KR20140104944A - 항-ａｘｌ 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항-ａｘｌ 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20140104944A
KR20140104944A KR1020147001805A KR20147001805A KR20140104944A KR 20140104944 A KR20140104944 A KR 20140104944A KR 1020147001805 A KR1020147001805 A KR 1020147001805A KR 20147001805 A KR20147001805 A KR 20147001805A KR 20140104944 A KR20140104944 A KR 20140104944A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
axl
axi
region
Prior art date
Application number
KR1020147001805A
Other languages
English (en)
Inventor
브루노 로베르트
베네딕트 포벨
그웨넬 쉐브
아지즈 야스리
크리스텔 라르부레
윌엠 르코네
티에리 샤르데
크리스티앙 라르로크
앙들레 펠레그렝
Original Assignee
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
앵스띠뛰 레지오날 뒤 깡세르 드 몽?리에 - 발 도헬르
오리바즈 파르마
위니베르시테 드 몽펠리에 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔), 앵스띠뛰 레지오날 뒤 깡세르 드 몽?리에 - 발 도헬르, 오리바즈 파르마, 위니베르시테 드 몽펠리에 1 filed Critical 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
Publication of KR20140104944A publication Critical patent/KR20140104944A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

본 발명은 항-Axl 항체 및 그의 진단 및 치료적 방법에서의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 H-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:2, H-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:3 및 H-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:4을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 L-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:6, L-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:7 및 L-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:8을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Axl에 특이성을 가지는 단일클론항체에 관한 것이다. 상기 단일클론항체는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11을 통해서 Axl의 세포외 도메인에 결합한다.

Description

항-ＡＸＬ 항체 및 그의 용도{ANTI-AXL ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 항-Axl 항체 및 진단 및 치료 방법에서의 그의 용도에 관한 것이다.
Axl은 수용체 티로신 키나아제 (RTKs)의 TAM 서브패밀리에 속하며, 또한 Tyro3 및 Mer을 포함한다. TAM 수용체는 세포외 영역 및 세포질 키나아제 도메인에서의 두 개의 면역글로불린-유사 도메인 및 듀얼 피브로넥틴 타입 III 반복 단위체(repeats)의 조합에 특징이 있다. TAM 수용체에 대한 리간드는 43%의 아미노산 서열 상동성을 보이고 유사한 도메인 구조를 공유하는 Gas6 (growth-arrest-specific 6) 및 단백질 S, 두 개의 비타민-K 의존성 단백질이다. 각 단백질은 네 개의 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF)-유사 모듈에 이은 11 g-카복시글루탐산 잔기, 및 두 개의 탠덤(tandem) 라미닌 G 도메인으로 이루어진 C-말단 성 호르몬-결합성 글로불린(sex hormone-binding globlin; SHBG)-유사 구조를 함유하는 N-말단 GIa 도메인을 갖는다. SHBG 도메인은 TAM 수용체의 결합 및 활성화 모두에 필요하고 충분한 한편, GIa 도메인은 음전하를 띠는 막 인지질에 결합하고 사멸 세포(apoptotic cells)의 TAM-매개 식작용에 중요한 역할을 한다. 세포 생존, 증식, 이주 및 부착을 포함하는 다양한 세포 반응에 있어서 TAM 활성화 및 신호전달은 연관되어 있다.
Axl 또는 그의 리간드 Gas6의 조절장애는 인간 암의 다양한 발병기전과 연관된다. Axl의 과발현은 다수의 인간 암 (교모세포종뿐만 아니라 폐, 전립선, 유방, 위, 췌장, 난소, 갑상선, 혈액암, 신장 세포암...)에서 보고되었고, 침습성, 전이 및 부정적 예후와 관련된다. 이러한 발견들은 Axl이 종양 성장, 침습 및 혈관 생성을 포함하는 종양 형성의 다양한 측면의 조절에 연관될 수도 있고 따라서 암의 치료적 개입, 특히, 항-전이성 암 치료제 개발, 및 약물 내성의 치료를 포함하는 다른 다양한 암 치료제를 위한 타겟이 된다는 점을 시사한다.
따라서, 항-Axl 단일클론 항체의 암 치료 용도가 개시되었다. 예를 들어, 항-Axl 항체에 대한 간행물은 WO2009/063965, WO2009/062690, 및 WO2011/014457을 포함한다.
면역 작용의 억제, 혈소판 응집의 활성화 및 바이러스 감염 유발인자 (예를 들어, Axl에 의해 에볼라(Ebola) 및 라사(Lassa) 바이러스의 흡수가 촉진된다)와 같은, 그의 리간드에 의존하거나 의존하지 않는 Axl의 다른 역할은 종양 외의 다른 적용을 위한 치료적 타겟으로서 Axl의 가능성을 강조한다.
본 발명은 H-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:2, H-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:3 및 H-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:4을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 L-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:6, L-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:7 및 L-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:8을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Axl에 특이성을 가지는 단일클론항체에 관한 것이다. 상기 단일클론항체는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11을 통해서 Axl의 세포외 도메인에 결합한다.
도 1: hAxl 에 대한 마우스 단일클론 항체의 친화성 및 특이성을 조사하기 위한 ELISA 실험. 인간 Axl-Fc (h-Axl), 마우스 Axl-Fc (m-Axl) 또는 인간 Mer-Fc (h-Mer), Tyro-3-Fc (h-Tyro-3)로 코팅된 플레이트는 단일클론 항-Axl 항체 (mAb1, mAb2, mAb3, mAb4 또는 20G7-D9)로 인큐베이트되었다. 세척 후, HRP-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG가 가해졌다. 20G7-D9는 h-Tyro-3 또는 h-Mer 또는 m-Axl와 교차-반응하지 않는다.
도 2: A549에서 세포 표면 Axl 의 유세포 분석. A549는 단일클론 항-Axl 항체 (mAb1, mAb2, mAb3, mAb4 또는 20G7-D9) 및 플루오레세인-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG로 염색되었다. 20G7-D9 염색 결과 10배 차이에 의한 이동(shift)이 나타나고 세포의 표면의 Axl 과발현을 설명한다.
도 3: BIAcore 를 이용한 Gas6 의 존재 또는 부존재 하에서 20 G7 - D9 의 친화성 측정. (A) Gas6 없이, 간단한 원-투-원 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 결합 속도(association rates; ka) 및 해리 속도(dissociation rates; kd)가 계산되었다. 평형 해리 상수 (KD)는 ka/kd 비로서 얻어졌다. 20G7-D9는 약 53 nM의 KD값을 가지고 인간 Axl에 고친화성으로 결합한다. (B) 20G7-D9는 Axl에 대한 리간드 Gas6의 결합을 차단하지 않는다.
도 4: 20 G7 - D9 mAb 의 Axl 수용체 인산화에 미치는 효과를 조사하기 위한 ELISA 실험. BXPC3, Capan-1, PANC1 및 MIAPaCa-2 췌장암 세포는 혈청-결핍(serum-starved), 마우스 항-Axl 항체로 전-인큐베이트(pre-incubated), 및 Gas6 리간드로 처리되었다. 세포 용해물은 PathScan®포스포-Axl (PanTyr) 샌드위치 ELISA 플레이트 (RD Systems, 미니애폴리스, MN)로 감염되었다. 다른 항체와 비교하여 20G7-D9은 지정된 네 개의 세포주에서, Gas6-자극된 세포에서 Axl 인산화 수준을 감소시킴으로써 Gas6-매개된 Axl 활성화를 차단하거나 상당히 감소시킬 수 있었다.
도 5: 마우스 항- Axl 항체의 세포 이주 및 증식에 미치는 효과를 조사하기 위한 상처 치유/ 스크래치 어세이 . 컨플루언시(confluency)로 성장시킨 후, A549 세포를 결핍시키고 피펫 팁(pipette tip)으로 상처를 입혔다. 20G7-D9 마우스 항-Axl은 mAb1보다 깨끗한 구역(cleared area)의 재증식(repopulation)을 더욱 감소시켰다. 이는 세포가 Gas6로 처리된 경우에도 마찬가지였다.
도 6: 항- Axl 20 G7 - D9 의 항-증식( anti - proliferative ) 효율을 조사하기 위한 세포 생존 어세이 . Capan-1, PANC1 및 MIAPaCa-2 췌장암 세포는 5일 동안 배지에서 성장되고 mAb1 또는 20G7-D9의 지정된 농도에서 처리되었다. MTS에 의하여 세포 생존능(cell viability)이 측정되었다. 20G7-D9는 mAb1보다 모든 시험된 세포주의 성장을 더욱 저해하고 저해율(%)은 농도-의존적이다.
도 7: 단일클론 항- Axl 20 G7 - D9 항체는 Axl 수용체의 급속한 하향-조절을 유도하고 Akt 경로를 저해한다. Panc1-세포는 다른 시간 동안 100 mg/ml의 mAb 20G7-D9로 인큐베이트되었다. 세포는 용해되고 웨스턴 블롯에 의하여 검출하기 위하여 총 단백질이 이용되었다. 도 7A에 도시한 바와 같이, Panc1 세포에서, mAb 20G7-D9는 Axl 수용체의 발현을 급속하게 하향-조절하였다. mAb 20G7-D9로 한 시간 인큐베이션 한 후, 세포는 Gas6로 30분 동안 인큐베이트되고 웨스턴 블롯에 의하여 티로신 702 (Axl 활성화) 상의 Axl 수용체 인산화 및 세린 473 (Akt 활성화) 상의 Akt의 인산화의 존재가 분석되었다. 도 7B에 도시한 바와 같이, mAb 20G7-D9 인큐베이션은 Gas6-유도된 Axl 및 Akt 단백질의 인산화의 감소를 일으킨다.
도 8: 누드 마우스에서, 마우스 항- Axl 항체의 인간 삼중 음성 유방암 및 인간 췌장암에 미치는 효과를 조사하기 위한 이종이식 모델. 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 MDA-MB-231 (삼중 음성 유방암 세포) 또는 MIAPaca-2, BXPC3 (췌장암 세포)를 이식시켰다. 동물은 마우스 항-Axl 항체, 300 ㎍/주사(injection)를 받았다. 처치하는 동안, 일주일에 한번 씩 캘리퍼로 종양의 성장이 모니터되었다. 누드 마우스에서 20G7-D9는 mAb1 보다 췌장 및 삼중 음성 종양의 전체적인 성장을 더욱 감소시켰고 (A, B, C), 췌장 BXPC3 이종이식된 마우스에서 비히클 또는 젬시타빈과 비교하여 전체적인 생존을 상당히 증가시켰다(D). 두 개의 주사를 받은 외식된 MIAPaca-2 이종이식 종양상에, mAb 20G7-D9에 의한 Axl 수용체의 급격한 하향-발현이 또한 관찰되었다(E).
도 9: hAxl - hFc 의 서열 및 항- Axl mAb 20 G7 - D9 의 에피토프의 위치결정( localization )/서열
항-Axl 항체 20G7-D9의 에피토프는 트립신 또는 GluC 프로테아제를 이용하여 제한된 단백질 분해 어세이(limited proteolysis assays) 및 MALDI 질량분석에 의하여 동정되었다. 도면은 인간 IgG1의 Fc 부분 및 히스티딘 Tag에 융합된 Axl의 세포외 도메인의 아미노산 33 내지 440으로 이루어진 이 실험에 사용된 항원 (hAxl-hFc) 조성물을 보여준다. 각 면역글로불린 유사 도메인 및 Axl 단백질의 피브로넥틴 3 도메인을 서열상에 나타내었다. mAb20G7-D9는 면역글로불린 유사 도메인 2 및 첫 번째 및 두 번째 피브로넥틴 도메인에 위치된 세 개의 펩타이드(입체구조적 에피토프; conformational epitope)에 결합한다(서열은 단백질 서열에서 프레임되고 표에 상세하게 기재된다).
도 10: 인간 Axl 의 엑토도메인의 모델의 표현 및 항- Axl 마우스 단일클론항체 20 G7 - D9 의 에피토프 및 Gas6 결합 도메인의 위치결정.
도 10A는 네 개 도메인이 모두 표지된 인간 Axl의 전체 세포외 도메인의 모델의 카툰-타입(cartoon-타입) 표현을 보여준다. 도 10B에서, 옅은-회색 β 시트(light-grey β sheet)로서 Gas6의 아미노산 305 내지 315으로부터의 단편이 가해졌고 이는 Axl의 면역글로불린-유사 도메인 1 이내의 Gas6 결합 도메인을 설명한다. 마지막으로, 도 10C는 회색 표면으로서 면역글로불린 유사 도메인 2 및 피브로넥틴 타입 III 도메인 1 및 2 이내의 20G7-D9 에피토프를 보여준다. 이는 첫째, 에피토프의 세 부분이 각 도메인의 바깥쪽 표면에 위치되어 있음을 확정한다. 둘째, 도 10C는 또한 인간 Axl 엑토도메인 상에서 Gas6 및 에피토프의 상호작용 부위는 서로 멀리 떨어져 있는 상태임을 설명한다.
정의:
용어 "Axl"은 기술분야에서 그의 일반적인 의미를 가지며 인간 Axl을 나타낸다. Axl은 또한 "Ark", "Tyro-7", "ufo" 또는 "jtkll"라고도 알려져 있다.
용어 "항-Axl 항체"는 Axl에 대한 직접적인 항체를 나타낸다 .
본 발명에 따르면, "항체" 또는 "면역 글로불린"은 동일한 의미를 가지며, 본 발명에서 동등하게 사용될 것이다. 여기에서 사용된 것으로서 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성부분, 즉, 면역특이적으로 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자이다. 이와 같은, 용어 항체는 항체 및 항체 단편의 변이체(variants) (유도체를 포함하는) 뿐만 아니라, 전체 항체 분자 및 항체 단편을 포함한다. 자연 항체에서, 두 개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결되고 각 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된다. 두 가지 타입의 경쇄, 람다 (I) 및 카파 (k)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 다섯 개의 주요 중쇄 클래스 (또는 이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각 사슬은 특유의 서열 도메인을 함유한다. 경쇄는 두 개 도메인, 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)을 포함한다. 중쇄는 네 개 도메인, 가변 도메인 (VH) 및 세 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3, 총괄적으로 CH라 한다)을 포함한다. 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 둘 다의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬 결합(association), 분비, 태반-통과 이동성(trans-placental mobility), 보체 결합, 및 Fc 수용체 (FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 수여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이고 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위 및 항원 결정 부위 사이의 구조적 상보성에 존재한다. 항체 결합 부위는 주로 과가변(hypervariable) 또는 상보성 결정 영역 (CDRs)으로부터의 잔기로 구성된다. 때때로, 비과가변 또는 골격 영역(framework regions; FR)으로부터의 잔기는 전체 도메인 구조에 영향을 미치고 따라서 결합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정 영역 또는 CDRs는 천연 면역글로불린 결합 부위의 자연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열이다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는, 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3로 명명된 세 개의 CDRs를 각각 가진다. 항원-결합 부위는, 따라서, 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 각 CDR 세트를 포함하는 여섯 개의 CDRs를 포함한다. 골격 영역 (FRs)은 CDRs 사이를 연결하는 아미노산 서열이다.
용어 "키메릭 항체"는 20G7-D9 항체 유래 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인, 및 인간 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체이다.
본 발명에 따르면, 용어 "인간화된 항체"는 인간 항체로부터의 가변 영역 골격 및 불변 영역을 가지나, 20G7-D9항체의 CDRs를 유지하는 항체이다.
용어 "Fab"는 프로테아제, 파파인으로 IgG를 처리하여 얻어지는 단편 중에서, H 사슬의 N-말단 측의 약 절반 및 L 사슬 전체가 이황화 결합을 통해서 서로 결합되어 있는, 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편을 나타낸다.
용어 "F(ab')2"는 프로테아제, 펩신으로 IgG를 처리하여 얻어지는 단편 중에서, 힌지 영역(hinge region)의 이황화 결합을 통하여 결합된 Fab보다 약간 큰, 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다.
용어 "Fab'"는 "F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합을 절단함에 의해 얻어지는, 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다.
단일 사슬 Fv("scFv") 폴리펩티드는 대개 펩티드-코딩 링커에 의해 결합되는 VH 및 VL 코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현되는 공유 결합된 VH::VL 헤테로다이머이다. "dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정화된 VH::VL 헤테로다이머이다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFvs의 결합(association)에 의해 자발적으로 형성되거나, 또는 2가 sc(Fv)2와 같은 펩티드 링커에 의한 1가 scFvs의 커플링에 의해 생성될 수 있다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위가 있는 작은 항체 단편으로, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)에서 경-쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중-쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 두 도메인 사이의 페어링(pairing)을 가능케 하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 상기 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어를 이루게 되고 두 개의 항원-결합 부위를 창출한다.
"정제된(purified)" 및 "분리된(isolated)"은, 본 발명에 따른 항체 또는 뉴클레오티드 서열을 참고하면, 소정의 분자가 같은 타입의 다른 생물학적 고분자(macromolecule)의 실질적인 부존재 하에 존재하는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 용어 "정제된"은 바람직하게는 적어도 75% 중량부, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 중량부, 더욱더 바람직하게는 적어도 95% 중량부, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 중량부의, 동일한 타입의 생물학적 고분자가 존재하는 것을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 "분리된" 핵산 분자는 상기 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 존재하지 않는 핵산 분자이다; 그러나, 상기 분자는 조성물의 기본 특성에 유해한 영향을 미치지 않는 몇몇의 부가의 염 또는 성분을 포함할 수도 있다.
본 발명의 항체:
본 발명은 분리된 항-Axl 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 하이브리도마를 생성하는 뮤린 항-Axl 항체 (20G7-D9)를 얻었다. 본 발명자들은 상기 mAb 20G7-D9의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 클로닝 및 특정했고, 따라서 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 항체의 상보적 결정 영역 (CDRs) 도메인을 결정했다:
Figure pct00001

따라서, 본 발명은 가변 도메인이 H-CDR1에 대한 SEQ ID NO:2, H-CDR2에 대한 SEQ ID NO:3 및 H-CDR3에 대한 SEQ ID NO:4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 Axl에 특이성을 가지는 단일클론항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 가변 도메인이 L-CDR1에 대한 SEQ ID NO:6, L-CDR2에 대한 SEQ ID NO:7 및 L-CDR3에 대한 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 Axl에 특이성을 가지는 단일클론항체에 관한 것이다.
본 발명의 단일클론항체는, 가변 도메인이 H-CDR1에 대한 SEQ ID NO:2, H-CDR2에 대한 SEQ ID NO:3 및 H-CDR3에 대한 SEQ ID NO:4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄 및 가변 도메인이 L-CDR1에 대한 SEQ ID NO:6, L-CDR2에 대한 SEQ ID NO:7 및 L-CDR3에 대한 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함할 수도 있다.
특히, 본 발명은 다음을 포함하는 항-Axl 단일클론항체를 제공한다:
- H-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:2, H-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:3 및 H-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
- L-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:6, L-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:7 및 L-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:8을 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 구체예에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지고/가지거나 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 가진다.
다른 구체예에서, 본 발명의 단일클론항체는 키메릭 항체, 바람직하게는 키메릭 마우스/인간 항체이다. 특히, 상기 마우스/인간 키메릭 항체는 위에서 규정한 20G7-D9 항체의 가변 도메인을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 단일클론 항체는 인간화된 항체이다. 특히, 상기 인간화된 항체에서, 가변 도메인은 인간 억셉터 골격 영역, 및 부가적으로 존재하는 인간 불변 도메인, 및 위에서 규정한 마우스 CDRs와 같은 비-인간 공여체 CDRs를 포함한다.
본 발명은 추가로, 이에 제한되는 것은 아니나 Fv, Fab, F(ab')2, Fab' dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디를 포함하는 Axl를 저지하도록 지시된 상기 항체의 항-Axl 단편을 제공한다.
본 발명은 추가로 Axl의 세포외 부분에서 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열에 결합하는 항-Axl 항체 또는 단편을 제공한다.
Figure pct00002

다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 항체를 제조하는 방법:
본 발명의 항-Axl 항체는 이에 제한되는 것은 아니나, 임의의 화학적, 생물학적, 유전학적 또는 효소적 기술의 단독 또는 조합과 같이, 기술분야에서 알려진 임의의 방법에 의해서 제조될 수 있다.
목적한 서열의 아미노산 서열을 알고 있는, 기술분야에서 통상의 기술자는 폴리펩티드 생성을 위한 표준 기술에 의하여 상기 항체를 쉽게 제조할 수 있다. 예를 들어, 그들은 잘-알려진 고상법(solid phase method), 바람직하게는 상업적으로 이용 가능한 펩티드 합성 장치 (어플라이드 바이오시스템(포스터 시티, 캘리포니아)에 의해 제조된 것과 같은)를 이용하고 제조자의 설명서에 따라 합성될 수 있다. 이에 대신하여, 본 발명의 항체는 기술분야에서 잘-알려진 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 항체를 코딩하는 DNA 서열의 발현 벡터로의 삽입(incorporation) 및 이와 같은 벡터의 적합한 진핵 또는 원핵 숙주로의 도입(introduction) 후의 DNA 발현 산물로서 획득될 수 있다. 상기 숙주는 목적 항체를 발현할 것이고, 후에 항체는 잘-알려진 기술을 이용하여 상기 숙주로부터 분리될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
일반적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피좀, 인공 크로모좀, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 어느 적합한 벡터에 포함될 수도 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 그에 의해 DNA 또는 RNA 서열 (예를 들어, 외부 유전자)이 숙주 세포내로 도입되어, 숙주를 형질전환하고 도입된 서열의 발현 (예를 들어 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 의미한다.
이에, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
이와 같은 벡터는 대상체에 투여함에 따라 상기 항체의 직접적인 발현을 일으키는 프로모터, 인핸서, 종결자(terminator) 등과 같은 조절 요소를 포함할 수도 있다. 동물 세포에 대한 발현 벡터에서 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40 (미츠카미 T. 외. 1987)의 초기 (early) 프로모터 및 인핸서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(구와나 Y 외. 1987)의 LTR 프로모터 및 인핸서, 면역글로불린 H 사슬의 프로모터 (메이슨 JO 외. 1985) 및 인핸서 (길리스 SD 외. 1983) 등을 포함한다.
인간 항체 C 영역을 코딩하는 유전자가 삽입 및 발현될 수 있다면, 동물 세포에 대한 어떤 발현 벡터도 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107 (미야지 H 외. 1990), pAGE103 (미츠카미 T 외. 1987), pHSG274 (브래디 G 외. 1984), pKCR (오헤어 K 외. 1981), pSG1 베타 d2-4-(미야지 H 외. 1990) 등을 포함한다.
플라스미드의 다른 예는 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR와 같은, 복제 개시점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 편입형 플라스미드(integrative plasmids) 등을 포함한다.
바이러스 벡터의 다른 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이와 같은 재조합 바이러스는 헬퍼 플라스미드(helper plasmids) 또는 바이러스로의 형질 감염 패키징 세포(transfecting packaging cells) 또는 트랜션트 형질감염(transient transfection)에 의한 것과 같은 기술분야에서 알려진 기술에 의해 제조될 수도 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포, 등을 포함한다. 이와 같은 복제-결함 재조합 바이러스를 제조하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어, WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 확인될 수도 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질 감염, 감염(infected) 또는 형질 전환(transformed)된 숙주 세포에 관한 것이다.
용어 "형질전환(transformation)"은 "외래(foreign)" (즉, 외부의(extrinsic) 또는 세포외) 유전자, 숙주 세포에 대한 DNA 또는 RNA 서열의 도입을 의미한다. 숙주 세포는 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 목적한 물질, 일반적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생산한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다.
본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 항체를 제조하기 위해 이용된다. 용어 "발현 시스템"은 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 위한, 적합한 조건 하에서의 숙주 세포 및 호환 가능한(compatible) 벡터를 의미한다.
통상의 발현 시스템은 대장균(E. coli) 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 베큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는, 원핵 세포 (박테리아와 같은) 및 진핵 세포 (효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 등과 같은)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예는 초대의(primary) 또는 확립된(established) 포유동물 세포 배양 (예를 들어, 림프아세포, 섬유아세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포, 등으로부터 생성되는)뿐 아니라 대장균(E.coli), 클루이베로마이세스 또는 사카로마이세스 효모, 포유동물 세포주 (예를 들어, 베로(Vero) 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포, 등)를 포함한다. 예는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포 (ATCC CRL1580), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 (이하에서 "DHFR 유전자"라 함)가 결핍된 CHO 세포 (우어라우프(Urlaub) G 외; 1980), 랫트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 (ATCC CRL1662, 이하에서 "YB2/0 세포"라 함), 등을 포함한다 .
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (i) 위에서 기술한 재조합 핵산 또는 벡터의 수용성 숙주 세포(competent host cell)로의 인 비트로(in vitro) 또는 엑스 비보(ex vivo) 도입, (ii) 얻어진 재조합 숙주 세포의 인 비트로 또는 엑스 비보 배양 및 (iii), 부가적으로, 상기 항체를 발현하고/하거나 분비하는 세포의 선택.
이와 같은 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체의 제조를 위해 사용될 수 있다.
다른 특정 구체예에서, 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 적합한 조건 하에서 하이브리도마 20G7-D9를 배양하여 20G7-D9 항체의 발현; 및
(ii) 발현된 항체의 회수.
본 발명의 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로즈, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 공정에 의해, 배양 배지로부터 적합하게 분리된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 인간 키메릭 항체는 위에서 기술한 VL 및 VH 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 획득하고, 그것을 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 코딩하는 유전자를 가지는 동물 세포 발현 벡터 내로 삽입하여 인간 키메릭 항체 발현 벡터를 구축하며 발현 벡터를 동물 세포내로 도입하여 코딩 서열을 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
인간 키메릭 항체의 CH 도메인으로, 인간 면역글로불린에 속하는 어떤 영역도 사용 가능하나, IgG 클래스가 적합하며 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같이 IgG 클래스에 속하는 어느 하나의 서브클래스도 사용될 수 있다. 또한, 인간 키메릭 항체의 CL으로, Ig에 속하는 어떤 영역 및 카파 클래스 또는 람다 클래스가 사용될 수 있다.
키메릭 항체의 제조방법은 종래의 재조합 DNA와 연관되고 유전자 형질감염 기술은 기술분야에 잘 알려져 있다(모리슨 SL. 외. (1984) 및 특허 문헌 US5,202,238; 및 US5,204, 244 참조).
본 발명의 인간화된 항체는 위에서 기술한 CDR 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 획득하고, 그것을 (i) 인간 항체와 동일한 중쇄 불변 영역 및 (ii) 인간 항체와 동일한 경쇄 불변 영역을 코딩하는 유전자를 가지는 동물 세포 발현 벡터 내로 삽입하여 인간화된 항체 발현 벡터를 구축하며, 발현 벡터를 동물 세포내로 도입하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 생성될 수도 있다.
인간화된 항체 발현 벡터는 항체 중쇄를 코딩하는 유전자 및 항체 경쇄를 코딩하는 유전자가 별도의 벡터 상에 존재하는 타입이거나 두 유전자가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤(tandem) 타입)일 수도 있다. 인간화된 항체 발현 벡터 구축의 용이성, 동물 세포로의 도입의 용이성, 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준 사이의 균형과 관련하여, 탠덤 타입의 인간화된 항체 발현 벡터가 바람직하다(시타라 K 외. 1994). 탠덤 타입 인간화된 항체 발현 벡터의 예는 pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 등을 포함한다.
종래의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술에 기초한 인간화된 항체의 제조방법은 기술분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, 리히만 L. 외. 1988; 노이버거 MS. 외. 1985 참조). 항체는 예를 들어, CDR-그래프팅 (EP 239,400; PCT 공개 WO91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; 패들란 EA (1991); 스터드니카(Studnicka) GM 외. (1994); 로거스카(Roguska) MA. 외. (1994)). 또한 항체는 사슬 셔플링 (U.S. Pat. No.5,565,332)을 포함하여 기술분야에서 알려진 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다. 이와 같은 항체를 제조하기 위한 일반적인 재조합 DNA 기술 또한 알려져 있다(유럽 특허 출원 EP 125023 및 국제 특허 출원 WO 96/02576 참조).
본 발명의 Fab는 Axl와 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제, 파파인으로 처리함에 의해 획득될 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵 발현 시스템 또는 진핵 발현 시스템을 위한 벡터 내로 삽입하고 상기 벡터를 원핵 또는 진핵생물(적절한 것으로서) 내로 도입함에 의해 Fab를 발현시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 F(ab')2는 Axl와 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제, 펩신으로 처리하여 획득될 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통하여 아래에서 기술되는 바와 같이 Fab'를 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 Fab'는 Axl와 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 환원제, 디티오트레이톨로 처리함에 의해 획득될 수 있다. 또한, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵생물을 위한 발현 벡터, 또는 진핵생물을 위한 발현 벡터 내로 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 (적절한 것으로서) 내로 도입함에 의해 그의 발현을 수행하여 제조될 수 있다.
본 발명의 scFv는 위에서 기술한 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 cDNA를 획득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하며, 상기 DNA를 원핵생물을 위한 발현 벡터, 또는 진핵생물을 위한 발현 벡터 내로 삽입하고 나서, 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 (적절한 것으로서) 내로 도입하여 scFv를 발현시켜 제조될 수 있다. 인간화된 scFv 단편을 생성하기 위하여, 공여체 scFv 단편으로부터 상보적 결정 영역 (CDRs)을 선택하고 그들을 알려진 삼차원 구조의 인간 scFv 단편 골격 상으로 그래프팅하는 것과 관련되는 CDR 그래프팅이라 하는 잘 알려진 기술이 사용될 수도 있다(예를 들어, W098/45322; WO 87/02671; US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494 참조).
여기에서 기술된 항체의 아미노산 서열의 변형(modification(s))이 고려된다. 예를 들어, 그것은 항체의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하기 위해 바람직할 수도 있다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FRs에 비-인간 동물 유래의 항체의 VH 및 VL에서 오로지 CDRs을 간단히 그래프팅함으로써 인간화된 항체가 제조되면, 항원 결합 활성은 비-인간 동물 유래의 본래의 항체의 결합 활성에 비하여 감소된다. CDRs 뿐 아니라 FRs에서의, 비-인간 항체의 VH 및 VL의 몇몇의 아미노산 잔기는 직접적으로 또는 간적접으로 항원 결합 활성과 관련되는 것으로 여겨진다. 따라서, 이들 아미노산 잔기의 인간 항체의 VH 및 VL의 FRs 유래의 다른 아미노산 잔기로의 치환은 결합 활성을 감소시킬 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 인간 CDR에 그래프팅된 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 항체의 결합에 직접적으로 관련되거나, CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 또는 항체의 삼차-원적 구조를 유지하고 항원의 결합에 직접적으로 관련되는 아미노산 잔기를 동정하기 위한 시도가 이루어져야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 동정된 아미노산을 비-인간 동물 유래의 본래 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써 증가될 수 있다.
변형 및 변화는 본 발명의 항체의 구조 및 그들을 코딩하는 DNA 서열에서 이루어질 수도 있고, 그럼에도 불구하고 목적한 성질을 갖는 항체를 코딩하는 기능성 분자를 얻을 수도 있다.
아미노 서열에서 변화를 일으키는데 있어서, 아미노산의 친수도 지수(hydropathic index)가 고려될 수도 있다. 단백질의 상호적인 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 친수도 아미노산 지수의 중요성이 기술분야에서 일반적으로 이해된다. 아미노산의 상대적 친수도 특성이 그 결과로 생긴 단백질의 이차원적 구조에 기여한다는 것은 인정된다. 아미노산의 상대적 친수도 특성은 결국에는 예를 들어, 효소, 기질 (substrates), 수용체, DNA, 항체, 항원 등 다른 분자와 단백질의 상호작용을 결정한다. 각 아미노산은 그들의 소수성 및 다음과 같은 전하 특성에 기초하여 친수도 지수를 가진다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8) ; 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
본 발명의 다른 목적은 또한 본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체(function-conservative variants)를 포함한다.
"기능-보존적 변이체"는 폴리펩티드의 전체적인 입체구조(conformation) 및 기능의 변화 없이 단백질 또는 효소의 소정의 아미노산 잔기가 변화된 것이다. 상기 아미노산 잔기의 변화는 아미노산의 비슷한 특성(예를 들어, 극성, 수소 결합 가능성, 산성, 염기성, 소수성, 방향성 등과 같은)을 갖는 아미노산으로의 치환(replacement)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보존적인 것으로 나타낸 것 이외의 아미노산은 단백질에서 달라질 수도 있어서 유사한 기능의 어느 두 개의 단백질 사이에 퍼센트 단백질 또는 아미노산 서열 유사성이 달라질 수도 있고, 예를 들어, 클러스터법(Cluster method)에 의한 것과 같은 정렬 방식(alignment scheme)에 따라 결정된 것으로서, 상기 유사성은 70 % 내지 99 %일 수 있고 이때 상기 유사성은 MEGALIGN 알고리즘에 기초한다. "기능-보존적 변이체"는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정된 것으로 적어도 60 % 아미노산 상동성, 바람직하게는 적어도 75 %, 더욱 바람직하게는 적어도 85 %, 특히 바람직하게는 적어도 90 %, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 95 %를 가지고, 천연의 또는 부모 단백질(parent protein)과 비교하여 동일하거나 실질적으로 유사한 성질 또는 기능을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
더 짧은 서열의 전체 길이에서, 80 % 초과, 바람직하게는 85 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과의 아미노산이 동일하거나 약 90 % 초과, 바람직하게는 95 % 초과가 유사한(기능적으로 동일한) 경우 두 개의 아미노산 서열은 "실질적으로 상동(substantially homologous)" 하거나 또는 "실질적으로 유사하다". 바람직하게는, 유사한 또는 상동의 서열은 예를 들어, GCG (유전적 컴퓨터 그룹, GCG 패키지를 위한 프로그램 매뉴얼, 버전 7, 매디슨, 위스콘신) 파일업 프로그램, 또는 BLAST, FASTA, 등과 같은 어느 서열 비교 알고리즘을 이용한 정렬에 의해 동정된다.
예를 들어, 특정 아미노산은 활성의 뚜렷한 손실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산에 의해 치환될 수도 있다. 단백질의 상호적인 수용력 (interactive capacity) 및 특성은 단백질의 생물학적 기능성 활성을 결정하기 때문에, 유사한 성질을 가지는 단백질이 얻어지는 동안에도, 단백질 서열, 및, 물론, 그 단백질의 DNA 코딩 서열에서 특정 아미노산의 치환이 이루어질 수 있다. 따라서 그들의 생물학적 활성의 뚜렷한 손실 없이, 본 발명의 항체 서열, 또는 상기 항체를 코딩하는 상응하는 DNA 서열에서 다양한 변화가 일어날 수도 있다고 생각된다.
특정 아미노산이 유사한 친수도 지수 또는 스코어를 가지는 다른 아미노산으로 치환될 수도 있음이 기술분야에 알려져 있다. 상기 치환에 의해서 여전히 유사한 생물학적 활성을 가지는 단백질, 즉 여전히 생물학적 및 기능적으로 동등한 단백질이 된다.
위에서 요약한 바와 같이, 아미노산 치환은 따라서 일반적으로 아미노산 곁-사슬 치환의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기, 등에 기초한다. 위에서 기술한 다양한 특징을 고려한 바람직한 치환은 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 다음을 포함한다: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.
따라서, 본 발명은 또한 가변 도메인이 다음을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다:
- SEQ ID NO: 2의 서열과 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가지는 H-CDR1,
- SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가지는 H-CDR2,
- SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가지는 H-CDR3,
- SEQ ID NO: 6의 서열과 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가지는 L-CDR1,
- SEQ ID NO: 7의 서열과 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가지는 L-CDR2,
- SEQ ID NO: 8의 서열과 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가지는 L-CDR3, 및
-상기 항체는 가변 도메인이 H-CDR1에 대한 SEQ ID NO: 2, H-CDR2에 대한 SEQ ID NO: 3 및 H-CDR3에 대한 SEQ ID NO: 4를 포함하는 중쇄 및 가변 도메인이 L-CDR1에 대한 SEQ ID NO: 6, L-CDR2에 대한 SEQ ID NO: 7 및 L-CDR3에 대한 SEQ ID NO: 8을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체로서 실질적으로 동일한 친화성을 가지고, 더욱 바람직하게는 뮤린 항-Axl 항체 20G7-D9와 실질적으로 동일한 친화성을 가지고 Axl에 특이적으로 결합한다.
따라서, 본 발명은 또한 Axl의 세포외 부분의 (Axl의 에피토프 아미노산 서열 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11) 면역글로불린 유사 도메인 2, FN3 도메인 1 및 FN3 도메인 2에 결합하는 항체를 제공한다.
상기 항체는 기술분야에서 알려진 어느 한 방법에 의하여 특이적 결합성에 대하여 분석될 수도 있다. 에피토프 결합에 대하여 다수의 다른 경쟁성 결합 어세이 방식(competitive binding assay format(s))이 사용될 수 있다. 면역분석법은 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석법, ELISA, "샌드위치" 면역분석법, 면역침강 어세이, 침전소 어세이, 겔 확산 침전소 어세이, 면역방사 어세이, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법, 및 보체-결합 어세이와 같은 기술을 이용한 경쟁성 분석 시스템(competitive assay systems)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 어세이는 일상적이고 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 오수벨 외., eds, 1994 커런트 프로토콜 인 몰레큘러 바이올로지(current Protocols in Molecular Biology), Vol. 1, 존 윌리 & 선즈, Inc., 뉴욕, 참조). 예를 들어, BIACORE®(GE 헬스케어, 피스카타웨이, NJ)은 단일클론 항체의 에피토프 빈 패널에 일상적으로 이용되는 다양한 표면 플라즈몬 공명 어세이 방식의 하나이다. 부가적으로, 안티바디, 레브러토리 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 레브러토리, 에드 할로우 및 데이비드 레인, 1988,에 기술된 것과 같은, 일상적인 크로스-블록 어세이(cross-blocking assay)가 수행될 수 있다.
본 발명의 제작된 항체는 예를 들어, 항체의 성질을 개선하기 위하여, VH 및/또는 VL 이내에 골격 잔기의 변형을 포함한다. 일반적으로 이와 같은 골격 변형은 항체의 면역원성을 감소시킨다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 또는 그 이상의 골격 잔기를 상응하는 점라인 서열(germline sequence)로 "복귀돌연변이(backmutate)"시키는 것이다. 더욱 구체적으로, 체세포 돌연변이된 항체는 그 항체가 유래된 점라인 서열(germline sequence)과는 다른 골격 잔기를 함유한다. 이와 같은 잔기는 항체 골격 서열을 그 항체가 유래된 점라인 서열과 비교함으로써 동정될 수 있다. 골격 영역 서열을 그들의 점라인 구조(configuration)로 복귀시키기 위해서, 예를 들어, 부위-지향성(site-directed) 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발에 의하여 체세포 돌연변이가 점라인 서열로 "복귀돌연변이"될 수 있다. 이와 같은 "복귀 돌연변이된" 항체 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 골격 변형의 다른 형태는 T 세포-에피토프를 제거하여 항체의 면역원성의 가능성을 감소시키기 위한, 골격 영역 내의, 또는 심지어 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 내의 하나 또는 그 이상의 잔기의 변이와 관련된다. 이 접근법은 또한 "탈면역화(deimmunization)"라고도 하며 카 외(Carr et al)의 U.S. 특허 공개 No. 20030153043에 더욱 상세하게 기술된다.
골격 또는 CDR 영역 내의 변형에 부가하여 또는 이에 대신하여, 본 발명의 항체는, 혈청 반-감기, 보체 결합, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포의 세포독성과 같은, 통상적으로 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 성질을 변경하는 Fc 영역 내의 변형을 포함하도록 제작될 수도 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 화학적 모이어티가 항체에 결합될 수 있다) 또는 그의 글리코실화가 변경되도록, 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 성질을 다시 변경되도록 변형될 수도 있다. 이들 각각의 구체예는 아래에서 더욱 상세하게 기술된다. Fc 영역에서 잔기의 번호 부여는 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따른다.
한 구체예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 보드머 외(Bodmer et al)의 U.S. 특허 No. 5,677,425에도 기술된다. CH1의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진하거나 또는 항체의 안정성이 증가 혹은 감소되도록 변경된다.
다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 변이되어 항체의 생물학적 반-감기가 감소된다. 더욱 구체적으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역 내로 도입되어, 본래의 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여 항체의 포도상구균 단백질 A (SpA) 결합이 손상된다. 이 접근법은 워드 외(Ward et al)의 U.S. 특허 No. 6,165,745에 더욱 상세하게 기술된다.
다른 구체예에서, 항체는 변형되어 그의 생물학적 반-감기가 증가한다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 다음의 변이가 도입될 수 있다: 워드(Ward)의 U.S. 특허 No. 6,277,375에 기술된 것으로서 T252L, T254S, T256F. 이에 대신하여, 프레스타 외(Presta et al)의 U.S. 특허 Nos. 5,869,046 및 6,121 ,022에 기술된 것으로서, 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여, 항체는 CH1 또는 CL 영역 이내에서 변경되어 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개의 루프로부터의 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유할 수 있다.
다른 한 구체예에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 교체에 의하여 변경되어 항체의 이펙터 기능이 변경된다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 교체되어, 부모 항체의 항원-결합 능력은 유지하되 항체의 이펙터 리간드에 대한 친화성이 변경될 수 있다. 친화성이 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근법은 윈터 외(Winter et al)의 U.S. 특허 Nos. 5,624,821 및 5,648,260에서 더욱 상세하게 기술된다.
다른 구체예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 교체되어 항체는 C1q 결합이 변경되고/변경되거나 보체 의존성 세포독성(CDC)이 감소 또는 없어질 수 있다. 이 접근법은 아이더소기 외(Idusogie et al)의 U.S. 특허 Nos. 6,194,551에서 더욱 상세하게 기술된다.
다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 항체의 보체에 결합하는 능력이 변경된다. 이 접근법은 보드머 외의 PCT 공개 WO 94/29351에도 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, Fc 영역은 변형되어 항체의 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력이 증가하고/증가하거나 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변형함에 의해서 항체의 Fc 수용체에 대한 친화성이 증가한다. 이 접근법은 프레스타(Presta)의 PCT 공개 WO 00/42072에도 기술되어 있다. 더욱이, 인간 IgGI for FcγRI, FcγRII, FcγIII 및 FcγRn 상의 결합 부위가 발견되었고 결합이 향상된 변이체가 기술되어 있다(쉴드, R. L. 외., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604, WO2010106180 참조).
또 다른 구체예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 어글리코실화된(aglycoslated) 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결핍된다). 글리코실화가 변경되어, 예를 들어, 항체의 항원에 대한 친화성이 증가할 수 있다. 이와 같은 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 이루어져 그 결과 하나 또는 그 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 부위를 제거함으로써 그 부위의 글리코실화가 제거된다. 이와 같은 어글리코실화는 항체의 항원에 대한 친화성을 증가시킬 수도 있다. 이와 같은 접근법은 코 외(Co et al)의 U.S. 특허 Nos. 5,714,350 및 6,350,861에서 더욱 상세하게 기술된다.
부가적으로 또는 이에 대신하여, 푸코실 잔기의 양이 감소되거나 또는 푸코실 잔기가 없는 하이포푸코실화된(hypofucosyated) 또는 비-푸코실화된 항체, 또는 증가된 이등분(bisecting) GlcNac 구조를 가지는 항체와 같이, 항체는 글리코실화의 타입이 변경되도록 만들어질 수 있다. 이와 같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 이해된다. 이와 같은 탄수화물 변형은, 예를 들어, 글리코실화 시스템을 가지는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 시스템을 가지는 세포는 기술분야에서 알려져 있고 숙주 세포로서 사용되어 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 가지는 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 항 외(Hang et al)의 EP 1 ,176,195는 푸코실 트랜스퍼라아제를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능적으로 손상된 세포주를 기술한다. 이와 같은 세포주에서 발현된 항체는 하이포푸코실화를 나타내거나 푸코실 잔기가 전혀 없게 된다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 하이포푸코실화 또는 비-푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어, 푸코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서 재조합 발현에 의하여 제조될 수도 있다. 프레스타의 PCT 공개 WO 03/035835는 푸코오스가 Asn(297)-결합된 탄수화물에 결합하는 능력이 감소된, 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기술한다. 또한 그 결과, 그 숙주 세포에서 발현된 항체가 하이포푸코실화된다 (또한 쉴드, R.L. 외., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). 우마나 외(Umana et al)의 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라아제를 발현하도록 제작된 세포주를 기술한다(예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III (GnTIII)). 이로써 제작된 세포주에서 발현되는 항체는 증가된 이등분(bisecting) GlcNac 구조를 나타내어, 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다(또한 우마나 외., 1999 Nat. 바이오테크. 17:176-180 참조). 유레카 테라퓨틱 사(EUreka Therapeutics)는 또한 푸코실 잔기가 전혀 없는 변경된 포유동물 글리코실화 패턴를 가지는 항체를 생성할 수 있는 유전적으로 제작된 CHO 포유동물 세포를 기술한다(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html). 이에 대신하여, 본 발명의 항체는 포유동물-유사 글리코실화 패턴을 위해 제작되고 글리코실화 패턴으로서 푸코오스 결핍 항체를 생성할 수 있는 효모 또는 사상균(filamentous fungi)에서 생성될 수 있다(예를 들어 EP1297172B1 참조).
본 발명에 의해 고려되는 항체의 다른 변형은 페길화(pegylation)이다. 항체는 페길화되어, 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반-감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 페길화하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 결합되는 조건 하에서, 항체, 또는 그의 단편을, 통상적으로, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시킬 수 있다. 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사체 반응성 수-용성 폴리머)의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의하여 수행될 수 있다. 여기에서 사용된, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노 (C1- C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은, 다른 단백질의 유도체화(derivatize)에 사용되는 PEG의 어떤 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 특정 구체예에서, 페길화될 항체는 어글리코실화된 항체이다. 단백질의 페길화 방법은 기술분야에서 알려져 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 니시무라 외 (Nishimura et al)의 EP O 154 316 및 이시카와 외 (Ishikawa et al)의 EP 0 401 384 참조.
본 발명에 의해 고려되는 항체의 다른 변형은 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편과 같은 혈청 단백질에 대한 컨쥬게이트 또는 단백질 융합이다. 상기 변형은 결과물 분자의 반-감기를 증가시킨다. 이와 같은 접근법은 예를 들어 밸런스 외 (Ballance et al)의 EP0322094에서 기술된다.
다른 가능성은 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 단백질에 대한 융합이다. 이는 결과물 분자의 반 감기를 증가시킨다. 이와 같은 접근법은 예를 들어 니그렌 외 (Nygren et al)의 EP 0 486　525에서 기술된다.
면역컨쥬게이트 :
본 발명의 항체는 검출가능한 표지로 컨쥬게이트되어 항-Axl 면역컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 적합한 검출가능한 표지는 예를 들어, 방사성동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생물발광 표지 또는 콜로이드 금을 포함한다. 이와 같은 검출가능하게-표지된 면역컨쥬게이트를 제조하고 검출하는 방법은 기술분야에서 통상의 기술자에게 잘-알려져 있으며, 아래에서 더욱 상세하게 기술된다.
검출가능한 표지는 오토래디오그래피에 의해 검출되는 방사성 동위원소일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S 및 14C이다.
항-Axl 면역컨쥬게이트는 또한 형광 화합물로 표지될 수 있다. 형광-표지된 항체의 존재는 면역컨쥬게이트를 적절한 파장의 광에 노출시키고 결과물의 형광을 검출함으로써 결정된다. 형광 표지 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민을 포함한다.
이에 대신하여, 항-Axl 면역컨쥬게이트는 항체와 화학발광 화합물의 커플링에 의하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-태그된 면역컨쥬게이트의 존재는 화학 반응의 진행 중에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.
유사하게, 생물발광 화합물을 사용하여 본 발명의 항-Axl 면역컨쥬게이트를 표지할 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광의 한 종류이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 표지에 유용한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라아제 및 애큐오린을 포함한다.
이에 대신하여, 항-Axl 면역컨쥬게이트는 항-Axl 단일클론항체와 효소를 결합함에 의하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 적절한 기질의 존재 하에서 항-Axl-효소 컨쥬게이트가 인큐베이트되는 경우, 예를 들어, 분광광도적, 형광적 또는 육안적 수단에 의하여, 효소 모이어티는 상기 기질과 반응하여 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 다중특이성 면역컨쥬게이트를 검출가능하게 표지하는데 사용 가능한 효소의 예는 β-갈락토시다제, 글루코오스 옥시다제, 퍼옥시다제 및 알칼라인 포스파타제를 포함한다.
통상의 기술자는 본 발명에 따라 이용될 수 있는 다른 적합한 표지를 알 것이다. 마커 모이어티의 항-Axl 단일클론 항체에 대한 결합은 기술분야에서 알려진 표준의 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 이와 관련된 통상의 방법론은 케네디 외(Kennedy et al)., Clin . Chim . Acta 70:1, 1976; 슈어 외 (Schurs et al)., Clin . Chim . Acta 81:1, 1977; 신 외(Shih et al)., Int'l J. Cancer 46:1101, 1990; 스테인 외 (Stein et al)., Cancer Res . 50:1330, 1990; 및 콜리건 (Coligan), supra에 기술된다.
더욱이, 면역화학적 검출의 편의성 및 다용도성은 아비딘, 스트렙타비딘, 및 비오틴으로 컨쥬게이트된 항-Axl 단일클론 항체를 사용함에 의하여 증강될 수 있다. (예를 들어, 윌첵 외(Wilchek et al). (eds.), "아비딘-비오틴 테크놀러지," 메쏘드 인 엔자이몰로지( Vol . 184) (아카데믹 프레스 1990); 바이어 외(Bayer et al)., "이뮤노케미컬 어플리케이션 오브 아비딘-비오틴 테크놀러지," 메쏘드 인 몰레큘러 바이올로지 ( Vol . 10) 149-162 (맨손(Manson), ed., 더 휴먼 프레스, Inc. 1992) 참조)
면역분석법을 수행하는 방법은 잘-확립되어 있다. (예를 들어, 쿡 및 쉘프, "모노클로날 안티바디 인 다이아그노스틱 이뮤노어세이," 모노클로날 안티바디 : 프로덕션, 엔지니어링, 앤 클리니컬 어플리케이션 180-208 (리터 및 래디맨, eds., 캠브리지 유니버시티 프레스 1995); 페리, "더 롤 오브 모노클로날 안티바디 인 더 어드밴스먼트 오브 이뮤노어세이 테크놀러지," 모노클로날 안티바디 : 프린서플 앤 어플리케이션107-120 (버치 및 레녹스, eds., 윌리-리스, Inc. 1995); 다이아먼디스, 이뮤노어세이 (아카데믹 프레스, Inc. 1996) 참조)
다른 관점에서, 본 발명은 항-Axl 단일클론항체-약물 컨쥬게이트를 제공한다. 여기에서 사용된 것으로 "항-Axl 단일클론항체-약물 컨쥬게이트"는 치료제에 컨쥬게이트된 본 발명에 따른 항-Axl 단일클론항체이다. 이와 같은 항-Axl 단일클론항체-약물 컨쥬게이트는 예를 들어, Axl-발현 암이 있는 대상체에게, 통상적으로 단독 투여되거나 다른 치료제와 조합하여 투여되었을 때와 같이 대상체에게 투여되었을 때, Axl-발현 세포 상의 임상적으로 유용한 효과를 생성한다.
통상적인 한 구체예에서, 항-Axl 단일클론항체는 세포독성제에 컨쥬게이트되어, 결과물인 항체-약물 컨쥬게이트는 세포에 의해 흡수되거나 내재화되었을 때 Axl-발현 세포 (예를 들어, Axl-발현 암 세포) 상에 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 발휘한다. 항체를 컨쥬게이션 하기 위한 특히 적합한 모이어티는 화학요법제, 효소 전환 프로드럭, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다. 예를 들어, 항-Axl 단일클론항체는 화학요법제 또는 독소와 같은 세포독성제에 컨쥬게이트될 수 있다(예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소와 같은, 예를 들어 세포증식 억제 또는 세포사멸제).
세포독성제의 유용한 클래스는 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화제 (예를 들어, 시스-플라틴, 모노(플라티늄), 비스(플라티늄) 및 트리-뉴클리어 플라티늄 복합체 및-카보플라틴과 같은 플라티늄 복합체), 안트라사이클린, 항생제, 항엽산제, 대사길항제, 화학요법 감작제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 불소화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신(lexitropsins), 니트로소우레아, 플라티놀 (platinols), 전-형성(pre-forming) 화합물, 퓨린 대사길항제, 퓨로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 라토포아이소머라제 저해제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.
각각의 세포독성제는 예를 들어, 안드로겐, 안트로마이신 (AMC), 아스파라기나제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부설판, 부티오닌 설폭시민, 캄프토테신, 카보플라틴, 카르무스틴 (BSNU), CC-1065 (리 외., Cancer Res . 42:999-1004, 1982), 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시티딘 아라비노시드, 사이토칼라신 B, 다카르바진, 닥티노마이신 (공식적으로 액티노마이신), 다우노루비신, 데카바진, 도세탁셀, 독소루비신, 에스트로겐, 5-플루오로데옥시우리딘, 에톱시드 포스페이트(etopside phosphate; VP-16), 5-플루오로우라실, 그라미시딘 D, 하이드록시우레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 로무스틴(lomustine; CCNU), 메클로레타민(mechlorethamine), 멜파란(melphalan), 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미스라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin) C, 미토잔트론(mitoxantrone), 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 플리카마이신(plicamycin), 프로카비진(procarbizine), 스트렙토조토신(streptozotocin), 테노포시드(tenoposide; VM-26), 6-티오구아닌, 티오TEPA, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈(vinorelbine)을 포함한다.
특히 적합한 세포독성제는 예를 들어, 돌라스타틴(dolastatins; 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin) E, AFP, MMAF, MMAE), DNA 마이너 그루브 결합제 (예를 들어, 엔다이인(enediynes) 및 렉시트롭신), 듀오카르마이신, 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 퓨로마이신, 빈카 알칼로이드, CC-1065, SN-38 (7-에틸-10-하이드록시-캄프토테인), 토포테칸(topotecan), 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 리조신(rhizoxin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 에키노마이신(echinomycin), 콤브레타스타틴(combretastatin), 네트롭신(netropsin), 에포틸론(epothilone) A 및 B, 에스트라무스틴(estramustine), 크립토피신(cryptophysins), 세마도틴(cemadotin), 메이탄시노이드(maytansinoids), 디스코데몰라이드(discodermolide), 엘레우테로빈(eleutherobin), 및 미토잔트론(mitoxantrone)을 포함한다.
특정 구체예에서, 세포독성제는 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜파란(melphalan), 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드와 같은 종래의 화학요법제이다. 이에 더하여, CC-1065 유사체, 칼리케아미신(calicheamicin), 메이탄신(maytansine), 돌라스타틴(dolastatin) 10의 유사체, 리족신(rhizoxin), 및 팰리톡신(palytoxin)과 같은 강력한 약물(potent agents)이 항-Axl-발현 항체에 결합될 수 있다.
구체적인 변형에 있어서, 세포독성 또는 세포증식 저해제는 아우리스타틴 E (돌라스타틴-10으로도 알려져 있는) 또는 그의 유도체이다. 통상적으로, 아우리스타틴 E 유도체는, 예를 들어, 아우리스타틴 E 및 케토산(keto acid) 사이에 형성된 에스테르이다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산 (benzoylvaleric acid)과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 일반적인 아우리스타틴 유도체는 AFP (디메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌디아민), MMAF (도발린-발린-돌라이소류닌-돌라프로인-페닐알라닌), 및 MAE (모노메틸 아우리스타틴 E)을 포함한다. 아우리스타틴 E 및 그의 유도체의 합성 및 구조는 U.S. 특허 출원 공개 No. 20030083263; 국제 특허 공개 Nos. WO 2002/088172 및 WO 2004/010957; 및 U.S. 특허 Nos. 6,884,869; 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; 및 4,486,414에서 기술된다.
다른 변형에 있어서, 세포독성제는 DNA 마이너 그루브 결합제이다. (예를 들어, U.S. 특허 No. 6,130,237. 참조) 예를 들어, 특정 구체예에서, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물이다. 다른 구체예에서, 마이너 그루브 결합제는 엔다이인(enediyne)이다(예를 들어, 칼리케아미신; calicheamicin).
특정 구체예에서, 항체-약물 컨쥬게이트는 항-튜불린제를 포함한다. 항-튜불린제의 예는 예를 들어, 탁산 (예를 들어, 탁솔®(파클리탁셀), 탁소텔(Taxotere®(도세탁셀)), T67 (툴라릭; Tularik), 빈카 알킬로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 돌라스타틴 (예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함한다. 다른 항튜불린제는 예를 들어, 바카틴 유도체, 탁산 유사체 (예를 들어, 에포틸론(epothilone) A 및 B), 노코다졸(nocodazole), 콜히친 및 콜시미드(colcimid), 에스트라무스틴(estramustine), 크립토피신(cryptophysins), 세마도틴(cemadotin), 메이탄시노이드(maytansinoids), 콤브레타스타틴(combretastatins), 디스코데몰라이드(discodermolide) 및 엘레우테로빈(eleutherobin)를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드, 항-튜불린제의 다른 그룹이다. 예를 들어, 구체적인 예에서, 메이탄시노이드는 메이탄신(maytansine) 또는 DM-1 (이뮤노젠, Inc.; 또한 카리 외(Chari et al)., Cancer Res. 52:127-131, 1992 참조)이다.
다른 구체예에서, 세포독성제는 대사길항제이다. 대사길항제는, 예를 들어, 퓨린 길항제 (예를 들어, 아조티오프린(azothioprine) 또는 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)), 디하이드로폴레이트 리덕타제 저해제(dihydrofolate reductase ingibitor) (예를 들어, 메토트렉세이트), 아시클로버(acyclovir), 간시클로버(gangcyclovir), 지도부딘(zidovudine), 비다라빈(vidarabine), 리바비린(ribavarin), 아지도티미딘(azidothymidine), 시티딘(cytidine) 아라비노사이드(arabioside), 아만타딘(amantadine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 이오도데옥시우리딘(iododeoxyuridine), 포스카르넷(poscarnet), 또는 트리플루리딘(trifluridine)일 수 있다.
다른 구체예에서, 항-Axl 단일클론항체는 효소 전환 프로-드럭(pro-drug)이다. 효소 전환 프로-드럭은 재조합에 의해 항체에 융합되거나 또는 공지의 방법을 이용하여 화학적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 효소 전환 프로-드럭의 예는 카복시펩티다제 G2( carboxypeptidase G2), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), 페니실린-V-아미다제(penicillin-V-amidase), 페니실린-G-아미다제(penicillin-G-amidase), β-락타마제(β-lactamase), β-글루코시다제(β-glucosidase), 니트로리덕타제(nitroreductase) 및 카복시펩티다제 A(carboxypeptidase A)이다.
치료제를 단백질, 및 특히 항체에 컨쥬게이트하는 기술은 잘-알려져 있다 (예를 들어, 아논 외(Arnon et al)., "모노클로날 안티바디 포 이뮤노타겟팅 오브 드럭 인 캔서 테라피, 모노클로날 안티바디 앤 캔서 테라피 (레이스펠트 외(Reisfeld et al). eds., 알란(Alan) R. 리스(Liss), Inc., 1985); 헬스트롬 외(Hellstrom et al)., "안티바디 포 드럭 딜리버리, 컨트롤드 드럭 딜리버리 (로빈슨 외(Robinson et al, eds., 마셀 데이커(Marcel Deiker), Inc., 2nd ed. 1987); 소프(Thorpe), "안티바디 캐리어 오브 사이토톡식 에이전트 인 캔서 테라피: 리뷰," 모노클로날 안티바디 '84: 바이올로지컬 앤 클리니컬 어플리케이션 (핀체라 외(Pinchera et al). eds., 1985); "아날리시스, 리절트, 앤드 퓨처 프로스펙티브 오브 더 테라퓨틱 유즈 오브 라디오라벨드 안티바디 인 캔서 테라피," 모노클로날 안티바디 포 캔서 디텍션 앤 테라피 (발트윈 외(Baldwin et al). eds., 아카데믹 프레스, 1985); 및 소프 외(Thorpe et al), 1982, Immunol . Rev . 62:119-58 참조. 또한, 예를 들어, PCT 공개 WO 89/12624 참조.)
진단 용도:
본 발명의 다른 목적은 암 및 Axl 수준이 변형된(증가 또는 감소) 다른 질병의 진단 및/또는 모니터링을 위한 본 발명의 항-Axl 항체에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 위에서 기술된 것으로서 형광 분자, 방사성 분자 또는 기술분야에서 알려진 임의의 다른 표지와 같은 검출가능한 분자 또는 물질로 표지될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 기술분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 방사성 분자로 표지될 수도 있다. 예를 들어 방사성 분자는 I123, I124, In111, Re186, Re188와 같은 신티그래픽(scintigraphic) 연구를 위한 방사성 원자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 또한 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-Ill, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은, 핵 자기 공명 이미징(nuclear magnetic resonance (NMR) imaging)(또한 자기 공명 이미징(magnetic resonance imaging; mri)으로도 알려진)을 위한 스핀 표지로 표지될 수도 있다. 항체의 투여 후에, 환자 내에서 항체의 분포가 검출된다. 어느 특정 표지의 분포를 검출하는 방법은 기술분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있고 어떠한 적절한 방법도 사용될 수 있다. 몇몇 예는, 이에 제한되지 않고, CT(computed tomography), PET(position emission tomography), MRI(magnetic resonance imaging), 형광, 화학발광 및 초음파촬영(sonography)을 포함한다.
본 발명의 Axl 과발현과 관련된 암의 진행 및 진단에 항체는 유용할 수도 있다 (예를 들어, 방사성촬영(radioimaging)에서). Axl 과발현과 관련된 암 질병은 통상적으로 편평 세포암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 교모세포종 및 신경섬유종증과 같은 신경교세포 종양, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 헤파토마(heptoma), 유방암, 결장암(colon cancer), 멜라노마, 대장암(colorectal cnacer), 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암(kidney cancer), 신암 (renal cancer), 전립선암, 외음암(vulval cancer), 갑상선암, 간암종(hepatic carcinoma), 육종, 혈액암(백혈병), 성상세포종, 및 다양한 타입의 두부 및 경부암 또는 다른 Axl 발현 또는 과발현성 과증식성(hyperproliferative) 질병을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 Axl 발현이 증가되거나 감소되는(가용성 또는 세포성 Axl 형태) 암 이외의 질병의 진단에 유용할 수도 있다.
통상적으로, 상기 진단 방법은 환자로부터 획득된 생물학적 샘플의 이용과 연관된다. 여기에서 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 획득된 다양한 샘플 타입을 포함하고 진단 또는 모니터링 어세이에 이용될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액상 샘플, 생검 시료(biopsy specimen)와 같은 고형 조직 샘플 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포, 및 그의 자손(progeny)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 Axl 과발현과 관련된 암 질병을 가지는 것으로 의심되는 개체로부터 수집된 조직 샘플로부터 획득된 세포를 포함하고, 바람직한 구체예에서 상기 세포는 신경교종(glioma), 위, 폐, 췌장, 유방, 전립선, 신장, 간 및 자궁내막으로부터 획득된다. 따라서, 생물학적 샘플은 임상 샘플, 세포 배양물, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체(biological fluid), 및 조직 샘플을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 항체 본 발명의 항체를 이용하여 대상체의 세포 상의 Axl를 검출함에 의한, 대상체에서 Axl 과발현과 관련된 암 질병의 진단 방법이다. 특히, 상기 진단 방법은 다음으로 이루어진 단계를 포함할 수도 있다:
(a) 항체가 Axl을 발현하는 생물학적 샘플의 세포와 복합체를 형성하도록 충분한 항체 조건 하에서, Axl 과발현과 관련된 암 질병이 있을 가능성이 있는 대상체의 생물학적 샘플 및 본 발명에 따른 상기 항체를 접촉;
(b) 상기 복합체의 검출이 Axl 과발현과 관련된 암 질병의 지표인 상기 복합체의 검출 및/또는 정량.
암 질병을 모니터하기 위하여, 암 질병이 진행(progresses) 또는 퇴행(regresses)하는지 결정하는 샘플에 결합하는 항체가 증가하는지 또는 감소하는지를 결정하기 위하여, 본 발명에 따른 진단 방법은 다른 시간 간격으로 반복될 수도 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항-Axl 항체에 의해 진단될 수 있는 인간 면역 질환, 혈전성 질환 (혈전증(thrombosis) 및 아테롬성 혈전증(atherothrombosis)), 및 심혈관 질환과 같은, Axl의 발현 또는 과발현, 또는 가용 형태의 Axl의 감소 또는 증가와 관련된 질병의 진단 방법이다.
치료 용도:
본 발명의 항체, 단편 또는 면역컨쥬게이트는 Axl발현과 관련된 어떠한 질병, 바람직하게는 암을 치료하는데 유용할 수도 있다. 본 발명의 항체는 단독 또는 어느 적합한 약물과 조합하여 사용될 수도 있다.
1) 본 발명의 항-Axl 항체는 Axl 및 또는 Gas6 발현, 과발현 또는 활성화와 관련된 과증식성 질병의 치료제로 사용될 수도 있다. 종양 조직은 특별히 제한되지 않으며 예는 편평 세포암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 교모세포종 및 신경섬유종증과 같은 신경교세포 종양, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 헤파토마(heptoma), 유방암, 결장암(colon cancer), 멜라노마, 대장암(colorectal cnacer), 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암(kidney cancer), 신암 (renal cancer), 전립선암, 외음암(vulval cancer), 갑상선암, 간암종(hepatic carcinoma), 육종, 혈액암(백혈병), 성상세포종, 및 다양한 타입의 두부 및 경부암을 포함한다. 더욱 바람직한 암은 신경교종, 위, 폐, 췌장 유방, 전립선, 신장, 간 및 자궁내막암이다. 2) 본 발명의 항-Axl 항체는 선천성 면역 반응의 강력한 활성화제이고 패혈증(sepsis)과 같은 인간 면역 질환의 치료에 사용될 수도 있으며, 백신과 같은 면역법의 보조제로서 사용될 수도 있고, 항-감염제 (박테리아, 바이러스, 기생충에 대한)로서 사용될 수도 있다. 3) 본 발명의 항-Axl 항체는 정맥 및 동맥 혈전증 및 아테롬성 혈전증(atherothrombosis)과 같은 혈전성 질환을 보전(protect) 또는 치료할 수도 있다.
4) 본 발명의 항-Axl 항체는 심혈관 질환을 보전(protect), 예방 또는 치료할 수도 있다.
5) 본 발명의 항-Axl 항체는 라사(Lassa) 및 에볼라(Ebola) 바이러스와 같은 바이러스의 침입을 예방 또는 저해할 수도 있고 바이러스 감염의 치료에 사용될 수도 있다.
여기에서 기술된 치료 방법의 각각의 구체예에서, 항-Axl 단일클론항체 또는 항-Axl 단일클론항체-약물 컨쥬게이트는 치료가 추구되는 질병 또는 질환의 관리와 관련된 종래의 방법론과 동일한 방식으로 전달된다. 여기에서의 기술에 따라, 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 유효량이 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 일정 시간 및 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 충분한 조건 하에서 투여된다.
따라서, 본 발명의의 목적은 본 발명의 항체, 단편 또는 면역컨쥬게이트의 치료상의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, Axl의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 여기에서 사용된 것으로서, 용어 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는, 이와 같은 용어가 적용되는 질환 또는 상태, 또는 이와 같은 질환 또는 상태의 하나 또는 그 이상의 증상의 예방(preventing), 또는 진행의 역전(reversing), 완화(alleviating), 저해(inhibiting)를 의미한다.
본 발명에 따른, 용어 "환자" 또는 "이를 필요로 하는 환자"는 Axl의 과발현과 관련된 질병에 영향받거나 영향받기 쉬운 인간으로 의도된다.
본 발명의 항체의 "치료상의 유효량"은 어떠한 의학적 치료에도 적용 가능한 합리적인 이점/위험 비율(benefit/risk ratio)에서 상기 암을 치료하기에 충분한 항체의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 항체 및 조성물의 총 일일 용량은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 담당 의사에 의하여 결정되는 것으로 이해될 것이다. 어떤 특정 환자에 대한 구체적인 치료상의 유효 용량 수준은 치료될 질환 및 그 질환의 심각성; 사용된 구체적인 항체의 활성; 사용된 구체적인 조성물, 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 환자의 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용된 구체적인 항체의 배설 속도; 치료기간; 사용된 구체적인 항체와 조합하여 또는 일치하여(coincidental) 사용된 약물; 의학 기술분야에서 잘 알려진 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 목적한 치료적 효과를 얻는데 필요한 용량보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여 목적한 효과가 얻어질 때까지 용량을 점차적으로 증가시키는 것은 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
특정 구체예에서, 항-Axl 단일클론항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 질병 또는 질환의 치료를 위한 제2약물과 조합하여 사용된다. 암 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 항-Axl 단일클론항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 예를 들어, 수술, 방사선요법, 화학요법, 또는 그들의 조합과 같은 종래의 암 치료법과 조합하여 사용될 수도 있다. 특정 관점에서, 본 발명에 따른 항-Axl 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트 암 치료법과 조합하기에 유용한 다른 치료제는 항-혈관형성제를 포함한다. 몇몇 관점에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 사이토카인(예를 들어, 종양에 대한 면역 반응을 자극하는 사이토카인)과 공동-투여(co-administered)된다.
몇몇 관점에서, 여기에서 기술된 항-Axl 단일클론항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 티로신 키나아제 저해제 (TKI)와 조합하여 사용된다.
몇몇 관점에서, 여기에서 기술된 항-Axl 단일클론항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 다른 치료적 단일클론항체 (mAb)와 조합하여 사용된다. 트라스트주맙(Trastuzumab; 허셉틴, 로쉐), 베바시주맙(Bevacizumab; 아바스틴, 로쉐) 및 세툭시맙(Cetuximab;에르비툭스(Erbitux), 머크)의 세 가지가 허가된 mAb 이다. 다른 mAb는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인플릭시맙(Infliximab; 레미케이드, 존슨 & 존슨), 리툭시맙(Rituximab; 리툭산, 로쉐), 아딜리무맙(Adalimumab; 휴미라, 애보트) 및 나탈리주맙(Natalizumab; 티사브리, 바이오젠(Biogen)).
약제학적 조성물:
투여를 위하여, 항-Axl 단일클론항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트는 약제학적 조성물로서 제제화된다. 항-Axl 단일클론항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 알려진 방법에 따라 제제화되어, 치료적 분자가 혼합물에서 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 결합될 수 있다. 투여가 수용자 환자에 의해 관용되는 경우 그 조성물을 "약제학적으로 허용가능한 담체"라 한다. 멸균한 포스페이트-완충된 식염수가 약제학적으로 허용가능한 담체의 하나의 예이다. 다른 적합한 담체가 기술분야에서 잘-알려져 있다(예를 들어, 제나로(Gennaro) (ed.), 레밍턴'스 파마슈티컬 사이언스 (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995) 참조). 제제는 추가로 하나 또는 그 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 알부민, 등을 포함하여 바이알 표면에서 단백질 손실을 방지할 수 있다.
약제학적 조성물의 형태, 투여 경로, 용량 및 요법은 투여될 조건, 병의 심각성, 환자의 나이, 체중 및 성별 등에 따라 당연히 달라진다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 투여 등을 위해 제제화될 수 있다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 주사될 수 있는 제제에 약제학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성(isotonic), 멸균된, 식염수 용액(모노소듐 또는 다이소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이와 같은 염의 혼합물), 또는, 경우에 따라, 멸균된 물 또는 생리 식염수의, 부가에 따라, 주사 가능한 용액 구조가 되는, 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수도 있다.
투여를 위해 사용되는 용량은 다양한 파라미터의 작용, 및 특히 사용된 투여 모드, 관련된 병인, 또는 이에 대신하여 목적한 치료기간의 작용에 따라 조절될 수 있다.
약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 유효량의 항체는 약제학적 허용가능한 담체 또는 수성 매질(수성 매질)에서 용해 또는 분산될 수도 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 세서미 오일, 피넛 오일 또는 수용성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균된 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉시 투여용(extemporaneous) 제제를 위한 멸균 파우더를 포함한다. 모든 경우에서, 제제는 멸균되어야 하고, 용이한 주사성(syringability)이 있을 정도로 유동성이어야 한다. 그것은 제작 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다.
유리 염기로서 활성 화합물의 용액 또는 약물학적으로 허용가능한 염은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 리퀴드 폴리에틸렌 글리콜, 및 그들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용 조건하에서, 제제는 방부제를 함유하여 미생물의 성장을 방지한다.
본 발명의 항체는 중성 또는 염 상태에서 조성물로 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가염(단백질의 자유 아미노기와 함께 형성된)을 포함한다. 자유 카복시기로 형성된 염은 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 페릭 하이드로사이드(ferric hydroxides)와 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 또한 유래될 수 있다.
담체는 또한 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 리퀴드 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매(dispersion medium)일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의하여, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의하여 및 계면활성제의 사용에 의하여 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살, 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균제에 의하여 초래될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 예를 들어, 당 또는 염화 나트륨의 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 지속적인 흡수는 조성물에서 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 흡수 지연제의 사용에 의해 초래될 수 있다.
멸균한 주사 가능한 용액은 적절한 용매에서 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라, 위에서 열거한 다양한 다른 성분에 포함시킨 후 멸균 여과하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 기본 분산매 및 위에서 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 파우더의 경우, 바람직한 방법은 앞서 기술한 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분의 파우더 플러스 어떤 부가의 목적 성분를 산출하는 진공-건조(vacuum-drying) 및 동결-건조(freeze-drying) 기술이다.
직접적인 주사를 위한 많은, 또는 높은 농도의 용액의 제조 방법 또한 고려되고, 용매로 DMSO가 고려되는 경우 매우 신속한 침투, 작은 종양 영역으로 고 농도의 활성제가 전달된다.
제제시, 용액은 투약 제형(dosage formulation)과 양립 가능한 방식 및 치료상으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 위에서 기술된 주사가능한 용액과 같이 다양한 투약 형태로 용이하게 투여되고, 약물 방출 캡슐 등 또한 사용될 수 있다.
수용액의 비경구 투여를 위하여, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충되어야하고 액상 희석액은 충분한 식염수 또는 글루코오스로 먼저 등장이 되도록 만들어야 한다. 이 특정 수용액은 특히 정맥, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이런, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시의 관점에 비추어 기술분야에서 통상의 기술자에게 알려질 것이다. 예를 들어, 하나의 용량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해되고 1000 ml의 피하주사액(hypodermoclysis fluid)에 가해지거나 주입의 후보 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "레밍턴 파마슈티컬 사이언스" 15th 에디션, 1035-1038 및 1570-1580 페이지 참조). 용량에서 처치될 대상체의 상태에 따라 몇몇 변화가 필수적으로 일어날 것이다. 투여를 책임지는 사람은, 어떤 경우에도, 각 대상체에게 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 발명의 항체는 치료적 혼합물 내에서 제제화되어 용량마다 약 0.0001 내지 1.0 밀리그람, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그람, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 약 10 밀리그람 등을 포함할 수도 있다. 복수회 용량(Multiple doses)으로 또한 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위해 제제화된 화합물에 더하여, 정맥 또는 근육내 주사와 같은, 다른 약제학적으로 허용가능한 형태는 예를 들어, 정제 또는 경구 투여를 위한 다른 고형 제제; 서방성 캡슐(time release capsules); 및 현재 사용되는 어떤 다른 형태를 포함한다.
특정 구체예에서, 항체를 숙주 세포로 도입하기 위하여 리포좀 및/또는 나노입자의 사용이 고려된다. 리포좀 및/또는 나노입자의 제제화 및 용도는 기술분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생가능한 방식으로 화합물을 봉입할 수 있다. 세포내 중합성 오버로딩(intracellular polymeric overloading)에 기인한 부작용을 피하기 위하여, 일반적으로 인 비보에서 분해 가능한 폴리머를 사용하여 이와 같은 초미세 입자 (약 0.1㎛의 크기)가 설계된다. 본 발명에서 이러한 요구를 만족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자의 사용이 고려되고 이와 같은 입자는 용이하게 만들 수도 있다.
리포좀은 수성 매질에서 분산되어 있는 인지질로부터 형성되고 자발적으로 다중 동심원성 이중층 소포체(multilamellar concentric bilayer vesicles) (또한 다중층 소포체(multilamellar vesicles; MLVs)라 하는)를 형성한다. MLVs는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛의 직경을 가진다. MLVs를 초음파 처리하여 코어에 수성 용액을 함유하는, 200 내지 500 Å 범위의 직경을 가지는 작은 단일층 소포체(small unilamellar vesicles; SUVs)가 형성된다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
키트 :
마지막으로, 본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 항체를 함유하는 키트는 Axl 발현 (증가 또는 감소)의 검출에서, 또는 치료적 또는 진단 어세이에서 사용하게 된다. 본 발명의 키트는 고체 지지체, 예를 들어, 조직 배양 플레이트 또는 비드 (예를 들어, 세파로즈 비드)에 결합된 항체를 함유할 수 있다. 항체를 함유하는 키트가 인 비트로 Axl의 검출 및 정량, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯을 위해 제공될 수 있다. 이와 같은 검출에 유용한 항체는 형광 또는 방사성 표지와 같은 표지와 함께 제공될 수도 있다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하도록 해석되어서는 안된다.
실시예 :
실시예 1: 마우스 항- AXL 단일클론항체의 생성
Axl에 대한 단일클론 항체는 Balb/c 마우스의 연속적인 면역(sequential immunization)에 의하여 개발되었다. Balb/c 마우스는 인간 Fc 도메인 (hAxl-hFc 단백질; R&D system)에 융합된 인간 Axl 세포외 도메인 (hAxlECD)으로 과면역(hyperimmunized)되었다. 프로인트 완전 (Freund's complete; 첫번째 주사) 또는 불완전 (incomplete; 두번째 및 세번째 주사) 보조제의 존재 하에서, 0, 14 및 28일에 10 ㎍의 가용성 hAxl-hFc를 Balb/c 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스 비장 세포는 이전에 기술된 프로토콜(살리(Salhi) 외. 바이오켐(Biochem). J. 2004)을 이용하여 마우스 골수종 세포 (PX63.Ag8.653; ATCC, 록빌(Rockville), MD)에 융합되었다. 세포는 플레이트 (웰 당 105)에서 하이브리도마 선택을 위한 HAT 배지로 배양되었다. 12일 후, 상청액이 수확되었고 직접적인 효소-결합 면역 측정 어세이 (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)에 의하여 Axl 결합 특이성 (hAxl-hFc 또는 hFc 단독)을 위하여 스크린되었다. 한계 희석(limiting dilution)에 의하여 서브클로닝의 두 번째 라운드 후에 여덟 개의 양성 클론이, mAb의 인 비트로 생성에서 큰 규모로 확장되었다. 컨디션드 상청액(Conditioned supernatant)은 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되었다.
실시예 2: 마우스 항- AXL 단일클론 항체는 마우스 Axl 또는 인간 TAM 수용체 패밀리의 다른 구성과 교차 반응( CROSS REACT )하지 않는다.
실시예 2.1: ELISA 에 의해 확정된 것으로서 마우스 항- AXL 단일클론 항체는 마우스 Axl 또는 인간 TAM 수용체 패밀리의 다른 구성과 교차 반응(CROSS REACT)하 지 않는다.
요약하면, hAxl-hFc 코팅된 플레이트는 1% 우혈청 알부민 (BSA) PBS, 0.1% 트윈 20 (PBST)으로 포화되었다.
교차 반응 어세이를 위하여, 코팅된 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인간 Axl-Fc (h-Axl), 마우스 Axl-Fc (m-Axl) 또는 인간 Mer-Fc (h-Mer), Tyro-3-Fc (h-Tyro-3)로 인큐베이트되었고 PBST에서 네 번 세척되었다. 플레이트는 항-Axl mAbs (37℃에서, 2 시간)로 인큐베이트되었고 PBST에서 네 번 세척되었다. 플레이트는 1% BSA, PBST에서, 1:2000 희석 HRP-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG (Sigma; 시그마)로 인큐베이트되었다(37℃에서 1 시간). 마지막으로, 오르토-페닐렌디아민 용액 (시그마)이 암소, 실온에서 30분 동안 가해지고 450 nm에서 흡광도가 측정되었다.
선택된 열 개의 항-hAxlECD mAbs의, h-Axl에 대한 특이성은, 용량-특이적 방식(dose-specific manner)으로 설명된다(도 1).
실시예 2.2: FACS 에 의해 확정된 것으로서 마우스 항- Axl 단일클론항체는 Axl-발현 세포에 특이적으로 결합한다.
Axl 발현 세포를 특이적으로 인지하는 본 발명의 마우스 항-Axl 단일클론 항체의 능력이 표준 기술을 이용하여 FACS에 의해 확정되었다. 요약하면, A549 세포 (ATCC 번호: CCL-185)는 수확되고, 4℃에서 1 시간 동안, 본 발명의 정제된 마우스 항-Axl 단일클론 항체로 염색되었으며, PBS-BSA 0.1%에서 세 번 세척되었다. 그리고나서, 암소, 4℃에서 45분 동안 플루오레세인-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG (1:50) (시그마)로 염색되었다. 샘플은 EPICS 유세포 분석기 (베크만-쿨터(Beckman-Coulter), 풀러턴(Fullerton), CA)상에서 분석되었다. 도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명의 마우스 항-Axl 단일클론 항체는 Axl 발현-A549 세포에 특이적으로 결합한다.
실시예 2.3: BIACore 에 의해 평가된 마우스 항- Axl 단일클론항체의 친화성 측정
항-Axl 항체의 결합 친화성을 확정하기 위하여, BIAcore-3000 기기(BIACORE AB, 웁살라(Uppsala), 스웨덴)로 표면 플라즈몬 공명 측정이 이용되었다. 실험은 실험실에 있는 프로테오믹 이미징 앤 몰레큘러 인터렉션(Proteomic Imaging and Molecular Interactions) (M. Pugniere)의 플랫폼으로부터의 설비에서 수행되었다. 항-Axl 항체 및 hAxl-hFc 사이의 친화성을 측정하기 위하여, 마우스 항-Axl 단일클론 항체는 hAxl-hFc로 코팅된 CM5 바이오센서 칩 (아민 커플링 키트를 이용하는(BIAcore AB))에 의하여 포획되었다. 속도(kinetics) 측정을 위하여, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 0.005% 계면활성제 P20 버퍼 중의 다양한 농도의 항-Axl mAb (2 내지 133 nM)가 25℃에서 50 ml/분의 유속으로 주사되었다. 결합속도(Association rates; ka) 및 해리 속도(dissociation rates; kd)는 간단한 원-투-원 랭뮤어 결합 모델(BIAcore 이밸류에이션 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산되었다. 평형 해리 상수 (KD)는 ka/kd 비율로서 계산되었다. 도시된 바와 같이(도 3A), 20G7-D9는 KD 5.3x10-8M을 보여주었다.
실시예 3: 마우스 항- AXL 단일클론항체는 GAS6 의 결합을 차단하지 않는다
경쟁 분석을 위하여, 포화 농도의 Gas6(625 nM)가 hAxl-hFc 코팅된 CM5 바이오센서 칩에 주사되었다(아민 커플링 키트를 이용하는 (BIAcore AB)). 마우스 항-Axl 단일클론항체 (666 nM)는 Gas6의 제거 없이 주사되었다. 첫 번째로 마우스 항-Axl 단일클론항체 (666 nM) 및 두 번째로 Gas6 (625 nM)를 주사하는 동일한 실험이 수행되었다. 결과는 20G7-D9는 hAxlECD 에 대한 Gas6 리간드와 경쟁 반응하지 않음을 보여주었다(도 3B).
실시예 4: 본 발명의 마우스 항- AXL 단일클론항체는 인 비트로에서 리간드 유도된 Axl 인산화를 저해한다.
본 발명의 마우스 항-Axl 단일클론항체가 Axl의 리간드 Gas6-유도 인산화를 차단할 수 있는지 조사하기 위하여 ELISA 실험이 수행되었다. 요약하면, BXPC3 (ATCC 번호: CRL-1687), Capan-1 (ATCC 번호: HTB-79), PANC1 (ATCC 번호: CRL-1469) 및 MIAPaCa-2 (ATCC 번호: CRL-1420) 세포가 평편한(flat-bottom) 6 웰 플레이트, 정상 성장 배지(normal growth medium)에 시딩되었다. 다음날, 성장 배지는 무-혈청 배지로 교체되어 하룻밤, 24시간 동안 세포를 결핍(starve)시켰다. 세포는 본 발명의 정제된 마우스 단일클론 항-Axl의 100 ㎍/mL로 전-인큐베이트(pre-incubated) 되었고, 그 후 37℃에서 30분 동안 Gas6로 인큐베이트된 250 ng/mL Gas6 유무로 처리하였다. 그 뒤에, 배지가 제거되었고, 세포는 포스파타제 및 프로테아제 저해제 (Roche Dianostics, Meylan, France)로 보충된 50 ㎕의 용해 버퍼(20 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100 (v/v), 10% 글리세롤 (v/v), 100 mM 소듐 플루라이드, 0.1 mM 페닐메틸설포닐 플루라이드, 1 mM 소듐 오르토바나데이트(시그마))에서 30분 동안 용해되었다. 원심분리에 의하여 세포 잔해가 제거되고 단백질 농도가 브래드포드 비색 반응(Bradford colorimetric reaction)에 의하여 확정되었다. 비색 어세이에서, 제조자에 의하여 기술된 대로 PathScan®포스포-Axl (PanTyr) 샌드위치 ELISA Kit (RD 시스템, 미니애폴리스, MN)가 450 nm에서 흡광도를 측정하는 포스포-Axl 수준의 검출을 위하여 사용되었다.
도 4에 도시한 바와 같이, mAb 20G7-D9는 모든 췌장암 세포주에서 Gas6 리간드-유도 Axl 인산화를 강하게 저해하였다. 다른 mAbs는 모든 췌장암 세포주에서 Gas6 리간드-유도 Axl 인산화를 저해하지 않거나 약간만 저해하였다.
실시예 5: 본 발명의 마우스 단일클론항체 항- AXL 는 세포 이주( cell migration)를 저해한다.
치유 과정을 관찰하는 상처 치유 어세이가 수행되었다. 상처 치유 과정에서 인위적으로 만든 상처의 가장자리의 세포가 상처 부위를 향하여 이주하였다. A549 세포는 24 웰 플레이트에서 컨플루언시 또는 근접 컨플루언시 (>90%)로 배양되었다. 상처 부위(wound field)는 멸균한 피펫 팁을 이용하여 웰의 중앙에 만들어졌다. 유주 세포는 돌출부(protrusions)를 확장할 수 있고 궁극적으로 상처 부위를 침습 및 폐쇄한다. 세포는 PBS로 매우 부드럽게 씻겨지고 100 ㎍/mL의 Gas6의 유무 하에서, 본 발명의 정제된 마우스 항-Axl 단일클론 항체 (100 ㎍/mL)로 인큐베이트되었다. 세포 이주 속도는 현미경 영상을 이용하여 처리 24 시간 후에 확정되었다. 도 5에 도시한 바와 같이, mAb 20G7-D9는 세포 이주를 강하게 저해하였는데, mAb1 또는 Gas6 처리 세포와는 대조적으로 치유 부위가 여전히 육안으로 볼 수 있었다.
실시예 6: 본 발명의 마우스 단일클론항체 항- AXL 는 세포 증식을 저해한다.
MIAPaca-2, Capan-1 및 PANC1 췌장암 세포가 96-웰 플레이트에서 4000 세포/웰로 시딩되었고 5일 동안 마우스 항-Axl 단일클론 항체 (25, 50 또는 100 ㎍/mL)로 처리되었다. 세포 증식 어세이가 MTS 어세이 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움)를 이용하여 수행되었다. MTS는 세포에 의해 조직 배양 배지에서 가용성인 포르마잔 생성물로 환원되었다. 포르마잔의 흡광도는 분광광도계를 이용하여 490 nm에서 측정되었다. 도 6에 도시한 바와 같이, 다른 Axl-특이적 항체 (mAb1)에서는 약간의 억제가 관찰된 반면에, mAb 20G7-D9는 췌장 세포의 증식을 강하게 억제하였다.
실시예 7: 본 발명의 마우스 항-인간 AXL 단일클론항체는 AXL 발현을 하향-조절( down - regulates )하고 AKT 경로를 저해한다.
mAb 20G7-D9에 의한 Axl 인산화 및 세포 이주의 억제와 관련된 메커니즘을 판독하기 위하여, 그의 Axl 수용체에 미치는 직접적인 효과 및 다운스트림 신호전달 경로가 분석되었다(Gas6 리간드에 의한 Axl 수용체의 활성화는 몇몇의 중요한 신호전달 캐스캐이드, AKT 경로를 현저히 유도하는 것으로 보고되었다). Axl 수용체 하향-조절 및 Axl 수용체 및 Akt의 인산화가 웨스턴 블롯에 의하여 20G7-D9 mAb 처리된 췌장암 세포주 (Panc-1 세포)에서 분석되었다.
췌장암 세포주, Panc-1 세포는 6 웰 플레이트 (웰 당 1x106 세포)에 플레이팅되었고 37℃에서 100 ug/ml 20G7-D9로 인큐베이트되었다. 다른 시간 지점에 수확된 세포주가 2 mM 페닐메틸설포닐 플루라이드, 100 mM 소듐 불화물(fluorure), 10 mM 소듐 오르토바나데이트, 및 완전 프로테아제 저해제 혼합물 1 정 (시그마, St Louis, MO)를 함유하는 버퍼 (150 mM NaCl, 10 mM TRIS pH7.4, 1mM EDTA, 1% TRITON X100)에서 용해되었다. 환원 조건 하에서, 8%- 또는 10%-SDS-PAGE에 넣은 후, 단백질은 0.1% 트윈 20 및 5% 무지방 분유를 함유하는 PBS에서 포화된 폴리비닐리덴 디플루라이드 멤브레인 (밀리포어; Millipore, 베드포드, MA) 상으로 이동되었다. 멤브레인은 4℃에서 하룻-밤 동안 셀 시그날링 테크놀로지(Cell signaling Technology)로부터의 항-인간-AXL (R&D systems), 항-포스포 (Y702) Axl 또는 항-포스포 (S473) Akt의 적절한 희석액으로 인큐베이트되었다. 면역블롯이 항체를 겨냥한 GAPDH (밀리포어)를 이용하여 정규화되었다. 멤브레인은 그 후 적절한 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 이차 항체 (Bio-Rad)로 인큐베이트되고 ECL 검출 (아머셤; Amersham) 및 G:BOX iChemi (신진; Syngene) 분석이 진행되었다.
세포가 mAb 20G7-D9로 처리되면, 90 분 후에 Axl 발현이 급격히 감소하고, 24 시간 후에는 거의 검출 불가능하다(도 7A). 포스포-Axl 및 포스포-Akt의 양의 유도는 세포가 Gas6로 자극된 경우 관찰되었다. 양 신호는 mAb20G7-D9의 전-처리에 의하여 급격하게 억제되었다(도 7B).
실시예 8: 본 발명의 마우스 항-인간 AXL 단일클론항체는 Axl 수용체의 하향-조절과 관련된 인간 삼중 음성 유방 암 및 췌장암의 인 비보 성장을 감소시킨다.
모든 인 비보(in vivo ) 실험은 동물 실험을 위한 프랑스 가이드라인에 부합하게 수행되었다(승낙 no. C34-172-27). 6-주령 암컷 무흉선 누드 마우스를 할란(Harlan)으로부터 구입하였다. 삼중-음성 유방암 세포 (5 x 106; MDA-MB-231; ATCC 번호: HTB-26) 또는 췌장 암종 세포 (3.5 x 106, BXPC3; 5x106, MIAPaCa-2)는 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 이식되었다. 종양을-갖고 있는 마우스를 종양이 약 100mm3 의 부피에 달하였을 때 다른 처리 군으로 무작위로 추출하였다. 마우스는 복강내 주사에 의하여 비히클 (0.9% NaCl) 또는 본 발명의 마우스 항-Axl 단일클론 항체, 300 ㎍/주사(injection), 단독, 또는 젬시타빈 (젬자; GEMZAR)으로 처리되었다 (일주일에 두 번, 4 주 동안). 종양 부피는 캘리퍼로 매주 측정되었다. BXPC3에 대한 결과는 또한 종양이 2,000 mm3의 미리-결정된(pre-defined) 부피에 달하는 시간을 이용하는 카플란-마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier survival curve)에 의하여 표현되었다. 중앙 지연(median delay)는 2,000 mm3의 부피에 도달한 종양을 가지는 마우스가 50%인 시간으로써 확정되었다. 항-hAxl mAb 20G7-D9는, mAb1는 그렇지 않지만, MDA-MB-231 및 췌장 이종이식의 종양 성장을 감소시켰다(도 8A, B, C). 변형된 카플란-마이어 곡선은 NaCl-처리된 마우스와 비교하여, 마우스가 20G7-D9항체로 처리된 경우 50% 생존 도달이 5-일 지연됨을 설명하였다 (도 8D).
다른 시리즈의 실험상에서, mAb 20G7-D9 또는 무관한 뮤린 IgG1 이소타입 mAb (Px)으로 처리된 MIAPaca-2 이종이식이 두 mAb 처리 주사 후에 외식되었고 Axl 수용체 (항-Axl mAb, R&D 시스템) 또는 GAPDH 컨트롤 단백질 (항-GAPDH , 밀리포어)의 웨스턴-블롯 검출을 위하여 사용되었다. mAb20G7-D9 처리는 종양에서 Axl 발현의 현저한 감소를 유도하였다(도 8E).
실시예 9: 마우스 항-인간 AXL 단일클론항체의 에피토프는 , 인간 AXL 의 면역글로불린 유사 도메인 2에 위치된 하나, 피브로넥틴 3 도메인 1에 위치된 하나 및 피 브로넥틴 3 도메인 2에 위치된 하나의 3 펩티드로 구성된 입체구조적 에피토프이다 .
에피토프 구조를 확정하기 위하여, 고정된(immobilized) 항원-항체 복합체의 제한된 단백질 분해 어세이가 수행되었다. 20G7-D9 에피토프를 맵핑하기 위하여, hAxl-hFc는 생리학적 조건 하에서, 고정된 20G7-D9 단일클론항체에 친화성 결합되었다. 단백질 분해 효소적 분해(proteolytic enzymatic cleavages)의 시리즈 (세린 프로테아제 트립신 및 엔도프로테나제 GluC)가 수행되어 20G7-D9에 의하여 보전되지 않는 hAxl-Fc 잔기를 제거하였다. 용출 후, 보전된 잔기, 즉, 20G7-D9 에피토프가, 고정된 항체에 친화성 결합하는 펩티드의 MALDI-MS 분석에 의하여 확정된 그들의 분자량에 기초하여 동정되었다.
20G7-D9 단일클론항체 (250 ㎍)는 실온에서, 1시간 동안, 공급자의 절차에 따라 프로막 마그네틱 마이크로스페어 PMC3N(ProMag Magnetics Microsphere PMC3N ; 뱅 레이보러토리(Bangs Laboratories))에 커플링되었다. 50 ㎍의 20G7-D9 마이크로비드 복합체는 50 ㎍의 항원 hAxl-hFc (R&D 시스템)로 인큐베이트되었고 4℃에서 90분 동안 결합되었다. 버퍼로 세 번 세척하여 자유 항원이 제거되었다. 20G7-D9 및 hAxl-hFc의 면역 복합체는 37℃에서 2시간 15분 동안 0.35 ㎍의 트립신 또는 GluC로 소화되었다. 상청액이 원심분리 (2000g, 4℃, 3 분)에 의하여 분리되어 버려졌다. 20G7-D9 및 hAxl-hFc 보전된 잔기와 관련된 마이크로비드는 버퍼로 세 번 세척되었다. TFA (트리플루오르아세트산; trifluoroacetic acid) 0.1%을 이용하여 실온에서 40분 동안 해리가 허용되었다. 스펙트럼이 MALDI 질량 분석기 (355nm, 200Hz, 텐션 소스를 위한 20kV, 250 ns의 추출시간 에서, Laser Nd/YAG가 있는 ABSCIEX MALDI 4800 )에 의하여 합계 1500의 레이져 샷(laser shots)으로 얻어졌다. 샘플에 사용된 메트릭스는 5mg/mL의 α-시아노-4-하이드록시시나미닉 산(α-cyano-4-hydroxycinnaminic acid; CHCA)이었다. 동정된 항원 hAxl-hFc (R&D 시스템)의 서열 구성 및 20G7-D9의 에피토프 서열이 도 9에 도시된다. 마우스 단일클론 20G7-D9 항체는 면역글로불린 유사 도메인 2(서열: "TSSFSCEAHNAK")에 위치한 하나, 피브로넥틴 타입 III 도메인 1(서열: "GMGIQAGEPDPPEE")에 위치한 하나 및 피브로넥틴 타입 III 도메인 2(서열: "TPEVLMDIGLRQE")에 위치된 하나의, 3 펩티드로 구성된 입체구조적 3D 에피토프에 결합한다.
실시예 10: 마우스 항-인간 AXL 단일클론항체의 에피토프는 허용 가능한 용매 표면적에 노출되고 구조적으로 GAS6 의 상호 작용 부위와 멀리 떨어져 위치해 있다.
인간 Axl 단백질의 세포외 도메인 모델이 2 단계로 구축되었다. 먼저, 면역글로불린-유사 도메인 (도메인 1 및 2)이 2C5D 코드 하에서, 단백질 데이터 뱅크에서 이용 가능한 결정학상 구조로부터 추출되었다. 이 구조는 Axl 엑토도메인의 두 개의 면역글로불린-유사 도메인이 Gas6의 첫 번째 라미닌 G-유사 도메인에 의하여 교차결합된(crosslinked) Axl/Gas6 복합체를 표현한다. 유감스럽게도, Axl의 두 개의 피브로넥틴 타입 III (FN3) 도메인은 아직 구체화되지 않았고, 따라서 모형화하는 것이 필요하였다. 모델이 상동 모델링법에 의하여 템플레이트로 인간 티틴(titin) 단백질 (PDB id: 3LPW)의 A 사슬로부터의 FN3 탠덤 A77-A78의 3D 구조를 이용하여 구축되었다. 정렬 후, 두 개의 단백질의 서열은 22.8 %의 상동성을 공유한다. 마지막으로, 면역글로불린-유사 도메인 및 피브로넥틴 타입 III 도메인이 두 도메인의 곁사슬 사이의 입체 장해(steric hindrance)를 최소화하기 위하여 이면각(dihedral angles)을 변형한 류신 224 및 프롤린 225 사이에서 함께 결합되었다.
그리고 나서 인간 Axl의 전체 엑토도메인의 이 모델 상에서 Gas6 결합 도메인과 마우스 항-Axl 항체 20G7-D9의 에피토프가 동정되었다. 이 모델은 Axl의 20G7-D9에 의하여 인지되는 세 개의 표면-위치된 항원성 부위의 특이적 위치결정을 설명한다(도 10). 이 모델은 또한 3 펩티드 (첫 번째는 Axl의 IgG유사 2, 두 번째는 Axl의 FN3 도메인 1 및 세 번째는 Axl의 FN3 도메인 2에 있는)로 구성된 20G7-D9 에피토프는, 리간드-결합 부위 (IgG 유사 도메인 1에 위치된 Gas6-결합 부위)로부터 멀리 떨어진 곳에 위치함을 설명하였다(실시예 3; 도 3B). 이는 수행된 경쟁 연구와 상응하는 결과였다.
참고문헌:
본 출원을 통하여, 다양한 참고문헌은 본 발명이 속한 기술분야의 상황을 기술한다. 이들 참고문헌의 개시는 본 명세서에 참고로써 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> INSERM ORIBASE PHARMA <120> ANTI-AXL ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> BIO11241 ROBERT / MC <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Asn Asp Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H-CDR1 <400> 2 Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H-CDR2 <400> 3 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Asn 1 5 10 15 Asp <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> H-CDR3 <400> 4 Pro Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL Chain <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Arg Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-CDR1 <400> 6 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-CDR2 <400> 7 Asn Ala Lys Thr Leu Ala 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-CDR3 <400> 8 Gln His His Tyr Ala Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope 1 <400> 9 Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope 2 <400> 10 Gly Met Gly Ile Gln Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope 3 <400> 11 Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly Leu Arg Gln Glu Val 1 5 10 <210> 12 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hAxl-hFc <400> 12 Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg 1 5 10 15 Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro 20 25 30 Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp 35 40 45 Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp 50 55 60 Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80 Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser 85 90 95 Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu 100 105 110 Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys 115 120 125 Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp 130 135 140 Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu 145 150 155 160 His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His 165 170 175 Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu 180 185 190 Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu 195 200 205 Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr 210 215 220 His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asn Asp Gly Met Gly Ile Gln 225 230 235 240 Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro 260 265 270 Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp 275 280 285 Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro 290 295 300 Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His 305 310 315 320 Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg 325 330 335 Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly 340 345 350 Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser 355 360 365 Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro 370 375 380 Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Val Lys Glu Pro 385 390 395 400 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp Pro Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro 405 410 415 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 420 425 430 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 435 440 445 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 450 455 460 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 465 470 475 480 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 485 490 495 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 500 505 510 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 515 520 525 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 530 535 540 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 545 550 555 560 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 565 570 575 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 580 585 590 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 595 600 605 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 610 615 620 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 625 630 635 640 Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His 645 650

Claims (18)

  1. H-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:2, H-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:3 및 H-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:4 을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 L-CDR1 영역에서 SEQ ID NO:6, L-CDR2 영역에서 SEQ ID NO:7 및 L-CDR3 영역에서 SEQ ID NO:8을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 Axl에 특이성을 갖는 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 단일클론 항체.
  3. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 단일클론 항체.
  4. 제2항 및 제3항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 단일클론항체.
  5. 제4항에 있어서, 키메릭 항체, 바람직하게는 키메릭 마우스/인간 항체인 단일클론항체.
  6. 제1항에 있어서, 인간화된 항체인 단일클론항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열, SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열에서 Axl의 세포외 도메인에 결합하는 것인 단일클론항체.
  8. Fv, Fab, F(ab')2, Fab' dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단일클론항체의 단편.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열.
  10. 제9항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제9항에 따른 핵산 또는 제10항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-Axl 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법.
  15. 암의 진단에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-Axl 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체 내에서 인간 면역 질환, 혈전성 질환, 심혈관 질환 및 바이러스, 박테리아, 또는 기생충 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병을 치료하는 방법 .
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 그를 필요로 하는 대상체의 선천성 면역 반응을 활성화하는 방법.
  18. 인간 면역 질환, 혈전성 질환, 심혈관 질환 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항에 따른 그의 단편.
KR1020147001805A 2011-06-22 2012-06-22 항-ａｘｌ 항체 및 그의 용도 KR20140104944A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11305793 2011-06-22
EP11305793.9 2011-06-22
US201161504258P 2011-07-04 2011-07-04
US61/504,258 2011-07-04
PCT/EP2012/062114 WO2012175691A1 (en) 2011-06-22 2012-06-22 Anti-axl antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140104944A true KR20140104944A (ko) 2014-08-29

Family

ID=47422056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147001805A KR20140104944A (ko) 2011-06-22 2012-06-22 항-ａｘｌ 항체 및 그의 용도

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9249228B2 (ko)
EP (1) EP2723376B1 (ko)
JP (1) JP6033293B2 (ko)
KR (1) KR20140104944A (ko)
AU (1) AU2012273954A1 (ko)
CA (1) CA2839508A1 (ko)
WO (1) WO2012175691A1 (ko)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9409988B2 (en) * 2011-06-22 2016-08-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-Axl antibodies and uses thereof
EP2589609A1 (en) * 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
US9382331B2 (en) * 2013-12-27 2016-07-05 Development Center For Biotechnology Alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
US20150252370A1 (en) * 2014-03-04 2015-09-10 Academia Sinica Use of atx inhibitors for treatment or prevention of influenza virus a infections
GB201410825D0 (en) * 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
GB201410826D0 (en) * 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
SI3169706T1 (sl) * 2014-07-11 2020-04-30 Genmab A/S Protitelesa, ki vežejo AXL
US10398774B2 (en) * 2014-12-09 2019-09-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Human monoclonal antibodies against AXL
EP3233119A2 (en) * 2014-12-18 2017-10-25 Bergen Teknologioverforing AS Anti-axl antagonistic antibodies
US9527922B2 (en) * 2014-12-31 2016-12-27 Development Center For Biotechnology Humanized alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
WO2016108894A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Develpment Center For Biotechnology Humanized alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
GB201506409D0 (en) * 2015-04-15 2015-05-27 Williams David G And Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Humanized anti-axl antibodies and their conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
EP3297663A4 (en) 2015-05-18 2018-12-19 Agensys, Inc. Antibodies that bind to axl proteins
EP3297662A4 (en) 2015-05-18 2019-03-13 Agensys, Inc. ANTIBODY BINDING TO AXL PROTEINS
GB201509338D0 (en) 2015-05-29 2015-07-15 Bergenbio As Combination therapy
LT3319993T (lt) 2015-07-10 2020-05-11 Genmab A/S Axl specifiniai antikūno-vaistokonjugatai, skirti vėžiui gydyti
US11091559B2 (en) 2015-08-27 2021-08-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ALK antibodies and methods for use thereof
US20190030180A1 (en) * 2016-01-13 2019-01-31 Genmab A/S Formulation for antibody and drug conjugate thereof
KR102477922B1 (ko) * 2016-03-16 2022-12-14 아베오미 코포레이션 Il-25에 대한 중화 모노클로날 항체 및 그의 용도
GB201610902D0 (en) 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
EP3612234B1 (en) 2017-04-20 2024-03-13 ADC Therapeutics SA Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
BR112020005011A2 (pt) * 2017-09-13 2020-09-15 National Research Council Of Canada anticorpos específicos de axl e usos dos mesmos
JP6544669B1 (ja) 2018-03-16 2019-07-17 ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジー アルファエノラーゼに特異的な抗体及びその使用
US20210070869A1 (en) 2018-04-10 2021-03-11 Genmab A/S Axl-specific antibodies for cancer treatment
WO2021013746A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Genmab A/S Axl antibody-drug conjugates for use in treating cancer
GB201912059D0 (en) 2019-08-22 2019-10-09 Bergenbio As Combaination therapy of a patient subgroup
TW202126696A (zh) * 2019-09-20 2021-07-16 美國德州系統大學評議委員會 抗epha10抗體及其使用方法
GB202004189D0 (en) 2020-03-23 2020-05-06 Bergenbio As Combination therapy
AU2021252094A1 (en) 2020-04-08 2022-11-10 Bergenbio Asa AXL inhibitors for antiviral therapy
GB202006072D0 (en) 2020-04-24 2020-06-10 Bergenbio Asa Method of selecting patients for treatment with cmbination therapy
CN114075548B (zh) * 2020-08-13 2023-11-21 广州医科大学附属第二医院 一种靶向axl的car-t细胞及其制备方法和应用
GB202104037D0 (en) 2021-03-23 2021-05-05 Bergenbio Asa Combination therapy

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994019478A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 The Rockefeller University Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2205007C (en) 1995-09-11 2010-12-14 Masamichi Koike Antibody against human interleukin-5 receptor .alpha. chain
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
EP0973540B1 (en) 1997-02-25 2005-11-02 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2287084A1 (en) 1997-04-10 1998-10-15 Royal Netherlands Academy Of Arts And Sciences Diagnosis method and reagents
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
WO2002000879A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
EP1382969A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
KR100650384B1 (ko) * 2005-09-12 2006-11-30 전남대학교산학협력단 성숙자연살해세포의 분화용 조성물 및 그 제조 방법
AU2008323206B2 (en) 2007-11-12 2014-08-14 U3 Pharma Gmbh AXL antibodies
AU2008321835B2 (en) * 2007-11-15 2014-11-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
EP2270053A1 (en) * 2009-05-11 2011-01-05 U3 Pharma GmbH Humanized AXL antibodies
CN102421802B (zh) * 2009-05-11 2014-08-20 U3制药有限公司 人源化的axl抗体
RU2011151069A (ru) * 2009-05-15 2013-06-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Анти-axl антитело
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
JP5940061B2 (ja) * 2010-06-18 2016-06-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ａｘｌ抗体及び使用方法
US9409988B2 (en) * 2011-06-22 2016-08-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-Axl antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012273954A1 (en) 2014-01-09
EP2723376A1 (en) 2014-04-30
EP2723376B1 (en) 2018-12-05
US9249228B2 (en) 2016-02-02
US20140302041A1 (en) 2014-10-09
JP6033293B2 (ja) 2016-11-30
JP2014522638A (ja) 2014-09-08
WO2012175691A1 (en) 2012-12-27
CA2839508A1 (en) 2012-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2723377B1 (en) Anti-axl antibodies and uses thereof
EP2723376B1 (en) Anti-axl antibodies and uses thereof
KR102101806B1 (ko) 항-인간-her3 항체 및 이의 용도
AU2014273966B2 (en) Oncostatin M receptor antigen binding proteins
CN113330036B (zh) 结合pd-l1和ox40的双特异性抗体
JP2022547850A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ免疫阻害剤及び応用
JP6449876B2 (ja) ニューレグリンに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトｈｅｒ３抗体及びその使用
US20180291098A1 (en) Anti-nrg1 (heregulin) antibodies and uses thereof
CN114761042A (zh) Il-38特异性抗体
WO2022063272A1 (en) Novel anti-claudin18 antibodies
JP6655673B2 (ja) ニューレグリンに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトｈｅｒ３抗体及びその使用
NZ618740B2 (en) Anti-axl antibodies and uses thereof
ES2712736T3 (es) Anticuerpos anti-Axl y sus usos
CN118047871A (zh) 一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid