KR20090066410A

KR20090066410A - 바실러스 서브틸리스 ｂｃ1212 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물

Info

Publication number: KR20090066410A
Application number: KR1020070133915A
Authority: KR
Inventors: 김종우; 한재진; 임종환; 박상진; 박을용; 신중철
Original assignee: (주) 비엔씨바이오팜
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2009-06-24

Abstract

본 발명은 사료 첨가용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 포함하는 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 종래 사료 첨가용으로 사용되는 미생물과는 달리 항균 활성을 갖는 항생물질을 생산하며, 효소 생산 능력에서도 종래 균주와는 다른 패턴을 갖고 있어 축산동물의 사료 효율 및 체중 증대에 유용하게 사용될 수 있다.

사료 첨가제, 바실러스 서브틸리스, 설팩틴 C

Description

바실러스 서브틸리스 ＢＣ1212 균주를 포함하는 사료 첨가용 조성물{Composition for Forage Additive Comprising Bacillus subtilis BC1212}

본 발명은 사료 첨가용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항생물질을 생산하는 바실러스 서브틸리스 종의 미생물을 포함하는 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.

가축 및 이들이 생산하는 생산품은 인류가 생존하기 위해 필요한 단백질의 중요한 공급원으로서 가축의 사육 및 이용의 발전은 인류의 건강과 생활의 질을 향상시키는데 있어 밀접한 관련을 갖는다. 가축을 사육하기 위한 사료는 현재 많은 부분에서 곡물이 사용되고 있는데, 최근 인구가 급격하게 증가함으로써 식량으로의 곡물의 수요가 증대되어 곡물을 사료의 원료로서 이용하기는 점점 어렵게 되었고 이러한 곡물 사료의 부족이 가축 사육의 발전에 제약이 되고 있다. 이에 사료 산업계에서는 곡물을 대체할 수 있는 사료의 개발 및 이용되는 사료의 효율을 극대화시키기 위한 많은 노력을 기울였으며, 동물의 소화기능 및 흡수율을 증진시킬 수 있는 사료 첨가용 조성물의 개발이 사료산업에서 중요한 위치를 차지하게 되었다. 사료 첨가용 조성물의 개발은 가축의 비육과 소화를 촉진시킴으로써 사료의 효율을 극대화시켜 사료 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 빠른 증식과 비육으로 인해 고품질의 가축 생산을 가능하게 하여 농가의 소득 수준 향상에 기여할 수 있다는 점에서 그 중요성이 매우 크다고 할 수 있다.

전통적으로 돼지 및 가금을 위한 동물 사료로는 주로 대두박, 참깨, 맥류, 볏짚 및 옥수수 등이 사용되어 왔으며, 최근에는 땅콩, 완두콩, 사탕무, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 대체 제품의 사용이 크게 증가되고 있다. 현재 축산농가에서 사용되는 동물 사료에는 아미노산, 무기염료, 비타민, 항생물질, 효소 등과 함께 생균제(살아있는 미생물제제)를 첨가하는데, 이는 영양보충, 소화 및 흡수 향상, 성장촉진, 질병예방 등과 같은 효과를 나타내기 위함이다. 그러나, 소화기계 질병이나 장기간에 걸친 항생제 사용 등으로 사육동물들의 건강을 유지하기가 쉽지 않은 실정이다. 또한, 가축에 있어서 장기간의 동물 약물 및 항생물질의 사용은 잔류 약물을 인간이 섭취함으로써 알레르기나 장내 정상 세균총의 변화를 일으키기 때문에 그의 용도가 제한되어 있으며, 그의 사용범위도 제한 및 감소되고 있다.

이와 같은 문제점들을 개선하기 위하여, 최근 사육 동물에서 발생하는 질병의 예방 및 치료를 위해 생균제로서 바실러스 나토, 유산 박테리아, 부틸산 박테리아, 락토바실러스 비피더스 등의 미생물이 연구되어 사용되고 있으나, 완전한 동물 질병 치료제로서 부족한 면이 많이 있다. 따라서, 동물에게 보다 안전할 뿐만 아 니라 동물의 장내에서 뛰어난 생존력을 나타낼 수 있는 새로운 생균제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 동물사료 첨가제로 사용될 수 있는 미생물에 대한 광범위한 연구를 계속한 결과, 바실러스 서브틸리스 종에 속하는 미생물 균주로서 본 발명자들에 의해 분리된 바 있는 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주가 종래 사육 동물에 미생물 첨가제로 사용되는 미생물과는 달리 항진균 및 항생활성을 갖는 물질을 생산할 뿐만 아니라, 다양한 효소생성 능력을 가져 사육 동물의 정장 및 소화 촉진 작용을 증가시킴으로써 사료 첨가용 생균제로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

상기 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주는 바실러스 속의 통성혐기성 박테이라군에 속하며, 항생물질인 화학식 1로 표시되는 설팩틴(surfactin) C를 생산한다.

상기 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주는 2004년 11월 8일자로 농업생명공학연구원에 기탁되어 있다(기탁번호: KACC 91141).

본 발명의 사료 첨가용 조성물의 제조에 사용되는 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주는 공지의 발효기술에 의해 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지, 반합성배지 및 합성배지와 같은 각종 배지가 제한없이 사용될 수 있다. (ⅰ) 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말, 몰라세 등이 사용될 수 있다; (ⅱ) 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있다; (ⅲ) 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있다. 그러나, 탄소원, 질소원 및 무기염은 반드시 상기 성분들에만 한정되는 것은 아니며, 그 외에도 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관 련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

미생물은 공지의 발효 기술에 따라 적당한 온도에서 적당한 기간동안 배양되며, 바람직하게는 예를 들면 20℃∼50℃에서 12시간∼5일동안 배양된다. 본 발명에 따라 수득된 배양액은 반복 세척함으로써 분리된 세포와 함께 또는 배양액 단독으로 사용될 수 있다. 그 외에도 세포를 함유한 배양액 또는 분리된 세포는 첨가제를 가하거나 가하지 않은 채로 동결건조 또는 분무건조되어 제제화될 수 있다. 이렇게 수득된 제제는 본 발명의 사료 첨가제 또는 사료로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가용 조성물을 제조하기 위하여, 배양액을 직접 제제화하거나 밀분, 녹말, 텍스트린 등의 희석제 및 곡류, 왕겨 및 탈지 쌀겨와 같은 겨, 오일 및 지방분이 풍부한 종자 케이크와 같은 사료용 원료와 함께 제제화될 수 있다. 또한, 배양액을 세척하여 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 전술한 방법으로 제제화할 수 있다. 수득된 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 살아있는 미생물 제제는 그를 함유한 사료형태로 또는 사료 첨가제 형태로 적당량 동물에 투여되어 체중 증가 및 촉진 성장을 시킨다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 밀기울 1 내지 20 중량%, 쌀겨 1 내지 20 중량%, 대두박 1 내지 20 중량%, FeSO₄ 0.001 내지 0.1 중량%, MnSO₄ 0.001 내지 0.1 중량% 및 잔량의 물을 포함하며, 바람직하게는 밀기울 2.8 중량%, 쌀겨 4.9 중량%, 대두박 5.1 중량%, FeSO₄ 0.02 중량%, MnSO₄ 0.05 중량% 및 잔량(87.13 중량%)의 물을 포함한다.

또한, 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며, 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)의 미생물, 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L.L. J. Animal Sci. 1976, 43. 910-926) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Jhonson, D.E et al. J. Anim. Sci., 1983, 56, 735-739; Williams, P.E.V. et al, 1990, 211) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 적절히 사용할 수 있다. 가공 과정은 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하다. 압출 성형은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고, 항효소 인자를 파괴시키며, 단백질 분해효소의 활성을 분자적 구조변화에 의한 새로운 부위로의 효소적 노출에 의해 증가시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제 중 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며, 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물이 사용될 수 있는 동물의 대표적인 예는 다음과 같다: 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축; 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류. 또한, 투여량은 투여될 동물의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 변화되므로 일정하게 정의하기는 어렵지만, 일반적으로 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 사료 1 ㎏당 살아있는 바실러스 서브틸리스 BC1212 10²∼10¹⁵ 세포, 바람직하게는 10⁴∼10¹² 세포, 보다 바람직하게는 10⁷∼10¹¹ 세포를 첨가한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사료 첨가용 조성물에 사용되는 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주는 산성 pH 조건, 특히 위산과 유사한 pH 1의 조건하에서도 뛰어난 생존력을 가지며(표 2 참조), 또한 담즙에서도 우수한 생존 및 성장 특성을 나타낸다. 이로부터, 상기 균주는 가축에 생균제로 사용할 경우 위 및 소장내에서도 생존하여 대장까지 안전하게 전달될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주는 종래에 생균제로 사용되고 있는 바실러스 서브틸리스 종의 다른 균주와는 전혀 다른 효소 활성을 나타낸다(도 5 참조). 바실러스 서브틸리스 BC1212는 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase) 및 산 포스파타제(acid phosphatase)에 대해 높은 활성을 나타내는데, 알칼린 포스파타제는 세균벽에서 분비되는 효소로서 세균이 외부환경에 대한 저항성을 가지는데 중요한 역할을 한다. 또한, 산 포스파타제는 인산분해효소로서 사료내의 인산 이용률을 증가시킬 수 있다. 산 및 염기 포스파타제는 인산화된 유기물로부터 인을 유리하는 역할을 하는 효소로서, 인은 생명체에서 필요로 하는 주요 무기물중의 하나로 에너지 대사(ATP) 및 생체 내 신호전달(kinase cascade)에 필수적인 인자 중에 하나이다. 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 강한 포스파타제 활성은 장내에서 인산화된 단백질 및 당 등의 영양분으로부터 인을 유리하여 부족한 가축 체내에 인을 공급하며, 또한 포스파타 제는 BC1212 균주의 세포벽과 세포막 사이에 존재하여 인산화된 단백질 및 당 등의 영양분으로부터 생존에 필요한 유리된 인을 흡수하여 생존률을 증가시키게 된다(PNAS, 2004, 101, 7919-7924; Biochem, J., 1971, 125, 635-641). 이러한 결과는, 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 강한 포스파타제 활성이 가축에게 부족하기 쉬운 영양성분인 인을 공급하고 BC1212 균주 자신은 생존에 필요한 인을 다량으로 흡수하여 생존률을 증가시킴으로써 항균 및 항바이러스 작용을 갖는 설펙틴의 생산 증가 효과와 더불어 가축의 장내 환경을 개선시키게 되고, 따라서 가축의 체중 증가를 보다 효과적으로 유도하게 된다는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 균주를 포함하는 사료를 급여할 경우에는 무첨가 대조군에 비해 사육 동물의 체중이 증가하며, 사료 효율 역시 무첨가 대조군에 비해 다소 높게 나타난다(표 3 참조). 아울러, 분변내 미생물 중 총혐기성균의 수는 차이를 나타내지 않으나, 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 급여에 의해 분변내 바실러스 서브틸리스의 수는 증가하고, 반면 대장균의 수는 감소한다(표 4 참조).

바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 포함하는 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 종래 사료 첨가용으로 사용되는 미생물과는 달리 항균 활성을 갖는 설펙틴 C를 생산하며, 효소 생산 능력에서도 종래 기존 균주와는 다른 패턴을 갖고 있어 축산동물의 사료 효율 및 체중 증대 효과가 뛰어나다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 배양 및 설펙틴의 분리

설펙틴 생산 균주의 분리를 위해 된장 10 g을 멸균 증류수 100 ㎖에 녹인 후 그 된장 용액을 원액으로 하여 10분의 1씩 4번 희석하여 얻은 희석액 10 ㎖을 영양 아가 배지(nutrient agar, Difco Co. USA)에 1 ㎖씩 도말하여 28℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 형성된 균 집락 중 설펙틴 생산 균주를 확인하기 위하여 혈액이 함유된 영양 아가 배지에 이쑤시개를 사용하여 균체를 접종한 후 28℃에서 48시간 배양하였으며, 혈액을 분해하여 환이 생기는 균체를 선발하였다. 특히 그 환의 크기가 가장 큰 균주를 분리하여 설펙틴 생산을 위한 균주로 사용하였다. 균주 보관과 전배양을 위한 고체배지로는 영양 아가 배지를 사용하였으며, 액체 배지로 GYM 배지(glucose 4 g, Yeast extract 4 g, Malt extract 10 g, CaCO₃ 2g, pH 7.2)를 사용하여 설펙틴을 생산하였다. 배양 시간과 설펙틴의 생산관계를 확인하기 위해 동일한 배지 10 ㎖을 사용하여 전배양을 2-3일 한 후 본 배양을 위해 200 ㎖ 배지(500 ㎖ 프라스크)에 2.5%의 비율로 전배양한 배양액을 접종하여 28℃에서 200 rpm으로 7-8일간 배양하였다. 이때 배양시 균주의 성장과 설펙틴의 생산을 알아보기 위해 12시간 마다 배양액을 샘플링하였다. 성장 정도는 600 ㎚에서 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 비교하였고, 설펙틴 생산량은 표준물질(sigma S3523)을 사용하여 비교 측정하였다. 그 결과, 설펙틴의 생산과 균주의 성장은 모두 배양 80시간부터 급격히 증가하였으며 140시간 후에 최대값을 보이다가 180시간 이후에는 상당히 감소하여 유지되는 것으로 나타났다(도 1).

상기 균주의 정확한 동정을 위해 16S rDNA 유전자 분석법을 이용한 균주 동정(마이크로아이디, 서울대학교 유전공학특화창업보육센터 411호)을 실시하였으며, 이 때 리보좀(ribosomal) RNA의 2차 구조를 참고하여 서열을 배열한 후 % Similarity 값을 구함으로서 동정을 완료하였다. 결정된 염기서열의 수는 804 염기쌍으로서, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는다. 결정된 염기서열을 바탕으로 리보좀 RNA의 2차 구조를 참고하여 % Similarity 값을 구하여 이를 분석한 결과, 16s RNA 염기서열의 상동성이 바실러스 서브틸리스 NRRL-B-23049T/AF074975와 99.75% 일치하였으며, 이로부터 본 발명자들은 상기 균주를 바실러스 서브틸리스에 속하는 "바실러스 서브틸리스 BC1212" 균주라 명명하고, 2004년 11월 8일자로 농업생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호: KACC 91141).

실시예 2: 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 항균 활성 측정

실시예 1에서 분리된 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 항균 활성을 확인 하기 위하여, 상기 균주를 영양 배지 (BD사, 미국)에서 24시간동안 배양한 후 원심분리하여 얻어진 배양 상등액을 HCl을 이용하여 pH 2 정도에서 침전시키고, 상기 침전물을 다시 원심분리하여 상등액은 버리고 침전물만 회수하였다. 얻어진 침전물을 에탄올로 2회 추출하여 수용성 불순물을 제거한 후, 에탄올에 녹는 분획만을 회수하였다.

다음으로, 활성 물질을 확인하기 위해 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저, 얻어진 에탄올 분획을 진공 증발기로 농축한 후, 5% 메탄올로 채워진 역상 C₁₈ 칼럼에 로딩(loading)하였고, 동일한 용매인 5% 메탄올로 용출하여 항균 물질이 포함된 분획만을 분리하였다. 다시 순도를 높이기 위해 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 수행한 후 에탄올로 용출하였고, 각각의 분획을 LC/MS 및 NMR을 이용하여 화합물의 구조를 결정하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 배양 상등액 중의 항균 활성을 나타내는 물질은 도 2와 같은 분리양상을 나타내었으며, 항균 활성 분획 중 제일 많은 양을 차지하고 있는 11분대의 물질을 순수분리하여 NMR 및 LC/MS를 이용하여 그 구조를 분석한 결과, 화학식 1로 표시되는 설팩틴 C (surfactin C)인 것을 확인하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 BC3125 균주의 배양 상등액 중의 항균 활성을 나타내는 물질은 도 2와 같은 분리양상을 나타내었으며, 항균 활성 분획 중 제일 많은 양을 차지하고 있는 11분대의 물질을 순수분리하여 NMR 및 LC/MS를 이용하여 그 구조를 분석한 결과, 화학식 1로 표시되는 설팩틴 C (surfactin C)인 것을 확인하였다.

또한, 분리된 설팩틴 C를 이용하여 질병 원인체로 작용하는 다양한 병원성 세균에 대한 항균 효과를 액체배지 희석법에 의해 측정하였다. 최소억제농도(MIC) 측정은 영양배지(BD사, 미국)에 설팩틴을 넣고 2배로 단계 희석한 후, 균의 최종 희석농도를 2.5×10⁵ CFU/㎖로 하여 24시간 배양 후 세균의 발육유무를 육안으로 확인하였으며, 세균의 발육이 인정되지 않는 최소농도를 MIC로 결정하였다. 그 결과, 설팩틴 C는 주로 그람양성 세균에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었으며, MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus)로 알려져 있는 항생제 내성 세균에서 특히 기존 항생물질에 비해 높은 항균 활성을 나타내었다(표 1).

다양한 병원균에 대한 설팩틴 C의 최소억제농도

병원균의 종류	최소억제농도(㎍/㎖)
병원균의 종류	SF	AMOX	COL	NFX	STM
Escherichia coli DE3^a	>250	>250	0.4	0.1	0.1
Escherichia coli KPU20031^b	>250	>250	0.4	0.1	0.1
Escherichia coli KPU20032^b	>250	31.3	0.4	0.1	2
Salmonella thyphimurium KPU2003^b	>250	>250	0.4	0.2	2
Staphylococcus aureus KCCM 40511^a	7.8	125	>250	7.8	>250
Staphylococcus aureus KCCM 41294^a	31.3	125	>250	>250	>250
Staphylococcus aureus KCCM 40881^a	15.6	31.3	>250	31.3	>250
Staphylococcus aureus KCCM 11593^a	15.6	<0.1	>250	7.8	>250
Staphylococcus aureus KCCM 40510^a	15.6	<0.1	>250	7.8	>250
Staphylococcus aureus KCCM 11812^a	15.6	125	>250	31.3	>250
Staphylococcus aureus KPU2003^b	15.6	7.8	>250	7.8	>250
Staphylococcus epidermis KPU2003^b	15.6	7.8	>250	7.8	>250

상기에서, 실험에 사용된 미생물(a)들의 항생제 내성 활성은 다음과 같다:

- 스타필로코쿠스 아우레우스 KCCM 40511; 페니실린 및 젠타마이신 저항성

- 스타필로코쿠스 아우레우스 KCCM 41294; 테트라사이클린, 스트렙토마이신 및 매크롤라이드(macrolide) 저항성

- 스타필로코쿠스 아우레우스 KCCM 40881; 페니실린 저항성

- 스타필로코쿠스 아우레우스 KCCM 11593; 페니실린 저항성

- 스타필로코쿠스 아우레우스 KCCM 40510; 메티실린(methicillin) 저항성

- 스타필로코쿠스 아우레우스 KCCM 11812; 페니실린 저항성.

(b)는 감염동물에서 분리된 균주를 나타내며, SF는 설팩틴 C; AMOX는 아목사실린; COL은 콜리스틴; NFX는 노르플록사신; 및 STM은 스트렙토마이신을 나타낸다.

실시예 3: 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 배양

균주 보관과 전배양(seed) 접종을 위한 고체 배지로는 영양 아가 배지(BD사, 미국)를 사용하였으며, 액체 배지로는 분리 정제의 용이성을 위해 최소 배지를 사용하였다. 최소 배지의 조성은 4% 포도당, 30 mM KH₂PO₄, 30 mM Na₂HPO₄, 50 mM NH₄NO₃, 0.8 mM MgSO₄, 2 mM FeSO₄, 0.004 mM EDTA 및 0.007 mM CaCl₂로 하였으며, 무기염류와 금속성분들은 각각 별도로 멸균하여 접종시 첨가하였다. 동일한 액체 배지에서 2-3일간 전배양한 다음, 균주의 농도를 2.5%로 맞추어 본 배양에 접종하였다. 본 배양에 사용한 배양액으로는 조성 A (1% 포도당, 3% 옥수수 전분, 1% 대두 밀(soybean meal), 0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.2% CaCO₃, 0.01% 소포제, 잔량의 물, 단위; wt/wt%)를 pH 6.75로 맞추어 사용하였으며, 140 rpm의 배양 회전 속도로 37℃에서 5일간 배양하여 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주 및 그 배양액을 얻었다. 각각 24, 48, 72시간마다 배양액을 취한 후, HPLC를 이용하여 배지내 설팩틴 C의 양을 측정하였다.

또한, 현재 동물사료의 원료로 사용되고 있는 미강, 소맥피, 대두박, 폐당밀 등을 탄소원 및 질소원으로 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 각 원료의 C, H, O, N, S의 함량을 자동원소분석기(EA1110, CE Instrument)를 이용하여 분석하였으며, 탄소원 및 질소원을 각각 2% 및 5%로 고정한 후 조성 B (2.8% 밀기울, 4.9% 쌀겨, 5.1% 대두박, 0.02% FeSO₄, 0.05% MnSO₄, 잔량의 물, 단위; wt/wt%)를 이용하여 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 배양하였다. 상기 조성 B는 pH를 6.75로 맞추어 사용하였으며, 140 rpm의 배양 회전 속도로 37℃에서 5일간 배양하여 바실러스 서브틸리스 BC1212 및 배양액을 얻었다. 각각 24, 48, 72시간마다 배양액을 취한 후, HPLC를 이용하여 배지내 설팩틴 C의 양을 측정하였다.

그 결과, 조성 A 및 조성 B 배양액을 이용하여 바실러스 서브틸리스 BC1212를 배양한 결과, 조성 B에서 높은 항균 활성을 나타내는 설팩틴 C를 많이 생산한다는 것을 확인하였다[도 3].

실시예 4: 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 pH 및 담즙 내성

바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 소화 과정에서의 생존 능력을 평가하기 위하여, 산성 조건 및 담즙에 대한 내성을 조사하였다. 산성 조건하에서의 생존능력을 평가하기 위하여, 상기 균주를 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 정치 배양하여 균의 농도가 10⁹ 내지 10¹⁰ 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)/㎖이 되도록 하였다. 배양된 균은 6,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균을 수집하였고, 이를 멸균수로 2회 세척한 후 1/100로 농축하여 세포수가 약 10¹⁰ CFU/㎖이 되도록 하여 사용하였다. pH 1, 2, 3, 4 및 5로 조정된 완충액에 희석한 균을 접종하여 1, 2 및 4시간동안 37℃에서 배양한 후, 멸균수로 희석하여 트립티카제 소이 아가(trypticase soy agar, BD사, 미국)에 접종하여 콜로니를 계수하였다. 생존률(%)은 반응시간 후의 생균수를 초기접종시 세균수로 나누어 산출하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 BC1212는 산성 pH 조건하에서도 비교적 안정하게 생존하는 것을 알 수 있었다(표 2). 위산의 pH와 유사한 pH 1에서도 4시간동안 약 64%의 생존률을 나타내었으며, pH 2 이상에서는 4시간 처리시 85.7% 이상의 우수한 생존률을 나타내었다.

다양한 산성 pH 조건에서의 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 생존률

pH	바실러스 서브틸리스 BC1212의 생존률(%)
pH	1시간	2시간	4시간
1	76.2	70.3	64.0
2	93.0	91.1	85.7
3	100	97.2	98.4
4	99.7	96.8	96.1
5	99.9	95.9	97.9

다음으로, 담즙 내성을 평가하기 위하여 트립티카제 소이 배지에 0.3% 황소 담즙을 첨가한 배지에 바실러스 서브틸리스 BC1212를 접종하여 37℃에서 배양하면서, 12시간동안 분광광도기를 이용하여 550 ㎚ 파장에서의 흡광도에 의한 균의 생장 정도를 측정하였다.

그 결과, 0.3% 황소 담즙의 처리에 의해 초기 성장은 억제되었으나 6시간 이후에는 정상적으로 성장하였으며, 이로부터 바실러스 서브틸리스 BC3125 균주는 담즙에서도 우수한 생존 및 성장을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 4).

상기 결과로부터, 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주는 가축에 생균제로 사용할 경우 위 및 소장내에서도 생존하여 대장까지 전달될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주가 생산하는 효소 활성

바실러스 서브틸리스 BC1212 균주가 분비하는 각종 효소의 활성을 알아보기 위해 API ZYM 키트(bioMerieux, Montalieu-Vercieu, France)를 이용하였다. 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 트립티카제 소이 배지에 접종하고 호기 조건으로 37℃에서 24시간 배양한 후 효소 활성을 측정하였다. 또한, 종래에 생균제로 사용되고 있는 바실러스 서브틸리스 나토와의 효소 활성을 비교하기 위해 바실러스 서브틸리스 나토(KCCM12027, 한국미생물균주은행, 한국)도 상기와 동일한 조건에서 배양한 후 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성은 대조군과 비교하여 0점에서 5점까지 발색정도를 확인하여 상대적으로 평가하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 BC1212는 종래에 생균제로 사용되고 있는 바실러스 서브틸리스 나토와는 전혀 다른 효소 활성을 나타내었다(도 5). 바실러스 서브틸리스 BC1212는 알칼린 포스파타제 및 산 포스파타제에 대해 높은 활성을 나타내었는데, 알칼린 포스파타제는 세균벽에서 분비되는 효소로서 세균이 외부환경에 대한 저항성을 가지는데 중요한 역할을 한다. 또한, 산 포스파타제는 인산분해효소로서 사료내의 인산 이용률을 증가시킬 수 있다.

실시예 6: 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 이유자돈에서의 증체 효과

이유자돈(Landrace×Yorkshire×Durok)은 충남대학교 부설 목장에서 4주령(평균 28일) 돼지를 총 20마리 구입하여 실험에 사용하였으며, 환경적인 스트레스를 제거하기 위해 한배 새끼인 돼지를 10마리씩 두 그룹으로 나누어 실시하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 BC1212가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 실시예 1에서 분리된 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 사료 ㎏ 당 0.1%로 첨가하여 4주간 급여하였다. 생산성 및 증체율을 측정하기 위해 입수시와 매주별 이유자돈의 체중을 측정하여 증체율을 계산하였으며, 사료 섭취율은 주간별로 누적 사료 섭취량으로 계산하였다. 사료 효율(%)은 체중 증가량을 사료 섭취율로 나누어 나타내었다.

다음으로, 바실러스 서브틸리스 BC1212 생균제의 급여에 의한 분변내 미생물의 변화를 알아보기 위해 실험 시작 후 마지막 28일에 각 시험군의 분변을 채취하였다. 채취한 분변을 혈액 배지에 접종하여 채취한 분변 중 총 혐기성 미생물의 집락수를 확인하였다. 또한, 분변내 바실러스 서브틸리스의 존재 유무를 확인하기 위해 각 시험군의 분변 시료를 바실러스 서브틸리스 감별 배지인 폴리믹신 피루베이트 달걀 난황 만니톨 브로모티몰 블루 아가(polymixin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar, 옥소이드, 영국)에 접종하여 37℃의 혐기 조건에서 48시간동안 배양한 후 바실러스 서브틸리스의 집락수를 측정하였다. 또한, 이유자돈에서 설사를 유발하는 주요 세균인 대장균을 검출하기 위해 대장균 감별 배지인 맥콘키(MacConkey) 배지(BD사, 미국)에 접종하여 37℃의 호기 조건에서 24시간동안 배양한 후 유당을 분해하는 집락을 대장균군으로 추정하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 BC1212의 급여에 따른 체중변화는 무첨가 대조군에 비해 증가한 것으로 나타났으며, 사료 효율 역시 무첨가 대조군에 비해 바실러스 서브틸리스 BC1212 투여군에서 다소 높게 나타났다(표 3). 또한, 분변내 미생물 중 총혐기성균 수는 차이를 나타내지 않았으나, 바실러스 서브틸리스 BC1212의 급여에 의해 분변내 바실러스 서브틸리스의 수는 증가하였으며, 대장균의 수는 감소하였다(표 4).

이유자돈에서 바실러스 서브틸리스 BC1212의 급여에 따른 체중변화

	무첨가 대조군	바실러스 서브틸리스 BC1212 투여군
평균체중(㎏)
0일(시험개시)	7.92±1.15	7.95±0.73
7일	9.99±1.25	9.80±0.79
14일	13.62±1.33	13.49±1.27
21일	17.25±2.02	19.26±1.40
28일	22.28±1.88	25.47±1.48
평균 일일 증체량(g)
0∼7일	294±70	287±88
8∼14일	520±52	530±141
15∼21일	520±150	540±98
21∼28일	720±140	887±84
평균 사료 섭취량(g)
0∼7일	494	413
8∼14일	642	625
15∼21일	735	758
21∼28일	1086	953
사료 효율 (증체량/사료 섭취량, %)
1주	0.77±0.17	0.66±0.21
2주	0.81±0.08	0.85±0.27
3주	0.73±0.21	0.71±0.14
4주	0.63±0.13	0.93±0.05

바실러스 서브틸리스 BC1212의 급여에 따른 분변내 미생물의 변화

	무첨가 대조군	바실러스 서브틸리스 BC1212 투여군
총 혐기 세균수(log CFU/g)	8.39±0.13	8.32±0.09
바실러스 서브틸리스 수(log CFU/g)	8.08±0.10	8.20±0.08
대장균군 수(log CFU/g)	8.38±0.02	8.14±0.13

제조예 . 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 포함하는 사료 첨가용 조성물의 제조

본 발명자들은 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주를 포함하는 본 발명의 사료 첨가용 조성물을 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.

사료 첨가용 조성물의 구성 비율(단위; 중량%)

	BC1212	효소 제제	미생물	아미노산	기타
제조예 1	100
제조예 2	90	10
제조예 3	80	10	10
제조예 4	70	10	10	10
제조예 5	60	15	15	8	2
제조예 6	55	20	15	8	2

상기 표 5에서, 효소 제제는 파이타제, 셀룰라제, 자일라나제, 말타제 및 전환효소의 혼합제제를 사용하였고, 비병원성의 미생물로는 아스퍼질러스 오리자에를 사용하였다.

도 1은 균주의 성장과 설펙틴의 생산과의 상관관계를 보여주는 그래프로서,□는 균체의 성장, ●는 설펙틴 생산을 나타낸다.

도 2는 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 배양 상등액 중에서 항균 활성을 나타내는 물질에 대한 액상크로마토그래피 자료이다.

도 3은 배지 조성물에 따른 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 설팩틴 C 생산량을 비교한 그래프이다.

도 4는 0.3% 황소 담즙의 처리가 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주의 성장에 미치는 영향을 평가한 그래프로서, "대조군"은 황소 담즙을 처리하지 않은 바실러스 서브틸리스 BC1212의 생장곡선, "황소 담즙 0.3%"는 0.3% 황소 담즙을 처리한 바실러스 서브틸리스 BC1212의 생장곡선을 나타낸다.

도 5는 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주와 바실러스 서브틸리스 나토(KCCM12027) 균주의 효소 활성을 비교한 그래프이다.

<110> B.N.C BIO PARM CO., LTD. <120> Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Rubus Coreanus Miquel Extract <130> 2007-dpa-0151 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 804 <212> DNA <213> Bacillus subtilis BC1212 <220> <221> rRNA <222> (1)..(804) <223> 16S rDNA sequence of Bacills subtilis BC1212 <400> 1 gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct 60 gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac 120 tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag 180 gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240 ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300 agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360 tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta 420 gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 480 cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 540 ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 600 cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660 tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt 720 ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780 tccacgccgt aaacgatgag tgct 804

Claims

바실러스 서브틸리스 BC1212 균주(기탁번호; KACC 91141)를 포함하는 사료 첨가용 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 균주는 화학식 1로 표시되는 설팩틴 C를 생산하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.

[화학식 1]
청구항 1에 있어서,

밀기울 2.8 중량%, 쌀겨 4.9 중량%, 대두박 5.1 중량%, FeSO₄ 0.02 중량%, MnSO₄ 0.5 중량%, 및 잔량(87.13 중량%)의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.
청구항 1에 있어서,

하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.
청구항 4에 있어서,

상기 효소 제제는 리파제, 파이타제, 아밀라제, 포스파타제, 카르복시메틸셀룰라제, 자일라나제, 말타제 및 전환효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.
청구항 1에 있어서,

비병원성의 다른 미생물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.
청구항 6에 있어서,

상기 미생물은 락토바실러스 속의 미생물, 아스퍼질러스 오리자에, 사카로미세스 세레비지에로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.
청구항 1에 있어서,

추가로 1종 이상의 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가용 조성물.