationskontrolle (ohne reverse Transkriptasereaktion) für jede Probe. Für die PCR-Reaktion wurden 5 μl einer 100x-Verdünnung der cDNAs, entsprechend ungefähr 2,5 ng RNA, als Templat verwendet. Außerdem enthielt die Reaktion 12,5 μl iQ^TM SYBR^® Green Supermix (Bio-Rad) und 5 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Invitrogen) in einem Gesamtvolumen von 25 μl. Die PCR-Reaktionen wurden in einer 96-Well-Platte durchgeführt mit einem iCycler Thermocycler und einem iCycler iQ Real Time PCR System (Bio-Rad). Es wurde das folgende Standardwarrneprofil verwendet: 3 min bei 95,0°C, gefolgt von 40 Zyklen von 15 sek bei 95,0°C und 1 min bei 60,0°C. 18S-rRNA wurde als interne Kontrolle verwendet, um die Menge an Templat-cDNA zu normalisieren. Die Reaktionen wurden in 3 bis 4 biologischen Kopien und 2 bis 6 technischen Kopien pro biologischer Kopie für jede Genotyp × Behandlung durchgeführt. Die relativen Transkriptmengen (RTL) wurden mit dem 2^ΔΔCT-Verfahren berechnet (24).
Bestimmung der Zinkkonzentration
Wurzeln und Sprosse von 4 Wochen alten, in Hydrokultur gezogenem Arabidopsis-Wildtyp (wt), T-DNA-Insertionsmutanten m19, m23 und m19m23 wurden geerntet, bestehend aus 3 Pflanzen pro Genotyp × drei Behandlungen (Zn–, Zn+, Zn++) × zwei unabhängige Experimenten. Die Wurzelsysteme wurden mit eiskaltem 5 mM PbNO₃ für 30 min desorbiert. Wurzeln und Sprosse wurden im Hinblick auf die Zinkkonzentration untersucht unter Verwendung der Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie (Perkin Elmer 1100B).
Herstellung von Konstrukten
Zur Herstellung von Überexpressionskonstrukten für die Transformation der Arabidopsis Doppel-T-DNA-Insertionsmutante (m19m23) wurden Volllängen-cDNAs von AtbZIP19 und AtbZIP23 (Klone GSLTSIL54ZH09 bzw. GSLTFB35ZE06) vom CNRGV (Centre National de Ressources Génomiques Végétales, France) im pCMV SPORT6-Klonierungsvektor mit Gateway-Rekombinationsstellen erhalten. Die cDNAs wurden mittels in vitro ortsgerichteter Rekombination in den Eingangsvektor pDONR207 (Invitrogen), für die weitere Rekombination in den Überexpressionsvektor pGD625 (De Folter, S. et al., 2005, Plant Cell 17: 1424–1433) kloniert. Die Konstrukte pCaMV35S::bZIP19 (OX19) und pCaMV35S::bZIP23 (OX23) wurden durch Verdauungsanalyse und Sequenzierung bestätigt und durch Elektroporation in den Agrobacterium tumefeciens Stamm AGL0 transformiert. Anschließend wurden m19m23 und Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen durch Eintauchen der Blüten transformiert (Clough, S. J. et al., 1998, Plant J. 16: 735–743). Unabhängig transformierte Linien wurden ausewählt im Hinblick auf einen einzelnen Insertionslokus durch Antibiotikaresistenz und einem Trennungsverhältnis der T2-Setzlinge von 3:1. Die Überexpression von bZIP19 oder bZIP23 wurde RT-PCR bestätigt. Fünf bzw. drei unabhängige Linien von m19m23-OX19 und m19m23-OX23 wurden mit 10 Setzlingen pro Linie analysiert, in MS-Medium entweder bei Zn– oder Zn+-Bedingungen angezogen, in zwei Wiederholungsplatten pro Linie. Als Kontrolle wurden Arabidopsis-Wildtyp und m19m23 Planzen verwendet.
Microarray-Analyse
Arabidopsis-Wildtyp (wt) und T-DNA-Insertionsdoppelmutanten m19m23-Pflanzen wurden in Hydrokulturmedium wie oben beschrieben angezogen. Sie wurden für 3 Wochen mit normaler Zinkversorgung (Zn+, 2 μM ZnSO₄) und 1 Woche mit niedriger Zinkversorgung (Zn–, 0,05 μM ZnSO₄) oder normaler Zinkversorgung (Zn+) angezogen. Die Wurzeln von vier Pflanzen pro Genotyp und pro Behandlung (Zn–/Zn+) wurden in zwei biologischen Wiederholungsexperimenten vereinigt, und die RNA wurde mit dem RNAeasy Pflanzen-RNA-Kit (Qiagen) extrahiert. Die Transkriptome wurden analysiert unter Verwendung von 1 μg Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial. Die Ziele wurden vorbereitet mit dem one-cycle-cDNA-Synthesekit, gefolgt von einer Biotinmarkierung mit dem IVT-Markierungskit (GeneChip One-cycle target labelling and control reagents, Affymetrix, High Wycombe, UK), und mit dem ATH1-Genchip für 16 h wie vom Hersteller empfohlen hybridisiert (Handbuch Geneexpressionsanalyse, Affymetrix). Die Rohdatenordner wurden bearbeitet und die Quantile im Bioconductor/R (27) normalisiert. Die differenzielle Expression jedes Gens wurde untersucht durch Anwendung eines regularisierten t-Tests Empirical Bayes (Smyth, G. K., 2004, Stat. Appl. Genet. Mol. Biol., 3, Iss. 1, Article 3)). Die p-Werte wurden unter Verwendung des Ansatzes von Benjamini und Hochberg (1995, J. Royal Stat., Soc. B 57: 289–300) korrigiert bezüglich Mehrfachtestung, was eine Kontrolle der False Discovery Rate (FDR) darstellt.
Statistik
Die Datenanalyse und Statistik wurde durchgeführt unter Verwendung von Microsoft Excel und SPSS 15.0 für Windows. Die statistische Analyse der Zinkkonzentration und Trockengewichtsdaten von Arabidopsis und den Mutantenlinien wurde mittels einer einfachen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem anschließenden Tukey-Test.
Ergebnisse
In Arabidopsis sind mehrere Mitglieder der ZIP-Familie der Metalltransporter hauptsächlich an der zellulären Aufnahme beteiligt, werden transkriptionell als Reaktion auf Zinkmangelbedingungen induziert und es wird angenommen, dass sie den Hauptweg von Zink in die Pflanze darstellen. Insbesondere das ZIP4-Gen wird in Wurzeln nach Zinkmangel stark induziert (3A). Wir verwendeten es, um den erhöhten Zinkbedarf der Saccharomyces cerevisiae zrz1zrt2-Mutante zu komplementieren, welche defekt war bezüglich der hoch- und niedrigaffinen Zinkaufnahme (Zhao, H. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2454–2458), und zeigten, dass es in der Tat für einen Zinktransporter codiert (4, B und C). Wir klonierten den Promotor des ZIP4-Gens stromaufwärts des GUS-Reportergens und exprimierten dieses Konstrukt in Arabidopsis. Eine GUS-Expression war nur zu sehen, wenn Pflanzen auf einem Zinkmangelmedium angezogen wurden, analog zur endogenen ZIP4-Genexpression (Daten nicht gezeigt). Um die Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, welche die ZIP4-Expression steuern, verwendeten wir sechs überlappende ZIP4-Promotorfragmente als Köder in einem Hefe-Ein-Hybrid-Assay. Wir verwendeten auch drei Tandem-Repeats eines palindromen Motivs mit 10 bp, welches in zwei Kopien nahe zu dem vorhergesagten ZIP4-Transkriptionsstart vorhanden war, als zusätzlichen Köder (2A, Fragmente A bis G). Es wurden mehrere Klone mit 2 cDNAs identifiziert, jedoch nur dann wenn mit Ködern gescreent wurde, welche zwei oder drei Kopien des 10 bp-Palindroms enthielten (2A, Fragmente E, F und G). Diese cDNAs entsprachen bZIP19 (At4g35040, NM_119670.4) und bZIP23 (At2g16770, NM_119670.4), zwei Genen der Basisregion/Leucin-Zippermotiv(bZIP)-Familie der Transkriptionsfaktoren. Arabidopsis enthält 75 Mitglieder der bZIP-Familie (Jakoby, M. et al., 2002, Trends Plant Sci. 7: 106–111).
Um die Beteiligung dieser drei bZIP-Gene bei der Kontrolle der Anpassung von Pflanzen an eine geringe Zinkversorgung zu untersuchen, analysierten wir die Transkriptmengen durch quantitative RT-PCR (qPCR) bei 3 Wochen alten Wildtyp-Setzlingen, angezogen auf Agarplatten mit drei unterschiedlichen Zinkkonzentrationen. Die Expression der bZIP19- und bZIP23-Gene verringerte sich um etwa die Hälfte bei einer erhöhten Zinkversorgung, wobei bZIP19 etwas stärker exprimiert wurde als bZIP23 (2B). bZIP24 zeigte geringere Transkriptmengen als die anderen zwei, und die Expression war nicht offensichtlich beeinflusst durch den Zinkstatus des Mediums, deshalb schlussfolgerten wir, dass bZIP19 und bZIP23 an der Reaktion auf Zinkmangel bei Pflanzen beteiligt sind.
Um ihre Mutantenphänotypen zu bestimmen, gewannen wir homozygote T-DNA-Insertionslinien für die bZIP19- und bZIP23-Gene (entsprechend als m19 und m23 bezeichnet), welche kein Volllängen-bZIP19- oder bZIP23-Transkript aufwiesen (5, A und B). Wir kreuzten beide Einzelmutantenlinien, um eine Doppelmutantenlinie zu erzeugen (m19m23). Wildtyp-Pflanzen und Einzel- oder Doppelmutanten, welche auf Boden angezogen wurden, zeigten keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede (Daten nicht gezeigt), jedoch, wenn sie auf Zinkmangel-Agarmedium (Zn–) angezogen wurden, war nur die Doppelmutantenlinie hypersensitiv gegenüber Zinkmangel (4A). 3 Wochen alte Setzlinge zeigten ein sehr schwaches Wachstum und eine starke Chlorose. Um die in vitro-Effekte während der Gewebekultur auszuschließen, zogen wir Pflanzen für einen längeren Zeitraum auf Hydrokulturmedium, wo sie sich normal entwickeln konnten. 4 Wochen alte Doppelmutantenpflanzen, angezogen mit einer geringen Zinkversorgung (Zn–), zeigten eine starke Wachstumsreduktion im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, wie durch einen Vergleich des Trockengewichts bestimmt wurde (4, B und C). Diese Pflanzen wiesen auch eine verringerte Zinkaufnahme auf, mit nur 58% und 73% der entsprechenden Spross- und Wurzel-Zinkkonzentration von Wildtyp-Pflanzen (4C). Bei einer niedrigen Zinkversorgung der Hydrokultur zeigte auch die m19-Einzelmutante ein verringertes Wachstum und eine verringerte Zinkaufnahme im Vergleich zum Wildtyp (4B). Bei Anzucht in Medium mit ausreichend Zink (Zn+) oder überschüssigem Zink (Zn++) sahen wir keine Unterschiede zwischen den Mutanten und dem Wildtyp (4, A und B), weder hinsichtlich des Zinkgehalts noch des Trockengewichts (6, 7). Um zu belegen, dass Mutationen von bZIP19 und bZIP23 in der Tat den Phänotyp der m19m23-Doppelmutante verursachen, exprimierten wir entweder die bZIP19- oder die bZIP23-cDNA jeweils unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors in der Doppelmutante. Dies komplementierte vollständig den bezüglich Zinkmangel hypersensitiven Phänotyp (8A).
Diese Befunde zeigen, dass bZIP19 und bZIP23 für essenzielle Transkriptionsfaktoren codieren, welche die Reaktion auf Zinkmangel bei Pflanzen steuern. Diese Gene agieren redundant, wobei bZIP19 nur teilweise redundant ist. bZIP-Transkriptionsfaktoren wirken im Allgemeinen als Dimere. Ihre Redundanz deutet darauf hin, dass bZIP19 und bZIP23 als Homo(di)mere wirken, in Übereinstimmung mit früheren Prognosen (Deppmann, C. D. et al., 2006, Mol. Biol. Evol. 23: 1480–1492). Die DNA-Zielsequenz für die Bindung von bZIP19 und bZIP23 sollte innerhalb des unvollständigen Palindroms liegen, welches im ZIP4-Promotor in zwei Kopien vorliegt, da drei Tandemkopien dieser Sequenz ausreichend sind, um beide bZIPs im Hefe-Ein-Hybrid-Assay zu identifizieren. Deswegen nannten wir die Palindrom-Konsensussequenz (RTGTCGACAY) ein Zinkmangel-Response-Element (ZDRE). Das ZDRE besitzt nicht den typischen ACTG-Kern, wie er in den DNA-Elementen A-Box (TACGTA), C-Box (GACGTC) oder G-Box (CACGTG) zu finden ist, an welche Pflanzen-bZIPs bekanntermaßen bevorzugt binden. Obwohl auch über andere Bindungsstellen berichtet wurde (Choi, H. et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 1723–1730; Fukazawa, I. et al., 2000, Plant Cell 12: 901–915), ist das ZDRE nicht darunter.
Um weiter zu bestätigen, dass das ZDRE in der Tat das charakteristische cis-Element ist, um Gene für die transkriptionelle Kontrolle durch bZIP19/23 zu steuern, untersuchten wir die Proomotoren von anderen ZIP-Transportergenen im Hinblick auf ZDREs. Von den 15 Arabidopsis ZIP-Genen (Mäser, P. et al., 2001, Plant Physiol. 126: 1646–1667) wird beschrieben, dass ungefähr die Hälfte bei Zinkmangelbedingungen im Vergleich zu einer normalen Zinkversorgung transkriptionell induziert wird (Grotz, N. et al., 1998, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 95: 7220–7224; Van de Mortel, J. E. et al., 2006, Plant Physiol. 142:1127–1147; Wintz, H. et al., 2003, J. Biol. Chem. 278: 47644–47653). Nur ZIP1, ZIP2, ZIP3, ZIP4 und IRT3 codieren Proteine, die als Zinktransporter charakterisiert werden (Grotz, siehe oben; Lin, Y.-F. et al., 2009, New Phytol. 182: 392–404), obwohl andere wahrscheinlich auch Zink transportieren. ZIP1, ZIP3, ZIP4, ZIP5, ZIP9, ZIP12 und IRT3 enthalten eine oder zwei ZDRE-Kopien in ihren Promotoren und diese Gene zeigen keine typische Induktion der Expression in der m19m23-Doppelmutante unter Zinkmangelbedingungen, wie wir dies beim Wildtyp sahen (8B). Die Expression von ZIP2, das nicht durch Zinkmangel induziert wird und keine ZDRE-Sequenz in seinem Promotor aufweist, wird nicht beeinflusst im Vergleich zur Mutante und zum Wildtyp (8B). Um den Effekt des Verlusts der bZIP19/23-Funktion auf die allgemeine Genexpression zu bestimmen, führten wir ein Microarray-Experiment durch und verglichen Wurzeln von in Hydrokultur angezogenen 4 Wochen alten m19m23-Doppelmutanten-Pflanzen mit denjenigen von Wildtyp-Pflanzen, welche in ihrer letzten Woche mit einer geringen Zinkversorgung behandelt wurden (Zn–). Nur 23 Gene zeigten eine statistisch signifikante Veränderung der Transkriptmengen und überstiegen einen Grenzwert eines 1,5-fachen Unterschieds (Tabelle 3).

Unter diesen waren 16 in der Doppelmutante herunterreguliert, einschließlich bZIP19 (eine Sonde für bZIP23 war in dem Microarray nicht enthalten). Von den 15 verbleibenden Genen werden 11 bekanntermaßen im Wildtyp Arabidopsis-Wurzeln bei Zinkmangel induziert (Van de Mortel et al., siehe oben) und 9 enthalten eine oder mehrere Kopien des ZDRE in ihren Promotorenregionen. Wir denken, dass diese direkte Ziele von bZIP19 und bZIP23 sind, wichtig für die primäre Zinkmangelreaktion, und die anderen Gene repräsentieren einen sekundären Effekt. Diese Befunde bestätigen die wichtige Rolle des ZDRE und der bZIP19/23-Gene bei der Steuerung der Reaktion auf Zinkmangel bei Arabidopsis. Sie zeigen auch, dass der starke negative Effekt auf das Wachstum und auf die Zinkkonzentration der m19m23-Mutante bei Wachstum unter Zinkmangel (4, A, B und C) großteils durch die Verringerung der Expression einer relativ kleinen Gruppe von Zinkhomöostasegenen erklärt wird, welche an der Aufnahme und Translokation von Metallen beteiligt sind. Tabelle 3. Differenziell exprimierte Gene, nachgewiesen durch eine komparative Microarray-Analyse der Wurzeltranskriptome von Arabidopsis-Wildtyp und m19m23-Doppelmutantenpflanzen. Es wurden Wurzeln von 4 Wochen alten Pflanzen verwendet, angezogen in Hydrokultur, welche in ihrer letzten Woche einem Zinkmangel (Zn–) ausgesetzt wurden. Der Faktor der Veränderung („fold change”) (FC) ≥ 1,5 und angepasste p-Werte (Benjamini-Hochberg, BH) ≤ 0,05 wurden als Ausschlussgrenze verwendet. Der durchschnittliche Expressionswert (log2-Maßstab) des Genmodells im Datensatz wird als A angezeigt.

Anmerkung (www.arabidopsis.org)	Genmodell	FC (≥ 1,5)	A	Angepasster p-Wert (BH)
herunterreguliert
Protein der bZIP Transcriptionsfaktorfamilie	AT4G35040	–35,87	7,31	9,27E–08
ZIP3 (Zinktransporter 3 Vorläufer)*	AT2G32270	–26,23	9,67	1,35E–09
Protein der Phosphatidylinositol-3- und 4-Kinasefamilie/Protein der Ubiquitinfamilie	AT5G24240	–8,43	8,20	3,57E–08
ZIP5 (Zinktransporter 5 Vorläufer)*	AT1G05300	–8,34	6,90	4,15E–07
ZIP4 (Zinktransporter 4 Vorläufer)*	AT1G10970	–7,19	7,68	9,27E–08
ZIP9 (Zinktransporter 9 Vorläufer)*	AT4G33020	–3,23	6,90	4,41E–04
ZIP1 (Zinktransporter 1 Vorläufer)*	AT3G12750	–3,21	7,33	1,10E–05
Nikotianaminsynthase, vermutlich*	AT5G56080	–3,02	9,24	1,28E–02
ATPAP27/PAP27 (Purple Acid Phosphatase 27)	AT5G50400	–2,51	9,79	1,10E–5
Nikotianaminsynthase, vermutlich*	AT1G56430	–2,46	7,68	1,98E–03
ATARP9 (Actin-verwandtes Protein 9)	AT5G43500	–2,33	7,28	3,16E–05
FRD3 (Eisenreduktase defective 3)	AT3G08040	–1,78	8,61	1,98E–03
Prolyloligopeptidase, vermutlich/Prolylendopeptidase, vermutlich/Post-Prolin Spaltenzym, vermutlich*	AT1G20380	–1,77	8,28	6,20E–03
WR3 (wundresponsiv 3)	AT5G50200	–1,60	11,63	2,48E–02
ZIP10 (Zinktransporter 10 Vorläufer)*	AT1G31260	–1,60	6,30	3,09E–02
Ähnlich mit unbekanntem Protein [Arabidopsis thaliana] (TAIR:AT1G61260.1)	AT4G04990	–1,59	8,41	4,22E–03
hochreguliert
LAC2 (Laccase 2)	AT2G29130	1,82	7,01	1,82E–02
ANR1; DNA-Bindung/Transkriptionsfaktor	AT2G14210	1,71	8,90	2,85E–02
Ähnlich mit unbekanntem Protein [Arabidopsis thaliana] (TAIR:AT1G21670.1)	AT1G21680	1,57	8,98	2,85E–02
ATEBP/ERF72/RAP2.3 (verwandt mit AP2 3)	AT3G16770	1,55	9,68	4,18E–02
COBL2 (Cobra-ähnliches Protein 2 Vorläufer)	AT3G29810	1,54	7,40	3,42E–02
Protein der Kelch-Repeat-enthaltenden Familie	AT1G80440	1,52	11,05	9,48E–03
ATPSK2 (Phytosulfokin 2 Vorläufer)	AT2G22860	1,52	9,20	4,24E–02

*Zeigt an, dass Gene eine oder mehrere Kopiendes ZDRE in ihrer Promotorregion enthalten.

Zusammenfassend ist die Funktion der bZIP19- und bZIP23-Transkriptionsfaktoren für die Reaktion und Anpassung von Pflanzen auf bzw. an eine niedrige Zinkversorgung essenziell. Die Identifizierung dieser Transkriptionsfaktoren, ebenso wie des ZDRE-Elements, an welches sie binden und die Zielgene, welche sie regulieren, stellt einen wichtigen Schritt vorwärts in Richtung eines umfassenden Verständnisses der Zinkhomöostase bei Pflanzen dar.
Beispiel 2
Arabidopsis-Pflanzen, Zugang Col, wurden mit OX19 oder OX23 tranformiert (im Hinblick auf die Konstruktion dieser Vektoren, siehe Beispiel 1), und es wurden homozygote T3-Pflanzen erhalten. Drei hochexprimierende Linien entweder mit OX19 (Genotypen 14, 15, 19) oder OX23 (Genotypen 16, 17, 18) wurden ausgewählt. Samen dieser Linien wurden gekeimt und in zwei Wiederholungen auf Hydrokulturmedium ohne zusätzliches Zn (0 μM Zn, Zn-Mangel), 2 μM Zn (Zn normal) oder 25 μM Zn (Zn-Überschuss) angezogen. Die Pflanzen wurden nach 6 Wochen fotografiert und Proben für eine Biomasseanalyse entnommen.
Wenn Pflanzen verglichen wurden, welche bei normalen Zn-Bedingungen angezogen wurden, war kein offensichtlicher Unterschied im sichtbaren Phänotyp zu sehen (Daten nicht gezeigt). Wenn aber Pflanzen verglichen wurden, die auf Zn-Mangelmedium angezogen wurden, waren die Linien 19 (OX19), 16 und 17 (OX23) im Allgemeinen größer und grüner (9). Wenn sie hinsichtlich der Biomasseproduktion untersucht wurden, wurde in der Tat gefunden, dass alle Linien mehr Biomasse als der Wildtyp erzeugten, obwohl dieser Befund bei diesem Experiment im kleinen Maßstab nur in Linie # 16 signifikant war (10A). Wenn Pflanzen im Hinblick auf die Biomasseproduktion untersucht wurden, die bei normaler Zinkversorgung angezogen wurden, wurde im Allgemeinen gefunden, dass sie im Vergleich zum Wildtyp weniger oder gleich viel Biomasse aufweisen (10B), obwohl die beobachteten Unterschiede nicht statistisch signifikant waren. Die Zinkkonzentrationen wurden in den Sprösslingen von allen Linien bestimmt, welche bei normalem Zink und bei Zinkmangel angezogen wurden. Die Zn-Konzentrationen in den Sprossen von Pflanzen, welche bei normalem Zink angezogen wurden, waren im Allgemeinen nicht unterschiedlich vom WT (Daten nicht gezeigt), jedoch war die Zinkkonzentration in allen Linien bei Zinkmangel niedriger als beim WT (11), wobei insbesondere die Linien 18 und 19 nur 60% der Zn-Konzentration des WT aufwiesen. Dies bedeutet, dass, obwohl Pflanzen nicht in der Lage sind, mehr Zn aufzunehmen, aufgrund der Abreicherung von Zn im Medium, einige OX19- und OX23-Linien mehr Biomasse mit der gleichen Menge Zn erzeugen können, was bedeutet, dass sie toleranter gegenüber Zn-Mangel und im Hinblick auf Zn effizienter sind.
Beispiel 3
Für dieses Experiment wurde ein neues pZIP4::bZIP19-Konstrukt hergestellt. Dieses enthält die vollständige Arabidopsis bZIP19-cDNA, fusioniert stromabwärts des Arabidopsis-ZIP4-Gens, responsiv gegenüber Zinkmangel. Die Rationale des Experiments ist die Untersuchung, ob eine Überexpression der bZIP19- oder bZIP23-Funktion die Toleranz gegenüber Zn-Mangel im Vergleich mit Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen verstärkt. Die Überexpression der bZIP19-Funktion in diesem Experiment wird im Gegensatz zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Experiment durch den Promotor des ZIP4-Zinktranspartergens vermittelt, welcher gegenüber Zn-Mangel transkriptionell responsiv ist. Somit wird die Überexpression der bZIP19-Funktion hauptsächlich in den Zellen und Geweben auftreten, in welchen normalerweise die Zn-Mangelreaktion aktiv ist, wenngleich dies auf einem höheren Niveau erwartet wird als bei WT-Pflanzen.
Arabidopsis-Pflanzen, Zugang Col, wurden mit dem pZIP4::bZIP19-Konstrukt transformiert und es wurden homozygote T3-Pflanzen erhalten. Es wurden insgesamt 6 Linien ausgewählt, welche die T-DNA an einem Lokus insertiert enthielten und nach drei aufeinander folgenden Generationen als Nachweis der stabilen Transformation einen unverminderten Hygromycin-resistenten Phänotyp zeigten. WT- und pZIP4::bZIP19-Pflanzen wurden in zwei Wiederholungen auf Medium mit normalem Zn (2 μM Zn) oder ohne Zn (0 μM Zn) zur Erzeugung eines Zn-Mangels angezogen. Nach 4 Wochen Wachstum wurden Fotos gemacht, um alle Unterschiede im sichtbaren Phänotyp zu bestimmen (12). In diesem Stadium zeigten die Pflanzen noch keine sichtbaren Zn-Mangelsymptome, aber zeigten eine Verzögerung des Wachstums im Vergleich mit Pflanzen, welche mit normalem Zn angezogen wurden (Daten nicht gezeigt). In diesem Stadium ist klar, dass WT-Pflanzen im Allgemeinen kleinere Rosetten aufweisen als mit pZIP4::bZIP19 transformierte Pflanzen. Sequenzprotokoll
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Claims

Verfahren zum Verändern der Kapazität einer Pflanze für die Anpassung an Veränderungen der Zinkkonzentration in der Umgebung, insbesondere des Bodens, umfassend Versehen der Pflanze mit einem Nukleotid, welches für ein bZIP19- und/oder bZIP23-Protein codiert, worin die Sequenzen in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 1 angegeben sind, oder Orthologe davon.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Toleranz gegenüber einem Zn-Mangel erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze imstande ist, Zink übermäßig zu akkumulieren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze imstande ist, die Konzentrationen von Zink in essbaren Teilen zu erhöhen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Pflanze mit einem Nukleotid, welches für ein bZIP19-Protein codiert und einem Nukleotid, welches für ein bZIP23-Protein codiert, versehen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Pflanze zusätzlich mit einem oder mehreren Polynukleotiden versehen wird, welche für ein Protein codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schwermetalltransportern, bevorzugt HMA2, HMA3 oder HMA4, YSL-Proteinen, bevorzugt YSL, bevorzugt YSL1 oder YSL3, ZIP- oder IRT-Proteinen, ZIF-Proteinen, NAS-Proteinen, MRP-Proteinen, FRD3 und MTPs.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Polynukleotid von Arabidopsis, mehr bevorzugt von A. thaliana stammt.
Verfahren zur Phytoremediation, umfassend die Schritte a) Anbauen einer Pflanze, welche transgen ist im Bezug auf ein Nukleotid, welches für ein bZIP19- und/oder bZIP23-Protein codiert, deren Sequenzen in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 1 angegeben sind, oder Orthologe davon, auf Boden, welcher mit Zn verschmutzt ist; b) Ernten der Pflanze; und c) Entsorgen der Biomasse.
Verfahren zur Biofortifikation, umfassen Anbauen einer Pflanze, welche transgen ist im Bezug auf ein Nukleotid, welches für ein bZIP19- und/oder bZIP23-Protein codiert, deren Sequenzen in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 1 angegeben sind, oder Orthologe davon.
Verwendung eines Nukleotids, welches für ein bZIP19- und/oder bZIP23-Protein codiert, worin die Sequenzen in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 1 angegeben sind, oder Orthologe davon, für die Transformation einer Pflanze, worin die Kapazität der Pflanze für die Anpassung an Veränderungen der Zinkkonzentration in der Umgebung, insbesondere des Bodens, verändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Verwendung nach Anspruch 10, worin das Orthologe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Orthologen von Populus trichocarpa (PtrbZIP38 oder XM_002305485.1 und PtrbZIP39 oder XM_002313671.1); Reis (OsbZIP48 oder AK071639.1), Helianthus annuus (CD852649.1), Medicago truncatula (TA25329_3880), Solanum tuberosum (TA33339_3880), Glycine max (TA50226_3847; TA50224_3847), Sorghum bicolor (TA23717_4558), Zea mays (TA111061_4577; TA111059_4577; CO451643), und Hordeum vulgare (TA45897_4513).