JP6935383B2 - 免疫不全マウス - Google Patents

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Description

本発明はＩＬ−２（インターロイキン２）受容体γ鎖の遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、ＦｃｇＲ（ＩｇＧ Ｆｃ受容体）が機能的に発現しな
い遺伝子改変免疫不全マウス、及び、該遺伝子改変免疫不全マウスにヒト細胞が顕著に高い割合で生着しているヒト細胞生着免疫不全マウス等に関する。
ヒト細胞、ヒト組織をインビボで解析できるヒト化免疫不全マウスは、創薬のためのリサーチツールとしての利用のみならず、ヒト細胞を移植することによりインビボでヒト細胞の分化、機能解析等の基礎研究を行うことができる有用なツールとして、医療への貢献が期待できる実験動物であるとされ、長年にわたり、より有用なヒト化免疫不全マウスの作出が試みられてきた。
例えば、ヒト細胞の生着が可能であり、補体活性、マクロファージ機能の減退やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の減退等がみられるＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに、サイトカインレセプター共通ドメインであるＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウス（ＩＬ２ＲγＫＯマウス）を戻し交配することにより、機能的なＴ細胞及びＢ細胞を共に欠失し、ＮＫ細胞の活性を消失し、マクロファージ機能が減退し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有するＮＯＧマウス（「ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＳｈｉＪｉｃ」,「ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ」等とも表示される）が伊藤らによって作出された（例えば、特許文献１参照）。ＮＯＧマウスは、ヒトの細胞や組織の生着性が非常に高い免疫不全マウスとされている。
一方、免疫システムにおいて、ＩｇＧ抗体はその構造に可変領域と定常領域を含み、可変領域において病原体等の異種抗原と結合が行われる。他方、多くの免疫細胞の表面には、ＩｇＧ抗体の定常領域に結合する受容体であるＦｃｇＲが存在しており、抗原等と結合した抗原特異的ＩｇＧ抗体はその定常領域を介してＦｃｇＲに結合する。その結果、免疫細胞の活性化が誘導され、病原体等の異物が排除される。
特許第３７５３３２１号公報
上述のＮＯＧマウスに、腫瘍関連抗原を高発現するヒトがん細胞を移植し、さらに腫瘍関連抗原を認識するＩｇＧ抗体を投与すると、ＮＯＧマウス内でのヒトがんの成長が著しく抑制されることが知られているが、かかる腫瘍関連抗原に結合した抗体を捕捉し、ヒトがん細胞を傷害する抗体依存的がん抑制反応においては、ＮＯＧマウスにおいてＩｇＧ抗体がマウスＦｃｇＲを介して関与することを発明者らは確認している。したがって、ヒト抗体を投与する抗体医薬品の機能評価実験等を行った場合、抗体への免疫応答がヒト免疫細胞に由来するものなのか、マウス免疫細胞に由来するものなのかを判別することが難しいという問題があった。
本発明の課題は、ヒト抗体に対する免疫不全マウス由来の免疫細胞の影響を排除することができ、かつ、ヒト細胞の生着性が従前より高い免疫不全マウスを提供することにある。
本発明者らは、ＮＯＧマウスからさらにマウスＦｃｇＲ遺伝子を欠損させた場合に、かかるマウスは、腫瘍に対する、抗体依存性の細胞傷害（Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity：ＡＤＣＣ）活性を示さず、ＮＯＧマウスと比較してヒト細胞が顕著に高い割合で生着することを見いだした。さらに、かかるマウスにヒトＩＬ−１５遺伝子を導入し、ヒトＮＫ細胞を生着させることにより、ヒトＮＫ細胞のみがエフェクター細胞となって、ＡＤＣＣ活性を評価することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原受容体遺伝子の再構成に関わる遺伝子の変異が両対立遺伝子座位にあり、さらにＦｃｇＲが機能的に発現しないことを特徴とする遺伝子改変免疫不全マウス。
［２］Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原受容体遺伝子の再構成に関わる遺伝子の変異が、ＳＣＩＤ変異又はＲＡＧ変異であることを特徴とする上記［１］記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
［３］ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯマウスであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載
の遺伝子改変免疫不全マウス。
［４］ＦｃｇＲの遺伝子が、Ｆｃｅｒ１ｇ及びＦｃｇｒ２ｂを含むことを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
［５］腫瘍に対する抗体依存性の細胞傷害活性を示さないことを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
［６］上記［１］〜［５］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに由来する組織。［７］上記［１］〜［５］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに由来する体細胞。
［８］上記［１］〜［５］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに由来する生殖細胞。
［９］上記［１］〜［５］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに、ヒト細胞が顕著に高い割合で生着していることを特徴とするヒト細胞生着免疫不全マウス。
［１０]ヒト細胞が、ヒト末梢血単核球であることを特徴とする上記［９］記載のヒト細
胞生着免疫不全マウス。
［１１］上記［９］又は［１０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウスに由来するヒト細胞が生着した組織。
［１２］上記［９］又は［１０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウスに由来するヒト体細胞。
［１３］上記［９］又は［１０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する生殖細胞。
［１４］上記［１］〜［５］のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスと、ヒトＩＬ−１５遺伝子を導入した遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）とを交配することにより、作出された遺伝子改変免疫不全マウス（II）。
［１５]遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）が、ヒトＮＫ細胞を増幅・維持できるＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスであることを特徴とする上記[１４]記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）。
［１６］上記［１４］又は［１５］記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に由来する組織。
［１７］上記［１４］又は［１５］記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に由来する体細胞。
［１８］上記［１４］又は［１５］記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に由来する生殖細胞。
［１９］上記［１４］又は［１５］記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に、ヒト細胞が顕著に高い割合で生着していることを特徴とするヒト細胞生着免疫不全マウス（II）。［２０］ヒト細胞が、ヒト末梢血単核球であることを特徴とする上記［１９］記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）。
［２１］上記［１９］又は［２０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する組織。
［２２］上記［１９］又は［２０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する体細胞。
［２３］上記［１９］又は［２０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する生殖細胞。
［２４］上記［９］又は［１０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウスを用いて、ヒト細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の活性や作用機序を評価する方法。
［２５］上記［１４］又は［１５］記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）を用いて、ヒトＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を評価する方法。
［２６］上記［１９］又は［２０］記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）を用いて、ヒトＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を評価する方法。
［２７］遺伝子改変免疫不全マウスに、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞とを共存させることにより、抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の機能を評価できることを特徴とするヒト細胞生着免疫不全マウス（III）。
［２８］ヒト細胞生着免疫不全マウス（III）を用いて、ヒト細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の機能を評価する方法。
［２９］ヒト細胞生着免疫不全マウス（III）を用いて、ヒト免疫細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の機能を評価する方法。
本発明によると、腫瘍に対して、マウス細胞由来のＡＤＣＣ活性を示さず、かつヒト細胞生着性が顕著に高い遺伝子改変免疫不全マウスを提供することができる。また、かかるマウスにヒト造血幹細胞を移植してＴ細胞等のヒト免疫細胞を分化させた後、さらにヒト腫瘍細胞を移植して、抗ヒトＰＤ−１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤として働く抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体を投与した場合に、投与した抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体のヒト腫瘍免疫反応を評価することができる。さらに、かかるマウスのゲノムにヒトＩＬ−１５遺伝子を導入し、ヒトＮＫ細胞を生着させることにより、ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞とするＡＤＣＣ活性を評価することができる。
各マウスについて、ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５（ｍＣＤ４５）＋白血球中のｍｏｕｓｅ ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩ（ｍＣＤ１６／３２）の発現の有無を示した図である。（ｂ）はＮＯＧマウス、（ｃ）はＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス、（ｄ）はＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの結果をそれぞれ示す。（ａ）はネガティブコントロールである。 ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５（ｍＣＤ４５）＋白血球中のｍＦｃｇＲＩＩＩ及びｍＦｃｇＲＩＩ発現細胞の割合を示した図である。 トラスツズマブ（ヒトＩｇＧ抗体）投与後のｍＣＤ４５＋白血球中のＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋単球／マクロファージ分画における、ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩ（ｍＣＤ１６／３２）の発現及びヒトＩｇＧ抗体の結合の有無を示す図である。（ａ）は、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにおけるトラスツズマブ投与しないネガティブコントール、（ｂ）は、ヒトＩｇＧ抗体投与ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス、（ｃ）は、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの結果をそれぞれ示す。 マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＩｇＧ１）投与後の血漿中のマウスＩｇＧ抗体の濃度の測定結果を示すグラフである。（ａ）は、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにマウスＩｇＧ１抗体を１００μｇそれぞれ投与した場合、（ｂ）は、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに１００μｇそれぞれ投与した場合、（ｃ）は、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに２０μｇそれぞれ投与した場合の結果を示す。 ヒトＩｇＧ抗体医薬３種類を、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス及び／又はＮＯＧマウスの腹腔内へそれぞれ１００μｇ投与した場合の、血漿中の各ヒトＩｇＧ抗体の濃度の測定結果を示すグラフである。（ａ）は、リツキシマブをそれぞれ投与した場合、（ｂ）は、トラスツズマブをそれぞれ投与した場合、（ｃ）は、モガムリズマブをそれぞれ投与した場合の結果を示す。 ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにＨｅｒ２陽性胃がん細胞株４−１ＳＴを皮下移植後の、腫瘍サイズの測定結果を示すグラフである。（ａ）は、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）をそれぞれのマウスに投与した場合、（ｂ）は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）をそれぞれのマウスに投与した場合の結果を示す。 ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにヒト浮遊系がん細胞株Ｄａｕｄｉを移植後の、血液中のｈＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞の割合の測定結果を示すグラフである。（ａ）は、ＰＢＳをＮＯＧマウス、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスに投与した場合、（ｂ）は、リツキシマブをＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスに投与した場合の結果を示す。 Ｄａｕｄｉ移植各マウスにリツキシマブ又はＰＢＳを投与し、Ｄａｕｄｉ移植後２３日目に剖検した腎臓の写真（ａ）、及び重量の測定結果（ｂ）を示す。 ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、ヒト造血幹細胞移植した後の総白血球中のｈ（human:ヒト）ＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。（ａ）は雄の各マウス、（ｂ）は雌の各マウスの結果を示す。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、ｈＣＤ４５＋細胞の詳細を示すグラフである。（ａ）は雄のｈＣＤ３３＋ミエロイド系細胞、（ｂ）は雄のｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、（ｃ）は雄のｈＣＤ３＋Ｔ細胞、（ｄ）は雌のｈＣＤ３３＋ミエロイド系細胞、（ｅ）は雌のｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、（ｆ）は雌のｈＣＤ３＋Ｔ細胞の結果を示す。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスを剖検して、造血臓器（骨髄・脾臓・血液）中のｈＣＤ４５＋細胞の生着率と生着細胞数を測定したグラフである。（ａ）は骨髄における生着率、（ｂ）は脾臓における生着率、（ｃ）は血液における生着率、（ｄ）は骨髄における生着細胞数、（ｅ）は脾臓における生着細胞数、及び（ｆ）は血液における生着細胞数を示す。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスを剖検して、造血臓器（骨髄・脾臓・血液）におけるｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、ｈＣＤ３３＋ミエロイド細胞、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞の占める割合及び生着細胞数を測定したグラフである。（ａ）は骨髄における各細胞の生着率、（ｂ）は脾臓における各細胞の生着率、（ｃ）は血液における各細胞の生着率、（ｄ）は骨髄における各細胞の細胞数、（ｅ）は脾臓における各細胞の細胞数、及び（ｆ）は血液における各細胞の細胞数を示す。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、Ｔ細胞亜集団の分化の状況を評価したグラフである。（ａ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞・ＣＤ８＋Ｔ細胞・ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞の亜集団についての脾臓と血液における評価を示し、（ｂ）は、ｈＰＤ−１についての評価が示されている。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、抗ヒトＰＤ−１抗体投与後マウスを剖検し、骨髄・脾臓・血液の各造血組織中の、ヒトＴ細胞を含めたヒト免疫細胞の増減を、上記装置を用いてフローサイトメトリーにより解析したグラフである。（ａ）は骨髄におけるｈＣＤ４５＋細胞生着率、（ｂ）は脾臓におけるｈＣＤ４５＋細胞生着率、（ｃ）は血液におけるｈＣＤ４５＋細胞生着率、（ｄ）は骨髄におけるｈＣＤ４５＋細胞数、（ｅ）は脾臓におけるｈＣＤ４５＋細胞数、及び（ｆ）は血液におけるｈＣＤ４５＋細胞数を示す。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、抗ヒトＰＤ−１抗体投与後にマウスを剖検して、造血臓器（骨髄・脾臓・血液）におけるｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、ｈＣＤ３３＋ミエロイド細胞、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞の占める割合及び生着細胞数を測定したグラフである。（ａ）は骨髄における各細胞の生着率、（ｂ）は脾臓における各細胞の生着率、（ｃ）は血液における各細胞の生着率、（ｄ）は骨髄における各細胞の細胞数、（ｅ）は脾臓における各細胞の細胞数、及び（ｆ）は血液における各細胞の細胞数を示す。 ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、抗ヒトＰＤ−１抗体投与後マウスを剖検し、脾臓組織中のｈＣＤ３＋Ｔ細胞について、さらに、Ｔ細胞の亜集団を検証したグラフである。（ａ）はＣＤ４＋Ｔ細胞・ＣＤ８＋Ｔ細胞・ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞の亜集団についての脾臓における生着率を示し、（ｂ）はＣＤ４＋Ｔ細胞・ＣＤ８＋Ｔ細胞・ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞の亜集団についての脾臓における細胞数を示す。 ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）を移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧマウスについて、（ａ）２５０００００個移植した場合のｈＣＤ４５＋細胞の生着率、（ｂ）２５０００００個移植した場合のｈＣＤ４５＋細胞の生着細胞数、（ｃ）１５０００００個移植した場合のｈＣＤ４５＋細胞の生着率、（ｄ）１５０００００個移植した場合のｈＣＤ４５＋細胞の生着細胞数を示すグラフである。 ヒトＰＢＭＣ移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧマウスを剖検した場合の、（ａ）２５０００００個移植した場合のｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞のｈＣＤ４５＋細胞中に占める割合及び生着率、（ｂ）２５０００００個移植した場合のＣＤ４＋Ｔ細胞・ＣＤ８＋Ｔ細胞・ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞の亜集団についての生着率、（ｃ）１５０００００個移植した場合のｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞のｈＣＤ４５＋細胞中に占める割合及び生着率、（ｄ）１５０００００個移植した場合のＣＤ４＋Ｔ細胞・ＣＤ８＋Ｔ細胞・ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞の亜集団についての生着率を示す。 （ａ）は、ヒトＰＢＭＣ移植したＮＯＧマウス、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスのｈＣＤ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。（ｂ）は、ＰＢＭＣ移植後抗ヒトＰＤ−１抗体投与した場合のヒトＰＤ−１＋Ｔ細胞に対するＡＤＣＣ活性の誘導の有無を示すグラフである。 ＮＯＧ-ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを掛け合わせたマウスについて、ｈＣＤ４５＋細胞の生着性（ａ）及びＮＫ細胞の割合（ｂ）を示すグラフである。 Ｄａｕｄｉ移植各ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスにリツキシマブ又はＰＢＳを投与し、Ｄａｕｄｉ移植後に剖検した腎臓の重量の測定結果を示す。 （ａ）は、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ（−ＦｃｇＲ＋／＋）マウスにＰＢＳ又はニボルマブを投与した場合、（ｂ）は、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにＰＢＳ又はニボルマブを投与した場合の結果を示すグラフである。 ＨＳＣ−４移植後、４週経過したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びＮＯＧ（−ＦｃｇＲ＋／＋）マウスの剖検後の、造血臓器（脾臓・血液）中及び腫瘍中のｈＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合（ａ，ｂ，ｃ）並びに細胞数（ｄ，ｅ，ｆ）を示すグラフである。（ａ）は腫瘍内のｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、（ｂ）は脾臓内のｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、（ｃ）は血液中のｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、（ｄ）は腫瘍内のｈＣＤ３＋Ｔ細胞の生着数、（ｅ）は脾臓内のｈＣＤ３＋Ｔ細胞の生着数、（ｆ）血液におけるｈＣＤ３＋Ｔ細胞の生着数を示す。
本発明の遺伝子改変免疫不全マウスとしては、ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、ＦｃｇＲが機能的に発現しないマウスであれば特に制限されず、上記遺伝子改変免疫不全マウスとしては、特定の免疫機能を司るタンパク質をコードする野生型の遺伝子の塩基配列について、一又は二以上の塩基の他の塩基への置換、一又は二以上の塩基の欠失、一又は二以上の塩基の挿入、アミノ酸の読み枠がずれるアウトオブフレーム及び／又はこれらの組合せ等の遺伝子の変異が導入される遺伝子改変により、野生型の遺伝子が奏する免疫作用が機能しないマウスをいう。なお、上記野生型としては、集団においてみられる最も一般的な対立遺伝子又は多型であって、突然変異により又は人為的操作による遺伝子改変がなされていないマウスを挙げることができる。
本発明はさらに、上記遺伝子改変免疫不全マウスと遺伝子改変免疫不全マウスにヒトＩＬ−１５遺伝子を導入した遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）とを交配することにより作出された遺伝子改変免疫不全マウス（II）も含む。
本発明におけるマウスとしては、齧歯目ネズミ科ハツカネズミ属に属する哺乳動物を挙げることができる。
本発明におけるＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損したマウスとしては、ＩＬ−２受容体γ鎖が機能的に発現しないマウスを挙げることができる。
上記ＩＬ−２受容体は、アルファ（α）鎖、ベータ（β）鎖及びガンマ（γ）鎖と呼ばれる３種類のタンパク質から構成されることがヒト及びマウスで知られており、上記ＩＬ−２受容体γ鎖は、γ鎖単独ではＩＬ−２との結合能を有さないが、β鎖とγ鎖とのヘテロ２量体はＩＬ−２に対する中親和性受容体となり、α鎖とβ鎖とγ鎖とのヘテロ３量体はＩＬ−２に対する高親和性受容体となる。
上記ＩＬ−２は、サイトカインの一種であり、ＩＬ−２の作用としては、細胞表面に存在するＩＬ−２受容体と結合することにより、ＩＬ−２のシグナルを細胞質から核内へ伝達し、Ｔ細胞やＢ細胞の増殖やＮＫ細胞の活性化への誘導すること等を挙げることができる。したがって、ＩＬ−２受容体γ鎖が機能的に発現しない場合としては、ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されることによりＩＬ−２受容体がＩＬ−２との結合能を失っている場合、又はシグナル伝達が起こらない場合を挙げることができる。
上記ＦｃｇＲが機能的に発現しない遺伝子改変免疫不全マウスとしては、ＦｃＲをコードする遺伝子の変異により、ＦｃｇＲが受容体タンパク質として機能しなくなったマウスを挙げることができる。ＦｃｇＲの受容体タンパク質としての機能としては、抗原とＩｇＧ抗体が結合した複合体に特異的に結合することにより細胞内にシグナルを伝達することを挙げることができる、本発明のマウスにおいては、かかる変異が両対立遺伝子座位にあることが必須である。
上記ＦｃｇＲは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫系細胞の表面上に通常存在する受容体タンパク質であって、遺伝子構造の類似性に基づいてＦｃｇｒＩ遺伝子がコードするＦｃｇＲＩ（ＣＤ６４抗原）、ＦｃｇｒＩＩ遺伝子がコードするＦｃｇＲＩＩ（ＣＤ３２抗原）、ＦｃｇｒＩＩＩ遺伝子がコードするＦｃｇＲＩＩＩ（ＣＤ１６抗原）の３種に大きく分類される。なお、ＦｃＲ共通γ鎖（ＦｃＲｇもしくはＦｃｅＲＩｇともいう）が、ＦｃｇＲＩとＦｃｇＲＩＩＩに共通の構成因子をなす。
本発明のマウスにおいては、さらにＴ細胞及びＢ細胞の抗原受容体遺伝子の再構成に関わる遺伝子の変異が両対立遺伝子座位にあることが必須で、例えば、当該変異としてＳＣＩＤ変異又はＲＡＧ変異を挙げることができる。上記ＳＣＩＤ変異は、重度複合免疫不全（Severe Combined Immuno-Deficiency：ＳＣＩＤ）を呈するマウスにおいて見いだされた、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（Protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide：Ｐｒｋｄｃ）遺伝子の変異である。
上記ＲＡＧ変異としては、Ｒａｇ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ）−１遺伝子又はＲａｇ−２遺伝子における変異を挙げることができる。かかる２つの遺伝子は、未熟なリンパ球に発現する遺伝子であって、免疫グロブリン遺伝子及びＴ細胞受容体の再構成に必須の作用を有し、Ｔ細胞やＢ細胞の成熟に不可欠の遺伝子である。
上記ＳＣＩＤ変異及び／又はＲＡＧ変異をはじめとするＴ細胞及びＢ細胞の抗原受容体遺伝子の再構成に関わる遺伝子の変異が両対立遺伝子座位に有するマウスは、ＤＮＡの修復異常によりＴ細胞及びＢ細胞の遺伝子再構成ができないため、Ｔ細胞とＢ細胞とが成熟段階に至らず、Ｔ細胞及びＢ細胞の機能が欠失する変異である。本発明のマウスにおいてかかる変異は、いずれも両対立遺伝子座位にあることが必須である。
本発明のＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、ＦｃｇＲが機能的に発現しない遺伝子改変免疫不全マウスを作出する方法としては、ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に導入された変異と、ＦｃｇＲ遺伝子の変異とを、従来公知のゲノム編集法によりマウスに導入する方法や、従来公知のマウスを用いて交配により作出する方法を挙げることができ、また、公知のゲノム編集法によりマウスに導入する方法と交配による方法を組み合わせて作出することもできる。
上記公知のゲノム編集法としては、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼを用いるＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins）システム等を例示することができる。上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＤＮＡ二本鎖を切断（Double Strand Breaks）してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することによってゲノムを編集することにより、ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に導入された変異やＦｃｇＲ遺伝子の変異をマウスＥＳ細胞やマウスｉＰＳ細胞に導入することができる点で好ましい遺伝子改変技術として挙げることができる。
上記従来公知のマウスを用いて交配により作出する方法としては、ＩＬ−２受容体γ鎖の遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、ＦｃｇＲ（ＩｇＧ Ｆｃ受容体）が機能的に発現しない遺伝子改変免疫不全マウスを作出できる方法であれば特に制限されず、ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損したマウスと、ＦｃｇＲが機能的に発現しないマウス（ＦｃｇＲ ＫＯマウス）とを交配する方法を例示することができる。なお、本明細書において「ＦｃｇＲ ＫＯマウス」とは、野生型（＋／＋）に対して両対立遺伝子座位の変異による機能の欠損（ＫＯ／ＫＯ）によりＦｃｇＲの機能が発現しないことを意味し、ヘテロ型（ＫＯ／＋）は含まない。
上記ＩＬ−２受容体γ鎖に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損したマウスとしては、具体的には、ＮＯＧマウス、Ｃ５７ＢＬ／６−ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２ｎｕｌｌ−ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス等の公知のマウスを挙げることができるが、両対立遺伝子座位にＳＣＩＤ変異もしくはＲＡＧ変異をさらに有する点で、ＮＯＧマウス、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２ｎｕｌｌ−ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウスが好ましく、Ｔ細胞及びＢ細胞の機能が欠失し、ＮＫ細胞の活性が消失マクロファージの機能が減退し、樹状細胞の機能が減退しているＮＯＧマウスが特に好ましい。
上記ＦｃｇＲの遺伝子の具体例としては、ＦｃｅｒＩ遺伝子、ＦｃｇｒＩ遺伝子、ＦｃｇｒＩＩ遺伝子、ＦｃｇｒＩＩＩ遺伝子を挙げることができ、上記ＦｃｇＲ ＫＯマウスの具体例としては、ＦｃｅｒＩ遺伝子が欠損するＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウス、ＦｃｇｒＩＩ遺伝子が欠損するＮＯＤ−Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウス、ＦｃｇｒＩＩＩ遺伝子が欠損するＮＯＤＩＩＩ−／−マウス、ＦｃｅｒＩ遺伝子とＦｃｇｒＩＩ遺伝子が欠損するＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスを挙げることができるが、機能的に発現しないＦｃｇＲが、Ｆｃｅｒ１ｇ及びＦｃｇｒ２ｂを含んでいる、ＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスを好適に例示することができる。
ＩＬ−２受容体γ鎖の遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、ＦｃｇＲが機能的に発現しない遺伝子改変免疫不全マウスの交配による作出方法として、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損しているマウスとして、例えばＮＯＧマウスを用い、ＦｃｇＲが機能的に発現しないマウス（ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス（遺伝子型）、ＦｃｇＲ ＫＯマウス（表現型））として、例えば機能しないＦｃｇＲの遺伝子が、Ｆｃｅｒ１ｇ及びＦｃｇｒ２ｂである、ＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスを用いた場合の作出方法を例にとって以下に説明する。なお、ＩＬ−２ｒｇがＸ染色体に存在するため、雄マウスの遺伝子型が、ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／Ｙ、雌マウスの遺伝子型は、ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌである場合に、ＩＬ−２ｒｇが両対立遺伝子座において欠損したマウスとなる。
上記ＮＯＧマウスは、ヒトの１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病）の病態に類似することから、ＮＯＤ（Non Obese Diabetes）と命名されたマウス（例えば、Jikken Dobutsu. 29:1-13, 1980参照）と、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（Ｐｒｋｄｃ）遺伝子の変異により、Ｔ細胞及びＢ細胞の機能が欠失し、重度の免疫不全を呈するＳＣＩＤマウスとを組み合わせたＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに、免疫不全症ＸＳＣＩＤ（X-linked severe combined immunodeficiency）の原因遺伝子であり、数種のサイトカインレセプター共通ドメインであるＩＬ−２レセプターγ鎖をノックアウトしたマウス（ＩＬ−２ＲγＫＯマウス）（Ohbo K et al., Blood 1996）を、Ｃｒｏｓｓ Ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ法（Inbred Strains in Biomedical Research, M.F.W.Festing, 1979, The Macmillan Press, London and Basingstoke）にしたがって戻し交配する方法により作出されたマウスであり、具体的には、特許第３７５３３２１号公報を参照することにより作出することができ、また、公益財団法人実験動物中央研究所より入手可能である。
上記ＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスは、東北大学の高井俊行により作出されたマウスであって、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）に保存されており、凍結胚又は個体復元マウスとして入手可能である。
ＮＯＧマウスとＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスとを用いた場合の本発明の遺伝子改変免疫不全マウスの作出方法としては、以下のａ）〜ｆ）の工程を順次備える方法を例示することができる。
ａ）雄のＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスと、雌のＮＯＧマウスとを交配する工程；
ｂ）雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄ／+，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／＋−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆ
ｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋マウスを選択する工程；
ｃ）ｂ）において選択されたマウスと雄のＮＯＧマウスとを戻し交配する工程；
ｄ）雄のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／Ｙ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋マウスと、雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋マウスとを選択する工程；
ｅ）ｄ）で選択された雄のマウスと雌のマウスとを兄妹交配する工程；
ｆ）１）雄のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／Ｙ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ，Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌと、２）雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ，Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌとを「ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス」として選択する工程；
上記作出工程におけるマウスの各遺伝子型については、適当なプライマーを用いたＰＣＲ法を用いた常法により確認することができる。
本発明は、上記遺伝子改変免疫不全マウスに由来する組織や体細胞や生殖細胞にも関する。
上記遺伝子改変免疫不全マウスに由来する組織としては、肝臓、脾臓、脳、腎臓、肺、皮膚、膀胱、胃、胆嚢、すい臓、副腎、前立腺、大腸、小腸、食道、筋肉、乳腺、胸腺、リンパ節、神経、気管、眼球、骨、心臓、脂肪、生殖器（例えば卵巣、子宮、精巣、精嚢腺）、胚又は甲状腺を例示することができるが、脾臓、骨髄、肝臓を好ましく例示することができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウスに由来する体細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織由来間質細胞、脂肪組織由来間質幹細胞、神経幹細胞、***幹細胞等の組織幹細胞や、組織前駆細胞や、筋肉細胞、線維芽細胞、上皮細胞、リンパ球、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ミエロイド細胞などを挙げることができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウスに由来する生殖細胞としては、マウスの***、卵子を挙げることができる。
本発明のマウスの有利な特性としては、マウスＦｃｇＲを介して作用するマウス貪食細胞が、がん抗原特異的なヒト抗体に結合した固形腫瘍や浮遊がん細胞（総称して「腫瘍」ともいう）に対する、ＡＤＣＣ活性を示さないこと、かつ、従来公知のマウスと比較してヒト細胞が顕著に高い割合で生着することを挙げることができる。
本発明のマウスが、上記のＡＤＣＣ活性を示すか否かを確認する方法としては、本発明のマウスと比較対象マウスのそれぞれに、ヒト固形がん細胞株を皮下移植等に移植し、ヒト抗体を投与後適時に、上記ヒト固形がん細胞株による腫瘍のサイズを計測する方法を挙げることができ、例えば、ヒト抗体投与後約２０日程度の本発明のマウスの腫瘍塊のサイズ（容積）が、マウスＦｃｇＲが発現する比較対象マウスにおける腫瘍のサイズの３倍、好ましくは４倍、より好ましくは５倍以上である場合に、上記腫瘍に対するＡＤＣＣ活性を示さないと判定することができる。
本発明のマウスが、上記のＡＤＣＣ活性を示すか示さないかを確認する他の方法としては、本発明のマウスと比較対象マウスのそれぞれに、ヒト浮遊系がん細胞株を血液中に移植し、ヒト抗体を投与後適時に、血液中のヒト浮遊系がん細胞の増殖の状況を確認する方法を挙げることができ、例えば、ヒト抗体投与後約２０日程度の本発明のマウスの総白血球中のヒト浮遊系がん細胞の割合が、マウスＦｃｇＲが発現する比較対象マウスの総白血球中のヒト浮遊系がん細胞の割合の３倍、好ましくは４倍、より好ましくは５倍、さらに好ましくは８倍以上である場合を挙げることができ、上記ヒト浮遊系がん細胞に対するＡＤＣＣ活性を示さないと判定することができる。
本発明のマウスが、上記のＡＤＣＣ活性を示すか示さないかを確認するさらに別の方法としては、ヒト浮遊系がん細胞を血液中に移植し、ヒト抗体を投与したマウスについて、移植後２３日目のがん細胞が局在する組織の重量を測定し、マウスＦｃｇＲが発現する比較対象マウスにおける該組織の重量と比較して、本発明のマウスにおける該組織の重量が顕著に重い場合に、ＡＤＣＣ活性を示さないと判断する方法を挙げることができる。例えば、ヒト抗体投与後約２０日程度の本発明のマウスにおけるがん細胞が局在する組織の一つである腎臓の重量が、比較対象マウスの腎臓の１．５倍、好ましくは１．７倍、より好ましくは２倍である場合を挙げることができ、かかる場合にヒト浮遊系がん細胞に対するＡＤＣＣ活性を示さないと判定することができる。
本発明のマウスには、ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、ＦｃｇＲが機能的に発現しないことを特徴とする遺伝子改変免疫不全マウスにヒト細胞が顕著に高い割合で生着している、ヒト細胞生着免疫不全マウスを含めることができ、かかるマウスの作製方法としては、ヒト細胞移植前の本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに、ヒト細胞の生着能を向上させるためにＸ線等の骨髄内環境を破壊する放射線を照射し、放射線照射後にヒト細胞を移植する方法を挙げることができる。放射される放射線の強度としては、好ましくは０．５〜２．０Ｇｙを例示することができ、移植の時期としては、放射線照射後２４時間以内が好ましい。なお、本発明において本発明のマウスに移植できるヒト細胞としては、ヒト造血幹細胞、ヒト末梢血単核球、ヒトＮＫ細胞を例示することができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウスに移植されたヒト細胞の生着性を評価する方法としては、マウスにおけるヒト細胞を、抗体が結合する特異的なエピトープ部位を有する細胞表面マーカーの存在によって同定する方法を挙げることができる。例えば、末梢血の総白血球中におけるヒト白血球（ｈＣＤ４５＋細胞）の生着性は、抗ｈＣＤ４５抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析によりｈＣＤ４５＋細胞が存在する場合に、生着していると判断することができる。ヒト血液細胞のおおもとであるヒト造血幹細胞（ｈＣＤ３４＋細胞）が遺伝子改変免疫不全マウスに生着した場合、白血球や赤血球や血小板を含むヒト血液細胞は、生着したヒト造血幹細胞から分化、増幅するが、免疫細胞である白血球はマウスの血液中や各免疫組織に貯留するからである。
本発明のマウスにおいてヒト細胞（組織）が顕著に高い生着性を有する場合としては、ＮＯＧマウスと比較した場合、移植後１６週目におけるＴｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡの解析（ｐ＜０．０５）により有意に高いヒト組織の生着性を示すことを挙げることができる。例えば、ＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウスにおいては、ヒト組織の生着性はほぼ認められないという知見からすると、ＮＯＧマウスと比較してかかる高いヒト組織の生着性を本件マウスが示すことは当業者が予想しえなかった効果である。
上記ヒト細胞がヒト造血幹細胞である場合のヒト造血幹細胞を移植する方法としては、成体マウスにＸ線照射後１日以内に１０００〜２５００００個、好ましくは１００００〜１０００００個、より好ましくは２５０００〜７５０００個のｈＣＤ３４＋造血幹細胞を尾静脈より移植する方法を挙げることができる。
上記ヒト造血幹細胞が生着したヒト細胞生着免疫不全マウスの特徴としては、脾臓において、Ｂ細胞への分化の指標となるｈＣＤ１９＋細胞数が顕著に多く検出されることを挙げることができ、顕著に多い場合としては、ＮＯＧマウスに比べて１．５倍、好ましくは２倍、より好ましくは２．５倍以上検出される場合を挙げることができる。上記ｈＣＤ１９＋細胞が存在するか否かは、例えば、抗ｈＣＤ１９抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析により確認することができる。
上記ヒト造血幹細胞が生着したマウスの脾臓の特徴としては、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞からさらにｈＣＤ４＋Ｔ細胞やｈＣＤ８＋Ｔ細胞やｈＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（double positive：ＤＰ）Ｔ細胞の亜集団に正常に分化しており、血液免疫系が再構築されることを挙げることができる。そして、上記分化したｈＣＤ４＋Ｔ細胞やｈＣＤ８＋Ｔ細胞やｈＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（double positive：ＤＰ）Ｔ細胞においては、ヒトＴ細胞に発現するＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １（ＰＤ−１）タンパク分子（ｈＰＤ−１）が発現する。上記ｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ４＋Ｔ細胞、ｈＣＤ８＋Ｔ細胞、ｈＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋細胞、ＰＤ−１＋細胞が存在するか否かは、例えば、一連の抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析により確認することができる。
上記ヒト細胞がヒト末梢血単核球である場合の、ヒト末梢血単核球を移植する方法としては、１０００００〜１×１０７個、好ましくは５０００００〜５００００００個、好ましくは１００００００〜３００００００個、より好ましくは１２５００００〜２７５００００個、さらに好ましくは１３０００００〜２５０００００個、特に好ましくは１４５００００〜１７５００００個のヒト末梢血単核球を尾静脈より移植する方法を挙げることができる。
ヒト末梢血単核球が生着したマウスとしては、ヒト末梢血単核球移植後６週目にｈＣＤ４５陽性の白血球（ｈＣＤ４５＋細胞）の生着細胞数がＮＯＧマウスにおける生着細胞数の２倍、好ましくは３倍、より好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍であること；ヒト末梢血単核球移植後６週目のヒト末梢血単核球中のｈＣＤ４５＋細胞の割合が、１％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは４％以上、さらに好ましくは５％以上、特に好ましくは６％以上であること及び／又は、ｈＣＤ４５＋細胞の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上がｈＣＤ３＋Ｔ細胞で占められている；ヒト細胞が顕著に高い割合で生着しているヒト細胞生着免疫不全マウスを挙げることができる。
以上のとおり、遺伝子改変免疫不全マウスに移植されたヒト細胞の生着性を評価することにより、上記ヒト細胞生着免疫不全マウスを用いて、ヒト細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の活性や作用機序を評価することができる。
本発明は、上記ヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する組織や体細胞や生殖細胞にも関する。上記ヒト細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の活性や作用機序の評価は、かかるヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する組織や体細胞や生殖細胞を用いて行うこともできる。
上記ヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する組織としては、肝臓、脾臓、脳、腎臓、肺、皮膚、膀胱、胃、胆嚢、すい臓、副腎、前立腺、大腸、小腸、食道、筋肉、乳腺、胸腺、リンパ節、神経、気管、眼球、骨、心臓、脂肪、生殖器（例えば卵巣、子宮、精巣、精嚢腺）、胚又は甲状腺を例示することができるが、脾臓、骨髄、肝臓を好ましく例示することができる。
上記ヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する体細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織由来間質細胞、脂肪組織由来間質幹細胞、神経幹細胞、***幹細胞等の組織幹細胞や、組織前駆細胞や、筋肉細胞、線維芽細胞、上皮細胞、リンパ球、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ミエロイド細胞などを挙げることができる。
上記ヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する生殖細胞としては、マウスの***、卵子を挙げることができる。
前記遺伝子改変免疫不全マウス（II）としては、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスと、ヒトＩＬ−１５遺伝子が導入された遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）とを交配することにより作出された、遺伝子改変免疫不全マウス（II）であれば特に制限されず、ヒトＩＬ−１５遺伝子が導入された遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）としては、ＮＯＧマウスにヒトＩＬ−１５遺伝子を導入したＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウス（「ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウス」ともいう）（例えば、特開２０１６−２２０５５９公報参照）を具体的に挙げることができる。また、ヒト細胞生着免疫不全マウス（II）としては、上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）にヒト末梢血単核球やヒトＮＫ細胞をはじめとするヒト細胞が生着しているマウスを挙げることができる。かかる遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）も本発明のマウスに含めることができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）にヒトＮＫ細胞を移植した、ヒト細胞生着免疫不全マウス（II）としては、ｈＣＤ５６＋細胞が、生着したｈＣＤ４５＋細胞の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上検出されるマウスが望ましく、遺伝子改変免疫不全マウス（II）としては、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを好適に例示することができる。上記ｈＣＤ５６＋細胞が存在するか否かは、例えば、抗ｈＣＤ５６抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析により確認することができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）においては、マウス貪食細胞に影響されることなくヒトＮＫ細胞のみがエフェクター細胞となり、ＡＤＣＣ活性を評価することができる。
すなわち、上記ヒトＮＫ細胞がエフェクター細胞となった、上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）においては、マウスＦｃｇＲを介して作用するマウス貪食細胞が、がん抗原特異的なヒト抗体に結合した腫瘍に対するＡＤＣＣ活性を示さない。したがって、遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）を用いて、腫瘍に対する抗体医薬の候補薬剤のスクリーニングを行うことができる。
例えば、遺伝子改変免疫不全マウス（II）にヒトがん細胞を移植後、ヒトＮＫ細胞と、抗体医薬の候補薬剤としてがん抗原特異的なヒト抗体とを投与することにより、ヒトＮＫ細胞のみがエフェクター細胞である場合のヒトがん細胞に対するＡＤＣＣ活性を評価することができる。具体的には、遺伝子改変免疫不全マウス（II）にヒトがん細胞を移植後、ヒトＮＫ細胞と上記候補薬剤とを投与し、がん細胞が局在する組織の重量増加が抑制された場合に、当該候補薬剤が、がん細胞に対する抑制効果を有すると判定することができる。同様の判定基準により、ＮＫ細胞が生着したヒト細胞生着免疫不全マウス（II）にヒトがん細胞を移植後、がん抗原特異的なヒト抗体を抗体医薬の候補薬剤として投与することにより、ヒトＮＫ細胞のみがエフェクター細胞である場合のヒトがん細胞に対するＡＤＣＣ活性を評価し、上記候補薬剤のスクリーニングを行うことができる。
また、本発明は、上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する組織や体細胞や生殖細胞にも関する。上記候補薬剤のスクリーニングは、かかる組織や体細胞や生殖細胞を用いて行うこともできる。
上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する組織としては、肝臓、脾臓、脳、腎臓、肺、皮膚、膀胱、胃、胆嚢、すい臓副腎、前立腺、大腸、小腸、食道、筋肉、乳腺、胸腺、リンパ節、神経、気管、眼球、骨、心臓、脂肪、生殖器（例えば卵巣、子宮、精巣、精嚢腺）、胚又は甲状腺を例示することができるが、脾臓、骨髄、肝臓を好ましく例示することができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する体細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織由来間質細胞、脂肪組織由来間質幹細胞、神経幹細胞、***幹細胞等の組織幹細胞や、組織前駆細胞や、筋肉細胞、線維芽細胞、上皮細胞、リンパ球、血液細胞、及びこれらの細胞からの分化したＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ミエロイド細胞などを挙げることができる。
上記遺伝子改変免疫不全マウス（II）やヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する生殖細胞としては、***、卵子を挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
［ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの作出］
ＮＯＧマウスを実験動物中央研究所から入手した。ＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌマウス（ＮＯＤ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス）の凍結保存胚（ＲＢＲＣ０２３３０）を、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣを介して入手した。
（ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの作出手順）
上記ＮＯＧマウスと、上記ＮＯＤ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌＦｃｇｒ２ｂｎｕｌｌマウスとから、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを、以下の工程により作出した。
（１）（第０世代（Ｆ＝０）〜第１世代（Ｆ＝１）
凍結保存胚から個体復元した雄のＮＯＤ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを、雌のＮＯＧマウスと交配することにより、４匹の雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄ／＋，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／＋−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋マウス（Ｆ＝１）を得た。
（２）（第１世代〜第２世代）
かかる４匹の雌の各マウスについて、ＮＯＧマウスと戻し交配し、２匹の雄のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／Ｙ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋マウス、２匹の雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋マウス（以下「ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス（遺伝子型）」と総称する）を得た。
（３）（第２世代〜第３世代））
かかるＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス同士を兄妹交配し、雄のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／Ｙ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ，Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌと、雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ，Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌを選択し、「ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス（遺伝子型）、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯマウス（表現型）」を得た。
上記各工程における、マウスの遺伝子検査は、マウスの組織片に１００μｇ／ｍＬのプロテインキナーゼＫ含有Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加して５５℃で溶解させた後、８５℃で加熱して調製した組織溶解液を用い、各遺伝子について、野生型かヘテロ欠損型かホモ欠損型等について以下のプライマーを用いてＰＣＲ法にて測定することにより検証を行った。
（１）Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー
５’−ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号１）（Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー１）
５’−ＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号２）（Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー２）
５’−ＧＧＣＴＧＧＣＴＡＴＡＧＣＴＧＣＣＴＴＴＣ−３’（配列番号３）（Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー３）
(Ｆｃｅｒ１ｇ検査用ＰＣＲ反応液)
１２．５μＬ Ｇｏ−Ｔａｑ用 ×２ ｂｕｆｆｅｒ
１．０μＬ Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー１ （５μＭ）
１．０μＬ Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー２ （５μＭ）
１．０μＬ Ｆｃｅｒ１ｇ検査用プライマー３ （５μＭ）
８．０μＬ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｈ２Ｏ
１．５μＬ ゲノムＤＮＡ(組織溶解液)
上記の試薬を混合して、ＰＣＲ反応液を調製した。
（ＰＣＲ増幅条件）
２５μＬの上記ＰＣＲ反応液を用い、９４℃にて３分の加熱処理；９４℃にて３０秒、６３℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３５サイクル；その後７２℃にて３分加熱処理；の条件で増幅処理が行われた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動に供し、目的のバンドサイズ付近の増幅産物バンドの有無を確認することにより、各マウスにおける標的遺伝子が野生型かＫＯ型かを判定した。すなわち、上記ＰＣＲ産物が、２４０ｂｐサイズであればＦｃｅｒ１ｇ ＫＯと判定し、１９８ｂｐサイズであればＦｃｅｒ１ｇ野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）（＋）と判定した。
（２）Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー
５’−ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号４）(Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー１）
５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＣＣＧＴＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５）(Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー２）
５’−ＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＡＡＣＧＴＧＴＡＧ−３’（配列番号６）（Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー３）
(Ｆｃｇｒ２ｂ検査用ＰＣＲ反応液）
１２．５μＬ Ｇｏ−Ｔａｑ用 ×２ ｂｕｆｆｅｒ
１．０μＬ Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー１ （５μＭ）
１．０μＬ Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー２ （５μＭ）
１．０μＬ Ｆｃｇｒ２ｂ検査用プライマー３ （５μＭ）
８．０μＬ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｈ２Ｏ
１．５μＬ ゲノムＤＮＡ(組織溶解液)
上記の試薬を混合して、ＰＣＲ反応液を調製した。
（ＰＣＲ増幅条件）
２５μＬの上記ＰＣＲ反応液を用い、９４℃にて３分の加熱処理；９４℃にて３０秒、６３℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３５サイクル；その後７２℃にて３分加熱処理；の条件で増幅処理が行われた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動に供し、目的のバンドサイズ付近の増幅産物バンドの有無を確認することにより、各マウスにおける標的遺伝子が野生型かＫＯ型かを判定した。すなわち、上記ＰＣＲ産物が、２３２ｂｐサイズであればＦｃｇｒ２ｂ ＫＯと判定し、１６１ｂｐサイズであればＦｃｇｒ２ｂ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（＋）と判定した。
（３）ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー
５’−ＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号７）（ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー１）
５’−ＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴ−３’（配列番号８）（ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー２）
５’−ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＴＡＧ−３’（配列番号９）（ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー３）
(ＩＬ−２ｒｇ検査用ＰＣＲ反応液)
７．５μＬ ＰＣＲバッファー(with dNTP, MgCl2) ×２ ｂｕｆｆｅｒ
０．１５μＬ ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー１ （２０μＭ）
０．１５μＬ ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー２ （２０μＭ）
０．１５μＬ ＩＬ−２ｒｇ検査用プライマー３ （２０μＭ）
０．３μＬ Tks Gflex ＤＮＡポリメラーゼ (１．２５Ｕ/μＬ)
５．２５μＬ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｈ２Ｏ
１．５μＬ ゲノムＤＮＡ(組織溶解液)
上記の試薬を混合して、ＰＣＲ反応液を調製した。
（ＰＣＲ増幅条件）
２５μＬの上記ＰＣＲ反応液を用い、９４℃にて３分の加熱処理；９８℃にて１０秒、６５℃にて１５秒、６８℃にて３０秒を１サイクルとして３０サイクル；その後６８℃にて３分加熱処理；の条件で増幅処理が行われた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動に供し、目的のバンドサイズ付近の増幅産物バンドの有無を確認することにより、各マウスにおける標的遺伝子の野生型がＫＯ型かを判定した。すなわち、上記ＰＣＲ産物が、３４０ｂｐサイズであればＩＬ−２ｒｇ ＫＯと判定し、６６０ｂｐサイズであればＩＬ−２ｒｇ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（＋）と判定した。
（４）ｓｃｉｄ検査用プライマー
５’−ＧＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴ−３’（配列番号１０）（ｓｃｉｄ検査用プライマー１）
５’−ＴＴＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１１）（ｓｃｉｄ検査用プライマー２）
５’−ＡＣＧＣＴＡＡＧＣ−３’（配列番号１２）（ｓｃｉｄ検査用プライマー３）
５’−ＣＧＣＴＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１３）（ｓｃｉｄ検査用プライマー４）
(ｓｃｉｄ検査用ＰＣＲ反応液)
５．０μＬ ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ×２ ｂｕｆｆｅｒ
０．２μＬ ｓｃｉｄ検査用プライマー１（１０μＭ）
０．２μＬ ｓｃｉｄ検査用プライマー２（１０μＭ）
０．４μＬ ｓｃｉｄ検査用プライマー３（５μＭ）
０．４μＬ ｓｃｉｄ検査用プライマー４（５μＭ）
０．２μＬ ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ （５０ｘ）
３．１μＬ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｈ２Ｏ
０．５μＬ ゲノムＤＮＡ(組織溶解液)
上記試薬を混合して、ＰＣＲ反応液を調製した。
（ＰＣＲ増幅条件）
１０μＬの上記ＰＣＲ反応液を用い、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ rｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙを実施した。９５℃にて１０秒の加熱処理；９５℃にて５秒、５５℃にて１０秒、７２℃にて３１秒を１サイクルとして４５サイクル；の条件で増幅処理が行われた。増幅反応のThreshold cycles (Ct)値から、このｓｃｉｄ検査用プライマー１・２・３を組み合わせて、Real-time ＰＣＲを行った場合に増幅反応が認められた場合をＳｃｉｄ変異あり、ｓｃｉｄ検査用プライマー１・２・４を組み合わせて、Real-time ＰＣＲを行った場合に増幅反応が認められた場合をＳｃｉｄ変異なし（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（＋））と判定した。
［実施例２］
［ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの特性］
（ＩｇＧ抗体受容体ＦｃｇＲの欠損）
上記作出されたＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、ＦｃｇＲ分子の発現が消失しているか否かについて検証を行った。ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの末梢血を採取し、赤血球溶血反応液で反応させて赤血球を除去することにより白血球分画を得た。かかる白血球分画を以下に示す蛍光色素標識抗原特異抗体を用いて抗体染色をした後、フローサイトメトリー（装置名：BD LSRFortessaTM X-20、Becton Dickinson社製）により蛍光強度を測定することにより、ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５（ｍＣＤ４５）＋白血球中における、ｍｏｕｓｅ ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩ（ｍＣＤ１６／３２）の有無、及びｍＦｃｅＲＩ分子の発現及びｍＣＤ４５＋白血球中における割合を検証した。上記ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス及びＮＯＧマウスについても同様の実験を行い、比較対象とした。結果を図１及び図２に示す。
ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体及び抗体の非特異結合を抑制するためのＦｃｇＲブロッキング抗体は、以下のとおりである。
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ１６／３２（ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩ）抗体（BioLegend社）
（結果）
これ以降、実施例の記載や図面において、ＮＯＧマウスを「＋／＋」：ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／＋Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／＋（ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋）マウスを「ＫＯ／＋」；ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ−Ｆｃｅｒ１ｇｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ，Ｆｃｇｒ２ｂｎｕｌｌ／ｎｕｌｌ（ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ）マウスを「ＫＯ／ＫＯ」と表すことがある。
図１から明らかなとおり、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス（ＫＯ／ＫＯ）（図１（ｄ））においては、ｍＣＤ４５＋白血球中において、ｍＦｃｇＲＩＩＩやｍＦｃｇＲＩＩは消失していた。一方、ＮＯＧマウス（図１（ｂ））及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス（図１（ｃ））においては、ｍＦｃｇＲＩＩＩ及びｍＦｃｇＲＩＩが発現していることが確認された。図２においても同様の結果が示された。
［実施例３］
（ヒトＩｇＧ抗体結合能）
ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、ＦｃｇＲ分子の発現が消失していることにより、ヒトＩｇＧ抗体への結合能が消失しているか否かについて検証を行った。ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに、ヒトＩｇＧ型抗体医薬トラスツズマブ１００μｇを腹腔内へ投与した後、３日目に末梢血を採取し、実施例２と同様の方法で白血球分画を得た。かかる白血球分画を以下に示す蛍光色素標識抗原特異抗体を用いて抗体染色をした後、前記装置を用いてフローサイトメトリーにより蛍光強度を測定することにより、ｍＣＤ４５＋白血球中のＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋単球／マクロファージ分画における、ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩ（ｍＣＤ１６／３２）の発現及びヒトＩｇＧ抗体の結合の有無を検証した。上記ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについても同様の実験を行い、比較対象とした。さらに、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスに上記ヒトＩｇＧ型抗体医薬を投与しないものをネガティブコントロールとした。結果を図３に示す。
ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は、以下のとおりである。
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（BioLegend社）、
ＰＥ標識抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（BioLegend社）、
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ１６／３２（ＦｃｇＲIII/II）抗体（BioLegend社）、
ＡＰＣ標識抗マウスＦ４／８０抗体（eBioscience社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
（結果）
図３（ｃ）から明らかなとおり、ヒト抗体投与ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、ｍＣＤ４５＋白血球中のＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋単球／マクロファージ分画において、ヒトＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩの陽性分画、及びヒトＩｇＧ抗体は検出されず、ヒトＩｇＧとマウスＦｃｇＲの結合は確認されなかった。一方、図３（ｂ）から明らかなとおり、ヒトＩｇＧ抗体投与ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスでは、ｍＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋単球／マクロファージ分画において、ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩが陽性である細胞の中にヒトＩｇＧ＋の分画が検出され、投与されたヒトＩｇＧはマウスＦｃｇＲに結合していることが確認された。他方、ネガティブコントロールにおいては、ＦｃｇＲＩＩＩ／ＩＩは陽性であったが、ヒトＩｇＧ抗体は検出されなかった（図３（ａ））。以上より、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、ヒトＩｇＧ型抗体に対する抗体結合能が喪失していることが確認された。
［実施例４］
（マウス抗体代謝能）
上記ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、ＦｃｇＲ分子の欠損により、マウス抗体の代謝能が変化するかを検証した。ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに、マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＩｇＧ１、ｃｌｏｎｅ ＭＯＰＣ−２１）をマウスの腹腔内へ１００μｇもしくは２０μｇ投与した後、１２週間にわたり継時的に血液を採取し、血漿分画を得た。得られた血漿中のマウスＩｇＧ抗体の濃度を、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｔ（Bethyl laboratories, Inc社製）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについても同様の実験を行い、比較対象とした。結果を図４に示す。
（結果）
図４（ｂ）から明らかなとおり、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにマウスＩｇＧ１抗体を１００μｇ投与した場合、マウスＩｇＧ１抗体は、投与後１週目で血漿中での濃度が最大値となり、その後徐々に減少したが、１２週目でも検出された。ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスと比較した場合においても、抗体濃度に違いは認められなかった（図４（ａ））。したがって、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおけるＦｃｇＲ分子の欠損は、マウス抗体の代謝速度に影響を与えないことが確認された。また、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスのみに着目し、マウスＩｇＧ１の１００μｇ投与群と２０μｇ投与群を比較すると、２０μｇ投与群の方が血漿中の抗体濃度が低値であることから、血漿中のマウスＩｇＧ濃度は抗体投与量に依存的であることが確認された（図４（ｃ））。
［実施例５］
（ヒト抗体代謝能）
上記ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、ＦｃｇＲ分子の欠損によりヒト抗体の代謝能が変化するかを検証した。ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに、ヒトＩｇＧモノクローナル抗体として以下に示す市販の抗体医薬３種類をマウスの腹腔内へそれぞれ１００μｇ投与した後、２８日間にわたり継時的に血液を採取し、血漿分画を得た。得られた血漿中の各ヒトＩｇＧ抗体の濃度を、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｔ （Bethyl laboratories, Inc社製）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス及びＮＯＧマウスについても同様の実験を行い、比較対象とした。結果を図５に示す。
ここで使用した抗体医薬は、以下のとおりである。
リツキシマブ（Rituximab）：抗ＣＤ２０モノクローナル抗体：Ｒｉｔｕｘａｎ（中外製薬株式会社製）；
トラスツズマブ（Trastuzumab）：抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体ハーセプチン（Herceptin）（Ｈｅｒ２特異的抗体医薬品）（中外製薬株式会社製）；
モガムリズマブ（Mogamulizumab）：ヒト化抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体ポテリジオ(Poteligeo)（協和発酵キリン株式会社製）；
（結果）
図５（ａ）〜（ｃ）から明らかなとおり、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに上記３種類のヒトモノクローナル抗体をそれぞれ１００μｇ投与した場合、いずれのヒトＩｇＧ抗体も投与後２週間以内にほぼ消失した。ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにおいても上記３種類のいずれの抗体についても同じ傾向が認められた。したがって、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおけるＦｃｇＲ欠損は、ヒト抗体の代謝速度にも影響を与えないことが確認された。
［実施例６］
（マウス貪食細胞によるＡＤＣＣ活性の消失（１））
ＮＯＧマウスに投与した抗原特異的抗体が、マウスＦｃｇＲを介してマウス貪食細胞に認識されることで、貪食反応が誘導されることが知られている。そこで、ヒト固形がん細胞株を用いて、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、マウスＦｃｇＲが欠損することにより、マウス貪食細胞によるＡＤＣＣ活性が消失するか否かを検証した。
ヒト固形がん細胞株の一種であるＨｅｒ２陽性胃がん細胞株４−１ＳＴの３ｍｍ角の腫瘍塊を、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに皮下移植することにより、４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した。ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについても同様の処理を行い、４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスを調製して比較対象とした。４−１ＳＴを移植後一週間目より５０μｇのトラスツズマブを、上記各４−１ＳＴ皮下移植マウスに週２回腹腔内投与し、２２日間にわたり継時的に腫瘍サイズを測定した。また、抗体の代わりにＰＢＳを投与した上記２種類のマウスをＰＢＳ投与コントロール群とした。結果を図６に示す。
（結果１）
図６（ｂ）から明らかなとおり、４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、トラスツズマブを投与した場合２２日目の腫瘍サイズは平均８５０ｍｍ３であった。一方、４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにおいては、トラスツズマブを投与した場合２２日目の腫瘍サイズは平均１５０ｍｍ３であって、４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスと比較して、トラスツズマブ抗体投与による腫瘍抑制効果が確認された。かかる結果は、マウスＦｃｇＲを介して作用するマウス貪食細胞が、がん抗原特異的なヒト抗体に結合した腫瘍（ヒト固形がん）を認識して傷害し、腫瘍塊の成長を抑制していること、また、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいてはマウス貪食細胞によるＡＤＣＣ活性が惹起されないことを示している。
（結果２）
図６（ａ）から明らかなとおり、ＰＢＳ投与コントロール群（saline）においては、４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスと４−１ＳＴ皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスとの間で腫瘍塊の成長度合いに違いは認められず、マウスＦｃｇＲの有無が腫瘍の成長度合いに影響を与えることはないことが確認された。
［実施例７］
（マウス貪食細胞によるＡＤＣＣ活性の消失（２））
ヒト浮遊系がん細胞株を用いて、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、マウスＦｃｇＲが欠損することにより、マウス貪食細胞によるＡＤＣＣ活性が消失するか否かを検証した。ヒト浮遊系がん細胞株の一種であるＣＤ２０＋バーキットリンフォーマ株Ｄａｕｄｉ、２．４ｘ１０６個を、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの尾静脈より移植し、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した。ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについても同様の処理を行い、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧマウス及びＤａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスを調製して比較対象とした。
尾静脈より抗原特異的抗体医薬品としてＲｉｔｕｘｉｍａｂ５０μｇを、上記各マウスに週１回腹腔内投与し、定期的に採血し、抗体染色後フローサイトメトリーにより血液中のＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞を測定した。また、抗体の代わりにＰＢＳを上記各マウスに投与することによりＰＢＳ投与コントロール群とした。移植後２１日目の結果を図７に示す。
（結果）
図７（ｂ）から明らかなとおり、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを投与したＤａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、血液中のＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞は総白血球中１〜２％の割合で検出された。一方、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを投与したＤａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにおいては、血液中のＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞は総白血球中０．２％以下まで減少した。他方、図７（ａ）から明らかなとおり、ＰＢＳ投与コントロール群では、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス及びＤａｕｄｉ移植ＮＯＧマウスのいずれにおいても、血液中のＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞は総白血球中約１．５％〜約４％の頻度で検出された。
［実施例８］
（マウス貪食細胞によるＡＤＣＣ活性の消失（３））
上記Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ又はＰＢＳを投与したＤａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス、及びＤａｕｄｉ移植ＮＯＧマウスについて、Ｄａｕｄｉ移植後２３日目に剖検し、Ｄａｕｄｉ細胞が集積する腎臓を摘出し、臓器重量を測定することによりマウス貪食細胞のＡＤＣＣ活性が機能しているか否かを評価した。結果について、各マウスの腎臓の写真を図８（ａ）に、各マウスの腎臓の重量のグラフを図８（ｂ）に示す。
（結果）
図８（ａ）及び（ｂ）から明らかなとおり、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ投与群（Ｒｉｔ．）において、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、腎臓の重量は０．５ｇ前後にまで増加した。一方、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスでは、腎臓の重量は０．２ｇ前後と腎臓の肥大化が抑制されていた。ＰＢＳ投与コントロール群においては、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスともに腎臓の重量は０．５ｇ前後まで増加した。また、Ｄａｕｄｉ移植ＮＯＧマウスの腎臓の重量は０．５７ｇ程度にまで増加しており、いずれにおいてもＤａｕｄｉ集積による腎臓の肥大化が認められた。なお、成体ＮＯＧマウスの腎臓は、一般的には０．２ｇ前後であることが知られている。以上の結果は、抗原特異抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを投与しても、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、マウス貪食細胞がマウスＦｃｇＲを介してがん細胞Ｄａｕｄｉ細胞を認識・攻撃できないことを示している。
（ＡＤＣＣ活性についてのまとめ）
実施例６〜８の結果より、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、マウスＦｃｇＲを欠損することにより、マウス貪食細胞のＡＤＣＣ活性が機能しないことが示唆されている。
［実施例９］
（ヒト造血幹細胞生着能の検証１）
ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおけるヒト造血幹細胞の生着能について検証した。
（ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの調製）
７週齢以上の成体ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにＸ線を照射することで骨髄を抑制した（Ｄａｙ０）。Ｘ線照射後１日以内に５００００個のｈＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞を尾静脈より移植することにより、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した。ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについても上記同様の調製処理を行うことにより、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウス及びヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスを調製し、比較対象とした。
(フローサイトメトリーによる検証)
上記各マウスについて、ヒト造血幹細胞移植後４週、８週、１２週、１６週及び２０週経過時に末梢血を採取し、実施例２と同様の方法で白血球分画を得た。さらに、かかる白血球分画を以下に示す蛍光色素標識抗原特異抗体を用いて抗体染色をした後、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定することにより、ヒト免疫細胞ｈＣＤ４５＋細胞の割合を測定した。結果を図９に示す。
なお、実施例９〜実施例１２で使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は、以下のとおりである。
ＢＵＶ３９５標識抗ｈＣＤ３３抗体（Becton Dickinson社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ１９抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ／Ｒ７００標識抗ｈＣＤ５６抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
（結果）
図９（ａ）及び（ｂ）から明らかなとおり、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウス、及びヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスの雄（ａ）、雌（ｂ）いずれにおいても、総白血球中のｈＣＤ４５＋細胞の割合は時間の経過とともに増加し、ｈＣＤ４５＋細胞の生着が確認された。ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、ｈＣＤ４５＋細胞の生着率は比較対象のマウスよりも８〜１６週にわたり有意に大きく、また、ヒト造血幹細胞移植後２０週経過時に７５％前後の値を示し、比較対象としたマウスよりも有意に高い値を示した。一方、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにおいては、ヒト造血幹細胞移植後２０週経過時においてもｈＣＤ４５＋細胞の割合は６０％前後の値にとどまった。
［実施例１０］
（ヒト造血幹細胞生着能の検証２）
上記ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウス、及びヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、ヒト造血幹細胞移植後４週から２０週経過時までの、総白血球中のｈＣＤ４５＋細胞の詳細を調べた。結果を図１０に示す。
（結果）
図１０から明らかなとおり、上記各マウスでは、ｈＣＤ３３＋ミエロイド系細胞（雄（ａ）、雌（ｄ））、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞（雄（ｂ）、雌（ｅ））、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞（雄（ｃ）、雌（ｆ））の分画がそれぞれ検出された。したがって、マウスＦｃｇＲが欠損していても、ヒト免疫細胞の分化能に影響を与えないことが確認された。
［実施例１１］
（ヒト造血幹細胞生着能の検証３）
上記ヒト造血幹細胞移植した、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、ヒト造血幹細胞移植後２６週経過時に剖検し、造血臓器（骨髄・脾臓・血液）中に、ｈＣＤ４５＋細胞がどの程度生着しているかを、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定することにより調べた。結果を図１１に示す。
（結果）
図１１（ａ）〜（ｆ）から明らかなとおり、ヒト造血幹細胞移植後２６週経過時において、骨髄（ＢＭ）（（ａ）（ｄ））・脾臓（Ｓｐｌ）（（ｂ）（ｅ））・血液（ＰＢ）（（ｃ）（ｆ））におけるｈＣＤ４５＋細胞の割合（Human CD45+ in MNC(%)）、及び細胞数（Abs. cell number (x 106 cells）もしくは Abs. cell number (x 103 cells/μL)）は、ヒト造血幹細胞移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウス間で、有意差は認められなかった。
［実施例１２］
（ヒト造血幹細胞生着能の検証４）
ひきつづき、剖検した各マウスについて、造血臓器（骨髄・脾臓・血液）中のｈＣＤ４５＋細胞の中でｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、ｈＣＤ３３＋ミエロイド細胞、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞の占める割合（Freq. of hCD45 (%）)、及び血液１μＬ中の各細胞の細胞数（Abs. cell number (x 103 cells/μＬ)）を調べた。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ解析を行った結果を図１２に示す。
（結果）
図１２から明らかなとおり、上記ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウス、及びヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスでは、ｈＣＤ３３＋ミエロイド系細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞のいずれの分画も検出されたが、特に脾臓のｈＣＤ１９＋Ｂ細胞（ｅ）については、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、ＮＯＧマウスの２．５倍以上、ＫＯ／＋マウスの１．２倍以上という顕著に多い細胞数が検出された。
［実施例１３］
（Ｔ細胞亜集団の分化）
一般的に、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞は、さらにＣＤ４＋Ｔ細胞・ＣＤ８＋Ｔ細胞・ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（double positive：ＤＰ）Ｔ細胞の亜集団に分けられることが知られている。そこで、上記ヒト造血幹細胞を移植した、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについて、末梢血採取試料について以下に示す蛍光色素標識抗原特異抗体を用いて抗体染色をした後、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定することにより、Ｔ細胞亜集団の分化の状況を評価した。結果を図１３に示す。
なお、ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は、以下のとおりである。
ＰＥ標識抗ｈＣＤ４抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ８ａ抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ６０５標識抗ヒトＰＤ−１（ＣＤ２７９）抗体（BioLegend社）
（結果）
図１３から明らかなとおり、ヒト造血幹細胞移植した、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスのいずれにおいても、ｈＣＤ４＋Ｔ細胞・ｈＣＤ８＋Ｔ細胞・ｈＣＤ４＋ｈＣＤ８＋ｈＤＰ Ｔ細胞の亜集団が正常に分化しており、血液免疫系の再構築が確認された（図１３（ａ））。さらに、ヒトＴ細胞に発現するＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １（ＰＤ−１）タンパク分子ｈＰＤ−１の発現を見たところ、ｈＣＤ４＋分画においてさらにｈＰＤ−１分子が発現していることが確認された（図１３（ｂ））。
したがって、ＦｃｇＲの欠損によってもこれらの機能は影響を受けないことを確認した。
［実施例１４］
（ヒト血液免疫系が再構築されたＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおけるヒト免疫細胞に対するマウスのＡＤＣＣ活性の検証）
７週齢以上の成体ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにＸ線を照射することで骨髄を抑制し、Ｘ線照射後１日以内に５００００個のヒト造血幹細胞を尾静脈より移植することにより、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した。ヒト造血細胞移植後１６週経過時に、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞の分化を確認したマウスについて、ヒトＴ細胞に発現するＰＤ−１タンパク分子を特異的に認識する抗ヒトＰＤ−１抗体（ＯＰＤＩＶＯ） (Bristol-Myers Squibb社製)を、ヒト造血幹細胞移植後１８週、１９週、及び２０週経過時に週１回計３回、各１００μｇ投与した後、マウスを剖検し、骨髄・脾臓・血液の各造血組織中の、ヒトＴ細胞を含めたヒト免疫細胞の増減を、フローサイトメトリーにより解析した。ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウス、及びヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスについても同様の処理を行い、比較対象とした。結果を図１４に示す。
なお、ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は以下のとおりである。
ＰＥ標識抗ｈＣＤ４抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ８ａ抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ１９抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ−Ｒ７００標識抗ｈＣＤ１９抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ−Ｒ７００標識抗ｈＣＤ５６抗体（Becton Dickinson社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ６０５標識抗ヒトＰＤ−１（ＣＤ２７９）抗体（BioLegend社）
ＢＵＶ３９５標識抗ｈＣＤ３３抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
（結果）
図１４（ａ）〜（ｃ）から明らかなとおり、ＯＰＤＩＶＯを投与した各マウスの骨髄・脾臓・血液におけるｈＣＤ４５＋細胞の割合（ｈＣＤ４５＋in MNC （％））に関しては、いずれの臓器でも有意差は認められなかった。一方、図１４（ｅ）から明らかなとおり、脾臓においては、ＯＰＤＩＶＯを投与したヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、ＯＰＤＩＶＯを投与した、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウスの４．２倍、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスの２．２倍以上のｈＣＤ４５＋細胞数(Abs. cell number (x10 6 cells))が検出され、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいてｈＣＤ４５＋細胞数が減少することなく生着したことが示された。
［実施例１５］
上記ＯＰＤＩＶＯを投与した各ヒト造血幹細胞移植マウスを解析して、ｈＣＤ４５＋細胞の詳細を調べた。結果を図１５に示す。
（結果）
図１５から明らかなとおり、上記ＯＰＤＩＶＯを投与した各マウスのいずれにおいてもｈＣＤ３＋Ｔ細胞、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞、ｈＣＤ３３＋ミエロイド系細胞、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞の各分画が検出された。また、ＯＰＤＩＶＯ投与ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスは、脾臓（図１５（ｂ））及び末梢血（図１５（ｃ））においてｈＣＤ３＋Ｔ細胞が減少することなく生着し、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合がＮＯＧマウスの２倍以上多かった。また、脾臓（図１５（ｅ））において、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞数がＮＯＧマウスの３倍以上であり、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞もＮＯＧマウスの３倍以上であった。
［実施例１６］
上記検出された脾臓のｈＣＤ４５＋細胞中のｈＣＤ３＋Ｔ細胞について、さらに、Ｔ細胞のサブセットを検証した。結果を図１６に示す。
（結果）
図１６から明らかなとおり、ＯＰＤＩＶＯ投与ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスは、ＯＰＤＩＶＯを投与した、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ及びヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスと比較して、脾臓においてｈＣＤ４５＋細胞中のｈＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が有意に高く、ＮＯＧマウスやＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスの３倍以上であった。ｈＣＤ４＋Ｔ細胞数もＮＯＧマウスやＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスの８倍以上であり、ｈＣＤ８＋Ｔ細胞数もＮＯＧマウスやＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスの４倍以上であり、Ｔ細胞サブセット細胞数も有意に多かった。
（実施例１４〜実施例１６のまとめ）
これらの結果は、ＮＯＧマウス及びＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスでは、マウスＦｃｇＲ分子が存在するので抗ＰＤ−１抗体によりｈＰＤ−１＋Ｔ細胞がマウス生体から除去されるが、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスではＦｃｇＲ分子が欠損しているので、抗ＰＤ−１抗体依存性のヒトＴ細胞の除去が起こらないことを示唆する。
［実施例１７］
（ヒト末梢血由来単核球分画（Peripheral blood derived monoclonal cells:ＰＢＭＣ）生着能の検証）
ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおけるヒトＰＢＭＣの生着能について検証した。７週齢以上の成体ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに、１５０００００個又は２５０００００個のヒトＰＢＭＣをマウス尾静脈より移植することにより、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した。ＮＯＧマウスについても上記同様の調製処理を行うことにより、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスを調製し、比較対象とした。
(フローサイトメトリーによる検証）
上記各マウスについて、ヒトＰＢＭＣ移植後２週、４週、５週及び／又は６週経過時に採血を行い、実施例２と同様の方法で白血球分画を得た。さらに、白血球分画を以下に示す蛍光色素標識抗原特異抗体を用いて抗体染色をした後、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定することにより、ヒト免疫細胞ｈＣＤ４５＋細胞の割合を測定した。結果を図１７に示す。
なお、ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は、以下のとおりである。
ＦＩＴＣ標識抗ｈＣＤ３３抗体（BioLegend社）
ＰＥ標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ１９抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
ＦＩＴＣ標識抗ｈＣＤ４抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ１９抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ標識抗ｈＣＤ１９抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ−Ｒ７００標識抗ｈＣＤ５６抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
（結果）
図１７（ａ）及び（ｂ）から明らかなとおり、ヒトＰＢＭＣを２５０００００個移植したＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスのいずれにおいても、ｈＣＤ４５＋細胞の生着を確認したが、細胞生着率はヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスでは４週目ではほぼ平均１０％前後であったのに対し、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、４週目に平均４８％となっており、４週目という早い時期でＮＯＧマウスと比較して３．５倍以上の値を示した。また、移植細胞数を減らしてヒトＰＢＭＣを１５０００００個移植して２週目で評価を行った場合、図１７（ｃ）から明らかなとおり、細胞生着率は、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスでは０．５％未満であったのに対し、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは１〜８％であってＮＯＧマウスの２〜１６倍であった。また、図１７（ｄ）から明らかなとおり、生着細胞数は、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスは５０−２００／μＬであるのに対し、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスでは１０／μＬ前後であることから、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスと比較してヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、特にＰＢＭＣ移植後早い時期において、また、ＰＢＭＣの移植数が通常行われているよりも少ない数でも、ＮＯＧマウスと比較して有意に高いことが確認された。
［実施例１８］
（ヒトＰＢＭＣ生着能）
上記ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウス及びヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスについて、ヒトＰＢＭＣ移植後４週経過時に、末梢血におけるｈＣＤ４５＋細胞の詳細を調べた。結果を図１８に示す。
なお、ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は、以下のとおりである。
ＦＩＴＣ標識抗ｈＣＤ４抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ１９抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ標識抗ｈＣＤ８ａ抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ−Ｒ７００標識抗ｈＣＤ５６抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
（結果）
図１８（ａ）及び（ｃ）から明らかなとおり、上記ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲＫＯ／ＫＯマウスにおいてｈＣＤ４５＋細胞の９７％以上は、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞で占められていることが確認された。１５０００００個のヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスでは、ｈＣＤ３＋Ｔ細胞の割合は７５％程度であった。図１８（ｂ）及び（ｄ）から明らかなとおり、Ｔ細胞亜集団については、上記いずれのヒトＰＢＭＣ移植マウスにおいてもＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ Ｔ細胞のいずれの分画も検出された。
［実施例１９］
（ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおけるヒト免疫細胞に対する抗体反応性）
ｈＣＤ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる解析により、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウス及びヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにおいて増殖したヒトＰＢＭＣ由来ｈＣＤ３＋細胞は、大部分がＰＤ−１分子を発現しており、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいても同様にＰＤ−１分子が発現していることが示された（図１９（ａ））。さらに、抗ヒトＰＤ−１抗体（マウスＩｇＧ１タイプ（ｃｌｏｎｅ Ｊ１１６））を、ＰＢＭＣ移植後５週目、６週目、７週目に上記各マウスに５０μｇずつ投与することにより、ヒトＰＤ−１＋Ｔ細胞に対する細胞傷害が誘導されるか否かを検証した。結果を図１９（ｂ）に示す。
（結果）
図１９（ｂ）から明らかなとおり、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは抗ヒトＰＤ−１抗体（マウスＩｇＧ１タイプ）を投与しても、ｈＣＤ４５＋細胞中のヒトＴ細胞の割合の減少は起こらなかった。一方、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウス及びヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスでは、ｈＣＤ４５＋細胞中のヒトＴ細胞の割合が非常に低くなった。したがって、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、ＦｃｇＲ分子が欠損しているので、抗ヒトＰＤ−１抗体依存性のヒトＴ細胞の除去が起こらないことが確認された。
［実施例２０］
（ハイブリッド型動物モデルの樹立）
ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスに、マウス生体内でヒトＮＫ細胞を増幅・維持することができるＮＯＧ-ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを掛け合わせることにより、両者の特性を有する動物モデルの作製を試みた。すなわち、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスとＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを交配し、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ，ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを作製した。
［実施例２１］
（in vitro培養して増幅させたヒト末梢血由来ＮＫ細胞（Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞）の生着能の検証）
ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ，ｈＩＬ−１５ ＴｇマウスにおけるヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞の生着能について検証した。７週齢以上の成体ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ，ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスに、３８５００００個のヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞をマウス尾静脈より移植することにより、ヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ, ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウス（ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ，ｈＩＬ−１５ Ｔｇ）を調製した。ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスについても上記同様の調製処理を行うことにより、ヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウス（ＦｃｇＲ＋/＋，ｈＩＬ−１５ Ｔｇ）を調製し、比較対象とした。
上記ヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ, ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス及びヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスについて、ヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞移植後２週経過時に末梢血を採取し、ｈＣＤ４５＋細胞の生着性を調べた。結果を図２０に示す。
なお、ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は、以下のとおりである。
ＡＰＣ−Ｒ７００標識抗ｈＣＤ５６抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
（結果）
図２０（ａ）から明らかなとおり、上記いずれのヒトＥｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞移植マウスにおいてもｈＣＤ４５＋細胞の生着が認められた。また、図２０（ｂ）から明らかなとおり、ｈＣＤ４５＋細胞の８０％以上は、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞で占められていることが確認された。これらの結果は、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスは、ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスの特性である、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈＣＤ５６＋細胞がインビボで長期に検出できるという、ヒトＮＫ細胞の生着性を保有していることを示唆している。
上記ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ，ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスに、Ｄａｕｄｉ １５０００００個を尾静脈より移植した。移植３日後に、in vitro培養して増幅させたヒト末梢血由来ＮＫ細胞（Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＮＫ細胞）を８５０００００個尾静脈より移植して、さらにヒト抗体医薬である抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ ２５μｇを週１回腹腔内に投与した。３週間後に、腎臓の重量を測定し、評価した。別途ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを交配してＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋，ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスを作製したうえでＤａｕｄｉ １５０００００個を尾静脈より移植し、また、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋マウスにもＤａｕｄｉ １５０００００個を尾静脈より移植し、ともに比較対象とした。
結果を図２１に示す。
図２１から明らかなとおり、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／＋（−ｎｏｎ−Ｔｇ）マウスでは、リツキシマブ投与により腎臓の重量は抑制された。反対に、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ，ｎｏｎ−Ｔｇマウスではリツキシマブ投与群でも、腎臓の重量の増加は認められた。さらに、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスでは、ＮＫ細胞移植のみもしくはリツキシマブの単独投与では腎臓重量は増加したままであったが、両者を投与することで腎臓の肥大化が抑制されていた。これらの結果は、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯ ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスは、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスとＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスの各々の特性を有しており、マウス貪食細胞に影響されること
なくヒトＮＫ細胞のみをエフェクター細胞として、がん抗原特異的なヒト抗体に結合した腫瘍に対するＡＤＣＣ活性を評価することができることを示唆している。
［実施例２２］
以下、遺伝子改変免疫不全マウスに、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞を共存させ、さらに抗ヒト抗体の生理活性を評価できるかどうかを検討した。すなわち、ヒト細胞生着免疫不全マウスを用いて、免疫チェックポイント阻害剤として働く抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の活性や作用機序の評価を行った。
（免疫チェックポイント阻害剤の腫瘍抑制反応の亢進機能の検証）
ヒト血液免疫系が再構築されたＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおける、ヒト免疫チェックポイント阻害剤の機能の評価を行った。免疫チェックポイント阻害剤として、抗ヒトＰＤ−１抗体、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ブリストルマイヤーズ・スクイーブ社製）を用いた。８週齢以上の成体ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにＸ線を照射することで骨髄を抑制し、Ｘ線照射後１日以内に５００００個のヒト造血幹細胞を尾静脈より移植することにより、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した。ヒト造血幹細胞移植後１６週以上経過し、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の分化を確認したヒト造血幹細胞移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスについて、ヒト造血幹細胞移植後２４週経過時にヒト頭頸部扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ−４（１５０００００個）を皮下移植することにより、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスを調製した（図２２におけるｄａｙ０）。
上記マウスに２００μｇのニボルマブをＨＳＣ−４移植後１週間毎に腹腔内へ投与した。ＨＳＣ−４移植後７日、１４日、２１日、２８日経過時に腫瘍サイズを計測した。ＮＯＧマウスについても上記同様の手順により、ヒト造血幹細胞移植ＮＯＧマウスを調製し、次いでＨＳＣ−４移植ＮＯＧ（−ＦｃｇＲ＋／＋）マウスを調製した。また、抗体の代わりにＰＢＳを投与した上記２種類のマウスをＰＢＳ投与コントロール群とした。腫瘍サイズの測定の結果を図２２に示す。
（結果）
図２２（ｂ）から明らかなとおり、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、ＰＢＳを投与した場合２８日目の腫瘍サイズは平均１３００ｍｍ３であった。一方、ニボルマブを投与した場合２８日目の腫瘍サイズは平均６００ｍｍ３であって、ＰＢＳ投与群と比較して、ニボルマブ抗体投与による腫瘍抑制効果が確認された。他方、図２２（ａ）から明らかなとおり、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ＋／＋マウスにおいては、２８日目の腫瘍サイズはＰＢＳを投与した場合もニボルマブを投与した場合も平均１０００ｍｍ３であって、ニボルマブ抗体投与による腫瘍抑制効果は確認されなかった。この結果は、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、免疫チェックポイント阻害剤による腫瘍抑制反応を亢進させる機能が検出されたが、ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ（−ＦｃｇＲ＋／＋）マウスでは、腫瘍抑制反応を亢進させる機能が検出されなかったことを示し、上記ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞を共存するＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいて、腫瘍抑制反応を亢進させる機能等の生理活性を評価できることが確認された。
［実施例２３］
（ヒト免疫チェックポイント阻害剤のＴ細胞浸潤の亢進機能の検証）
上記ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスについて、ヒト造血幹細胞移植後２８週経過時に採血を行い、ヒト造血細胞移植後２８週経過時（抗ヒトＰＤ−１抗体（ニボルマブ）の最終投与を行った翌日）にマウスを剖検し、脾臓と腫瘍を採取した。腫瘍・脾臓・血液の各組織中の、ヒトＴ細胞を含めたヒト免疫細胞の増減を、フローサイトメトリーにより解析した。さらに血液と脾臓に関しては、実施例２と同様の方法で白血球分画を得た。ＨＳＣ−４移植ＮＯＧ（−ＦｃｇＲ＋／＋）マウスについても同様の処理を行い、比較対象とした。
なお、上記腫瘍は、１ｍｇ／ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ（シグマ社製）／１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（シグマ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen社製）培地内で細断し、さらにｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｒ（Miltenyi Biotec社製）を用いて懸濁しながら３７℃にて計６０分間反応することで細胞を単離させ、細胞浮遊分画から白血球分画を得た。さらに、白血球分画を以下に示す蛍光色素標識抗原特異抗体を用いて抗体染色をした後、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定することにより、ヒト免疫細胞ｈＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合を測定した。結果を図２３に示す。
なお、ここで使用した蛍光色素標識抗原特異抗体は以下のとおりである。
ＦＩＴＣ標識抗ｈＣＤ４４抗体（BioLegend社）
ＰＥ標識抗ｈＰＤ−１抗体（BioLegend社）
ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ８ａ抗体（BioLegend社）
ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識抗ｍＣＤ４５抗体（BioLegend社）
ＡＰＣ標識抗ｈＣＤ６９抗体（BioLegend社）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−Ｒ７００標識抗ｈＣＤ１９抗体（Becton Dickinson社）
ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ｈＣＤ４抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１標識抗ｈＣＤ３抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ｈＣＤ４５抗体（BioLegend社）
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ６０５標識抗ヒトＰＤ−１（ＣＤ２７９）抗体（BioLegend社）

（結果１）
図２３（ａ）から明らかなとおり、ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、ＰＢＳを投与した場合、腫瘍内に浸潤した単核球分画中でヒトＴ細胞が占める割合は平均１２％だが、ニボルマブを投与した場合のヒトＴ細胞が占める割合は３０％であって、ＰＢＳ投与群と比較して、ニボルマブ抗体投与による腫瘍内へのヒトＴ細胞浸潤の亢進が確認された。一方、ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ＋／＋マウスにおいては、ＰＢＳを投与した場合、腫瘍内に浸潤した単核球分画中でヒトＴ細胞が占める割合は平均２．３％だが、ニボルマブを投与した場合のヒトＴ細胞が占める割合は０．７％であって、ＰＢＳ投与群と比較して、ニボルマブ抗体投与による腫瘍内へのヒトＴ細胞の減少が確認された。また、図２３（ｂ）及び（ｃ）から明らかなとおり、ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの脾臓及び血液において、ニボルマブを投与した場合のヒトＴ細胞が占める割合は、脾臓では平均３１．５％、末梢血では平均２０．８％だが、ＰＢＳを投与した場合の脾臓は平均９．８％、末梢血は平均１１．６％であり、ＰＢＳ投与群と比較して多く、ニボルマブ抗体投与により、ヒトＴ細胞の割合の増加が確認された。ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ＋／＋マウスにおいては、ニボルマブを投与した場合のヒトＴ細胞が占める割合は、脾臓では平均６．０％、末梢血では平均１．８％だが、ＰＢＳを投与した場合の脾臓では平均９．２％、末梢血では平均２．８％であり、ニボルマブ抗体投与によるヒトＴ細胞数の減少が確認された。
（結果２）
図２３（ｄ）から明らかなとおり、ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスにおいては、ＰＢＳを投与した場合、腫瘍内のヒトＴ細胞数は平均６０００００個だが、一方、ニボルマブを投与した場合の腫瘍内のヒトＴ細胞数は平均２１０００００個であって、ＰＢＳ投与群と比較して、ニボルマブ抗体投与による腫瘍内のヒトＴ細胞数が増加していた。しかし、ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ＋／＋マウスにおいては、ＰＢＳを投与した場合、腫瘍内のヒトＴ細胞数は平均１４００００個だが、ニボルマブを投与した場合の腫瘍内のヒトＴ細胞数は平均３６０００個であって、ＰＢＳ投与群と比較して、ニボルマブ抗体投与による腫瘍内へのヒトＴ細胞数の減少が確認された。また、図２３（ｅ）及び（ｆ）から明らかなとおり、ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスの脾臓及び血液において、ニボルマブを投与した場合のヒトＴ細胞数は、脾臓では平均１２４０００００個であり、末梢血では平均１２７００００個／ｍＬだが、ＰＢＳを投与した場合の脾臓では平均２６０００００個であり、末梢血では平均３５００００個／ｍＬであり、ＰＢＳ投与群と比較して多く、ニボルマブ抗体投与により、ヒトＴ細胞数の増加が確認された。ＨＳＣ−４皮下移植ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＋／＋マウスにおいては、ニボルマブを投与した場合のヒトＴ細胞数は、脾臓では平均８０００００個であり、末梢血では平均６００００個／ｍＬだが、ＰＢＳを投与した場合の脾臓では平均２００００００個であり、末梢血では平均１９００００個／ｍＬであり、ニボルマブ抗体投与によるヒトＴ細胞数の減少が確認された。
以上の結果は、ＮＯＧ（−ＦｃｇＲ ＋／＋）マウスでは抗ＰＤ−１抗体により腫瘍内のＰＤ−１＋Ｔ細胞がマウス貪食細胞によって傷害されたが、ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯ／ＫＯマウスでは、免疫チェックポイント阻害剤の生理活性である腫瘍内へのＴ細胞浸潤の亢進効果が検出できたことを示している。
本発明のマウスは、マウス貪食細胞に影響されることなく、ＡＤＣＣ活性を評価できるヒト化免疫不全マウスとして、医学分野において非常に有用である。

Claims (29)

  1. ＩＬ−２受容体γ鎖遺伝子に変異が導入されて、ＩＬ−２受容体γ鎖が欠損し、かつ、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原受容体遺伝子の再構成に関わる遺伝子の変異が両対立遺伝子座位にあり、さらにＦｃｇＲが機能的に発現しないことを特徴とする遺伝子改変免疫不全マウス。
  2. Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原受容体遺伝子の再構成に関わる遺伝子の変異が、ＳＣＩＤ変異又はＲＡＧ変異であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
  3. ＮＯＧ−ＦｃｇＲ ＫＯマウスであることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子改変
    免疫不全マウス。
  4. ＦｃｇＲの遺伝子が、Ｆｃｅｒ１ｇ及びＦｃｇｒ２ｂを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
  5. 腫瘍に対する抗体依存性の細胞傷害活性を示さないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
  6. 請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに由来する組織。
  7. 請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに由来する体細胞。
  8. 請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに由来する生殖細胞。
  9. 請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに、ヒト細胞が顕著に高い割合で生着していることを特徴とするヒト細胞生着免疫不全マウス。
  10. ヒト細胞が、ヒト末梢血単核球であることを特徴とする請求項９記載のヒト細胞生着免疫不全マウス。
  11. 請求項９又は１０記載のヒト細胞生着免疫不全マウスに由来するヒト細胞が生着した組織。
  12. 請求項９又は１０記載のヒト細胞生着免疫不全マウスに由来するヒト体細胞。
  13. 請求項９又は１０記載のヒト細胞生着免疫不全マウスに由来する生殖細胞。
  14. 請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスと、ヒトＩＬ−１５遺伝子が導入された遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）とを交配することにより、作出された遺伝子改変免疫不全マウス（II）。
  15. 遺伝子改変免疫不全マウス（Ｉ）が、ヒトＮＫ細胞を増幅・維持できるＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ Ｔｇマウスであることを特徴とする請求項１４記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）。
  16. 請求項１４又は１５記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に由来する組織。
  17. 請求項１４又は１５記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に由来する体細胞。
  18. 請求項１４又は１５記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に由来する生殖細胞。
  19. 請求項１４又は１５記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）に、ヒト細胞が顕著に高い割合で生着していることを特徴とするヒト細胞生着免疫不全マウス（II）。
  20. ヒト細胞が、ヒト末梢血単核球であることを特徴とする請求項１９記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）。
  21. 請求項１９又は２０記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する組織。
  22. 請求項１９又は２０記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する体細胞。
  23. 請求項１９又は２０記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）に由来する生殖細胞。
  24. 請求項９又は１０記載のヒト細胞生着免疫不全マウスを用いて、ヒト細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の活性や作用機序を評価する方法。
  25. 請求項１４又は１５記載の遺伝子改変免疫不全マウス（II）を用いて、ヒトＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を評価する方法。
  26. 請求項１９又は２０記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（II）を用いて、ヒトＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を評価する方法。
  27. 請求項１〜５いずれか記載の遺伝子改変免疫不全マウスに、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞とを共存させることにより、抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の機能を評価できることを特徴とするヒト細胞生着免疫不全マウス（III）。
  28. 請求項２７記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（III）を用いて、ヒト細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の機能を評価する方法。
  29. 請求項２７記載のヒト細胞生着免疫不全マウス（III）を用いて、ヒト免疫細胞に対する抗ヒト細胞表面タンパク分子抗体の機能を評価する方法。
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