CN109602895A - Mfg-e8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物医学领域，公开了MFG‑E8在选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化中的应用以及MFG‑E8在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。MFG‑E8能够通过分子信号通路NF‑κB和PI3K‑Akt选择性调控M1亚型炎症毒性小胶质细胞向M2亚型神经保护小胶质细胞极化转变，为阿尔茨海默病的治疗提供了新的治疗靶点。

Description

MFG-E8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞 极化的药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物医学领域，具体涉及MFG-E8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是老年人中最常见的痴呆类型。AD是一种进行性中枢神经***退行性疾病，临床表现以记忆力减退及其他认知功能损害为主。患者进行性加重出现情感交流、执行力、理解力、时间地点定向以及视觉空间定位障碍等表现，多数因并发症，如感染而死亡。其晚期情感障碍及并发症，给患者本人、家庭以及社会带来沉重的生理心理以及经济负担。目前认为AD发病由多种因素共同作用引起，如遗传、环境因素等，但其发病机制尚未彻底阐明。

研究表明，正常情况下，淀粉样蛋白(Aβ)可以诱导小胶质细胞产生M1亚型炎症改变，导致其吞噬清除Aβ能力下降，减少老年斑形成。目前针对淀粉样蛋白斑是阿尔茨海默病的特征性病理表现，可引起小胶质细胞的显著激活，围绕于淀粉样蛋白斑周围的小胶质细胞极化为M2亚型，表现为多种吞噬相关受体及保护因子表达增加，小胶质细胞发挥吞噬清除功能，将Aβ清除出脑组织，促进神经功能的修复。然而，M2亚型的吞噬调节功能又受到位于坏死组织部位的M1亚型小胶质细胞的调控，M1亚型分泌的多种促炎因子对M2亚型吞噬及修复功能具有抑制作用。同时研究发现M1亚型极化虽然可以减少Aβ产生，但可显著促进淀粉样蛋白斑沉积；而M2亚型极化则促进Aβ产生，但可显著抑制淀粉样蛋白斑沉积。淀粉样蛋白斑随患者病程、病变部位及Aβ清除变化而不断变化，因此脑内M1和M2亚型相互转化更为复杂，对M1/M2亚型极化的调节可以作为AD治疗的新方向。

但是目前研究中缺少有效可行的治疗靶点，既可以调控抑制淀粉样蛋白诱导小鼠原代小胶质细胞炎症反应减轻，同时又能够将该类炎症毒性细胞(M1亚型)转化为具有神经保护作用的抑炎小胶质细胞(M2亚型)。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供了MFG-E8在选择性调控Aβ诱导的小胶质细胞极化中的应用，MFG-E8能够通过分子信号通路NF-κB和PI3K-Akt选择性调控M1亚型炎症毒性小胶质细胞向M2亚型神经保护小胶质细胞极化转变，为AD的治疗提供了新的治疗靶点。

为了实现上述目的，本发明一方面提供MFG-E8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的应用。

优选地，MFG-E8用于抑制小胶质细胞的M1亚型极化，促进小胶质细胞的M2亚型极化。

优选地，MFG-E8用于调控小胶质细胞由M1亚型向M2亚型转化。

优选地，MFG-E8通过NF-κB和PI3K-Akt信号通路选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化。

优选地，其中，MFG-E8的浓度为10μg/mL以上。

优选地，其中，MFG-E8的浓度为10-100μg/mL。

本发明第二方面提供MFG-E8在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

本发明第三方面提供一种用于治疗阿尔茨海默病的药物，该药物含有MFG-E8作为有效成分。

通过上述技术方案，本发明通过细胞体外实验证实MFG-E8(乳脂球表皮生长因子8)可以通过分子信号通路NF-κB和PI3K-Akt选择性调控M1亚型炎症毒性小胶质细胞向M2亚型神经保护小胶质细胞极化转变，为AD的治疗提供了新的治疗靶点。

具体地，本发明研究证实MFG-E8可以通过负向调节NF-κB、正向调节PI3K-Akt信号通路而发挥抑制M1亚型极化，促进M2亚型极化的作用。可以此为靶点，进行AD治疗新方法的研究。

并且，由于MFG-E8属于组织细胞内源性分泌产物，因此在应用于临床过程中不会出现药物毒性及免疫排斥反应。

附图说明

图1-1表示用抗CD68抗体染色的原代小胶质细胞；

图1-2表示MFG-E8对于经Aβ42处理的小鼠原代小胶质细胞的活化；

图2表示Aβ42处理后M1和M2标志物基因表达水平；

图3表示仅MFG-E8处理后M1和M2标志物基因表达水平；

图4表示经Aβ42和MFG-E8处理后M1和M2标志物基因表达水平；

图5表示经MFG-E8阻断后M1和M2标志物基因表达水平；

图6表示MFG-E8调节Aβ42诱导NF-κB和PI3KAkt信号通路的变化；

图7表示MFG-E8调节阻断的Aβ42诱导NF-κB和PI3K-Akt途径的变化；

图8表示小胶质细胞中M1和M2基因的差异表达。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明一方面提供MFG-E8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的应用。

现有研究表明，淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化(Aβ-Induced MicroglialPolarization)在阿尔茨海默病(AD)中起重要作用。根据本发明，MFG-E8可与小胶质细胞结合并调节其炎症反应。

具体地，MFG-E8能够抑制小胶质细胞的M1亚型极化，促进小胶质细胞的M2亚型极化。根据本发明，MFG-E8调控小胶质细胞由M1亚型向M2亚型转化。

并且，通过本发明的研究证实，MFG-E8通过NF-κB和PI3K-Akt信号通路选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化。

根据本发明，优选地，MFG-E8的浓度为10μg/mL以上，更优选地，MFG-E8的浓度为10-100μg/mL。本发明通过实验证实了浓度为10μg/mL以上的MFG-E8即能够有效调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞的选择性极化。

在本发明中，所述小胶质细胞可以为人小胶质细胞，也可以为非人动物的小胶质细胞。MFG-E8可以为人源MFG-E8或者人源化的MFG-E8，也可以为动物源MFG-E8或者动物源化的MFG-E8，例如可以为通过基因工程方式表达的MFG-E8。

本发明第二方面提供MFG-E8在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

本发明第三方面提供一种用于治疗阿尔茨海默病的药物，该药物含有MFG-E8作为有效成分。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，Aβ42肽购自美国AnaSpec公司，小鼠重组MFG-E8蛋白和MFGE8ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司，CD68抗体购自英国AbD Serotec公司，FITC标记羊抗兔二抗购自ZSGB-Bio公司，MFG-E8抗体(goat-control IgG antibody)购自美国Santa Cruz Biotechonology公司，吡咯烷二硫氨基甲酸酯(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、LY294002、抗p-IκB、抗IκB、抗p-p65、抗p65、抗p-Akt、抗Akt和抗i-GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

以下实施例中，具体实验步骤如下：

1.1纤维态Aβ42的制备

1)将10mg Aβ42充分溶于2.217mL六氟异丙醇(HFIP)中，常温下反应溶解30min，至溶液清亮透明，注意不要有气泡产生，必要时可使用超声碎裂仪加速***5min。

2)将上述溶液等体积分入0.5mL EP管(每管100μL，约每管0.451mg)，打开EP管盖，通风橱中过夜，充分挥发HFIP。

※以上操作均在通风橱中进行。

3)取出EP管后，使用SpeedVac真空离心浓缩***离心1h，充分清除残余HFIP，此时可见清亮薄蛋白膜覆于管底。所得蛋白保存于-20℃。

4)将-20℃保存的Aβ42蛋白取出，恢复至室温。

5)将0.451mg Aβ42充分溶于20μL DMSO中(终浓度5mM)，充分震荡30s，必要时超声震荡10min。

5)将2μL 5mM的Aβ42-DMSO混合液溶于98μL含有10mM HCl(购自Sigma)的双蒸水中，即可得终浓度为100μM的纤维态Aβ42。

6)37℃保存24h即可使用。

1.2原代海马小胶质细胞培养

1)使用新生1-3天内的Balb/C小鼠用于原代小胶质细胞提取与培养。超净工作台消毒后，铺无菌巾，于冰袋上依次剪开小鼠头皮和颅骨，充分暴露小鼠大脑皮层，仔细剥除其余组织，取出小鼠双侧大脑海马，置于含有3mL预冷生理盐水的无菌培养皿中暂时保存。

2)将所有海马移入另一含有预冷生理盐水的培养皿中。去除脑膜及表面血管，剥离出海马。将海马组织切成约2×2×2mm大小的碎块后，移入另一含有9mL PBS的离心管，置于37℃水浴缓慢振荡10分钟。

3)加入无菌的1mL胰蛋白酶，轻轻混匀(混合后工作浓度为0.125％)，37℃水浴振荡消化10min，加入5mL含有10％澳洲胎牛血清的培养基终止消化，轻柔吹打3次。静置数分钟待组织下沉后，将细胞悬液移入另一新的离心管，再加入10mL培养基至管内剩余组织中，吹打3-4次后，再等待组织下沉，收集细胞悬液。重复上述步骤3-5次，至将组织全部吹打分散成细胞悬液。

4)将收集的细胞悬液用200目筛的筛网过滤，过滤后的细胞悬液用15mL的离心管分装，以1000转/分离心10min。去上清液，加入10mL培养基，并轻吹打3次，让细胞碎片和残余组织团块下沉后，再收集细胞悬液。

5)将收集的细胞悬液用33μm(200目)的筛网过滤。将细胞密度稀释至15mL接种到3个面积75cm2的细胞培养瓶中，使用含10％美洲胎牛血清的DMEM-F12培养液培养于含有5％CO2的37℃培养箱。

6)接种后24h更换培养液一次，之后视培养情况约每培养2-3天换液一次。

7)观察8-12天后，至星形胶质细胞铺满底壁，小胶质细胞呈小圆形透亮状时，可进行小胶质细胞分离。将75cm2培养瓶平放于摇床上，以200转/分震荡摇晃2h，转移至镜下观察至多数小胶质细胞脱离后，收集悬液以1000转/分离心5min，弃去上清，加入培养液重悬后即可使用。

8)选择CD68抗体鉴定原代小胶质细胞。将上述7)中分离所得的细胞以1×105/mL的密度接种于24孔板中，24h后使用PBST在摇床上清洗两遍，4％多聚甲醛后使用0.3％Triton-X 100透化，PBST清洗后，山羊血清封闭液封闭1小时，加入一抗CD68，4℃摇床孵育过夜，加入FITC标记山羊抗大鼠IgG，常温孵育60分钟；避光条件下，PBS清洗，甘油加盖玻片封片，正立荧光显微镜观察细胞并照相，计数阳性CD68细胞数，计算原代小胶质细胞的纯度。

1.3MTT法检测细胞活性

MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜并沉积于细胞中，而死亡细胞则无此功能，无甲臜沉积。二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)可溶解细胞内的甲臜，使用酶标仪在490nm波长处可测定其光吸收值，在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比关系。可根据酶标仪所测得的吸光度值(Optical Density，OD)，来判断活细胞数目，OD值越大，则细胞活性越强。

具体步骤如下：

(1)将小胶质细胞接种到96孔板中，每孔加入约100μl，铺板使待测细胞调至密度至105/孔。

(2)将细胞培养于含有5％CO₂的37℃培养箱中3天，至细胞单层铺满孔底，并进行处理。

(3)每孔加入5mg/mL的MTT(即0.5％MTT)溶液20μl，继续孵育4-6小时。

(4)终止培养，小心吸出并丢弃孔内培养基。

(5)每孔加入150μl DMSO，避光低速振荡10分钟，使孔底的结晶物充分溶解。

(6)在酶联免疫检测仪490nm波长处测量各孔的吸光值，并记录结果，以时间为横坐标，细胞存活率为纵坐标，进行绘制细胞生长曲线。

1.4ELISA检测

细胞上清MFG-E8浓度的检测采用小鼠MFG-E8ELISA试剂盒。操作步骤严格按照说明书进行，详细步骤如下：

取出ELISA试剂盒室温放置30min复温。

试剂准备：将100×生物素抗体用生物素抗体稀释液稀释成1×；100×辣根过氧化酶-生物素用辣根过氧化酶-生物素稀释液稀释成1×；25×洗涤液用双蒸水稀释成1×。

标准品准备：用样品稀释液将高浓度标准品倍比稀释成400、200、100、50、25、12.5、6.25、0pg/mL共7管。

取出足够的测试孔，分别设置空白对照孔、标准孔及待测样本孔，注意标记各孔位置，标准孔中加入标准品100μl，待测样品孔中加入100μl样本，再分别加入酶标工作液100μl于上述孔中，空白对照孔不需加样品和酶标工作液。

封板膜封板后，37℃孵育2h。

小心揭掉封板膜，弃去液体，滤纸上拍干，暂不需洗涤。

每孔加入1×生物素标记抗体100μl，封板膜封板后37℃孵育1h。

洗板：弃去液体，并每孔加入洗涤液200μl，静置2min，甩去洗涤液，干净滤纸上拍干，如此反复洗板3次。

每孔加入1×辣根过氧化物酶-生物素100μl，封板膜封板后37℃孵育1h。

洗板：弃去液体，并每孔加入洗涤液200μl，静置2min，甩去洗涤液，干净滤纸上拍干，如此反复洗板5次。

显色：每孔加入显色液90μl，37℃避光显色15-30min。

终止：每孔加入终止液50μl，轻微震荡混匀终止反应。

以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度(OD值)。应在终止反应5min内进行。

根据标准品的浓度与OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，然后计算各样品中MFG-E8的浓度。

1.5细胞免疫荧光检测

1)PBS漂洗约5min×3次(本步骤及以下各步骤均需在摇床上漂洗进行)；

封闭液50μl(含Triton X-100)室温封闭1-2h；

甩去或吸干封闭液；

孵育一抗抗体约50μl(抗体稀释液配制)，湿盒中4℃过夜处理；

5)湿盒中室温孵育一抗约1h；

6)PBS漂洗约5min×3次；

※以下步骤均需避光操作处理：

7)避光孵育荧光标记二抗约50μl，湿盒中室温1h；

8)PBS漂洗约5min×3次；

9)滴加约50μl含DAPI抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片；

10)室温下避光静置约5分钟，待封片剂凝固；

11)荧光显微镜下观察并拍照保存。

1.6Western Blot检测

1.6.1细胞总蛋白提取

1)使用预冷4℃的PBS冲洗培养皿2次以清除剩余的培养液；

2)加入RIPA裂解液进行裂解(1mL/100小胶质细胞组织，用前即刻加入10μl/mLPMSF)，使用玻璃匀浆器充分匀浆至肉眼看不见组织块为止；

置于冰上，超声粉碎机进一步碎裂蛋白样品约30s；

置于冰上，孵育约30min；

将样品置于超速冷冻离心机中离心处理，转速20000g，约30min；

收集EP管中上清液分装转移入另一无菌EP管，-80℃保存待进行蛋白定量测定。

1.6.2蛋白浓度测定

1)配制BCA标准品、样品和BCA工作液：

2)BCA标准品的配制：使用双蒸水稀释BCA溶液，使之浓度依次定容为2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0μg/mL，并依次标记为A、B、C、D、E、F、G、H、I；

3)样品的制备：所有样品均使用双蒸水稀释，使待测样品浓度位于标准曲线的线性部分，每个反应准备2个平行测定作为副孔；

4)准备BCA工作液：使用下面方程计算所需的BCA工作液总量：

(#标准品+#待测样本)×(#复孔)×0.2mL＝总BCA工作液量；BCA工作液＝50份A液+1份B液，充分混匀后备用。

5)应用96孔板进行测定，在96孔板每个孔中均加入25μl标准品或待测样品；

6)然后加入约200μl BCA工作液，盖上盖子后，充分混匀30秒；

7)盖上盖子后，在37℃孵育30分钟；

8)静置冷却至室温；

9)使用酶标仪测定562nm处的样品吸光度并计算待测样品的蛋白浓度。

1.6.3Western Blot操作步骤

1)安装Western Blot仪器玻璃板；

2)按下述表1配方配制10％分离胶，迅速充分混匀

表1

3)灌注分离胶时注意避免产生气泡，并留出足够的灌注浓缩胶所需的空间(梳子齿长+0.5cm)

4)加入异丙醇约200-300μL压胶

5)室温中垂直静置约30min，待分离胶充分凝固

6)轻轻倒去异丙醇后，其边缘残留液体使用滤纸擦干

7)按下述表2配方配制5％浓缩胶，迅速充分混匀

表2

8)灌注浓缩胶，立即插上干净并用双蒸水湿润的Teflno梳子，注意避免混入或产生气泡

9)室温中垂直静置约30min，待浓缩胶充分凝固

10)准备蛋白样品和预染蛋白marker

11)卸下玻璃板，拔掉梳子，将玻璃板放入电泳槽，固定好后，加入约700mL 1×电泳液

12)上样：按照实验分组依次加样，每孔蛋白样品上样量为10μL(30-100μg)，预染蛋白marker上样量则为10μL

13)按正负电极接好Western Blot电泳仪

14)电泳条件为：80V×30min电泳浓缩胶+100V×90min电泳分离胶

15)观察蛋白电泳直到目的条带电泳至仪器玻璃底部，然后终止电泳

16)配制10×转膜液

17)先使用200mL甲醇激活PVDF转印膜约3-5min

18)然后将约800mL转膜液(100mL 10×转膜液+700mL双蒸水)与200mL甲醇充分混匀，共配制约1000mL 1×转膜液(电泳开始时即可将1×转膜液放入4℃冰柜中预冷)

19)裁剪PVDF转印膜(8.5×4.5cm)，在膜的蛋白面/凹面右上角切角作为标记

20)将玻璃板连同分离胶一同浸泡入1×转膜液中处理

21)按下述顺序安装Western Blot夹板

白色孔板上

海绵垫

滤纸

膜蛋白面/凹面向胶

分离胶中

滤纸

海绵垫

黑色孔板下

用铲板充分压紧上述装置，避免在胶和PVDF转印膜之间产生气泡影响转膜效果

22)将转膜板放入转膜槽中充分固定好

23)在转膜槽一侧加入小冰袋，将整个转膜槽置入4℃冰柜中，加入约1000mL 1×转膜液，开始电转

24)Western Blot转膜条件为：100V×70min

25)配制1×TBST溶液

26)配制5％脱脂奶粉封闭液

27)使用丽春红染液染色后比照预染蛋白marker所对应的目的条带及内参条带的位置，进行裁剪PVDF转印膜，并用铅笔标注不同分子量位置的条带以便于后续步骤中的识别处理

28)在摇床上使用封闭液常温封闭PVDF转印膜1-2小时

29)配制一抗抗体：按照适当的稀释比例用封闭也配制目的蛋白的一抗和内参的一抗，分别加至目的蛋白条带和内参条带上

30)置于4℃摇床上，孵育一抗抗体过夜处理

31)于摇床上1×TBST，漂洗约10min×3次

32)配制二抗：按照适当的稀释比例使用封闭液配制HRP偶联的二抗抗体，分别加至目的蛋白条带和内参条带上

33)常温摇床上孵育二抗1小时

34)摇床上1×TBST漂洗10min×3次

35)进暗室前，准备好定影液、显影液、蒸馏水、烧杯、胶片、移液枪、弯盘、剪刀、镊子、Timer、枪头等物品

※以下的步骤均需避光操作进行：

36)进暗室将胶片剪至合适大小，并在右上角剪角作为标记

37)配制PVDF转印膜发光液，发光液＝1份A液+1份B液，充分混匀备用

38)将PVDF转印膜水平平铺在平板上(做好标记的蛋白面朝上)，进暗室加发光液200μl/条带，发光约2-5min

39)将蛋白条带转移至白板上(由于发光强度不同，内参和目的蛋白条带应分次曝光)，蛋白面朝上平铺，再在其上盖一层保鲜膜作为隔绝

40)条带的曝光时间视其发光强度而定，一般内参的曝光时间较短，1-10s即可，目的蛋白的曝光时间需进一步探索，曝光后放入显影液中数秒至数分，显出影像后即可夹出，然后放入定影液约4min，再使用蒸馏水充分清洗胶片，拿出暗房静置晾干

41)曝光后的PVDF转印膜勿丢弃，可放于1×TBST中4℃保存

如结果不满意或者目的蛋白条带和内参条带分子量接近而难以分开时，可使用蛋白印迹膜再生液洗膜后重新封闭、孵育一抗、二抗、曝光处理(即用蛋白印迹膜再生液洗膜10-30min后、1×TBST摇床上漂洗10min后重新封闭，重复步骤28至41)

1.7Real-time PCR检测

1.7.1提取细胞总RNA

1)每个小皿中加入约1mL RNAiso Plus，置于冰上，使用移液枪反复吹吸匀浆；

2)室温静置约5min；

3)12000g 4℃离心处理5min；

4)小心吸取EP管中上清液，将其转移入另一新的EP管中；

5)向上述匀浆裂解液中加入适量氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量，如1mL×1/5＝200μL)，盖紧EP管盖，用力充分振荡(漩涡振荡器振荡至少15s)，待其充分乳化，且溶液呈乳白色(无分相现象)后，再室温静置5min；

6)12000g 4℃离心处理15min；

7)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色上清液、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相，吸取上层的无色上清液(0.5mL左右)至另一新的EP管中；

8)向上清液中加入等体积的异丙醇(0.5mL左右)后，盖上盖子，上下颠倒EP管充分混匀后(振荡约30s)，在15-30℃下静置约10min；

9)12000g 4℃离心处理10min，一般在离心后，试管底部会出现少许沉淀；

10)小心弃去上层上清，保留沉淀，缓慢沿管壁加入75％的乙醇1mL(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒充分洗涤EP管管壁，12000g 4℃离心处理5min，后小心弃去乙醇液体(为了更好的控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)；

11)室温干燥沉淀静置2-5min，加入适量的(如20μL)RNase-free水溶液充分溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，使用核酸分析仪对RNA浓度进行检测；

12)RNA浓度测定：一般要求待测样品的OD260/280比值为1.8-2.0；

13)将RNA样品逆转录成cDNA或-80℃冰箱保存备用。

1.7.2逆转录反应(RT-PCR)

①按下列表3组份配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)。

表3

*1反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的Total RNA。

②逆转录反应条件如下：

37℃15min(逆转录反应)

85℃5sec(逆转录酶的失活反应)

③将得到的RT反应液加入到下一步的Real-time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real-time PCR反应体积的1/10(V/V)量。

1.7.3Real-time PCR反应

①Real-time PCR引物序列如表4所示

表4

基因	正向引物(5’to 3’)	反向引物(5’to 3’)
			MFG-E8	CGGGCCAAGACAATGACATC	TCTCTCAGTCTCATTGCACACAAG
TNF-α	TGTAGCCCACGTCGTAGCAA	AGGTACAACCCATCGGCTGG
			IL-1β	TGTGCAAGTGTCTGAAGCAGC	TGGAAGCAGCCCTTCATCTT
CD86	ACGATGGACCCCAGATGCACCA	GCGTCTCCACGGAAACAGCA
			Arg-1	AGCCAATGAAGAGCTGGCTGGT	AACTGCCAGACTGTGGTCTCCA
IL-10	GCCTTATCGGAAATGATCCA	TCTCACCCAGGGAATTCAAA
			CD206	TCAGCTATTGGACGCGAGGCA	TCCGGGTTGCAAGTTGCCGT
β-actin	ACCCTAAGGCCAACCGTGAA	AGAGCATAGCCCTCGTAGATGG

②按下列表5组份配制PCR反应液(反应液的配制需在冰上进行)。

表5

*1通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好的结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物的浓度；

*2DNA模板添加量通常在100ng以下。但因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可对其进行梯度稀释，确定最佳的cDNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量就不要超过PCR反应液总体积的10％；

*3在20μl反应液中可以使用相当于10pg-100ng Total RNA量的cDNA为扩增模板。

③进行Real-time PCR反应。

按照以下表6PCR扩增程序进行：

表6

④实验结果分析。

反应结束后确认Real-time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线。用2-ΔΔCt法对目的基因表达量进行相对定量。

实施例1

使用纤维态Aβ42(10μM)诱导小鼠原代小胶质细胞的活化，24h后，通过免疫荧光和Western blot分析表征CD68的表达，结果如图1-1和图1-2所示。并且，为了测定MFG-E8的效果，先加入MFG-E8孵育1h后再进行Aβ42诱导。

图1-1表示用抗CD68抗体染色的原代小胶质细胞，Bar＝20μm；图1-2中的b为Western blot测定的CD68表达，GAPDH为内部对照；c为每组的定量分析，显示了CD68表达的倍数变化；d使用MTT方法检测小胶质细胞的活化。e使用ELISA在培养基中测试MFG-E8的浓度，GAPDH为内部对照；g进行每组的定量分析。*表示相对于Aβ(-)/MFG-E8(-)，<0.05；**表示相对于Aβ(+)/MFG-E8(-)，<0.05；数字符号表示与对照组相比，<0.05。

图1-1和图1-2的结果表示纤维态Aβ42显著诱导了CD68的表达(P<0.05)。在10至100μg/mL的浓度下，MFG-E8剂量依赖性地抑制CD68表达升高，100μg/mL的浓度下具有显著性(P<0.05)。而Aβ42(10μM)在24小时孵育后对小胶质细胞活力产生显着的抑制作用(P<0.05)，而用10至100μg/mL浓度的MFG-E8预孵育后逐渐逆转，100μg/mL的浓度下具有显著性(P<0.05)。Aβ42(10μM)显示出小胶质细胞内MFG-E8表达的时间依赖性抑制和小胶质细胞外MFG-E8的产生，在24小时具有显着性(P<0.05)。

实施例2

为了定量小胶质细胞的M1和M2极化，将原代小胶质细胞与Aβ42(10μM)孵育24小时后，使用Q-PCR测定M1细胞(TNF-α，IL-1β，CD86)和M2细胞(Arg-1，IL-10，CD206)的代表性标志物的mRNA表达，结果如图2所示。

从图2可以看出，M1标志物水平时间依赖性地增加(6至24小时)。相反地，M2标志物表达时间依赖性地被抑制(6至24小时)。

实施例3

为了探究MFG-E8是否影响M1/M2极化，将原代小胶质细胞与MFG-E8(100μg/mL)孵育指定时间后，使用Q-PCR测定M1细胞和M2细胞的代表性标志物的mRNA表达，结果如图3所示。从图3可以看出，MFG-E8不影响小胶质细胞极化状态，并且在各标志基因中无表达差异(P<0.05)。

将原代小胶质细胞与指定浓度的MFG-E8孵育1h，再加入Aβ42(10μM)孵育24小时后，使用Q-PCR测定M1细胞和M2细胞的代表性标志物的mRNA表达，结果如图4所示。从图4可以看出，MFG-E8逆转了M1标志的增加趋势，但导致了M2标志的积累。

将原代小胶质细胞与或不与MFG-E8(100μg/mL)/MFG-E8抗体(5mg/mL)/IgG抗体(5mg/mL)孵育1h，再加入Aβ42(10μM)孵育24小时后，使用Q-PCR测定M1细胞和M2细胞的代表性标志物的mRNA表达，结果如图5所示。从图5可以看出，在存在MFG-E8抗体(5mg/mL)的情况下，MFG-E8对M1和M2标记物的作用显着减弱(P<0.05)。然而，阴性对照IgG抗体(5mg/mL)不影响MFG-E8的作用(P<0.05)。

实施例4

为了研究MFG-E8的作用机理，针对响应Aβ42(10μM)的NF-κB和PI3K-Akt信号转导途径的改变进行了测定。使用Western blot进行定量分析，结果如图6所示。图6中，a为NF-κB和PI3KAkt信号通路的Western blot结果；b为p-IκBα和IκBα表达的定量分析；c为p-p65、细胞质和核p65表达的定量分析；d为p-Akt和Akt表达的定量分析。*表示不同标记物相对于Aβ(-)/MFG-E8(-)，<0.05；**表示不同标记相对于Aβ(+)/MFG-E8(0μg/mL)，<0.05。

从图6可以看出，孵育24小时后，IκBα和NF-κBp65亚基的磷酸化以及IκBα和p-Akt的表达明显降低。在正常条件下，p65亚基定位于细胞质中。对核和细胞质分级提取物的进一步研究表明，p65亚基从细胞质转运到细胞核。用MFG-E8预处理1h可以剂量依赖地抑制这些蛋白质的上述变化。

实施例5

为了研究MFG-E8在NF-κB和PI3KAkt途径中的作用，在加入Aβ42之前，先将小胶质细胞与MFG-E8(100μg/mL)、MFG-E8抗体(5mg/mL)共同孵育1h。然后加入Aβ42(10μM)孵育24h后，通过Western blot分析，结果如图7所示。图7中，a为NF-κB和PI3K-Akt信号通路的Western blot结果；b为p-IκBα和IκBα表达的定量分析；c为p-p65、细胞质和核p65表达的定量分析；d为p-Akt和Akt表达的定量分析。*表示不同标记物相对于Aβ(+)/MFG-E8(-)，<0.05；**表示不同标记物相对于Aβ(+)/MFG-E8(+)，<0.05。

从图7可以看出，MFG-E8对p-IκBα、IκBα、p-p65和p-Akt的作用受其抗体的抑制，但是当使用IgG抗体(5mg/mL)时没有发现这种效应。

实施例6

先将原代小胶质细胞与MFG-E8(100μg/mL)\PDTC(10uM)或LY294002(5μM)孵育1h，然后加入在Aβ42(10μM)孵育24h，使用Q-PCR测定M1细胞和M2细胞的代表性标志物的mRNA表达，结果如图8所示。

从图8可以看出，使用内在拮抗剂阻断NF-κB和PI3K-Akt时，与单独使用Aβ42处理的组相比，PDTC(10μM)(NF-κB抑制剂)抑制M1标记物表达，LY294002(5μM)(PI3K抑制剂)提高M2标记物的表达。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学附属第一医院

<120> MFG-E8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的

应用

<130> I55064ZSF

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MFG-E8-F

<400> 1

cgggccaaga caatgacatc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MFG-E8-R

<400> 2

tctctcagtc tcattgcaca caag 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> TNF-α-F

<400> 3

tgtagcccac gtcgtagcaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> TNF-α-R

<400> 4

aggtacaacc catcggctgg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IL-1β-F

<400> 5

tgtgcaagtg tctgaagcag c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IL-1β-R

<400> 6

tggaagcagc ccttcatctt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CD86-F

<400> 7

acgatggacc ccagatgcac ca 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CD86-R

<400> 8

gcgtctccac ggaaacagca 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Arg-1-F

<400> 9

agccaatgaa gagctggctg gt 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Arg-1-R

<400> 10

aactgccaga ctgtggtctc ca 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IL-10-F

<400> 11

gccttatcgg aaatgatcca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IL-10-R

<400> 12

tctcacccag ggaattcaaa 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CD206-F

<400> 13

tcagctattg gacgcgaggc a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CD206-R

<400> 14

tccgggttgc aagttgccgt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> β-actin-F

<400> 15

accctaaggc caaccgtgaa 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> β-actin-R

<400> 16

agagcatagc cctcgtagat gg 22

Claims (8)

1.MFG-E8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，MFG-E8用于抑制小胶质细胞的M1亚型极化，促进小胶质细胞的M2亚型极化。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，MFG-E8用于调控小胶质细胞由M1亚型向M2亚型转化。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，MFG-E8通过NF-κB和PI3K-Akt信号通路选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的应用，其中，MFG-E8的浓度为10μg/mL以上。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，MFG-E8的浓度为10-100μg/mL。

7.MFG-E8在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

8.一种用于治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于，该药物含有MFG-E8作为有效成分。