KR100650384B1 - 성숙자연살해세포의 분화용 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

성숙자연살해세포의 분화용 조성물 및 그 제조 방법 Download PDF

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김은미
김상현
윤지연
고창보
허영진
심우영
허성범
이은희
윤희정
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Abstract

본 발명은 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화를 유도하는 Axl 수용체 티로신 키나제의 리간드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, 전구자연살해세포를 Axl 수용체 티로신 키나제의 리간드로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시킴을 특징으로 하는, 성숙자연살해세포의 제조 방법에 관한 것이다.
조혈모세포, 성숙자연살해세포, 분화, Axl 리간드, Axl 수용체 티로신 키나제

Description

성숙자연살해세포의 분화용 조성물 및 그 제조 방법{A composition for differntiation and a method for production of mature natural killer cell}
도 1은 공지된 바에 따라 마우스의 골수로부터 조혈모세포의 분리와 성숙자연살해세포로의 분화 유도과정을 도식화한 것이다 (BM: 골수; HSC: 조혈모세포; pNK: 전구자연살해세포; mNK: 성숙자연살해세포).
도 2는 공지된 방법에 따라 마우스 골수에서 분리된 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포로 분화시킬 때 분화단계별 세포들의 순도를 FACS 분석한 결과이다.
도 3은 마우스의 골수에서 분리된 조혈모세포, 공지된 방법에 따라 분리된 조혈모세포로부터 분화된 전구자연살해세포 및 수득한 전구자연살해세포로부터 OP9 기질세포의 유무하에 배양되어 분화된 성숙자연살해세포에서의 특이적인 유전자 발현을 RT-PCR 후 전기영동 분석한 결과이다.
도 4는 마우스 전구자연살해세포를 기질세포(세포명 OP9)의 공동배양 유무에 의한 성숙자연살해세포로의 최종분화 정도를 FACS 분석한 결과이다.
도 5는 SAGE에 의해 조혈모세포가 성숙자연살해세포로 분화할 때 분화단계별로 각 세포에서 발현되는 특이 유전자의 발굴을 위한 모식도이다.
도 6은 마우스 조혈모세포가 성숙자연살해세포로 분화할 때 분화단계별로 각 세포에서 발현되는 Axl에 대한 전기영동 결과와 SAGE 결과를 비교한 것으로 양 결과의 일치성을 보여준다.
도 7은 본 발명에 따라 Axl 폴리클로날 항체가 마우스 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 미치는 효과를 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 Axl 폴리클로날 항체가 마우스 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 미치는 효과를 보여주는 RT-PCR 후 전기영동 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 기질세포와 공동배양 없이 저농도의 인터루킨-15와 Axl 폴리클로날 항체가 마우스 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 미치는 효과를 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 10은 본 발명에 따라 기질세포와 공동배양 없이 저농도의 인터루킨-15와 Axl 폴리클로날 항체가 마우스 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 미치는 효과를 보여주는 RT-PCR 후 전기영동 결과이다.
도 11은 본 발명에 따라 Axl 폴리클로날 항체가 성숙자연살해세포의 인터페론-감마 생성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따라 Axl 폴리클로날 항체가 전구자연살해세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 13은 마우스 재조합 Gas6이 마우스 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 분석한 결과이다.
도 14는 워퍼린(Warfarin)이 마우스 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 분석한 결과이다.
도 15는 마우스 Gas6 cDNA를 클로닝한 본 발명의 재조합 벡터를 분석한 결과이다.
도 16은 본 발명의 재조합 마우스 Gas6 발현벡터의 제조 결과를 분석한 것이다.
도 17은 본 발명의 마우스 Gas6 cDNA의 클로닝과 발현벡터의 제작 결과를 분석한 것이다.
도 18은 본 발명의 마우스 Gas6 형질감염체에서 Gas6 발현을 분석한 결과이다.
도 19는 본 발명에 따라 마우스 Gas6 형질감염체가 마우스 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 미치는 효과를 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 20은 본 발명에 따라 마우스 Gas6 형질감염체가 마우스 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 미치는 효과를 보여주는 RT-PCR 후 전기영동 결과이다.
도 21은 본 발명에 따라 마우스 Gas6 형질감염체가 성숙자연살해세포의 인터페론-감마 생성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 22는 본 발명에 따라 마우스 네이티브 Gas6가 전구자연살해세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 23은 본 발명의 마우스 Axl cDNA 클로닝 및 레트로바이러스 벡터(pLXSN)에 클론된 Axl cDNA의 방향을 분석한 결과이다.
도 24는 본 발명의 마우스 Axl-Fc 발현벡터의 제작 결과를 분석한 것이다.
도 25는 본 발명의 마우스 Axl-Fc 융합단백질이 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 분석한 결과이다.
도 26은 자가-불활성 렌티(Self-inactivating Lenti) 바이러스를 기초로 한 본 발명에 사용한 벡터시스템을 도식화한 것이다.
도 27은 본 발명에 사용한 더블-프로모터 siRNA 카세트와 siRNA 주형 올리고머들의 구성을 도식화한 것이다.
도 28은 본 발명의 Axl siRNA의 클로닝 결과를 분석한 것이다.
도 29는 293T세포에서 pFIV-U6/H1-GFP 바이러스의 감염 정도를 분석한 결과이다.
도 30은 마우스 조혈모세포와 전구자연살해세포에서 pFIV-U6/H1- GFP 바이러스 감염 정도를 분석한 결과이다.
도 31은 본 발명의 Axl siRNA가 마우스 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 분석한 결과이다.
도 32는 본 발명에 따라 Axl 폴리클로날 항체를 이용해서 분화시킨 자연살해세포의 항암 활성능력을 동물 실험을 통해 분석한 결과이다.
도 33은 본 발명에 따라 Axl 폴리클로날 항체를 이용해서 분화시킨 자연살해세포의 암세포 살상능력을 세포 실험을 통해 분석한 결과이다.
도 34는 사람 Axl을 발현하는 본 발명의 재조합 발현벡터 pET-hAxl/ECD이다.
도 35는 사람 Gas6를 발현하는 본 발명의 재조합 발현벡터 phGas6이다.
도 36은 본 발명에 따라 사람 제대혈로부터 분리한 조혈모세포를 전구자연살해세포로 분화시키고, 이들 세포를 사람 Axl 폴리클로날 항체로 처리하여 분화된 성숙자연살해세포의 FACS 분석 결과이다.
본 발명은 전구자연살해세포(precusor natural killer cell, pNK)로부터 성숙자연살해세포(mature natural killer cell, mNK)로의 분화를 유도하는 Axl 수용체 티로신 키나제(Axl Receptor tyrosine kinase, 이하 Axl로 약칭할 수 있다)의 리간드에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF(줄기세포인자) 및 Flt3L(Fms와 유사한 티로신 키나제 3 리간드)로 처리하여 전구자연살해세포 (precursor Natural killer cell, pNK)로 분화시키고, 전구자연살해세포를 Axl의 리간드로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시킴을 특징으로 하는, 성숙자연살해세포의 제조 방법에 관한 것이다.
현재의 암 치료법들인 외과적 수술요법, 약물요법, 방사선치료법 등은 일시적으로 치료효과를 나타낼 수 있으나 내성, 재발 또는 여러 가지 부작용이 발생하는 문제점이 있어 많은 선진국에서 항암제나 진단시약을 개발하기 위해 면역반응을 조절할 수 있는 면역치료법을 이용하고자 하는 시도가 활발히 진행되고 있으나 암의 진단, 예방 및 치료법을 효율적으로 개발할 수 있는 면역세포치료법 개발은 아 직 초기단계로 알려져 있다. 자연살해세포(Natural Killer cell, NK)는 병원균, 암, 동종이계의(allogeneic) 세포 등을 제거하는 선천성면역 (innate immunity)에 관여하며, 인터페론-감마, 종양괴사인자-알파, 인터루킨-12 등의 사이토카인을 분비하여 적응성면역 (adaptive immunity)을 매개함으로써 암에 특이적인 기억 형성을 조절하는 기능을 가지고 있으며 여러 암들에서 자연살해세포의 기능 및 분화능력에 결함이 있는 것으로 보고되었다. 자연살해세포를 이용한 기존의 암 치료요법으로는 인터루킨-2로 자연살해세포를 활성화시켜 암세포에 대한 면역반응을 증진시키는 방법이 이용되어 왔는데 이러한 방법은 부작용과 함께 개인에 따른 치료효과의 지속성, 내성 및 치료효과의차이 등 많은 문제점을 가지고 있다고 알려져 있다. 자연살해세포의 암 살상 효과를 높이기 위해서는 무엇보다도 활성이 높은 자연살해세포를 대량으로 확보해야 한다. 자연살해세포는 암이나 난치성 바이러스 감염 등의 치료에 응용할 가능성이 있어 실제 임상에 사용하는 것은 100억 개 이상의 자연살해세포가 필요하다고 한다. 그러나 늘리는 것이 매우 어려운 세포로 지금까지 여러 가지 방법으로 시도되어 왔으나, 인터루킨-2나 인터루킨-15로는 많아야 수십 배가 한계였으나, 그 후 타인의 암세포를 섞으면 수백 배로 늘어나는 것이 밝혀졌다. 2005년에 발표된 가장 새로운 자연살해세포 증식 방법은 두 개의 유전자를 섞은 타인의 암세포를 섞어 배양하면 1000배가 된다고 하나 아직 연구단계에 있다. 적어도 수백 배 정도 이상을 늘리는 것은 타인의 암세포와 같이 섞어서 배양하는 것이 기본이다. 타인의 암세포와 섞거나 또한 유전자를 사용하는 것 등은 아직 해결되지 않은 안전상의 문제, 윤리적인 문제가 남겨져 있는 상황이다.
본 발명의 목적은 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화를 유도하여 다량의 성숙자연살해세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화를 유도하는 물질을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 성숙자연살해세포를 저 용량의 인터루킨-2로 처리하여 활성화된 성숙자연살해세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따라 분화되고 활성화된 성숙자연살해세포를 이용한 면역세포치료제를 제공하는데 있다.
상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 기존의 대부분의 연구들에서 이용한 성숙자연살해세포와는 달리, 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화과정(도 1)을 연구하였으며, 그 결과 분화를 촉진시키는 유전자인 Axl을 발견하였다. Axl (p140)은 Sky, Eyk 과(family)에 속하는 타이로신 수용체 인산화효소로써 Axl 과에는 Rse(Sky, Brt, Tif, Dtk, Tyro3), Mer(Eyk, Nyk, Tyro12)가 있으며 Axl, Rse와 Mer은 대부분의 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있으나 그 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. Axl의 리간드로는 Gas6이 알려져 있으며, 이는 비타민 K에 의존적인 세포성장인자(vitamin K-dependent growth-potentiating factor)로 Axl의 독특한 구조상 세포의 이동, 성장, 분화에 관여할 것으로 추론되고 있다. Axl의 발현은 섬유아세포, 골수의조상세포(myeloidprogenigor), 대식세 포, 신경조직, 난포, 골격근 등에서 발현되나 림프구에서는 발현되지 않는다고 보고된 바 있다. 비록 Axl과 Gas6의 역할이 항원 제시 세포의 항상성 및 조혈모세포 성장을 조절하는 것으로 알려져 있으나, Axl과 Gas6가 자연살해세포의 발생 및 기능에 조절하는 역할이 있다는 것에 대하여 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로 분화하는데 Axl이 필수적인 역할을 한다는 것을 발견하였고, 자연살해세포로의 분화조절제로서 작용하는 Axl의 발견을 기초로 하여, 마우스의 골수로부터 조혈모세포를 채취하여 이들 세포로부터 Axl 항체 및/또는 Gas6를 이용하여 성숙자연살해세포로 분화시키는 시스템을 확립하였다. 이후 그러한 분화 시스템을 개조 변형시켜 사람의 말초혈액, 골수 또는 제대혈로부터 채취한 조혈모세포에 적용함으로써 기능이 증강된 성숙자연살해세포를 대량으로 생성하는데 성공하였다.
이러한 성공에 따라, 한 가지 관점으로, 본 발명은 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화를 유도하는 Axl의 리간드를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 Axl 수용체 티로신 키나제(Axl Receptor tyrosine kinase, 이하 “Axl")의 리간드로서, 상기 Axl에 대한 항체, 감마-카르복실화된 Gas6(growth-arrest specific gene6) 단백질 및 단백질 S(protein S) 중 어느 하나 이상의 리간드를 함유하는 것을 특징으로 하는, 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화를 유도하는데 사용되는 조성물을 제공한다. 본원에서 용어 "리간드"는 Axl과 결합하여 그 수용체가 작용성 반응을 나타내도록 하는 폴리펩타이드 또는 화합물을 의미한다. 본 발명에 따른 리간드는 Axl에 대한 항체, Gas6 및 단백질 S(protein S)를 포함한다. 용어 “분화”는 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 즉, 구조나 기능이 특수화하는 현상을 말한다. 성숙자연살해세포에서 용어 성숙은 자연살해세포가 세포의 고유 기능을 발휘할 수 있는 능력을 갖고 있음을 의미하며, 예를 들면 암세포를 인지하고 직접 암세포를 죽일 수 있는 능력을 가졌음을 가리킨다. 자연살해세포가 성숙되었는지의 여부는 발현 물질을 마커로 하여 확인할 수 있는데 마우스나 사람의 경우 잘 밝혀져 있다. 마우스의 마커로는 예를 들면 NK1.1, CD122, LY49 Family(Ly49A, Ly49C, Ly49D, Ly49E, Ly49F, Ly49G, Ly49H, Ly49I), NKG2A/C/E가 포함되며, 사람의 마커로는 예를 들면 NKG2A, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD56, CD161이 포함된다. 이러한 마커들의 기능은 본 분야의 전문가에게는 잘 인지되어 있다.
다른 관점으로서, 본 발명은 (i) 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, (ii) 전구자연살해세포를 Axl의 리간드로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시켜 성숙자연살해세포를 수득함을 특징으로 하는, 성숙자연살해세포의 제조 방법을 제공한다.
한 가지 양태로, 본 발명은 조혈모세포를 사람의 골수, 말초혈액 또는 제대혈로부터 분리함을 특징으로 하여 사람 성숙자연살해세포를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 Axl의 리간드로서 Axl에 대한 항체, 사람 감마-카르복실화된 Gas6 및 이 둘의 배합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 사용함을 특징으로 하여 사람 성숙자연살해세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 전구자연살해세포를 사람 기질(stroma)세포의 존재하에 리간드로 처리함을 특징으로 하는 사람 성숙자연살해세포의 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (i) 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, (ii) 전구자연살해세포를 Axl의 리간드로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시켜 성숙자연살해세포를 수득하고, (iii) 분화된 성숙자연살해세포를 인터루킨-2로 처리하여 활성화시킴을 특징으로 하는, 활성화된 성숙자연살해세포의 제조 방법을 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은 분화된 성숙자연살해세포를 약 8 내지 15ng/ml의 인터루킨-2로 처리함을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 활성화된 성숙자연살해세포를 포함함을 특징으로 하는 면역세포치료제를 제공한다. 본원에서 면역세포치료제는 각종 항암제 또는 면역증강제 등으로 사용될 수 있음을 의미한다. 활성화된 성숙자연살해세포에서 용어 “활성화”는 성숙자연살해세포가 IL-2에 의해 자극을 받음으로써 실질적인 세포독성 효능을 발휘한다는 것을 의미한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 환자의 혈액 및/또는 골수로부터 조혈모세포를 추출하고, 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, 전구자연살해세포를 기질세포의 존재하에 Axl의 리간드로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시키고, 분화된 성숙자연살해세포를 인터루킨-2로 처리하여 활성화시키고, 활성화된 성숙자연살해세포를 환자 자신에게 주입함을 특징으로 하는 자가면역세포치료요법을 제공한다. 본 발명에서 "자가면역세포치료요법"이란 환자의 몸에서 면역세포를 채취하여 혹은 환자 자신의 조혈모세포를 이용하여 시험관 수준에서 면역세포로 분화시킨, 즉 체외에서의 배양을 통해 암세포만을 선택적으로 살해할 수 있는 면역세포의 수를 늘리거나 기능을 강화시킨 후 다시 체내 로 주입하여 암을 치료하는 것을 말한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 사람 동종 제대혈, 공여 혈액 및/또는 골수로부터 조혈모세포를 추출하고, 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, 전구자연살해세포를 기질세포의 존재하에 Axl의 리간드로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시키고, 분화된 성숙자연살해세포를 인터루킨-2로 처리하여 활성화시키고, 활성화된 성숙자연살해세포를 환자에게 주입함을 특징으로 하는 동종면역세포치료요법을 제공한다. 본 발명에서 "동종면역세포치료요법"이란 태아의 제대혈로부터 성체줄기세포를 이용하여 시험관 수준에서 면역세포로 분화시킨, 즉 체외에서의 배양을 통해 암세포만을 선택적으로 살해할 수 있는 면역세포의 수를 늘리거나 기능을 강화시킨 후 다시 체내로 주입하여 암을 치료하는 것을 말한다.
자연살해세포는 특정 미생물 감염 및 신생물의 인식 및 파괴를 포함한 다양한 생물학적 기능을 갖는 선천적 면역계에 연루된 백혈구 림프구이다(Moretta, A., Bottino, C., Mingari, M.C., Biassoni, R. and Moretta, L., Nat. Immunol., 3, 6, 2002). 이들의 형태적 특징은 세포질 내에 조밀하게 분홍-보라색의 염색 과립의 존재를 근거로 거대한 과립 림프구(Large Granular Lymphocyte, LGL)-유사 형태를 보여준다. 이들은 정상적인 말초혈 림프구에서 약 10 내지 20%, 간 림프구에서 15 내지 25%, 비장 림프구에서 1 내지 5%를 포함한다. 휴면 자연살해세포는 혈중에 순환하나, 사이토카인에 의한 활성화 후 이들은 병원체-감염된 또는 악성 세포를 함유한 대부분의 조직 내로 유출 및 침윤할 수 있다 (Colucci, F., Di Santo, J.P. and Leibson, P.J., Nat. Immunol., 3, 807, 2002; Kelly J. M., Darcy P. K., Markby J. L., Godfrey D. I., Takeda K., Yagita H., Smyth M. J., Nat. Immunol., 3, 83 , 2002; Shi F. D., Wang H. B., Li H., Hong S., Taniguchi M., Link H., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Nat. Immunol., 1, 245, 2000; Korsgren M., Persson C. G., Sundler F., Bjerke T., Hansson T., Chambers B. J., Hong S., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Korsgren O., J. Exp. Med., 189, 553, 1999). 일반적으로, 자연살해세포의 표현형은 CD56 및 CD16(사람), NKR-P1C(마우스에서 NK1.1, 사람에서 CD161), DX5, Ly49(마우스; 이들은 특정 마우스 스트레인으로 한정된다) 표면 항원의 발현 및 CD3의 결여로 특징 지워진다. 사람 자연살해세포의 대부분(총 자연살해세포 중 90%)은 CD56의 저밀도 발현(CD56 dim 보다 더 세포독성을 나타냄)을 나타내고 고수준의 Fcγ 수용체 III(FcγRIII, CD16)를 발현하는 반면, 약 10%의 자연살해세포는 CD56brightCD16dim 또는 CD56brightCD16- 이다(Schattner, A. and Duggan, D. B., Arthritis Rheum., 27, 1072, 1984). 자연살해세포는 바이러스-감염된 세포, 종양 세포 및 일부 정상적인 동종 세포에서 사전 교육 없이 활성화 수용체와 이들의 리간드간의 상호작용을 통한 초기 숙주 방법에 핵심적인 역할을 한다.
자연살해세포는 주 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 부류 I 분자에 대해 특이적인 자연살해세포 억제 수용체를 통한 인식으로 인해 정상 세포와 주 조직적합성 복합체 부류 I 분자의 발현이 없는 세포를 구별하는 능력을 갖고 있다. 자연살해세포의 기능은 표적 세포에서 주 조직적합성 복합체 부류 I 또는 주 조직적합성 복합체 부류 I-연관된 분자와 같은 리간드와 상호작용하는 활성화 수용체와 억제 수용체간의 균형에 의해 조절된다(Rajaram, N., Tatake, R. J., Advani, S. H. and Gangal, S. G., Br. J. Cancer, 62, 205, 1990). 이들 수용체는 두 개의 구조적 과로 분류된다: 면역글로불린 상위과(백혈구 억제 수용체, 살해세포 Ig-유사 수용체 (KIR, CD158) 및 C-유형 렉틴-유사과(NKG2D, CD94/NKG2, 림프구 항원 49(LY49)). 자연살해세포는 세포-표면 수용체와 이들의 리간드사이의 상호작용 후 인터페론-감마 및 종양괴사인자-알파와 같은 몇 가지 사이토카인을 생성한다(Bryson, J. S. and Flanagan, D. L., J. Hematother. Stem Cell Res,. 9, 307, 2000).
자연살해세포의 작용기 기능은 인터루킨-2, 인터루킨-12, 인터루킨-15, 인터루킨-18, 인터루킨-21 및 I형 인터페론-αβ를 포함한 사이토카인과 세포 표면 수용체의 차별적인 개입과 조합하여 자극할 수 있는 반면, 이들은 인터페론-감마, 인터루킨-5, 인터루킨-10, 인터루킨-13, 인터페론-알파 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)와 같은 면역조절 사이토카인뿐만 아니라 자연살해세포 수용체와 이들의 리간드간의 상호작용 후 많은 케모카인(Kemokine)을 생성한다(Shi F. D., Wang H. B., Li H., Hong S., Taniguchi M., Link H., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Nat. Immunol., 1, 245, 2000). 사람의 경우, CD56bright 자연살해세포 하위세트는 또한 인터페론-감마, 종양괴사인자-알파, 종양괴사인자-베타, 인터루킨-10 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(Lian R. H., Maeda M., Lohwasser S., Delcommenne M., Nakano T., Vance R. E., Raulet D. H., Takei F., J. Immunol ., 168, 4980, 2002)를 포함한 몇 가지 사이토카인을 생성하지만, CD56dim 자연살해세포 하위세트는 이들 사이토카인을 생성하지 않는다(Colucci, F., Di Santo, J.P. and Leibson, P.J., Nat. Immunol., 3, 807, 2002; Shi F. D., Wang H. B., Li H., Hong S., Taniguchi M., Link H., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Nat. Immunol., 1, 245, 2000). 비록 미성숙 자연살해세포가 인터루킨-5 및 인터루킨-13과 같은 Th2 사이토카인을 생성할 수 있을지라도, Th2 사이토카인을 생성하는 능력은 최종 분화시 상실된다; 대신 성숙자연살해세포는 인터페론-감마를 생성하는 능력을 획득한다(Van Beneden K., Stevenaert F., De Creus A., Debacker V., De Boever J., Plum J., Leclercq G., J . Immunol., 166, 4302, 2001). 자연살해세포는 인터루킨-15( Crosier, K. E. and Crosier, P. S., Pathology, 29, 131, 1997; Nakano, T., Kawamoto, K., Kishino, J., Nomura, K., Higashino, K. and Arita, H., J. Biochem., 323, 387, 1997; Fridell, Y. W., Villa, J., Jr, Attar, E. C. and Liu, E. T., J. Biol. Chem., 273, 7123, 1997) 또는 인터루킨-2(Goruppi, S., Ruaro, E. and Schneider, C., Oncogene, 12, 471, 1996)에 의해 부분적으로 조절되는 XCL1, CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, CCL22, and CXCL8(Lundwall, A., Dackowski, W., Cohen, E., Shaffer, M., Mahr, A., Dahlback, B., Stenclrclr, J. and Wydro, R., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986)를 포함 한 많은 케모카인을 분비하고 반응한다. 이들 케모카인은 이차 림프구 조직에서 감염 및 신생 세포에 대한 자연살해세포 호밍(Homing)에 중요한 역할을 하며 그 조직에서 인터페론-감마의 생성이 T 세포 반응을 직접적으로 조절하는 역할을 할 수 있다(Lundwall, A., Dackowski, W., Cohen, E., Shaffer, M., Mahr, A., Dahlback, B., Stenclrclr, J. and Wydro, R., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986). 휴면 CD56dim/CD16+ 자연살해세포 하위세트는 CXCR1, CXCR2, CXCR3 및 CXCR4를 발현하는 한편, CD56bright/CD16- 자연살해세포는 고수준의 CCR5 및 CCR7을 발현한다. 자연살해세포의 세포용해 활성은 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL10 및 CXC3L1에 의해 자극된다.
자연살해세포가 암세포를 죽이는 기전에는 다음의 두 가지가 있다. 세포 수용체를 이용한 방법으로, 자연살해세포는 세포 표면에 세 가지 종류의 종양괴사인자 단백질들을 발현한다. 이는 파스리간드(FASL), 종양괴사인자 그리고 트레일(TRAIL)로 암세포에 있는 이들 수용체와 결합하여 암세포의 아포토시스를 유도하는 것으로 알려져 있다(Ashkenazi, A., Nature Rev. Cancer., 2, 420, 2002). 자연살해세포가 암세포를 죽이는 또 다른 방법은 퍼포린(Perforin)이나 그랜자임(Granzyme)과 같은 세포질성 과립물들을 통한 것이다. 이 물질들은 암세포의 세포막을 뚫어 암세포를 용해시키며 결국에는 암세포를 죽게 만드는 작용을 하게 된다(Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R. and Smyth, M. J., Curr. Opin. Immunol., 12, 323, 2000).
자연살해세포가 만능 조혈모세포(혈액세포와 면역세포를 구성하는 근원이 되는 세포임)로부터 유래한다는 것은 잘 알려져 있지만 아직 그것의 발생과정에 대해서는 잘 알려져 있지 않다(Lian R. H., Maeda M., Lohwasser S., Delcommenne M., Nakano T., Vance R. E., Raulet D. H., Takei F., J. Immunol., 168, 4980, 2002). 조혈모세포는(사람에서는 Lin-CD34+, 마우스에서는 Lin-c-kit+Sca2+ ) 태아의 흉선, 태아의 간, 제대혈 그리고 성체 골수로부터 유도될 수 있고 이들은 T 세포나 자연살해세포로 분화할 수 있는 전구물질로(Lian R. H., Kumar V., Semin. Immunol., 14, 453, 2002; Douagi I., Colucci F., Di Santo JP., Cumano A., Blood, 99, 473, 2002) 시험관 수준에서 인터루킨-7, SCF, 그리고 flt3L과 반응하여 배양하면 전구자연살해세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려져 있다(Williams N. S., Klem J., Puzanov I. J., Sivakumar P. V., Bennett M., Kumar V., J. Immunol,. 163, 2648, 1999). 여기서 분화는 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 즉, 구조나 기능이 특수화하는 현상을 말한다. 전구자연살해세포는 조혈모세포에서 성숙자연살해세포의 중간단계의 세포로 골수, 태아의 흉선, 혈액, 비장 그리고 간 등에 고루 퍼져 있다. 하지만 이들은 인터페론-감마를 생산하지 못하기 때문에 세포용해능력은 없다. 본 발명에서는 조혈모세포에 대한 마커를 c-kit+Lin-(마우스), CD34+(사람)로 정의하였다.
전구자연살해세포(사람에서는 CD56-CD122+CD34+, 마우스에서는 CD122+ NK1.1-DX5-)는 인터루킨-15를 처리하여 배양시키면 미성숙자연살해세포(사람에서는 CD122+CD16l-CD56-KIR-, 마우스에서는 CD122+CD2+NK1.1+DX5+Ly49-)로 분화할 수 있다 . 전구자연살해세포를 인터루킨-15가 포함된 배지에서 지속적으로 배양을 하게 되면 조숙한(pseudomature) 세포용해성 자연살해(CD122+CD2+NK1.1+DX5+CD94/NKG2+ Ly49-) 세포로 분화할 수 있지만 이들의 세포용해능력은 거의 없는 것으로 알려져 있다. 기질세포는 여러 종류의 사이토카인과 발달 과정 중의 자연살해세포 표면 수용체와 직접적으로 반응할 수 있는 물질들을 분비하는 세포이다. 기질세포가 분비하는 이러한 물질들은 성숙자연살해세포의 성숙과정에 필수적인 요소로 성숙자연살해세포에 LyS49+가 발현되도록 해주는 기능을 가지는 것으로 보고되어 있다(Iizuka K., Chaplin D. D., Wang Y., Wu Q., Pegg L. E., Yokoyama W. M., Fu Y. X., Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 6336, 1999; Briard D., Brouty-Boye D., Azzarone B., Jasmin C., J. Immunol., 168, 4326, 2002). 세포용해능을 가지는 Ly49+ 성숙자연살해세포(사람에서는 CD56+KIR+CD3-, 마우스에서는 CD122+CD2+NK1.1+DX5+CD94/NKG2+ Ly49+CD3-)는 인터루킨-15 존재 하에서 전구자연살해세포와 기질세포의 공동배양을 통해 분화시킬 수 있다(Williams N. S., Klem J., Puzanov I. J., Sivakumar P. V., Bennett M., Kumar V., J. Immunol,. 163, 2648, 1999). 자연살해세포의 발 달 단계 중 초기 발달 단계에는 CD94, NKG2A, NKG2C 와 Ly49B 가 발현되고 그 다음 단계에서는 Ly49G, Ly49C와 Ly49I가 발현되고 마지막 단계에서는 Ly49A, D, E와 F가 발현된다(Williams N. S., Kubota A., Bennett M., Kumar V., Takei F., Eur. J. Immunol., 30, 2074, 2000). 본 발명에서는 전구자연살해세포에 대한 마커를 CD122+ NK1.1-(마우스)로 정의하였다.
전구자연살해세포는 PU.1, GATA3, Id2 그리고 Ets-1과 같은 전사 인자들을 발현한다(Boggs S. S., Trevisan M., Patrene K., Geogopoulos K., Nat. Immunol., 16, 137, 1998). 전사인자 ikaros, PU.1 (Colucci F., Samson S. I., DeKoter R. P., Lantz O., Singh H., Di Santo J. P., Blood, 97, 2625, 2001)과 Id2(Ikawa T., Fujimoto S., Kawamoto H., Katsura Y., Yokota Y., Proc. Natl. Acad. Sci,. 98, 5164, 2001)를 결핍시킨 마우스에서 전구자연살해세포 수의 감소가 관찰 된다. 조혈모세포는 myb 종양유전자(oncogene), c-myc 그리고 Oct 2b와 같은 전사 인자를 발현한다. 이들 인자들은 전구자연살해세포의 증식과 발달에 중요한 역할을 한다(Bar-Ner M., Messing L. T., Segal S., Immunobiology, 185, 150, 1992; Melotti P., Calabretta B., Blood, 87, 2221, 1996). 전구자연살해세포에서 Fc 수용체, 종양괴사인자 수용체, 인터루킨-7 수용체와 케모카인 수용체 그리고 CD36 와 같은 면역 조절제들은 전구자연살해세포 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다.
성숙자연살해세포에서 RGS(G 단백질 시그날 조절자, regulator of G protein signaling), 림프구 특이 단백질 티로신 키나아제와 Fyn 원종양유전자와 같은 시그날 전달 분자들은 자연살해세포의 성숙에 관여하는 물질들로 알려져 있다(Ikawa T., Fujimoto S., Kawamoto H., Katsura Y., Yokota Y., Proc. Natl. Acad. Sci,. 98, 5164, 2001; Ogasawara K., Hida S., Azimi N., Tagaya Y., Sato T., Yokochi-Fukuda T., Waldmann T. A., Taniguchi T., Taki S., Nature, 391, 700, 1998). 성숙자연살해세포는 암세포를 인지하고 직접 암세포를 죽일 수 있는 능력을 가진 세포를 말한다. 성숙자연살해세포에 인터루킨-2의 처리는 성숙자연살해세포의 증식과 활성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 수용체 티로신 키나아제는 세포의 증식, 세포의 발달, 세포의 생존과 세포의 이동에 대한 세포 외부에서의 자극을 세포 안으로 시그날 전달하는 막을 통해서 생기는(transmembrane) 단백질로 구성된다(Ullrich, A., Schlessinger, J., Cell, 61, 203, 1990; Fantl, W. J., Johnson, D. E., Williams, L. T., Biochem., 62, 453, 1993; Heldin, C., Cell, 80, 213, 1995). 모든 수용체 티로신 키나아제는 공통적으로 세포질 키나아제 도메인을 가지고 있는 데 여기에 성장 인자가 결합을 하게 되면 수용체 티로신 키나아제는 활성화가 된다. 본 발명에서는 성숙자연살해세포에 대한 마커를 CD122+NK1.1+(마우스), CD34+(사람)로 정의하였고 성숙자연살해세포 중에서도 완전히 성숙한 세포들에 대한 마커로는 Family Ly49A+, Ly49C+, Ly49D+, Ly49E+, Ly49F+, Ly49G+, Ly49H+, Ly49I+, NKG2A/C/E+(마우스), CD56+, NKG2A+, CD161+, NKP46+, NKP30+, NKP44+, NKG20+(사람)로 정의하였다.
수용체 티로신 키나아제의 활성은 자가-인산화와 티로신 인산화에 의해 이루어진다. Axl은(ARK 혹은, UFO와 TYRO7로도 불림) 가장 처음으로 발견된 수용체 티로신 키나아제의 상과(superfamily) 중 하나이다. 수용체 티로신 키나아제는 다음과 같은 공통적인 구조를 가진다. 두 개의 면역글로불린과 관련된 도메인 그리고 여기에 연결되어 있는 두 개의 피브로넥틴 타입 III 반복 도메인(fibronectin type III repeat domain) 마지막으로 세포질 내제의 수용체 티로신 키나아제를 포함한 세포외 도메인으로 구성된다(O'Bryan, J. P., Frye, R. A., Cogswell, P.C., Neubauer, A., Kitch, B., Prokop, C., Espinosa, R. III, Lebeau, M. M., Earp, H. S., Liu, E. T., Mol. Cell. Biol., 11, 5016, 1991). Axl 은 가슴, 뼈대근육, 심장, 조혈조직, 정소, 난소 그리고 자궁 내막에서 발현 된다(Faust, M., Ebensperger C., Schulz, A. S., Schleithoff, L., Hameister, H., Bartram, C. R. and Janssen, J. W., Oncogene, 7, 1287, 1992; Graham, D. K., Bowman G. W., Dawson, T. L., Stanford W. L., Earp, H. S., and Snodgrass, H. R., Oncogen, 10, 2349, 1995; Neubauer, A., Fiebeler, A., Graham, D. K., O'Bryan, J. P., Schmidt, C. A., Barckow, P., Serke, S., Siegert, W., Snodgrass, H. R., Huhn, D., Blood, 84, 1931, 1994; Berclaz, G., Altermatt, H.J., Rohrbach, V., Kieffer, I., Dreffer, E. and Andres, A. C., Ann. Oncol., 12, 819, 2001; Wimmel, A., Glitz, D., Kraus, A., Roeder, J. and Schuermann, M., Eur. J. Cancer., 37, 2264, 2001; Sun, W. S., Misao, R., Iwagaki, S., Fujimoto, J. and Tamaya, T., Mol. Hum. Reprod., 8, 552, 2002). Axl 은 세포외 리간드 결합 도메인과 관련된 세포 접착 분자, 두 개의 면역글로불린과 비슷한 도메인 그리고 두 개의 피브로넥틴 타입 III 도메인으로 구성된 특징을 나타내고 있다. 최근 연구에서는 Axl이 암형성, 신경과 조혈 조직의 발달과정에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Crosier, K. E. and Crosier, P. S., Pathology, 29, 131, 1997).
Gas6은 성장 정지 특이 유전자 6 단백질로 비타민 K 의존성 단백질 과중 하나이다. 이들 과는 Axl, Sky(Rse, Brt, Tif, Dtk, Etk-2와 Tyro3)과 Mer(c-Eyk, Nyk와 Tyro12)을 포함한 Axl/sky 과에 대한 리간드로 알려져 있다(Godowski, P. J., Mark, M. R., Chen, J., Sadick, M. D., Raab, H. and Hammonds R. G., Cell, 82, 355, 1995; Varnum, B. C., Young, C., Elliott, G., Garcia, A., Bartley, T. D., Fridell, Y. W., Hunt, R. W., Trail, G., Clogston, C., Toso, R. J., Nature, 373, 623, 1995; Chen, J., Carey, K. and Godowski, P. J., Oncogene, 14, 2033, 1997). Gas6은 혈액 응고 조절과 관련된 혈청 단백질인 단백질 S와 46% 의 동일한 아미노산 서열을 가지고 있고 구조 또한 비슷한 것으로 알려져 있다(Manconrftti, G., Brancolini, C., Avanzi, G. and Schneider, C., Mol. Cell. Biol., 13, 4976, 1993). Gas6은 장, 고환, 폐의 내피, 자궁내막에서 발현되고 자궁내막 암에서도 많이 발현된다(Prieto, A. L., Weber, J. L., Tracy, S., Heeb, M. J. and Lai, C., Brain Res., 816, 646, 1999; Chan, M. C. W., Mather, J. P., Mccray, G. and Lee, W. M., J. Androl., 21, 291, 2000; Wimmel, A., Glitz, D., Kraus, A., Roeder, J. and Schuermann, M., Eur. J. Cancer., 37, 2264, 2001).
Gas6이 완벽한 생물학적 활성을 갖기 위해서는 비타민 K 의존성 감마-카르복실화가 이루어져야한다(Manconrftti, G., Brancolini, C., Avanzi, G. and Schneider, C., Mol. Cell. Biol., 13, 4976, 1993; Lundwall, A., Dackowski, W., Cohen, E., Shaffer, M., Mahr, A., Dahlback, B., Stenclrclr, J. and Wydro, R., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986; Chen, J., Carey, K. and Godowski, P. J., Oncogene, 14, 2033, 1997). Gas6은 민무늬근육 세포에서 트롬빈에 의해 유도되는 세포 성장에 대한 인자로서 작용한다(Nakano, T., Kawamoto, K., Kishino, J., Nomura, K., Higashino, K. and Arita, H., J. Biochem., 323, 387, 1997). 게다가, Gas6는 혈관의 민무늬근육 세포의 Axl 매개에 의한 세포 이동에 관여하는 화학유인분자로 알려져있다(Davis, J. E., Smyth, M. J. and Trapani, J. A., Eur. J. Immunol., 31, 39-47, 2001). 또한 Gas6는 혈청 결핍에 의한 NIH3T3 세포를 세포사로 부터 보호해 주고 세포 주기가 계속 돌아갈 수 있게 해 주는 역할을 한다(Goruppi, S., Ruaro, E. and Schneider, C., Oncogene, 12, 471, 1996). 최근, Gas6는 포유류 세포에서 베타 카테닌(β-catenin)의 안정화와 T-세포 인자의 전사활성을 유도하는 것으로도 알려져 있다(Goruppi, S., Chiaruttini, C., Ruaro, M. E., Varnum, B. and Schneider, C., Mol. Cell. Biol., 21, 902, 2001).
단백질 S는 혈액응고를 막는 비타민-K 의존성 혈장 당단백질로서 응고인자 Va 및 VIIIa의 분해시 활성화된 단백질 C의 보조 인자로 작용한다. 또한, 단백질 S는 다른 세포 유형에서 미토겐으로 작용하며 종양 형성성 Axl 과의 일원인 Tyro3의 리간드이다 (Wimmel A. et al., Cancer 1999 Jul 1;86(1):43-9). 단백질 S는 Gas6과 마찬가지로 Axl/Sky 과의 일원을 자극하는 것으로 밝혀져 왔다. 단백질 S는 Gas6과 비슷한 구조(아미노 말단 Gla 도메인, 4개의 EGF-like 도메인, 그리고 시그날전달 분자와 같은 G 도메인으로 구성)를 가지고 있으며 Axl/Sky 상과를 인산화 시킬 수 있는 기능을 가지고 있다(Evenas P., et al., Biol Chem. 2000 Mar; 381(3):199-209).
단백질 S는 사람의 혈장 중에 유리된 단백질 형태와 C4b-결합 단백질과 복합 형태로 존재한다(Dahlback & Stenflo (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 2512-2516). 사람 단백질 S는 간단한 정제 방법으로 수득할 수 있는데, 예를 들면 바륨 시트레이트 흡착, DEAE-세파셀(Sephacel) 크로마토그래피 및 블루 세파로즈상에서의 크로마토그래피 등이 포함된다(Dahlback B., Biochem. J. (1983) 209, 837-846). 또한, 단백질 S는 유전자 재조합으로 제조할 수 있다(Merel Van Wijnen, et al., Biochem. J. 330, 389-396).
본 발명에서 사용된 재조합 DNA 방법은 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및/또는 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. (1994)]에 기술된 것이다. 예를 들면, 아래 예시적으로 기술된 바와 같이 재조합 발현 기술을 통해 Axl 또는 Gas6 또는 단백질 S를 암호화한 핵산 서열을 적절한 벡터(Vector) 내로 삽입시킴으로써 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 다량 생성 할 수 있다. 그런 다음, 그 서열을 사용하여 검출 탐침 또는 증폭 프라이머를 생성할 수 있다. 또는, Axl 또는 Gas6 또는 단백질 S를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 발현벡터내로 삽입하고, 생성된 발현 벡터를 적절한 숙주내로 도입하여 배양함으로써 단백질을 다량으로 생성할 수 있다. 핵산 서열을 수득하는 다른 방법으로는 PCR(중합효소 연쇄 반응)이다. 역전사효소를 사용하여 폴리(A)+RNA 또는 전체 RNA로부터 cDNA를 준비한다. 전형적으로 Axl 또는 Gas6 또는 단백질 S의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화한 cDNA의 두 개 개별 영역에 상보적인 두 프라이머를 Taq 중합효소와 같은 중합효소와 함께 cDNA에 첨가하고 중합효소가 두 프라이머 사이의 cDNA 영역을 증폭한다. Axl 또는 Gas6 또는 단백질 S의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 원핵, 효모, 곤충(baculovirus systems) 및/또는 진핵 숙주 세포에서 증폭/발현시킬 수 있다(Meth. Enz. vol. 185 D. V. Goeddel ed., Academic Press, Sna Diego Calif., 1990). 전형적으로 발현벡터는 플라스미드 유지 및 외래 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유한다. 이러한 서열로는 프로모터, 인핸서, 복제원, 전사종결서열, 분비리더서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드의 암호화 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 및 선별 마커 등이 포함된다. 이러한 플랭킹 서열은 본 분야의 전문가에게는 잘 알려져 있으며 용이하게 선별적으로 사용할 수 있다.
포유동물 세포에서 Axl 또는 Gas6 또는 단백질 S 코딩 DNA의 전사를 위해 적절한 프로모터의 예로는 SV40 프로모터(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1(metallothionein gene) promoter(Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814), CMV 프로모터(Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) 또는 아데노바이러스 2 메이저 후기 프로모터(Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)이다. 곤충 세포에서 적합하게 사용되는 프로모터의 예로는 폴리헤드린 프로모터 (미국특허 제4,745,051호; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), P10 프로모터 (J. M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), 백큘로바이러스 immediate early 유전자 1 프로모터(미국특허 제5,155,037호 및 제5,162,222호) 또는 백큘로바이러스 39K delayed-early 유전자 프로모터(미국특허 제5,155,037호 및 제5,162,222호)를 들 수 있다. 효모 숙주 세포에 적합한 프로모터로는 예를 들면 효모 글라이코라이시스 유전자 (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) 또는 알코올 데하이드로게나제 유전자 (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982) 또는 TPI1(미국특허 제4,599,311호) 또는 ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) 프로모터가 포함된다. 진균 숙주 세포에 적합한 프로모터로는 ADH3 프로모터(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) 또는 tpiA 프로모터를 예로 들 수 있다. 다른 적절한 프로모터의 예로는 A. oryzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파틱 프로테이나제, A. niger 중성 알파-아밀라제, A. niger 산 안정한 알파-아밀라제, A. niger 또는 A. awamori 글루코아밀라제 (gluA), Rhizomucor miehei 리파제, A. oryzae 알카리성 프로테아제, A. oryzae 트리오즈 포스페이트 이소머라제 또는 A. nidulans 아세트아미다제 코딩 유전자로부터 유래 된 것이다.
DNA 서열은 필요한 경우 사람 성장 호르몬 터미네이터(Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는 TPI1(Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) 또는 ADH3(McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) 터미네이터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 또한 프로모터로부터 하류와 DNA 서열의 삽입 부위로부터 상류에 한 세트의 RNA 스플라이스 부위를 함유할 수 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 수득할 수 있다. 또한 발현 벡터에는 삽입 부위의 하류에 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 시그날은 SV40으로부터 초기 또는 후기 폴리아데닐화 시그날, 아데노바이러스 5 Elb 영역으로부터 폴리아데닐화 시그날 또는 사람 성장 호르몬 유전자 터미네이터(DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981)이다. 발현 벡터는 또한 아데노바이러스 2 tripartite 리더와 같은 비암호 바이러스 리더 서열을 프로모터와 RNA 스플라이스 부위사이에 포함하고, SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질을 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위해, 분비 시그날 서열(리더 서열, prepro 서열 또는 pre 서열로도 알려져 있다)이 재조합 벡터에 제공될 수 있다. 분비 시그날 서열은 펩타이드 암호화 DNA 서열에 정확한 리딩 프레임으로 결합된다. 분비 시그날 서열은 흔히 펩타이드 암호화 서열의 5’에 위치한다. 분비 시그날 서열은 펩타이드와 정상적으로 결합 되거나 다른 분비 서열의 코딩 유전자로부터 유래 될 수 있다. 효모 세포로부터 분비되도록 하기 위해, 분비 시그날 서열은 세포의 분비 경로로 발현 폴리펩타이드의 충분한 유도를 보장하는 것은 어떠한 시그날 펩타이드도 코딩할 수 있다. 시그날 펩타이드는 천연 시그날 펩타이드 또는 이의 기능상 일부이거나 합성 펩타이드일 수 있다. 적합한 시그날 펩타이드는 알파-인자 시그날 펩타이드(미국특허 제4,870,008호), 마우스 타액 아밀라제(O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646), 변형된 카르복시펩티다제 시그날 펩타이드(L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), 효모 BAR1 신호 펩타이드(국제특허 WO 87/02670) 또는 효모 아스파트산 프로테아제 3(YAP3) 시그날 펩타이드(M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137)이다. 효모에서 충분한 분비를 위해, 리더 펩타이드 코딩 서열이 시그날 서열의 하류와 암호화 DNA 서열의 상류에 삽입될 수 있다. 리더 펩타이드의 기능은 배양 배지로의 분비를 위해 발현된 펩타이드가 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 골지체 및 분비낭으로 이동하도록 한다(즉, 세포벽을 따라 또는 세포막을 지나 세포질 주변으로 단백질의 분비). 리더 펩타이드는 효모 알파-인자 리더(미국특허 제4,546,082호, 미국특허 제4,870,008호, EP 123 294, EP 123 544 및 EP 163 529)일 수 있다. 대안으로, 리더 펩타이드는 합성 리더 펩타이드일 수 있으며, 예를 들면 국제특허 제WO89/02463호 또는 W92/11378호에 기술된 바와 같이 작제할 수 있다. 진균에서 사용하기 위한 시그날 펩타이드는 편리하게는 아스퍼질러스 종 아밀라제 또는 글루코아밀라제 코딩 유전자, Rhizomucor miehei 리파제 또는 프로테아제 또는 Humicola lanuginosa 리파제 코딩 유전자로부터 유래 될 수 있다. 곤충에서 사용하기 위한 시그날 펩타이드는 편리하게는 리피돕테란 Manduca sexta adipokinetic 호르몬 전구 시그날 펩타이드(미국특허 제5,023,328호)와 같은 곤충 유전자(국제 특허 제WO90/05783)로부터 유래 될 수 있다.
포유동물에 DNA 서열을 형질감염 및 발현시키는 방법은 예를 들면 Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; and Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845에 기술되어 있다. 클로닝된 DNA 서열은 배양된 포유동물 세포내로 예를 들면 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염(Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) 또는 전기천공(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)에 의해 도입된다. 외래 DNA를 발현하는 세포를 동정 및 선별하기 위해 선별성 표현형(선별 마커)를 제공하는 유전자는 일반적으로 해당 유전자 또는 cDNA와 함께 세포내로 도입된다. 바람직한 선별 마커는 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 제공하는 유전자를 포함한다. 선별 마커는 증폭가능한 선별 마커일 수 있다. 바람직한 증폭성 선별 마커는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 서열이다. 선별 마커는 별도의 플라스미드로 해당 유전자와 동시에 세포내로 도입되거나 동일한 플라스미드로 도입될 수 있다. 동일한 플라스미드인 경우, 선별 마커와 해당 유전자는 다른 프로모터 또는 동일한 프로모터의 조절하에 있을 수 있는데, 후 자 배열은 dicistronic 메시지를 생성한다. 이러한 유형의 작제물은 공지되어 있다 (미국특허 제4,713,339호). 또한, 전달체 DNA로 알려진 추가의 DNA를 세포내로 도입되는 혼합물에 추가하는 것이 유리할 수 있다.
세포가 DNA를 흡수한 후 적절한 성장 배지에서 전형적으로 1-2일간 성장시켜 해당 유전자의 발현을 개시한다. 용어 적절한 성장 배지는 세포의 성장 및 해당 단백질의 발현에 필요한 영양소 및 기타 성분을 함유한 배지를 의미한다. 일반적으로 배지는 탄소원, 질소원, 필수아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장인자를 포함한다. 감마-카르복실화 단백질의 생성을 위해, 배지는 비타민 K, 바람직하게는 약 0.1 mug/ml 내지 약 5 mug/ml의 농도로 함유한다. 그런 다음, 약물 선별을 적용하여 선별 마커를 안정한 양상으로 발현하는 세포의 성장을 선별한다. 증폭성 선별 마커로 형질감염된 세포의 경우, 약물 농도를 증가시켜 클로닝 된 서열의 증가 된 복제수를 선별할 수 있고, 그럼으로써 발현 수준을 증가시킨다. 이어서, 안정하게 형질감염된 세포의 클론을 해당 단백질의 발현에 대해 스크리닝한다.
해당 펩타이드의 코딩 DNA 서열이 도입되는 숙주 세포는 전사 후 변형 펩타이드를 생성할 수 세포면 어떠한 것이든 가능할 수 있으며, 효모, 진균 및 고등 진핵 세포가 포함된다. 본 발명에 사용되는 포유동물 세포주의 예로는 COS-1(ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장(BHK) 및 293(ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 세포주를 들 수 있다. 바람직한 BHK 세포주는 tk-ts13 BHK 세포주(ATCC CRL 10314)이다(Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982). 또한 다른 세포주가 사용될 수 있는데 랫트 Hep I(랫트 간종양; ATCC CRL 1600), 랫트 Hep II(랫트 간종양; ATCC CRL 1548), TCMK(ATCC CCL 139), 사람 폐(ATCC HB 8065), NCTC 1469(ATCC CCL 9.1), CHO(ATCC CCL 61) and DUKX 세포(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)가 포함된다. 적합한 효모의 예로는 사카로마이세스 종 또는 쉬조사카로마이세스 종의 세포, 특히 사카로마이세프 세레비지애 또는 사카로마이세스 클루이베리가 포함된다. 효모 세포를 이종 DNA로 형질전환시키고 그로부터 이종 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 미국특허 제4,599,311, 제4,870,008, 제5,037,743 및 제4,845,075호에 기술되어 있다. 형질전환 세포는 선별 마커, 통상적으로 약물 내성 또는 특정 영양소, 예를 들면 루이신의 부재하에서 성장하는 능력에 의해 결정된 표현형에 의해 선별된다. 효모에 바람직한 벡터는 미국특허 제4,931,373호에 기술된 POT1 벡터이다. 다른 사상형 진균 세포의 예로는 아스퍼질러스 종, 뉴로스포라 종, Fusarium 종 또는 Trichoderma 종, 특히 A. oryzae, A. nidulans 또는 A. niger의 스트레인이다. 아스퍼질러스 종을 단백질 발현을 위해 사용한 것이 예를 들면 EP 272 277 및 EP 238 023, EP 184 438에 기술되어 있다. F. oxysporum의 형질전환은 예를 들면 문헌 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156에 기술된 바와 같이 실시할 수 있다. Trichoderma 종의 형질전환은 EP 244 234에 기술된 바와 같이 실시할 수 있다. 사상형 진균이 숙주 세포로 사용될 때 편리하게는 DNA 작제물을 숙주 염색체에 통합시켜 재조합 숙주 세포를 수득할 수 있다. 이러한 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포에 안정하게 유지되기 때문에 장점으로 간주 된다. 숙 주 염색체내로 DNA 작제물의 통합은 통상적인 방법, 예를 들면 동종 또는 이종 재
조합에 의해 실시될 수 있다. 곤충세포의 형질전환 및 이종 폴리펩타이드의 생성은 미국특허 제4,745,051호, 제4,879,236호, 제5,155,037호 및 제5,162,222호 및 EP 397,485호에 기술된 바와 같이 실시할 수 있다. 숙주로 사용된 곤충 세포주는 적합하게는 Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia ni 세포와 같은 Lepidoptera 세포주일 수 있다(미국특허 제5,077,214호). 배양 조건은 적합하게는 국제 특허 제WO89/01029 또는 WO89/01028에 기술된 바와 같을 수 있다.
상기된 형질전환 또는 형질감염 숙주 세포는 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 적합한 영양 배지에서 배양한 후 생성된 단백질의 전체 또는 일부를 배양물로부터 회수할 수 있다. 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 숙주 세포를 성장시키는데 적합한 통상적인 배지, 예를 들면 적절한 보충제를 함유한 최소 또는 복합 배지일 수 있다. 적합한 배지는 제조업체로부터 입수가능하거나 공지된 바에 따라 제조할 수 있다(예, ATCC의 카달로그). 이어서, 세포에 의해 생성된 단백질은 배양 배지로부터 통상적인 절차에 의해 회수할 수 있다. 통상의 절차는 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하고, 상청액 또는 여과액의 단백질수성 성분을 염(예, 황산암모늄)에 의해 침전시키며, 여러 크로마토그래피 절차(예, 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등)에 의해 정제하는 것 등을 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 Axl 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal) 어느 것이든 가능할 수 있다. Axl 항체는 Santa Cruz Biotech으로 부터 구입할 수 있다. 또한 본 발명에서 사용되는 항체는 공지 방법에 따라 제조할 수 있다.
폴리클로날 항체는 항원과 보조제를 동물에 수회 피하 도는 복강내 주사하여 획득한다. 면역화할 종에서 면역원성인 단백질(예, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 유도화제 (예, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르, N-하이드록시석신이미드, 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2 등)에 관련 항원을 결합시키는 유용할 수 있다. 동물은 항원, 면역원성 결합체 또는 유도체에 대하여 예를 들면 100mug 또는 5 mug의 단백질 또는 결합체(각각 토끼 또는 마우스의 경우)를 3회 용량의 프로인트 완전 부형제와 배합하고 용액을 여러 부위에 경피 주사함으로써 면역화 한다. 1개월 후 동물을 프로인트 완전 부형제중 펩타이드 또는 결합체의 최초량의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사 접종한다. 7 내지 14일 후 동물로부터 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가 고저까지 동물을 접종한다. 바람직하게는, 동물을 동일한 항원의 결합체로 접종하지만, 다른 단백질 및/또는 다른 가교시약과 결합시키기도 한다. 또한 결합체는 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양에서 만들 수 있다. 또한 알룸과 같은 응고제가 면역반응을 증강시키는데 적절히 사용된다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 군으로부터 수득 된다. 즉, 그 군을 포함한 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 변형 모노클로날은 개개 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특성을 가리킨다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하거나, 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물 (예, 햄스터)이 상기된 바와 같이 면역화 되어 면역화을 위해 사용된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 다른 방법으로서, 림프구를 시험관에서 면역화할 수 있다. 그런 다음, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59 103 (Academic Press, 1986). 이에 따라 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포가 하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없다면, 하이브리도의 배양 배지는 전형적으로 하이폭산틴, 아미놉테린 및 티미딘(HAT 배지)를 포함할 것이다.
이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다. 바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 항체 생성을 지지하며, HAT와 같은 배지에 민감한 것이다. 이들 가운데, 바람직한 골수종 세포주는 마우스 골수종 세포주, 예를 들면 미국 캘리포니아 샌디에고, Salk Institute Cell Distribution Center에서 입수할 수 있는 MOPC-21 및 PMC-11 마우스 종양 및 미국 ATCC로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 사람 골수종 및 마우스-사람 이종골수종 세포주가 또한 사람 모노클로날 항체의 생성을 위 해 사용될 수 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강 도는 시험관 결합검정 예, 방사능면역검정 또는 효소-연결 면역흡착 검정)에 의해 결정한다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들면 문헌(Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980))의 Scatchard 분석으로 결정할 수 있다. 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 절차에 의해 아클로닝하여 클론을 얻고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59 103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킨다. 이 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다. 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 예를 들면 단백질 A-세파로즈, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 항체 정제 절차에 의해 분리한다.
조혈모세포는 자체 재생능이 있고 개인의 일생동안 수임된 선조세포의 기원이다. 원시뿐만 아니라 보다 수임된 조혈모세포의 일반적인 특징은 항-CD34 모노클로날 항체를 이용한 FACS(형광-활성화 세포 분류기) 분석에 의해 검출될 수 있는 CD34 항원의 발현이다. 조혈모세포는 골수, 말초혈액, 제대혈 등으로부터 유래된다. 제대혈은 가장 풍부한 조혈모세포의 근원으로 알려져 있다. 분만 후 직접 태반으로부터 수득 된 제대혈은 조혈모세포가 풍부하고 골수 및 말초혈로부터 얻은 세포보다 높은 증식능을 갖는다. 과립구-콜로니 자극 인자와 같은 조혈성장 인자의 주입은 CD34(+) 세포의 가동화를 상당히 촉진할 수 있다(Beyer J et al., Hematopoietic rescue after high-dose chemotherapy using autologous peripheral-blood progenitor cells or bone marrow: a randomized comparison. J Clin Oncol 1995;13:1328-1335; and Smith TJ et al., Economic analysis of a randomized clinical trial to compare filgrastim-mobilized peripheral-blood progenitor-cell trnasplantation and autologous bone marrow transplantation in patients with Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol 1997;15:5-10). 과립구-콜로니 자극 인자는 조혈모세포의 채취 기간 동안에 일일 300-960 ug의 용량으로 피하 투여된다. 조혈모세포를 분리하거나 정제하는데 사용되는 전략은 많이 있다. 이 가운데 형광(Preffer FI, et al., Lineage-negative side-population(SP) cells with restricted hematopoietic capacity circulate in normal human adult blood: immunophenotypic and functional characterization. STEM CELLS 2002; 20:417427) 또는 면역자기 기술(Przyborski SA. Isolation of human embryonal carcinoma stem cells by immunomagnetic sorting. Stem Cells 2001; 19:500504)을 이용하여 특정 세포 표면 마커에 따라 세포를 분류하거나, 배양 플라스틱에서 줄기세포의 차등 평판 효율을 활용하거나(Friedenstein AJ, et al., Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 1976; 4:267274), 컬럼-분리 기술(Huss R. Isolation of primary and immortalized CD34 hematopoietic and Mesenchymal stem cells from various sources. STEMCELLS 2000; 18:19)이 포함된다.
성숙자연살해세포를 활성화하기 위해서 인터루킨-2를 사용하는 것은 잘 알려져 있다. 인터루킨-2의 처리 방법은 두 가지가 제시되고 있다. 첫 번째 방법으로 인터루킨-2를 직접 환자에 투여해서 투여된 인터루킨-2에 의해서 생체내에서 자연살해세포가 증식되고 활성화시키는 것이 있고, 두 번째 방법으로 환자로부터 채혈하여 혈액에서 성숙자연살해세포를 분리하여 인터루킨-2로 자극시켜 활성화시킨 후 활성화된 성숙자연살해세포를 다시 환자에게 투여하는 방법이 있다. 이들은 모두 인터루킨-2로 자연살해세포를 활성화시켜 활성화된 자연살해세포에 의해 암세포 파괴를 목적으로 하고 있다. 하지만 이러한 방법들은 고농도(약 150ng/ml)의 인터루킨-2가 사용되어 이에 따른 부작용이 문제점으로 대두 되고 있다. 이것에 대한 부작용으로는 강한 독성, 발열과 폐부종 그리고 쇼크의 유발이 있으며 이러한 효과는 인터루킨-2가 T림프구로 하여금 종양괴사인자나 인터페론-감마 와 같은 다른 사이토카인의 생산을 자극하여 이들 사이토카인이 혈관 내피와 다른 세포에 작용하기 때문이다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해 적은 농도의 인터루킨-2 사용에 대한 연구들이 수행 중에 있지만 아직 만족할 만한 결과에 대해서는 보고되어 진 바가 없다(M.J. Smyth, Y. Hayakawa, K. Takeda, H. Yagita, Nat Rev Cancer. 2,850, 2002; M. A. Caligiuri,et al.,J. Exp. Med. 171, 1509,1990).
본 발명에 따르면, 본 발명의 분화된 성숙자연살해세포를 약 8 내지 15ng/ml의 저용량 인터루킨-2로 처리하여도 성숙자연살해세포를 충분히 자극 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 인터루킨-2의 사용량은 약 10 ng/ml이다. 인터루킨-2의 그러한 저용량은 활성화된 성숙자연살해세포가 독성을 유발하지 않는 것으로 보인다. 세포 보존은 몇 가지 방법이 사용되고 있는데, 가장 잘 알려진 것은 초저온보존(cryopreservation)이다. 또한 HypoThermosolTM(BioLife Solutions Inc.) 계열 및 DMSO 용액(dimethyl sulfoxide)을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 관점으로서, 자연살해세포는 환자에게 투여 전후로 초저온보존될 수 있다. 초저온보존의 대표적인 방법이 미국특허 제60168991호에 기술되어 있다. 소규모 초저온보온의 경우 세포는 사전냉장된 5% 사람 혈청 알부민(HAS)중에 200x106/ml로 재현탁시킬 수 있다. 이어서, 상기 HAS 용액중에 20% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 등량을 적가한다. 혼합물을 초저온바이알에 1 ml/바이알의 양으로 분취하고 초저온챔버(NalgeneTM)에서 -80℃로 밤새 동결시킨다. 대규모 초저온보존의 경우, 세포는 AIM V에 600x106/ml로 재현탁할 수 있다. 그런 다음, 등량의 20% AIM V를 점증적으로 첨가한다. 혼합물은 속도제어 동결시스템(FormaTM)을 이용하여 20 ml/낭으로 동결용기(Cryocyte, Baxter)에 동결시킨다. 활성화된 성숙자연살해세포의 세포독성 유효량은 시험관 및 생체내 용도뿐만 아니라 이들 살해 세포의 궁극적인 표적이 되는 세포의 양 및 유형에 따라 다양할 수 있다.
여기서 세포독성유효량은 성숙자연살해세포가 암세포를 살상할 수 있는(약리 작용을 일으킬 수 있는) 약물의 분량으로 정의한다. 또한 유효량은 환자의 건강 상태 및 중증에 따라 변할 수 있기 때문에, 전문의가 모든 변수를 적절히 고려하여 결정해야 한다. 일반적으로, 성인 암환자에게 투여하는 양은 회당 106 내지 1012개 세포, 바람직하게는, 회당 108 내지 1011개 세포, 더욱 바람직하게는 회당 109 내지 1010개 세포이다. 본 발명의 방법에 따라 증식된 성숙자연살해세포는 약제학적으로 허용되는 담체(예, 염수 용액)과 함께 치료를 위해 환자에게 피하, 근육내, 정맥내, 경막내로 투여될 수 있다. 다양한 생체 재료(세포 전달체)의 사용은 자연살해세포가 목(target)부위로 전달되는 효율과 자연살해세포에 의한 암살상 능력의 효율을 높일 수 있다. 세포 전달체로는 다당류 계열의 메틸셀룰로오스(M.C. Tate, D.A. Shear, S.W. Hoffman, D.G. Stein, M.C. LaPlaca, Biomaterials 22, 1113, 2001), 키토산(Suh JKF, Matthew HWT. Biomaterials, 21, 2589, 2000; Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford DS, et al., J Biomed Mater Res, 51, 586, 2000), N-이소프로필아크릴아마이드(isopropylacrylamide) 공중합체 계열의 P(NIPAM-co-AA)(Y.H. Bae, B. Vernon, C.K. Han, S.W. Kim, J. Control. Release 53, 249,1998 H. Gappa, M. Baudys, J.J. Koh, S.W. Kim, Y.H. Bae, Tissue Eng. 7, 35, 2001) 등이 있으며 이외에도 Poly(산화에틸렌)/poly(D,L-젖산-co-글리콜산) (B. Jeong, K.M. Lee, A. Gutowska, Y.H. An, Biomacromolecules 3, 865, 2002), P(PF-co-EG) (Suggs LJ, Mikos AG. Cell Trans, 8, 345, 1999), PEO/PEG (Mann BK, Gobin AS, Tsai AT, Schmedlen RH, West JL., Biomaterials, 22, 3045, 2001 Bryant SJ, Anseth KS. Biomaterials, 22, 619, 2001), PVA (Chih-Ta Lee, Po-Han Kung and Yu-Der Lee, Carbohydrate Polymers, 61, 348, 2005), 콜라겐 (Lee CR, Grodzinsky AJ, Spector M., Biomaterials 22, 3145, 2001), alginate (Bouhadir KH, Lee KY, Alsberg E, Damm KL, Anderson KW, Mooney DJ. Biotech Prog 17, 945, 2001 Smidsrd O, Skjak-Braek G., Trends Biotech, 8, 71, 1990) 등이 조직공학에 있어서 세포 치료에 대한 세포 전달체로써 사용되고 있다.
이하 본 발명은 상기의 도면을 참조하여 하기 실시예로 예시하고자 한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 된다.
실시예 1. 마우스 자연살해세포 분화단계에 따라 발현되는 특정 유전자의 발굴
(A) 마우스의 골수(Bone marrow, BM)로부터 조혈모세포의 분리 방법과 자연살해세포의 분화 방법
8-12 주령된 마우스(C57BL/6, Korea Reasearch Bioscience and Biotechnology에서 구입하여 무균상태에서 동물 관리 지침에 따라 관리하였음)의 전체 뼈를 분리하여 골수세포를 얻은 다음 세포용해 완충액(0.2% NaCl, 1.6% NaCl)으로 적혈구를 제거하여 세포를 2.4G2 상청액과 10분간 아이스에서 반응시키고 2mM EDTA 가 함유된 인산염 완충용액 (buffer A)에 세척하였다. 완충용액 A에 세포를 현탁시켜(1X108/500㎕) 바이오틴(biotin)이 붙여진 항체 칵테일(Mac-1, Gr-1, B220, NK 1.1, CD2, TER-119, Pharmingen)을 가하고 4℃에서 10분간 반응시킨 다음 세포를 완충용액 A로 세척하고, 1X108세포에 900㎕의 완충용액 A와 100㎕의 스트렙트아비딘(streptavidin)-마이크로비즈(microbeads) (Miltenyi Biotec)를 가하여 4℃에서 15분간 반응시켰다. 세포를 세척한 후, MACS(마그네틱 비드-활성화 세포 분류기) 완충용액(2mM EDTA와 0.5% BSA가 함유된 인산염 완충용액)에 현탁시켜 나일론 메쉬(70㎛)로 여과하여 준비하였다. 마그테틱 컬럼(CS column, Miltenyi Biotech)을 슈퍼 MACS에 장치하고 마그네틱 비드가 표지된 세포를 통과시켜 MACS 완충용액으로 컬럼을 충분히 세척한 다음 컬럼을 통과한 액을 원심 분리하여 리니지 음성인(Lin-) 세포를 얻었다. Lin-세포(1X107)에 FITC가 붙어 있는 항-c-kit (Pharmingen)을 가하고 4℃에서 10분간 반응시킨 후, 세척하고 항-FITC 마이크로 비즈 (Miltenyi Biotec)와 다시 4℃에서 15분간 반응시켜 500㎕의 MACS 완충용액에 현탁하고 마그네틱 필드내에서 MS 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 충분히 세척하고 1ml의 MACS 완충용액으로 밀어내어 c-kit+ 인 세포를 얻어 조혈모세포로 사용하였다. 이렇게 분리된 조혈모세포를 전구자연살해세포로 분화시키기 위해 SCF(30ng/ml, Biosource), 인터루킨-7 (0.5 ng/ml, PeproTech), Flt3l(50ng/ml,PeproTech), 인도메타신(2㎍/ml, Sigma), 젠타마이신(2㎍/ml, Sigma)이 함유된 RPMI(Gibco)배지로 3일마다 배지의 절반을 새롭게 갈아주면서 1X106/ml의 농도로 24 웰 배양 용기(24 well plate)에서 배양하였다. 6일 동안 이들 사이토카인들을 첨가하여 배양 후 CD122-FITC 항체와 multisort 마이크로 비즈를 첨가시켜 반응시키고 MACS를 수행함 으로써 CD122+한 전구자연살해세포를 얻었다. 전구자연살해세포를 성숙자연살해세포로 분화시키기 위해서 다시 6일 동안 인터루킨-15(20ng/ml), 인도메타신(2㎍/ml), 젠타마이신(2㎍/ml)이 첨가된 RPMI 배지를 이용하여 두 가지 방법으로 분화시켰는데, 기질세포(ATCC)와 공동배양(co-culture)하여 성숙자연살해세포(mature NK-2)로 분화시키는 방법과 공동배양하지 않고 덜 성숙자연살해세포(mature NK-1)로 분화시키는 방법을 수행하였으며 이들 세포를 수확하여 자연살해세포 표면분자들의 발현을 분석하였다(도 1).
(B) 마우스 조혈모세포 및 성숙자연살해세포로의 분화단계별 분리된 세포들의 순도
8마리의 8-12주령 된 마우스(C57BL/6)로부터 실시예 1 (A)에 제시된 방법을 이용하여 2×108개의 전체 골수세포를 얻은 후 4×106 개의 Lin-, c-kit+인 조혈모세포를 분리하였다. 이들 조혈모세포로부터 CD122+한 전구자연살해세포를 얻어 이들 세포를 인터루킨-15 존재하에 기질세포와 공동배양(+OP9) 또는 전구자연살해세포의 단독배양(-OP9) 후 두 가지의 성숙자연살해세포를 분리하여 이들 각 분화단계별 세포의 순도 (purity)를 다음과 같은 방법을 통해 확인하였다. 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포 까지 분화단계별 세포들의 특성을 여러 가지 세포표면 분자들에 대한 항체를 이용하여 면역염색하기 위하여 1x106 세포로 조정하여 염색 완충용 액(20mM HEPES, 3% 우태아혈청, 0.1% NaN3가 포함된 인산염 완충용액, pH 7.4)으로 1회 세척하였다. 이를 FITC(fluoresceinated isothiocyanate, 플루오레세인이 붙어 있는 이소티오시안산염) 또는 PE(phycoerythrin, 홍조소) 형광물질이 결합된 자연살해세포 분화단계별 마커(세포표식자들) 즉, c-kit(Pharmingen), lineage(Pharmingen), NK1.1(Pharmingen), CD122(Pharmingen), 등의 항체를 세포시료에 가하여 0℃에서 30분간 반응시키고 염색 완충용액으로 2회 세척한 후 FACS(BD/Aria)로 분석하였다. 조혈모세포는 c-kit과 lineage(Pharmingen) 마커를 이용하였고(c-kit+Lin-) 전구자연살해세포(CD122+NK1.1-)와 성숙자연살해세포(CD122+NK1.1+)는 CD122(Pharmingen)와 NK1.1(Pharmingen) 항체를 이용하여 FACS로 분석하였다. 조혈모세포는 96%, 전구자연살해세포는 95%, 성숙자연살해세포(-OP9)는 94% 그리고 성숙자연살해세포(+OP9)은 96%의 수율로 획득됨을 확인하였다(도 2).
(C) 마우스 자연살해세포에서 특이 발현하는 유전자의 확인
위에서 얻은 세포들을 이용해 자연살해세포에서 특이적으로 발현하는 유전자인 CD122와 퍼포린의 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 각각의 세포들로부터 전체 RNA를 얻기 위해 2 x 106의 LK1 세포를 인산염 완충용액으로 1회 세척한 후에 RNA 분리용액(RNAzol B, TEL- TEST) 500㎕를 각 시료에 넣고 부드럽게 피펫팅 하여 세포를 깨고 50㎕의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 얼음에서 5분간 방치하였다. 이를 12,000rpm, 15분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상청액을 취하고 동량의 이소프로필 알콜을 넣고 얼음에서 20분 동안 방치하였다. 다시 12,000rpm, 20분 동안 4℃에서 원심분리한 후 침전물을 80% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후에 0.1% 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)가 포함된 물을 20㎕ 넣고 잘 녹였다. 이와 같이 얻은 RNA로 부터 MMLV 역전사효소(Roche)로 외가닥 cDNA를 합성하였고 각각의 유전자 특이적인 프라이머 CD122, 5'-gtcgacgctcctctcagctgtgatggctaccata-3'와 5'-ggatcccagaagacgtctacgggcctcaaattccaa-3', 퍼포린, 5'-gtcacgtcgaagtacttggtg-3'와 5'-aaccagccacatagcacacat-3', 베타-액틴(β-actin), 5'-gtggggcgccccaggcacca-3'와 5'-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3'를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 다음과 같이 수행하였다. 5 x 반응 완충용액(Roche) 5㎕, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, TTP 각 5μM, Roche) 2㎕, 3'프라이머 1㎕(20pmol), 증류수 1㎕, 전체 세포 RNA 10㎕, 역전사 효소 1㎕(200U) 혼합물(총량 20㎕)을 42℃에서 30분간 반응시킨 후 90℃에서 5분간 반응을 정지시켰다. 이렇게 얻은 반응물에 다음과 같은 시료를 섞어 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 위의 반응물 20㎕, 중합효소 연쇄반응 10 x 완충용액(Roche) 8㎕, 5' 프라이머 1㎕(20pmol), 3' 프라이머 1㎕(20pmol), 증류수 69㎕, Taq 중합효소(Takara) 1㎕(2.5U)의 반응물(총량 100㎕)을 95℃에서 5분간 방치하여 어떤 다른 효소활성을 저해시킨 후에 95℃에서 1분 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분 동안 반복하는 사이클을 30여 회 수행하고 마지막으로 95℃에서 1분 30 초, 55℃에서 1분, 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 이렇게 얻은 반응물 중에서 10㎕을 취하여 1% 아가로스 겔에서 30분간 100V에서 전기영동 하였다. 분석 결과, 각 분화단계별 세포들은 기존의 연구에서 알려진 CD122와 퍼포린의 발현양상과 일치함을 확인하였다. CD122는 전구자연살해세포 보다 성숙자연살해세포에서 발현정도가 컸으며 기질세포와 공동배양한 경우에 더 많은 발현이 관찰되었다. 퍼포린은 성숙자연살해세포에서 발현이 되며 기질세포와 공동배양 하였을 때 발현이 증가함을 관찰하였다(도 3).
(D) 마우스의 기질세포와 공동배양 유무에 의한 성숙자연살해세포의 분화도 측정
위에서 얻은 성숙자연살해세포(-OP9 과 +OP9)을 이용해 성숙자연살해세포 표면분자들(NK1.1과 Ly49)의 발현을 NK1.1 과 Ly49 항체들(Pharmingen)을 이용하여 (B)에서 수행한 FACS 분석을 통해 비교해 보았다. 전구자연살해세포를 인터루킨-15 존재 하에서 기질세포와 공동배양하지 않은 세포에 비하여 기질세포와 공동배양하여 분화시킨 성숙자연살해세포들은 NK1.1과 Ly49 세포 표면분자들을 발현하고 있어 기질세포는 자연살해세포의 최종 분화에 필수적인 역할 및 특이성이 있음을 확인하였다. 기질세포와 공동배양하여 분화시킨 성숙자연살해세포에서 Ly49A+NK1.1+인 세포는 1.2%, Ly49C/I+NK1.1+인 세포는 25%, Ly49D+NK1.1+인 세포는 2.1%, Ly49G2+NK1.1+인 세포는 30%의 확률로 획득하였으며 기질세포와 공동배양하지 않은 경우에는 위의 특징을 가지는 세포를 획득하지 못하였다(도 4).
(E) SAGE를 통한 마우스 성숙자연살해세포의 분화 유도 물질 발굴
분리한 조혈모세포, 전구자연살해세포 그리고 두 가지의 성숙자연살해세포로부터 각각의 분화단계에 따라 특이적으로 발현되는 유전자를 발굴하고자 SAGE(Serial Analysis of gene expression)를 수행하였다(도 5). 각 분화 단계별 세포인 조혈모세포, 전구자연살해세포 그리고 두 가지의 성숙자연살해세포로부터 (C)와 동일한 방법으로 전체 RNA를 분리하고 각각의 RNA 5㎍을 oligo(dT)25 비드(Dynal A.S.)와 반응시켜 mRNA를 분리하였다. 분리한 mRNA와 5'에 바이오틴이 붙어 있고 3‘위치에 올리고(dT)를 포함한 프라이머를 이용하여 cDNA 합성 키트(Life Technology)로 cDNA를 합성하였다. cDNA와 반응한 SAGE tag들은 T4 DNA 연결효소를 이용해 연결시키고 이 반응물은 제한효소 sphI(Roche)으로 처리한 pZero-1 벡터(Invitrogen)에 T4 DNA 연결효소(Roche)를 이용해 삽입하였다. M13 F 프라이머와 M13 R 프라이머를 이용해 (C)에 실시한 중합 효소 연쇄반응을 수행하여 반응물을 얻었다. 이 반응물은 Big-Dye 시퀀싱 키트와 ABI1377 시퀀서(Perkin-elmer Applied Biosystems)로 염기서열 분석을 하였다. Tag 시퀀스는 SAGE 300 소프트웨어를 이용해 추출하였다. 레퍼런스 SAGE-tag 데이터베이스는 GenBank에 있는 기존에 알려진 마우스의 발현 시퀀스로 구성이 된 것이며 이들 시퀀스는 각 전사물의 오리엔테이션, polu(A) 시그날(AATAAA EH는 ATTAAA), poly(A) tail, 그리고 시퀀스 말단에 CATG 절단 사이트를 포함하였다. 컴퓨터 프로그램, GIST(Gene Identification and Sequence Topography)를 이용하여 SAGE tag 과 참조 SAGE 데이타 베이스를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 전구자연살해세포에서만 발현되고 다른 분화단계에서는 발현되지 않는 유전자들 중 Axl 유전자가 이들 세포에만 많은 수로 그리고 특이적으로 발현되고 있음을 알 수 있었다(표 1). 데이터의 통계 분석에 대한 유의 확률 (p-value)는 paired Student t test 소프트웨어 프로그램을 이용하여 분석하였고(실시예의 모든 데이타 적용) SAGE tag들의 발현에 대한 평가는 v2, Audic, 과 Claveric 방법(http://telethon.bio.unipd.it/bioinfo/IDEG6_ form)을 이용하여 분석하였다.
전구자연살해세포에서 특이적으로 발현되는 유전자
Gene name HSC pNK mNK(-OP9) mNK(+OP9) Unigene Id
Axl 0 189 0 0 Mm.4128
전구자연살해세포에서 이들 유전자발현이 실제로 SAGE 결과와 일치하는지를 (C)에서 실시한 역전사 중합효소 연쇄반응으로 알아본 결과, SAGE tag의 수와 Axl의 발현 양상이 일치는 것으로 확인되었다. 즉, Axl이 전구자연살해세포에서 발현 양이 증가 되어 있음을 관찰하였다(도 6).
실시예 2. Axl 폴리클로날 항체가 자연살해세포의 분화에 미치는 영향
(A) Axl 폴리클로날 항체에 의한 성숙자연살해세포 특이 수용체들의 발현: 기질세포와 공동 배양
마우스 조혈모세포로부터 자연살해세포로 분화 과정 중 전구자연살해세포에(7일째) 1㎍의 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-1096)를 처리하고 전술한 방법과 동일하게 다시 6일 동안 인터루킨-15 (40ng/ml) 등이 첨가된 조건하에서 기질세포와 공동배양을 수행하여 성숙자연살해세포로 분화시킨 후 분화정도를 NK1.1 항체와 자연살해세포에 특이적인 수용체들에 대한 항체들(Ly49G2, Ly49A, Ly49C/F/I, Pharmingen)로 염색한 후 실시예 1(B)와 같은 방법으로 FACS 분석 한 결과, 염소항체(goat Ig, R&D)를 처리한 대조군과 이를 처리하지 않은 대조군(실시예 1(B)의 방법으로 얻은) 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리한 세포들에서 Ly49A+NK1.1+인 세포는 1.2%에서 3.2%, Ly49C/I+NK1.1+인 세포는 1%에서 3.5%, Ly49G+NK1.1+인 세포는 1.2%에서 3.2%로 완전히 성숙자연살해세포로의 분화전도가 약 2배가량 증가하여 Axl 폴리클로날 항체가 자연살해세포의 분화에 영향을 미친다는 것을 확인하였다(도 7).
(B) Axl 폴리클로날 항체에 의한 성숙자연살해세포 특이 유전자들의 발현: 기질세포와 공동 배양
(A)와 동일한 조건의 자연살해세포로부터 자연살해세포와 관련된 유전자들(인터페론-감마, 5'-agcggctgactgaactcagattg-3'와 5'-gcacagttttcagctctatagg-3'; 인터루킨-15Ra, 5'-ccaacatggcctcgccgcagct-3'와 5'-ttgtagagaaagcttctggctc-3' 인터루킨-18, 5'-aggtacaaccgcagtaatacgg-3'와 5'-agtgaacattacagatttatccc-3' 그리고 퍼포린, 5'-gtcacgtcgaagtacttggtg-3'와 5'-aaccagccacatagcacacat-3')의 발현을 실시예 1(C)에서 실시한 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 분석하였다. 그 결과, 염소항체를 처리한 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리한 세포들에서 위 유전자들의 발현이 증가 되는 것을 관찰하여 Axl 폴리클로날 항체에 의해 완전히 성숙자연살해세포의 분화전도가 증가하는 것을 확인하였다(도 8).
(C) Axl 폴리클로날 항체에 의한 성숙자연살해세포 특이 수용체들의 발현: 기질세포 없이 배양
또 다른 조건하에서 Axl 폴리클로날 항체에 의한 성숙자연살해세포로의 분화 효과를 확인하기 위하여, 전구자연살해세포를 기질세포와 공동배양하지 않고 보다 적은 농도의 인터루킨-15(25ng/ml)와 Axl 플리클로날 항체(500ng/ml)를 직접 처리함과 동시에 배양 용기에 붙여 고정시킨 후 성숙자연살해세포로의 분화정도를 NK1.1 항체와 자연살해세포에 특이적인 수용체들에 대한 항체들(Ly49G2, Ly49A, Ly49C/F/I, NKG2A/C/E)로 염색한 후 실시예 1(B)와 같은 방법으로 FACS 분석한 측정해 본 결과, 기질세포가 없는 상태에서도 Axl 폴리클로날 항체를 처리하지 않았을 때에 비하여 처리한 세포들에서 자연살해세포로의 분화유도가 Ly49A+ NK1.1+인 세포는 8.4%에서 9.8% 와 9.3%, Ly49C/F/I+NK1.1+인 세포는 2.5% 에서 4% 와 5.3%, NKG2A/C/E+NK1.1+인 세포는 9.3%에서 18%와 16%로 증가함을 관찰하였다 (도 9).
(D) Axl 폴리클로날 항체에 의한 성숙자연살해세포 특이 유전자들의 발현: 기질세포 없이 배양
실시예 2 (C)와 동일한 조건의 자연살해세포로 부터 자연살해세포와 관련된 유전자들(CD122, 퍼포린 그리고 그랜자임 비)의 발현을 실시예 1(C)에서 실시한 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 분석하였다. 그 결과, 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리한 세포들에서 위 유전자들의 발현이 증가 되는 것을 관찰하여 기질세포가 없는 상태에서도 Axl 폴리클로날 항체에 의해 완전한 성숙자연살해세포의 분화전도가 증가하는 것을 확인하였다(도 10).
실시예 3. Axl 폴리클로날 항체가 자연살해세포의 인터페론-감마 생성에 미치는 영향
실시예 1(B)에서 얻은 전구자연살해세포에 Axl 폴리클로날 항체(500ng/ml), 인터루킨-15(10ng/ml)와 기질세포와 공동배양 하여 성숙자연살해세포를 확보한 후 사람 인터루킨-2(10ng/ml, R&D)를 처리하여 성숙자연살해세포를 활성화 시켰다. 24시간 후에 인터페론-감마 일라이저(ELISA) 키트(BD Pharmingen)을 이용하여 인터페론-감마의 생성량을 측정한 결과 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리한 실험군에서 인터페론-감마의 생성량이 증가함을 관찰하였다(도 11)
실시예 4. Axl 폴리클로날 항체가 전구자연살해세포의 증식에 미치는 영향
기질세포를 1x104 으로 96웰 마이크로 배양용기에 평판하고 하루 지난 후에 실시예 1 (B)에서 얻은 전구자연살해세포를 웰당 2.5x 104 세포가 되도록 분주하였다. 인터루킨-15(25ng/ml)를 모두 포함한 상태에서 염소항체, Axl 폴리클로날 항체(a-Axl) 그리고 Axl-Ig를 각각 500ng/ml 처리하고 48시간 후에 전구자연살해세포의 증식 정도를 MTS 검증(CellTiter 96 AQueous Assay, Promega, Madison, WI)을 통해 분석하였다. MTS 검증은 테트라졸리움(tetrazolium) 화합물[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS]과 전자-커플링(electron-coupling) 시약인 페나신 메소황산염(phenazine methosulfate, PMS)을 이용한 발색 분석법으로 세포 배양시기의 마지막 날 0.025ml 의 MTS/PMS혼합액을 각 웰에 첨가하여 30 분 동안 반응시킨 후 일라이저 리더(Molecular Devices Co. Sunnyvale, CA, USA)를 이용해서 495nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리한 경우 전구자연살해세포의 증식이 두 배 정도 증가함을 관찰했고 Axl-Ig를 처리한 경우 전구자연살해세포의 증식이 감소하는 것으로 보아 Axl 폴리클로날 항체에 의한 Axl 시그날 전달이 전구자연살해세포 증식에 중요하게 작용함을 관찰하였다(도 12).
실시예 5. Axl 과 이의 리간드 Gas6 의 상호작용이 자연살해세포 분화에 미치는 효과
Gas6와 Axl의 결합에 의한 시그날 전달이 자연살해세포의 분화에 미치는 영향을 알아보고자 마우스 재조합 Gas6(500ng/ml, R&D)을 분화과정 중에 처리한 결과, 자연살해세포의 분화에는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타나(도 13), Gas6이 생물학적 활성을 나타내기 위해서는 감마-카르복실화 과정이 필요한 것으로 판단되어 이후의 실험에서는 기질세포에서 발현되는 Gas6을 이용하였다. Gas6이 전구자연살해세포에서 발현되는 Axl의 리간드로 작용하는 것을 억제하기 위해서 워퍼린(Sigma)을 사용하여 Axl를 통한 시그날 전달에 미치는 영향을 조사하였다. 조혈모세포를 전구자연살해세포로 분화시킨 후 인터루킨-15 (25ng/ml)와 워퍼린을 1㎍/ml, 2.5㎍/ml, 5㎍/ml의 농도로 각각 처리하고 7일 동안 기질세포 (2x104)와 공동배양 한 후 전구자연살해세포가 성숙자연살해세포로 분화되는 정도를 실시예 1(B)에서 실시한 유속세포형광분석기로 분석하였다. 그 결과, NK1.1, NKG2A/C/E 와 Ly49C/F/H/I 자연살해세포에서 특이적으로 발현되는 수용체들 또한 농도 의존적으로 감소(NK1.1+NKG2A/C/E+는 25%, 16%, 16%, 8.8%의 경향으로 NK1.1+Ly49C/F/H/I+는 2.3%, 1.9%, 1.6%, 0.5%의 경향으로)되는 것으로 나타났다(도 14). 이 결과로부터 Axl와 그 리간드인 Gas6의 상호작용은 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로 분화하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
실시예 6. 마우스 Gas6 발현벡터 및 레트로바이러스 벡터 제조
활성을 갖고 있는 Gas6을 얻기 위하여 마우스 기질세포에서 분리한 RNA와 Gas6 프라이머 (5'-ggcctcgagcatgccgccaccgcccgggc-3'와 5'-ggcgaattccggtctagggggtggcatgc- 3')로 실시예 1(C) 에 언급한 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 Gas6 cDNA(100ng)를 증폭한 후 제한효소로 EcoRI(1U, Roche)으로 처리한 pCR4-TOPO(50ng, Invitrogen)에 클로닝 하였다(도15). 클로닝 된 클론들 중에서 염기서열분석 결과 참조 염기서열(gene ID; AK086187)과 동일한 클론의 cDNA를 마우스 Gas6 발현벡터 제조 및 레트로바이러스 벡터 제조에 사용하였다. 레트로바이러스 벡터 pLXSN(Invitrogen)을 EcoRI(1U)처리한 후, pCR4-Gas6 #8에 EcoRI(1U) 제한효소를 처리하여(50ng) 분리한 마우스 Gas6 cDNA(100ng)를 첨가하고 T4 DNA 연결효소(1U, Roche)로 연결하여 재조합된 pLXSN-Gas6을 제조하였으며(도 16, 왼쪽), pcDNA3.1(+)을 EcoRI(1U)과 CIP(송아지 창자의 알칼라인 포스파타아제) 효소(1U)를 처리한 후, pCR4-Gas6 #8에 EcoRI(1U) 제한효소를 처리하여 분리한 마우스 Gas6 cDNA(100ng)를 첨가하고 T4 DNA 연결효소(1U)로 연결하여 재조합된 pcDNA3.1-Gas6을 제조하였다(도 16, 오른쪽). 제조된 이들 발현벡터에서 마우스 Gas6 cDNA의 바이러스 및 CMV 프로모터에 대한 방향은 제한효소 XhoI(1U, Roche)을 이용하여 각각 확인하고 프로모터에 정방향과 역방향의 클론을 각각 pLXSN-Gas6/F, pLXSN-Gas6/R 그리고 pcDNA3.1-Gas6/F, pcDNA3.1-Gas6/R이라 명명하였다(도 17).
실시예 7. 마우스 Gas6 형질감염체 제조
Gas6 유전자를 발현하지 않는 NIH3T3 세포주(ATCC)에 pcDNA3.1(+), pcDNA3.1-Gas6/F, pcDNA3.1-Gas6/R을 각각 리포펙타민(Lipofectamine)시약(Invitrogen)을 이용해 형질감염시키고 G418 항생제 함유배지에서 형질감염체 들을 각각 선별한 후 제한 희석법으로 마우스 Gas6 유전자를 과잉으로 발현하는 클론들을 얻었다. 한편, 마우스 Gas6 발현 레트로바이러스 제조를 위해 Gas6 레트로바이러스 벡터 pLXSN-Gas6/F, pLXSN-Gas6/R을 바이러스 구조물을 형성시켜 줄 수 있는 세포주인 PT67에 형질감염하고 G418 함유배지에서 선별하여 제한 희석법 수행 후 각각의 클론들에서 생성된 레트로바이러스의 감염 세포주 NIH3T3 세포에서 Gas6 발현 정도를 Gas6 프라이머(5'-ggcctcgagcatgccgccaccgcccgggc-3'와 5'-ggcgaattccggtctagggggtggcatgc-3')를 이용하여 실시예 1(C)와 동일한 방법의 역전사 중합효소 연쇄반응 (A)과 웨스턴 블랏(Western blot) (B)으로 확인하였다(도 18). 웨스턴 블랏은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 세포 배양용기로부터 세포를 수거한 후 세포용해완충용액(lysis buffer, 20mM HEPES pH 7.9, 100mM KCL, 300mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 1mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 100 mg/ml aprotinin, and 1 mg/ml leupeptin)으로 세포를 용해시켜 아이스에 30분 동안 방치하였다. 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용해 측정하였다. 동일한 양의 단백질 용해물을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 PVDF 멤브레인(Millipore, Marlborough, MA)에 전기영동 한 단백질을 이동시켰다. PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액(1% BSA and 5% skim milk in PBS)으로 4℃ 에서 밤새 반응시키고 TBST (50 mM Tris. pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)로 세 번 세척해 주었다. 단백질을 포함하고 있는 PVDF 멤브레인을 염소 항 마우스 Gas6 항체(Santa Cruz)로 상온에서 2시간 동안 1차 반응한 후 HRP가 접합 된 항 영소 IgG (Santa Cruz)로 상온에서 1시간 동안 2차 반응하였다. TBS로 위의 멤브레인을 세 번 세척 한 후 ECL 시스템 (Amersham-Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)을 이용하여 시그날을 검출했다.
실시예 8. 마우스 Gas6 이 자연살해세포의 분화에 미치는 효과
마우스의 골수로부터 얻은 Lin-, c-kit+인 조혈모세포를 SCF(30ng/ml), 인터루킨-7(0.5 ng/ml), Flt3L(50ng/ml), 인도메타신(2㎍/ml), 젠타마이신(2㎍/ml)이 함유된 RPMI배지에 1X106/ml의 농도로 24 웰 배양 용기에서 배양하였다. 37℃, 5% CO2에서 6일간 배양하여 얻은 전구자연살해세포에 인터루킨-15(20ng/ml)와 함께 마우스 Gas6 형질감염체를 24시간 동안 배양한 후 2,000rpm에서 10분간 원심분리하여 회수한 배양상등액 시료와 마우스 Gas6 및 Axl 폴리클로날 항체를 6일간 더 배양하여 성숙자연살해세포로 분화시켰다. 이들 세포를 수확하여 실시예 1(B)에서 사용한 FACS 분석 이용하여 자연살해세포 표면분자들의 발현을 분석하였다. 이때 각 단계별 세포들의 순도는 FACS 분석을 이용하여 관찰한 결과 모두 약 95% 이상이었다. 마우스 Gas6 형질감염체로부터 분비되는 마우스 Gas6이 전구자연살해세포에서 발현되는 Axl과 결합하여 성숙자연살해세포로 분화하는데 영향을 미치는지 알아보기 위해, 전구자연살해세포를 정상적인 NIH3T3 세포 대조군과 벡터를 형질감염시킨 대조군, 그리고 마우스 Gas6을 과잉 발현하는 형질감염체와 각각 공동배양 또는 이들의 배양상청액에 의한 자연살해세포의 분화 능력을 분석하였다. 그 결과, 마우스 Gas6 형질감염체와 공동배양한 전구자연살해세포는 대조군들에 비해 성숙자연살해세포로 분화가 촉진됨을 확인하였다(약 14%에서 47%로 증가)(도 19). 뿐만 아니라 Gas6을 과잉 발현시킨 형질감염체(5x103)의 배양상청액(1:20으로 희석함)을 분화 중에 처리하였을 때, 성숙자연살해세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 실시예 1(C)와 동일한 방법으로 확인해본 결과, 대조군에 비해 Gas6을 과잉 발현시킨 형질감염체(5x103)의 배양상청액을 처리한 세포에서 퍼포린, 인터루킨-18, 인터페론-감마 등의 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다(도 20). 따라서 조혈모세포로부터 자연살해세포로의 분화 과정 중에 Axl은 Gas6와 결합에 의한 시그날전달을 통해 자연살해세포의 분화에 큰 영향을 미치고 있음을 확인하였다.
실시예 9. Gas6 가 자연살해세포의 인터페론-감마 생성에 미치는 영향
실시예 1(B)에서 얻은 전구자연살해세포를 인터루킨-15(10ng/ml)와 기질세포와 공동배양 하고 여기에 Gas6 항체(500ng/ml), Axl-Ig (500ng/ml), 워퍼린 (500ng/ml)을 각각 처리하였다. 여기에 Gas6의 형질감염체의 배양상청액을 1:20으로 희석하여 처리한 것(실험군) 또는 벡터만 집어넣은 형질감염체의 배양 상청액을 1:20으로 희석하여 처리한 것(대조군)으로부터 성숙자연살해세포를 확보한 후 사람 인터루킨-2 (10ng/ml, R&D)를 처리하였다. 24시간 후에 인터페론-감마 일라이저 키트(BD Pharmingen)을 이용하여 인터페론-감마의 생성량을 측정한 결과 Gas6의 형질감염체의 배양 상청액을 1:20으로 희석하여 처리한 실험군에서 인터페론-감마의 생성량이 증가함을 관찰하였다. 실험군에서 아무것도 처리를 하지 않은 군에서 보다 Gas6 항체(500ng/ml), Axl-Ig (500ng/ml), 워퍼린 (500ng/ml)를 처리한 군에서 인터페론-감마의 생성량이 감소하는 것을 관찰하여 Gas6 의 시그날은 Axl에 의해 전달되어 자연살해세포의 활성에 관여함을 확인하였다(도 21).
실시예 10. Gas6 가 전구자연살해세포의 증식에 미치는 영향
기질세포를 1x104으로 96웰 마이크로 배양용기에 평판하고 하루 지난 후에 실시예 1(B)에서 얻은 전구자연살해세포를 웰당 2.5x 104 세포가 되도록 분주하였다. 인터루킨-15(25ng/ml)를 모두 포함한 상태에서 Axl-Ig와 Gas6 항체(a-Gas6)를 각각 500ng/ml 처리한 후 실시예 8에서 얻은 Gas6의 배양상청액을 첨가하여 48시간 후에 전구자연살해세포의 증식 정도를 실시예 4와 동일한 방법의 MTS 검증를 통해 분석하였다. 벡터만을 형질 감염시킨 세포의 배양상청액을 처리한 대조군에 비해 Gas6가 과발현된 형질 감염세포의 배양상청액을 처리한 실험군에서 전구자연살해세포 증식이 증가함을 관찰하였고 Axl-Ig와 Gas6 항체에 의해 전구자연살해세포 증식이 감소하는 것을 보아 Axl과 Gas6 의 상호작용에 의해 전구자연살해세포 증식이 유도됨을 확인하였다(도 22).
실시예 11. 마우스 Axl 발현시스템 구축
Axl이 높게 발현되는 마우스 RAW264.7 대식세포주로부터 분리한 전체 RNA와 Axl 프라이머 (배열(sense); 5'-ggtgcccatcaacttcggaa, 역배열(antisense); 5'-ggatgtcccaggtggaagatt)로 실시예 1(C)와 동일한 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 2,750 bp의 마우스 Axl cDNA(100ng)를 제한효소 EcoRI(1U)으로 처리한 pCR4-TOPO(50ng)의 에 클로닝 하였다(도 23). 또한 레트로바이러스 벡터 pLXSN을 EcoRI(1U)과 CIP 효소(1U)를 처리한 후 pCR4-Axl #4에 EcoR I 제한효소를 처리하여 분리한 Axl cDNA(100ng)를 첨가하고 T4 DNA 연결효소(1U)로 연결하여 재조합된 pLXSN-Axl을 제조하였다. 레트로바이러스 벡터에서 Gas6 cDNA의 프로모터에 대한 방향은 클로닝부위의 하위에 있는 프라이머와 Axl의 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응과 염기서열 분석으로 확인하고 프로모터에 정방향과 역방향의 클론을 각각 pLXSN-Axl/F, pLXSN-Axl/R이라 명명하였다.
실시예 12. 마우스 Axl - IgG 융합단백질 (fusion protein) 제조
Gas6 발현 레트로바이러스 제조와 동일한 방법으로 PT67 세포주에 형질감염하고 Axl-IgG 융합단백질 발현 세포주를 제조하기 위해, 마우스 IgG1 Fc (constant fragment) 부위의 5'에 BamHI과 3'에 Xho I 링커를 첨가하여 실시예 1(C)과 동일한 방법으로 중합효소 연쇄반응으로 증폭하고 pCR4-TOPO에 클로닝(pCR4-Fc) 하였다. 또한 Axl 유전자의 세포 밖 도메인(extracellular domain, ECD)의 3'에 BamHI 링커를 첨가하여 증폭한 후 pCR4-TOPO에 클로닝(pCR4-Axl/ECD) 하였다. 그리고 pCR4-Fc에 Xho I(1U)과 BamHI(1U, Roche)을 처리하여 약 820 bp Fc 부분을 분리하였으며 pCR4-Axl/ECD에 EcoRI(1U)과 BamHI(1U)을 처리하여 약 1350 bp Axl/ ECD(100ng)를 pcDNA3.1(50ng) EcoRI-XhoI 사이트에 Fc와 Axl/ECD 절편을 클로닝하고 BamHI(1U), BamHI(1U)/XhoI(1U) 제한효소로 DNA 클론들을 제작하였다(도 24). 최종적으로 pcDNA3.1/Axl-Fc 플라스미드를 293T 세포에 형질감염하여 G418 함유배지에서 형질감염체를 선별하고 제한 희석법으로 Axl-IgG 융합단백질을 과량으로 발현하는 클론을 얻었다.
실시예 13. 마우스 Axl - IgG 융합단백질이 자연살해세포의 분화에 미치는 효과
Axl의 시그날전달을 차단했을 때 자연살해세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해, 분화시킨 전구자연살해세포를 7일 동안 기질세포(2x104)와 공동배양하는 동안 인터루킨-15(25ng/ml)와 Axl-Ig을 처리 한 후 전구자연살해세포가 성숙자연살해세포로 분화되는 정도를 NK1.1과 NKG2A/C/E, Ly49G2 항체로 염색한 후 FACS 분석하였다. 그 결과, Axl과 그 리간드인 Gas6의 작용을 Axl-Ig로 차단시, 성숙자연살해세포의 마커인 NK1.1와 NKG2A/C/E, Ly49G2의 양성인 세포가 감소함으로써 Axl-Gas6 작용이 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 관찰하였다(도 25).
실시예 14. Axl 발현 억제에 의한 자연살해세포의 분화
자연살해세포에서 Axl을 제거하기 위해 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다(도 26).
(1) siRNA 제작
Axl의 기능을 가지는 부위를 선택적으로 블로킹하여 Axl 유전자의 기능을 제거하기 위하여 Axl 유전자의 표적 염기서열로써 다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. gtctcccgtacttcctgga(#1), ctcacccactg caacctgc(#2), agacctacacagtttcctc(#3) 세 가지를 선정한 후 각각의 염기서열이 sense 프라이머로써 5'사이트에 aaag 돌출(overhangs)염기서열을 포함한 프라이머와 그것에 상보적인 염기서열인 antisense 프라이머에 aaaa를 5'사이트에 첨부하여 올리고머를 제작하였다. 이들 각각의 올리고머를 95℃에서 가열냉각(annealing) 하여 더블 가닥으로 준비하고 더블 프로모터 pFIV-H1/U6 siRNA-GFP 발현벡터는 BbsI(Roche)으로 분해한 후 정제하여 클로닝 하였다(도 27). 클로닝 수행 후 형질전환 하여 얻은 클론 중에서 siRNA를 포함하고 있는 클론들을 찾기 위해, U6 중합효소 연쇄반응 프라이머와 anti-sense siRNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여, siRNA가 포함되어 있는 클론에서 약 100bp에서 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하였다(도 28).
(2) 렌티바이러스 siRNA 발현시스템 확립
자연살해세포에 감염될 수 있는 렌티바이러스를 만들기 위하여 siRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터와 헬퍼 벡터인 VSVG, RSV-REV, pMDL g/pRRE을 사용하였다. 바이러스 구조물을 형성시켜 줄 수 있는 세포주인 293T 세포(ATCC)를 10cm2 배양접시에 약 5x105 cell을 가하고 약 24시간 후에 위에 준비한 벡터들을 각각 1.5㎍씩 리포펙타민을 이용하여 형질감염 한 후 약 4시간 후에 새로운 DMEM 배지로 갈아 주고 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 약 48시간 후에 배지를 3000rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포 잔해물을 제거 한 후 배양 상청액을 Millex-HV 0.45um PVDF 여과기로 여과하여 보관하였다. 이렇게 얻은 배양 상청액에서 바이러스 생산을 확인하기 위해서, 293T 세포를 1x105 세포씩 6 웰 배양용기에 가한 후 24시간이 지나면 바이러스 입자를 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DEME 배지와 1:1로 섞어서 293T 세포에 처리하였다. 이때 세포막에 바이러스 캡시드(capsid)가 결합하는 정도를 증가시켜 주기 위해서 polybrene을 8㎍/ml 농도로 첨가시켜 주었다. 바이러스에 24시간 동안 감염시킨 후 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM 배지로 갈아 준 후 다시 48동안 배양하여 형광 현미경과 실시예 1(B)에서 실시한 FACS분석을 하였다. 이를 통해 GFP가 표지 되어 있는 pFIV 발현 벡터가 효율적으로 형질도입(transduction)되었음을 확인하였다(도 29).
(3) 조혈모세포로부터 자연살해세포로의 분화과정 중에 렌티바이러스 감염
마우스의 골수세포로부터 조혈모세포를 분리하여 약 1x106 세포당 바이러스 입자를 첨가하고 24시간동안 감염시켜 인터루킨-7(0.5ng/ml), FLT3L(50ng/ml), SCF(30ng/ml)를 첨가한 배지로 약 6일간 배양한 후 전구자연살해세포를 수확하여 실시예 1(B)에서 실시한 FACS 분석을 통해 형질도입의 유무를 확인한 결과, 렌티바이러스가 잘 감염되어 GFP 발현이 증가되었고 Axl 억제에 의한 자연살해세포의 분화도 억제되는 것으로 나타났다 (도 30, 도 31).
실시예 15. 동물 암 모델에서 자연살해세포에 의한 암형성 억제능 규명
동물 암 모델을 확립하기 위해서, C57BL/6 유래의 암세포인 B16F10 흑색종 세포를 7-8주령의 C57BL/6 마우스에 5x104 수로 정맥 주사한 다음날, 대조군 항체(1㎍/ml) 와 사람 인터루킨-2(10ng/ml, Sigma) 또는 Axl 폴리클로날 항체(1㎍/ml)와 인터루킨-2(10ng/ml)를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 각각 1x106 수로 정맥주사하고 2주 후 폐에서 이들 B16F10 흑색종 세포의 수를 측정하여 전이능 및 항암효과를 분석하였다. 그 결과, Axl 폴리클로날 항체로 자극된 성숙자연살해세포를 주사한 폐 조직에서 관찰된 암세포의 콜로니수는 대조군 항체로 처리된 성숙자연살해세포를 주사한 마우스에 비해 감소(약 4-10배) 되었으나 Axl-Ig를 처리한 성숙자연살해세포를 주사한 폐 조직에서 콜로니 수는 현저하게 증가하여 Axl이 자연살해세포를 활성화시켜 암세포의 형성뿐만 아니라 전이능도 조절할 수 있음을 확인하였다(도 32).
실시예 16. 동물 암 모델에서 자연살해세포에 의한 암세포 살상능 규명
자연살해세포에 의한 암세포 살상 능력을 비교하기 위해, 실시예 15의 마우스 비장으로부터 세포를 분리하여 48시간 동안 사람 인터루킨-2(10ng/ml)로 자극하고 51Cr (100uci)으로 2시간 동안 표지한 YAC-1 세포를 1:100, 1:50, 1:25의 비율로 섞어 반응시키고 4시간 후 배양상청액으로 분비된 51Cr의 양을 측정한 결과, 암대조군은 약 30% 정도의 암세포 살상 능에 비해 대조군 항체를 처리하여 분화시킨 자연살해세포를 주사한 실험군의 경우는 58%, Axl 폴리클로날 항체를 처리하여 분화시킨 자연살해세포를 처리한 실험 군은 암세포 살상능이 약 75%로 대조군에 비해 현저하게 높은 암세포 살상능을 나타냄을 확인하였다 (도 33).
실시예 17. 사람 Axl 대장균 발현 벡터 제조
실시예 1 (C)과 동일한 방법으로 Axl이 발현되는 세포주 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, ATCC)로부터 전체 RNA 를 분리하고 Axl 프라이머(sense; 5'-cca tat gga aag tcc ctt cgt ggg caa c, antisense; 5'-cct cga gca cca gct ggt gga ctg gct g)를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 신호전달 시퀀스가 제거된 세포밖 도메인(Extra Cellular Domain, ECD)에 해당하는 hAxl cDNA 절편을 증폭하여 1214 bp의 cDNA를 얻었다. Axl cDNA(100ng) 절편이 C-말단에 (his)6가 표적 되도록 pET29a(50ng)의 제한효소 NdeI(1U, Roche)과 XhoI(1U)사이트에 T4 DNA 연결효소 (1U)를 이용하여 클로닝 하였다. 여기서 얻어진 클론은 pET-hAxl/ECD이라 명명하였다 (도 34).
실시예 18. 사람 Axl 항원 제조
Axl-(his)6 단백질을 발현시키기 위해 이콜라이(E. coli) BL21(DE3)에 pGEX-4T-3-Axl/F, pGEX-4T-3-Axl/R을 각각 형질전환(transformation) 하였다. 여기서 얻은 형질전환 된 콜로니를 박테리아 항생제(kanamycin)가 포함된 배양액(LB broth, Gibco)에 접종한 후 0.5mM IPTG(Sigma)를 첨가하여 25℃ 배양기에서 4 시간 배양하였다. 부유 상태에 있는 박테리아를 6,000rpm에서 10분 동안 원심분리 한 후 박테리아를 회수 하여 1X PBS로 현탁하였다. 이것을 아이스에 방치한 후 초음파기(Sonicator)를 이용해 박테리아를 완전히 분해시킨 후 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리아 잔해물로부터 상층액을 분리하였다. 박테리아 용해물(상층액)에 존재하는 수용성 및 불용성 hAxl/ECD로부터 융합단백질을 정제하기 위해서 박테리아 용해물을 HiTrapTM chelating HP(Amersham pharmacia) 를 이용해 Axl-(his)6 융합 단백질을 확보하였다.
실시예 19. 사람 Axl 단백질 특이적 폴리클로날 항체의 제조
사람 재조합 Axl 항원을 이콜라이(E. coli)로부터 획득한 후에 항 토끼 사람 Axl을 얻기 위한 항원으로 사용하였다. 항원 특이적 폴리클로날 항체를 생성하기 위하여 1mg/ml 농도로 인산완충용액 중에 용해된 정제된 사람 Axl 단백질 300㎍를 동량의 프로인트 면역보강제(complete Freund's adjuvant)로 유화시킨 후 10주 된 토끼에게 1차 면역주사 하였다. 1차 접종 후 1차와 동량 항원이 프로인트 면역보강제(incomplete Freund's adjuvant)와 유화된 것을 2주, 1주, 1주 간격으로 2, 3, 4 차 근육주사 하였다. 4번째 근육주사 한 7일 후 심장천공법으로 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 상온에서 30분 그리고 4℃에서 하룻밤동안 방치하여 완전 응고시킨 후 2,500rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취함으로써 혈청을 얻었다. 혈청을 1X PBS로 5배 희석하여 단백질 A 컬럼에서 정제 하였다.
실시예 20. 사람 Axl 특이적 모노클로날 항체의 제조
정제된 사람 Axl 25㎍/100㎕을 동일한 양의 프로인트 면역보강제로 유화시킨 후 생후 6-8주된 BALB/c 마우스에게 2주 간격으로 3회 복강내에 주입하였다. 마지막 주입 후 항 Axl에 대한 항체의 생성을 일라이저 분석법으로 확인하고 2주 후에 25㎍의 사람 Axl로 마지막으로 면역시킨 다음 5일 후 마우스로부터 비장세포를 추출하고 Sp2/0 골수종 세포와 10:1 비율로 혼합하여 이 혼합액을 50% 폴리에틸렌글리콜 1500 용액에 3분 동안 방치시켜 세포융합을 실시하였다. 이것을 1,200rpm에서 8분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 얻은 후 10% 우태아 혈청을 함유한 HAT RPMI-1640 배지에 ml당 3.5× 106 세포가 되도록 부유시켜 96-웰 배양용기에 웰당 0.1ml씩 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 3일 후 10% 우태아 혈청 함유 HAT RPMI-1640 배지를 웰당 0.1ml씩 첨가하고 4일 마다 배지의 반 정도를 신선한 배지로 갈아주었다. 배양된 배양액에 대한 일라이저를 수행하고 항체 역가 높은 웰의 세포를 수거하여 제한희석법으로 배양하였다. 배양액에 0.5 세포/ 웰 / 96 웰 배양용기로 준비하여 일라이저를 수행하여 항원 특이적이고 활성도(activity)가 높은 하이브리도마를 선별하였다. HAT 선택 배양 후 하이브리도마 세포의 항체 생산 여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. 즉, 상기에서 면역에 사용했던 사람 Axl을 0.01 M 카보네이트 바이카보네이트(carbonate-bicarbonate) 완충액(pH 9.6)에 0.1㎍/ml로 희석하여 웰마다 50㎕씩 넣고 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 그 다음에 PBST(phosphate buffer saline, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, 0.15 % Tween 20)로 4회 세척하고, 0.1% 알부민으로 37℃에서 30분 동안 블로킹시켰다. 세포의 배양 상등액은 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후에 PBST로 4회 세척하였다. 바이오틴이 붙어있는 2차 항체인 항 마우스 면역글로불린 항체를 1㎍/ml이 되도록 0.1% BSA-PBST로 희석한 후에 웰마다 50㎕씩 넣고 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 다시, PBST로 4회 세척한 후에 스트렙트아비딘-퍼옥시다아제(Streptavidin- Horseradish Peroxidase)를 0.1% BSA-PBST로 1000배 희석하여 웰마다 50㎕씩 넣고 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후에 다시 PBST로 4회 세척하였다. 효소반응을 위한 기질로는 티엠비(Tetra-Methylbenzidine, TMB)용액을 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 반응시킨 후에 2N-황산으로 반응을 정지시키고 450nm 파장에서 일라이저 판독기로 흡광도를 측정하였다. 항 사람 Axl 항체의 생성여부를 확인하여 양성을 보이는 웰에서 얻은 세포들은 제한희석법으로 웰당 0.3 세포가 되도록 3회 전클로닝(subcloning)하여 배양함으로써 모노클로날화하여 항 사람 Axl 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다. 하이브리도마의 배양 상청액으로부터 항 사람 Axl 모노클로날 항체를 얻기 위해 GC 컬럼을 이용하여 항체를 분리하고 투석하여 항 사람 Axl 모노클로날 항체를 얻었다.
실시예 21. 사람 Gas6 발현 벡터 제조
실시예 1(C)와 동일한 방법으로 Gas6가 발현되는 사람 세포주 HUVEC (American Type Culture collection)로부터 전체 RNA 를 분리하고 Gas6 프라이머(sense; 5'-ggcccgtggccccttcgctct, antisense; ggcctaggctgcggcgggct)를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 2041bp의 cDNA를 증폭하여 PCR 클로닝 벡터에 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 분석된 사람 Gas6 cDNA를 EcoRI(1U)으로 절단하여 분리하였다. pcDNA3.1 벡터를 EcoRI 제한효소(1U)를 처리하여 사람 Gas6 cDNA(100ng)를 pcDNA3.1 벡터(50ng)에 T4 DNA 연결효소(1U)를 이용하여 클로닝하여 사람 Gas6 발현 벡터 pchGas6를 제조하였다(도 35).
실시예 22. 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의 제조
감마-카르복실화된 사람 Gas6를 얻기 위해 사람 Gas6 발현 벡터 pchGas6를 사람 293(ATCC)세포에 lipfectamine 시약(Invitrogen, Carlslbad, CA)를 이용하여 형질감염하고 0.75mg/ml G418(Gibco) 항생제 함유배지에서 형질감염체 들을 각각 선별한 후 제한 분석법으로 사람 Gas6 유전자를 과잉으로 발현하는 클론들을 확보하였다. 사람 Gas6가 형질전환된 293 세포는 배양상청액으로 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 과량 분비하게 되는데 이를 실시예 8에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 사람 Gas6 유전자를 과잉으로 발현하는 클론임을 확인하였다. 사람 자연살해세포의 분화 유도에 사람 Gas6가 형질전환된 293 세포의 배양상청액을 1:20으로 희석 사용하여 이 배양상청액에 포함되어 있는 감마-카르복실화된 사람 Gas6의 기능을 확인하였다.
실시예 23. Axl 폴리클로날 항체(Santa cruz)를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포 로부터 성숙자연살해세포의 분화
(A) 사람 제대혈 유래 조혈모세포로부터 자연살해세포의 분화
제대혈로부터 다음의 방법을 이용하여 조혈모세포를 분리하였다. 50ml 튜브에 사람 제대혈을 25ml씩 나눠 담은 후(1팩=100ml) 1X PBS를 동량(25ml) 넣어주고 천천히 혼합하였다. 새 50ml 튜브에 Picoll을 20ml씩 나눠 담은 후 사람 제대혈과 1XPBS를 1:1로 섞은 것을 층이 훼손되지 않도록 부어 50ml까지 채웠다. 2000rpm, 25℃로 20분간 원심분리(브레이크를 푼 상태)하였다. 원심분리가 끝나고 나면 맨 위층인 노란색의 상층(혈청) 부분과 밑의 맑은 부분 사이에 있는 하얗게 보이는 층(세포층=약10ml)만 따로 얻어내서 1XPBS 20ml이 들어있는 50ml 튜브로 옮긴 후 2000rpm, 25℃에서 10분간 원심분리 하였다. 밑에 가라앉은 펠릿(Pellet)이 확인되면 상등액을 버리고 펠릿을 손으로 두드려 풀어준 다음, ACK 완충용액(0.15 M NH4Cl, 1mM KHCO3, 0.1 mM EDTA(disodium salt), pH 7.2)을 10ml 정도 넣어 섞은 후 37℃에 10분간 방치하였다. 2500rpm에서 4℃, 10분간 원심분리한 후에 상등액을 버리고 튜브를 손으로 쳐서 펠릿을 풀어 주었다. MACS 완충용액(2mM EDTA와 0.5% BSA를 1XPBS에 녹인 다음 여과함)을 약 2ml을 넣어서 피펫으로 부유시켜 새로운 50ml 튜브에 얹어진 여과기에 거른 후 세포가 담겨있던 튜브에 다시 MACS 완충용액을 10ml정도 넣어서 세척하고 여과기에 거르는 작업을 반복하여 50ml을 채웠다.
얻어진 50ml 튜브 안에 담겨진 세포를 세포수 측정기(HEMOCYTOMETER, MARIENFELD)를 이용하여 세포수 측정을 하였다. 2000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리 한 다음 세포수를 측정해서 얻은 결과와 비교하여 1X108을 한 번의 반응으로 계산해서 반응 수에 맞게 MACS 완충용액을 1ml씩 넣고 펠릿을 풀어준 뒤 반응 수에 맞게 준비된 1.5 ml 튜브에 나눠 담았다. 1700rpm, 3분씩 원심분리한 뒤 상등액을 버리고 완충용액 이용해 펠릿을 풀어주는 방법으로 펠릿을 씻어주는 것을 3번 반복하였다. 마지막엔 500㎕ MACS 완충용액를 넣어주고 펠릿을 풀어준 다음 각 1.5ml 튜브 별로 CD34+ micro bead-25㎕와 블로킹 시약-25㎕를 각각 넣고 섞어주었다. 4℃에서 30분간 반응한 후 튜브를 위아래로 5분마다 10회 뒤집어 주었다. 30분이 지나면 1700rpm으로 3분간 원심분리하고 상등액을 버리는 세척을 3번 반복하고 마지막에 MACS 완충용액 500㎕ 넣어준 후 펠릿을 풀어주었다. MACS 컬럼을 MACS에 설치한 후 MACS 완충용액 3ml로 세척해 주었다. 완충용액이 완전히 다 내려가기 전에 펠릿을 풀어준 것을 조심스럽게 부어주고 펠릿이 다 내려갔으면 다시 MACS 완충용액을 5ml 내려주고 다시 MACS 완충용액 2ml을 컬럼에 넣어 다시 걷어내었다.
컬럼을 MACS에서 분리해 낸 다음, MACS 완충용액 5ml을 넣어주고 피스톤으로 15ml 튜브에 밀어내고 한 번 더 MACS 완충용액 5ml 넣어주고 밀어낸 다음 얻어낸 것을 세포수 측정을 해서 24 웰 배양용기에 조혈모세포 배양액(사람 SCF-30ng/ml(Pepro Tech), 사람 FLT3L50ng/ml(Pepro Tech), 사람 인터루킨-7 10ng/ml,(Pepro Tech)) 1ml에 웰당 1X106 세포/ml 씩 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 분리한 사람 조혈모세포로부터 전구자연살해세포로 분화시키기 위해 분리된 CD34+세포를 사람 SCF(30ng/ml), Flt-3L(50ng/ml), 인터루킨-7(10ng/ml)를 함유한 Myelocult H5100 (Gibco) 배지에 1x106/ml의 농도로 현탁시켜 24 웰 배양용기에 배양하였다. 3일마다 절반의 배지를 신선한 배지로 바꾸어 주면서 계대배양 하였다. 이 세포들을 14일간 배양하여 사람 전구자연살해세포를 얻었다. 사람 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로 분화시키기 위해 배양 14일 후 생성된 전구자연살해세포를 사람 인터루킨-15(20ng/ml, Pepro Tech)를 함유하는 MyeloCult 배지(Gibco)에 제대혈로부터 분리한 기질세포(분리방법: 제대혈에서 조혈모세포 분리 후 CD34-한 세포를 10%RPMI 배지에 평판하여 2 시간동안 5%(CO2) 배양기에서 배양하였다. 배양액에 떠있는 세포만을 10%RPMI 배지를 이용하여 새로운 배양용기에 평판하였다. 4일, 7일 후 배양액을 교체한 후 8일째 되는 날 배지를 제거하고 1XPBS 3ml을 넣고배양기에서 5분간 방치하였다. 트립신-EDTA 1ml을 1분간 처리 한 후 10% RPMI 배지를 이용하여 세포를 세척하였다. 원심분리를 하여 세포를 모은 후 기질세포를 24 웰 당 4×104씩 평판하였다)와 공동배양 하여 성숙자연살해세포를 획득하였다.
(B) 기질세포 없이 사람 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화
(A)와 동일한 조건에서 사람 기질세포를 사용하지 않고 사람 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로 분화시켜 CD56(Pharmingen)을 포함한 성숙자연살해세포 표면분자들의 발현을 실시예 1(B)와 동일한 방법으로 FACS 분석해 본 결과 이들의 발현 정도가 사람 기질세포를 공동배양하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때보다 현저히 낮음을 확인하였다. 이를 통해서 사람 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화유도에 사람 기질세포가 반드시 필요함을 확인하였다.
(C) Axl 폴리클로날 항체(Santa cruz)를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 (A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 Axl 폴리클로날 항체 1㎍/ml(Santa Cruz)을 첨가하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A(Pharmingen), CD161(Pharmingen), NKP46(Pharmingen), NKP30(Pharmingen), NKP44 (Pharmingen), NKG20(Pharmingen) 그리고 CD56 (Pharmingen)을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 염소항체를 처리한 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다(도 36).
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 항체(Santa Cruz)를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 1:1의 비율로 1㎍/ml 량으로 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 항체를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 24. 사람 Axl 폴리클로날 항체를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포 로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 23(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 23(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 19에서 얻은 사람 Axl 폴리클로날 항체 1㎍/ml를 첨가하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 염소항체를 처리한 대조군에 비해 사람 Axl 폴리클로날 항체를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체를 인터루킨-15 (Pepro Tech)와 함께 1:1의 비율로 1㎍/ml 량으로 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 25. 사람 Axl 모노클로날 항체를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포 로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 23(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 23(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 20에서 얻은 사람 Axl 모노클로날 항체 1㎍/ml를 첨가하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 염소항체를 처리한 대조군에 비해 사람 Axl 모노클로날 항체를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 모노클로날 항체를 인터루킨-15 (Pepro Tech)와 함께 1:1의 비율로 1㎍/ml 량으로 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 모노클로날 항체를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 26. 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 23(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 23(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 22에서 얻은 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석 처리하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 벡터만 형질감염시킨 배양상청액을 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다. 사람 Axl 폴리클로날 항체 또는 Axl 모노클로날 항체를 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 27. Axl 폴리클로날 항체( Santa Cruz )와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 23(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 23(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz) 1㎍/ml과 실시예 22에서 얻은 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석하여 동시에 처리하였다. 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 사람 Gas6를 형질감염시킨 배양상청액만 처리한 대조군과 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)만 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6와 Axl 폴리클로날 항체를 동시에 처리하였을 경우 약간 증가된 분화율을 보였다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15 (Pepro Tech)와 함께 처리(항체와 1:1비율)하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 28. 사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 23(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 23(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 19에서 얻은 Axl 폴리클로날 항체 1㎍/ml과 실시예 22에서 얻은 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석하여 동시에 처리하였다. 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 사람 Gas6를 형질감염시킨 배양상청액만 처리한 대조군과 Axl 폴리클로날 항체만 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6와 Axl 폴리클로날 항체를 동시에 처리하였을 경우 약간 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 동시에 처리하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 처리(항체와 1:1비율)하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 29. 사람 Axl 모노클로날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 제대혈 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 23(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 23(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 20에서 얻은 Axl 모노클로날 항체 1㎍/ml과 실시예 22에서 얻은 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석하여 동시에 처리하였다. 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 사람 Gas6를 형질감염시킨 배양상청액만 처리한 대조군과 Axl 모노클로날 항체만 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6와 Axl 모노클로날 항체를 동시에 처리하였을 경우 약간 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 동시에 처리하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 처리(항체와 1:1비율)하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 30. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포 에서 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)에 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 5주령의 수컷 누드마우스(Nude Balb/c mouse, 면역기능이 결핍된 유전자변형 마우스, 오리엔트 바이오)를 이용하여 항암 활성을 측정해 보았다. 누드마우스는 무균시설이 갖추어진 동물실에서 동물 관리 지침에 따라 관리하였다. 사람 유래의 암세포(위암세포,KCLB no.00638; 자궁암세포,KCLB no.10002; 유방암세포, KCLB no.30022; 신장암 세포, KCLB no.30044; 흑색종 암세포, KCLB no.30068; 폐암 세포, KCLB no.30053; 난소암 세포, KCLB no.30077;를 포함한 여러 종류)를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 1640 세포 배양액(Gibco) 을 이용하여 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 배양한 암세포를 1XPBS로 세척한 후 트립신-EDTA(Gibco)를 처리하여 암세포를 회수하였다. 세포로부터 트립신-EDTA를 제거하고 1XPBS로 세포를 부유시켜 108 세포/0.1㎕이 되도록 세포수를 측정하여 준비하였다. 108 개의 암세포를 누드마우스의 피하에 인슐린 주사기(Pharmingen)를 이용해 주입하고 직경 약 0.8mm가 될 때까지 1주 정도 암세포를 키웠다. 형성된 암 조직에 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포(1x106)를 사람 인터루킨-2(10ng/ml)로 활성화시킨 다음 암조직에 주입하였다. 시간 별로 암조직의 부피를 측정하여 관찰한 결과 염소항체를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다.
실시예 31. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포 에서 사람 Axl 폴리클 로날 항체에 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 폴리클로날 항체를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 염소항체를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 사람 Axl 폴리클로날 항체를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 32. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포 에서 사람 Axl 모노클로날 항체에 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 모노클로날 항체를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 염소항체를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 사람 Axl 모노클로날 항체를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 33. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포에서 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 벡터를 형질감염시킨 배양상청액을 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다. Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 34. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포 에서 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)만 처리하여 분화시킨 대조군과 감마-카르복실화된 사람 Gas6만 처리하여 분화시킨 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 동시에 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 감소율이 약간 증가하는 것을 관찰하였다.
실시예 35. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포 에서 사람 Axl 폴리클 로 날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 사람 Axl 폴리클로날 항체만 처리하여 분화시킨 대조군과 감마-카르복실화된 사람 Gas6만 처리하여 분화시킨 대조군에 비해 사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 동시에 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 감소율이 약간 증가하는 것을 관찰하였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 사용하여 얻은 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 36. 동물 암 모델에서 사람 제대혈 유래 조혈모세포 에서 사람 Axl 모노클로 날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 사람 Axl 모노클로날 항체만 처리하여 분화시킨 대조군과 감마-카르복실화된 사람 Gas6만 처리하여 분화시킨 대조군에 비해 사람 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 동시에 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 감소율이 약간 증가하는 것을 관찰하였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 사용하여 얻은 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 37. Axl 폴리클로날 항체(Santa cruz)를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포 로부터 성숙자연살해세포의 분화
(A) 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 자연살해세포의 분화
사람 골수로부터 조혈모세포의 분리하기 위하여 50ml 튜브에 사람 골수를 25ml씩 나눠 담은 후 실시예 23(A)와 동일한 방법으로 조혈모세포와 전구자연살해세포를 분리하여 성숙자연살해세포로의 분화시켰다. 여기서 사용한 사람 기질세포는 사람 골수에서 분리하였고 골수에서 기질세포 분리 방법은 실시예 23(A)의 제대혈에서 기질세포 분리 방법과 동일한 방법을 이용하였다.
(B) Axl 폴리클로날 항체(Santa cruz)를 이용한 성숙자연살해세포의 분화
(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 (A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 Axl 폴리클로날 항체 1㎍/ml(Santa Cruz)을 첨가하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1 (B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 염소항체를 처리한 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다(도 36).
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 1:1의 비율로 1㎍/ml 량으로 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 38. 사람 Axl 폴리클로날 항체를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 37(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 37(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 19에서 얻은 Axl 폴리클로날 항체 1㎍/ml를 첨가하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 염소항체를 처리한 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체를 인터루킨-15 (Pepro Tech)와 함께 1:1의 비율로 1㎍/ml 량으로 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 39. 사람 Axl 모노클로날 항체를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포세포의 분화
실시예 37(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 37(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 20에서 얻은 사람 Axl 모노클로날 항체 1㎍/ml를 첨가하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 염소항체를 처리한 대조군에 비해 사람 Axl 모노클로날 항체를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 모노클로날 항체를 인터루킨-15 (Pepro Tech)와 함께 1:1의 비율로 1㎍/ml 량으로 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 모노클로날 항체를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 40. 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 37(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 37(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 22에서 얻은 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석 처리하여 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 벡터만 형질감염시킨 배양상청액을 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리하였을 경우 약 2~3배 증가된 분화율을 보였다. 사람 Axl 폴리클로날 항체 또는 Axl 모노클로날 항체를 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15 (Pepro Tech)와 함께 처리하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 41. Axl 폴리클로날 항체( Santa Cruz )와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 37(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 37(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz) 1㎍/ml과 실시예 22에서 얻은 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석하여 동시에 처리하였다. 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 사람 Gas6를 형질감염시킨 배양상청액만 처리한 대조군과 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)만 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6와 Axl 폴리클로날 항체를 동시에 처리하였을 경우 약간 증가된 분화율을 보였다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 처리(항체와 1:1비율)하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 42. 사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 37(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 37(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 19에서 얻은 Axl 폴리클로날 항체 1㎍/ml과 실시예 23에서 얻은 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석하여 동시에 처리하였다. 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1 (B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 사람 Gas6를 형질감염시킨 배양상청액만 처리한 대조군과 Axl 폴리클로날 항체만 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6와 사람 Axl 폴리클로날 항체를 동시에 처리하였을 경우 약간 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 동시에 처리하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 처리(항체와 1:1비율)하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 43. 사람 Axl 모노클로날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 를 이용한 사람 골수 유래 조혈모세포로부터 성숙자연살해세포의 분화
실시예 37(A)에서 얻은 전구자연살해세포를 실시예 37(A)와 동일 조건에 인터루킨-15를 처리하는 대신 실시예 20에서 얻은 사람 Axl 모노클로날 항체 1㎍/ml과 실시예 22에서 얻은 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 1:20으로 희석하여 동시에 처리하였다. 14일 동안 분화시킨 후 사람 성숙자연살해세포를 실시예 1(B)과 같은 방법으로 FACS 분석하여 그 분화 정도를 확인하였다. 사람에 대한 성숙자연살해세포 마커로는 NKG2A, CD161, NKP46, NKP30, NKP44, NKG20 그리고 CD56을 사용하였다. CD56+NKG2A+ , CD56+CD161+ , CD56+NKP46+ , CD56+NKP30+ , CD56+NKP44+ 그리고 CD56+NKG20+한 세포들은 사람 Gas6를 형질감염시킨 배양상청액만 처리한 대조군과 Axl 모노클로날 항체만 처리한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6와 사람 Axl 모노클로날 항체를 동시에 처리하였을 경우 약간 증가된 분화율을 보였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 사용하여 성숙자연살해세포를 분화시켰을 때와 비슷한 결과를 얻었다.
추가로, 동일조건하에 전구자연살해세포를 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 인터루킨-15(Pepro Tech)와 함께 처리(항체와 1:1비율)하여 분화율을 확인하였다. 그 결과 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리한 경우에 비하여 약간 증가된 분화율을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 44. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포 에서 Axl 폴리클로날 항체( Santa Cruz )에 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 염소항체를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다.
실시예 45. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포 에서 사람 Axl 폴리클로날 항체에 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 폴리클로날 항체를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 염소항체를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 사람 Axl 폴리클로날 항체를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 46. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포 에서 사람 Axl 모노클로 날 항체에 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 모노클로날 항체를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 염소항체를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 사람 Axl 모노클로날 항체를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 47. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포에서 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 벡터를 형질감염시킨 배양상청액을 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 대조군에 비해 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 현저한 감소가 관찰되었다. Axl 폴리클로날 항체를 사용하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 48. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포 에서 Axl 폴리클로날 항체( Santa Cruz )와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)만 처리하여 분화시킨 대조군과 감마-카르복실화된 사람 Gas6만 처리하여 분화시킨 대조군에 비해 Axl 폴리클로날 항체(Santa Cruz)와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 동시에 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 감소율이 약간 증가하는 것을 관찰하였다.
실시예 49. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포에서 사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 사람 Axl 폴리클로날 항체만 처리하여 분화시킨 대조군과 감마-카르복실화된 사람 Gas6만 처리하여 분화시킨 대조군에 비해 사람 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 동시에 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 감소율이 약간 증가하는 것을 관찰하였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 사용하여 얻은 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
실시예 50. 동물 암 모델에서 사람 골수 유래 조혈모세포에서 사람 Axl 모노클로날 항체와 감마- 카르복실화된 사람 Gas6 의해 분화 유도된 성숙자연살해세포에 의한 항암 활성 규명
사람 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 이용하여 분화시킨 사람 성숙자연살해세포에 의해 사람 암세포가 사멸되는지 관찰해 보기 위해 실시예 30과 동일한 방법으로 실험한 결과 사람 Axl 모노클로날 항체만 처리하여 분화시킨 대조군과 감마-카르복실화된 사람 Gas6만 처리하여 분화시킨 대조군에 비해 사람 Axl 모노클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 동시에 처리하여 분화시킨 성숙자연살해세포를 주입한 군에서 암조직 부피의 감소율이 약간 증가하는 것을 관찰하였다. 구입한 Axl 폴리클로날 항체와 감마-카르복실화된 사람 Gas6를 형질감염하여 얻은 배양상청액을 사용하여 얻은 성숙자연살해세포를 사용하였을 때와 암조직 부피의 감소에 있어서 비슷한 결과를 얻었다.
임상
원격 전이된 대장암 환자 2명, 폐전이로 재발된 유방암 환자 1명, 비호지킨 림프종 환자 1명 및 급성 림프성 백혈병 환자를 대상으로 하여, 각 환자는 개별적인 적절한 프로토콜에 따라 화학요법을 받은 후 10일째 과립구-콜로니 자극 인자를 600-900ug/d의 피하 용량으로 주사를 맞았다. 백혈구(WBC)가 회복되면 (>1x109/혈액 리터) 즉시 CD34+PBSC를 매일 모니터링하였다. 20x106CD34+세포/혈액 리터 일 때 채혈하였다. CD34+세포의 절대수는 FACScan 분석기 (Becton Dickinson / Aria)와 적절한 이소타입-일치된 음성 대조군을 이용하여 평가하였다. 환자로부터 채혈된 말초혈을 실시예 23에 기술된 방법에 따라 조혈모세포를 분리하고 성숙자연살해세포로 분화시킨 후 분화된 성숙자연살해세포를 인터루킨-2 (10ng/ml)로 처리하여 활성화시키고 환자에게 주사함으로써 자가 치료를 받았다. 증례의 수는 적으나, 환자 모두 종양이 축소되는 뚜렷한 치료효과를 보았다.

Claims (10)

  1. Axl 수용체 티로신 키나제(Axl Receptor tyrosine kinase, 이하 “Axl")의 리간드로서, 상기 Axl에 대한 항체, 감마-카르복실화된 Gas6(growth-arrest specific gene6) 단백질 및 단백질 S(protein S) 중 어느 하나 이상의 리간드를 함유하는 것을 특징으로 하는, 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화를 유도하는데 사용되는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 Axl에 대한 항체인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 감마-카르복실화된 Gas6 단백질인 조성물.
  4. (i) 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF(줄기세포인자) 및 Flt3L(Flt3 Ligand)로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, (ii) 전구자연살해세포를 Axl 수용체 티로신 키나제(Axl Receptor tyrosine kinase, 이하 “Axl")에 대한 항체, 감마-카르복실화된 Gas6(growth-arrest specific gene6) 단백질 및 단백질 S(protein S) 중에서 하나 이상으로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시켜 성숙자연살해세포를 수득함을 특징으로 하는, 성숙자연살해세포의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 조혈모세포가 사람의 골수, 말초혈액 및 제대혈로 이루어진 그룹중에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 것인 사람 성숙자연살해세포의 제조 방법.
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서, 전구자연살해세포를 사람 기질세포의 존재하에 상기 리간드로 처리하는 사람 성숙자연살해세포의 제조 방법.
  8. (i) 조혈모세포를 인터루킨-7, SCF(줄기세포인자) 및 Flt3L(Flt3 Ligand)로 처리하여 전구자연살해세포로 분화시키고, (ii) 전구자연살해세포를 Axl 수용체 티로신 키나제(Axl Receptor tyrosine kinase, 이하 “Axl")에 대한 항체, 감마-카르복실화된 Gas6(growth-arrest specific gene6) 단백질 및 단백질 S(protein S) 중에서 하나 이상으로 처리하여 성숙자연살해세포로 분화시켜 성숙자연살해세포를 수득하고, (iii) 분화된 성숙자연살해세포를 인터루킨-2로 처리하여 활성화시킴을 특징으로 하는, 활성화된 성숙자연살해세포의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 인터루킨-2의 처리량이 8 내지 15 ng/mg인 방법.
  10. 제8항에 따라 제조된 활성화된 성숙자연살해세포를 포함함을 특징으로 하는, 대장암, 유방암, 비호지킨 림프종 또는 급성 림프성 백혈병 치료제.
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