KR20130047329A - Compostion of feed additives containing bacillus subtilis np15 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 미생물을 함유하는 항생제 대체용 사료첨가제에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 토양에서 분리한 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a feed additive for replacing antibiotics containing microorganisms, and more particularly, to a feed additive composition comprising Bacillus subtilis NP15 strain isolated from soil.
가축의 대량사육을 통한 단백질의 공급과 유제품등의 부산물은 인류의 건강과 생활의 질을 향상시키는데 기여하여 왔고 대량사육에서 가축의 질병예방을 목적으로 사용되는 항생제는 최근까지도 필수적인 것으로 인식되어 많은 양이 사용되고 있으나 과도한 사용으로 인해 전 세계적으로 규제 필요성이 제기되고 이다. 또한 현재 가축 사육을 위한 사료는 대부분 곡물이 사용되고 있으나 지속적인 인구증가로 인한 식량으로서의 곡물 수요가 증대되어 곡물을 사료 원료로서의 이용은 큰 어려움에 직면해 있다. 이에 관련 업계에서는 곡물을 대체할 수 있는 사료의 개발 및 이용되는 사료의 효율을 극대화시키기 위한 많은 노력을 기울였으며, 구체적으로 동물의 소화기능 및 흡수율을 증진시킬 수 있는 우수한 사료 첨가용조성물의 개발필요성이 제기되고 있다. 사료첨가용 조성물의 개발은 질병예방과 함께 가축의 비육과 소화를 촉진시켜 사료의 효율을 극대화시켜 사료 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 빠른 증식과 비육을 기대할 수 있다. 특히 최근 농산물의 안정성과 친환경 축산물의 수유가 높아지면서 고품질의 가축 생산을 가능하게 하여 농가 및 관련산업의 소득 수준 향상에 기여할 수 있다. 최근의 사료는 대두박, 볏짚, 옥수수 등의 전통적인 원료외에 각종 부산물과 함께 영양보충, 소화 및 흡수 향상, 성장촉진, 질병예방 등과 같은 효과를 얻기 위해 아미노산, 무기염료, 비타민, 항생물질, 효소 등과 함께 생균을 첨가하고 있다. 그러나, 질병예방이나 사료효율 증대를 위한 장기간에 걸친 항생제 사용으로 사육동물들의 건강을 유지하기가 쉽지 않다. 또한, 가축에 있어서 장기간의 동물 약물 및 항생물질의사용은 잔류 약물을 인간이 섭취함으로써 알레르기나 장내 정상 세균총의 변화를 일으키기 때문에 그의 용도와 사용범위도 제한되고 있다. 이와 같은 문제점들을 개선하기 위하여, 최근 사육 동물에서 발생하는 질병의 예방 및 치료를 위해 생균제로서 바실러스 나토, 유산 박테리아, 부틸산 박테리아, 락토바실러스 비피더스 등의 미생물이 연구되어 사용되고 있으나, 완전한 동물 질병 치료제로서 부족한 면이 많이 있다. 기존의 동물에게 보다 안전할 뿐만 아니라 동물의 장내에서 뛰어난 생존력을 나타낼 수 있는 미생물 뿐 아니라 사료 제조공정 중에서도 활성을 유지할 수 있는 새로운 미생물의 개발이 요구되고 있는 실정이다.By-products such as protein supply and dairy products through livestock raising have contributed to improving human health and quality of life. Antibiotics, which are used to prevent livestock diseases in livestock raising, have been recognized as essential until recently. Is used, but excessive use raises the need for regulation worldwide. In addition, most of the fodder for livestock raising is grain, but the demand for grain as food is increasing due to the continuous population growth, which makes it difficult to use grain as a feed material. In this regard, the industry has made a lot of efforts to develop feed substitutes and maximize the efficiency of the feed used, and in particular, the necessity of developing an excellent feed additive composition that can enhance the digestion and absorption rate of animals. Is being raised. The development of feed additive composition can promote the fattening and digestion of livestock along with disease prevention to maximize feed efficiency and reduce feed usage, as well as expect rapid growth and fattening. In particular, the recent increase in the stability of agricultural products and the feeding of environment-friendly livestock products enables the production of high-quality livestock, which can contribute to improving the income level of farms and related industries. Recent feeds include amino acids, inorganic dyes, vitamins, antibiotics, enzymes, etc. to achieve nutritional supplementation, digestion and absorption, growth promotion, and disease prevention along with various by-products in addition to traditional raw materials such as soybean meal, rice straw, and corn. Probiotics are added. However, long-term use of antibiotics to prevent disease or increase feed efficiency makes it difficult to maintain the health of breeding animals. In addition, the long-term use of animal drugs and antibiotics in livestock causes a change in allergens or normal intestinal flora in humans by ingesting residual drugs, thereby limiting their use and scope of use. In order to improve these problems, microorganisms such as Bacillus natto, lactic acid bacteria, butyric acid bacteria, Lactobacillus bifidus, etc. have been studied and used as probiotics for the prevention and treatment of diseases occurring in farm animals. There are many things that are lacking. The development of new microorganisms that are not only safer for existing animals but also can maintain activity in the feed manufacturing process as well as microorganisms that can exhibit excellent viability in the intestines of animals.
이에, 본 발명자들은 항균활성을 가지면서, 동물의 장내에서 뛰어난 생존력을 나타내는 미생물을 함유하는 사료용 첨가제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 토양으로부터 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 분리하고, 상기 균주가 종래 사육 동물에 미생물 첨가제로 사용되는 미생물과는 달리 항균활성을 갖는 물질을 생산할 뿐만 아니라, 동물의 장내에서 생존력이 높고 각종 유용 효소를 생산함으로서, 동물의 사료 소화를 도와 동물의 비육과 증체에 효과가 뛰어 나다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Therefore, the present inventors have made an effort to develop a feed additive containing microorganisms having an antimicrobial activity and exhibiting excellent viability in the intestine of the animal. As a result, the Bacillus subtilis NP15 strain is isolated from the soil, and the strain is a conventional breeding animal. Unlike microorganisms used as microbial additives, the product not only produces antimicrobial activity, but also has high viability and various useful enzymes in the intestine of the animal, helping to digest the animal's feed, which is excellent for animal fattening and weight gain. It was confirmed that the present invention was completed.
본 발명의 목적은 동물의 사료 소화를 도와 동물의 비육과 증체에 효과가 뛰어난 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 함유하는 사료첨가용 조성물을 제공하는데 있다.
SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a feed additive composition containing Bacillus subtilis NP15 strain, which is effective in animal feed and help in digestion and weight gain.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 NP 15 균주(기탁번호; KFCC 11503P)을 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for feed addition comprising Bacillus subtilis NP 15 strain (Accession Number; KFCC 11503P).
본 발명에 따른 사료첨가용 조성물에서 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 다른 미생물과는 달리 성장이 우수하고 항균 활성을 갖는 물질을 생산하며, 고온, 위산 및 답즙에 내성을 가지고 식물계 사료의 분해섭취에 용이한 다양한 효소를 분비하며, 기존의 미생물제제인 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주(대한민국 공개특허 10-2009-0066410)와 비교하여도 높은 증체량을 나타내는 등 다른 균주와는 다른 유용한 특성을 갖고 있어, 축산동물의 질병예방 및 폐사율 감소, 사료 효율과 체중 증대에 효과적으로 사용될 수 있다.
The Bacillus subtilis NP15 strain used in the feed composition according to the present invention, unlike other microorganisms, produces a material having excellent growth and antimicrobial activity, and is resistant to high temperature, gastric acid and bile and degrades intake of plant feed. It releases various enzymes that are easy to kill, and has useful properties different from other strains, such as showing a high weight gain compared to the Bacillus subtilis BC1212 strain (Korean Patent Publication No. 10-2009-0066410). It can be effectively used to prevent disease and reduce mortality, feed efficiency and weight gain in animals.
도 1은 바실러스 서브틸리스 NP 15가 생산하는 항균활성 물질을 확인하기 위한 MALDI-TOF Mass Spectra 결과를 나타낸 것으로, A. 배양액 (hplc 기준 1mg/ml), B. CH3Cl:MeOH extract (hplc 기준 1mg/ml), C. 표준품 (1mg/ml)의 순서로 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 설팩틴의 황색포도상 구균에 대한 최소저지농도 (㎍/㎖) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 설팩틴의 열에 대한 안정성을 조사한 것이다.
도 4는 pH1.0과 pH 2.0의 강산조건에서 바실러스 서브틸리스 NP 15의 생존성을 나타낸 것이다.
도 5는 0.06%와 0.5% 농도의 담즙산 (pH=6.0)에서 바실러스 서브틸리스 NP 15의 적응성을 나타낸 것이다.
도 6은 바실러스 서브틸리스 NP 15가 생산하는 효소 및 활성을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the MALDI-TOF Mass Spectra results for identifying the antimicrobial active material produced by Bacillus subtilis NP 15, A. culture medium (hpmg based 1mg / ml), B. CH3Cl: MeOH extract (hplc 1mg / ml) and C. Standards (1mg / ml) in order of mass spectrometry.
Figure 2 shows the results of the minimum inhibitory concentration (㎍ / ㎖) for the Staphylococcus aureus of sulfactin.
Figure 3 examines the stability of the heat of sulfactin.
Figure 4 shows the viability of Bacillus subtilis NP 15 in strong acid conditions of pH 1.0 and pH 2.0.
5 shows the adaptability of Bacillus subtilis NP 15 at bile acids (pH = 6.0) at 0.06% and 0.5% concentrations.
Figure 6 shows the enzymes and activities produced by Bacillus subtilis NP 15.
일 관점에서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 NP 15 균주(기탁번호; KFCC 11503P)을 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a feed additive composition comprising Bacillus subtilis NP 15 strain (Accession No .; KFCC 11503P).
상기 바실러스 서브틸리스 NP15균주(기탁번호; KFCC 11503P)는 2011년 1월 일자로 에 기탁되어 있으며, 항균물질인 설팩틴(surfactin)을 생산한다The Bacillus subtilis NP15 strain (Accession No .; KFCC 11503P), deposited at 1 January 2011, produces antibacterial sulfactin (surfactin).
본 발명의 사료첨가용 조성물의 제조에 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 공지의 발효기술에 의해 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지, 반합성배지 및 합성배지와 같은 각종 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 탄소원으로는 포도당, 수크로스, 전분, 몰라세, 물엿, 맥아당 등이 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두분, 암모늄염, 나이트레이트염 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있다. 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있다. 그러나, 탄소원, 질소원 및 무기염은 반드시 상기 성분들에만 한정되는 것은 아니며, 그 외에도 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다. Bacillus subtilis NP15 strain used in the preparation of the feed composition of the present invention can be cultured in a liquid medium or a solid medium by known fermentation techniques. As the medium, various mediums such as natural medium, semi-synthetic medium and synthetic medium can be used without limitation. As the carbon source, glucose, sucrose, starch, molasses, syrup, maltose and the like may be used. As the nitrogen source, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, soy flour, ammonium salt, nitrate salt and other organic or inorganic nitrogen-containing compounds may be used. As the inorganic salt, phosphate such as magnesium, manganese, potassium, calcium, iron, carbonate, chloride, etc. may be used. However, the carbon source, nitrogen source and inorganic salts are not necessarily limited to the above components, in addition, amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds may be added to the medium.
상기 균주는 공지의 발효 기술에 따라 적당한 온도에서 적당한 기간 동안 배양되며, 바람직하게는 예를 들면 20℃～50℃에서 10시간～5일동안 배양된다. 본 발명에 따라 수득된 미생물 배양액은 원심분리 후 세척 또는 농축에 의해 분리된 세포와 함께 또는 배양액 단독으로 사용될 수 있으며 바람직하게는 유효성분이 포함된 전체 배양액을 첨가제를 가하거나 가하지 않은 채로 동결건조 또는 분무건조되어 제제화될 수 있다. 이렇게 수득된 제제는 본 발명의 사료 첨가제 또는 사료로 사용될 수 있다.The strain is incubated for a suitable period of time at a suitable temperature according to known fermentation techniques, preferably incubated for 10 hours to 5 days at 20 ℃ to 50 ℃, for example. The microbial culture obtained according to the present invention may be used together with the cells separated by washing or concentration after centrifugation or culture alone, preferably lyophilized or sprayed with or without additives of the whole culture containing the active ingredient. Can be dried and formulated. The formulation thus obtained can be used as a feed additive or feed of the present invention.
본 발명에 따른 사료첨가용 조성물을 제조하기 위하여, 배양액을 직접 제제화하거나 말분, 밀분, 녹말, 텍스트린 등의 희석제 및 볏짚, 곡류, 왕겨 및 탈지 쌀겨와 같은 겨, 오일 및 지방분이 풍부한 종자 케이크와 같은 사료용 원료와 함께 제제화될 수 있다. 수득된 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 살아있는 미생물 제제는 그를 함유한 사료형태로 또는 사료 첨가제 형태로 적당량 동물에 투여되어 체중 증가 및 촉진 성장을 시킨다. In order to prepare a feed composition according to the present invention, a culture medium is formulated directly, or a diluent such as powder, wheat flour, starch, and textrin, and a seed cake rich in bran, oil and fat such as rice straw, cereals, rice husk and skim rice bran; It can be formulated with the same feedstock. The viable microbial preparation of the obtained Bacillus subtilis NP15 strain is administered to an appropriate amount of animal in the form of a feed containing it or in the form of a feed additive to gain weight and promote growth.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사료첨가용 조성물은 포도당 2% (w/v), 내지 4 % (w/v), 대두박 1 내지 20% (w/v), FeSO4 0.001 내지 0.1% (w/v), MnSO4 0.001 내지 0.1% (w/v) 및 효모추출물 0.1 내지 2% (w/v)를 포함하며, 더욱 바람직하게는 포도당 4% (w/v), 대두박 5.1% (w/v), FeSO4 0.02 % (w/v), MnSO4 0.05% (w/v) 을 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the feed composition of the present invention is
또한, 본 발명의 사료첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만들어 동물이 사용할 수 있게 해주는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 셀룰라제(cellulase), 아라비난 (arabinan)을 분해하는 아라비나제 (arabinase), 아라비노갈락탄 (arabinogalactan)을 분해하는 아라비노퓨라노시타제 (arabinofuranosidase), 갈락탄을 분해하는 갈락타나제 (galactanase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 펙틴성분이 다수 포함된 식물성원료를 분해하는 펙티나제 (pectinase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase), 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소등과 같은 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.In addition, the feed composition of the present invention may be in the form of a dry or liquid formulation, it may further comprise one or more enzyme preparation. Enzyme preparations can be either dry or liquid, hydrolyzing phytase, starch and glycogen, which break down phytic acid to form phosphates and inositol phosphates for use by animals. Enzymes amylase, cellulase that breaks down cellulose, arabinase that breaks down arabinan, and arabinofuranosita that breaks down arabinogalactan Arabinofuranosidase, galactanase to decompose galactan, xylanase to decompose xylose, pectinase to decompose vegetable ingredients containing a large number of pectins, Before making a glucose-fructose mixture by hydrolyzing maltase and saccharose, which hydrolyzes maltose into two molecules of glucose It may be selected from the group consisting of enzymes such as invertase, lipase such as lipase and the like.
또한, 본 발명의 조성물은 바실러스 서브틸리스 NP15 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)과 류코노스톡 속 (Leuconostoc sp.), 웨이셀라 속(Weisella sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.)의 미생물, 가축의 사료 소화흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균, 토양미생물로 동물의 체중증가와 면역증강에 도움을 주는 스트렙토마이세스속 (Streptomyces sp)과 노카르디아 속 (Nocardia sp.)의 미생물 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 미세조류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In addition, the composition of the present invention may further include other non-pathogenic microorganisms in addition to the Bacillus subtilis NP15 strain. Microorganisms that can be added include Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., Weisella sp. And Entero, which have physiological and organic degradability under anaerobic conditions such as cattle stomach. Microorganisms of the Enterococcus sp., Filamentous fungi, such as Aspergillus oryzae, which increase the digestibility of feed in livestock, and soil microorganisms, streptomyces to help animals gain weight and boost immunity. Microorganisms of Streptomyces sp and Nocardia sp. And yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, microalgae, and the like, but are not limited thereto.
본 발명에서 더욱 바람직한 경우에는 비타민과 항산화물질인 b-carotene, astaxanthin을 생산하는 미세조류로서 두나리엘라 (Dunaliella), 헤마토코쿠스 (Heamatococcus)등이 포함될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. More preferred case in the present invention may include, but is not limited to, Dunaliella, Hematococcus, etc. as microalgae that produce vitamins and antioxidants b-carotene and astaxanthin.
본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 N15과 함께, 헤마코쿠크스 균체를 첨가하여, 육계에 급여한 결과, 증체량과 사료요구율이 증가하는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, with Bacillus subtilis N15, hematococcus cells were added and fed to broilers, it was confirmed that the increase in weight and feed requirements increased.
각종 곡물, 볏짚, 과일 가공 부산물 및 대두 단백을 비롯한 부산물 및 다양한 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 적절히 사용할 수 있다. By-products and various feedstocks, including various grains, rice straws, fruit processing by-products and soy protein, can be suitably used as unprocessed or processed.
본 발명의 사료첨가용 조성물이 사용될 수 있는 동물의 대표적인 예는 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 개, 고양이 등과 같은 가축과 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위 등과 같은 가금류이다. 또한, 투여량은 투여될 동물의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 변화되므로 일정하게 정의하기는 어려우나, 일반적으로 본 발명의 사료첨가용 조성물은 사료 1 ㎏ 당 살아있는 바실러스 서브틸리스 NP15 105～1015 세포, 바람직하게는 107～1011 세포를 첨가하거나 배양물을 직접 동결건조시켜 사료 1 Kg당 건조물 0.1 내지 1 % (w/v)를 사용한다.Representative examples of animals in which the feed composition of the present invention may be used include livestock such as edible cattle, cows, calves, pigs, piglets, dogs, cats, and poultry such as chicks, chickens, domestic chickens, roosters, ducks, geese, and the like. to be. In addition, since the dosage varies depending on the type of animal to be administered, the age and the type of other feed components, it is difficult to define the dosage constant. Generally, the feed additive composition of the present invention is a live Bacillus
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사료첨가용 조성물에 사용되는 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 산성 pH 조건, 특히 위산과 유사한 pH 2이하의 조건하에서도 뛰어난 생존력을 가지며, 또한 담즙에서도 우수한 생존 및 성장 특성을 나타낸다. 이로부터, 상기 균주는 가축에 생균제로 사용할 경우 위 및 소장내에서도 생존하여 대장까지 안전하게 전달될 수 있음을 알 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the Bacillus subtilis NP15 strain used in the feed composition of the present invention has excellent viability even under acidic pH conditions, especially
본 발명의 구현예에 따르면 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 기존 균주에 비해 다양한 효소를 분비하며, 이는 외부의 영양성분들을 용이하게 분해하여 균주 자신은 생존에 필수적인 탄소원 분해에 필요한 갈락타나제, 셀룰라제, 펙틱라이아제에 높은 활성을 나타낸다. 식물세포벽의 주성분인 아라비노갈락탄은 현재 사료로 이용되는 대두 콩의 주성분으로 이를 효율적으로 분해하여 탄소원을 섭취하기 위해서는 높은 효율의 아라비노갈락타나제를 사용하거나 분해하는 미생물을 이용하는 것이 바람직하며 이를 통하여 사료섭취시 분해를 용이하게 하여 사료 섭취를 용이하게 할 수 있다. 또 다른 식물세포벽의 주요성분인 펙틴질을 분해하는데 필요한 펙틱라이아제와 식물기질의 또다른 주요성분인 셀룰로즈를 분해하는 셀룰라제의 경우에도 동일한 효과를 기대할 수 있으며 이들 세 가지 효소를 모두 포함하는 경우 더욱 양호한 기질 분해를 기대할 수 있다. 뿐만아니라 산 포스파타제와 알칼리 포스파타제도 가지고 있어 생체 에너지 발생에 필수적인 인과 같은 성분을 다량으로 흡수하여 생존률을 증가시킬 수 있다. 또한 항균 및 항바이러스 작용을 갖는 설펙틴의 생산 하므로 전반적으로 이들의 역할이 가축의 장내 환경을 개선시키게 되고, 따라서 가축의 체중 증가를 보다 효과적으로 유도하게 된다는 것을 나타낸다. According to an embodiment of the present invention, the Bacillus subtilis NP15 strain secretes a variety of enzymes compared to the existing strain, which easily decomposes external nutrients so that the strain itself is required for the decomposition of galactase, cellulase, which is essential for survival. , High activity against pectitase. Arabinogalactan, a major component of plant cell walls, is the main component of soybean beans currently used as feed, and in order to efficiently decompose it and consume carbon sources, it is preferable to use microorganisms that use or degrade high-efficiency arabinogalactase. Through the feed intake can facilitate the decomposition can facilitate the feed intake. The same effect can be expected for pecticase, which is a major component of another plant cell wall, and for cellulase, which degrades cellulose, another major component of plant substrates. Good substrate degradation can be expected. In addition, it has acid phosphatase and alkaline phosphatase, which can increase the survival rate by absorbing a large amount of components such as phosphorus which is essential for generating bioenergy. In addition, the production of sulfectins with antimicrobial and antiviral action indicates that overall their role is to improve the intestinal environment of the livestock, thus inducing more effective weight gain of the livestock.
또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 균주를 포함하는 사료를 육계와 자돈등의 동물에 급여할 경우에는 무첨가 대조군에 비해 사육 동물의 체중이 증가하며, 사료 효율 역시 무첨가 대조군에 비해 높게 나타난다. In addition, according to another preferred embodiment of the present invention, when feeding the feed containing the strain to animals such as broilers and piglets, the weight of the breeding animal increases compared to the non-added control, feed efficiency is also higher than the non-added control appear.
바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 포함하는 본 발명의 사료첨가용 조성물은 종래 사료 첨가용으로 사용되는 미생물과는 달리 항균 활성을 갖는 설펙틴을 생산하며, 성장이 뛰어나면서도 내산 및 내 담즙 활성을 갖고 다양한 기질을 분해하여 탄소원과 인 섭취에 도움이되는 효소들을 가지고 있어 축산동물의 사료 효율 및 체중 증대 효과가 뛰어나며, 기존 설팩틴 생산 미생물제제인 바실러스 서브틸리스 BC1212 균주(대한민국 공개특허 10-2009-0066410)와 비교하여도 이유자돈의 증체율이 증가하였다는 것을 확인하였다.
The feed additive composition of the present invention comprising the Bacillus subtilis NP15 strain, unlike the microorganisms used for conventional feed addition, produces a sulfectin having antimicrobial activity, and has excellent growth and acid and bile activity. It has enzymes that help the carbon source and phosphorus ingestion by decomposing the substrate, which is excellent in the feed efficiency and weight gain of livestock animals, and the bacillus subtilis BC1212 strain, a conventional sulfactin-producing microorganism (Republic of Korea Patent Publication 10-2009-0066410) It was confirmed that the increase rate of weaning piglets was increased even compared with.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예Example 1: One: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주의 분리 배양 Isolation of Strains
항생제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여, 경기도 수원시내 토양을 건조 후 정량 1g을 멸균 증류수 10 ㎖에 혼합 후 이것을 원액으로 하여 10분의 1씩 7번 희석하여 얻은 희석액 10 ㎖을 영양 아가 배지(nutrient agar, Difco Co. USA)에 1 ㎖씩 도말하여 30℃에서 40시간 배양하였다. 배양 후 형성된 균 집락 중 설펙틴 생산 균주를 확인하기 위하여 혈액이 함유된 영양 아가 배지에 이쑤시개를 사용하여 균체를 접종한 후 30℃에서 48시간 배양하였으며, 황색포도당 구균에 대해 억제환을 보이는 균주를 선별한 후 혈액을 분해하여 환이 생기는 균체를 최종 선발하였다. 특히 그 환의 크기가 가장 큰 균주를 분리하여 설펙틴 생산을 후보 균주로 사용하였다. 균주 보관과 전배양을 위한 고체배지로는 영양 아가 배지를 사용하였으며, 액체 배지로 MSM 배지(NH4NO3 4g, KH2PO4 4g, Na2HPO4 5.6g, MgSO4·7H2O 0.1g, CaCl2·7H2O 1mg, FeSO4·7H2O 1mg, EDTA(Na2) 0.1mg, Glucose 40g, pH=7.0))를 사용하여 설펙틴을 생산하였다. 단일집락 하나를 상기 액체배지 50 ㎖ (250 ㎖ 프라스크)에 접종하고 30℃에서 전 배양한 후 동일배지 200 ㎖ 배지(500 ㎖ 프라스크)에 5%의 비율로 전 배양한 배양액을 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 3일간 배양하였다. 이때 배양 시 균주의 성장과 설펙틴의 생산을 알아보기 위해 12시간 마다 배양액을 샘플링하였다. 성장 정도는 600 ㎚에서 흡광도(OD600)를 측정하여 비교하였다. 설펙틴 생산량은 표준물질(sigma S3523)을 사용하여 HPLC로 비교 측정하였다. 그 결과, 균주의 성장은 모두 배양 20시간부터 급격히 증가하였으며 설팩틴의 생산은 40시간 후에 최대값을 보이다가 50시간 이후에는 감소 경향을 보이면서 유지되는 것으로 나타났다. 상기 균주의 정확한 동정을 위해 한국미생물보존센터에 의뢰하여 동정을 실시한 결과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 98.6% 일치하였으며, 이로부터 본 발명자들은 상기 균주를 바실러스 서브틸리스에 속하는 "바실러스 서브틸리스 NP15" 균주라 명명하고, 2011년 1월 18일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호; KFCC 11503P).
In order to isolate the antibiotic-producing strain, 10 ml of dilution obtained by diluting 1 g of quantitatively with 10 ml of sterile distilled water and diluting 7 times by 10 times as a stock solution after drying soil in Suwon, Gyeonggi-do 1 ml each of agar, Difco Co. USA) and incubated for 40 hours at 30 ℃. In order to identify the sulfectin-producing strains in the colonies formed after the culture, the cells were inoculated with a toothpick in a nutrient medium containing blood using a toothpick, and then cultured for 48 hours at 30 ° C. After screening, the cells were finally selected to decompose blood to form a ring. In particular, the strain with the largest ring size was isolated and sulfectin production was used as a candidate strain. Nutrient agar medium was used as a solid medium for strain storage and preculture, and MSM medium (NH 4 NO 3) was used as a liquid medium. 4 g, KH 2 PO 4 4 g, Na 2 HPO 4 5.6 g, MgSO 4 · 7H 2 O 0.1 g, CaCl 2 · 7H 2 O 1 mg, FeSO 4 · 7H 2 O 1 mg, EDTA (Na 2 ) 0.1 mg, Glucose 40 g, pH = 7.0)) Was used to produce sulfectin. One single colony was inoculated into 50 ml (250 ml Prask) of the medium and pre-incubated at 30 ° C, followed by inoculation of the culture medium pre-incubated at a rate of 5% in 200 ml medium (500 ml Prask) of the same medium. Incubated at 200 rpm for 3 days. At this time, the culture was sampled every 12 hours to determine the growth of the strain and the production of sulfectin. The degree of growth was compared by measuring the absorbance (OD600) at 600 nm. The sulfectin production was compared by HPLC using a standard (sigma S3523). As a result, the growth of all strains increased sharply from 20 hours of culture, and the production of sulfactin showed a maximum value after 40 hours, but maintained after 50 hours. As a result of the identification by the Korea Microorganism Conservation Center for accurate identification of the strain, it was 98.6% consistent with Bacillus subtilis. Strain NP15 "and was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center on January 18, 2011 (Accession No .; KFCC 11503P).
실시예Example 2: 2: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주의 항균 활성 측정 및 Determination of antimicrobial activity of strains and 설팩틴의Sulfactin 확인 Confirm
실시예 1에서 분리한 바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 항균 활성을 확인하기 위하여, 상기 균주를 MSM배지에서 40시간동안 배양한 후 원심분리하여 얻어진 배양 상등액을 5N 염산 을 이용하여 pH 2 정도에서 침전시키고, 상기 침전물을 다시 원심분리하여 상등액은 버리고 침전물만 원심분리하여 회수하였다. 얻어진 침전물을 dichloromethane, acetone, chloroform:methanol (2:1), metahnol 등으로 각각 추출하여 얻어진 분획을 이용하여 항균활성을 확인한 결과 chloroform:methanol(2:1), acetone 등에서 활성을 보였으며 유기용매에 잘 녹고 물에는 잘 녹지 않는 것으로 보아 lipid 등의 소수성 물질을 예상할 수 있었다. 항균 활성을 보이는 물질을 확인하기 위해 배양액을 여과한 것과 chloroform:methanol(2:1)로 추출한 용매층을 표준품과 함께 MALDI-TOF Mass spectroscopy (Voyager-DE STR, Applied Biosystems, 아주대학교 공동기기원)를 통해 확인 한 결과 분자량(m/z) 1030, 1044 및 1060을 major로 하는 complex물질들이 검출되었다. Database 검색결과 이들은 바실러스에서 생산되는 항균물질 설팩틴으로 밝혀졌다 (도 1). In order to confirm the antibacterial activity of the Bacillus subtilis NP15 strain isolated in Example 1, the culture supernatant obtained by incubating the strain for 40 hours in MSM medium and centrifuged was precipitated at
설팩틴 표준품 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 S3523)과 여과배양액 및 배양침전물의 chloroform:metahnol (2:1) 추출물 모두에서 표준품과 분자 피크가 일치함을 확인할 수 있었고 동일한 분자량을 보이는 것으로 확인되었다. Both the sulfactin standard (Sigma Aldrich, Catalog No. S3523) and the chloroform: metahnol (2: 1) extracts of the filtrate and the culture precipitate showed the same molecular peaks as those of the standard.
설팩틴을 이용하여 질병 원인체로 작용하는 다양한 병원성세균에 대한 항균 효과를 액체배지희석법에 의해 측정하였다. 최소억제농도(MIC) 측정은 영양배지(BD사, 미국)에 설팩틴을 넣고 2배씩 계열희석한 후, 균의 최종 희석농도를 1.0x106CFU/㎖로 하여 24시간 배양 후 세균의 발육유무를 육안으로 확인하였으며, 세균의 발육이 인정되지 않는 최소농도를 MIC로 결정하였다. 그 결과, 설팩틴은 주로 그람양성 세균에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었 다(표 1). 소의 유방염 등을 유발하는 황색포도상 구균에 대해 가장 항균활성이 좋은 것으로 나타났다 (도 2).The antibacterial effect on various pathogenic bacteria acting as a disease agent using sulfactin was measured by the liquid medium dilution method. To measure the minimum inhibitory concentration (MIC), add sulfatin to the nutrient medium (BD, USA), dilute the series twice, and incubate for 24 hours at 1.0x10 6 CFU / ml. Was visually confirmed, and the minimum concentration at which the growth of bacteria was not recognized was determined by MIC. As a result, sulfactin showed excellent antimicrobial activity mainly against gram positive bacteria (Table 1). The antimicrobial activity was shown to be best against Staphylococcus aureus causing bovine mastitis (Fig. 2).
실시예Example 3: 3: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주의 배양 Culture of strain
균주 보관과 전배양(seed) 접종을 위한 고체 배지로는 영양 아가 배지(Nutrient agar, BD사, 미국)를 사용하였으며, 액체 배지로는 분리 정제의 용이성을 위해 최소 배지를 사용하였으며 그 조성은 4% (w/v) 포도당, 50 mM NH4NO3, 40 mM Na2HPO4, 30 mM KH2PO4, 4 μM FeSO4, 7 μM CaCl2, 4 μM sodium EDTA, 0.5% (w/v) Yeast extract 넣고 pH를 멸균 후 7.2가 되도록 하여 사용하였다. 500 mL 플라스크에 100mL의 배지를 각각 넣고 nutrient broth와 상기 생산배지를 전 배양으로 하여 30℃에서 200rpm으로 60시간 배양한 결과, 설팩틴의 생산량은 1.8g/L, 건조균체량은 13.8g/L를 나타내었다. 최적배양조건을 수회 조사하여 본 발명자들이 분리한 균주가 기존균주와 다른 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 비교하기 위해 설팩틴 생산균주인 바실러스 서브틸리스 에이티씨 21332균주와 NP15균주를 사용하여 최종적으로 본 배양에 사용한 배양액으로 4% 포도당, KH2PO4 4.0g/L, K2HPO4 4.0g/L NH4(COHO) 1g/L, MgSO4·7H2O 0.2g/L, MnSO4·H2O 0.15g/L, CaCl2·7H2O 0.2mg/L, FeSO4·7H2O 1.1g/L, EDTA(Na2) 0.1mg/L, Yeast extract 5g/L, Antifoam 0.001%를 넣고 5L jar fermentror에 총 3L로 제조한 배지를 사용하여 비교하였다. Nutritious agar medium (Nutrient agar, BD, USA) was used as a solid medium for strain storage and seed inoculation, and a minimum medium was used as a liquid medium for ease of separation and purification. % (w / v) glucose, 50 mM NH 4 NO 3 , 40 mM Na 2 HPO 4 , 30 mM KH 2 PO 4 , 4 μM FeSO 4 , 7 μM CaCl 2 , 4 μM sodium EDTA, 0.5% (w / v ) Yeast extract was added and used to make pH 7.2 after sterilization. 100 mL of medium was added to 500 mL flasks, and the nutrient broth and the production medium were incubated for 60 hours at 30 ° C. at 200 rpm. The yield of sulfactin was 1.8 g / L and dry cell weight was 13.8 g / L. Indicated. By examining the optimal culture conditions several times, it was found that the strains isolated by the present inventors were different from the existing strains. In order to compare these results, the culture solution used in the present culture using the Bacillus subtilis HT 21332 strain and the NP15 strain, which are sulfactin producing strains, was used as 4% glucose, KH 2 PO 4 4.0 g / L, K 2 HPO 4 4.0 g / L NH 4 (COHO) 1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O 0.2 g / L, MnSO 4 · H 2 O 0.15 g / L, CaCl 2 · 7H 2 O 0.2 mg / L, FeSO 4 · 7H 2 O 1.1g / L, EDTA (Na 2 ) 0.1mg / L, Yeast extract 5g / L, Antifoam 0.001% was added to the 5L jar fermentror using a total of 3L prepared medium .
배양조건은 30℃ 200rpm 으로 교반하면서 pH 6.7을 유지하고 통기량을 초기 1vvm에서 점차 0.1vvm까지 낮추는 방식으로 70시간 동안 배양하였다. 그 결과 설팩틴의 생산량은 공시균주와 유사하지만 균체량은 NP15균주가 더 높았다 (표 3). 이러한 결과로 NP15균주는 사료첨가제 제조 시 더 많은 균체량을 생산하여 원가를 절감할 수 있을 것으로 예상되어 산업적으로 유용할 것으로 판단되었다.The culture conditions were maintained at pH 6.7 while stirring at 30 ℃ 200rpm and incubated for 70 hours by lowering the aeration amount from the initial 1vvm to 0.1vvm. As a result, the production of sulfactin was similar to that of the test strain, but the cell weight was higher in the NP15 strain (Table 3). As a result, the NP15 strain was expected to be able to reduce the cost by producing more bacteria in the manufacture of feed additives, which would be useful industrially.
실시예Example 4: 4: 설팩틴의Sulfactin 독성 및 안정성 시험 Toxicity and Stability Test
설팩틴의 동물사료첨가제로서 사용하기 위한 안정성 확보를 위해 급성 경구독성을 통해 1차적인 독성시험을 실시하였다. 독성시험은 시험의 공정성을 위해 (주)켐온에 수탁의뢰하여 실시하였다. 먼저 표준품인 설팩틴(surfactin)은 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 S3523)로 부터 구입하여 실시하였으며 시험대상은 건조균체 및 생균으로 나누어 실시하였다. 급성경구독성시험은 국립수의과학검역원 고시 (2009-18호, 2009년 12월 30일)에 따라 암수 각각 5마리로 구성된 총 10마리의 mouse를 이용하여 제공한 시료를 사료 및 음료 형태로 제조하여 급여하는 것으로 각각 총 8주간 진행되었다(표 4). 전반적인 마우스에 대한 급성경구독성은 표준품과 시료 모두 중등도 이하의 결과를 보였고 본 연구를 통해 준비된 시료에서 체중 kg 당 4g 이상의 결과를 보여 매우 안정한 것으로 판단되었다.In order to secure the stability for use as an animal feed additive of sulfactin, primary toxicity test was conducted through acute oral toxicity. Toxicity test was conducted by commissioning Chem Co., Ltd. for the fairness of the test. First, sulfactin, a standard product, was purchased from Sigma Aldrich (Cat. No. S3523), and the test subjects were divided into dry and live cells. The acute oral toxicity test was carried out in the form of feed and drink using samples from 10 mice consisting of 5 males and females according to the National Veterinary Research and Quarantine Service Notice (2009-18, December 30, 2009). A total of eight weeks were spent (Table 4). Overall acute oral toxicity in mice was below moderate in both standard and samples, and the results were more stable than 4g / kg body weight.
(LD50, mg/Kg)Acute Oral Toxicity
(LD 50 , mg / Kg)
실시예Example 5: 5: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주의 Strain pHpH 및 담즙 내성 And bile resistance
사료용 첨가제 제조 시 활성성분인 설팩틴의 보존력과 안정성을 확인하기 위해 고온 및 산성조건에서의 성능을 확인하였다. In order to confirm the preservation and stability of the active ingredient sulfactin in the preparation of feed additives, the performance under high temperature and acid conditions was checked.
바실러스 서브틸리스 NP15 균주의 소화 과정에서의 위장관 내 생존 능력을 평가하기 위하여, 산성 조건 및 담즙에 대한 내성을 조사하였다. 산성 조건하에서의 생존능력을 평가하기 위하여, 상기 균주를 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 정치 배양하여 균의 농도가 1012 내지 1013 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)/㎖이 되도록 하였다. 배양된 균은 6,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균을 수집하였고, 이를 멸균수로 2회 세척한 후 1/100로 농축하여 세포수가 약 1010CFU/㎖이 되도록 하여 사용하였다. pH 1, 2, 3, 4 및 5로 조정된 완충액에 희석한 균을 접종하여 1, 2 및 4시간동안 37℃에서 배양한 후, 멸균수로 희석하여 트립티카제 소이 아가(trypticase soy agar, BD사, 미국)에 접종하여 콜로니를 계수하였다. 생존률(%)은 반응시간 후의 생균수를 초기접종시 세균수로 나누어 산출하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 NP15는 산성 pH 조건하에서도 비교적 안정하게 생존하는 것을 알 수 있었다(표2). 위산의 pH와 유사한 pH 1에서도 4시간동안 약 64%의 생존률을 나타내었으며, pH 2 이상에서는 4시간 처리시 85.7% 이상의 우수한 생존률을 나타내었다.In order to assess the viability of the gastrointestinal tract during digestion of Bacillus subtilis NP15 strains, acidic conditions and resistance to bile were investigated. In order to evaluate the viability under acidic conditions, the strain was inoculated in a liquid medium and then incubated at 37 ° C. for 12 hours to obtain a concentration of 10 12 to 10 13 colony forming units (CFU) / ml. It was made. The cultured bacteria were collected by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes, and the cells were washed twice with sterile water and concentrated to 1/100 to give a cell number of about 10 10 CFU / ml. Inoculated with diluted bacteria in buffer adjusted to
다음으로, 담즙 내성을 평가하기 위하여 트립티카제 소이 배지에 0.06% 와 0.5%의 담즙산을 첨가한 배지를 이용하여 바실러스 서브틸리스 NP15를 접종하여 37℃에서 배양하면서, 12시간 동안 분광광도기를 이용하여 550 ㎚ 파장에서의 흡광도에 의한 균의 생장 정도를 측정하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 NP15균주는 담즙산의 처리에 의해 초기 성장은 억제되었으나 6시간 이후에는 정상적으로 회복하여 성장하였음을 알 수 있다 (도 6). 이로부터 바실러스 서브틸리스 NP-15 균주는 담즙에서도 우수한 생존 및 성장을 나타낸다는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 바실러스 서브틸리스 NP15 균주는 가축에 생균제로 사용할 경우 위 및 소장내에서도 생존하여 대장까지 전달될 수 있음을 확인하였다.
Next, in order to evaluate the bile resistance, inoculated Bacillus subtilis NP15 with a medium containing 0.06% and 0.5% bile acid in trypticase soy medium and incubated at 37 ° C., using a spectrophotometer for 12 hours. The degree of growth of bacteria by absorbance at 550 nm was measured. As a result, the Bacillus subtilis NP15 strain was suppressed the initial growth by the treatment of bile acid, but after 6 hours it can be seen that the normal recovery and growth (Fig. 6). From this it was confirmed that Bacillus subtilis NP-15 strain shows excellent survival and growth even in bile. From the above results, it was confirmed that Bacillus subtilis NP15 strain can survive in the stomach and small intestine and be delivered to the large intestine when used as a probiotic in livestock.
실시예Example 6: 6: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주가 생산하는 효소 활성 Enzyme Activity Produced by Strains
바실러스 서브틸리스 NP15 균주가 분비하는 글루코시다제, 갈락토시다제, 만노시다제, 셀로바이아제, 싸카라제, 포스파타제, 트레할라제, 이눌리나제등의 효소활성은 API CH-50 키트(bioMerieux, Montalieu-Vercieu, France)를 이용하였고 갈락타나제 측정은 라치우드 갈락탄 (Megazyme, Wicklow, Ireland)을 이용하여 갈락토즈 유리정도를 소모지-넬슨법으로 측정하였다. 셀룰라제 측정은 카르복시메틸셀룰로즈 (Sigma, yongin, Korea)를 기질로 하여 측정하였고 펙티나제는 대두펙틴 또는 폴리갈락투론산 (Sigma, Yongin, Korea)을 기질로 갈락투로닉산 유리정도를 측정하였다. 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 트립티카제 소이 배지에 접종하고 호기 조건으로 30℃에서 30시간 배양한 후 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성은 대조군과 비교하여 0점에서 5점까지 발색정도를 확인하여 상대적으로 평가하였다. 그 결과, 바실러스 서브틸리스 NP15는 종래에 생균제로 사용되고 있는 다른 바실러스 서브틸리스들과는 달리 갈락타나제와 펙티나제에 대해 높은 활성을 나타내었다 (도 8). 이러한 사실로 동물이 식물성원료를 사료로 공급할 경우 더욱 효과적으로 분해하여 영양원을 섭취하는데 유리할 것으로 사료되었다. 또한 셀롤라제와 알칼린 및 산 포스파타제에도 유의한 활성을 나타내었는데 이들은 모두 동물의 생존에 필수적인 탄소원과 인산 효율을 증가시킬 수 있는것이다.
Enzymatic activity of glucosidase, galactosidase, mannosidase, cellobiase, saccharase, phosphatase, trehalase, inulinase and the like secreted by the Bacillus subtilis NP15 strain was determined by the API CH-50 kit ( bioMerieux, Montalieu-Vercieu, France) were used, and galactanase was measured by Larchwood galactan (Megazyme, Wicklow, Ireland). Cellulase was measured using carboxymethylcellulose (Sigma, yongin, Korea) as substrate and pectinase was measured soybean pectin or polygalacturonic acid (Sigma, Yongin, Korea) as substrate. . Bacillus subtilis NP15 strain was inoculated in trypticase soy medium and incubated at 30 ° C. for 30 hours under aerobic conditions, and enzyme activity was measured. Enzyme activity was relatively evaluated by confirming the color development from 0 to 5 points compared to the control. As a result, Bacillus subtilis NP15 showed high activity against galactanase and pectinase, unlike other Bacillus subtilis which are conventionally used as a probiotic (FIG. 8). This fact suggests that animal feed would be more effective in decomposing more nutrients when feeding animal feed. It also showed significant activity in celase, alkaline and acid phosphatase, all of which could increase the carbon source and phosphoric acid efficiency necessary for animal survival.
실시예Example 7: 7: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주의 육계에서의 효과 Effect of Strains on Broilers
육계에 대한 효과는 경상대학교 수의과대학 동물의약연구소에서 15일령의 육계를 사용하여 각 20마리씩을 한 시험군으로 대조군포함 3개군으로 나누어 실시하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 NP15가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 실시예 1 에서 분리된 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 톤 당 0.5kg과 1.0kg씩 사료에 첨가하여 4주간 급여하였다. 일정한 시간에 실험계의 일반상태 관찰하고 각군의 사료섭취량을 매일 측정하여 기록하였으며, 실험계의 체중을 투약전, 그리고 투약후 1주일에 한 번씩 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하여 층체율을 산정하였으며, 사료 섭취율은 주간별로 누적 사료 섭취량으로 계산하였다. 사료 효율(%)은 체중 증가량을 사료 섭취율로 나누어 나타내었다. 실험 종료 시점에 모든 실험계를 대상으로 심장천공법을 통해 채혈한 다음, 일부 혈액은 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 호염기구, 그리고 호중구 등을 혈액자동분석기를 이용하여 분석하였고, 일부 혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하여 혈청 중의 IgG의 농도를 ELISA kit를 이용하여 분석하였다. 혈청 중 IgG의 농도를 측정하기 위해 혈청을 1,000배 희석하여 ELISA에 적용하였다. 각 실험군으로부터 얻은 자료 결과를 Sigma plot을 이용하여 student's t-test로 실시하여, p < 0.05일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 시험기간 동안 폐사계는 없었으며, 모든 실험군의 시험계에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 표 4 시험계에 대해 시험약 투여전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 상대적으로 개선된 상태를 보였으며, 특히, Bacillus subtilis를 사료에 0.1% (1 kg/ton feed)로 투여한 실험군의 증체율과 사료요구율이 가장 좋게 나타났다. Bacillus subtilis와 Bacillus subtilis 합제를 사료 ton 당 0.5kg 혼합한 실험군은 비슷한 사료요구율을 나타내었다. 표 4는 육계의 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호산구 수 등이 증가하였으며, 백혈구와 호중구는 감소하는 경향을 나타내었다. 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호염구 수의 경우, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)과, Bacillus subtilis와 해조추출물의 합제를 0.05와 0.1%를 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. Bacillus subtilus와 해조류의 육계급여가 자돈에서와 같이 비특이 면역기능과 관련성이 있는 일부 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다. The effects on broilers were conducted at the Gyeongsang National University Veterinary Medicine Institute of Veterinary Medicine at 20-day-old broilers, divided into three groups including a control group and 20 animals. The control group was fed a feed that does not contain Bacillus subtilis NP15, the experimental group was fed Bacillus subtilis NP15 strain isolated in Example 1 by adding 0.5kg and 1.0kg per tonne of feed to the feed for 4 weeks. Observed the general condition of the experimental system at a certain time and measured and recorded the feed intake of each group every day, and measured the weight of the experimental system at a certain time every week before and after the administration and recorded the stratification rate. Intake rates were calculated as cumulative feed intake weekly. Feed efficiency (%) was expressed by weight gain divided by feed intake rate. At the end of the experiment, all the experimental systems were collected by cardiac puncture, and then some blood was analyzed using a blood autoanalyzer for red blood cells, white blood cells, hemoglobin, lymphocytes, monocytes, eosinophils, basophils, and neutrophils. Some blood was centrifuged to separate serum and the concentration of IgG in serum was analyzed using ELISA kit. Serum was diluted 1,000-fold and subjected to ELISA to determine the concentration of IgG in serum. The data obtained from each experimental group was performed by student's t-test using Sigma plot, and it was considered that there was a significant difference when p <0.05. There was no mortality during the trial and no specific symptoms were observed in all experimental groups. Table 4 shows the body weight, feed intake, and feed demand rate measured before and after the administration of test drug for each week. The weight gain and feed rate of the experimental group were significantly improved compared to the control group, especially Bacillus Subtilis showed the best gain and feed rate in the experimental group fed 0.1% (1 kg / ton feed). Bacillus subtilis and Bacillus The experimental group with 0.5kg per ton of subtilis mixture showed similar feed demand. Table 4 shows the blood analysis results for the control and experimental groups of broilers. Compared to the control group, the number of erythrocytes, hemoglobin, monocytes, and eosinophils was increased in the experimental group, and leukocytes and neutrophils were decreased. In the case of erythrocytes, hemoglobin, monocytes, and basophils, the group with 0.1% Bacillus subtilis (p <0.001) increased significantly compared with the control group. Also, in the case of neutrophil count, Bacillus group containing 0.1% subtilis (p <0.001) and Bacillus The combination of subtilis and seaweed extract showed a significant decrease in the group added with 0.05 and 0.1% (p <0.001) compared with the control. The broiler feeding of Bacillus subtilus and algae is thought to increase immunity by inducing an increase in some lymphocytes associated with nonspecific immune function as in piglets.
실시예Example 8: 8: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주의 Strain 이유자돈에서의At weaners 증체Weight 효과 effect
이유자돈(LandracexYorkshirexDurok)은 4주령의 3원 교잡종 (Landracex- YorkshirexDuroc) 60두를 대상으로 대조군포함 각 시험군을 20마리씩으로 3개 시험군으로 하여 4반복으로 돈방 당 5두씩 배치하여, 경상대학교 부속 동물사육장에서 5주간 사양시험을 수행하였다. 시험군은 바실러스 서브틸리스 NP-15를 각각 0.01, 0.05, 0.1% 사료에 첨가하여 공급한 것이고 대조군은 사료만 공급한 것이다. 28℃ 전·후, 상대습도 50-70%, 12시간의 명암주기, 환기가 되는 환경에서 사료 및 상수도수를 자유급여 시켰다. 실험기간 동안 사료섭취량 및 체중을 매주 측정하여 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI) 및 사료요구율(feed/gain) 등을 계산하였다.Weaning pigs (LandracexYorkshirexDurok), 60 rats of four-week-old three-way hybrids (Landracex- YorkshirexDuroc), each group of 20 animals including the control group, each of which consisted of three test groups, and placed five heads per pig in 4 replicates. Specimen testing was conducted for five weeks at the kennel. The test group was fed with Bacillus subtilis NP-15 added to 0.01, 0.05 and 0.1% feed, respectively, and the control group was fed only feed. Before and after 28 ℃, the feed and tap water were freely supplied in 50-70% relative humidity, 12-hour contrast cycle, and ventilated environment. Feed intake and body weight were measured weekly during the experimental period to calculate the daily gain (ADG), daily feed intake (ADFI) and feed / gain.
실험종료 시점에 모든 자돈을 대상으로 경정맥으로부터 혈액을 채혈하여 일부 혈액은 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 호염기구, 그리고 호중구 등을 혈액자동분석기를 이용하여 측정하였고, 일부 혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하여, 면역력에 미치는 영향 등을 확인하기 위해, 면역력과 관련된 IgG와 IFN-γ를 시중에 판매되고 있는 Pig IgG ELISA kit (Koma Biotech Inc., Seoul, Korea)와 Porcine IFN-gamma ELISA kit (RayBiotech Inc., Georgia, USA)를 구입하여 분석하였다. 실험을 통해 얻어진 각 실험군의 자료들을 분석하여 각 실험군 간의 유의성 검정을 수행하기 위해 분석된 자료들을 Sigma plot을 이용하여 student's t-test로 실시하여, p < 0.05일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 NP15가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 실시예 1 에서 분리된 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.5 kg과 1 kg을 첨가하여 4주간 급여하였다. 생산성 및 증체율을 측정하기 위해 입수시와 매주별 이유자돈의 체중을 측정하여 증체율을 산하였으며, 사료 섭취율은 주간별로 누적 사료 섭취량으로 계산하였다. 사료 효율(%)은 체중 증가량을 사료 섭취율로 나누어 나타내었다. 시험기간 동안 폐사돈은 없었으며, 모든 실험군의 시험돈에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 표 7은 시험돈에 대해 시험약 투여전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 나타났으며, 특히, Bacillus subtilis를 사료에 1.0 kg/ton (0.1%) 투여한 실험군의 증체율이 가장 높았으며, 사료요구율은 가장 낮게 나타났다. 표 8은 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 그리고 호염기구 수 등이 증가하였으며, 백혈구와 호중구는 감소하는 결과를 나타내었다. 림프구와 단핵세포 수의 경우, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)에서 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는, Bacillus subtilis 급여가 자돈에서 비특이 면역기능과 관련성이 큰 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다.At the end of the experiment, blood was collected from the jugular vein in all piglets, and some blood was measured using an automated blood analyzer (RBC), white blood cells, hemoglobin, lymphocytes, monocytes, eosinophils, basophils, and neutrophils. In order to confirm the effect on the immunity by separating the serum by centrifugation, Pig IgG ELISA kit (Koma Biotech Inc., Seoul, Korea) and Porcine IFN- gamma ELISA kit (RayBiotech Inc., Georgia, USA) was purchased and analyzed. Obtained through experiment In order to analyze the data of each experimental group and perform the significance test between each experimental group, the analyzed data were performed by student's t-test using Sigma plot, and it was considered that there was a significant difference when p <0.05. The control group was fed a diet not containing Bacillus subtilis NP15, the experimental group was fed Bacillus subtilis NP15 strain isolated in Example 1 by adding 0.5 kg and 1 kg per kg feed for 4 weeks. In order to measure productivity and growth rate, the weight gain rate was calculated by measuring the weight of weaning pigs at the time of acquisition and weekly, and the feed intake rate was calculated as the cumulative feed intake weekly. Feed efficiency (%) was expressed by weight gain divided by feed intake rate. There was no mortality during the trial, and no specific symptoms were observed in all pigs. Table 7 shows the weight, feed intake, and feed demand rate measured for each test pig before and after the administration of the test drug. The weight gain and feed rate of the experimental group were significantly higher than those of the control group, especially Bacillus. Subtilis was highest in the experimental group with 1.0 kg / ton (0.1%) in feed, and the lowest in feed requirement. Table 8 shows the blood analysis results for the control group and the experimental group. Compared to the control group, the number of erythrocytes, hemoglobin, lymphocytes, monocytes, eosinophils, and basophils was increased in the experimental group, and leukocytes and neutrophils were decreased. Bacillus for lymphocyte and monocyte count It was increased in the group added with 0.1% subtilis (p <0.001). Also, in the case of neutrophil count, Bacillus The 0.1% subtilis group (p <0.001) significantly decreased compared to the control group. These results, Bacillus subtilis It is believed that the diet increases the immune capacity by inducing an increase in lymphocytes that are highly related to nonspecific immune function in piglets.
실시예Example 9: 9: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주와 조류배양물 Strains and Bird Cultures 혼합제제의Mixed 육계에서의 효과 Effects in broilers
육계에 대한 혼합제제의 효과는 실시예 7과 동일한 15일령의 육계를 사용하여 각 20마리씩을 한 시험군으로 대조군포함 3개군으로 나누어 실시하였다. 대조군은 바실러스 서브틸리스 NP15와 헤마토코쿠스가 포함되지 않은 사료를 급여하였으며, 실험군은 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.449kg과 헤마토코쿠스 0.001 kg을 사료에 첨가한것을 0.5kg군으로 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.998kg과 헤마토코쿠스 0.002 kg을 사료에 첨가한것을 1.0kg 군으로 하여 4주간 급여하였다. 동물의 체중 및 사료섭취율, 상태관찰, 혈액 및 면역계의 변화정도는 실시예 7과 동일하게 실시하였다. 시험기간 동안 폐사계는 없었으며, 모든 실험군의 시험계에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. The effect of the mixed preparations on broilers was carried out by dividing each of the 20 animals into three groups including the control group using the same 15-day-old broilers as in Example 7. The control group was fed a diet not containing Bacillus subtilis NP15 and hematococcus, and the experimental group was added 0.549 kg of Bacillus subtilis NP15 strain to 0.449 kg per kg feed and 0.001 kg of hematococcus to the feed. The Bacillus subtilis NP15 strain was fed 0.998 kg per kg kg and 0.002 kg of hematococcus to the feed 1.0 kg group for 4 weeks. Body weight and feed intake rate, status observation, the degree of change in blood and immune system were carried out in the same manner as in Example 7. There was no mortality during the trial and no specific symptoms were observed in all experimental groups.
표 10은 시험계에 대해 시험약 투여전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 상대적으로 개선된 상태를 보였으며, 특히, 바실러스 서브틸리스 NP15와 헤마투코쿠스를 혼합하여 사료에 0.5 kg/Kg 으로 투여한 실험군의 증체율과 사료요구율이 가장 좋게 나타났다. 혼합제를 사료 kg 당 1.0 kg 혼합한 실험군은 비슷한 사료요구율을 나타내었다. 표 11은 육계의 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호산구 수 등이 증가하였으며 특히 헤모글로빈 수치가 크게 증가하였고, 백혈구와 호중구는 감소하는 경향을 나타내었다. 적혈구, 헤모글로빈, 단핵세포, 그리고 호염구 수의 경우, 혼합제를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, 혼합제 Bacillus subtilis와 0.05와 0.1%를 첨가한 군(p<0.001)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. Bacillus subtilus의 육계급여가 자돈에서와 같이 비특이 면역기능과 관련성이 있는 일부 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다. Table 10 shows the body weight, feed intake, and feed demand rate measured for each test system before and after the administration of the test drug. The weight gain and feed rate of the experimental group were significantly improved compared to the control group, especially, when the mixture of Bacillus subtilis NP15 and Hematococcus was administered to the feed at 0.5 kg / Kg. Weight gain and feed demand were the best. The experimental group with 1.0 kg / kg of feed mixture showed similar feed demand. Table 11 shows the blood analysis results for the control and experimental groups of broilers. Compared to the control group, the number of erythrocytes, hemoglobin, monocytes, and eosinophils was increased in the experimental group, especially hemoglobin levels increased, and leukocytes and neutrophils decreased. In the case of erythrocytes, hemoglobin, monocytes, and basophils, the 0.1% addition group (p <0.001) was significantly increased compared to the control group. In addition, in the case of neutrophil count, the mixture Bacillus The subtilis and 0.05 and 0.1% groups (p <0.001) showed a significant decrease compared to the control group. Bacillus Subsequent broiler diets are thought to increase immunity by inducing an increase in some lymphocytes associated with nonspecific immune function as in piglets.
실시예Example 10: 10: 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis NP15NP15 균주와 조류배양액 Strains and Algal Cultures 혼합제제의Mixed 이유자돈에서의At weaners 증체Weight 효과 effect
이유자돈의 시험은 실시예 8과 같이 4주령의 3원 교잡종(Landrace×Yorkshire×Duroc) 60두를 대상으로 대조군포함 각 시험군은 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.449kg과 헤마토코쿠스 0.001 kg을 사료에 첨가한 것을 0.5kg군으로 바실러스 서브틸리스 NP15 균주를 사료 ㎏ 당 0.998kg과 헤마토코쿠스 0.002 kg을 사료에 첨가한것을 1.0kg 군으로. 시험군 1은 바실러스 서브틸리스 NP-15를 각각 0.05% 와 헤마토코쿠스 세포 동결건조물 0.005% 를 공급한 것이고 대조군은 사료만 공급한 것이다. 실시예 8과 동일한 조건으로 실험기간 동안 사료섭취량 및 체중을 매주 측정하여 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI) 및 사료요구율(feed/gain) 등을 계산하였다. 시험기간 동안 폐사돈은 없었으며, 모든 실험군의 시험돈에서 특이한 증상은 관찰되지 않았다. 표 13은 시험돈에 대해 시험약 투여 전, 투여 후 매주 경시별로 측정한 체중, 사료섭취량, 그리고 사료요구율 등을 나타낸 것이다. 시험약을 투여한 실험군의 증체량 및 사료요구율이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 나타났으며, 특히, Bacillus subtilis를 사료 톤당 0.5 kg 급여한 실험군의 증체율이 가장 높았으며, 사료요구율은 가장 낮게 나타났다. Bacillus subtilis 합제를 사료 ton 당 0.5kg을 혼합한 실험군은 서로 유사한 증체율과 사료요구율을 나타내었으나, 상대적으로 Bacillus subtilis 합제를 0.5kg을 사료에 혼합하여 투여한 군이 증체율과 사료요구율에서 좋은 결과를 나타냈다. The test of weaning pigs was carried out in 60 four-week-old ternary hybrids (Landrace × Yorkshire × Duroc) as in Example 8. Each test group including the control group was treated with Bacillus subtilis NP15 strain at 0.449 kg / kg of hematococcus. 0.5 kg of 0.001 kg was added to feed and 0.998 kg of Bacillus subtilis NP15 strain per kg of feed and 0.002 kg of hematococcus to 1.0 kg of feed.
표 14는 대조군과 실험군에 대한 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. 대조군에 비해 실험군이 전반적으로 적혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵세포, 호산구, 그리고 호염기구 수 등이 증가하였으며, 백혈구와 호중구는 감소하는 결과를 나타내었다. 림프구와 단핵세포 수의 경우, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)과, Bacillus subtilis와 해조추출물의 합제를 0.1% 첨가한 군(p<0.05)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였다. 또한, 호중구 수의 경우에서는, Bacillus subtilis를 0.1% 첨가한 군(p<0.001)과, Bacillus subtilis와 해조추출물의 합제를 0.1% 첨가한 군(p<0.05)이 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는, Bacillus subtilis와 해조류의 급여가 자돈에서 비특이 면역기능과 관련성이 큰 림프구의 증가를 유도하여 면역능력을 증가시키는 것으로 사료된다.Table 14 shows the blood analysis results for the control group and the experimental group. Compared to the control group, the number of erythrocytes, hemoglobin, lymphocytes, monocytes, eosinophils, and basophils was increased in the experimental group, and leukocytes and neutrophils were decreased. Bacillus for lymphocyte and monocyte count group containing 0.1% subtilis (p <0.001) and Bacillus There was a significant increase (p <0.05) in the 0.1% mixture of subtilis and seaweed extract compared to the control. Also, in the case of neutrophil count, Bacillus Subtilis added 0.1% (p <0.001) and Bacillus subtilis mixed with seaweed extract 0.1% (p <0.05) significantly decreased compared with the control group. These results, Bacillus Subtilis and algae supplementation is thought to increase immunity by inducing an increase in lymphocytes associated with nonspecific immune function in piglets.
Claims (10)
Feeding composition comprising Bacillus subtilis NP15 strain (Accession No .; KFCC 11503P).
The composition of claim 1, wherein the strain produces the antibacterial sulfactin.
The composition of claim 1, further comprising one or more enzyme preparations.
4. The enzyme preparation of claim 3 wherein the enzyme formulation is selected from the group consisting of galactase, pectinase, amylase, phytase, phosphatase, cellulase, arabinase, xylanase, maltase and lipase. Feed composition.
The feed additive composition of claim 1, further comprising other non-pathogenic microorganisms.
The method of claim 5, wherein the microorganism is selected from the group consisting of microalgae, Lactobacillus genus, Leukonostock, Nocardia genus, Streptomyces, Aspergillus orizae and Saccharomyces cerevisiae. Feed composition according to claim.
The feed additive composition according to claim 1, which further contains at least one amino acid.
According to claim 1, Feed additive composition, characterized in that the addition of beta carotene, astaxanthin-producing algae as an adjuvant.
The feed additive composition according to claim 1, further comprising an immunopotentiator.
10. The composition of claim 9, wherein the immunopotentiator is selected from the group consisting of beta carotene, vitamins and beta glucan.
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2011
- 2011-10-31 KR KR1020110112279A patent/KR20130047329A/en not_active Application Discontinuation
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