KR20130047329A

KR20130047329A - 바실러스 서브틸리스 ｎｐ１５ 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물

Info

Publication number: KR20130047329A
Application number: KR1020110112279A
Authority: KR
Inventors: 심상준; 김경록; 송영준
Original assignee: 대한뉴팜(주)
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2013-05-08

Abstract

본 발명은 미생물을 함유하는 항생제 대체용 사료첨가제에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 토양에서 분리한 바실러스 서브틸리스 NP 15 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 사료첨가용 조성물에서 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 다른 미생물과는 달리 성장이 우수하고 항균 활성을 갖는 물질을 생산하며, 고온, 위산 및 답즙에 내성을 가지고 식물계 사료의 분해섭취에 용이한 다양한 효소를 분비하는 등 다른 균주와는 다른 유용한 특성을 갖고 있어, 축산동물의 질병예방 및 폐사율 감소, 사료 효율과 체중 증대에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

바실러스 서브틸리스 ＮＰ１５ 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물{Compostion of Feed Additives Containing Bacillus subtilis NP15}

본 발명은 미생물을 함유하는 항생제 대체용 사료첨가제에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 토양에서 분리한 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것이다.

가축의 대량사육을 통한 단백질의 공급과 유제품등의 부산물은 인류의 건강과 생활의 질을 향상시키는데 기여하여 왔고 대량사육에서 가축의 질병예방을 목적으로 사용되는 항생제는 최근까지도 필수적인 것으로 인식되어 많은 양이 사용되고 있으나 과도한 사용으로 인해 전 세계적으로 규제 필요성이 제기되고 이다. 또한 현재 가축 사육을 위한 사료는 대부분 곡물이 사용되고 있으나 지속적인 인구증가로 인한 식량으로서의 곡물 수요가 증대되어 곡물을 사료 원료로서의 이용은 큰 어려움에 직면해 있다. 이에 관련 업계에서는 곡물을 대체할 수 있는 사료의 개발 및 이용되는 사료의 효율을 극대화시키기 위한 많은 노력을 기울였으며, 구체적으로 동물의 소화기능 및 흡수율을 증진시킬 수 있는 우수한 사료 첨가용조성물의 개발필요성이 제기되고 있다. 사료첨가용 조성물의 개발은 질병예방과 함께 가축의 비육과 소화를 촉진시켜 사료의 효율을 극대화시켜 사료 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 빠른 증식과 비육을 기대할 수 있다. 특히 최근 농산물의 안정성과 친환경 축산물의 수유가 높아지면서 고품질의 가축 생산을 가능하게 하여 농가 및 관련산업의 소득 수준 향상에 기여할 수 있다. 최근의 사료는 대두박, 볏짚, 옥수수 등의 전통적인 원료외에 각종 부산물과 함께 영양보충, 소화 및 흡수 향상, 성장촉진, 질병예방 등과 같은 효과를 얻기 위해 아미노산, 무기염료, 비타민, 항생물질, 효소 등과 함께 생균을 첨가하고 있다. 그러나, 질병예방이나 사료효율 증대를 위한 장기간에 걸친 항생제 사용으로 사육동물들의 건강을 유지하기가 쉽지 않다. 또한, 가축에 있어서 장기간의 동물 약물 및 항생물질의사용은 잔류 약물을 인간이 섭취함으로써 알레르기나 장내 정상 세균총의 변화를 일으키기 때문에 그의 용도와 사용범위도 제한되고 있다. 이와 같은 문제점들을 개선하기 위하여, 최근 사육 동물에서 발생하는 질병의 예방 및 치료를 위해 생균제로서 바실러스 나토, 유산 박테리아, 부틸산 박테리아, 락토바실러스 비피더스 등의 미생물이 연구되어 사용되고 있으나, 완전한 동물 질병 치료제로서 부족한 면이 많이 있다. 기존의 동물에게 보다 안전할 뿐만 아니라 동물의 장내에서 뛰어난 생존력을 나타낼 수 있는 미생물 뿐 아니라 사료 제조공정 중에서도 활성을 유지할 수 있는 새로운 미생물의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 항균활성을 가지면서, 동물의 장내에서 뛰어난 생존력을 나타내는 미생물을 함유하는 사료용 첨가제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 토양으로부터 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 분리하고, 상기 균주가 종래 사육 동물에 미생물 첨가제로 사용되는 미생물과는 달리 항균활성을 갖는 물질을 생산할 뿐만 아니라, 동물의 장내에서 생존력이 높고 각종 유용 효소를 생산함으로서, 동물의 사료 소화를 도와 동물의 비육과 증체에 효과가 뛰어 나다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 동물의 사료 소화를 도와 동물의 비육과 증체에 효과가 뛰어난 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 함유하는 사료첨가용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 NP 15 균주(기탁번호; KFCC 11503P)을 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 사료첨가용 조성물에서 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 다른 미생물과는 달리 성장이 우수하고 항균 활성을 갖는 물질을 생산하며, 고온, 위산 및 답즙에 내성을 가지고 식물계 사료의 분해섭취에 용이한 다양한 효소를 분비하며, 기존의 미생물제제인 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주(대한민국 공개특허 10-2009-0066410)와 비교하여도 높은 증체량을 나타내는 등 다른 균주와는 다른 유용한 특성을 갖고 있어, 축산동물의 질병예방 및 폐사율 감소, 사료 효율과 체중 증대에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 바실러스 서브틸리스 NP 15가 생산하는 항균활성 물질을 확인하기 위한 MALDI-TOF Mass Spectra 결과를 나타낸 것으로, A. 배양액 (hplc 기준 1mg/ml), B. CH3Cl:MeOH extract (hplc 기준 1mg/ml), C. 표준품 (1mg/ml)의 순서로 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 설팩틴의 황색포도상 구균에 대한 최소저지농도 (㎍/㎖) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 설팩틴의 열에 대한 안정성을 조사한 것이다.
도 4는 pH1.0과 pH 2.0의 강산조건에서 바실러스 서브틸리스 NP 15의 생존성을 나타낸 것이다.
도 5는 0.06%와 0.5% 농도의 담즙산 (pH=6.0)에서 바실러스 서브틸리스 NP 15의 적응성을 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 서브틸리스 NP 15가 생산하는 효소 및 활성을 나타낸 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 NP 15 균주(기탁번호; KFCC 11503P)을 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것이다.

상기 바실러스 서브틸리스 NP15균주(기탁번호; KFCC 11503P)는 2011년 1월 일자로 에 기탁되어 있으며, 항균물질인 설팩틴(surfactin)을 생산한다

본 발명의 사료첨가용 조성물의 제조에 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 공지의 발효기술에 의해 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지, 반합성배지 및 합성배지와 같은 각종 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 탄소원으로는 포도당, 수크로스, 전분, 몰라세, 물엿, 맥아당 등이 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두분, 암모늄염, 나이트레이트염 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있다. 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있다. 그러나, 탄소원, 질소원 및 무기염은 반드시 상기 성분들에만 한정되는 것은 아니며, 그 외에도 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

상기 균주는 공지의 발효 기술에 따라 적당한 온도에서 적당한 기간 동안 배양되며, 바람직하게는 예를 들면 20℃～50℃에서 10시간～5일동안 배양된다. 본 발명에 따라 수득된 미생물 배양액은 원심분리 후 세척 또는 농축에 의해 분리된 세포와 함께 또는 배양액 단독으로 사용될 수 있으며 바람직하게는 유효성분이 포함된 전체 배양액을 첨가제를 가하거나 가하지 않은 채로 동결건조 또는 분무건조되어 제제화될 수 있다. 이렇게 수득된 제제는 본 발명의 사료 첨가제 또는 사료로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 사료첨가용 조성물을 제조하기 위하여, 배양액을 직접 제제화하거나 말분, 밀분, 녹말, 텍스트린 등의 희석제 및 볏짚, 곡류, 왕겨 및 탈지 쌀겨와 같은 겨, 오일 및 지방분이 풍부한 종자 케이크와 같은 사료용 원료와 함께 제제화될 수 있다. 수득된 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 살아있는 미생물 제제는 그를 함유한 사료형태로 또는 사료 첨가제 형태로 적당량 동물에 투여되어 체중 증가 및 촉진 성장을 시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사료첨가용 조성물은 포도당 2% (w/v), 내지 4 % (w/v), 대두박 1 내지 20% (w/v), FeSO₄ 0.001 내지 0.1% (w/v), MnSO₄ 0.001 내지 0.1% (w/v) 및 효모추출물 0.1 내지 2% (w/v)를 포함하며, 더욱 바람직하게는 포도당 4% (w/v), 대두박 5.1% (w/v), FeSO₄ 0.02 % (w/v), MnSO₄0.05% (w/v) 을 포함한다.

또한, 본 발명의 사료첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만들어 동물이 사용할 수 있게 해주는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 셀룰라제(cellulase), 아라비난 (arabinan)을 분해하는 아라비나제 (arabinase), 아라비노갈락탄 (arabinogalactan)을 분해하는 아라비노퓨라노시타제 (arabinofuranosidase), 갈락탄을 분해하는 갈락타나제 (galactanase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 펙틴성분이 다수 포함된 식물성원료를 분해하는 펙티나제 (pectinase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase), 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소등과 같은 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 바실러스 서브틸리스 NP15 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)과 류코노스톡 속 (Leuconostoc sp.), 웨이셀라 속(Weisella sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.)의 미생물, 가축의 사료 소화흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균, 토양미생물로 동물의 체중증가와 면역증강에 도움을 주는 스트렙토마이세스속 (Streptomyces sp)과 노카르디아 속 (Nocardia sp.)의 미생물 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 미세조류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 더욱 바람직한 경우에는 비타민과 항산화물질인 b-carotene, astaxanthin을 생산하는 미세조류로서 두나리엘라 (Dunaliella), 헤마토코쿠스 (Heamatococcus)등이 포함될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 N15과 함께, 헤마코쿠크스 균체를 첨가하여, 육계에 급여한 결과, 증체량과 사료요구율이 증가하는 것을 확인하였다.

각종 곡물, 볏짚, 과일 가공 부산물 및 대두 단백을 비롯한 부산물 및 다양한 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 사료첨가용 조성물이 사용될 수 있는 동물의 대표적인 예는 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 개, 고양이 등과 같은 가축과 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위 등과 같은 가금류이다. 또한, 투여량은 투여될 동물의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 변화되므로 일정하게 정의하기는 어려우나, 일반적으로 본 발명의 사료첨가용 조성물은 사료 1 ㎏ 당 살아있는 바실러스 서브틸리스 NP15 10⁵～10¹⁵ 세포, 바람직하게는 10⁷～10¹¹ 세포를 첨가하거나 배양물을 직접 동결건조시켜 사료 1 Kg당 건조물 0.1 내지 1 % (w/v)를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사료첨가용 조성물에 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 산성 pH 조건, 특히 위산과 유사한 pH 2이하의 조건하에서도 뛰어난 생존력을 가지며, 또한 담즙에서도 우수한 생존 및 성장 특성을 나타낸다. 이로부터, 상기 균주는 가축에 생균제로 사용할 경우 위 및 소장내에서도 생존하여 대장까지 안전하게 전달될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 기존 균주에 비해 다양한 효소를 분비하며, 이는 외부의 영양성분들을 용이하게 분해하여 균주 자신은 생존에 필수적인 탄소원 분해에 필요한 갈락타나제, 셀룰라제, 펙틱라이아제에 높은 활성을 나타낸다. 식물세포벽의 주성분인 아라비노갈락탄은 현재 사료로 이용되는 대두 콩의 주성분으로 이를 효율적으로 분해하여 탄소원을 섭취하기 위해서는 높은 효율의 아라비노갈락타나제를 사용하거나 분해하는 미생물을 이용하는 것이 바람직하며 이를 통하여 사료섭취시 분해를 용이하게 하여 사료 섭취를 용이하게 할 수 있다. 또 다른 식물세포벽의 주요성분인 펙틴질을 분해하는데 필요한 펙틱라이아제와 식물기질의 또다른 주요성분인 셀룰로즈를 분해하는 셀룰라제의 경우에도 동일한 효과를 기대할 수 있으며 이들 세 가지 효소를 모두 포함하는 경우 더욱 양호한 기질 분해를 기대할 수 있다. 뿐만아니라 산 포스파타제와 알칼리 포스파타제도 가지고 있어 생체 에너지 발생에 필수적인 인과 같은 성분을 다량으로 흡수하여 생존률을 증가시킬 수 있다. 또한 항균 및 항바이러스 작용을 갖는 설펙틴의 생산 하므로 전반적으로 이들의 역할이 가축의 장내 환경을 개선시키게 되고, 따라서 가축의 체중 증가를 보다 효과적으로 유도하게 된다는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 균주를 포함하는 사료를 육계와 자돈등의 동물에 급여할 경우에는 무첨가 대조군에 비해 사육 동물의 체중이 증가하며, 사료 효율 역시 무첨가 대조군에 비해 높게 나타난다.

바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 포함하는 본 발명의 사료첨가용 조성물은 종래 사료 첨가용으로 사용되는 미생물과는 달리 항균 활성을 갖는 설펙틴을 생산하며, 성장이 뛰어나면서도 내산 및 내 담즙 활성을 갖고 다양한 기질을 분해하여 탄소원과 인 섭취에 도움이되는 효소들을 가지고 있어 축산동물의 사료 효율 및 체중 증대 효과가 뛰어나며, 기존 설팩틴 생산 미생물제제인 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주(대한민국 공개특허 10-2009-0066410)와 비교하여도 이유자돈의 증체율이 증가하였다는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 분리 배양

항생제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여, 경기도 수원시내 토양을 건조 후 정량 1g을 멸균 증류수 10 ㎖에 혼합 후 이것을 원액으로 하여 10분의 1씩 7번 희석하여 얻은 희석액 10 ㎖을 영양 아가 배지(nutrient agar, Difco Co. USA)에 1 ㎖씩 도말하여 30℃에서 40시간 배양하였다. 배양 후 형성된 균 집락 중 설펙틴 생산 균주를 확인하기 위하여 혈액이 함유된 영양 아가 배지에 이쑤시개를 사용하여 균체를 접종한 후 30℃에서 48시간 배양하였으며, 황색포도당 구균에 대해 억제환을 보이는 균주를 선별한 후 혈액을 분해하여 환이 생기는 균체를 최종 선발하였다. 특히 그 환의 크기가 가장 큰 균주를 분리하여 설펙틴 생산을 후보 균주로 사용하였다. 균주 보관과 전배양을 위한 고체배지로는 영양 아가 배지를 사용하였으며, 액체 배지로 MSM 배지(NH₄NO₃ 4g, KH₂PO₄ 4g, Na₂HPO₄ 5.6g, MgSO₄·7H₂O 0.1g, CaCl₂·7H₂O 1mg, FeSO₄·7H₂O 1mg, EDTA(Na₂) 0.1mg, Glucose 40g, pH=7.0))를 사용하여 설펙틴을 생산하였다. 단일집락 하나를 상기 액체배지 50 ㎖ (250 ㎖ 프라스크)에 접종하고 30℃에서 전 배양한 후 동일배지 200 ㎖ 배지(500 ㎖ 프라스크)에 5%의 비율로 전 배양한 배양액을 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 3일간 배양하였다. 이때 배양 시 균주의 성장과 설펙틴의 생산을 알아보기 위해 12시간 마다 배양액을 샘플링하였다. 성장 정도는 600 ㎚에서 흡광도(OD600)를 측정하여 비교하였다. 설펙틴 생산량은 표준물질(sigma S3523)을 사용하여 HPLC로 비교 측정하였다. 그 결과, 균주의 성장은 모두 배양 20시간부터 급격히 증가하였으며 설팩틴의 생산은 40시간 후에 최대값을 보이다가 50시간 이후에는 감소 경향을 보이면서 유지되는 것으로 나타났다. 상기 균주의 정확한 동정을 위해 한국미생물보존센터에 의뢰하여 동정을 실시한 결과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 98.6% 일치하였으며, 이로부터 본 발명자들은 상기 균주를 바실러스 서브틸리스에 속하는 "바실러스 서브틸리스 NP15" 균주라 명명하고, 2011년 1월 18일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호; KFCC 11503P).

실시예 2: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 항균 활성 측정 및 설팩틴의 확인

실시예 1에서 분리한 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 항균 활성을 확인하기 위하여, 상기 균주를 MSM배지에서 40시간동안 배양한 후 원심분리하여 얻어진 배양 상등액을 5N 염산 을 이용하여 pH 2 정도에서 침전시키고, 상기 침전물을 다시 원심분리하여 상등액은 버리고 침전물만 원심분리하여 회수하였다. 얻어진 침전물을 dichloromethane, acetone, chloroform:methanol (2:1), metahnol 등으로 각각 추출하여 얻어진 분획을 이용하여 항균활성을 확인한 결과 chloroform:methanol(2:1), acetone 등에서 활성을 보였으며 유기용매에 잘 녹고 물에는 잘 녹지 않는 것으로 보아 lipid 등의 소수성 물질을 예상할 수 있었다. 항균 활성을 보이는 물질을 확인하기 위해 배양액을 여과한 것과 chloroform:methanol(2:1)로 추출한 용매층을 표준품과 함께 MALDI-TOF Mass spectroscopy (Voyager-DE STR, Applied Biosystems, 아주대학교 공동기기원)를 통해 확인 한 결과 분자량(m/z) 1030, 1044 및 1060을 major로 하는 complex물질들이 검출되었다. Database 검색결과 이들은 바실러스에서 생산되는 항균물질 설팩틴으로 밝혀졌다 (도 1).

설팩틴 표준품 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 S3523)과 여과배양액 및 배양침전물의 chloroform:metahnol (2:1) 추출물 모두에서 표준품과 분자 피크가 일치함을 확인할 수 있었고 동일한 분자량을 보이는 것으로 확인되었다.

설팩틴을 이용하여 질병 원인체로 작용하는 다양한 병원성세균에 대한 항균 효과를 액체배지희석법에 의해 측정하였다. 최소억제농도(MIC) 측정은 영양배지(BD사, 미국)에 설팩틴을 넣고 2배씩 계열희석한 후, 균의 최종 희석농도를 1.0x10⁶CFU/㎖로 하여 24시간 배양 후 세균의 발육유무를 육안으로 확인하였으며, 세균의 발육이 인정되지 않는 최소농도를 MIC로 결정하였다. 그 결과, 설팩틴은 주로 그람양성 세균에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었 다(표 1). 소의 유방염 등을 유발하는 황색포도상 구균에 대해 가장 항균활성이 좋은 것으로 나타났다 (도 2).

다양한 병원균에 대한 설팩틴의 최소억제농도 (㎍/㎖)

구분	균주명	MIC (㎍/㎖)
그람 양성	Bacillus subtilis ATCC 6633	50
	Enterococcus feacalis KCTC 2011	50
	Staphylococcus aureus ATCC 6538P	25
	Streptomyces suis KCTC 3557	50
그람 음성	Escherichia coli KCTC 1682	>2,500
	Pseudomonas ATCC10145	>2,500
	Serratia marcescence ATCC13880	>2,500
	Salmonella KCTC 1926	>1,000
	Salmonella KCTC 2932	>2,500

실시예 3: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 배양

균주 보관과 전배양(seed) 접종을 위한 고체 배지로는 영양 아가 배지(Nutrient agar, BD사, 미국)를 사용하였으며, 액체 배지로는 분리 정제의 용이성을 위해 최소 배지를 사용하였으며 그 조성은 4% (w/v) 포도당, 50 mM NH⁴NO₃, 40 mM Na₂HPO₄, 30 mM KH₂PO₄, 4 μM FeSO₄, 7 μM CaCl₂, 4 μM sodium EDTA, 0.5% (w/v) Yeast extract 넣고 pH를 멸균 후 7.2가 되도록 하여 사용하였다. 500 mL 플라스크에 100mL의 배지를 각각 넣고 nutrient broth와 상기 생산배지를 전 배양으로 하여 30℃에서 200rpm으로 60시간 배양한 결과, 설팩틴의 생산량은 1.8g/L, 건조균체량은 13.8g/L를 나타내었다. 최적배양조건을 수회 조사하여 본 발명자들이 분리한 균주가 기존균주와 다른 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 비교하기 위해 설팩틴 생산균주인 바실러스 서브틸리스 에이티씨 21332균주와 NP15균주를 사용하여 최종적으로 본 배양에 사용한 배양액으로 4% 포도당, KH₂PO₄ 4.0g/L, K₂HPO₄ 4.0g/L NH₄(COHO) 1g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2g/L, MnSO₄·H2O 0.15g/L, CaCl₂·7H₂O 0.2mg/L, FeSO₄·7H₂O 1.1g/L, EDTA(Na₂) 0.1mg/L, Yeast extract 5g/L, Antifoam 0.001%를 넣고 5L jar fermentror에 총 3L로 제조한 배지를 사용하여 비교하였다.

배양조건은 30℃ 200rpm 으로 교반하면서 pH 6.7을 유지하고 통기량을 초기 1vvm에서 점차 0.1vvm까지 낮추는 방식으로 70시간 동안 배양하였다. 그 결과 설팩틴의 생산량은 공시균주와 유사하지만 균체량은 NP15균주가 더 높았다 (표 3). 이러한 결과로 NP15균주는 사료첨가제 제조 시 더 많은 균체량을 생산하여 원가를 절감할 수 있을 것으로 예상되어 산업적으로 유용할 것으로 판단되었다.

분리주와 공시균주의 건조균체량 및 설팩틴 생산량

	건조균체량 (g/L)	설팩틴 생산량 (g/L)
NP15	20.3	2.1
ATCC21332	12.9	2.1

실시예 4: 설팩틴의 독성 및 안정성 시험

설팩틴의 동물사료첨가제로서 사용하기 위한 안정성 확보를 위해 급성 경구독성을 통해 1차적인 독성시험을 실시하였다. 독성시험은 시험의 공정성을 위해 (주)켐온에 수탁의뢰하여 실시하였다. 먼저 표준품인 설팩틴(surfactin)은 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 S3523)로 부터 구입하여 실시하였으며 시험대상은 건조균체 및 생균으로 나누어 실시하였다. 급성경구독성시험은 국립수의과학검역원 고시 (2009-18호, 2009년 12월 30일)에 따라 암수 각각 5마리로 구성된 총 10마리의 mouse를 이용하여 제공한 시료를 사료 및 음료 형태로 제조하여 급여하는 것으로 각각 총 8주간 진행되었다(표 4). 전반적인 마우스에 대한 급성경구독성은 표준품과 시료 모두 중등도 이하의 결과를 보였고 본 연구를 통해 준비된 시료에서 체중 kg 당 4g 이상의 결과를 보여 매우 안정한 것으로 판단되었다.

설팩틴 및 생산균주의 마우스 급성 경구독성 시험 결과

성분	급성경구독성 (LD₅₀, mg/Kg)
발효 건조물	4,000
생균 (2.0X10¹¹/㎖ CFU)	5,000
표준품	5,805

실시예 5: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 pH 및 담즙 내성

사료용 첨가제 제조 시 활성성분인 설팩틴의 보존력과 안정성을 확인하기 위해 고온 및 산성조건에서의 성능을 확인하였다.

바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 소화 과정에서의 위장관 내 생존 능력을 평가하기 위하여, 산성 조건 및 담즙에 대한 내성을 조사하였다. 산성 조건하에서의 생존능력을 평가하기 위하여, 상기 균주를 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 정치 배양하여 균의 농도가 10¹² 내지 10¹³ 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)/㎖이 되도록 하였다. 배양된 균은 6,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균을 수집하였고, 이를 멸균수로 2회 세척한 후 1/100로 농축하여 세포수가 약 10¹⁰CFU/㎖이 되도록 하여 사용하였다. pH 1, 2, 3, 4 및 5로 조정된 완충액에 희석한 균을 접종하여 1, 2 및 4시간동안 37℃에서 배양한 후, 멸균수로 희석하여 트립티카제 소이 아가(trypticase soy agar, BD사, 미국)에 접종하여 콜로니를 계수하였다. 생존률(%)은 반응시간 후의 생균수를 초기접종시 세균수로 나누어 산출하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 NP15는 산성 pH 조건하에서도 비교적 안정하게 생존하는 것을 알 수 있었다(표2). 위산의 pH와 유사한 pH 1에서도 4시간동안 약 64%의 생존률을 나타내었으며, pH 2 이상에서는 4시간 처리시 85.7% 이상의 우수한 생존률을 나타내었다.

다음으로, 담즙 내성을 평가하기 위하여 트립티카제 소이 배지에 0.06% 와 0.5%의 담즙산을 첨가한 배지를 이용하여 바실러스 서브틸리스 NP15를 접종하여 37℃에서 배양하면서, 12시간 동안 분광광도기를 이용하여 550 ㎚ 파장에서의 흡광도에 의한 균의 생장 정도를 측정하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 NP15균주는 담즙산의 처리에 의해 초기 성장은 억제되었으나 6시간 이후에는 정상적으로 회복하여 성장하였음을 알 수 있다 (도 6). 이로부터 바실러스 서브틸리스 NP-15 균주는 담즙에서도 우수한 생존 및 성장을 나타낸다는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 가축에 생균제로 사용할 경우 위 및 소장내에서도 생존하여 대장까지 전달될 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주가 생산하는 효소 활성

바실러스 서브틸리스 NP15 균주가 분비하는 글루코시다제, 갈락토시다제, 만노시다제, 셀로바이아제, 싸카라제, 포스파타제, 트레할라제, 이눌리나제등의 효소활성은 API CH-50 키트(bioMerieux, Montalieu-Vercieu, France)를 이용하였고 갈락타나제 측정은 라치우드 갈락탄 (Megazyme, Wicklow, Ireland)을 이용하여 갈락토즈 유리정도를 소모지-넬슨법으로 측정하였다. 셀룰라제 측정은 카르복시메틸셀룰로즈 (Sigma, yongin, Korea)를 기질로 하여 측정하였고 펙티나제는 대두펙틴 또는 폴리갈락투론산 (Sigma, Yongin, Korea)을 기질로 갈락투로닉산 유리정도를 측정하였다. 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 트립티카제 소이 배지에 접종하고 호기 조건으로 30℃에서 30시간 배양한 후 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성은 대조군과 비교하여 0점에서 5점까지 발색정도를 확인하여 상대적으로 평가하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 NP15는 종래에 생균제로 사용되고 있는 다른 바실러스 서브틸리스들과는 달리 갈락타나제와 펙티나제에 대해 높은 활성을 나타내었다 (도 8). 이러한 사실로 동물이 식물성원료를 사료로 공급할 경우 더욱 효과적으로 분해하여 영양원을 섭취하는데 유리할 것으로 사료되었다. 또한 셀롤라제와 알칼린 및 산 포스파타제에도 유의한 활성을 나타내었는데 이들은 모두 동물의 생존에 필수적인 탄소원과 인산 효율을 증가시킬 수 있는것이다.

실시예 7: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 육계에서의 효과

육계에 대한 효과는 경상대학교 수의과대학 동물의약연구소에서 15일령의 육계를 사용하여 각 20마리씩을 한 시험군으로 대조군포함 3개군으로 나누어 실시하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 NP15가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 실시예 1 에서 분리된 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 톤 당 0.5kg과 1.0kg씩 사료에 첨가하여 4주간 급여하였다. 일정한 시간에 실험계의 일반상태 관찰하고 각군의 사료섭취량을 매일 측정하여 기록하였으며, 실험계의 체중을 투약전, 그리고 투약후 1주일에 한 번씩 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하여 층체율을 산정하였으며, 사료 섭취율은 주간별로 누적 사료 섭취량으로 계산하였다. 사료 효율(%)은 체중 증가량을 사료 섭취율로 나누어 나타내었다. 실험 종료 시점에 모든 실험계를 대상으로 심장천공법을 통해 채혈한 다음, 일부 혈액은 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 호염기구, 그리고 호중구 등을 혈액자동분석기를 이용하여 분석하였고, 일부 혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하여 혈청 중의 IgG의 농도를 ELISA kit를 이용하여 분석하였다. 혈청 중 IgG의 농도를 측정하기 위해 혈청을 1,000배 희석하여 ELISA에 적용하였다. 각 실험군으로부터 얻은 자료 결과를 Sigma plot을 이용하여 student's t-test로 실시하여, p < 0.05일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 시험기간 동안 폐사계는 없었으며, 모든 실험군의 시험계에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 표 4 시험계에 대해 시험약 투여전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 상대적으로 개선된 상태를 보였으며, 특히, Bacillus subtilis를 사료에 0.1% (1 kg/ton feed)로 투여한 실험군의 증체율과 사료요구율이 가장 좋게 나타났다. Bacillus subtilis와 Bacillus subtilis 합제를 사료 ton 당 0.5kg 혼합한 실험군은 비슷한 사료요구율을 나타내었다. 표 4는 육계의 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호산구 수 등이 증가하였으며, 백혈구와 호중구는 감소하는 경향을 나타내었다. 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호염구 수의 경우, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)과, Bacillus subtilis와 해조추출물의 합제를 0.05와 0.1%를 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. Bacillus subtilus와 해조류의 육계급여가 자돈에서와 같이 비특이 면역기능과 관련성이 있는 일부 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다.

바실러스 서브틸리스 NP 15균주를 이용한 육계에서의 효과

구분	실험군
구분	대조군	0.5kg군	1.0kg군
초기체중 (g)	459±29.4	457±22.4	460±31.2
종료체중 (g)	1,917±196.2	1,968±201.4	2,252±220.5
0 ～ 7 일
증체량, g	261±2.3	276±2.2	315±3.1
사료섭취량, g	539±4.2	558±4.7	628±5.1
사료요구율(feed/gain)	2.07±0.02	2.02±0.03	1.99±0.02^*
0 ～ 14 일
증체량, g	559±4.3	591±4.6	673±5.4
사료섭취량, g	1,109±10.2	1,145±10.9	1,282±11.3
사료요구율(feed/gain)	1.98±0.2	1.94±0.3	1.90±0.3^*
0 ～ 21 일
증체량, g	951±6.4	986±6.8	1,134±8.3
사료섭취량, g	1,862±12.4	1,912±13.2	2,126±15.1
사료요구율(feed/gain)	1.96±0.2	1.94±0.3	1.87±0.2^*
0 ～ 28 일
증체량, g	1,458±12.3	1,511±13.1	1,792±15.7
사료섭취량, g	2,837±21.2	2,923±24.5	3,310±27.1
사료요구율(feed/gain)	1.95±0.3	1.93±0.3	1.85±0.2^*

육계 실험에서의 혈액분석 지표

Parameters	실험군¹ ⁾
Parameters	대조군	0.5kg군	1.0kg군
RBC(M/㎣)	2.31±0.24	2.37±0.12	2.87±0.25^**
WBC(M/㎣)	16.65±1.84	16.22±1.27	11.49±1.12^*
Hemoglobin(g/dl)	9.2±0.3	9.8±0.5	14.7±1.1^**
Lymphocytes(%)	68.1±4.54	59.9±4.42	64.8±3.23
Monocytes(%)	263±15.2	271±20.5	343±20.4^**
Eosinophiles(%)	1.13±0.08	1.17±0.04	1.29±0.07^**
Basophiles(%)	2.75±0.07	2.72±0.32	2.65±0.36
Neutrophiles(%)	24.5±1.29	23.9±1.45	21.2±1.36^**

육계 실험에서의 IgG농도 변화

Control	0.5 kg군	1.0 kg군
74.2 ± 2.26	74.3 ± 2.14	76.1 ± 2.14^*

실시예 8: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 이유자돈에서의 증체 효과

이유자돈(LandracexYorkshirexDurok)은 4주령의 3원 교잡종 (Landracex- YorkshirexDuroc) 60두를 대상으로 대조군포함 각 시험군을 20마리씩으로 3개 시험군으로 하여 4반복으로 돈방 당 5두씩 배치하여, 경상대학교 부속 동물사육장에서 5주간 사양시험을 수행하였다. 시험군은 바실러스 서브틸리스 NP-15를 각각 0.01, 0.05, 0.1% 사료에 첨가하여 공급한 것이고 대조군은 사료만 공급한 것이다. 28℃ 전·후, 상대습도 50-70%, 12시간의 명암주기, 환기가 되는 환경에서 사료 및 상수도수를 자유급여 시켰다. 실험기간 동안 사료섭취량 및 체중을 매주 측정하여 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI) 및 사료요구율(feed/gain) 등을 계산하였다.

실험종료 시점에 모든 자돈을 대상으로 경정맥으로부터 혈액을 채혈하여 일부 혈액은 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 호염기구, 그리고 호중구 등을 혈액자동분석기를 이용하여 측정하였고, 일부 혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하여, 면역력에 미치는 영향 등을 확인하기 위해, 면역력과 관련된 IgG와 IFN-γ를 시중에 판매되고 있는 Pig IgG ELISA kit (Koma Biotech Inc., Seoul, Korea)와 Porcine IFN-gamma ELISA kit (RayBiotech Inc., Georgia, USA)를 구입하여 분석하였다. 실험을 통해 얻어진 각 실험군의 자료들을 분석하여 각 실험군 간의 유의성 검정을 수행하기 위해 분석된 자료들을 Sigma plot을 이용하여 student's t-test로 실시하여, p < 0.05일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 NP15가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 실시예 1 에서 분리된 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.5 kg과 1 kg을 첨가하여 4주간 급여하였다. 생산성 및 증체율을 측정하기 위해 입수시와 매주별 이유자돈의 체중을 측정하여 증체율을 산하였으며, 사료 섭취율은 주간별로 누적 사료 섭취량으로 계산하였다. 사료 효율(%)은 체중 증가량을 사료 섭취율로 나누어 나타내었다. 시험기간 동안 폐사돈은 없었으며, 모든 실험군의 시험돈에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 표 7은 시험돈에 대해 시험약 투여전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 나타났으며, 특히, Bacillus subtilis를 사료에 1.0 kg/ton (0.1%) 투여한 실험군의 증체율이 가장 높았으며, 사료요구율은 가장 낮게 나타났다. 표 8은 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 그리고 호염기구 수 등이 증가하였으며, 백혈구와 호중구는 감소하는 결과를 나타내었다. 림프구와 단핵세포 수의 경우, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)에서 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는, Bacillus subtilis 급여가 자돈에서 비특이 면역기능과 관련성이 큰 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다.

이유자돈을 이용한 바실러스 서브틸리스 NP15 급여에 따른 체중변화

구분	실험군
구분	대조군	0.5kg군	1.0kg군
초기체중 (kg)	6.12±0.13	6.08±0.28	6.09±0.31
종료체중 (kg)	12.95±0.74	13.35±0.69	15.37±0.56
0 ～ 7 일
증체량, kg	1.26±0.21	1.31±0.24	1.43±0.16
사료섭취량, kg	2.05±0.26	2.13±0.31	2.25±0.23
사료요구율(feed/gain)	1.63±0.2	1.63±0.3	1.57±0.2
0 ～ 14 일
증체량, kg	3.32±0.14	3.32±0.21	3.65±0.31
사료섭취량, kg	5.86±0.42	5.84±0.47	6.05±0.41
사료요구율(feed/gain)	1.77±0.2	1.76±0.2	1.66±0.1
0 ～ 21 일
증체량, kg	5.26±0.38	5.42±±0.42	6.90±0.51
사료섭취량, kg	8.59±0.53	8.75±0.56	10.3±0.64
사료요구율(feed/gain)	1.63±0.2	1.61±0.3	1.49±0.2
0 ～ 28 일
증체량, kg	6.83±0.47	7.27±0.56	9.28±0.71
사료섭취량, kg	11.4±0.84	11.9±0.77	14.0±0.86
사료요구율(feed/gain)	1.67±0.2	1.64±0.2	1.51±0.3**

이유자돈에서의 혈액세포의 변화

지 표	실험군
지 표	대조군	0.5 kg군	1.0 kg군
RBC(M/㎣)	7.21±0.33	7.28±0.29	7.61±0.37
WBC(M/㎣)	14.26±2.03	13.92±2.04	12.36±3.24
Hemoglobin(g/dl)	14.4±1.36	14.4±1.84	14.6±2.53
Lymphocytes(%)	40.1±3.16	42.24±2.46	49.6±2.35^**
Monocytes(%)	2.9±0.22	3.1±0.37	3.8±0.52^**
Eosinophiles(%)	9.9±2.41	10.1±2.42	11.1±2.11
Basophiles(%)	0.35±0.05	0.36±0.04	0.42±0.09
Neutrophiles(%)	45.9±3.25	43.9±3.43	35.5±2.24^**

이유자돈에서의 면역지표의 변화정도

Item	실험군
Item	대조군	0.5kg	1.0kg
IgG (ng/ml)	3.82 ± 0.31	4.15 ± 0.39^**	4.46 ± 0.35^**
IFN-γ (pq/ml)	32.4±1.27	32.9±1.43	35.6±1.36^**

실시예 9: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주와 조류배양물 혼합제제의 육계에서의 효과

육계에 대한 혼합제제의 효과는 실시예 7과 동일한 15일령의 육계를 사용하여 각 20마리씩을 한 시험군으로 대조군포함 3개군으로 나누어 실시하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 NP15와 헤마토코쿠스가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.449kg과 헤마토코쿠스 0.001 kg을 사료에 첨가한것을 0.5kg군으로 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.998kg과 헤마토코쿠스 0.002 kg을 사료에 첨가한것을 1.0kg 군으로 하여 4주간 급여하였다. 동물의 체중 및 사료섭취율, 상태관찰, 혈액 및 면역계의 변화정도는 실시예 7과 동일하게 실시하였다. 시험기간 동안 폐사계는 없었으며, 모든 실험군의 시험계에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다.

표 10은 시험계에 대해 시험약 투여전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 상대적으로 개선된 상태를 보였으며, 특히, 바실러스 서브틸리스 NP15와 헤마투코쿠스를 혼합하여 사료에 0.5 kg/Kg 으로 투여한 실험군의 증체율과 사료요구율이 가장 좋게 나타났다. 혼합제를 사료 kg 당 1.0 kg 혼합한 실험군은 비슷한 사료요구율을 나타내었다. 표 11은 육계의 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호산구 수 등이 증가하였으며 특히 헤모글로빈 수치가 크게 증가하였고, 백혈구와 호중구는 감소하는 경향을 나타내었다. 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호염구 수의 경우, 혼합제를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, 혼합제 Bacillus subtilis와 0.05와 0.1%를 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. Bacillus subtilus의 육계급여가 자돈에서와 같이 비특이 면역기능과 관련성이 있는 일부 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다.

NP15균주와 헤마토코쿠스 혼합제제의 육계에 대한 효과

구분	실험군
구분	대조군	0.5 kg 합제	1.0 kg 합제
초기체중 (g)	459±29.4	458±23.2	461±29.9
종료체중 (g)	1,917±196.2	2,054±202.3	2,161±197.1
0 ～ 7 days
증체량, g	261±2.3	298±2.5	305±3.2
사료섭취량, g	539±4.2	601±4.9	611±5.3
사료요구율(feed/gain)	2.07±0.02	2.02±0.03	2.00±0.03^*
0 ～ 14 days
증체량, g	559±4.3	623±5.7	659±6.1
사료섭취량, g	1,109±10.2	1,199±10.8	1261±11.5
사료요구율(feed/gain)	1.98±0.2	1.92±0.4^*	1.91±0.2^*
0 ～ 21 days
증체량, kg	951±6.4	1,055±7.4	1,059±7.9
사료섭취량, kg	1,862±12.4	2,031±14.3	2,001±13.2
사료요구율(feed/gain)	1.96±0.2	1.93±0.2^*	1.89±0.3^*
0 ～ 28 days
증체량, kg	1,458±12.3	1,596±13.6	1,700±16.4
사료섭취량, kg	2,837±21.2	3,048±24.6	3,221±26.5
사료요구율(feed/gain)	1.95±0.3	1.91±0.2^*	1.89±0.2^*

NP15균주와 헤마토코쿠스 혼합제제의 육계 혈액지표 분석

Parameters	실험군
Parameters	대조군	0.5 kg 합제	1.0 kg 합제
RBC(M/㎣)	2.31±0.24	2.45±0.16^*	2.62±0.21
WBC(M/㎣)	16.65±1.84	15.20±1.32	14.73±1.31
Hemoglobin(g/dl)	9.2±0.3	10.6±1.2^*	12.6±0.8^**
Lymphocytes(%)	68.1±4.54	61.8±3.21	63.5±4.21
Monocytes(%)	263±15.2	290±18.6^*	318±13.6^**
Eosinophiles(%)	1.13±0.08	1.20±0.05	1.23±0.07^*
Basophiles(%)	2.75±0.07	2.69±0.23	2.66±0.23
Neutrophiles(%)	24.5±1.29	23.3±1.38^**	22.1±1.52^**

NP15균주와 헤마토코쿠스 혼합제제의 육계에 대한 면역증진 효과

Control	0.5 kg 합제	1.0 kg 합제
74.2 ± 2.26	74.5 ± 2.78	75.3 ± 1.59

실시예 10: 바실러스 서브틸리스 NP15 균주와 조류배양액 혼합제제의 이유자돈에서의 증체 효과

이유자돈의 시험은 실시예 8과 같이 4주령의 3원 교잡종(Landrace×Yorkshire×Duroc) 60두를 대상으로 대조군포함 각 시험군은 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.449kg과 헤마토코쿠스 0.001 kg을 사료에 첨가한 것을 0.5kg군으로 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.998kg과 헤마토코쿠스 0.002 kg을 사료에 첨가한것을 1.0kg 군으로. 시험군 1은 바실러스 서브틸리스 NP-15를 각각 0.05% 와 헤마토코쿠스 세포 동결건조물 0.005% 를 공급한 것이고 대조군은 사료만 공급한 것이다. 실시예 8과 동일한 조건으로 실험기간 동안 사료섭취량 및 체중을 매주 측정하여 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI) 및 사료요구율(feed/gain) 등을 계산하였다. 시험기간 동안 폐사돈은 없었으며, 모든 실험군의 시험돈에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 표 13은 시험돈에 대해 시험약 투여 전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 나타났으며, 특히, Bacillus subtilis를 사료 톤당 0.5 kg 급여한 실험군의 증체율이 가장 높았으며, 사료요구율은 가장 낮게 나타났다. Bacillus subtilis 합제를 사료 ton 당 0.5kg을 혼합한 실험군은 서로 유사한 증체율과 사료요구율을 나타내었으나, 상대적으로 Bacillus subtilis 합제를 0.5kg을 사료에 혼합하여 투여한 군이 증체율과 사료요구율에서 좋은 결과를 나타냈다.

표 14는 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 그리고 호염기구 수 등이 증가하였으며, 백혈구와 호중구는 감소하는 결과를 나타내었다. 림프구와 단핵세포 수의 경우, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)과, Bacillus subtilis와 해조추출물의 합제를 0.1% 첨가한 군(p<0.05)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)과, Bacillus subtilis와 해조추출물의 합제를 0.1% 첨가한 군(p<0.05)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는, Bacillus subtilis와 해조류의 급여가 자돈에서 비특이 면역기능과 관련성이 큰 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다.

NP15균주와 헤마토코쿠스 혼합제제의 이유자돈에 대한 효과

구분	실험군
구분	Control	시험군 1	시험군 2
초기체중 (kg)	6.12±0.13	6.11±0.22	6.10±0.13
종료체중 (kg)	12.95±0.74	13.39±0.71	14.46±0.68
0 ～ 7 days
증체량, kg	1.26±0.21	1.30±0.23	1.31±0.15
사료섭취량, kg	2.05±0.26	2.11±0.32	2.09±0.24
사료요구율(feed/gain)	1.63±0.2	1.62±0.2	1.60±0.3
0 ～ 14 days
증체량, kg	3.32±0.14	3.32±0.23	3.48±0.19
사료섭취량, kg	5.86±0.42	5.79±0.43	5.91±0.52
사료요구율(feed/gain)	1.77±0.2	1.74±0.2	1.70±0.3
0 ～ 21 days
증체량, kg	5.26±0.38	5.45±0.46	6.18±0.43
사료섭취량, kg	8.59±0.53	8.68±0.59	9.54±0.62
사료요구율(feed/gain)	1.63±0.2	1.59±0.3	1.54±0.2
0 ～ 28 days
증체량, kg	6.83±0.47	7.28±0.56	8.36±0.63
사료섭취량, kg	11.4±0.84	11.7±0.92	13.1±0.85
사료요구율(feed/gain)	1.67±0.2	1.61±0.2*	1.57±0.3**

NP15균주와 헤마토코쿠스 혼합제제의 이유자돈의 혈액지표 분석

지 표	실험군
지 표	대조군	0.5 kg군	1.0 kg 군
RBC(M/㎣)	7.21±0.33	7.32±0.69	7.48±0.69
WBC(M/㎣)	14.26±2.03	13.65±2.91	12.86±2.91
Hemoglobin(g/dl)	14.4±1.36	14.5±2.13	14.6±1.13
Lymphocytes(%)	40.1±3.16	43.6±4.15	46.5±3.21^*
Monocytes(%)	2.9±0.22	3.3±0.31	3.6±0.41^*
Eosinophiles(%)	9.9±2.41	10.3±2.07	10.8±2.06
Basophiles(%)	0.35±0.05	0.38±0.06	0.40±0.07
Neutrophiles(%)	45.9±3.25	41.37±3.58	37.8±2.58^*

NP15균주와 헤마토코쿠스 혼합제제의 이유자돈에 대한 면역증진 효과

Item	실험군
Item	대조군	0.5 kg군	1.0 kg 군
IgG (ng/ml)	3.82 ± 0.31	4.24 ± 0.42^**	4.37 ± 0.46^**
IFN-γ (pq/ml)	32.4±1.27	33.7±1.29^**	34.8±1.35^**

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11503P

20110118

Claims

바실러스 서브틸리스 NP15 균주(기탁번호; KFCC 11503P)을 포함하는 사료첨가용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 균주는 항균물질 설팩틴을 생산하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제1항에 있어서, 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 효소 제제는 갈락타나제, 펙티나제, 아밀라제, 파이타제, 포스파타제, 셀룰라제, 아라비나제, 자일라나제, 말타제 및 리파제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제1항에 있어서,비병원성의 다른 미생물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 미생물은 미세조류, 락토바실러스 속, 류코노스탁 속, 노카르디아속, 스트렙토마이스속, 아스퍼질러스 오리자에 및 사카로미세스 세레비지에로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제1항에 있어서, 추가적으로 1종 이상의 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제1항에 있어서, 추가적으로 베타카로틴, 아스타잔틴을 생산하는 조류를 면역증강제로 첨가하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제1항에 있어서, 추가적으로 면역증강물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 면역증강물질은 베타카로틴, 비타민 및 베타글루칸으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.