KR20130136968A - 안전하고 기능적인 인간화 항 베타-아밀로이드 항체 - Google Patents

안전하고 기능적인 인간화 항 베타-아밀로이드 항체 Download PDF

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Abstract

본 개시는 알츠하이머병과 같이 아밀로이드 단백질과 연관되어 있는 일군의 장애 및 이상인 아밀로이드증의 치료에서의 치료 및 진단 용도를 위한 안전하고 기능적인 인간화 항베타 항체에 관한 것이다.

Description

안전하고 기능적인 인간화 항 베타-아밀로이드 항체{SAFE AND FUNCTIONAL HUMANIZED ANTI BETA-AMYLOID ANTIBODY}
본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2010년 7월 30일자 U.S. 특허 가출원 번호 61/400,650의 우선권 혜택을 주장하는 바이다.
1. 서문
본 발명은 알츠하이머병과 같이 아밀로이드 단백질과 연관되어 있는 일군의 장애 및 이상인 아밀로이드증에 대한 안전하고 기능적인 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
2. 발명의 배경
아밀로이드증은 단일 질환의 것이 아니라, 하나 이상의 장기 또는 신체 시스템에 축적되는 아밀로이드로 지칭되는 왁스질 전분-유사 단백질의 세포외 조직 침착물을 특징으로 하는, 다양한 군의 진행성 질환 과정이다. 아밀로이드 침착물이 축적되면서, 그것은 장기 또는 신체 시스템의 정상적인 기능을 방해하기 시작한다. 15종 이상의 상이한 유형의 아밀로이드증이 존재한다. 주요 형태는 알려져 있는 전조가 없는 원발성 아밀로이드증, 일부 다른 이상에 후속하는 속발성 아밀로이드증, 및 유전성 아밀로이드증이다.
속발성 아밀로이드증은 결핵, 가족성 지중해열로 지칭되는 박테리아 감염, 골 감염 (골수염), 류마티스 관절염, 소장의 염증 (육아종 회장염), 호지킨병, 및 나병과 같은 만성의 감염 또는 염증 질환 동안 발생한다.
아밀로이드 침착물에는 아밀로이드 P (오각형) 성분 (AP), 정상적인 혈청 아밀로이드 P (SAP)와 관련된 글리코단백질, 및 술페이트화 글리코스아미노글리칸 (GAG), 결합 조직의 복합 탄수화물이 포함된다. 아밀로이드 물질의 약 90%를 차지하는 아밀로이드 단백질 원섬유는 수종의 상이한 유형의 단백질들 중 1종을 포함한다. 이들 단백질은 콩고 레드(Congo red)에 대한 결합 부위를 나타냄으로써 아밀로이드 단백질의 독특성 염색 특성을 초래하는 독특한 단백질 배열구조인 소위 "베타-병풍" 시트 원섬유로 접힐 수 있다.
많은 노화 질환들이 아밀로이드-유사 단백질을 바탕으로 하거나 그와 연관되어 있으며, 부분적으로 질환의 발병기전은 물론 진행에 기여하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 물질의 세포외 침착물의 축적을 특징으로 한다. 이러한 질환에는, 신경학적 장애 예컨대 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈 (네델란드 유형); 괌 파킨슨-치매 복합증이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아밀로이드-유사 단백질을 바탕으로 하거나 그와 연관되어 있는 다른 질환으로는 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야곱병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병(Adult Onset Diabete); 노인성 심장 아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성과 같은 안구 장애를 포함한 기타의 것들이 있다.
이러한 질환들의 발병기전이 다양할 수 있기는 하지만, 그 특유의 침착물은 종종 많은 공통된 분자 성분들을 함유하고 있다. 이는, 상당한 정도까지, 활성화된 보체 성분, 급성기 반응물들, 면역 조절인자, 및 기타 염증 매개체들의 동시적인 침착으로 이어지는 염증유발 경로의 국소적 활성화에 기인할 수 있다 (문헌 [McGeer et al ., 1994]).
알츠하이머 병 (AD)은 주로 뇌의 비정상적인 단백질 침착물의 축적물인 아밀로이드 플라크(plaque)에 의해 야기되는 것으로 생각되고 있는 신경학적 장애이다. 병에 걸린 개체의 뇌에서 발견되는 가장 흔한 유형의 아밀로이드는 주로 Aβ 원섬유로 구성된다. 과학적인 증거들은 플라크 중 베타-아밀로이드 단백질의 생성 및 축적 증가가 신경 세포 사멸로 이어지며, 그것은 AD의 발병 및 진행에 기여한다는 것을 나타내고 있다. 주요 뇌 영역에서의 신경 세포의 상실은 다시 신경전달물질의 감소 및 기억의 손상을 야기한다. 플라크 축적의 주 원인이 되는 단백질에는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 및 2종의 프레세닐린(presenilin) (프레세닐린 I 및 프레세닐린 II)이 포함된다. 상시 발현되며 대부분의 세포에서 효소 β 및 γ 세크레타제에 의해 이화되는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적인 절단은 39 내지 43개 아미노산의 Aβ 펩티드 방출로 이어진다. APP의 분해는 플라크에서 응집되는 그의 경향을 증가시킬 가능성이 있다. 특히, 해당 C-말단에 있는 2개의 매우 소수성인 아미노산 잔기로 인하여 고도의 응집체 구축 경향을 갖는 것이 Aβ(1-42) 단편이다. 따라서, Aβ(1-42) 단편은 주로 AD에서의 신경돌기 플라크 형성의 개시에 연루되어 그의 원인이 되며, 그에 따라 고도의 병리학적 가능성을 가지고 있는 것으로 여겨진다.
따라서, AD에 걸린 환자에서 아밀로이드 플라크의 형성을 예방하고/거나 기존의 플라크를 소산시키는 치료제에 대한 필요성이 존재한다. 구체적으로, 필요한 것은 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 펩티드 섬유의 응집과 연관된 플라크의 형성과 같은 질환의 생리학적 소견에 대응할 수 있는 제제이다.
베타-아밀로이드에 대한 수동 면역화가 AD에 대한 요법 치료로서 점점 더 매력적인 전략이 되고 있다. 수동 면역화의 효과성은 항-Ab 요법이 플라크 부하를 감소시키고 행동 결손을 역전시키는 것으로 나타난 AD의 트랜스제닉 동물 모델에서 입증되어 있다. Ab에 의한 능동 면역화의 위험성인 세포독성 T-세포의 압도적인 과-활성화에도 불구하고, 수동 면역화 역시 소교 세포 및 보체 활성화의 Fg 수용체-매개 과-활성화의 위험성을 가지고 있으며, 그것은 부적절한 염증유발 반응 및 혈관성 부종에 기여할 수 있다.
항-아밀로이드 베타 항체에 대해서는 예를 들면 2007년 6월 21일자 공개 WO 2007/068412; 2008년 5월 22일자 공개 WO 2008/060364; 2007년 6월 21일자 공개 WO 2007/068412; 2007년 6월 21일자 공개 WO 2007/068412; 2007년 6월 21일자 공개 WO 2007/068412; 2007년 6월 21일자 공개 WO 2007/068412; 2008년 12월 24일자 공개 WO 2008/156621; 2008년 12월 24일자 공개 WO 2008/156621; 2008년 12월 24일자 공개 WO 2008/156621에 기술되어 있다 (또한 표 2 참조).
항-베타 아밀로이드 항체를 사용한 AD와 같은 아밀로이드증을 갖는 환자의 치료 동안 관찰되는 부작용에는 염증성 부작용, 예컨대 수막염 및 수막뇌염, 그리고 뇌에서의 액체 축적 (뇌 부종)이 포함된다. 아밀로이드증과 연관된 합병증을 감소시키거나 제거하는 요법이 요구되고 있다.
3. 발명의 개요
본 발명의 신규한 조성물 및 방법은 알츠하이머병 (AD)과 같은 아밀로이드증의 수동 면역요법을 위한 더 안전한 치료적 대안을 제공한다. 본 발명은 부분적으로 효과적인 중화 능력은 물론 감소된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체가 Aβ 독성을 감소시키면서도 이전에 공지된 Aβ 모노클로날 항체 (mAb) 치료제들에 비해 유해한 부작용을 회피한다는 발견에 기초하고 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 MABT로 알려져 있는 IgG4 이소형의 인간화 항-Aβ 모노클로날 항체 (mAb)가 소교세포의 Fcγ-수용체-매개 과-할성화의 위험성을 감소시키고 보체 활성화를 회피하는 것으로 보인다는 것을 발견하였다. MABT는 시험관내 및 생체내 모두에서 다수 형태의 Aβ1-42 및 Aβ1-40에 높은 친화도로 결합하였으며, Aβ1-42 올리고머-유도 세포독성으로부터 보호되었고, 소교세포에 의한 신경독성 Aβ의 흡수를 매개하였다. 동일한 항원-결합 가변 도메인을 포함하며 Aβ에 대하여 동일한 결합력을 갖는 인간 IgG1 야생형 하위부류와 비교하였을 때, MABT는 소교세포에서 스트레스-활성화 p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK)의 활성화 감소를 나타내었으며, 더 적은 염증유발 매개체의 방출을 유도하였다.
본 발명은 또한 부분적으로는 AD에서의 항-Aβ 항체-매개 신경보호를 위한 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화의 예상하지 않았던 역할에도 기초하고 있다. p38 MAP 키나제 활성은 일반적으로 염증유발성인 것으로 생각되며, 그에 따라 AD와 같은 아밀로이드증의 병원성 염증 상태에 기여하는 것으로 생각되어져 왔다. 그러나 놀랍게도, 소교 세포에서의 중간수준 p38 MAP 키나제 활성화는 병원성 염증 상태의 생성 없이도 항-Aβ 항체-매개 신경보호에 기여한다.
본원에서 제공되는 것은 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 안전한 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물이다. 아밀로이드증에는 신경학적 장애 예컨대 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈 (네델란드 유형), 괌 파킨슨-치매 복합증은 물론, 아밀로이드-유사 단백질을 바탕으로 하거나 그와 연관되어 있는 다른 질환 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야곱병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병, 노인성 심장 아밀로이드증, 내분비 종양, 및 황반 변성, 피질 시각 결손, 녹내장, 시신경 드루젠, 시신경병증, 시신경염, 백내장, 안구 아밀로이드증 및 격자 이영양증과 같은 안구 장애를 포함한 기타의 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본원에서 제공되는 것은 소교 세포에서 p38 MAP 키나제의 중간수준 활성화를 촉발하도록 선택 또는 변형된 이펙터 영역을 갖는 항-Aβ 항체이다. 또한, 본원에서 제공되는 것은 p38 MAP 키나제가 소교 세포에서 중간 수준으로 활성화되도록 용량 및/또는 투여 요법이 선택되는, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료 및 예방 방법이다. 구체적인 실시양태에서, 안전하고 기능적인 항-Aβ 항체는 IgG4 항체의 이펙터 영역을 가진다. 소정의 더 구체적인 실시양태에서, 안전하고 기능적인 항-Aβ 항체는 IgG4 항체의 CH2 영역을 가진다. 소정의 구체적인 실시양태에서, p38 MAP 키나제 활성화의 중간 수준은 독성인 베타-아밀로이드 올리고머 단독에 의한 p38 MAP 키나제 활성화 수준은 상회하나 독성 베타-아밀로이드 올리고머와 함께인 IgG1 항-Aβ 항체에 의한 p38 MAP 키나제 활성화 수준 미만인 수준이다. 소정 실시양태에서, 항-Aβ 항체의 이펙터 영역은 그의 이펙터 기능이 감소되도록 변형된다. 소정 실시양태에서, 변형은 아미노산 치환 및/또는 결실을 초래하는 임의의 유전적 변경일 수 있다.
추가적으로 제공되는 것은 항-Aβ 항체의 안전성 향상 방법이다. 일 실시양태에서는, 해당 비-IgG4 항-Aβ 항체의 불변 영역을 IgG4 항체로부터 유래한 불변 영역으로 대체하는 것을 포함하는, 비-IgG4 항-Aβ 항체의 안전성 향상 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서는, 해당 비-IgG4 항체의 불변 영역을 비 IgG1 항체로부터 유래한 불변 영역으로 대체하는 것을 포함하는, 비-IgG4 항-Aβ 항체의 안전성 향상 방법이 제공된다. 구체적인 실시양태에서, 비-IgG4 항-베타 아밀로이드 항체의 안전성 향상 방법은 IgG1 항-Aβ 항체의 안전성을 향상시키기 위한 것이다.
또한, 본원에서 제공되는 것은 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료 및/또는 예방에 있어서의 그의 안전성 및 기능성에 대하여 항-Aβ 항체를 시험하기 위한 세포 배양-기반 검정 시스템이다. 소정 실시양태에서는, 소교 세포가 독성 베타-아밀로이드 올리고머 및 시험 항-Aβ 항체와 함께 인큐베이션된다. 소교 세포 내로의 베타 아밀로이드의 항-Aβ 항체-매개 흡수는 예컨대 베타 아밀로이드의 제거를 매개함에 있어서의 항체의 기능성을 입증한다. 소교 세포에서의 중간 수준의 항-Aβ 항체-매개 p38 MAP 키나제 활성화는 항체가 기능적이면서도 안전하다는 둘다를 표시한다. 소정 실시양태에서, p38 MAP 키나제 활성화의 중간 수준은 독성인 베타-아밀로이드 올리고머 단독에 의한 p38 MAP 키나제 활성화 수준은 상회하나, 야생형 (즉 비변형 IgG1 불변 영역)의 이펙터 기능 수준을 갖는 IgG1 항-Aβ 항체에 의한 p38 MAP 키나제 활성화 수준 미만인 수준이다. 이와 같은 세포 배양-기반 검정 시스템은 Aβ의 신경독성 효과로부터 뉴런을 보호하는 그의 능력에 대하여 항-Aβ 항체를 시험하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 세포 배양-기반 검정 시스템은 중간 수준으로 p38 MAP 키나제 활성화를 촉발하는 그의 능력에 대하여 항-Aβ 항체를 시험하는 데에 사용될 수 있다.
소정 실시양태에서, 세포 배양-기반 검정 시스템은 뉴런을 추가적으로 포함한다. 독성 베타-아밀로이드 올리고머, 시험 항-Aβ 항체, 및 소교 세포와의 공동-인큐베이션시 뉴런의 생존률은 시험 항-Aβ 항체의 기능성을 입증한다.
소정 실시양태에서, 세포 배양-기반 검정 시스템은 1차 피질 세포 배양물이다. 1차 피질 세포 배양물은 독성 베타-아밀로이드 올리고머 및 시험 항-Aβ 항체와 함께 인큐베이션된다. 소교 세포로의 베타 아밀로이드의 항-Aβ 항체-매개 흡수는 예컨대 베타 아밀로이드의 제거를 매개함에 있어서의 항체의 기능성을 표시한다. 소교 세포에서의 중간 수준의 항-Aβ 항체-매개 p38 MAP 키나제 활성화는 항체의 기능성 및 안전성 모두를 입증한다.
또한, 본원에서 제공되는 것은 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료 및/또는 예방을 위한 안전하고 기능적인 항체이다. 소정 실시양태에서는, Aβ에 결합되는 비-IgG4 인간화 항체의 가변 영역이 인간 IgG4 항체의 불변 영역과 조합된다. 다른 실시양태에서는, Aβ에 결합되는 IgG1 인간화 항체의 가변 영역이 인간 IgG4 항체의 불변 영역과 조합된다. 소정 실시양태에서는, Aβ에 결합되는 비-IgG4 인간화 항체의 CH2 도메인이 인간 IgG4 항체의 CH2 도메인으로 대체된다. 다른 실시양태에서는, Aβ에 결합되는 IgG1 인간화 항체의 CH2 도메인이 인간 IgG4 항체의 CH2 도메인으로 대체된다. 소정 실시양태에서, 불변 영역의 불변 영역은 변형된 불변 영역이 감소 또는 제거된 이펙터 기능을 가지도록 IgG1 항체의 불변 영역이 변형된 IgG1 항체로부터 유래한다.
다른 실시양태에서는, IgG1 항-Aβ 항체가 항-염증제와의 조합으로 투여됨으로써 소교 세포에서 p38 MAP 키나제가 중간 수준으로 활성화되는, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 소정의 구체적인 실시양태에서, p38 MAP 키나제 활성화의 중간 수준은 독성인 베타-아밀로이드 올리고머 단독에 의한 p38 MAP 키나제 활성화 수준은 상회하나, 항-염증제 없이 올리고머 단독 존재하에서의 정상적인 수준의 이펙터 기능을 갖는 IgG1 항-Aβ 항체에 의한 p38 MAP 키나제 활성화 수준 미만인 수준이다.
3.1 용어
본원에서 사용될 때, "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"이라는 용어들은 호환가능하며, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들로 구성되는 생체분자를 의미하는 것으로 정의된다.
본원에서 사용될 때의 단수 형태("a", "an" 및 "the")의 용어는 "하나 이상"을 의미하여 정의되는 것으로써, 문맥상 부적절하지 않은 한, 복수의 것을 포함한다.
"아밀로이드증"이라는 용어는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질에 의해 야기되거나 그와 연관된 질환 및 장애의 군을 지칭하며, 여기에는 아밀로이드 플라크에 의한 것을 포함하여, 단량체, 원섬유 또는 중합체 상태, 또는 이들 3종의 임의 조합인 아밀로이드-유사 단백질의 존재 또는 활성에 의해 야기되는 질환 및 장애가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 질환에는 비제한적으로 신경학적 장애 예컨대 알츠하이머병 (AD), 인지 기억 용량의 상실을 특징으로 하는 질환 또는 이상 예를 들자면 경도의 인지 손상 (MCI), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈 (네델란드 유형), 괌 파킨슨-치매 복합증, 및 아밀로이드-유사 단백질을 바탕으로 하거나 그와 연관되어 있는 다른 질환 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야곱병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 봉입체 근염 (IBM), 성인 발병 당뇨병, 내분비 종양, 노인성 심장 아밀로이드증; 및 황반 변성, 드루젠-관련 시신경병증, 및 베타-아밀로이드 침착으로 인한 백내장을 포함한 여러 눈 질환을 포함한 질환들과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때의 "검출하는" 또는 "검출되는"이라는 용어는 생물학적 분자의 검출에 면역화학 또는 조직학적 방법과 같은 공지의 기술을 사용하는 것을 의미하며, 조사되는 생체분자의 존재 또는 농도를 정성 또는 정량적으로 측정하는 것을 지칭한다.
"아밀로이드 β", "아밀로이드 베타", "Aβ", "β-아밀로이드", 또는 "베타 아밀로이드"는 당업계-공지의 용어로서, 아밀로이드 β 단백질 및 펩티드는 물론, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질분해 절단에 의해 생성될 수 있는 변형체, 단편 및 그의 임의의 기능성 등가물들을 지칭하는데, 여기에는 비제한적으로 Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41, Aβ1-42 및 Aβ1-43을 포함하여, 아밀로이드 병리에 연루되거나 그와 연관되어 있는 APP의 단편들이 포함된다.
상기에서 언급한 바와 같은 아밀로이드 β 펩티드의 구조 및 서열은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 해당 펩티드의 제조 방법, 또는 뇌 및 다른 조직으로부터의 그의 추출 방법에 대해서는 예를 들면 문헌 [Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984)]에 기술되어 있다. 또한, 아밀로이드 β 펩티드는 다양한 형태로 상업적으로 입수가능하기도 하다.
"단리된"이라는 용어는 자연상에서 함께 발생하는 성분들 중 일부 이상이 없는 생물학적 분자를 의미한다.
본원에서 사용될 때의 "항체" 또는 "항체들"이라는 용어는 당업계-공지의 용어로서, 알려져 있는 항원에 결합되며, "이뮤노글로불린" 또는 "이뮤노글로불린 분자"라는 용어와 호환가능하게 사용되는 분자 또는 분자의 활성 단편, 그리고 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합되는 결합 부위를 포함하는 이뮤노글로불린의 부분을 지칭하는 것으로 이해된다. 이뮤노글로불린은 실질적으로 이뮤노글로불린 카파 및 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자들은 물론, 무수한 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자들에 의해 코딩되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질이다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 그것은 다시 각각 이뮤노글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다. 중쇄의 하위부류들도 공지되어 있다. 예를 들면, 인간에서의 IgG 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위부류 중 어느 것일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 항체와 관련하여 "특이적으로 결합되는"은 항체가 구조적으로 상이한 항원(들)에 그것이 결합되는 것에 비해 훨씬 더 큰 친화도로 그의 표적 항원에 결합된다는 것을 의미한다.
전형적인 이뮤노글로불린 구조 단위는 사량체로 구성되는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 각 쌍이 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kD)을 갖는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성된다. 각 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산으로 된 가변 영역을 한정한다. 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)라는 용어는 각각 경쇄 및 중쇄의 이러한 부분을 지칭한다.
항체는 전체 길이의 무손상 항체로서, 또는 여러 펩티다제 또는 화학물질을 사용한 분해에 의해 생성되는 수많은 충분히 특성화되어 있는 단편들로서 존재한다. 따라서, 예를 들자면, 펩신은 힌지 영역의 디술피드 결합 아래에서 항체를 분해하여, 그 자체가 디술피드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab')2를 생성시킨다. F(ab')2는 경도의 조건하에서 환원되어 힌지 영역의 디술피드 결합이 절단됨으로써, F(ab')2 이량체가 Fab' 단량체로 전환될 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab 단편이다 (다른 항체 단편들에 대한 더 상세한 설명을 위해서는, 문헌 [Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)] 참조). 무손상 항체의 분해와 관련하여 다양한 항체 단편들이 정의되지만, 당업자라면, 화학적인 것, 또는 재조합 DNA 방법론을 활용하는 것 중 어느 하나에 의해 어떠한 다양한 항체 단편도 새로 합성될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 따라서, 본원에서 사용될 때의 항체라는 용어에는 전체 항체의 변형에 의해 생성된 것, 또는 새로 합성된 것 중 어느 하나인 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 수득된 항체 및 단편들도 포함된다.
"항체"라는 용어에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라, 단일 쇄, 이중특이적, 유인원화, 인간 및 인간화 항체는 물론, 이들의 활성 단편이 포함된다. 알려져 있는 항원에 결합되는 분자 활성 단편의 예에는 Fab 이뮤노글로불린 발현 라이브러리의 생성물, 및 상기 언급된 항체 및 단편들 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함하여, 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fab/c, Fv, Fab', 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 이러한 활성 단편들은 수많은 기술들에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체가 펩신과 같은 효소에 의해 절단된 후, HPLC 겔 여과에 적용될 수 있다. 다음에, Fab 단편을 함유하는 적절한 분획이 수집된 후, 막 여과 등에 의해 농축될 수 있다. 항체 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기술의 추가 설명을 위해서는, 예를 들면 문헌 [Khaw, B. A. et al . J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)]; [Rousseaux et al . Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986]을 참조하라.
재조합으로 제조되는 항체는 통상적인 전체 길이 항체, 단백질분해성 분해 유래의 공지의 활성 항체 단편, 독특한 활성 항체 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv), 도메인 결실 항체 등일 수 있다. Fv 항체는 크기가 약 50 Kd이며, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 단일 쇄 Fv ("scFv") 폴리펩티드는 직접 연결되는 것 또는 펩티드-코딩 링커에 의해 연결되는 것 중 어느 하나인 VH- 및 VL-코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유 결합된 VH::VL 이종이량체이다. 문헌 [Huston, et al . (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883]을 참조하라. 자연적으로 응집되었으나 화학적으로 분리된 항체 V 영역으로부터의 경 및 중 폴리펩티드 쇄를 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 접히게 되는 scFv 분자로 전환시킨 수많은 구조들이 존재한다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,091,513, 5,132,405 및 4,956,778을 참조하라.
조합 부위(combining site)는 항원 결합에 참여하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄 ("H") 및 경쇄 ("L")의 N-말단 가변 ("V") 영역의 아미노산 잔기들에 의해 형성된다. 항체 가변 영역은 "프레임워크 영역" (FR)으로 알려져 있는 더 보존된 측접 연장체들 사이에 개재하며 "과가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로 지칭되는 3개의 고도로 변이성인 연장체를 포함한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 과가변 영역 (LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3) 및 중쇄의 3개의 과가변 영역 (HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)는 3차원 공간에서 항원 결합 표면 또는 포켓(pocket)을 형성하도록 서로에 대하여 배치된다. 따라서, 항체 조합 부위는 항체의 CDR을 구성하는 아미노산들, 및 결합 부위 포켓을 구성하는 소정의 프레임워크 잔기들을 나타낸다.
조합 부위를 구성하는 특정 항체의 아미노산 잔기들의 정체성(identity)은 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 항체 CDR은 카바트(Kabat) 등에 의해 최초로 정의된 과가변 영역으로 확인될 수 있다 (문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al ., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G and Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu] 참조). CDR의 위치는 코티아(Chothia) 등에 의해 최초로 기술된 구조적 루프 구조로서 확인될 수도 있다 (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al ., Nature 342, 877 (1989)], 및 [Tramontano et al ., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)] 참조). 다른 방법으로는 카바트와 코티아 사이의 절충안으로서 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재는 악셀리스(Accelrys))를 사용하여 유도되는 "AbM 한정", 또는 마칼룸(Macallum) 등에 의한 CDR의 "접촉 한정(contact definition)" (문헌 ["Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J Mol Biol. 1996 Oct 11;262(5):732-45])이 포함된다.
키메라 항체는 항체의 하나 이상 영역이 제1 종 유래 항체로부터의 것이고, 항체의 하나 이상 영역이 제2의 다른 종 유래 항체로부터의 것인 항체이다. 일 실시양태에서, 키메라 항체는 영장류 이뮤노글로불린 유래의 영역을 포함하는 것이다. 인간 임상 용도를 위한 키메라 항체는 통상적으로 인간 항체 유래의 불변 영역과 함께 비-인간 동물, 예컨대 설치류로부터의 가변 영역을 갖는 것으로 이해된다. 반면, 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래한 대부분 또는 전체 가변 프레임워크 영역 및 전체 불변 영역과 함께 비-인간 항체로부터의 CDR을 사용한다. 인간 키메라 항체는 통상적으로 설치류 항체 유래의 가변 영역을 갖는 것으로 이해된다. 통상적인 인간 키메라 항체는 중쇄 및 경쇄 모두가 설치류 항체로부터 유래한 가변 영역과 함께, 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 가진다. 키메라 항체는 인간 불변 영역의 천연 아미노산 서열 및 천연 설치류 가변 영역 서열에 대한 약간의 변화를 포함할 수 있다. 키메라 및 인간화 항체는 CDR 그라프팅(grafting) 접근법 (예컨대 U.S. 특허 번호 5,843,708; 6,180,370; 5,693,762; 5,585,089; 5,530,101 참조), 쇄 셔플링(shuffling) 전략 (예컨대 U.S. 특허 번호 5,565,332; 문헌 [Rader et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915] 참조), 분자 모델링 전략 (U.S. 특허 번호 5,639,641) 등을 포함하여, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
2개 이상 쇄 항체의 경우에 본원에서 사용될 때의 "인간화 항체"는 하나 이상의 쇄가 인간화된 것이다. 인간화 항체 쇄는 하나 이상의 프레임워크 영역이 인간의 것인 가변 영역을 가진다. 단일 쇄인 인간화 항체는 쇄가 하나 이상의 프레임워크 영역이 인간의 것인 가변 영역을 갖는 것이다. 인간화 항체 쇄 또는 그 단편의 가변 영역의 비-인간 부분은 통상적으로 설치류 기원인 비-인간 공급원, 구체적으로는 비-인간 항체로부터 유래한다. 인간화 항체에 대한 비-인간 기여분은 통상적으로 1종 (또는 그 초과)의 인간 이뮤노글로불린(들)로부터 유래한 프레임워크 영역 중에 산재된 하나 이상 CDR 영역의 형태로 제공된다. 또한, 프레임워크 지지 잔기들은 결합 친화도를 보존하도록 변경될 수 있다.
"인간화 항체"는 추가적으로 불변 영역 (예를 들면 1개 이상의 불변 영역, 또는 경쇄의 경우 그의 일부, 그리고 일부 실시양태에서는 중쇄의 경우 3개의 불변 영역)을 포함할 수 있다. 존재할 경우, 인간화 항체의 불변 영역은 통상적으로 기원이 인간이다. 인간화 항체를 수득하는 방법에 대해서는 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Queen et al ., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)], [Hodgson et al ., Bio/Technology, 9:421 (1991)] 참조). 인간화 항체는 또한 예컨대 토끼 및 마우스와 같은 대형 동물에서 친화도-성숙(affinity-matured) 인간-유사 폴리클로날 항체의 생성을 가능케 하는 새로운 유전 공학 접근법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,632,976을 참조하라.
본원에서 사용될 때의 "불변 영역" 또는 약어로 "CR"이라는 용어는 이뮤노글로불린의 불변 영역 유전자를 지칭한다. 불변 영역 유전자는 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 코딩하고 있다. 통상적으로 비-인간 (예컨대 뮤린)의 것인 키메라 인간 항체 및 인간화 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역에 의해 대체된다. 대상 키메라 또는 인간화 항체의 불변 영역은 통상적으로 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래한다. 중쇄 불변 영역은 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤의 5종 이소형 중 어느 것에서 선택될 수 있다. 또한, 다양한 하위부류의 중쇄 (예컨대 중쇄의 IgG 하위부류)은 상이한 이펙터 기능을 담당하며, 그에 따라 원하는 중쇄 불변 영역을 선택하는 것에 의해 원하는 이펙터 기능을 갖는 항체가 제조될 수 있다. 본 발명의 영역 내에서 사용될 수 있는 불변 영역은 감마 1 (IgG1), 특히 감마 1 (IgG1) 이소형, 감마 3 (IgG3), 및 특별히는 감마 4 (IgG4)의 Fc 영역이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 유형, 바람직하게는 카파 유형의 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 인간 카파 불변 쇄 (문헌 [Heiter et al . (1980) Cell 22:197-207])이며, 불변 중쇄는 인간 IgG4 불변 쇄이다.
"모노클로날 항체"라는 용어 역시 당업계에 충분히 인식되어 있으며, 단일 클로닝된 항체 생성 세포의 생성물인 항체를 지칭한다. 통상적으로, 모노클로날 항체는 정상적으로 짧게 생존하는 항체-생성 B 세포를 암 세포 (때로는 "불멸" 세포로 지칭됨)와 같은 신속-성장 세포에 융합시키는 것에 의해 제조된다. 생성되는 혼성 세포, 또는 하이브리도마(hybridoma)는 빠르게 증식됨으로써, 항체를 생산하는 클론을 생성시킨다.
본 발명의 목적상, "모노클로날 항체"에는 완전한 모노클로날성에는 아직 도달하지 못한 모 클론에 의해 생성되는 항체도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 동일한 그의 결합 부위들 (다가일 경우) 각각을 갖는 것으로 이해되는 이뮤노글로불린 또는 항체일 수 있거나, 또는 대안적으로 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체일 수 있다.
"이중특이적" 또는 "2관능성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al ., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조하라. "다중특이적" 또는 "다관능성 항체"는 2개를 초과하는 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개를 초과하는 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성 항체이다. 다중특이적 항체는 이중특이적 항체와 동일한 다양한 방법들을 사용하여 제조될 수 있다.
"단편"이라는 용어는 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 쇄보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 부분 또는 일부를 지칭한다. 단편은 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 수득될 수 있다. 단편은 재조합 수단에 의해 수득될 수도 있다. 대표적인 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및/또는 Fv 단편이 포함된다. "항원-결합성 단편"이라는 용어는 항원에 결합되거나, 또는 항원 결합 (즉, 특이적 결합)에 대하여 무손상 항체와 (즉, 그것이 유래된 무손상 항체와) 경쟁하는 이뮤노글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 결합성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 결합성 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일 쇄, 및 단일-쇄 항체가 포함된다.
"단편"은 또한 또 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 5개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 10개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 15개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 20개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 25개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 40개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 50개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 60개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 70개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 80개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 90개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 100개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 125개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 150개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 175개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 200개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들, 또는 250개 이상의 연속되는 아미노산 잔기들 의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드의 단편은 하나 이상의 폴리펩티드의 기능을 유지한다.
"항원"이라는 용어는 항체에 결합될 수 있는 것 또는 그의 단편을 지칭한다. 면역원은 유기체, 구체적으로 동물, 더욱 구체적으로는 인간을 포함한 포유동물에서 면역 반응을 도출할 수 있는 항원을 지칭한다. 항원이라는 용어는 항원성을 담당하는 항원의 부분을 지칭하는 항원성 결정인자 또는 에피토프 (항원에 존재하는 접촉부와 접촉하고 있거나 그를 지지함에 있어서 중요한 역할을 함)로 알려져 있는 영역을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "가용성인"이라는 용어는 수용액 중에서 부분적으로 또는 완전히 용해되는 능력을 의미한다.
또한, 본원에서 사용될 때, "면역원성인"이라는 용어는 면역원의 항원에 대항하여 항체, T-세포 및 기타 반응성 면역 세포들의 생성을 도출하는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 면역원성이라는 용어는 수용자에게 투여되었을 때 면역 반응 (체액성 또는 세포성)을 도출하는 항원 능력의 척도를 지칭한다. 면역 반응은 치료될 장애를 완화 또는 경감하기 위하여 투여된 본 발명의 면역원성 조성물에 대항하여 개체가 충분한 항체, T-세포 및 기타 반응성 면역 세포들을 생성시킬 때 발생한다.
"감소된 면역원성"을 갖는 인간화 항체는 모 항체, 예컨대 뮤린 항체에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 인간화 항체를 지칭한다.
"모 항체의 결합 특성을 실질적으로 유지하는" 인간화 항체는 해당 인간화 항체를 제조하는 데에 사용된 모 항체에 의해 인식되는 항원에 특이적으로 결합되는 능력을 유지하는 인간화 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 모 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 친화도 및 결합력을 나타내게 된다. 소정 실시양태에서, 항체의 친화도는 모 항체 친화도의 10% 이상, 모 항체 친화도의 약 30% 이상, 또는 모 항체 친화도의 50% 이상일 것이다. 항원-결합 친화도를 검정하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있는데, 여기에는 반-최대 결합 검정, 경쟁 검정, 및 스캐차드(Scatchard) 분석이 포함된다. 적합한 항원 결합 검정이 본 출원에 기술되어 있다.
본원에서 사용될 때, "보존적 변화"는 입체형태 또는 항원성에 있어서 실질적으로 중성이어서, 각각 천연 단백질과 비교하였을 때, 돌연변이 폴리펩티드의 3차 구조에 최소한의 변화를 생성시키거나, 또는 돌연변이 폴리펩티드의 항원성 결정인자에 최소한의 변화를 생성시키는 변경을 지칭한다. 본 발명의 항체 및 항체 단편을 지칭할 때, 보존적 변화는 항체를 대상 수용체에 결합을 할 수 없도록 하지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 당업자라면, 어떤 아미노산 치환이 입체형태 및 항원성에 있어서 중성일 가능성을 높게 유지하면서 이루어질 수 있는지 예상할 수 있을 것이다. 그와 같은 안내는 예를 들면 문헌 [Berzofsky, (1985) Science 229:932 940] 및 [Bowie et al . (1990) Science 247:1306 1310]에 제공되어 있다. 입체형태 및 항원성에 있어서 중성을 유지할 가능성에 영향을 주는 것으로 고려될 요인에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: (a) 소수성 잔기는 단백질의 내부에 위치될 가능성이 더 크기 때문에, 소수성 아미노산의 치환은 항원성에 영향을 줄 가능성이 덜함; (b) 치환되는 아미노산이 천연 아미노산을 구조적으로 모방하기 때문에, 생리화학적으로 유사한 아미노산의 치환은 입체형태에 영향을 줄 가능성이 덜함; 및 (c) 진화상으로 보존된 서열의 변경은 입체형태에 부정적인 영향을 줄 가능성이 있는데, 그와 같은 보존은 아미노산 서열이 기능적인 중요성을 가질 수 있음을 암시하기 때문임. 당업자라면, 비제한적으로 미세보체(microcomplement) 고정법 (문헌 [Wasserman et al . (1961) J. Immunol. 87:290 295]; [Levine et al . (1967) Meth. Enzymol. 11:928 936]), 및 입체형태 의존성 모노클로날 항체를 사용한 결합 연구 (문헌 [Lewis et al. (1983) Biochem. 22:948 954])와 같이 잘 알려져 있는 검정들을 사용함으로써, 단백질 입체형태에 있어서의 변경을 평가할 수 있을 것이다.
"치료상 기능적인 양"이라는 용어는 인간 또는 동물에게 투여되었을 때 해당 인간 또는 동물에서 치료 효과를 초래하기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. 기능적인 양은 당업자에 의해 일상적인 절차에 따라 용이하게 결정된다.
본원에서 사용될 때, "치료하다", "예방하다", "예방하는", 및 "예방"이라는 용어는 예방제 또는 치료제의 투여에 기인하는 대상체에서의 1종 이상 장애 증상의 재발 또는 발병의 예방을 지칭한다.
항-베타 아밀로이드 항체 맥락에서의 "안전하고 기능적인 양"이라는 용어는 알츠하이머병에 걸린 환자에게 투여되었을 때, 환자에서 새로운 아밀로이드 플라크의 형성을 감소시키거나 또는 예방하거나, 환자에서 아밀로이드 플라크 부하를 감소시키고/거나 환자 인지 능력의 저하를 감소시키거나 또는 예방하거나, 또는 그것을 향상시키고, 염증성 부작용, 예컨대 수막염 및 수막뇌염, 그리고 뇌에서의 액체 축적 (뇌 부종)과 같은 부작용이 관찰되지 않거나, 또는 어떠한 부작용도 환자의 치료가 중단되어야 할 만큼 심하지는 않은, 항-베타 아밀로이드 항체의 양을 지칭한다. 소정 실시양태에서는, 새로운 아밀로이드 플라크의 형성이 미처리 대조군에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 감소된다. 소정 실시양태에서는, 아밀로이드 플라크 부하가 미처리 대조군에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 감소된다. 소정 실시양태에서는, 환자 인지 능력의 저하가 미처리 대조군에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 감소된다. 소정 실시양태에서는, 환자의 인지 능력이 미처리 대조군에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 향상된다.
"비-IgG1 항체"라는 용어는 하기의 이소형 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 1종의 임의의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭하는데, 단, 상기 비-IgG1 항체는 그의 야생형 이펙터 기능을 유지하는 IgG1 불변 영역을 가지지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 비-IgG1 항체는 IgG4 항체이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 비-IgG1 항체는 생성되는 항체의 이펙터 기능이 야생형 IgG1 항체에 비해 감소되거나 제거되도록 돌연변이된 IgG1 항체 유래의 불변 영역을 가진다.
p38 MAP 키나제 활성화 맥락에서의 "중간 수준"이라는 용어는 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준은 상회하나, 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체와 동일한 Kd로 베타 아밀로이드에 결합되는 동일 농도의 IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 존재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준 미만인, p38 MAP 키나제 활성화 수준을 지칭한다.
4. 도면의 설명
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도 1a 내지 1f는 실시예 6.1 및 6.2에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프 및 면역조직화학 영상들을 제공한다. 항-Aβ MABT 모노클로날 항체는 고도의 친화도로 상이한 Aβ 펩티드들에 결합되며, 항-응집 특성을 가진다. 인간 및 뮤린 Aβ1-42 및 인간 Aβ1-40에 결합되는 mMABT (1a) 및 MABT (1b)를 비교하는 데는 Aβ ELISA가 사용되었다. MABT는 상이한 Aβ1-42 조립 상태에의 결합에 대해서도 시험되었다 (1c). MABT는 트랜스제닉 APP 마우스로부터의 뇌 절편 (1d 상부 패널), 및 인간 AD 측두 신피질 절편 (1d 하부 패널)에 존재하는 Aβ 플라크에 결합된다. 시험관내 기능성은 Aβ1-42 응집을 방해하고 사전형성된 Aβ1-42 응집체를 조립해제시키는 MABT의 능력으로 나타내었다. Aβ1-42 응집의 억제, 및 사전-형성된 Aβ1-42 응집체의 응집해제는 ThT-기반의 검정에서 10:1 몰비 (Aβ1-42 대 모노클로날 항체)를 사용하여 입증하였다 (1e). 대조군으로는, N-말단 에피토프를 갖는 항-Aβ IgG 모노클로날 항체가 사용되었다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 (±SD)을 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01. MABT는 방법에 기술되어 있는 바와 같이, 다량체성 Aβ 조립체에의 결합시 ThT 형광에 의존하지 않는 Aβ1-42 자가-조립 검정에서도 시험되었다 (1f). 2개 검정의 평균 (±SEM)을 나타내었다.
도 2a 내지 2c는 실시예 6.3에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프 및 면역세포화학 영상들을 제공한다. MABT는 1차 혼합 피질 배양물에서 Aβ1-42 올리고머의 세포독성을 억제한다. P1 래트로부터의 혼합 피질 세포는 100 ㎍/mL의 MABT 또는 IgG 대조 모노클로날 항체가 있거나 없는 2.5 또는 5 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 처리되었다 (2a). 방법 단원에 기술되어 있는 바와 같이, 세포 생존력을 측정하는 데에는 MTT 검정이 사용되었다. 5개의 독립적인 실험의 평균 (±SEM)을 나타내었다. *P < 0.05, **P < 0.01. 유사하나 대사 활성의 마커로서 ATP 생성을 측정하는 검정에서, 세포는 200 ㎍/mL의 MABT가 있거나 없는 10 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 처리되었다 (2b). 결과는 2개의 독립적인 검정의 평균 (±SEM)을 나타낸다. 연장된 Aβ1-42 올리고머 처리 후의 신경독성은 형태구조 분석에 의해 시험되었다 (2c). 상기한 바와 같은 세포가 50 ㎍/mL의 MABT가 있거나 없는 10 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 4일 동안 처리된 다음, TuJ1 및 DAPI로 염색되었다.
도 3a 내지 3f는 실시예 6.4에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프 및 면역세포화학 영상들을 제공한다. 신경돌기에 결합되는 Aβ1-42 올리고머는 항-Aβ IgG4 모노클로날 항체에 의해 감소되었다. P1 래트로부터의 혼합 피질 세포는 100 ㎍/mL의 MABT 또는 IgG 대조군이 있거나 없는 2 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 30분 (제시) 또는 18시간 (미제시) 동안 처리되었다. 좌측으로부터 우측으로, 도면은 하기를 나타낸다: 완충제 대조군, Aβ1-42 올리고머, 및 MABT를 동반한 Aβ1-42 올리고머를 사용한 처리 (3a). 세포 핵을 표지하는 데에는 DAPI가 사용되었으며; 뉴런을 표지하는 데에는 뉴런-특이적 튜불린에 대한 항체인 TuJ1이 사용되었고; 베타-아밀로이드를 표지하는 데에는 항-Aβ 항체 (클론 6E10)가 사용되었다. 하부 열은 3종의 마커 전체를 나타내는 반면, 상부의 열은 Aβ 및 DAPI만을 나타낸다. 2개의 삽입도는 신경돌기에 대한 Aβ1-42 올리고머의 결합 (좌측), 및 MABT 모노클로날 항체에 의한 이와 같은 결합의 억제 (우측)을 도시한다. 30분 처리 및 18시간 처리에 대하여 형광의 정량적 측정을 나타내었다 (3b). 2개 실험의 평균 결과 (±SEM)를 나타낸다. 하이라이트 플루오르(HyLite Fluor)-488을 사용하여 표지된 Aβ1-42는 MABT가 신경돌기에 대한 Aβ1-42의 결합을 억제하였음을 증명하였다. 하이라이트 플루오르-488로 태깅된 Aβ1-42가 사용되었다는 것 이외에는, (3a)에 대하여 기술된 것과 같이 P1 래트로부터의 피질 배양물을 처리하였다 (3c). Aβ1-42-표지된 샘플은 상부 패널에 나타내었으며, DAPI-염색된 샘플은 하부 패널에 나타내었다. 대표적인 한가지 실험을 나타낸다. Aβ1-42 형광을 정량하여, 2개의 독립적인 실험의 평균 (±SD)을 나타내었다 (3d). 방법에서 기술된 바와 같이, Aβ1-42의 세포내 축적은 트립신-제거(trypsin-cleared) 세포에서 Aβ1-42에 대한 ELISA를 수행함으로써 검정되었다 (3c). 3개 실험의 평균 결과 (±SEM)를 나타내었다. MABT를 사용한 처리시, Aβ1-42 올리고머는 (3f)에 나타낸 바와 같이 소교세포와 유사한 세포에 의해 흡수되는 것으로 보였다. 세포 핵을 표지하는 데에는 DAPI가 사용되었으며; 베타-아밀로이드를 표지하는 데에는 항-Aβ 항체가 사용되었다.
도 4a 내지 4f는 실시예 6.5에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프 및 공초점 영상들을 제공한다. MABT 처리시, FcR-매개 기작을 통하여 소교세포로 Aβ1-42 올리고머가 흡수되었다. MABT에 복합체화된 Aβ1-42 올리고머가 소교세포 내로 흡수되는 것을 나타내는 데에는 공초점 영상화가 사용되었다. 세포 핵을 표지하여 소교세포 자체를 나타내는 데에는 DAPI가 사용되었으며; Aβ1-42 올리고머를 표지하는 데에는 항-Aβ 항체가 사용되었다 (4a). Z-스택으로부터 제공된 3-차원 영상으로부터 정단-내지-원거리 슬라이스가 수득되었다. 공초점 영상화는 실시예 단원의 물질 및 방법에 기술되어 있는 바와 같이 Aβ에 대하여 표지되고 (말단) DAPI로 염색된 (중앙) 혼합 피질 세포에서 수행되었다. 소교세포는 세포내 위치를 나타내는 일련의 공초점 스택을 통하여 최대 형광 강도에 대하여 식별 및 스캐닝되었으며 (4b), 최소 역치를 상회하는 형광 신호의 총 면적이 정량되었다 (4c). 그래프상의 각 표시는 단일 세포 내의 염색된 Aβ의 총 면적을 나타낸다. 각 처리 조건에 대하여 최소 20개의 세포가 분석되었다. 데이터는 일원 ANOVA에 이어지는 터키 사후 다중 비교를 사용하여 비교되었다. 평균 (±SEM)을 나타내었다. 소교세포 (Iba1+)가 MABT에 복합체화된 Aβ1-42를 흡수하는 세포-유형으로 증명되었다 (4d). 소교세포에는 Iba1이 마커로 사용되었으며, Aβ1-42 A를 나타내는 데에는 하이라이트 플루오르-488-표지된 Aβ1-42가 사용되었고, 세포 핵을 나타내는 데에는 DAPI가 사용되었다. Iba1과 Aβ1-42의 공동국소화가 보인다. 상이한 IgG 모노클로날 항체들에 의한 Aβ1-42 올리고머 내재화는 FcγR-결합과 상관된다. 결합 검정에서는, FcγRIIIa-V158에 대한 서로 다른 결합이 증명되었다 (4e). 항-Aβ 모노클로날 항체는 Aβ1-42 올리고머 독성에 대한 완전한 보호 효과에 FcγR-결합을 필요로 한다. P1 래트로부터의 혼합 피질 세포가 MABT, MABT-IgG1-D265A, MABT-IgG1, 또는 IgG1 대조 mAb가 있거나 없는 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 처리되었다 (4f). 그래프는 5개의 독립적인 실험으로부터의, Aβ1-42 올리고머 처리 세포와 비교한 세포 생존력의 평균 (±SEM) % 증가를 나타낸다. 통계 분석은 일원 ANOVA에 이어지는 터키 사후 다중 비교를 사용하여 수행되었다.
도 5a 내지 5d는 실시예 6.6에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프 및 면역세포화학 영상들을 제공한다. Aβ1-42 올리고머에 복합체화되는 경우, 야생형 백본을 갖는 IgG1의 첨가는 Aβ1-42 올리고머-처리된 소교세포에서 나타난 것에 비해 p38 활성화를 상당히 증가시켰다. P1 래트로부터의 혼합 피질 세포가 100 ㎍/mL의 MABT, MABT-IgG1-D265A, 또는 MABT-IgG1 야생형이 있거나 없는 10 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 30분 동안 처리되었다. 대조군으로는 Aβ에 결합되지 않는 IgG1 모노클로날 항체가 사용되었다. p38 MAPK의 활성은 방법에 기술되어 있는 바와 같이 포스포-특이적 ELISA에 의해 측정되었다 (5a). 4개의 독립적인 실험의 평균 (±SEM)을 나타내었다. 통계 분석은 일원 ANOVA에 이어지는 터키 사후 다중 비교를 사용하여 수행되었다. 모노클로날 항체와 복합체화된 Aβ1-42 올리고머를 사용한 p38 MAPK의 활성화는 소교세포에 특이적이었다 (5b). 세포는 상기한 바와 같이 처리된 다음, Iba1 (소교세포), 및 DAPI (세포 핵)를 사용하여 포스포-p38 MAPK에 대하여 염색되었다. 좌측으로부터 우측으로, 도면은 하기를 나타낸다: 완충제 대조군, Aβ1-42 올리고머, 및 MABT와 함께인 Aβ1-42 올리고머를 사용한 처리. 포스포-p38 MAPK와 Iba1의 공동국소화는 우측 삽입도에 나타내었다. 소교세포-특이적 p38 활성을 증명하는 데에는 CX3CR1-GFP 마우스로부터의 순수 소교세포가 사용되었다 (5c). 포스포-p38 단독에 대한 염색은 상부 패널에 나타내었으며, 포스포-p38과 함께인 CX3CR1-GFP 신호 (소교세포)는 하부 패널에 나타내었다. Aβ1-42 올리고머 독성에 대한 MABT의 완전한 보호 효과에는 p38 MAPK 활성이 필요하였다. p38-특이적 억제제인 1 μM의 SB239063의 존재 또는 부재하에, 단독, 또는 100 ㎍/ml의 MABT 또는 MABT-IgG1-D265A와 함께인 10 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 P1 래트로부터의 혼합 피질 세포가 처리되었다 (5d). 24시간 후, MTT 판독을 사용한 세포독성 검정이 수행되었다. 4개 실험의 평균 (±SEM)을 나타내었다. 통계 분석은 일원 ANOVA에 이어지는 터키 사후 다중 비교를 사용하여 수행되었다.
도 6은 실시예 6.6에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프를 제공한다. FcγR에 대한 IgG1의 높은 친화도는 소교세포에 의한 Aβ1-42-매개 염증유발 방출을 감소시키는 데에 있어서 그것이 덜 효과적이게 한다. 24시간 처리 후 (방법 참조), 보강된 소교세포에 의한 TNFα의 방출이 측정되었다. 3개의 독립적인 실험의 평균 (±SEM)을 나타내었다. 통계 분석은 일원 ANOVA에 이어지는 터키 사후 다중 비교를 사용하여 수행되었다.
도 7은 실시예 6.1에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프를 제공한다. APP 마우스 모델에서, 플라크-부하가 감소되었으며, 비-공간적 기억력이 향상되었다. MABT 모노클로날 항체의 마우스 버젼인 mMABT를 사용한 만성 수동 면역화 후, 이중 APP/PS1 트랜스제닉 마우스에서의 플라크 부하 백분율 (A) 및 평균 플라크 수 (B)가 측정되었다. 대조군 (PBS)으로는 PBS가 주사된 동물이 사용되었다. 밀집 플라크를 염색하는 데에는 티오플라빈-S (ThS)가 사용되었다 (방법 참조). 기능성은 2회의 mMABT 투여 후, 단일 트랜스제닉 hAPP 돌연변이 마우스에서 입증되었다 (C). 회상 기억력의 척도로서의 인지 지수 (RI)는 새로운 대상 인지 시험 (방법 참조)을 사용하여 연구되었다. 대조군 (PBS)으로는 PBS가 주사된 동물이 사용되었다. 그래프상의 각 원은 개별 마우스를 나타낸다. 평균 (±SD)을 나타내었으며, *P < 0.01이었다.
도 8은 실시예 6.1에 기술되어 있는 실험에 해당하는 웨스턴 블롯을 제공한다. 신경독성 Aβ1-42는 저- 및 고-분자량 올리고머들의 혼합물이다. 신경독성 Aβ1-42 올리고머가 제조된 후 (방법 참조), Aβ1-42 올리고머-매개 신경독성에 대한 모노클로날 항체 처리의 효과를 검정하는 시험관내 실험에 사용되었다. Aβ1-42 올리고머가 SDS/PAGE 4-12% 구배 겔상에서 전개된 후, 니트로셀룰로스 막으로 이동된 다음, 항-Aβ 항체 (클론 6E10)를 사용하여 블롯팅되었다.
도 9는 실시예 6.2에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프를 제공한다. 중앙-도메인 유도 MABT는 ApoE4와의 Aβ1-42의 상호작용을 억제한다. 재조합 인간 ApoE4에의 Aβ1-42의 결합에 대한 항-Aβ N-말단 (클론 6E10 및 WO2), C-말단 (클론 G2-11), 또는 중앙-도메인 (MABT) 모노클로날 항체의 효과를 평가하는 데에는 ELISA가 사용되었다. IgG 모노클로날 항체가 없는 신호의 %억제를 나타내었다.
도 10은 실시예 6.5에 기술되어 있는 실험에 해당하는 그래프 및 면역세포화학 영상을 제공한다. 가교-결합된 MABT IgG4 모노클로날 항체는 IgG1 야생형과 비교하였을 때 감소된 결합 활성을 가졌다. 가교-결합된 항-Aβ IgG1 야생형은 양성 비-Aβ-결합 IgG1 대조군과 유사한 활성으로 모든 FcRγ 수용체에 결합되었다. MABT 및 MABT-IgG1-D265A 둘다는 MABT-Aβ IgG1 및 비-Aβ-결합 IgG1 양성 대조군에 비해 모든 FcγR에 대하여 실질적으로 감소된 결합성을 가졌다. 이러한 발견은 인간 IgG4 항체 (문헌 [Gessner et al., 1998]) 및 D265A 돌연변이를 보유하는 IgG1 항체 (문헌 [Shields et al., 2001])에 대한 공개된 데이터와 일치한다.
도 11은 항-베타 아밀로이드 항체로 처리된 APP/PS1 마우스에서의 Aβ 플라크의 생체내 영상화 수행을 제공한다. MABT의 전신성 투여는 생체 내에서 개별 아밀로이드 플라크를 조절한다. APP/PS1 동물에서의 아밀로이드 플라크는 I.P.로 주사된 메톡시-X04를 사용하여 표지되었으며, 생체내 2-광자 현미경법에 의해 가시화되었고, 여러 주에 걸쳐 추적되었다 (A). 시간 경과에 따른 플라크 부피의 상대적인 변화는 최초 영상화 기간으로부터의 증가-배수로 플로팅되었다 (B). 평균하면, 개별 플라크 크기는 MABT를 사용한 전신성 투여 후 부피가 감소되었다 (x개 플라크, 2마리 동물).
4.1 서열의 설명
서열 1 MABT 인간화 중쇄 가변 영역 (CDR1)의 아미노산 서열
서열 2 MABT 인간화 중쇄 가변 영역 (CDR2)의 아미노산 서열
서열 3 MABT 인간화 중쇄 가변 영역 (CDR3)의 아미노산 서열
서열 4 MABT 인간화 경쇄 가변 영역 (CDR1)의 아미노산 서열
서열 5 MABT 인간화 경쇄 가변 영역 (CDR2)의 아미노산 서열
서열 6 MABT 인간화 경쇄 가변 영역 (CDR3)의 아미노산 서열
서열 7 MABT 인간화 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 8 MABT 인간화 경쇄의 아미노산 서열
서열 9 인간화 MABT 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열
서열 10 MABT 인간화 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 11 MABT 인간화 중쇄의 아미노산 서열
서열 12 IG 감마-4 쇄 C 영역의 아미노산 서열 - 변형됨
서열 13 MABT 인간화 중쇄 가변 영역 CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열 14 MABT 인간화 중쇄 가변 영역 CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열 15 MABT 인간화 경쇄 가변 영역 CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열 16 MABT 인간화 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 17 MABT 인간화 경쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 18 MABT 인간화 경쇄 불변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 19 MABT 인간화 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 20 MABT 인간화 중쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 21 MABT 인간화 중쇄 불변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 22 HCDR2에 선행하는 통상적인 아미노산 서열
5. 상세한 설명
하기에서 기술되는 것은 항-아밀로이드 베타 항체를 시험하기 위한 세포-기반의 검정 시스템, 및 항-아밀로이드 베타 항체를 사용한 환자 치료의 모니터링 및 조정 방법이다. 역시 하기에서 기술되는 것은 신경보호제의 안전성 또는 효능을 시험하기 위한 세포-기반의 검정 시스템, 및 신경보호제를 사용한 환자 치료의 모니터링 및 조정 방법이다. 추가적으로 하기에서 기술되는 것은 안전하고 기능적인 항체, 및 알츠하이머병의 치료를 위한 그와 같은 안전하고 기능적인 항체의 사용 방법이다. 제약 제제 및 투여 양식 역시 기술된다.
5.1 세포-기반 검정 시스템
본원에서 제공되는 것은 아밀로이드증의 치료를 위한 항체 또는 다른 제제의 안전성 및 기능성을 시험하기 위한 시험관내 세포-기반 검정 시스템이다. 소정 실시양태에서는, 시험 항체의 존재 및 부재하에, 아밀로이드증에 의해 영향을 받는 세포 ("표적 세포"), 해당 병리학적 형태의 아밀로이드 단백질, 및 면역 이펙터 세포 (예컨대 자연 킬러 세포, 대식세포, 예컨대 소교 세포, 호중구, 및 비만 세포)가 인큐베이션된다. 항체의 안전성 및 기능성을 시험하기 위하여 측정될 수 있는 파라미터에는 표적 세포의 생존률, 아밀로이드 단백질의 면역 이펙터 세포로의 내재화, 및 면역 이펙터 세포에서의 p38 MAP 키나제 경로의 활성화가 포함된다. 소정 실시양태에서, 안전하고 기능적인 항체는 최대의 내재화, 및 p38 MAP 키나제 경로의 중간수준 활성화를 초래한다.
더 구체적인 실시양태에서, 아밀로이드증은 알츠하이머병이며, 아밀로이드 단백질은 베타 아밀로이드이고, 면역 이펙터 세포는 소교 세포이며, 표적 세포는 뉴런이다. 특정 실시양태에서는, 기존의 세포주로부터 세포를 수득하여 혼합 배양물을 생성시킨다. 다른 실시양태에서, 혼합 세포 배양물은 1차 피질 배양물이다 (문헌 [Meberg & Miller 2003, Methods Cell Biol 71:111-127]). 소정 실시양태에서, 혼합 세포 배양물은 래트, 마우스, 또는 침팬지로부터의 1차 피질 배양물이다. 소정 실시양태에서, 1차 피질 배양물은 인간 환자로부터의 피질 생검 또는 척수 생검에 의해 수득된다.
뉴런 및 소교 세포를 포함하는 혼합 세포 배양물이 베타 아밀로이드 단백질과 함께 인큐베이션된다. 일 실시양태에서, 베타 아밀로이드 단백질은 베타 아밀로이드 올리고머로서 제공된다. 이와 같은 검정 시스템에서는, 하기의 파라미터들이 측정될 수 있다: (1) 예컨대 대사 전환(metabolic turnover)에 의해 뉴런 생존률이 측정될 수 있으며, 대사 전환은 예컨대 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)의 미토콘드리아 산화 또는 ATP 방출에 의해 측정될 수 있음; (2) 예컨대 베타 아밀로이드 단백질에 대한 면역세포화학, 또는 베타 아밀로이드 단백질의 표지 및 직접 측정 및/또는 가시화에 의해 소교세포 내로의 베타-아밀로이드 올리고머 내재화가 측정될 수 있음; 및 (3) 예컨대 인산화된 p38 MAPK ("포스포-p38")에 대한 ELISA에 의해 p38 MAPK 경로의 활성화가 측정될 수 있음.
소정 실시양태에서, 베타 아밀로이드 및 안전하고 기능적인 항체의 존재하에서의 뉴런 생존률은 안전하고 기능적인 항체 부재하에서의 뉴런 생존률에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 이상, 또는 500% 이상 증가된다.
소정 실시양태에서, 안전하고 기능적인 항체 존재하에서의 소교세포 내로의 베타 아밀로이드의 내재화는 안전하고 기능적인 항체 부재하에서의 내재화율에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 이상, 또는 500% 이상 증가된다.
소정 실시양태에서, 베타 아밀로이드 및 안전하고 기능적인 항체의 존재하에서의 소교세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화는 베타 아밀로이드의 존재하, 그러나 안전하고 기능적인 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화에 비해 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 사이로 증가된다. 더 구체적인 실시양태에서, 베타 아밀로이드 및 안전하고 기능적인 항체의 존재하에서의 소교세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화는 베타 아밀로이드의 존재하, 그러나 안전하고 기능적인 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화에 비해 10%-30% 사이로 증가된다. 또한, 베타 아밀로이드 및 안전하고 기능적인 항체의 존재하에서의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화는 IgG1 이소형 항 베타 아밀로이드 항체의 존재하에서 p38 MAP 키나제가 활성화되는 것에 비해 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 덜 증가된다.
소정 실시양태에서는, 항체의 안전성 및 기능성을 측정하기 위하여, 병리학적 형태의 베타 아밀로이드, 예컨대 올리고머성 베타 아밀로이드, 시험 항체, 및 소교 세포가 인큐베이션된다. 이와 같은 검정 시스템에서는, 하기의 파라미터들이 측정될 수 있다: (1) 예컨대 베타 아밀로이드 단백질에 대한 면역세포화학, 또는 베타 아밀로이드 단백질의 표지에 의해 소교세포 내로의 베타 아밀로이드 올리고머 내재화가 측정될 수 있음; 및 (2) 예컨대 포스포-p38에 대한 ELISA에 의해 p38 MAPK 경로의 활성화가 측정될 수 있음.
p38 MAP 키나제 활성화를 측정하는 데에는, 당업자에게 알려져 있는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 소정 실시양태에서는, 인산화된 p38 MAP 키나제에 특이적으로 결합되는 항체를 사용하는 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 또는 면역세포화학이 인산화된, 즉 활성화된 p38 MAP 키나제의 수준을 측정하는 데에 사용된다. 소정 실시양태에서, p38 MAP 키나제 활성화는 p38 MAP 키나제의 핵 국소화도(degree of nuclear localization)를 측정하기 위하여 p38 MAP 키나제에 특이적으로 결합되는 항체를 사용하는 면역세포화학에 의해 측정된다. p38 MAP 키나제의 핵 국소화도가 높을수록, p38 MAP 키나제 활성화 수준은 더 높다.
소정 실시양태에서는, p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 다른 구성요소의 활성화가 측정될 수 있다. 소정 실시양태에서는, 환자에서의 p38 MAP 키나제 활성화를 측정하기 위하여, p38 MAP 키나제의 하류 표적의 발현 수준이 측정될 수 있다. 그와 같은 하류 표적에는 90-kDa 리보솜 S6 키나제 (pp90rsk); (RSK) 패밀리: RSK1, RSK2, MNK1/2 및 MSK1/2; 및 핵 번역 인자 예컨대 Elk-1, ATF2, STAT3 및 CREB가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하류 표적의 발현 수준은 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법, 예컨대 비제한적으로 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 측정될 수 있다.
5.2 치료의 모니터링 및 조정
소정 실시양태에서는, 베타 아밀로이드와 같은 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합되는 안전하고 기능적인 항체를 사용하여 치료중인 환자의 면역 이펙터 세포 예컨대 소교 세포에서 p38 MAP 키나제 활성화가 모니터링된다. 면역 이펙터 세포는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 환자로부터 수득될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 소교 세포는 피질 생검 또는 척수 생검에 의해 수득된다. 면역 이펙터 세포는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 배양물 중에서 유지될 수 있다.
소정 실시양태에서는, 신경보호제와 같은 작용제를 사용하여 치료중인 환자의 면역 이펙터 세포 예컨대 소교 세포에서 p38 MAP 키나제 활성화가 모니터링된다. 소정의 더 구체적인 실시양태에서, 환자는 알츠하이머병과 같은 아밀로이드증에 대하여 치료중이다. 소정의 더욱 더 구체적인 실시양태에서, 환자는 타크린(tacrine) (코그넥스(COGNEX) 사, 뉴저지 모리스 플레인 소재), 도네페질(donepezil) (아리셉트(ARICEPT) 사, 일본 도쿄 소재), 리바스티그민(rivastigmine) (엑셀론(EXELON) 사, 뉴저지 이스트 하노버 소재), 갈란타민(galantamine) (레미닐(REMINYL) 사, 뉴저지 뉴 브룬스위크 소재), 또는 메만틴(memantine) (나멘다(NAMENDA) 사, 뉴욕 뉴욕 소재)를 사용하여 치료중이다.
소정 실시양태에서, 투여 투여량 및/또는 투여 요법은 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화가 중간 수준이 되도록, 즉 항체의 부재시보다는 더 높으나 베타 아밀로이드 올리고머 존재하에서의 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합되는 IgG1 항체의 존재시보다는 더 낮게 되도록 환자에 대하여 조정된다. p38 MAP 키나제 활성화가 중간 수준을 상회할 경우, 투여량이 감소되고/거나 투여 빈도가 감소된다. p38 MAP 키나제 활성화가 중간 수준 미만인 경우, 투여량이 증가되고/거나 투여 빈도가 증가된다.
소정 실시양태에서는, p38 MAP 키나제 활성화를 중간 수준으로 조정하기 위하여, 안전하고 기능적인 항체와 함께 p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 조절인자가 공동-투여된다. p38 MAP 키나제 활성화가 중간 수준을 상회할 경우, p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 억제제가 공동-투여될 수 있다. p38 MAP 키나제 활성화가 중간 수준 미만인 경우에는, p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 활성화제가 공동-투여될 수 있다.
예시적인 p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 억제제에는 4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(4-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]페놀 ("SB 202190"); 4-[5-(4-플루오로페닐)-2-[4-(메틸술포닐)페닐]-1H-이미다졸-4-일]피리딘 ("SB 203580"); 및 트랜스-4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-메톡시-4-피리미디닐)-1H-이미다졸-1-일]시클로헥산올 ("SB 239063"), 그리고 이들의 제약상 적합한 유도체들이 포함된다.
예시적인 p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 활성화제에는 아니소마이신, MKK, Rac, Cdc42 및 PAK1, IL-1, IL-1-수용체, TNF, LPS, TRAF6, 및 TAB1/2이 포함된다.
소정 실시양태에서, p38 MAP 키나제 중간 활성화 수준은 안전하고 기능적인 항체 부재하에서의 환자의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화를 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 사이로 상회한다.
p38 MAP 키나제 활성화를 측정하는 데에는, 당업자에게 알려져 있는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 소정 실시양태에서는, 인산화된 p38 MAP 키나제에 특이적으로 결합되는 항체를 사용하는 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 또는 면역세포화학이 인산화된, 즉 활성화된 p38 MAP 키나제의 수준을 측정하는 데에 사용된다. 소정 실시양태에서, p38 MAP 키나제 활성화는 p38 MAP 키나제의 핵 국소화도를 측정하기 위하여 p38 MAP 키나제에 특이적으로 결합되는 항체를 사용하는 면역세포화학에 의해 측정된다. p38 MAP 키나제의 핵 국소화도가 높을수록, p38 MAP 키나제 활성화 수준은 더 높다.
소정 실시양태에서는, p38 MAP 키나제 신호전달 경로의 다른 구성요소의 활성화가 측정될 수 있다.
소정 실시양태에서는, 환자에서의 p38 MAP 키나제 활성화를 측정하기 위하여, p38 MAP 키나제의 하류 표적의 발현 수준이 측정될 수 있다. 그와 같은 하류 표적에는 90-kDa 리보솜 S6 키나제 (pp90rsk); (RSK) 패밀리: RSK1, RSK2, MNK1/2 및 MSK1/2; 그리고 핵 번역 인자 예컨대 Elk-1, ATF2, STAT3 및 CREB가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하류 표적의 발현 수준은 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법, 예컨대 비제한적으로 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 또는 예를 들면 RT-PCR에 의한 유전자 전사체의 검출에 의해 측정될 수 있다.
또한, 본원에서 제공되는 것은 환자에서의 알츠하이머병의 치료를 위한 항 베타-아밀로이드 항체의 안전성 및 기능성 평가 방법이다. 소정 실시양태에서는, 환자로부터 소교 세포가 수득될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 소교 세포는 항 베타-아밀로이드 항체를 사용한 환자의 치료가 개시되기 전에 환자로부터 수득될 수 있다. 환자로부터의 소교 세포는 표준의 업계-공지 기술을 사용하여 세포 배양물 중에서 유지될 수 있다.
소정 실시양태에서는, 환자로부터의 소교 세포가 항 베타-아밀로이드 항체 및 베타-아밀로이드 올리고머와 함께 인큐베이션된다. 하기의 파라미터들이 측정될 수 있다: 소교 세포에 대한 항체-베타 아밀로이드 복합체의 결합; 항체-베타 아밀로이드 복합체의 소교 세포로의 내재화; 및/또는 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화.
대조군은 항 베타-아밀로이드 항체 단독 (즉, 베타-아밀로이드 올리고머 없이)과 함께; 및/또는 베타-아밀로이드 올리고머 단독 (즉, 항체 없이)과 함께; 및/또는 베타-아밀로이드 올리고머 존재하에 IgG1 항 베타-아밀로이드 항체와 함께 환자로부터의 소교 세포를 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 소정 실시양태에서, 항 베타-아밀로이드 항체는 p38 MAP 키나제 활성화가 베타-아밀로이드 올리고머의 존재하, 그러나 안전하고 기능적인 항체의 부재하에서의 환자의 대조 소교 세포의 p38 MAP 키나제 활성화를 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 사이로 상회하는 경우에, 안전하고 기능적이다. 소정 실시양태에서, 항 베타-아밀로이드 항체는 소교 세포 내로의 베타-아밀로이드 내재화가 모노클로날 항체 MABT (단원 6 참조)의 그것을 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 사이로 상회 또는 하회하는 경우에, 안전하고 기능적이다.
5.3 안전하고 기능적인 항체
소정 실시양태에서는, 안전하고 기능적인 항체를 제공하기 위하여, 치료될 아밀로이드증의 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합되는 항체의 불변 영역이 변형 또는 대체될 수 있다. 소정 실시양태에서, 생성되는 항체의 불변 영역은 중간수준의 활성으로 자연 킬러 세포, 대식세포, 호중구 및 비만 세포와 같은 면역 이펙터 세포 표면상의 Fc 수용체에 결합된다. 소정 실시양태에서, 생성되는 항체는 중간 수준으로, 즉 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화는 상회하나 동일한 결합 특이성을 갖는 동일 농도 IgG1 항체의 존재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 미만으로, 면역 이펙터 세포의 p38 MAPK 경로를 활성화한다. 소정 실시양태에서는, 안전하고 기능적인 항체를 제공하기 위하여, 상보성 결정 영역 ("CDR") 외부의 가변 영역이 변형될 수도 있다. 역시 본원에서 제공되는 것은 그와 같은 항체, 및 그와 같은 항체를 포함하는 제약 조성물의 생성 방법이다.
항원 결합 특이성은 각각 항체 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 삽입되어 있는 상보성 결정 영역 ("CDR")에 의해 제공된다. 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 구축에 사용될 수 있는 CDR을 둘러싸고 있는 항체 불변 영역 및 프레임워크 영역에는 단원 5.3.1에 기술되어 있는 것들이 포함된다. 소정 실시양태에서, 안전하고 기능적인 항체의 구성에 사용될 수 있는 CDR 또는 가변 영역은 표 2에 제시되어 있는 항체들로부터 유래할 수 있다.
소정 실시양태에서는, 인간 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합되는 공지 항체의 CDR (하기 표 2 참조)이 인간 IgG4의 불변 영역과 조합되며, 항체 CDR들 사이의 프레임워크 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4와 같은 인간 IgG의 프레임워크 영역으로 대체된다. 소정 실시양태에서는, 공지의 인간화 항-베타 아밀로이드 항체, 예컨대 바피뉴주맙(Bapineuzumab) 또는 솔라네주맙(Solanezumab)의 가변 영역이 인간 IgG4의 불변 영역과 조합된다.
5.3.1 불변 영역
본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 항체 불변 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함한 임의의 이소형으로부터 유래할 수 있다. 소정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 항체 불변 영역은 아형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 유래할 수 있다.
마찬가지로, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 항체 중쇄 영역의 프레임워크 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함한 임의의 이소형으로부터 유래할 수 있다. 소정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 항체 프레임워크 영역은 아형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 유래할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 불변 영역은 이소형 IgG로부터 유래할 수 있다. 더욱 더 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 불변 영역은 이소형 IgG4로부터 유래할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 프레임워크 영역은 이소형 IgG로부터 유래할 수 있다. 더욱 더 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 프레임워크 영역은 이소형 IgG4로부터 유래할 수 있다.
소정 실시양태에서, 안전하고 기능적인 항체 중쇄의 불변 영역은 상이한 이소형 또는 아형들로부터의 키메라 불변 영역이다. 구체적인 실시양태에서, 중쇄의 불변 영역은 IgG4의 이펙터 기능을 담당하는 IgG4 중쇄 불변 영역의 해당 부분과 상이한 IgG 아형 사이의 키메라이다. 구체적인 실시양태에서, 중쇄의 불변 영역은 인간 IgG4 중쇄 불변 영역의 CH2 도메인과 상이한 IgG 아형 사이의 키메라이다.
소정 실시양태에서, 키메라 불변 영역은 하기에 기술되는 바와 같은 Fcγ에 대하여 중간수준의 결합 활성을 가진다. 소정 실시양태에서, 키메라 불변 영역은 단원 5.1에서 기술된 세포-기반 검정 시스템에 의해 측정하였을 때 p38 MAP 키나제 경로 활성이 중간 수준이 되도록 소교 세포와 같은 면역 이펙터 세포로의 내재화를 매개한다.
소정 실시양태에서는, 돌연변이를 도입하는 것에 의해 불변 영역이 최적화된다. 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 사용하여 불변 영역에 도입될 수 있다. 소정 실시양태에서, 생성되는 항체는 높은 수준이면서도 p38 MAP 키나제 경로의 활성화는 중간 수준이 되도록 소교 세포로의 베타 아밀로이드의 내재화를 높은 수준으로 촉진한다. 내재화 및 p38 MAP 키나제 활성화의 비율은 단원 5.1에 기술되어 있는 세포-기반 검정 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 소정 실시양태에서, 돌연변이된 불변 영역을 갖는 항체는 하기에 기술되는 바와 같은 Fc 수용체에 대하여 중간 수준의 결합 활성을 가진다.
소정 실시양태에서, 불변 영역은 글리코실화 양식을 변경하는 것에 의해 최적화된다. 글리코실화 양식은 항체가 합성되는 발현 시스템에 의해, 및/또는 글리코실화되는 아미노산 (예컨대 Asn297)을 돌연변이시키는 것에 의해 변경될 수 있다. 소정 실시양태에서, 생성되는 항체는 높은 수준이면서도 p38 MAP 키나제 경로의 활성화는 중간 수준이 되도록 소교 세포로의 베타 아밀로이드의 내재화를 높은 수준으로 촉진한다. 내재화 및 p38 MAP 키나제 활성화의 비율은 단원 5.1에 기술되어 있는 세포-기반 검정 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 소정 실시양태에서, 변경된 글리코실화 양식을 갖는 불변 영역을 갖는 항체는 하기에 기술되는 바와 같은 Fc 수용체에 대하여 중간 수준의 결합 활성을 가진다.
소정 실시양태에서, 불변 영역은 그의 Fc 수용체에 대하여 중간수준의 결합 활성을 가진다. 표 1에 나타낸 것은 예시적인 Fc 수용체들 및 그들의 각 주요 항체 리간드이다. 항체 리간드와 Fc 수용체 사이의 결합 활성은 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하는 대표적인 방법에는 ELISA 검정 및 비아코어(BIACORE) 분석이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 소정의 더 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 면역 이펙터 세포로의 항체 항원 복합체의 내재화를 매개하는 Fc 수용체이다. 소정의 더욱 더 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 소교 세포에서 발현되는 Fcγ 수용체이다.
<표 1>
Figure pct00001
소정 실시양태에서, 항체 불변 영역은 이소형 IgG의 것이며, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 불변 영역은 Fcγ 수용체에 대한 IgG1의 결합 활성의 10% 내지 30% 사이, 20% 내지 40% 사이, 30% 내지 50% 사이, 40% 내지 60% 사이, 50% 내지 70% 사이, 60% 내지 80% 사이, 또는 70% 내지 90% 사이인 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 가진다. 구체적인 실시양태에서, 알츠하이머병의 치료를 위한 안전하고 기능적인 항체의 생성을 위한 불변 영역은 Fcγ에 대한 IgG1의 결합 활성의 15% 내지 25% 사이, 더욱 구체적으로는 약 20%이다.
소정 실시양태에서, 항-Aβ 항체의 이펙터 영역은 항체의 이펙터 기능이 감소 또는 제거되도록 변형된다. 변형은 아미노산 치환 및/또는 결실을 초래하는 임의의 유전적 변경일 수 있다. 더 구체적인 실시양태에서, 불변 영역은 감소 또는 제거된 이펙터 기능을 갖는 변형 IgG1 불변 영역이다. 그와 같은 변형은 예를 들면 그 전체가 본원에 개재되는 2000년 7월 20일자 공개 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/42072에 기술되어 있는 바와 같이 도입될 수 있다. 소정 실시양태에서, 변형된 불변 영역을 갖는 항체의 해당 Fc 수용체에 결합되는 능력은 비변형 불변 영역에 비해 감소된다. 다른 실시양태에서, 불변 영역과 그의 Fc 수용체 사이의 결합은 변경되지 않으나, 이펙터 세포 존재하에서의 세포독성과 같은 이펙터 기능이 비변형 불변 영역에 비해 감소된다.
5.3.2 가변 영역
소정의 실시양태에서는, 베타 아밀로이드 및/또는 그의 병리학적 형태(들)에 특이적으로 결합되는 것으로 알려져 있는 항체의 가변 영역이 안전하고 기능적인 항체의 생성에 사용될 수 있다. 소정의 더 구체적인 실시양태에서는, 베타 아밀로이드 및/또는 그의 병리학적 형태(들)에 특이적으로 결합되는 것으로 알려져 있는 인간화 항체의 가변 영역이 안전하고 기능적인 항체의 생성에 사용될 수 있다. 소정 실시양태에서, 가변 영역은 비-IgG4 인간화 항체로부터 수득된다. 구체적인 실시양태에서, 가변 영역은 비-IgG4 인간화 항체로부터 수득되며, IgG4 불변 영역이 불변 영역으로 사용된다.
해당 아밀로이드 단백질에 결합되는 것으로 알려져 있는 항체의 CDR이 본원에서 기술되는 방법에 유용한 안전하고 기능적인 항체의 생성에 사용될 수 있다. 소정 실시양태에서는, 베타 아밀로이드 및/또는 그의 병리학적 형태(들)에 특이적으로 결합되는 것으로 알려져 있는 항체의 CDR이 그와 같은 안전하고 기능적인 항체의 생성에 사용될 수 있다.
CDR 또는 가변 영역이 사용될 수 있는 예시적인 항체에는 표 2에 제시되어 있는 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
<표 2>
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 CDR은 하기와 같다: 중쇄의 CDR1은 서열 1의 아미노산 서열을 가지며; 중쇄의 CDR2는 서열 2의 아미노산 서열을 가지고; 중쇄의 CDR3은 서열 3의 아미노산 서열을 가지며; 경쇄의 CDR1은 서열 4의 아미노산 서열을 가지고; 경쇄의 CDR2는 서열 5의 아미노산 서열을 가지며; 경쇄의 CDR3은 서열 6의 아미노산 서열을 가짐.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 7의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다. 더 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 7의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 10의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다. 더 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 10의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
더욱 더 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 7의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 10의 아미노산 서열에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다.
일 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 7의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 10의 아미노산 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
mMABT 항체의 CDRL2 서열 ("KVSNRFS" (서열 5))은 항체 활성에 부정적인 영향을 주지 않으면서 약간 변형될 수 있다. 보존적 치환은 50 위치에서의 K 대신 R로의 교환 및 53 위치에서의 N 대신 S로의 교환을 통하여 이루어질 수 있다. 따라서, 2종의 대안적인 CDRL2 서열은 각각 "RVSNRFS" 및 "KVSSRFS"이다. 이들은 각각 mMABT VK-R 및 mMABT VK-S로서 다른 변화 없이 뮤린의 VK 서열에 도입된다.
5.3.3 항체의 구축
소정 실시양태에서는, 아밀로이드 단백질 또는 그의 병리학적 형태, 예컨대 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합되는 항체의 CDR이 본 발명의 안전하고 기능적인 항체에 부합하는 불변 영역 (단원 5.3.1)을 갖는 항체로 도입된다. 소정 실시양태에서는, 아밀로이드 단백질 또는 그의 병리학적 형태, 예컨대 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합되는 항체의 가변 영역이 본 발명의 안전하고 기능적인 항체에 부합하는 불변 영역 (단원 5.3.1)과 조합된다.
인간화 항체의 구축 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 인간화 항체의 생성 방법에 대해서는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2008/011348 공개의 국제 특허 출원 번호 PCT/US2007/073504에 기술되어 있다.
5.3.4 안전성에 대한 시험
항-베타 아밀로이드 항체를 사용한 알츠하이머병의 치료시 관찰되는 부작용에는 염증성 부작용, 예컨대 수막염 및 수막뇌염, 그리고 뇌에서의 액체 축적 (뇌 부종)이 포함된다. 기타 부작용으로는 유해 면역 반응, 즉 투여된 항-베타 아밀로이드 항체에 대항하는 환자에 의한 면역 반응이 포함된다.
5.3.4.1 유해 면역 반응
항-베타 아밀로이드 항체를 투여받은 환자에서 모니터링될 수 있는 한가지 부작용은 항체에 대한 항체 반응이다. 해당 유해 면역 반응의 정도를 검출, 모니터링 또는 정량하는 것으로 당업자에게 알려져 있는 어떠한 기술도 사용될 수 있다. 그와 같은 항체 반응은 항체가 항-베타 아밀로이드 항체에 결합되는 경우에 발생한다. 가용성인 항원이 혈관 구획(vascular compartment)에서 항체와 조합되는 경우, 그들이 순환성의 면역 복합체를 형성하고, 그것은 다양한 기관의 혈관 상(vascular bed)에서 비특이적으로 포획됨으로써, 소위 면역 복합체 질환, 예컨대 혈청병, 혈관염, 신장염, 혈관염을 동반한 전신 홍반성 루푸스, 또는 사구체신염을 야기할 수 있다.
면역 복합체 질환은 당업계에 알려져 있는 어떠한 방법을 사용하여서도 검출 및/또는 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 면역 복합체 시험이 혈액 중 순환성 면역 복합체를 입증함으로써 면역 복합체 질환의 중증도를 평가하는 데에 사용될 수 있다. 면역 복합체 시험은 당업자에게 알려져 있는 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 구체적으로, 면역 복합체 시험은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 4,141,965, U.S. 특허 번호 4,210,622, U.S. 특허 번호 4,210,622, U.S. 특허 번호 4,331,649, U.S. 특허 번호 4,544,640, U.S. 특허 번호 4,753,893, 및 U.S. 특허 번호 5,888,834에 기술되어 있는 방법들 중 임의의 1종 이상을 사용하여 수행될 수 있다.
또 다른 방법은 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 검출하는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 면역검정의 사용이다. 문헌 [Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists]; [Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W]; 프레스타(Presta)의 U.S. 특허 번호 6,737,056; 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612)]; WO96/13590; 및 WO96/29605를 참조하라.
5.3.4.2 부종
항-베타 아밀로이드 항체를 투여받은 환자에서 모니터링될 수 있는 한 가지 부작용은 예를 들면 MRI 스캔, DCE-MRI 스캔, PET 스캔, 및/또는 CT 스캔에 의해 평가될 수 있는 부종, 특히 뇌 부종이다. 부종의 정도를 검출, 모니터링 또는 정량하는 것으로 당업자에게 알려져 있는 어떠한 기술도 사용될 수 있다. 부종은 부종의 동물 모델에서 측정될 수도 있다. 이와 같은 방법들에서는, 부종 부피 (타측의 것 중 동측 반구 부피의 반구 부피)가 계산된다.
CT 및 T1-칭량 MRI에서는, 뇌 부종이 저밀도 또는 고강도 병변으로 가시화될 수 있다. 뇌척수액과 같이 높은 물 함량을 갖는 뇌 부종 및 기타 구조가 T2-칭량 MRI에서는 고강도이다. 뇌 부종이 등강도 또는 고강도 배경에 대비되는 고강도 병변으로서 선명하게 가시화되기 때문에, 유체-감쇠 역전-회복(Fluid-attenuated inversion-recovery) MR 영상은 추가적인 정보를 제공한다.
5.3.4.3 수막염
항-베타 아밀로이드 항체를 투여받은 환자에서 모니터링될 수 있는 한 가지 부작용은 수막염이다. 수막염의 정도를 검출, 모니터링 또는 정량하는 것으로 당업자에게 알려져 있는 어떠한 기술도 사용될 수 있다. 운동 및 감각 기능; 신경 기능; 듣기 및 말하기; 시력; 조정 및 균형; 정신 상태; 및 기분 또는 행동의 변화를 평가하도록 설계된 일련의 시험들을 포함하는 신경학적 조사가 수행될 수도 있다. 신경계의 기능은 소리 굽쇠, 소형 전등, 반사 망치 및 핀과 같은 물품들을 이용한 강도 및 감각의 시험을 통하여 평가될 수 있다.
뇌 및 척수를 둘러싸 보호하는 뇌척수액을 분석하는 것은 급성 및 만성 염증을 검출할 수 있다. 척추 천자 (또는 요추 천자)로 알려져 있는 절차에서, 하배부(lower back)에 삽입된 특수 바늘에 의해 소량의 뇌척수액을 분리한다. 샘플링 전에, 피부는 국소 마취제에 의해 마비된다. 건강한 사람에서는 완전히 투명한 액체를 시험하여, 박테리아 또는 혈액의 존재를 검출함은 물론, 글루코스 수준 (낮은 글루코스 수준은 박테리아 또는 진균성 수막염의 신호임) 및 백혈구 (백혈구 계수의 상승 역시 감염의 신호임)를 측정한다. 절차는 보통 병원에서 수행되며, 약 45분이 걸린다.
수막염 진단에 도달하기 위해서는, 비침습성 영상화 절차가 일상적으로 사용된다. 그와 같은 컴퓨터-보조 영상화는 뇌 염증; 내출혈 또는 출혈; 및 수막염과 연관될 수 있는 기타 뇌 이상의 신호를 밝힐 수 있다. CT 스캔으로도 알려져 있는 컴퓨터 단층촬영은 x-선과 컴퓨터 기술을 조합하여 골, 기관 및 조직의 빠르고 선명한 2-차원 영상을 생성시킨다. 때로는 뇌에서 상이한 조직들을 눈에 띄게 함으로써 수막의 염증을 검출하기 위하여, 조영 염료가 혈류에 주사된다. 자기 공명 영상화 (MRI)는 컴퓨터-생성 라디오파 및 강한 자석을 사용하여 조직, 기관, 골 및 신경을 포함한 신체 구조의 세부 영상을 생성시킨다. 더 상세하기 밝히기 위하여, 시험 전에 조영 염료가 주사될 수 있다. 수막염 진단을 보조하기 위하여 사용되는 또 다른 영상화 기술은 초음파이다.
뇌파검사, 또는 EEG는 두개골을 통하여 뇌의 전기적 활성을 모니터링함으로써, 수막염과 연관된 비정상적인 뇌파를 확인할 수 있다. EEG는 뇌의 염증 진단을 보조하는 데에 사용된다.
5.3.5 기능성에 대한 시험
5.3.5.1 신경심리학적 시험
본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 1종 이상의 신경심리학적 시험을 사용하여 평가될 수 있다. 대표적인 신경심리학적 시험들이 하기되어 있는데, 여기에는 비제한적으로 알츠하이머병 등록 확립을 위한 콘소시움(The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease) ("CERAD"; 예를 들면 문헌 [Morris JC, Mohs RC, Rogers H, Fillenbaum G, Heyman A. Consortium to establish a registry for Alzheimer's disease (CERAD) clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer's disease. Psychopharmacol Bull. 1988;24(4):641-52]; [Morris JC, Heyman A, Mohs RC, Hughes JP, van Belle G, Fillenbaum G, Mellits ED, Clark C. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part I. Clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 1989 Sep;39(9):1159-65]; 및 [Welsh K, Butters N, Hughes J, Mohs R, Heyman A. Detection of abnormal memory decline in mild cases of Alzheimer's disease using CERAD neuropsychological measures. Arch Neurol. 1991 Mar;48(3):278-81] 참조)에 의해 확립되어 있는 것들이 포함된다.
일 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 알츠하이머병 평가 척도-인식 시험(Alzheimer Disease Assessment Scale-Cognitive test) ("ADAS-Cog"; 예를 들면 문헌 [Rosen WG, Mohs RC, Davis KL. A new rating scale for Alzheimer's disease. Am J Psychiatry. 1984 Nov; 141(11):1356-64]; [Ihl R, Brinkmeyer J, Janner M, Kerdar MS. A comparison of ADAS and EEG in the discrimination of patients with dementia of the Alzheimer type from healthy controls. Neuropsychobiology. 2000 Jan;41(2):102-7]; 및 [Weyer G, Erzigkeit H, anowski S, Ihl R, Hadler D. Alzheimer's Disease Assessment Scale: reliability and validity in a multicenter clinical trial. Int Psychogeriatr. 1997 Jun;9(2):123-38] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 알츠하이머병 등급화 척도에서의 행동 병리학(Behavioral Pathology in Alzheimer's Disease Rating Scale) ("BEHAVE-AD"; 예를 들면 문헌 [Reisberg B, Borenstein J, Salob SP, Ferris SH, Franssen E, Georgotas A. Behavioral symptoms in Alzheimer's disease: phenomenology and treatment. J Clin Psychiatry. 1987 May;48 Suppl:9-15] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 블레세드-치매 정보-기억-집중 시험(Blessed-Dementia Information-Memory-Concentration Test) (예를 들면 문헌 [Blessed G, Tomlinson BE, Roth M. The association between quantitative measures of dementia and of senile change in the cerebral grey matter of elderly subjects. Br J Psychiatry. 1968 Jul;114(512):797-811] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 캠브리지 신경심리학 시험 자동화 배터리(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery) ("CANTAB"; 예를 들면 문헌 [Swainson R, Hodges JR, Galton CJ, Semple J, Michael A, Dunn BD, Iddon JL, Robbins TW, Sahakian BJ. Early detection and differential diagnosis of Alzheimer's disease and depression with neuropsychological tasks. Dement Geriatr Cogn Disord. 2001;12:265-280]; [Fray PJ, Robbins TW. CANTAB battery: proposed utility in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 1996 Jul-Aug; 18(4):499-504]; 및 [Robbins TW, James M, Owen AM, Sahakian BJ, McInnes L, Rabbitt P. Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB): a factor analytic study of a large sample of normal elderly volunteers. Dementia. 1994 Sep-Oct;5(5):266-81] 참조)를 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 클락 드로우 시험(Clock Draw Test) (예를 들면 문헌 [Sunderland T, Hill JL, Mellow AM, Lawlor BA, Gundersheimer J, Newhouse PA, Grafman JH. Clock drawing in Alzheimer's disease. A novel measure of dementia severity. J Am Geriatr Soc. 1989 Aug;37(8):725-9]; 및 [Lee H, Swanwick GR, Coen RF, Lawlor BA. Use of the clock drawing task in the diagnosis of mild and very mild Alzheimer's disease. Int Psychogeriatr. 1996 Fall;8(3):469-76] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 치매에서의 우울증의 코넬 척도(Cornell Scale for Depression in Dementia) ("CSDD"; 문헌 [Alexopoulos GS, Abrams RC, Young RC, Shamoian CA. Cornell Scale for Depression in Dementia. Biol Psychiatry. 1988 Feb 1;23(3):271-84])를 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 노인의학 우울증 척도(Geriatric Depression Scale) ("GDS"; 예를 들면 문헌 [Burke WJ, Roccaforte WH, Wengel SP. The short form of the Geriatric Depression Scale: a comparison with the 30-item form. J Geriatr Psychiatry Neurol. 1991 Jul-Sep;4(3):173-8] 참조)를 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 간이 정신 상태 시험(Mini Mental State Exam) ("MMSE"; 예를 들면 문헌 [Folstein MF, Folstein SE, and McHugh PR. "Mini-Mental State": a practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J Psychiatr Res. 1975; 12:189-198]; 및 [Cockrell JR, and Folstein MF. Mini-Mental State Examination (MMSE). Psychopharm Bull. 1988;24(4):689-692] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 신경정신병 목록(Neuropsychiatric Inventory) ("NPI"; 문헌 [Cummings JL, Mega M, Gray K, Rosenberg-Thompson S, Carusi DA, Gornbein J. The Neuropsychiatric Inventory: comprehensive assessment of psychopathology in dementia. Neurology. 1994 Dec;44(12):2308-14]; [Cummings JL. The Neuropsychiatric Inventory: assessing psychopathology in dementia patients. Neurology. 1997 May;48(5 Suppl 6):S1O-6])을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 7분 스크린(7 Minute Screen) (예를 들면 문헌 [Solomon PR, Pendlebury WW. Recognition of Alzheimer's disease: the 7 Minute Screen. Fam Med. 1998 Apr;30(4):265-71]; 및 [Solomon PR, Hirschoff A, Kelly B, Relin M, Brush M, DeVeaux RD, Pendlebury WW. A 7 minute neurocognitive screening battery highly sensitive to Alzheimer's disease. Arch Neurol. 1998 Mar;55(3):349-55] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다.
5.3.5.2 생체내 영상화
대상체에서의 생체내 영상화를 사용하여, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성이 평가될 수 있다.
영상화 시약은 환자 신체에의 정맥내 주사에 의해, 또는 두개 주사 또는 두개골을 통과하는 구멍의 천공에 의해 직접 뇌로 투여될 수 있다. 시약의 투여량은 치료 방법에 관한 것과 동일한 범위 내의 것이어야 한다. 통상적으로, 시약은 표지되지만, 일부 방법에서는, 친화도를 갖는 1차 시약은 표지되지 않고, 1차 시약에 결합되는 2차 표지제가 사용된다. 표지의 선택은 검출 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 광학적 검출에는 형광 표지가 적합하다. 외과적 개입 없는 단층촬영 검출에는, 상자성 표지의 사용이 적합하다. 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 사용하여 방사성 표지가 검출될 수도 있다.
치료의 기능성은 표지된 부위의 수, 크기 및/또는 강도를 해당 기준선 값에 비교함으로써 평가될 수 있다. 기준선 값은 알츠하이머병을 가지지 않는 개체 군집에서의 평균 값을 나타낼 수 있다. 다르게는, 기준선 값은 동일 환자에서 측정된 이전의 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 치료를 개시하기 전에 환자에서 기준선 값이 측정된 후, 이후의 측정값이 기준선 값과 비교될 수 있다. 기준선에 비교한 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 나타낼 수 있다.
항-베타 아밀로이드 항체는 Aβ의 감축된(truncated) 형태가 뇌척수액 또는 다른 신체 조직 또는 체액에 존재하는지 여부를 측정하는 데에도 유용하다. 그와 같은 형태의 기준선에 비해 덜한 수준으로의 환자에서의 존재는 치료에 대한 양성 반응을 나타낼 수 있다.
(1) 양전자 방출 단층촬영
일 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 양전자 방출 단층촬영 (PET)과 함께 프로브로서 방사성-표지된 추적자를 사용하여 알츠하이머병의 병태생리를 모니터링하는 것에 의해 평가될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Nagren et al. 2009, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer's disease, published online December 22, 2009.] 참조). 예를 들면, 아밀로이드 플라크 부하를 영상화하기 위하여, 탄소-11-표지된 피츠버그 화합물 B가 PET와 함께 방사성추적자로서 사용될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Rinne 2010, Lancet Neurology 9:363-372] 참조). 아밀로이드 플라크 부하의 PET 영상화를 위한 다른 추적자로는 18F-표지된 스틸벤 및 스티릴피리딘 (예를 들면 문헌 [Kung et al. 2010, Journal of Medicinal Chemistry 53:933-941] 참조); 18F-표지된 벤조티아졸 (BTA)-유도체 3'-18FFPIB; 콩고-레드 유도체 SB-13의 11C- 및 18F-표지 버전; 그리고 아미노-나프틸 유도체 18FFDDNP (예를 들면 문헌 [Henriksen et al. 2008, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Suppl 1:S75-81] 참조)가 포함된다.
(2) 자기 공명 영상화
일 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 자기 공명 영상화 (MRI)를 사용하여 평가될 수 있다. MRI는 중추 신경계에서의 부피 변화를 평가하는 데에 (예를 들면 문헌 [Fagan et al. 2009, Annals of Neurology 65:176-183] 참조), 그리고 혈관성 부종을 정량하는 데에 (예를 들면 문헌 [Black et al. 2010, Alzheimer Disease and Associated Disorders 24:198-203] 참조) 사용될 수 있다.
5.3.5.3 동물 모델
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성은 알츠하이머병 모델을 사용하여 생체 내에서 시험될 수 있다. 그와 같은 동물 모델 알츠하이머병에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로 마우스, 래트 및 영장류를 사용한 모델들이 포함된다.
알츠하이머병의 대표적인 뮤린 모델에는 TgCRND8 마우스가 포함된다 (예를 들면 문헌 [Chishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001)]; [Janus, C. et al., Aβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408, 979-982 (2000)] 참조). TgCRND8 마우스는 인간에서 알츠하이머병을 야기하는 것으로 알려져 있는 2종의 과오 돌연변이(missense mutation) (KM670/671NL 및 V717F)를 보유하는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 이전유전자 (APP695)를 발현한다. 약 3개월령에, 이 마우스는 대뇌 Aβ 수준의 상승 및 대뇌 세포외 아밀로이드 플라크의 수 증가 둘다를 동반하는 진행성 공간 학습 결핍을 나타낸다. 6개월령까지, TgCRND8 마우스의 뇌에서의 Aβ의 수준, 및 아밀로이드 플라크의 형태구조, 밀도 및 분포는 충분히 확립된 알츠하이머병에 걸린 인간의 뇌에서 관찰되는 것과 유사하다. 알츠하이머병에 걸린 인간 환자에서와 마찬가지로, 마우스 모델의 생화학, 행동 및 신경병리학적 특징들은 촉진된 사망률을 동반한다. 알츠하이머병의 다른 대표적인 뮤린 모델에 대해서는 당업계에 알려져 있으며, 해당 마우스들이 상업적으로 입수가능하다 (예를 들면 더 잭슨 래보래토리(The Jackson Laboratory) 사의 웹사이트에서 구입가능한 알츠하이머병 마우스 모델 자원 참조).
알츠하이머병의 영장류 모델 역시 당업계에 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Wenk, 1993, Behavioural Brain Research 57(2):117-122]; 및 [Fainman et al., 2007, American Journal of Medical Genetics 144B(6):818-819] 참조).
동물 모델에서의 해당 알츠하이머병의 치료 후, 비제한적으로 하기하는 것들을 포함한 당업계 공지의 방법을 사용하여 치료의 기능성이 평가될 수 있다.
(1) 생존 조사
모든 사망 발생시에 생존 가능성을 계산함으로써 작은 샘플 크기에 적합화된 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 기술을 사용하여, 마우스의 생존 가능성이 평가될 수 있다. 생존의 분석을 위하여, 마우스는 대조 군 및 치료 군(들)로 군화될 수 있으며, 예컨대 타론-웨어(Tarone-Ware) 시험을 사용하여 군들 사이가 비교 평가될 수 있다.
(2) 모리스 수중 미로(Morris Water Maze) 시험
전기한 바와 같이 모리스 수중 미로 시험이 수행될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Morris, R. Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci Methods 11, 47-60 (1984)] 참조). 이 절차에서, 마우스는 물이 채워져 있으며 탈출 플랫폼이 물 표면 바로 아래에 잠겨 있는 순환 풀에 위치될 수 있다. 플랫폼에는, 가까운 시각적 신호를 향해 유영함으로써 동물이 그것을 찾을 수 있도록, 가시적인 마커가 위치될 수 있다 (다르게는, 플랫폼의 위치를 표시하는 형식적인 신호가 존재하지 않는 더 복잡한 형태의 시험이 마우스에게 제공될 수 있음. 이와 같은 형태에서는, 마우스가 원거리의 시각적 신호에 대비하여 플랫폼의 위치를 학습해야 함). 마우스가 수중에 머무는 시간의 길이가 인지 능력과 반비례하게 된다.
대표적인 시험은 하기와 같다: 1일차에 사전-훈련 없이, 숨겨진 플랫폼이 구비되는 모리스 수중 미로 시험에 마우스가 도입된다. 마우스는 일 당 6회 시도로 3일 동안 시험될 수 있다. 4일차에는, 풀로부터 플랫폼이 제거된 후, 각 마우스에 1회의 30-초 수영 탐사 시도가 제공될 수 있다. 마지막 날에는, 그의 수영 능력, 시야 및 일반적 인지를 평가하기 위하여, 신호 시험이 마우스에 제공될 수 있다. 신호 시험은 플랫폼이 시험에 사용되었던 것과 상이한 4분면에 위치되며 깃발로 표시될 수 있다는 것으로 구성될 수 있다. 플랫폼을 찾기까지 60초가 동물에게 허용될 수 있다. 플랫폼을 찾지 못하는 동물은 최종 공간 기억 분석에 사용되지 않는다. 행동 데이터는 반복 측정 인자로서 약물 또는 유전형 및 훈련 기간을 사용한 요인 분산 분석 (ANOVA)의 혼합 모델을 사용하여 분석될 수 있다.
(3) 운동 활성
운동 활성은 공지의 접근법들을 사용하여, 예를 들면 로타로드(rotarod) (샌디에고 인스트루먼츠(San Diego Instruments) 사, 캘리포니아 샌디에고 소재)를 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 전기한 바와 같이 (예컨대 문헌 [Masliah, et al. (2000)] 참조), 2일 동안 로타로드에서, 마우스가 분석될 수 있다. 그와 같은 분석에서, 1일차에, 마우스는 1회차는 10 rpm으로, 2회차는 20 rpm으로, 3회차 내지 5회차는 40 rpm으로, 5회 시도 동안 훈련될 수 있다. 2일차에는, 각각 40 rpm으로 7회 시도 동안 마우스가 시험될 수 있다. 시도시, 마우스는 개별적으로 실린더에 위치될 수 있으며, 시간 기간에 걸쳐 적절한 속도로 회전 속도가 증가된다. 마우스가 로드 상에서 머무는 시간의 길이 (추락 잠복기(fall Latency))가 기록되어 운동 기능의 척도로서 사용될 수 있다.
(4) 뇌 아밀로이드 부하
뇌 아밀로이드 부하는 하기와 같이 시험될 수 있다: 시험 동물로부터의 뇌가 제거될 수 있으며, 일 반구가 4% 파라포름알데히드에 고정된 후, 시상면 중앙에서 파라핀 왁스에 포매될 수 있다. 일련의 조직적인 균일한 무작위 절편을 생성시키기 위하여, 전체 반구에 걸쳐 5 마이크로미터 연속 절편들이 수집될 수 있다. 50 마이크로미터 간격의 일련의 절편들이 분석에 사용될 수 있다 (10-14개 절편/세트). 포름산을 사용한 항원 재생, 및 주 항-베타 아밀로이드 항체 (예컨대 다코(Dako) M-0872), 이어서 2차 항체 (예컨대 다코 스트렙트(Strept)ABC복합체/양고추냉이 키트)를 사용한 인큐베이션 후, 플라크가 확인될 수 있다. 최종 생성물은 디아미노벤지딘 (DAB)를 사용하여 가시화될 수 있으며, 예컨대 룩솔 패스트 블루를 사용하여 대비-염색될 수 있다. 아밀로이드 플라크 부하는 예를 들면 라이카(Leica) 현미경 및 히타치(Hitachi) KP-M1U CCD 비디오 카메라와 접속된 레코(Leco) IA-3001 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 평가될 수 있다. 다음에, 플라크 수 및 플라크 면적 측정을 위하여 현미경사진을 이진 영상으로 전환하는 데에는, 오픈랩(Openlab) 영상화 소프트웨어 (임프로비젼(Improvision) 사, 매사추세츠 렉싱턴 소재)가 사용될 수 있다.
(5) 혈장 및 뇌 아밀로이드 베타
하기와 같이 혈장 및 뇌에서 아밀로이드 베타의 수준이 측정될 수 있다: 완충된 수크로스 용액 중에서 반뇌 샘플이 균질화된 후, 이어서 가용성 아밀로이드 베타 수준의 경우 0.4% 디에틸아민/100 mM NaCl, 전체 Aβ의 단리의 경우 냉장 포름산 중 어느 것에 의해 균질화될 수 있다. 중화 후, 샘플은 희석된 후, 상업적으로 입수가능한 키트 (예를 들면 바이오소스 인터내셔날(BIOSOURCE International) 사에 의해 제공되는 것들)를 사용하여, Aβ에 대해 분석될 수 있다. Aβ 종에 대해서는, 우레아 겔을 사용하여 모든 분획상에서 웨스턴 블롯 분석이 수행될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Wiltfang, J. et al., Highly conserved and disease-specific patterns of carboxyterminally truncated Abeta peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 in Alzheimer's disease and in patients with chronic neuroinflammation J Neurochem 81, 481-496 (2002)] 참조). 아밀로이드 베타는 예를 들면 6E10 (바이오소스 인터내셔날 사) 및 강화 케미루미넨센스(Chemiluminenscence) (아머샴(Amersham) 사)를 사용하여 검출될 수 있다.
(6) 뇌에서의 APP의 분석
APP는 하기와 같이 뇌에서 검출될 수 있다: 20 mM 트리스 (pH 7.4), 0.25 M 수크로스, 1 mM EDTA 및 1 mM EGTA, 및 0.4% DEA (디에틸아민)/100 mM NaCl과 혼합된 프로테아제 억제제 칵테일 중에서 109,000×g로 마우스 반뇌 샘플이 균질화 및 회전될 수 있다. 상청액은 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 APP 수준에 대하여 분석될 수 있는 반면, 펠릿은 예를 들면 전기한 바와 같은 모노클로날 항체 C1/6.1을 사용하여 APP 전체단백질에 대하여 분석될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Chishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001)]; 및 [Janus, C. et al., A. beta, peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408, 979-982 (2000)] 참조).
(7) 장기 강화작용
표준의 절차를 사용하여, 마우스 해마의 CA1 구역에서 장 전위(field potential)가 기록될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Sarvey, J M, Burgard E C & Decker G. Long-term potentiation: studies in the hippocampal slice. J Neurosci Methods 28, 109-124 (1989)]; 및 [Stanton, P K & Sarvey J M. Norepinephrine regulates long-term potentiation of both the population spike and dendritic EPSP in hippocampal dentate gyrus. Brain Res Bull. 18, 115-119 (1987)] 참조). 마우스의 뇌가 제거될 수 있으며, 각 반구로부터의 해마가 분리될 수 있고, 그로부터 절편이 제조될 수 있다 (예를 들면 350 ㎛ 관상 절편이 제조될 수 있음). 절편은 NaCl-CSF를 함유하는 홀딩 챔버로 이동된 후, 1시간을 초과하여 회복될 수 있다. 일단 챔버에 위치되고 나면, 절편은 올리고머성 Aβ를 보존하기 위하여 15 ml의 ACSF를 함유하는 폐쇄 루프에 의해 연속적으로 관류될 수 있다. 안정 기준선 20분 후, 1 ml의 15× 농축 7PA2 조건화 배지가 관류 루프에 첨가될 수 있다. 기준선 자극 및 강직을 전달하기 위하여, 양극성 자극 전극 (예컨대 월드 프레시젼 인스트.(World Precision Inst.) 사에 의해 제공되는 것들)이 샤퍼 곁가지(Schaffer collateral)에 위치될 수 있다. ACSF를 함유하는 보로실리케이트 유리 기록 전극이 자극 전극으로부터 대략 75-200 ㎛에 위치될 수 있다. 자극의 강도 (통상적으로 10~20 μAmps 사이)는 최대 장 전위 반응의 25-40%를 수득하도록 설정될 수 있다. 시험 자극은 0.05 Hz로 전달될 수 있다. 장기 강화작용을 유도하기 위하여, 4회의 강직 (1초 동안 100 Hz)이 5분 간격으로 전달될 수 있다. 장 전위 반응은 예를 들면 악소패치(Axopatch) 200B를 사용하여 10배 증폭될 수 있다. 데이터는 10 kHz에서 샘플링되고, 2 kHz에서 필터링될 수 있다. 트레이스(trace)는 예를 들면 p클램프(pClamp) 9.2를 사용하여 분석될 수 있다. 장 전위의 기울기는 전체 반응의 대략 10-60%를 사용하여 추정될 수 있다.
(8) 시냅토피신(synaptophysin) 정량
파라포름알데히드-고정된 처리 및 대조 마우스의 3개의 균일하게 이격된 시상 절편(saggital section)에서, 시냅토피신 면역조직화학 염색이 수행될 수 있다. 절편들은 예를 들면 항-시냅토피신 IgG (1:40; 로슈 사, 퀘백 라발 소재)를 사용하여 시냅토피신에 대하여 면역표지될 수 있다. 디지털 영상이 촬영 및 분석될 수 있다. 각 절편 내에서, 3개의 무작위로 선택된 100 ㎛2 면적의 해마 CA1 영역이 시냅토피신 반응성 세포체 및 버튼(bouton)에 대하여 계수될 수 있다. 결과는 100 ㎛2 당 반응성 세포체 및 버튼의 수의 평균으로 표현될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Chen, F. et al. Carboxyl-terminal fragments of Alzheimer beta-amyloid precursor protein accumulate in restricted and unpredicted intracellular compartments in presenilin 1-deficient cells. J Biol. Chem. 275, 36794-36802 (2002)]; [Phinney, A. et al., No hippocampal neuron or synaptic bouton loss in learning-impaired aged β-amyloid precursor protein-null mice. Neuroscience 90, 1207-1216 (1999)] 참조).
(9) 조건화된 미각 기피
조건화된 미각 기피(conditioned taste aversion) (CTA)는 치료 제공 전 및 후의 동물의 인지 기능을 시험하는 데에 사용되는 매우 민감하고 잘 알려져 있는 표준 시험이다. CTA는 미각과 같은 새로운 자극과 불쾌함을 연관시키는 것을 학습함으로써, 새로운 자극에의 이후의 재-노출시 동물이 새로운 미각을 회피하도록 하는 동물의 능력을 시험하는 데에 사용된다. CTA는 다양한 피질 및 피질하 수준에서 뇌와 관련된다. 기피 행동을 생성시키는 것과 함께 정보를 올리고 내리는 것을 연결하는 결합은 상호연결 단위 중 어느 것에 영향을 주는 변화에 의해 감쇠되거나 강화될 수 있다. 결합 학습(associative learning)의 형태로서의 CTA의 강도는 몇 가지 거명하자면 경구 자극의 신규성 (예컨대 비-신규 자극은 기피 조건화될 수 없음), 생성되는 "불쾌함"의 정도 (독성), 반복의 수 (훈련), 계수 욕구 (예컨대 갈증)를 포함한 다수의 변수들에 의해 측정된다. 매우 다양한 화학 및 물리적 인자들이 용량-의존성 양식으로 CTA를 생성시킬 수 있지만, 염화리튬이 신뢰성 있게 권태감 및 식욕부진을 생성시킨다. 천연 발생 불쾌감과 마찬가지로, 리튬은 시토카인 방출을 포함한 상기한 경로를 자극하는 것에 의해 CTA를 생성시킨다.
(10) 반스 미로(Barnes Maze)
반스 미로는 탁자의 원주 부근에 원형의 구멍을 갖는 원형 탁자로 구성된다. 각 구멍의 아래에는, 드롭 박스(drop box)로 지칭되는 박스를 위한 슬롯이 존재한다. 미로에서의 동물의 목표는 개방된 상부를 가지며 탁자 상부의 구멍들 중 하나를 통하여 도달할 수 있는 박스인 드롭 박스에 도달하는 것이다. 탁자 표면에서의 노출은 부정적 강화로 기능함으로써, 시험 대상체가 피난처를 찾도록 동기를 부여한다. 가용한 유일한 피난처는 드롭 박스로써, 시험 대상체는 거기로 도망쳐야 한다. 시험 대상체를 미로에 익숙해지도록 하기 위하여, 상기 대상체는 구원의 손길(sheltering hand)에 의해 드롭 박스로 안내된다. 4 내지 5회의 전개 후, 정상적인 시험 대상체는 빠르게 드롭 구멍의 위치를 찾아낼 수 있다. 플랫폼 부근에 설정된 고정된 시각적 신호가 시험 동안 설치류를 배향시키는 기능을 한다.
수행도는 통상적으로 대상체가 만들어내는 오류의 수, 즉 그것이 그의 코를 드롭 박스를 포함하지 않는 원형의 구멍에 찔러 넣거나, 또는 그의 머리가 그 위에서 헤매는 회수에 의해 측정된다. 대상체들간에 오류/시도 수의 감소율이 측정된다. 다른 수행도 값이 측정될 수도 있는데, 예를 들면 각 설치류에 의해 사용되는 전략이 무작위 (각 구멍을 무작위로 점검함), 체계적 (각 구멍을 양식에 따라 점검함), 또는 공간적 (드롭 박스가 구비된 구멍으로 바로 이동함)으로 점수화될 수 있다.
(11) 지연 샘플 대응(Delayed Matching to Sample)
지연 샘플 대응 (DMTS) 절차는 보통 실험실 동물에서 공간적 인식 기억을 평가하는 데에 사용된다. 대표적인 프로토콜에서, 대상체는 2개의 철수가능 레버 및 음식물 펠릿 분배기가 장착된 챔버에 위치된다. 일정 시간 기간 후, 하나의 샘플 레버가 제공되는데, 음식물을 얻기 위해서는 대상체가 레버를 눌러야 한다. 다음에, 레버는 철수되고, 상이한 기간의 지연 후, 다시 양 레버가 제시되면, 대상체는 선택을 할 필요가 있다. 대응 조건하에서, 올바른 반응은 이전에 제시되었던 것으로서 음식물 펠릿의 전달로 보상되는 레버를 누르는 것으로 구성될 것이다. 올바르지 않은 반응은 방의 불이 꺼지는 5초의 중간휴식 기간으로 처벌된다. 대상체의 올바른 반응 및 올바르지 않은 반응의 수를 분석함으로써, 작업 기억(working memory)이 측정된다.
(12) 소교세포 활성화
소교세포의 활성화는 알츠하이머병의 치료에서 유익한 역할을 제공할 수 있다. 따라서, 소교세포 활성화를 측정하는 공지의 방법을 사용하여, 본원에서 기술되는 알츠하이머병 치료의 기능성이 평가될 수 있다 (예를 들면 문헌 [Higuchi, 2009, Current Alzheimer Research 6:137-143] 참조). 그와 같은 방법은 대조 대상체의 것과 비교하여 치료된 대상체의 소교세포 활성화 수준을 측정하는 데에 PET 영상화를 포함하여 상기한 것들과 같은 영상화 기술들을 활용한다.
5.4 치료 방법
본원에서 제공되는 것은 안전하고 기능적인 항체를 사용하는, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 안전하고 기능적인 치료 방법이다. 소정 실시양태에서, 방법은 면역 이펙터 세포에서 p38 MAP 키나제가 중간 수준으로 활성화되도록 용량 및/또는 투여 요법을 사용하는, 아밀로이드 단백질 및/또는 그의 병리학적 형태, 예컨대 응집체에 특이적으로 결합되는 비-IgG1 항체의 투여를 포함한다. 본 단원에서 사용될 때의 p38 MAP 키나제 활성화와 관련된 "중간 수준"이라는 용어는 항체의 부재시보다는 더 높지만, 동일한 결합 특이성을 가지나 IgG1 항체의 불변 영역을 갖는 항체의 존재시보다는 더 낮은 수준을 의미한다. p38 MAP 키나제 활성화 수준은 단원 5.1에 제시되어 있는 바와 같이 측정될 수 있다.
소정 실시양태에서, 아밀로이드 단백질 및/또는 그의 병리학적 형태, 예컨대 응집체에 특이적으로 결합되는 비-IgG1 항체는 소교 세포와 같은 면역 이펙터 세포로의 아밀로이드 베타 단백질과 같은 표적 항원의 최대 내재화, 그리고 중간 수준의 p38 MAP 키나제 활성화를 초래하는 용량 및/또는 투여 요법을 사용하여 투여된다. 소정 실시양태에서는, p38 MAP 키나제가 중간 수준으로 활성화되도록, 항체가 p38 MAP 키나제 경로의 조절인자와 조합되어 투여된다.
소정 실시양태에서, 본원의 방법에 사용될 비-IgG1 항체는 인간 IgG4 항체의 불변 영역을 갖는 항체이다. 소정 실시양태에서, 비-IgG1 항체는 인간 IgG4 항체의 CH2 도메인을 갖는 IgG 항체의 불변 영역을 가진다. 소정 실시양태에서는, 인간 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합되는 공지 비-인간화 항체의 CDR (하기 표 2 참조)이 인간 IgG4 항체의 불변 영역과 조합되며, 항체 CDR들 사이의 프레임워크 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4와 같은 인간 IgG 항체의 프레임워크 영역으로 대체된다. 소정 실시양태에서는, 공지의 인간화 항-베타 아밀로이드 항체, 예컨대 바피뉴주맙 또는 솔라네주맙의 가변 영역이 인간 IgG4 항체의 불변 영역과 조합된다.
소교세포 내로의 베타 아밀로이드 내재화 및 p38 MAP 키나제 활성화는 당업자에게 알려져 있는 어떠한 기술을 사용하여서도 측정될 수 있다. 소정 실시양태에서, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료에 사용될 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 투여량은 단원 5.1에 기술되어 있는 세포-기반 검정 시스템을 사용하여 결정된다. 구체적으로, 투여량은 소교세포 내로의 베타 아밀로이드의 내재화는 최대화되는 반면, p38 MAP 키나제 경로의 활성화는 IgG1 이소형 항 베타 아밀로이드 항체의 존재하에서 p38 MAP 키나제가 활성화되는 것에 비해 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 덜 활성화되도록 조정된다.
소정 실시양태에서, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료에 사용될 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 투여 요법은 단원 5.1에 기술되어 있는 세포-기반 검정 시스템을 사용하여 결정된다. 구체적으로, 투여량은 소교세포 내로의 베타 아밀로이드의 내재화는 최대화되는 반면, p38 MAP 키나제 경로의 활성화는 IgG1 이소형 항 베타 아밀로이드 항체의 존재하에서 p38 MAP 키나제가 활성화되는 것에 비해 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 덜 활성화되도록 조정된다.
소정 실시양태에서, 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 투여량은 소교세포 내로의 베타 아밀로이드의 내재화는 최대화되는 반면, p38 MAP 키나제 경로의 활성화는 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준을 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 상회하여 활성화되도록 조정된다.
소정 실시양태에서, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함한 아밀로이드증의 치료에 사용될 본 발명의 안전하고 기능적인 항체의 투여 요법은 단원 5.1에 기술되어 있는 세포-기반 검정 시스템을 사용하여 결정된다. 구체적으로, 투여량은 소교세포 내로의 베타 아밀로이드의 내재화는 최대화되는 반면, p38 MAP 키나제 경로의 활성화는 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준을 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 상회하여 활성화되도록 조정된다.
구체적인 실시양태에서, 아밀로이드증은 알츠하이머병이며, 아밀로이드 단백질은 베타 아밀로이드이고, 면역 이펙터 세포는 소교 세포이다. 방법 및 조성물이 구체적으로 알츠하이머병에 대하여 더 상세하게 제시되고 있기는 하지만, 비제한적으로, 본 방법 및 조성물은 비제한적으로 예를 들면 경증 인지 손상 (MCI), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈 (네델란드 유형)과 같이 인지 기억 능력의 상실을 특징으로 하는 질환 또는 이상을 포함한 알츠하이머병 (AD)과 같은 신경학적 장애를 포함한 질환과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증; 괌 파킨슨-치매 복합증은 물론; 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증과 같이 아밀로이드-유사 단백질을 바탕으로 하거나 그와 연관되어 있는 다른 질환; 크로이츠펠트 야곱병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 봉입체 근염 (IBM), 성인 발병 당뇨병, 내분비 종양, 및 노인성 심장 아밀로이드증; 및 황반 변성, 드루젠-관련 시신경병증, 및 베타-아밀로이드 침착으로 인한 백내장을 포함한 다양한 눈 질환을 포함한 아밀로이드증들의 치료 및 예방에 일반적으로 적용가능하다. 구체적인 실시양태에서, 아밀로이드증은 알츠하이머병이며, 환자는 인간 환자이다.
소정 실시양태에서, 알츠하이머병은 본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체, 및 알츠하이머병의 치료에 현재 사용되고 있는 하기의 약물들 중 1종 이상, 예컨대 타크린 (코그넥스 사, 뉴저지 모리스 플레인 소재), 도네페질 (아리셉트 사, 일본 도쿄 소재), 리바스티그민 (엑셀론 사, 뉴저지 이스트 하노버 소재), 갈란타민 (레미닐 사, 뉴저지 뉴 브룬스위크 소재), 및 메만틴 (나멘다 사, 뉴욕 뉴욕 소재)의 조합을 사용하여 치료된다.
5.5 제약 제제 및 투여
본원에서 제공되는 안전하고 기능적인 항체 (단원 5.2)는 생리학적으로 허용가능한 제제화에서 제조될 수 있으며, 공지의 기술을 사용하여 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 기술되는 바와 같은 안전하고 기능적인 항체는 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합되어 치료 조성물을 형성한다. 적합한 제약 담체, 희석제 및/또는 부형제에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 여기에는 예를 들면 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등이 포함된다.
본원에서 제공되는 제약 조성물의 제제화는 당업자에게 알려져 있는 표준의 방법론에 따라 성취될 수 있다.
본원에서 제공되는 제약 조성물은 적합하고 제약상 기능적인 용량의 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예에는 환제, 크림, 및 이식가능 투여 단위가 포함된다. 환제는 경구로 투여될 수 있다. 치료용 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 이식가능 투여 단위는 국소적으로, 예를 들면 종양 부위에 투여될 수 있거나, 또는 치료 조성물의 예컨대 피하로의 체계적인 방출을 위하여 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예에는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 주사에 적합한 제제, 및 국소 및 안내 투여용 제제가 포함된다. 에어로졸 제제의 예에는 폐에의 투여를 위한 흡입기 제제가 포함된다.
조성물은 표준의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 국소, 경구, 직장, 비내, 피간(interdermal), 복강내, 또는 비경구 (예를 들면 정맥내, 피하, 또는 근육내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 조성물이 생분해성 중합체와 같은 지속 방출 매트릭스에 도입된 후, 상기 중합체가 예를 들면 종양 부위의 전달이 필요한 근접부에 이식될 수 있다. 방법은 단일 용량의 투여, 예정된 시간 간격의 반복 용량의 투여, 및 예정된 시간 기간 동안의 지속 투여가 포함된다.
본원에서 사용될 때, 지속 방출 매트릭스는 보통 효소적 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해가능한 중합체인 물질로 제조되는 매트릭스이다. 일단 신체에 삽입되고 나면, 효소 및 체액이 매트릭스에 작용하게 된다. 지속 방출 매트릭스는 바람직하게는 리포솜, 폴리락티드 (폴리락티드 산), 폴리글리콜리드 (글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히아루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생체적합성 물질로 선택된다. 본 발명의 목적에 통상적으로 사용되는 생분해성 매트릭스에는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 공중합체) 중 어느 하나의 매트릭스가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
조성물의 투여량이 예를 들면 치료되는 이상, 사용되는 구체적인 조성물, 및 기타 임상적 요인 예컨대 환자의 연령, 체구, 성별 및 일반적인 건강 상태, 신체 표면적, 투여될 구체적인 화합물 또는 조성물, 동시에 투여되는 다른 약물, 및 투여 경로와 같은 다양한 인자들에 따라 달라지게 된다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다.
조성물은 본 발명에 따른 항체, 및 임의로 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제, 및 질환의 치료 절차와 함께, 생물학적으로 활성인 물질 또는 화합물, 특히 산화적 스트레스에 대응하는 화합물, 항-아폽토시스 화합물, 금속 킬레이터, DNA 복구의 억제제 예컨대 피렌제핀 및 대사물, 3-아미노-1-프로판술폰산 (3APS), 1,3-프로판디술포네이트 (1,3PDS), α-세크레타제 활성화제, β- 및 γ-세크레타제 억제제, 타우 단백질, 신경전달물질, β-시트 파괴제, 베타 아밀로이드 제거/고갈 세포성 구성요소에 대한 유인제, 피로글루타메이트화 아밀로이드 베타 3-42를 포함한 N-말단 감축 베타 아밀로이드의 억제제, 항-염증 분자, "비정형 항정신병제" 예를 들자면 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀 또는 콜린에스테라제 억제제 (ChEI) 예컨대 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 및/또는 갈란타민, M1 효능제 및 임의의 아밀로이드 또는 타우 변형 약물을 포함한 기타 약물, 및 영양 보충제 예를 들자면 비타민 B12, 시스테인, 아세틸콜린의 전구체, 레시틴, 콜린, 징코 빌로바, 아시에틸-L-카르니틴, 이데베논, 프로펜토필린, 또는 크산틴 유도체로 구성되는 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함하는 다른 조성물과 조합되어 투여될 수 있다.
투여는 일반적으로 비경구로, 예컨대 정맥내로일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 수성 용매는 염수 및 완충된 매질을 포함한 물, 알콜/수용액, 에멀젼 또는 현탁액으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 비경구 담체에는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스 기반의 것들) 및 기타가 포함된다. 예컨대 항미생물제, 항-산화제, 킬레이팅제, 불활성 기체 등과 같은 보존제가 존재할 수도 있다.
제약 조성물은 추가적으로 예컨대 특히 인간 기원의 혈청 알부민 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질성 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물에는, 그의 의도하는 용도에 따라, 추가적인 생물학적 활성제가 존재할 수도 있다.
결합 표적이 뇌에 위치하는 경우, 본 발명의 소정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 그의 활성 단편을 제공한다. 소정의 신경변성 질환은 혈액-뇌 장벽 투과도의 증가와 연관되어 있어서, 항체 또는 그의 활성 단편이 용이하게 뇌로 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 손상되지 않고 남아 있는 경우, 그것을 건너 분자를 수송하기 위한 몇 가지 당업계-공지의 접근법들이 존재하며, 거기에는 물리적 방법, 지질-기반의 방법, 및 수용체 및 채널-기반의 방법이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈액-뇌 장벽을 건너 항체 또는 그의 활성 단편을 수송하는 물리적 방법에는 혈액-뇌 장벽을 완전히 우회하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 우회법에는 뇌에의 직접 주사 (예를 들면 문헌 [Papanastassiou et al ., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 및 뇌에 전달 장치를 이식하는 것 (예를 들면 문헌 [Gill et al ., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 글리아델 웨이퍼스(Gliadel Wafers)™, 길드포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical) 사 참조)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 장벽에 구멍을 생성시키는 방법에는 초음파 (예를 들면 U.S. 특허 공개 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들면 고장성 만니톨 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)])의 투여에 의한 것), 예컨대 브래디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들면 U.S. 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 혈액-뇌 장벽을 벌리는 뉴런의 형질감염 (예를 들면 U.S. 특허 공개 번호 2003/0083299 참조)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈액-뇌 장벽을 건너 항체 또는 그의 활성 단편을 수송하는 지질-기반의 방법에는 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피상 수용체에 결합되는 항체 결합 단편에 연결되는 리포솜 내에 항체 또는 그의 활성 단편을 캡슐화하는 것 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 20020025313 참조), 및 저-밀도 지단백질 입자 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 20040131692 참조)에서 항체 또는 그의 활성 단편을 코팅하는 것이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈액-뇌 장벽을 건너 항체 또는 그의 활성 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반의 방법에는 혈액-뇌 장벽의 투과도를 증가시키는 글루코코르티코이드 차단제를 사용하는 것 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널을 활성화시키는 것 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 2005/0089473 참조); ABC 약물 수송체를 억제하는 것 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 2003/0073713 참조); 트랜스페린을 사용하여 항체를 코팅하고 1종 이상 트랜스페린 수용체의 활성을 조절하는 것 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 번호 2003/0129186 참조); 및 항체를 양이온화하는 것 (예를 들면 U.S. 특허 번호 5,004,697 참조)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
당업자라면, 일상적인 수준을 넘지 않는 실험을 사용하여, 본원에서 기술되는 본 발명의 구체적인 실시양태들에 대한 많은 등가물들을 찾아내거나 확인할 수 있을 것이다. 그와 같은 등가물들은 하기하는 청구범위에 포괄되는 것으로 하고자 한다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌들은 전체적으로 그리고 모든 목적에 있어서, 각 개별 공개 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함되는 것이라고 구체적이고도 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도까지, 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 본원에서 기술되는 구체적인 실시양태에 의해 영역이 제한되어서는 아니 된다. 사실상, 당업자라면, 전기한 설명 및 첨부 도면으로부터, 본원에서 기술되는 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형들이 떠오르게 될 것이다. 그와 같은 변형들은 첨부된 청구범위의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다.
6. 실시예
6.1 다중의 Aβ 입체형태에 동일하게 결합되는 인간화 IgG4 항체의 식별
전기한 바와 같은 리포솜 백신 제제를 사용하여 Aβ 펩티드 항원으로 마우스를 면역화함으로써, 뮤린 항-Aβ 모노클로날 항체를 생성시켰다 (문헌 [Muhs et al., 2007]). 다중의 Aβ 종에 결합되는 능력, 및 소형 세포독성 펩티드 응집체로의 Aβ1-42 조립을 억제하는 능력을 포함한 몇 가지 기준을 사용하여 후보 항체를 선택하였다. 알츠하이머병의 단일-트랜스제닉 뮤린 돌연변이 인간 APP 및 이중-트랜스제닉 뮤린 돌연변이 인간 APP/PS1 모델 모두를 사용한 생체내 기능성 연구를 위해, IgG2b 백본을 갖는 모노클로날 뮤린 mAb (mMABT)를 선택하였다. mMABT를 사용한 치료는 기억을 향상시키고 플라크 부하를 감소시켰다 (도 7 참조). mMABT를 더 친화도 성숙시키고, 인간 IgG4 백본으로 인간화하였다 (생성되는 항체 역시 "MABT"로 지칭됨). 시험관 내에서의 Aβ에 대한 MABT의 결합을 시험하기 위하여, 일련의 상이한 Aβ1-42 조제물들을 제조하여 특성화하였다. 이들은 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 단리된 단량체성 및 올리고머성 Aβ1-42 분획으로부터, 성숙한 Aβ1-42 섬유, 내지 크기가 이량체 및 삼량체에서 더 고도 분자량의 다량체까지의 범위인 고도 신경독성 Aβ1-42 올리고머 조립체들의 더 복잡한 혼합물까지 다양하였다 (도 8 참조). ELISA에 의해 상이한 Aβ1-42 펩티드 조제물들에 대한 MABT의 결합을 측정하였는데, mABT와 유사하게, 상이한 Aβ1-42 조립 상태들 간에 고도로 유사한 것으로 나타났다 (도 1a-c).
이후, 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)을 발현하는 트랜스제닉 마우스의 뇌에서의 Aβ 플라크, 및 인간 AD 뇌 절편에서의 아밀로이드 플라크에의 결합에 대하여 MABT를 시험하였다. hAPP 트랜스제닉 마우스 (도 1d 상부) 및 AD 뇌 (도 1d 하부) 모두에서의 아밀로이드 플라크를 MABT 모노클로날 항체로 면역장식(immunodecoration)하였다. 종합하면, 이들 데이터는 AD 뇌에 존재하는 가용성 신경독성 Aβ 올리고머 및 Aβ 조립체 모두에 대한 MABT 결합의 강한 증거를 제공한다.
6.2 병리학적 Aβ 조립체의 억제 및 사전-형성된 원시섬유성 Aβ1-42 펩티드의 응집해제
시험관내 데이터는 Aβ와 조합되었을 때 항-Aβ 항체가 병리학적 고도-수준의 Aβ 조립체 형성을 예방하고 사전-형성된 Aβ 응집체를 역전시킬 수 있음을 나타내었다 (문헌 [Legleiter et al., 2004]; [Solomon et al., 1997]). MABT 모노클로날 항체의 결합 에피토프는 Aβ1-42의 아미노산 14 내지 23에 대하여 맵핑되었으며, 그에 따라 자가-회합, 이후의 올리고머화를 담당하는 Aβ1-42의 주 소수성 양이온 분절, 및 Aβ1-42 β-시트 조립체의 코어와 중첩된다 (문헌 [Pike et al., 1993]; [Esler et al., 1996]; [Haass and Selkoe, 2007]). 아밀로이드 조립은 방해하지 않으나 β-시트가 풍부한 소형 아밀로이드 응집체에 결합시 형광을 발하는 염료인 티오플라빈-T (ThT)를 사용하여 (문헌 [Levine, III, 1993]), 시험관내 Aβ1-42 응집에 대한 MABT의 효과를 시험하였다. Aβ1-42의 N-말단에 대하여 유도된 (및 그에 따라 자가-조립 도메인을 형성하는 코어 아미노산과 중첩되지 않는) 대조 항-Aβ 모노클로날 항체와 비교하였을 때, MABT는 Aβ1-42 응집 (도 1e 좌측 패널) 및 사전-응집된 Aβ1-42 펩티드의 소산 (도 1e 우측 패널)에 대한 강한 억제 효과를 나타내었다. Aβ의 N-말단에 대하여 유도된 대조 모노클로날 항체는 두 검정 모두에서 항-중앙-도메인 MABT 모노클로날 항체에 비해 대략 절반의 억제 활성을 가졌다. MABT를 항-C-말단 항-Aβ 모노클로날 항체와 비교하였을 때에도 유사한 결과가 수득되었다 (미제시). 이러한 시험관내 검정은 A베타1-42 펩티드의 연장된 β-시트에 결합되는 ThT의 능력에 기초한다 (문헌 [Levine, III, 1993]). 따라서, 이것이 β-시트 풍부 Aβ1-42에 결합되는 ThT의 잠재적인 모노클로날 항체-매개 치환으로 인한 인위적 결과가 아니라는 것을 입증하기 위하여, ThT 형광이 아니라 고정된 비-표지 Aβ1-42 상으로 응집 또는 자가-조립되는 표지된 Aβ1-42의 능력에 의존하는 검정을 수행하였다. 이와 같은 검정에서도 유사한 결과가 수득되었는데, 즉 MABT가 용량-의존 방식으로 Aβ1-42의 자가-조립을 예방하였다 (도 1f). 이러한 데이터는 이와 같은 검정에서 MABT와 같이 Aβ의 중앙-도메인에 대하여 유도된 항체가 Aβ의 다른 도메인을 표적으로 하는 항체에 비해 Aβ1-42 원섬유 신장 및/또는 응집에 대하여 가장 견고한 억제 효과를 제공한다는 것을 나타낸다.
가용성 및 막-결합 모두의 다른 단백질에 결합되는 가용성 Aβ1-42 올리고머의 능력이 그의 독성에 기여하는 것으로 제시된 바 있다 (문헌 [Strittmatter et al., 1993]; [Liu et al., 2009]). Aβ1-42에 대한 ApoE4의 상호작용 부위는 아미노산 18 내지 28을 필요로 한다 (문헌 [Strittmatter et al., 1993]). 재조합 인간 ApoE4에 결합되는 Aβ1-42에 대한 MABT의 효과를 시험관 내에서 시험하고, Aβ1-42의 N- 또는 C-말단에 특이적인 모노클로날 항체와 비교하였다. ApoE4 및 Aβ1-42의 포화 농도가 사용되는 조건하에서, MABT는 Aβ1-42와 ApoE4 상호작용의 80% 이상을 억제하였는데, 이는 시험된 다른 모노클로날 항체들 중 어느 것을 사용한 것보다도 더 컸다 (도 9 참조). 요약하자면, 이러한 데이터는 MABT가 독성인 생물학적 활성 조립체 상태로의 Aβ1-42의 추가적인 올리고머화를 예방하고, 이미 응집되었거나 플라크에 결합된 Aβ1-42를 소산시킨다는 것을 보여준다. 또한, 중앙에 위치하는 결합 에피토프를 사용하여, MABT는 ApoE와 같은 다른 단백질에 대한 Aβ 펩티드의 상호작용에 대하여 경쟁함으로써, 자가-회합을 포함하여 Aβ 중앙 도메인의 아미노산을 필요로 하는 Aβ와의 상호작용을 차단할 수 있다.
6.3 시험관 내에서의 Aβ1-42 올리고머의 신경독성 효과에 대한 MABT -매개 중화
MABT 모노클로날 항체에 대한 치료 기능성을 보여주는 생화학 및 생체내 기능성 데이터 둘다에 따라, 세포독성 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 1차 세포-배양 모델에서의 MABT 모노클로날 항체의 효과를 시험하였다. P1 래트로부터의 1차 피질 배양물을 성장시키고, 유리 Aβ1-42 올리고머 또는 MABT에 복합체화된 올리고머로 처리하였다. 대조군으로는, 모든 실험에서 비-특이적 IgG 모노클로날 항체를 사용하였다. 24시간에 걸친 2.5 또는 5 μM Aβ1-42 올리고머를 사용한 피질 배양물의 처리는 세포 생존력의 지표인 MTT의 미토콘드리아 산화에 의해 측정되는 바의 대사 전환의 감소를 초래하였다 (도 2a). MABT 존재하에서의 5 μM까지의 Aβ1-42 올리고머 농도 (1:7.5의 MABT 대 Aβ1-42 올리고머 몰비)에 대하여, 독성으로부터의 완전한 해제가 관찰되었다. 이러한 결과를 확인하기 위해, 발광 검정을 사용하여 ATP 방출을 측정하였는데, 역시 유사한 MABT의 세포보호 효과를 나타내었다 (도 2b). Aβ1-42 매개 뉴런 세포 사멸에 대한 MABT의 효과를 추가적으로 평가하기 위하여, 마우스 배아 피질 뉴런을 6일 동안 배양물 중에서 유지하고, MABT와 함께 또는 그것 없이 4일 동안 Aβ1-42로 처리하였다. 대조 배양물은 건강한 형태구조를 나타내었다 (도 2c, 최좌측 패널). 4일 동안의 Aβ1-42를 사용한 처리는 액손 변성을 초래하였으며, 총 액손 수의 감소를 야기하였다 (도 2c, 중앙 패널). Aβ1-42와 MABT의 조합을 사용하여 처리된 세포는 대조군 세포와 유사한 것으로 보였다 (도 2c, 최우측 패널). 이러한 결과는 항-Aβ MABT 모노클로날 항체가 래트 피질 배양물을 급성 Aβ1-42 올리고머-매개 생존력 상실로부터, 및 배아 마우스 피질 뉴런을 Aβ1-42-유도성 변성으로부터 둘다 보호할 수 있음을 나타낸다.
6.4 세포-막과의 Aβ1-42 올리고머의 상호작용이 항-Aβ MABT mAb 에 의해 억제됨
Aβ 펩티드, 특히 응집 중간물 (문헌 [Bateman et al., 2007])은 세포 막에 존재하는 다양한 지질 및 단백질들과 결합하는 것으로 알려져 있다. MABT가 뉴런에 대한 Aβ1-42 올리고머의 결합을 감소시키거나 심지어는 차단함으로써 그의 신경보호 효과를 발휘할 수 있는지를 시험하였다. 막-결합 Aβ에 대한 면역형광 염색을 수행하였다. Aβ1-42 올리고머를 혼합 피질 배양물에 30분 또는 18시간 동안 적용한 후, Aβ에 대하여 배양물을 염색하고, 항체와 함께 뉴런-특이적 클래스 III β-튜불린인 TuJ1에 첨가하였다. Aβ1-42 올리고머를 사용한 피질 뉴런의 처리는 뉴런, 특히 신경 돌기와의 Aβ의 강한 결합을 초래하였다 (도 3a, 중앙 패널 및 삽입도). MABT와의 공동-처리는 Aβ1-42 올리고머의 뉴런과의 상호작용, 특히 뉴런 돌기에 결합되는 것을 차단하였다. 이와 같은 효과는 30분만큼 조기에 용이하게 관찰되었으며 (도 3a 및 3b), 처리 18시간 이상 동안 유지되었다 (도 3b). 본 검정에서 Aβ1-42 올리고머를 염색하는 데에 N-말단 항-Aβ mAb (클론 6E10)를 사용함으로써 (도 3a) MABT와 염색에 사용된 검출 모노클로날 항체 간의 간섭에 대한 가능성을 감소시키기는 하였지만, 하이라이트 플루오르(HiLyte Flour)-488 형광 표지된 Aβ1-42를 사용하여 이러한 결과를 확인하였다. 이와 같이 직접 표지된 Aβ1-42 펩티드를 사용하여 피질 배양물을 처리하는 것은 MABT가 1차 피질 배양물에서 뉴런 돌기에 대한 Aβ1-42의 결합을 감소시켰다는 결론을 추가적으로 지지하였다 (도 3c 및 3d).
뉴런내 Aβ1-42의 축적이 뉴런 기능장애에 상당히 기여하는 것으로 나타난 바 있다 (문헌 [Casas et al., 2004]; [Wirths et al., 2001]; [Cleary et al., 2005]; [Oddo et al., 2003]). ELISA 검정을 사용하여, 트립신-제거 세포에서 Aβ1-42의 세포내 축적을 측정하였다. 이와 같은 분석은 MABT가 Aβ1-42 올리고머 내재화를 60%가 넘게 감소시켰다는 것을 입증하였다 (도 3e). 예상외로, 면역형광 연구에서의 관찰 역시 MABT 존재하에서는 Aβ1-42 올리고머 회합이 뉴런 돌기로부터 벗어나 소교 세포와 유사한 세포 윤곽을 향해 이동하는 것이 존재함을 시사하였다 (도 3f).
6.5 Aβ1-42 올리고머의 소교세포 흡수
MABT/Aβ1-42 복합체 형성과 Aβ1-42의 소교세포 흡수 사이의 관계를 조사하였다. MABT에 복합체화된 Aβ1-42 올리고머가 소교세포에 의해 흡수된다는 것을 증명하기 위하여, 처리된 혼합 뉴런 배양물에 대한 공초점 영상화를 수행하였다. Aβ1-42 올리고머 단독으로 처리된 세포와 비교할 때, MABT가 소교세포인 것으로 보이는 세포 윤곽으로의 Aβ1-42 올리고머의 빠른 흡수를 매개한다는 것이 발견되었다 (도 4a). 이것은 처리 후 30분만큼 조기에 빠르게 나타났다. 소교세포는 Aβ의 흡수 및 분해에 결정적인 역할을 하는데, 이는 APP 마우스에서는 훼손되어 있는 기능이다 (문헌 [Hickman et al., 2008]). 항-Aβ 면역요법과 비교할 때, Aβ 플라크가 제거되는 한 가지 가능한 기작은 Aβ에 결합된 항-Aβ의 FcγR-결합 특성을 통해서라는 것이 제안된 바 있다 (문헌 [Koenigsknecht-Talboo et al., 2008]). 그러나, 소교세포 및 FcγR 활성화에 의한 항-Aβ/Aβ 복합체의 흡수는 해당 세포가 활성화되는 것을 촉발할 수 있다.
뉴런에 대한 Aβ1-42 올리고머의 직접적인 세포독성을 극복하는 것 이외에도, 치료용 항-Aβ 항체는 이상적으로는 상당히 감소된 염증유발 반응과 함께 이러한 염증유발 반응에 기인하는 부정적인 결과의 상당한 감소를 가지게 된다. 따라서, 동일한 항원 결합 서열을 보유하나 가변성의 FcγR 결합 친화도, 및 그에 따른 상이한 소교세포 활성화 잠재력을 갖는 상이한 IgG 백본을 보유하는 항체와 MABT를 비교하였다. 여기에는 최대 FcγR-결합 능력을 갖는 인간 IgG1 야생형 (MABT-IgG1), 및 FcγR-결합을 급격하게 감소시키는 D265A 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1 백본 (MABT-IgG1-D265A)이 포함되었다 (문헌 [Shields et al., 2001]). 표면 플라스몬 공명을 사용하여 증명되는 바와 같이, 시험된 모든 백본 변이체들은 유사한 친화도로 Aβ1-42에 결합되었다.
이어서, Aβ1-42 올리고머 처리된 1차 피질 소교세포에 대한 공초점 영상화를 사용하여, 이러한 상이한 모노클로날 항체 백본들이 소교세포로 Aβ1-42 올리고머를 내재화하는 능력을 비교하였다. Aβ1-42 올리고머 내재화가 MABT-IgG1 > MABT > MABT-IgG1-D265A의 순서로 FcγR-결합과 크게 상관된다는 것이 발견되었다 (도 4b 및 4c). 소교세포가 실제로 모노클로날 항체에 복합체화된 Aβ1-42를 흡수한다는 것을 증명하기 위하여, 하이라이트 플루오르-488 표지된 Aβ1-42 및 소교세포 마커 Iba1의 공동-염색을 사용한 연구를 반복하였다. MABT 또는 MABT-IgG1 모노클로날 항체 중 어느 하나에 결합시, 태깅된 Aβ1-42가 Iba1+ 소교세포에서 풍부해진다 (도 4d). MABT-IgG1 모노클로날 항체와 조합된 Aβ1-42로 처리된 세포 배양물에서, 소교세포는 더 응축된 핵 및 더 밝은 Iba1 염색을 가졌으며, 이러한 특징들은 더 큰 항원/항체-매개 소교세포 활성화를 암시하였다. FcγR-결합 차이를 증명하기 위하여, 상이한 가교-결합 IgG mAb의 저-친화도 FcγRIIIa-V158에 대한 결합을 측정하였는데, MABT-IgG > MABT > MABT-IgG1-D265A의 결합 계층체계가 확인되었다 (도 4e). FcγR 패밀리의 다른 구성원에 대한 결합은 도 10에 나타내었다.
상이한 IgG 모노클로날 항체 백본들을 혼합 1차 피질 배양물에서 Aβ1-42 올리고머-매개 독성을 역전시키는 그의 능력에 대하여 시험하였다. Aβ1-42 올리고머-매개 독성의 완전한 역전에는, MABT 및 MABT-IgG1 모노클로날 항체 둘다에 대하여 나타나는 기능적 FcγR 결합 활성이 필요하였다 (도 4f). FcγR 결합 기능성이 결핍되어 있는 MABT-IgG1-D265A 모노클로날 항체는 Aβ1-42 올리고머-매개 세포 독성의 역전에 있어서 유의성이 없는 경향만을 나타내었다. 놀랍게도, IgG4 MABT 모노클로날 항체에 비해 더 큰 FcγR-결합 친화도를 보유하는 MABT-IgG1 야생형 모노클로날 항체가 MABT에 비교하였을 때 더 작은 보호 효과의 경향을 나타내었다. 따라서, 완전한 해제를 위해서는 소교세포 FcγR에의 결합이 필요하기는 하지만, MABT에 비한 FcγR에 대한 MABT-IgG1 백본의 강화된 결합은 원치않는 소교세포 활성화를 초래할 수 있고, 그것은 Aβ1-42 올리고머-매개 신경독성에 대항하는 전체 보호의 감소로 이어질 수 있다.
6.6 MABT - IgG1 야생형 백본은 염증유발 소교세포 반응으로 이어짐
항-Aβ 모노클로날 항체에 의해 그의 활성화 상태가 변경되는 Aβ1-42 올리고머-유도 독성의 하류 매개체를 확인하기 위한 노력으로서, 몇 가지 후보 신호전달 경로를 조사하였다. 신경독성 및 소교세포 활성화에 기여함에 있어서의 p38 MAPK의 역할에 대해서는, 광범위하게 기록되어 있다 (문헌 [Li et al., 2004]; [Wang et al., 2004]). 단독 또는 항-Aβ MABT, MABT-IgG1, MABT-IgG1-D265A와의 조합으로서의 Aβ1-42 올리고머, 또는 Aβ1-42 올리고머에 결합되지 않은 대조 IgG1을 사용하여 처리된 1차 혼합 피질 배양물에서 p38 MAPK 활성화를 조사하였다. Aβ1-42 올리고머를 사용하여 세포를 처리하였을 경우, p38 MAPK는 15분 이내에 활성화되었으며 (미제시), 30분에 최대에 도달하였다. 상이한 모노클로날 항체와의 조합시에는, IgG1 야생형 백본을 보유하며 FcγR에 대해 가장 큰 결합 친화도를 갖는 MABT-IgG1만이 포스포-p38 MAPK-특이적 ELISA에 의해 나타난 바와 같이 Aβ1-42 올리고머-유도 p38 MAPK 활성을 한층 더 증가시켰다 (도 5a). 여러 항-Aβ 항체들이 유사한 친화도로 Aβ1-42에 결합되기 때문에, MABT-IgG1 모노클로날 항체는 MABT와 동일한 정도로 독성 Aβ1-42 올리고머를 중화해야 한다. 그러나, IgG1 백본의 더 큰 FcγR-결합 친화도는 뉴런과 같이 Aβ1-42 올리고머의 작용에 고도로 민감한 세포에 해로울 수 있는 소교세포 활성화를 초래할 수 있다. Aβ1-42 올리고머에 복합체화된 MABT 모노클로날 항체는 Aβ1-42 올리고머-유도 p38 MAPK 활성을 감소시키지 않았고, 오히려 더 높은 활성으로의 경향을 나타낸 바, 이는 이와 같은 항체에 의한 부분적인 FcγR 활성화를 반영하였다.
이러한 초기 검정이 뉴런 세포 및 신경교 세포 모두를 포함하는 혼합 피질 배양물에서의 총 p38 MAPK 활성을 측정하였기 때문에, Aβ1-42 올리고머와 MABT의 조합을 사용하여 세포를 처리하였을 때 검출되는 p38 MAPK 활성이 소교세포에 특이적이었는지의 문제를 시험하였다. 이전과 같이 세포를 처리하였으나, 이번에는 소교세포 마커 Iba1과 함께 면역형광 염색에 의해 포스포-p38 MAPK 활성을 조사하였다. MABT 또는 MABT-IgG1 모노클로날 항체에 복합체화된 Aβ1-42 올리고머를 사용한 처리시에는, 포스포-p38 MAPK에 대하여 양성인 세포 염색의 대략 93%가 Iba1+이었다 (도 5b). 소교세포에서의 p38 MAPK의 활성화를 확인하기 위하여, 정제된 소교세포를 동일한 방식으로 처리하였다. 이러한 조건하에서는, 소교세포에서의 Aβ1-42/IgG 복합체-매개된 p38 MAPK 활성화가 용이하게 확인되었다 (도 5c).
Aβ1-42 올리고머-매개 신경독성에 대한 p38 MAPK 활성화의 기여에 초점을 맞추어, 세포를 제2 세대 p38 MAPK-특이적 억제제로 처리한 다음, 단독, 또는 MABT 또는 저-FcγR-결합 MABT-IgG1-D265A 모노클로날 항체 중 어느 하나와의 조합으로서의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 처리하였다. 예상외로, p38 MAPK 억제제의 존재하에서 MTT 신호의 MABT-매개 증가가 MABT-IgG1-D265A의 경우로까지 감소되었는데, 이는 p38 MAPK 억제에 대한 MABT-매개 해제 기능의 감소를 시사하였다 (도 5d). p38 MAPK 억제는 MABT-IgG1-D265A 모노클로날 항체와 복합체화된 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 처리된 세포에서는 효과가 없었다. 이러한 결과는 MABT 모노클로날 항체가 Aβ1-42 올리고머 단독에서 관찰되는 것을 유의미하게 상회하는 p38 MAPK 수준을 유도하지는 않지만, p38 MAPK 활성화가 MABT-매개 신경보호에서 역할을 한다는 것을 나타낸다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 혼합 배양 시스템에서의 이와 같은 활성의 세포 표적은 소교 세포이다.
증가된 소교세포 활성화를 더욱 직접적으로 하류 염증유발 해독체에 연관시키기 위하여, 소교세포가 보강된 1차 세포 배양물에 의한 TNFα 방출을 측정하였다 (>61% Iba1+, 미제시). Aβ1-42 올리고머로 처리시 보강된 소교세포에 의한 염증유발 TNFα의 방출은 시험된 모든 항-Aβ 모노클로날 항체의 존재하에서 감소되었다 (도 6). 그러나, 가장 큰 효과는 MABT의 존재하에서 관찰되었다. 따라서, 항-Aβ IgG4 모노클로날 항체는 신경보호 효과, 및 제한된 소교세포 활성화로 소교세포에 의한 Aβ 포식을 촉진하는 능력을 조합하여, 항-Aβ IgG1 모노클로날 항체에 비해 더욱 바람직한 프로파일을 가질 수 있다.
6.7 물질 및 방법
6.7.1 세포-배양물 제조
메베르그(Meberg) 및 밀러(Miller)에 의해 기술된 바와 같이 (문헌 [Meberg and Miller, 2003]), 생후 1일의 스프래그-도울리(Sprague-Dawley) 래트 (찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories) 사, 프랑스 라브레슬 소재)로부터 래트 1차 피질 배양물을 제조하였다. 소뇌 및 수막을 제거하고, 피질을 소형 단편으로 절단한 후, 해리 완충제 (파파인, CaCl2, EDTA, 및 HEPES; 모두 인비트로겐(Invitrogen) 사, 캘리포니아 칼스배드 소재) 중에서 37℃에서 효소적 파괴에 의해 해리시켰다. 10분 동안 DNase (인비트로겐 사)를 첨가하였다. 해리 후, 분산된 피질 뉴런들을 폴리-L-리신 (0.01%; 분자량 150,000-300,000; 시그마(Sigma) 사) 코팅된 6-웰, 24-웰, 또는 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 면역세포화학을 위하여, 코팅된 유리 커버슬립상에서 24-웰 플레이트로 세포를 성장시켰다. 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2로, 신경기초 배지 (인비트로겐 사)에서 페놀-레드 없이, L-글루타민 (2 mM; 시그마 사), B27 보충물 (인비트로겐 사), 및 페니실린/스트렙토마이신 (시그마 사)을 첨가하여, 세포를 유지하였다. 배양물 중에서 1시간 30분 후, 배지를 성상세포-조건화 배지로 대체하였다. 배양물 중에서 추가 4일 후, 2.5 μM의 시토신 아라비노시드 (Ara-C) (인비트로겐 사)를 사용한 처리에 의해 세포 증식을 차단하였다. 이러한 배양 조건하에서는, NeuN/DAPI 염색에 의해 세포 중 20%가 뉴런으로 확인되었다 (미제시). 다르게 언급되지 않는 한, 혼합 피질 배양물을 사용한 실험은 일반적으로 시험관내 일차(days-in-vitro) ("DIV") 6에 수행되었다. 상기에 피질 배양물에 대하여 기술된 바와 같이, 피질 및 해마로부터 제조된 보강 소교세포를 수확하였다. 고도의 글루코스를 함유하는 DMEM에 피질 및 해마를 넣고, 10 mL 피펫, 다음에는 주사기를 사용하여 피페팅함으로써 균질화하였다. 균질화물을 1,000×g에서 3분 동안 원심분리한 다음, 10% FCS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고도 글루코스를 함유하는 사전-가온 DMEM (소교세포 배지)에 재현탁시켰다. 다음에, 세포 현탁액을 T75 조직-배양 플라스크로 이동시키고, 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2로 1주 동안 유지하였다. 플라스크를 진탕하여 부착 세포로부터 소교세포를 분리한 후, 수집하여 DMEM으로 세척하였다. 생성되는 세포를 1 mL의 소교세포 배지에 재현탁한 후, 계수하여, 5×104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 소교세포 보강을 증명하기 위하여, 각각 성상세포 및 소교세포 마커인 GFAP 및 Iba1을 사용하여 세포를 염색하였다. Iba1의 경우 60%를 초과하는 세포가 양성으로 염색되었으며, GFAP 및 Iba1 모두에 대하여 염색되는 세포는 없었다. 생후 3일차 CX3CR1-GFP 마우스 (잭슨 래보래토리즈(Jackson Laboratories) 사)로부터 순수 소교세포를 제조하였다. 피질 및 해마를 절제하여, 고도의 글루코스를 함유하는 DMEM 중에서 10 mL 피펫, 다음에는 18 게이지 바늘을 사용하여 연화처리하였다. 균질물을 1,000g로 3분 동안 원심분리한 다음, 고도 글루코스, 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 사전-가온 DMEM (소교세포 배지)에 재현탁하였다. 다음에, 세포 현탁액을 T75 조직-배양 플라스크로 이동시키고, 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2로 7-10일 동안 유지하였다. 진탕에 의해 소교세포를 분리한 후, 수집하여, DMEM으로 세척하였다. 생성되는 세포를 1 mL 소교세포 배지에 재현탁한 후, 계수하고, 실험에 사용하기 위하여 조직 배양 처리된 유리 챔버 슬라이드에 5×104개 세포/웰로 플레이팅하였다.
6.7.2 항-Aβ 항체의 생성
IgG4 항-Aβ 모노클로날 항체 MABT는 전기한 바와 같이 (문헌 [Muhs et al., 2007]) 제조된 백신을 사용하여 마우스를 면역화함으로써 생성된 마우스 IgG2b 모노클로날 항체 (mMABT)의 인간화된 형태이다.
6.7.3 Fc γR 결합
효소-연관 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 일단의 인간 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 시험 항체들의 결합을 측정하였다. 인간 FcγR (제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 사, 캘리포니아 소재)은 C 말단에 Gly/6xHis/글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST) 폴리펩티드 태그를 갖는 수용체 γ-쇄의 세포외 도메인을 함유하는 융합 단백질이다. 본 실험에서 양성 대조군 (IgG1 대조군)으로는 인간 IgG1 프레임워크를 갖는 모노클로날 항체를 사용하였다. 0.05 M 탄산나트륨 완충제 (pH 9.6) 중에서 마우스 모노클로날 항 GST 항체 (제넨테크, 인크. 사)를 사용하여 4℃에서 밤새 플레이트를 코팅하였다. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 0.5% BSA, 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 검정 완충제를 사용한 차단 후, 플레이트를 FcγR과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항-GST 코팅과의 상호작용을 통하여 인간 FcγR을 플레이트에 고정시켰다. PBS 중 10% 차단제 카세인을 함유하는 검정 완충제 (피어스(Pierce) 사; 일리노이 록포드 소재) 중에서 항-Aβ MABT, MABT-IgG1, MABT-IgG1-D265A, 또는 IgG1 대조 모노클로날 항체의 연속 희석물을 제조하였다. 희석 샘플들을 고친화도 수용체 (FcγRIa)의 경우 단량체 형태로, 또는 저친화도 수용체 (FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa)의 경우 다량체 형태로 적용하였다. 시험 항체의 다량체 형태는 염소 항 인간 κ-쇄의 F(ab')2 단편 (MP 바이오메디칼즈(MP Biomedicals) 사, 오하이오 솔론 소재)을 시험 모노클로날 항체와 대략 3:1의 몰비로 가교결합시키는 것에 의해 생성시켰다. 플레이트를 FcγR과 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 단계 후에는, PBS 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 세척 완충제를 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 염소 항 인간 F(ab')2의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합 F(ab')2 단편 (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 사; 펜실베이니아 웨스트 그로브 소재)을 사용하여, FcγR에 결합된 항체를 검출하였다. 테트라메틸벤지딘 (TMB; 커크가드 & 페리 래보래토리즈(Kirkegaard & Perry Laboratories) 사, 메릴랜드 가이터스버그 소재)이 기질로서 사용되었다. 플레이트를 실온에서 15 내지 20분 동안 인큐베이션함으로써 색상 발현을 허용하였다. 1 M H3PO4를 사용하여 반응을 종결하고, 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices) 사, 캘리포니아 서니베일 소재)에서 450 nm에서의 흡광도를 측정하였고, 650 nm의 것을 참조하였다. 각 샘플 흡광도에 대비하여 2반복 샘플 희석액으로부터의 평균 흡광도 값을 플로팅함으로써 결합 곡선을 생성시켰다.
6.7.4 생체내 기능성 연구
생체내 기능성 평가를 위하여 2개의 연구를 수행하였다. 회상 기억력을 측정하기 위하여, 군 당 12마리의 돌연변이 인간 APP 마우스에 MABT 모노클로날 항체 또는 비히클 대조군 (PBS)의 2회 i.p. 주사를 투여하였다. 2차 주사 1일 후, 기술된 바와 같이 (문헌 [Dewachter et al., 2002]) 새로운 대상 인지 과제 (ORT)를 사용하여 회상 기억력을 연구하였다. 인지 지수 (RI)는 해마가 연관되는 비공간 기억력의 척도인, 새로운 대상 및 3시간 전에 관찰한 대상 둘다를 탐색하는 데에 소요된 시간에 대비한 새로운 대상을 탐색하는 데에 소요된 시간의 비로 정의되었다. 별도의 연구로서, 이중 트랜스제닉 아밀로이드-플라크 양성 돌연변이 인간 APP/PS1 마우스를 사용하여, 피질 플라크 부하에 대한 모노클로날 항체 투여의 효과를 측정하였다. 마우스에 500 ㎍의 MABT 모노클로날 항체를 16주의 기간 동안 매주 i.p.로 주사한 후, 피질 플라크 부하를 측정하였다. 뇌를 절제하여, 우측 대뇌 반구를 PBS 중 4% 파라포름알데히드에서 밤새 침지 고정시킨 후, 자유 부상 인큐베이션을 위하여 시상 비브라톰(vibratome) 절편 (40 ㎛)을 절단하고, 염색시까지 0.1% 나트륨 아지드를 포함하는 PBS 중에서 4℃에서 저장하였다. 티오플라빈-S를 사용하여, 상이한 수준에서의 5개의 절편을 밀집 플라크에 대해 염색하였다. 절편들을 염색 및 맹검 정량을 위하여 무작위화하였다. 소니(Sony) DXC-9100P 카메라가 장착된 라이카 DMR 현미경을 사용하여 영상을 수득하고, 라이카 Q-윈(Win) 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터로 분석하였다. 현미경을 위한 광 강도 및 콘덴서 설정은 영상 수득 과정 내내 일정하게 유지하였다. 티오플라빈-S 염색에서의 아밀로이드 부하의 자동 정량을 위해서, 해마이행부(subiculum)의 면적을 선택하였다.
6.7.5 독성 Aβ1-42 올리고머의 제조
Aβ1-42 펩티드 (바켐(Bachem) 사)를 HFIP에 용해시키고, 초음파처리한 후, 실온에서 밤새 진탕하였다. 다음에, 아르곤 흐름하에서 분취량을 건조하고, 진공 건조한 후, 사용시까지 단량체성 Aβ1-42 펩티드 필름으로서 -80℃에서 저장하였다. 165 ㎍ 분취량의 펩티드 필름을 7 μL DMSO, 85 μL PBS, 및 9 μL의 2% SDS에 재현탁하고, 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 300 μL의 물을 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 900 μL의 33% 메탄올 4% 아세트산 용액을 사용하여 4℃에서 1시간 동안 Aβ1-42 올리고머를 침전시키고, 16,200g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, Aβ1-42 올리고머를 건조한 후, 1 ㎍/μL의 최종 농도로 Na2HPO4/NaCl 용액에 재현탁시켰다.
6.7.6 Aβ1-42 세포독성 검정
혼합 피질 배양물에서 DIV 5에 Aβ1-42 올리고머의 세포독성을 시험하였다. 세포의 처리 전에, 최종 농도 100 ㎍/mL의 모든 항체들을 무-혈청 세포 배양물 배지에서 30분 동안 37℃로 Aβ1-42 올리고머와 공동-배양하였다. 일부 실험의 경우, Aβ1-42 올리고머를 사용한 처리 전에, 강력한 제2-세대 p38 억제제인 1 μM의 SB239063을 사용하여 1시간 동안 혼합 피질 배양물을 사전-처리하였다. 세포 생존력을 평가하기 위하여, 제조자의 지침에 따라 표준화된 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 환원 검정 (프로메가(Promega) 사, 미국 위스콘신 매디슨 소재)을 수행하였다. 다양한 처리에 반응하는 세포 생존력을 평가하기 위하여, 표준화된 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 환원 검정 (프로메가 사, 미국 위스콘신 매디슨 소재)을 수행하였다. 간단하게 말하자면, 최종 3시간의 처리 동안, 96-웰 플레이트 (코스타(Costar) 사)에서 성장된 세포를 MTT 염료 용액과 함께 인큐베이션하고, 플레이트 판독기 (테칸(Tecan) 사)를 사용하여 570 및 690 nm에서 흡광도를 판독함으로써, 청색 포르마잔 생성물의 생성을 측정하였다. 결과는 Aβ1-42 올리고머-처리된 세포에 대비한 생존 증가 백분율로 나타내었다. 면역형광을 사용하여 시험관 내 검정으로, Aβ1-42 올리고머-유도성 변성으로부터 뉴런을 보호하는 MABT 모노클로날 항체의 능력도 평가하였다. 배아일 17.5의 마우스 피질 뉴런을 단리하여, 해리하고, 시험관 내의 B27 보충물을 포함하는 신경기초 배지 중에서 배양하였다. Aβ1-42 단량체성 펩티드 필름에 대하여 상기한 바와 같이 Aβ1-42를 제조한 후, 10 μL의 DMSO를 첨가하여 펩티드를 용해시켰다. 다음에, 78.6 μL의 햄(Ham's)-F12 배지를 첨가하고, 세포 처리 전에, 25 μM의 Aβ1-42 펩티드 용액을 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포는 총 9일 동안 성장시켰으며, 3일차 및 처리일에 공급되었다. 처리를 위하여, 50 ㎍/mL의 MABT가 있거나 없는 2 μM의 Aβ1-42를 5일차 또는 6일차에 첨가하였으며, 동일 부피의 DMSO-F12 단독을 비히클 대조군으로서 사용하였다. 처리 3 또는 4일 후의 9일차에, 뉴런을 고정한 후, 항-β-튜불린 항체인 TuJ1으로 염색하였다. FITC-표지된 2차 항체를 사용하고 형광 현미경법을 사용하여 미세소관을 가시화하였다.
6.7.7 면역조직화학
AD 환자 및 연령-맞춤 비-AD 대조군 (티슈 솔루션즈(Tissue Solutions) 사, 영국 클라이드뱅크 소재)로부터의 파라핀 탑재 측두엽 뇌 절편 (20 ㎛)을 면역조직화학 염색에 사용하였다. 탈파라핀화된 절편을 포름산을 사용한 항원 회수에 적용한 다음, 1차 항체로서의 MABT 50 ㎍/mL를 사용하여 표지하였다. 2차 항체로는 염소-항-인간 비오티닐화 IgG를 사용하였다. 디아미노벤지딘 (다코(Dako) 사, 덴마크 글로스트루프 소재)을 사용하여 염색을 수행하고, 유키트(Eukitt) 탑재 배지를 사용하여 탑재하였다. 영상은 제이스(Zeiss) 사의 LSM 700 역상 현미경에서 수득하였다.
6.7.8 Aβ1-42 ELISA
ELISA에 의해 세포내 Aβ1-42 축적을 측정하기 위하여, 6-웰 세포-배양 플레이트 (코스타 사)에서 1차 피질 배양물을 처리한 후, 그것을 세척하여, 트립신-제거한 다음 (문헌 [Bateman et al., 2007]), 50 mM의 트리스-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 1% 트리톤 X-100으로 구성되며 프로테아제- 및 포스파타제-억제제 칵테일을 함유하는 세포-용해 완충제에서 용해시켰다. BCA 검정 (피어스 사)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 고-감도 Aβ1-42 특이적 ELISA (더 제네틱스 컴패니, 인크.(The Genetics Company, Inc.) 사, 스위스 쥐리히 소재)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 세포-용해물 Aβ1-42를 측정하였다.
6.7.9 면역세포화학 및 공초점 영상화
유리 커버슬립상에서 세포를 성장시켰다. 처리 후, PBS를 사용하여 세포를 신속하게 세척한 다음, 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시켰다. 철저한 세척 후, 세포를 100% 메탄올 중에 -20℃에서 10분 동안 침지하였다. 다음에, 그것을 다시 세척하고, 10% 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS인 차단 용액 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 2차 항체와 함께 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척하여, 프로롱(ProLong) 금 항소멸 시약 (인비트로겐 사)을 사용하여 유리 슬라이드상에 탑재하였다. 63× 렌즈를 사용하는 제이스 사의 LSM 700 역상 현미경상에서 초형광(epifluorescence) 및 공초점 영상을 수득하였다. 형광 강도는 표준 초형광 사진에 의해 묘사된 세포체에서 측정하였다. 이미지J(ImageJ) 1.42 (미국 국립 보건원, 프리웨어)를 사용하여 3-차원 영상으로 Z-스택(stack)을 제공하였으며, 그로부터 표지된 단백질을 포함하는 정단 내지 원거리 슬라이스를 수득하였다. Aβ1-42를 표지하는 데에 1차 항체 또는 2차 항체가 사용되지 않는다는 것 이외에는 동일한 방식으로, 하이라이트 플루오르-488-태깅 Aβ1-42로 처리된 세포를 처리하였다.
6.7.10 포스포 - p38 ELISA
래트 피질 배양물을 폴리-L-리신 코팅된 6-웰 세포-배양 플레이트 (코스타 사, 미국 매사추세츠 캠브리지 소재)에 시딩하고, DIV 5에 사용하였다. 다르게 표시되지 않는 한, 세포는 100 ㎍/mL의 모노클로날 항체가 있거나 없는 2 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 30분 동안 처리하였다. 일부 검정에서는, 제2-세대 p38 억제제인 SB239063을 사용하여 1시간 동안 세포를 사전-처리하였다. 양성 대조군으로는 아니소마이신을 사용하였다. 얼음상에 세포를 위치시키고 배지를 흡인함으로써, 처리를 중단하였다. 세포를 빙냉 PBS를 사용하여 세척하고, 세포 스크래퍼(scraper)를 사용하여 수확한 후, 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 1% 트리톤 X-100으로 구성되며 프로테아제- 및 포스파타제-억제제 칵테일을 함유하는 용해 완충제에서 용해시켰다. BCA 검정 (피어스 사, 미국 일리노이 록포드 소재)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. p38 MAPK 활성화의 반-정량 측정에는, 제조자의 지침에 따라 래트 포스포-p38 MAPK 비색측정 ELISA 키트를 사용하였다 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) 사, 미국 매사추세츠 비벌리 소재). 분광광도측정 마이크로플레이트 판독기 (테칸 사)에서 370 nm로 플레이트를 판독하였다. 일부 실험의 경우에는, 면역세포화학을 사용하여 포스포-p38을 검정하였다.
6.7.11 TNF α 방출
소교세포가 보강된 래트 피질 배양물 (총 DAPI+ 세포 중 >60%가 Iba1+)을 100 ㎍/mL의 항체가 있거나 없는 10 μM의 Aβ1-42 올리고머를 사용하여 6시간 및 24시간 동안 처리하였다. 양성 대조 자극으로는 1 ㎍/mL의 LPS (시그마 사)를 사용하였다. 표시된 시점에 세포 상청액을 취하고, 0.2 ㎛ 필터로 통과시킨 후, 제조자의 지침에 따라 퀀티킨(Quantikine) 래트 TNFα/TNFSF1A (R&D 시스템즈(R&D Systems) 사)를 사용하여 TNFα에 대하여 시험하였다.
또한, CX3CR1-GFP P3 새끼로부터의 순수 소교세포 배양물을 1 ㎍/ml의 LPS, 단독, 또는 100 ㎍/ml의 항-Aβ MABT, MABT-IgG1, MABT-IgG1-D265A, 대조 IgG1과의 조합으로서의 10 μM의 Aβ1-42 올리고머, 또는 항체 단독을 사용하여 24시간 동안 처리하였다. 세포 상청액을 수확하여, 0.2 ㎛ 필터로 통과시키고, 바이오-플렉스(Bio-Plex) 마우스 23-플렉스 검정 (바이오-래드(Bio-Rad) 사, 미국 캘리포니아 허큘리스 소재) 상에 전개시켰다.
6.7.12 통계 분석
모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 5 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software) 사, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 표시된 바와 같이 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. 데이터는 경우에 따라 스튜던트 t-검정, 일원 ANOVA에 이어지는 투키 사후 다중 비교, 또는 윌콕슨 순위-합계 비-파라미터 검정에 의해 분석하였다. <0.05의 P-값을 취하여 통계적으로 유의성 있는 차이를 표시하였다.
6.7.13 아밀로이드 플라크의 생체내 영상화
최초 영상화 기간 2주 전에, 전기한 바와 같이 (문헌 [Trachtenberg et al 2002], [Holtmaat et al 2009]), 10개월령의 APP hAPP(V717I)/PS1 마우스의 체감각 피질 상부에 두개 윈도우(cranial window)를 이식하였다. 각 영상화 기간 24시간 전에, 10 mg/kg 메톡시-X04를 I.P.로 동물에게 주사함으로써 개별 아밀로이드 플라크를 가시화하고 (문헌 [Klunk et al 2002]), 영상화 직전에는, 안지오센스(AngioSense)680 (비센 메디칼(VisEn Medical) 사)을 I.V.로 주사함으로써, 혈관을 가시화하였다. 각 영상화 기간 동안에는, 이소플루란-산소 혼합물을 사용하여 동물을 마취하고, 헤드 포스트(head post)를 사용하여 현미경에 탑재하였다. 영상은 40× NA 0.8 대물 렌즈 (올림푸스(Olympus) 사)의 후방-초점(back-focal) 평면으로 약 30 mW를 전달하는 820 nm로 조정된 Ti:사파이어 레이저 (마이타이 딥시(MaiTai DeepSee); 스펙트라 피직스(Spectra Physics) 사)를 사용하는 2-광자 레이저 스캐닝 현미경 (생체내 울티마(Ultima); 프레이리 테크놀로지스(Prairie Technologies) 사)를 통하여 수집하였다. 매일 대상에 대비하여 마우스를 재현가능하게 위치시킴으로써 개별 아밀로이드 플라크가 여러 주 동안 영상화되는 것을 가능케하기 위해 혈관구조의 패턴을 사용하였다. 개별 플라크의 부피는 주어진 플라크 부근으로 이동된 해당 영역 내의 바탕 상의 픽셀 수를 합계함으로써 추정하였다. 바탕은 평균 픽셀 강도 + 아밀로이드 플라크에 인접하여 이동된 해당 영역 내의 2개의 표준 편차로 정의된다. 제4 및 제8 영상화 기간 후에는, 60 mg/kg의 MABT를 I.P.로 동물에게 투여하였다.
참고문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Sequence Listing <110> AC Immune S.A. and Genentech, Inc. <120> Safe and Functional Humanized Antibodies <130> 12593-020-228 <140> To Be Determined <141> To Be Determined <150> 61/400,650 <151> 2010-07-30 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised heavy chain variable region (CDR1) <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised heavy chain variable region (CDR2) <400> 2 Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised heavy chain variable region (CDR3) <400> 3 Gly Asp Tyr 1 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised light chain variable region (CDR1) <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised light chain 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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 180 185 190 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 305 310 315 320 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 325 330 335 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 340 345 350 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 355 360 365 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 370 375 380 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 385 390 395 400 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 405 410 415 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 <210> 12 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IG GAMMA-4 CHAIN C REGION modified <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 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300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised heavy chain variable region (CDR2) <400> 13 agcatcaata gtaatggtgg tagcacctat tatccagaca gtgtgaaggg c 51 <210> 14 <211> 9 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised heavy chain variable region (CDR3) <400> 14 ggtgactac 9 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> MABT humanised light chain variable region (CDR1) <400> 15 agatctagtc agagccttgt atatagtaat ggagacacct atttacatt 49 <210> 16 <211> 336 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> artificial humanized MABT variable light chain <400> 16 gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggtga gcctgcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gccaaggcac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 17 <211> 657 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> artificial humanized MABT light chain <400> 17 gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggtga gcctgcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct 300 tggacgttcg gccaaggcac caaggtggaa atcaaaagga ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 18 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> artificial humanized MABT light chain constant region <400> 18 aggactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 19 <211> 336 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> artificial humanized MABT variable heavy chain <400> 19 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccaggcaagg gtctcgaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac accgccgtgt attactgtgc aagtggtgac 300 tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc tcctca 336 <210> 20 <211> 1317 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> artificial humanized MABT heavy chain <400> 20 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccaggcaagg gtctcgaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac accgccgtgt attactgtgc aagtggtgac 300 tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc 360 ttccccctgg cgccctgctc cagatcgacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg 420 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 480 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 540 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag 600 cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaat atggtccccc gtgtccccca 660 tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag 720 gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag 780 gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag 840 acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 900 ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 960 ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg 1020 tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1080 gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1140 aacaactaca agaccacgcc tcccgtcctc gattccgacg gctccttctt cctctacagc 1200 aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg 1260 catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaa 1317 <210> 21 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> artificial humanized MABT heavy chain constant region <400> 21 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccagatc gacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300 aaatatggtc ccccgtgtcc cccatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt cctcgattcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctgggtaa a 981 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Typical amino acid sequence preceding HCDR2 <400> 22 Leu Glu Trp Ile Gly 1 5

Claims (29)

  1. 환자의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화 정도를 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 알츠하이머병과 같은 아밀로이드증의 치료 과정을 모니터링하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아밀로이드증이 항 베타-아밀로이드 항체를 사용하여 치료되는 것인 방법.
  3. a. 신경독성 Aβ1-42 올리고머 및 항-베타 아밀로이드 항체와 함께 소교 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
    b. 소교 세포에 의한 베타 아밀로이드 펩티드의 흡수를 측정하는 단계
    를 포함하는, 작용제의 신경보호 활성을 시험하는 방법.
  4. a. 신경독성 Aβ1-42 올리고머 및 항-베타 아밀로이드 항체와 함께 소교 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
    b. 소교 세포에서 p38 MAP 키나제 활성화를 측정하는 단계
    를 포함하는, 작용제의 안전성을 시험하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 작용제가 항-베타 아밀로이드 항체인 방법.
  6. 아밀로이드증의 치료를 필요로 하는 환자에게 안전하고 기능적인 양의 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 안전하고 기능적인 양이 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준은 상회하지만 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체와 동일한 Kd로 베타 아밀로이드에 결합되는 동일 농도의 IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 존재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준 미만인 수준으로 환자의 소교 세포에서 p38 MAP 키나제의 활성화를 초래하는 것인, 알츠하이머병과 같은 아밀로이드증의 치료 방법.
  7. 제5항에 있어서, 환자의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제의 활성화가 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 부재하에서의 환자의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화를 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 사이로 상회하는 것인 방법.
  8. 아밀로이드증의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여 요법 중에 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 투여 요법이 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 부재하에서의 p38 MAP 키나제 활성화 수준은 상회하지만 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체와 동일한 Kd로 베타 아밀로이드에 결합되는 동일 농도의 IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 존재하에서의 p38 키나제 활성화 수준 미만인 수준으로 환자의 소교 세포에서 p38 MAP 키나제의 활성화를 초래하는 것인, 알츠하이머병과 같은 아밀로이드증을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 환자의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제의 활성화가 인간화 비-IgG1 항-베타 아밀로이드 항체 부재하에서의 환자의 소교 세포에서의 p38 MAP 키나제 활성화를 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50%; 또는 45%-55% 사이로 상회하는 것인 방법.
  10. 베타-아밀로이드에 기능적으로 결합되는 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 비-IgG4 항체의 불변 영역을 IgG4 항체로부터 유래한 불변 영역으로 대체하는 것을 포함하는, 안전하고 기능적인 인간화 항-베타 아밀로이드 항체를 제조하는 방법.
  11. a. 1차 혼합 피질 세포 배양물을 수득하는 단계;
    b. 세포 배양물을 신경독성 Aβ1-42 올리고머 및 항-베타 아밀로이드 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
    c. 뉴런 생존률을 측정하는 단계
    를 포함하는, 항-베타 아밀로이드 항체의 신경보호 활성을 시험하는 방법.
  12. 제6항에 있어서, 뉴런 생존률이 MTT의 미토콘드리아 산화로 측정되는 바의 대사 전환에 의해 측정되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 뉴런 생존율이 ATP 방출에 의해 측정되는 것인 방법.
  14. 제2항 내지 제4항, 제6항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항-베타 아밀로이드 항체가
    a. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 경쇄 가변 영역 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    b. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 경쇄 가변 영역 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    c. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 경쇄 가변 영역 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 방법.
  15. 제2항 내지 제4항, 제6항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항-베타 아밀로이드 항체가
    a. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 중쇄 가변 영역 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    b. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 중쇄 가변 영역 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
    c. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 중쇄 가변 영역 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 모두 표 2에 열거되어 있는 동일한 항-베타 아밀로이드 항체로부터 유래한 것인 방법.
  17. i) 비-IgG4 인간화 항체로부터 유래한 베타-아밀로이드에 결합되는 가변 영역의 아미노산 서열, 및 ii) IgG4 항체로부터 유래한 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항-베타 아밀로이드 항체.
  18. 제17항에 있어서, 비-IgG4 인간화 항체가 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 인간화 항-베타 아밀로이드 항체.
  19. i) IgG1 인간화 항체로부터 유래한 베타-아밀로이드에 결합되는 가변 영역의 아미노산 서열, 및 ii) IgG4 항체로부터 유래한 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항-베타 아밀로이드 항체.
  20. 안전하고 기능적인 양의 제17항 또는 제19항의 인간화 항체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  21. 제17항 또는 제19항에 있어서, 항-베타 아밀로이드 항체가
    a. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 경쇄 가변 영역 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    b. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 경쇄 가변 영역 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    c. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 경쇄 가변 영역 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 항체.
  22. 제17항 또는 제19항에 있어서, 항-베타 아밀로이드 항체가
    a. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 중쇄 가변 영역 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    b. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 중쇄 가변 영역 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
    c. 표 2에 열거되어 있는 항-베타 아밀로이드 항체의 중쇄 가변 영역 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 항체.
  23. 제21항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 모두 표 2에 열거되어 있는 동일한 항-베타 아밀로이드 항체로부터 유래한 것인 방법.
  24. i) IgG1 인간화 항체로부터 유래한 베타-아밀로이드에 결합되는 가변 영역의 아미노산 서열, 및 ii) 비-IgG1 항체로부터 유래한 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항-베타 아밀로이드 항체.
  25. 해당 비-IgG4 항체의 불변 영역을 IgG4 항체로부터 유래한 불변 영역으로 대체하는 것을 포함하는, 비-IgG4 항-베타 아밀로이드 항체의 안전성을 향상시키는 방법.
  26. 해당 비-IgG4 항체의 불변 영역을 비 IgG1 항체로부터 유래한 불변 영역으로 대체하는 것을 포함하는, 비-IgG4 항-베타 아밀로이드 항체의 안전성을 향상시키는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 비-IgG4 항체가 IgG1 항체인, 비-IgG4 항-베타 아밀로이드 항체의 안전성을 향상시키는 방법.
  28. 제15항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 모두 표 2에 열거되어 있는 동일한 항-베타 아밀로이드 항체로부터 유래한 것인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 모두 표 2에 열거되어 있는 동일한 항-베타 아밀로이드 항체로부터 유래한 것인 방법.
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