TWI802838B - 混合真菌發酵產物用於做為提升禽類免疫力之飼料添加物的用途及方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種混合真菌發酵產物，及用於做為提升禽類免疫力之飼料添加物的用途。本發明亦提供一種利用本發明之混合真菌發酵產物製備益生性飼料之方法。本發明之混合真菌發酵產物富含總酚類化合物、粗多醣、粗三萜類化合物等生物性有效成分，能更具機能性地提升動物營養消化率及抗氧化調節之能力，進而達到增強禽類免疫力的效果。

Description

混合真菌發酵產物用於做為提升禽類免疫力之飼料添加物的用途及方法

本發明係關於一種混合真菌發酵產物用於做為提升禽類免疫力之飼料添加物的用途。更特別地，係關於一種利用混合真菌發酵產物取代部分飼料原料，以製作能增強禽類免疫力的益生性飼料之方法。

隨著歐盟對於禁止抗生素應用於家禽飼養之影響，消費者之偏好也隨之改變，而生產者為因應家禽飼養過程所面臨之環境考驗並滿足消費者對於禽肉安全之考量現多選擇使用益生性之飼料添加物(如酵素、益生菌等)，嘗試取代抗生素以改善家禽之生長狀況。另外畜牧產業上配製混合飼糧時，常添加外源酵素(如纖維素酶、木聚糖酶、聚葡萄糖酶、蛋白酶等)以提高動物之營養分消化率，而為了達較佳之飼養效果，複合纖維酵素(含纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶等)也被使用，其目的多為補充動物體內未能分泌或分泌不足之部份，然大多數外源酵素可藉由微生物進行量化生產。

近年來，能源危機使部分農作物及穀物轉作為生質能源，產生大量之工業副產物，但每年這種生物質的大量堆積，導致原料浪費及環境差等問題產生，倘若能妥善處理，提高潛在具有利用價值的材料之損耗 程度，便能增加產物的附加價值。

目前雖已有於第一階段利用對蛋白質分解能力較好的枯草桿菌(N21)將飼料原料進行分解後，再於第二階段使用產酸能力較好的乳酸菌(L12)進行發酵，來提升發酵飼料的產酸能力，並藉以增加飼養動物之免疫力(黃憲榮等人，畜產研究47(4)：239-250,2014；國立嘉義大學碩士論文/2007/柯瑋羚)，但於國內及國際上尚無以二或多種不同的混合真菌，應用於發酵農業加工副產物，並將所得之發酵產物用於生產機能性飼料，以提高植物性飼料營養分利用及提高動物抗氧化能力的相關研究。而本發明已確立能更完善降解高纖維含量副產物之生產平台，並將富含高量酵素及益生性物質之混合真菌發酵產物應用於家禽飼糧中，而製得可改善家禽生長表現以及提升禽類之免疫力的益生性飼料，藉以達到促進經濟動物之健康及降低生產者之成本，並可供作為無抗生素飼養之較佳選擇。

於是，本發明之一方面係關於一種混合真菌發酵產物用於做為提升禽類免疫力之飼料添加物的用途，其中所述之混合真菌發酵產物係藉由將二或多種選自藍寶石菇菌((Blue Oyster mushroom(Pleurotus ostreatus var.columbinus))及木黴菌之菌種，以相同重量百分比(%(W/W)，較佳為10%(W/W))接種入發酵基質，並於室溫、好氧環境下發酵10-14天而得。

於本發明之一些具體實施例，所述之發酵基質係選自高纖維含量之農業加工副產物，較佳為一穀類加工副產物。於本發明之一些具體實施例，所述之穀類加工之副產物為麩皮。

於本發明之一些具體實施例，所述之混合真菌發酵產物係藉由將混合真菌進行二階段固態發酵之方式獲得。於本發明之一體實施例，所述之二階段固態發酵係包含：將藍寶石菇菌菌種接種於固態發酵基質，於室溫下發酵4-6天；及將木黴菌接種至前述之以藍寶石結菌菌種發酵之固態基質，再於室溫、好氧環境下發酵6-8天而得。

於另一方面，本發明係關於一種製備增強禽類免疫力之益生性飼料的方法，其包含將原飼糧中的5%至10%取代以所述之混合真菌發酵產物，其中所述之混合真菌發酵產物係藉由將二或多種選自藍寶石菇菌及木黴菌之菌種與發酵基質於室溫下發酵10-14天而得。

於本發明之一些其體實施例，所述之混合真菌發酵產物為一混合真菌發酵麩皮。於本發明之其他具體實施例，所述之益生性飼料係用於增強禽類之血清抗氧化性狀與抗發炎性狀，藉以提升禽類之免疫力。於本發明之一具體實施例，所述之益生性飼料係用於提高抗氧化因子Nrf2、HO-1、GST之表現量及降低促氧化因子ROMO1、NOX1之表現量。於本發明之一具體實施例，所述之益生性飼料係用於降低血清中促發炎激素腫瘤壞死因子-α(TNF-a)的濃度及降低促發炎因子NF-κ B、IL-1 β、TNF-α、iNOS之表現量。

圖1，係顯示飼糧中部份(5%或10%)取代以無發酵麩皮(WB)或混合真菌發酵產物(T2)，對於35日齡白肉雞肝臟中氧化相關因子Nrf2、HO-1、GST、ROMO1、NOX1基因之mRNA表現量的影響。數值係以管家基因 β-肌動蛋白標準化後呈現。

圖2，係顯示飼糧中部份(5%或10%)取代以無發酵麩皮(WB：Wheat bran)或混合真菌發酵產物(T2：mixed fungal fermented product)，對於35日齡白肉雞周邊血液單核細胞(PBMCs)中血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產生量之影響。數值以得自8個獨立處理動物(n=8)之平均值±S.D.表示。

圖3，係顯示飼糧中部份(5%或10%)取代以無發酵麩皮(WB)或混合真菌發酵產物(T2)，對於35日齡白肉雞肝臟中免疫相關促發炎因子NF-κ B、IL-1 β、TNF-α、iNOS基因之mRNA表現量的影響。數值係以管家基因β-肌動蛋白標準化後呈現。

實施例一、利用混合真菌發酵產物製備益生性飼料

混合真菌發酵產物之製備

將藍寶石結菌廢棄太空包打散置入滅菌袋中封口發酵3天，製成藍寶石菇菌菌種備用。另以麩皮(60%濕度)接種10%(W/W)濃度為107/mL之孢子液，於室溫好氧發酵3天，製成木黴菌菌種備用。將發酵基質麩皮以RO水調整至60%(W/W)水分並進行121℃、15分鐘之滅菌，然後接種10%(W/W)之前述備用藍寶石菇菌菌種，封口後於室溫發酵4-6天。上述之發酵進行至第五至六天時，接種入10%(W/W)之前述備用木黴菌菌種，並於室溫好氧環境下持續發酵6-8天(總發酵天數為10-14天)，而製得混合真菌發酵麩皮產物。

下表一所列為經分析測試混合真菌發酵麩皮產物中所含總酚類化合物、粗多糖、粗三萜類化合物等生物活性成分的含量。各數值係以平均值±標準偏差的方式表示，GAE代表沒食子酸當量(Gallic acid equivalent)，DW代表乾重(dry weight)，CGE代表葡萄糖當量(Glucose equivalent)，UAE代表熊果酸當量(Ursolic acid equivalent)。

將所製得之混合真菌發酵麩皮產物，以5%及10%之取代量添加至肉雞飼糧中，並充分混合而製備得益生性動物飼料。表二及表三係分別例舉其中添加取代量為5%-10%之混合真菌發酵麩皮產物的肉雞前期及肉雞後期飼料配方，對照組(Control)為不含麩皮或添加混合真菌發酵麩皮產物的基礎飼料。

¹對照組：基礎飼料(玉米-豆粕)；5% WB：基礎飼料其中5%以未經發酵之麩皮取代；10% WB：基礎飼料其中10%以未經發酵之麩皮取代；5% T2：基礎飼料其中5%以混合真菌發酵麩皮產物取代；10% T2：基礎飼料其中10%以混合真菌發酵麩皮產物取代。

²每kg基礎飼料中添加：Vit.A,15000U、Vit.D₃,3000U、Vit.E,30mg、Vit.K₃,4mg、Vit.B₂,8mg、Vit.B6,5mg、Vit.B₁₂,25μg、Ca-泛酸鹽，19mg、菸鹼酸，50mg、葉酸，1.5mg；生物素，60μg。

³每kg基礎飼料中添加：Co(CoCO₃),0.255mg、Cu(CuSO₄．5H₂O),10.8mg、Fe(FeSO₄．H₂O),90mg、Zn(ZnO),68.4mg、Mn(MnSO₄．H20),90mg、Se(Na₂SeO₃.),0.18mg。

¹對照組：基礎飼料(玉米-豆粕)；5% WB：基礎飼料其中5%以未經發酵之麩皮取代；10% WB：基礎飼料其中10%以未經發酵之麩皮取代；5% T2：基礎飼料其中5%以混合真菌發酵麩皮產物取代；10% T2：基礎飼料其中10%以混合真菌發酵麩皮產物取代。

²每kg基礎飼料中添加：Vit.A,15000U、Vit.D₃,3000U、Vit.E,30mg、Vit.K₃,4mg、Vit.B₂,8mg、Vit.B6,5mg、Vit.B₁₂,25μg、Ca-泛酸鹽，19mg、菸鹼酸，50mg、葉酸，1.5mg；生物素，60μg。

³每kg基礎飼料中添加：Co(CoCO₃),0.255mg、Cu(CuSO₄．5H₂O),10.8mg、Fe(FeSO₄．H₂O),90mg、Zn(ZnO),68.4mg、Mn(MnSO₄．H2O),90mg、Se(Na₂SeO₃),0.18mg。

實施例二、含有混合真菌發酵產物之益生性動物飼料提升禽類免疫力

1.優化雞隻的腸道型態增加對飼料之吸收利用

由下表四之數據顯示，餵食本發明之含有混合真菌發酵產物之益生性動物飼料，可使1-21日齡白肉雞的體重及體增重1.7%，並改善3%飼料效率，而對於1-35日齡白肉雞，亦顯示可改善2%飼料效率。進一步檢視於飼糧中部份取代以混合真菌發酵產物對於35日齡肉雞腸道型態之影響，發現本發明之益生性動物飼料可改善空腸與迴腸之絨毛長度：隱窩深 度比例，分別增加2.1%與5.7%。表示，本發明之含有混合真菌發酵產物之益生性動物飼料能夠顯著改善雞隻的腸道型態，進而增加對飼料之吸收與利用。

實驗數值係以每組80隻肉雞(n=80)，經過四次重複實驗(20隻肉雞/重複)獲得之平均值(n=4)。

WB：未經發酵之麩皮；T2：混合真菌發酵麩皮產物。

^a-c意指在同行中上標字母不相同者代表彼此間具有顯著差異(P<0.05)。

2.改善禽類腸道菌相

腸道菌落與消化、代謝、免疫作用、內分泌等均有相關，與全身各種生理及疾病都有密切的關聯。已有研究指出，腸道乳酸菌群與家禽健康呈現正相關性，而大腸桿菌群則為可能具有潛在危害之病原菌。因 此，本實驗採集對照組及試驗組之雞隻迴腸及盲腸內容物，將其以磷酸鹽緩衝食鹽水稀釋後，以平板塗抹法利用MRS瓊脂培養基以及Coliform培養基分別培養測定乳酸菌群及大腸桿菌群數量。測得結果列示於表五。

表五為含有混合真菌發酵產物之益生性動物飼料對於35日齡肉雞腸道菌相之影響。結果顯示，本案之混合真菌發酵產物以5%及10%之取代量添加於飼料，可分別提高乳迴腸及盲腸乳酸菌菌數5.8%及2.9%；及降低迴腸及盲腸大腸菌8.4%及9.8%。乳酸桿菌除能抑制腸道致病菌、維持消化道機能、並能促進食慾及免疫調節。因此，以本發明混合真菌發酵產物作為添加劑製得之益生性動物飼料餵養肉雞，可增加益生菌以及降低有害菌數以改善腸道菌叢環境，增強其免疫力。

實驗數值係經過三次重複實驗(4隻肉雞/重複)獲得之平均值(n=3)。

SEM：平均值之標準偏差。

WB：未經發酵之麩皮；T2：混合真菌發酵麩皮產物。

^a-c意指在同行中上標字母不相同者代表彼此間具有顯著差異(P<0.05)。

3.增強禽類之血清抗氧化性狀

自由基會損害細胞，破壞免疫系統，導致免疫能力隨之下降，因此若提供之飼糧中能補充有效消除自由基的抗氧化添加物，便能透過飲食來幫助家禽維持及增強其免疫能力。於是，本發明含有混合真菌發酵產物之益生性動物飼料在增強雞隻抗氧化性狀上的功效，亦為其提升禽類免疫能力的重要指標。

試驗選定肉雞血清之抗氧化酵素超氧岐化酶、過氧化氫酶代表肉雞體內抗氧化能力之指標，並以丙二醛代表肉雞氧化壓力指標，利用商用檢測套組針對血清進行檢測。檢測之結果列於表六。此外，為以基因層面確認混合真菌發酵麩皮於肉雞基因層面之抗氧化調控效果。試驗萃取白肉雞肝臟之mRNA，進行即時聚合酶鏈式反應，測定抗氧化因子Nrf2、HO-1、GST；以及促氧化因子ROMO1、NOX1之表現量，以管家基因β-肌動蛋白(β-actin)標準化後呈現於圖1。

表六為發酵產物對於35日齡肉雞抗氧化性狀之影響。結果顯示，本案之混合真菌發酵產物以5%及10%添加於飼料，可提升超氧岐化酶活性3.9%；提升過氧化氫酶活性21.9%；降低氧化壓力指標丙二醛濃度13.8%；提升穀胱甘肽過氧化物酶活性37.6%。

實驗數值係經過三次重複實驗(4隻肉雞/重複)獲得之平均值(n=3)。

SEM：平均值之標準偏差。

WB：未經發酵之麩皮；T2：混合真菌發酵麩皮產物；CAT：過氧化氫酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

^a-c意指在同行中上標字母不相同者代表彼此間具有顯著差異(P<0.05)。

此外，在基因層面之證據顯示，以本發明混合真菌發酵產物作為添加劑製得之益生性動物飼料餵養肉雞，可提高抗氧化因子Nrf2、HO-1、GST之表現量；同時降低促氧化因子ROMO1、NOX1之表現量(圖1)。

由上述之實驗結果表示，以本發明混合真菌發酵產物作為添加劑製得之益生性動物飼料餵養肉雞，可增強肉雞之抗氧化性狀，而有助於提升雞隻的免疫力。

3.強化禽類之免疫性狀

發炎時免疫細胞會大量分泌此類細胞激素以啟動免疫反應因子，但也使得動物採食量下降、體組織分解率上升、生長激素產生減少，最後使動物生長性能變差，繼而體組織代謝率減低，整體免疫能力下降。 利用抗生素降低發炎，雖然是有效可行的方法，但是會造成畜產品中藥殘的嚴重問題。

白肉雞常因現場飼養環境面臨不佳而有急性發炎情形產生，例如環境氨氣對於雞隻眼瞼及呼吸道黏膜之刺激，以及病原菌之危害。此時體內分泌大量促發炎因子，並且亦一併產生氧化壓力以清除病原菌及危害因子之侵害，此一反應將消耗雞隻大量能量，並可能抑制其生長表現，甚至造成緊迫死亡。故，強化免疫性狀之目的則為，適當地調降急性發炎反應所產生之可能危害，同時抗氧化之效果之提升，亦可有效降低發炎現象所帶來之的損傷。

本試驗採集肉雞血清檢體，以商用酵素結合免疫吸附分析套組測定其促發炎激素血清腫瘤壞死因子-α之濃度，以作為判斷其體內發炎反應之指標。此外，為以基因層面確認混合真菌發酵麩皮於肉雞基因層面之免疫調控效果。試驗萃取白肉雞肝臟之mRNA，並以即時聚合酶鏈式反應測定促發炎因子NF-κB、IL-1β、TNF-α、iNOS之表現量，以管家基因β-肌動蛋白標準化後呈現於圖3。

實驗結果顯示，本案之混合真菌發酵產物以5%及10%添加於飼料，可降低促發炎激素血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)達60%(圖2)；在基因層面，可降低促發炎因子NF-κB、IL-1β、TNF-α、iNOS之表現量(圖3)。表示，本發明混合真菌發酵產物作為動物飼料添加劑，可藉由提升雞隻的抗氧化之能力，同時降低發炎現象帶來之損傷，而強化其免疫性狀。

綜合以上之實驗結果顯示，以混合藍寶石菌以及木黴菌進行發酵之麩皮產物，可在發酵過程產生與單一菌株發酵相比較高量之酵素與 生物活性物質，並添加於動物飼料取代部分飼料餵養雞隻，可透過在發酵過程產生較高量具有抗氧化及抗發炎之生物活性物質，優化雞隻的腸道型態增加對飼料之吸收利用，增加益生菌與降低有害菌數以改善腸道菌叢環境，並增強肉雞之血清抗氧化性狀與抗發炎性狀，降低促發炎因子NF-κB、IL-1β、TNF-α、iNOS之表現量，與提高抗氧化因子Nrf2、HO-1、GST之表現量，藉以提升禽類之免疫力。

Claims (5)

1. 一種製備提升禽類免疫力之益生性飼料的方法，其包含將原飼糧中的5%至10%取代以一混合真菌發酵產物，其中該混合真菌發酵產物係藉由將藍寶石菇菌(Blue Oyster mushroom(Pleurotus ostreatus var.columbinus)及木黴菌(Trichoderma pseudokoningii)，以相同重量百分比(%(W/W))，與一選自高纖維含量之穀類加工副產物於室溫、好氧條件下發酵10-14天而得。
2. 如請求項1所述之方法，其中該混合真菌發酵產物為一藉由將藍寶石菇菌以10%(W/W)接種於麩皮，於室溫下發酵4-6天；及將木黴菌以10%(W/W)接種至前述之以藍寶石菇菌菌種發酵之發酵麩皮，再於室溫好氧環境下發酵6-8天而得的混合真菌發酵麩皮產物。
3. 如請求項1所述之方法，其中該益生性飼料係用於增強禽類之血清抗氧化性狀與抗發炎性狀，藉以提升禽類之免疫力。
4. 如請求項1或3所述之方法，其中該益生性飼料係用於提高抗氧化因子Nrf2、HO-1、GST之表現量及降低促氧化因子ROMO1、NOX1之表現量。
5. 如請求項1或3所述之方法，其中該益生性飼料係用於降低血清中促發炎激素腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度及降低促發炎因子NF-κ B、IL-1 β、TNF-α、iNOS之表現量。

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